ESTUDIO DEL ADECUADO CRECIMIENTO DEL HONGO TRICHODERMA HARZIANUM Y TRICHODERMA HAMATUM EN SUSTRATO SÓLIDO

8/17/2019 ESTUDIO DEL ADECUADO CRECIMIENTO DEL HONGO TRICHODERMA HARZIANUM Y TRICHODERMA HAMATUM EN S…

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA

ESTUDIO DEL ADECUADO CRECIMIENTO DEL HONGO TRICHODERMA

HARZIANUM Y TRICHODERMA HAMATUM EN SUSTRATO SÓLIDO.

TRABAJO DE GRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA

QUÍMICA

AUTORA: JUANA MARICELA POALACIN CABASCANGO

TUTORA: ING. LORENA ELIZABETH VILLARREAL VILLOTA

QUITO

2015


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APROBACIÓN DEL TUTOR

En calidad de Tutora del Trabajo de Grado titulado, “ESTUDIO DEL ADECUADO

CRECIMIENTO DEL HONGO TRICHODERMA HARZIANUM Y TRICHODERMA

HAMATUM EN SUSTRATO SÓLIDO”, me permito certificar que el mismo es original y ha

sido desarrollado por la señorita JUANA MARICELA POALACIN CABASCANGO, bajo mi

dirección y conforme a todas las observaciones realizadas, considero que el trabajo reúne los

requisitos necesarios.

En la ciudad de Quito, a los 30 días del mes de Abril del 2015

Ing. Lorena Elizabeth Villareal Villota MSc.

PROFESORA TUTORA


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iii

AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL

Yo, JUANA MARICELA POALACIN CABASCANGO en calidad de autora del trabajo de

grado realizado sobre el ESTUDIO DEL ADECUADO CRECIMIENTO DEL HONGO

TRICHODERMA HARZIANUM Y TRICHODERMA HAMATUM EN SUSTRATO SÓLIDO,

por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos

los contenidos que me pertenecen o de parte de los que contiene esta obra, con fines

estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización,

seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y

demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.

Quito, 30 de Abril del 2015

Juana Maricela Poalacin Cabascango

C.C. 1804267977

[email protected]


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A mis queridos padres Manuel y Carmen

por su amor, comprensión y

sacrificio.


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v

AGRADECIMIENTO

A Dios mi guía, y mi fortaleza quien con su amor infinito me dirigió por el camino correcto,

quien me alivió en mis momentos de tristeza y me ayudó a superar los obstáculos que se me

presentaron.

A mis padres Manuel y Carme quienes con esfuerzo y sacrificio permitieron que yo culminara

con mis estudios universitarios, quienes con su cariño y amor forjaron en mí una persona de

bien.

A mi hermana querida Myrian Poalacin quien estuvo alentándome día tras día para seguir

adelante y no renunciar a mis sueños, gracias por entenderme, por tus consejos y especialmente

gracias por ser el instrumento que Dios utilizó para que Él llegara a mi corazón y encontrara el

lado alegre de la vida.

A mis amigos Luis Asero, Melissa Enríquez, Glenda Andrade, Naty Velasco, Johanna Bonilla y

Anita Peralta que siempre estuvieron cuando los necesitaba brindándome su apoyo y amistaddesinteresada, también a mis amigos Diego Pullas, Victoria Ballagán y Margoth Quillupangui

quienes siempre encontraban la forma para hacernos olvidar de los momentos de tristeza.

A la Lic. Celia Velasteguí quien siempre confió en mis capacidades, quien me alentó y ayudó a

que este trabajo se desarrollara.

A mi directora de tesis la Ing. Lorena Villareal quien con sus conocimientos me guio durante

todo el desarrollo de esta investigación.

Mary.


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CONTENIDO

pág

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... x

LISTA DE GRÁFICOS ...........................................................................................................xi

LISTA DE TABLAS ..............................................................................................................xii

LISTA DE ANEXOS ............................................................................................................. xiv

SIMBOLOGÍA ....................................................................................................................... xv

RESUMEN ............................................................................................................................ xvi

ABSTRACT ......................................................................................................................... xvii

INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 1

1. MARCO TEÓRICO .............................................................................................................. 3

1.1 Los hongos .......................................................................................................................... 3

1.2 Trichoderma spp. ................................................................................................................ 4

1.2.1 Clasificación Taxonómica. ............................................................................................... 5

1.2.2 Reproducción.. ................................................................................................................. 6

1.2.3 Morfología. ...................................................................................................................... 6

1.2.3.1 Características macroscópicas. ..................................................................................... 6

1.2.3.2 Características microscópicas. ...................................................................................... 6

1.3 Trichoderma harzianum. ..................................................................................................... 7

1.4 Trichoderma hamatum ........................................................................................................ 8

1.5 Mecanismos de Acción ....................................................................................................... 91.5.1 Competencia. .................................................................................................................. 9

1.5.2 Micoparasitismo. .............................................................................................................. 9

1.5.3 Antibiosis.. ....................................................................................................................... 9

1.6 Factores que influyen en el crecimiento ............................................................................. 10

1.6.1 Temperatura................................................................................................................... 10

1.6.2 Humedad .. ...................................................................................................................... 10

1.6.3 Aireación. ...................................................................................................................... 10

1.6.4 pH. ................................................................................................................................. 11


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vii

1.6.5 Tamaño de partícula del sustrato.................................................................................... 11

1.6.6 Exposición de luz ............................................................................................................ 11

1.7 Los hongos en el control biológico .................................................................................... 11

1.8 Sustratos en la producción de Trichoderma spp. ................................................................ 12

1.9 Fermentación .................................................................................................................... 13

1.9.1 Fermentación en medio líquido. ..................................................................................... 13

1.9.2 Fermentación en medio sólido. ....................................................................................... 14

1.9.3 Comparación entre la fermentación en medio sólido y en medio líquido. . ....................... 14

1.10 Curva de crecimiento microbiano .................................................................................... 16

1.11 Aplicaciones de Trichoderma spp. ................................................................................... 17

2. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................. 19

2.1 Pruebas preliminares ......................................................................................................... 19

2.2 Diseño experimental .......................................................................................................... 20

2.3 Aplicación del hongo Trichoderma en plantas ................................................................... 24

2.4 Materiales y equipos ......................................................................................................... 24

2.5 Sustancias y reactivos ........................................................................................................ 25

2.6 Procedimientos.................................................................................................................. 25

2.6.1 Producción de Trichoderma spp. . .................................................................................. 25

2.6.2 Preparación del medio de cultivo a base de agar patata dextrosa (PDA) ........................ 27

2.6.3 Procedimiento de resiembra en el medio de cultivo PDA ................................................ 27

2.6.4 Preparación del sustrato en botellas de vidrio y en fundas de polietileno ........................ 27

2.6.5 Siembra del inóculo de Trichoderma spp. en botellas y en fundas.. ................................. 28

2.6.5.1 Recuento celular.. ........................................................................................................ 28

2.6.5.2 Diluciones seriadas. .................................................................................................... 28

2.6.5.3 Cámara de Neubauer ................................................................................................... 29

2.6.5.4 Cálculo matemático de la concentración. .................................................................... 31

2.6.6 Procedimiento de contaje de esporas del sustrato sólido ................................................. 32

3. DATOS .............................................................................................................................. 33

3.1 Datos preliminares ............................................................................................................ 33

3.1.1 Datos de las sustancias utilizadas................................................................................... 33

3.1.2 Preparación del sustrato en camineras.. ......................................................................... 33

3.1.3 Concentración del inóculo para siembra en camineras. .................................................. 34

3.1.4 Concentración de esporas producidas en camineras.. ..................................................... 34

3.2 Datos del diseño experimental ........................................................................................... 35


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viii

3.2.1 Preparación del sustrato en fundas. ................................................................................ 35

3.2.2 Concentración del inóculo para siembra en fundas.. ....................................................... 36

3.2.3 Contaje de esporas producidas en fundas. . ..................................................................... 36

4. CÁLCULOS ....................................................................................................................... 394.1 Cálculos de las pruebas preliminares ................................................................................. 39

4.1.1 Cálculo para determinar la cantidad de agua absorbida por el sustrato.. ....................... 39

4.1.2 Cálculo del volumen total de agua adicionada en la preparación del sustrato. ............... 39

4.1.3 Cálculo de la cantidad de agua total ............................................................................... 40

4.1.4 Cálculo de la masa del sustrato seco. ............................................................................. 40

4.1.5 Cálculo del porcentaje de humedad . ............................................................................... 41

4.1.6 Cálculo para determinar la concentración de esporas. ................................................... 41

4.2 Cálculos del diseño experimental....................................................................................... 424.2.1 Porcentaje de humedad óptimo.. ..................................................................................... 42

4.2.2 Cálculo de la cantidad de agua total. ............................................................................. 42

4.2.3 Construcción de las curvas de crecimiento ..................................................................... 43

4.3 Cálculo estadístico ............................................................................................................ 43

4.3.1 Corrección de logaritmo base 10 a logaritmo natural . .................................................... 43

4.3.2 Cálculo de la velocidad de crecimiento de las curvas...................................................... 44

4.3.3 Cálculo del Coeficiente de variación.. ............................................................................ 45

5. RESULTADOS .................................................................................................................. 46

5.1 Resultados de las pruebas preliminares .............................................................................. 46

5.1.1 Cantidad de agua presente en la preparación del sustrato en camineras. . ....................... 46

5.1.2 Resultados de porcentaje de humedad del sustrato. ......................................................... 46

5.1.3 Concentración de esporas obtenida de la propagación en botellas.................................. 47

5.1.4 Curvas de concentración versus volumen de agua adicionado al sustrato. ...................... 48

5.1.5 Curvas de concentración versus porcentaje de humedad .. ............................................... 49

5.2 Resultados del diseño experimental ................................................................................... 50

5.2.1 Volumen de agua óptimo.. .............................................................................................. 50

5.2.2 Resultados de la masa de agua total.. ............................................................................. 51

5.2.3 Resultados de temperatura y % de humedad para propagar Trichoderma. ...................... 51

5.2.4 Construcción de la curva de crecimiento.. ...................................................................... 52

5.3 Curvas de crecimiento obtenidas ....................................................................................... 57

5.4 Resultados estadísticos ...................................................................................................... 60

5.4.1 Resultados de %CV.. ...................................................................................................... 62

5.4.2 Velocidad específica de crecimiento microbiano.. ........................................................... 63


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ix

5.5 Selección de las mejores condiciones para producir Trichoderma spp. ............................... 63

5.5.1 Análisis comparativo del % de humedad......................................................................... 63

5.5.2 Análisis comparativo de la concentración.. ..................................................................... 64

5.5.3 Análisis comparativo del coeficiente de variación (%CV).. ............................................. 65

5.5.4 Selección de las mejores condiciones.. ............................................................................ 66

5.6 Resultados de aplicación del hongo Trichoderma spp. ....................................................... 66

6. DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 68

7. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 70

8. RECOMENDACIONES ..................................................................................................... 72

CITAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................... 73

BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................... 77

ANEXOS................................................................................................................................ 79


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x

LISTA DE FIGURAS

pág

Figura 1. Hifa mostrando los principales organelos celulares. .................................................... 3

Figura 2. Estructura del 6-pentil-α-pirona .................................................................................. 5

Figura 3. Características macroscópicas de Trichoderma spp..................................................... 6

Figura 4. Características microscópicas de Trichoderma spp. .................................................... 7

Figura 5. Trichoderma harzianum ............................................................................................. 8

Figura 6. Trichoderma hamatum ............................................................................................... 8

Figura 7. Tipos de sustratos ..................................................................................................... 12

Figura 8. Curva de crecimiento microbiano ............................................................................. 16

Figura 9. Diseño experimental para la producción de esporas y construcción de la

curva de crecimiento del hongo Trichoderma harzianum (TH) ................................................ 22

Figura 10. Diseño experimental para la producción de esporas y construcción de la

curva de crecimiento del hongo Trichoderma hamatum (THa). ................................................ 23 Figura 11. Diagrama de flujo del proceso de producción de Trichoderma spp. ......................... 26

Figura 12. Diluciones seriadas ................................................................................................. 29

Figura 13. Cámara de Neubauer .............................................................................................. 30

Figura 14. Divisiones de la zona de conteo .............................................................................. 30

Figura 15. Recuento con alta concentración celular ................................................................. 31

Figura 16. Aplicación en plantas de fresas ............................................................................... 66

Figura 17. Resultados luego de un mes de aplicación en plantas de fresa ................................. 67

Figura 18. Aplicación de los microorganismos en plantas de mora........................................... 67 Figura 19. Resultados luego de 50 días de aplicación en plantas de moras ............................... 67


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xi

LISTA DE GRÁFICOS

pág

Gráfico 1. logC = f (Va) para Trichoderma harzianum............................................................. 48

Gráfico 2. logC = f (Va) para Trichoderma hamatum ............................................................... 49

Gráfico 3. logC = f (%H) para Trichoderma harzianum........................................................... 49

Gráfico 4. logC = f (%H) para Trichoderma hamatum............................................................. 50

Gráfico 5. logC = f (tiempo) para Trichoderma harzianum a condición 1................................. 57



Gráfico 8. logC = f (tiempo) para Trichoderma hamatum a condición 1 ................................... 58

Gráfico 9. logC = f (tiempo) para Trichoderma hamatum a condición 2 ................................... 59

Gráfico 10. logC = f (tiempo) para Trichoderma hamatum a condición 3 ................................. 59

Gráfico 11. Velocidad de crecimiento de Trichoderma harzianum a condición 1 ..................... 60

Gráfico 12. Velocidad de crecimiento de Trichoderma harzianum a condición 2 ..................... 60 Gráfico 13. Velocidad de crecimiento de Trichoderma harzianum a condición 3 ..................... 61

Gráfico 14. Velocidad de crecimiento de Trichoderma hamatum a condición 1 ....................... 61



Gráfico 17. Análisis comparativo de la humedad ..................................................................... 64

Gráfico 18. Análisis comparativo de la concentración de esporas............................................. 65

Gráfico 19. Análisis comparativo del coeficiente de variación ................................................. 65


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xii

LISTA DE TABLAS

pág

Tabla 1. Comparación entre la fermentación líquida y sólida ................................................... 15

Tabla 2. Volumen de agua adicionada en la preparación del sustrato ....................................... 19

Tabla 3. Número de repeticiones realizadas ............................................................................. 21

Tabla 4. Datos de las sustancias utilizadas ............................................................................... 33

Tabla 5. Datos de preparación del sustrato para TH en camineras ............................................ 33

Tabla 6. Datos de preparación del sustrato para THa en camineras .......................................... 33

Tabla 7. Datos de concentración del inóculo para siembra en camineras .................................. 34

Tabla 8. Datos del recuento celular de TH en camineras .......................................................... 34

Tabla 9. Datos del recuento celular de THa en camineras ........................................................ 35

Tabla 10. Datos de preparación del sustrato para TH en fundas ............................................... 35

Tabla 11. Datos de preparación del sustrato para THa en fundas .............................................. 36

Tabla 12. Datos de concentración del inóculo para siembra en fundas...................................... 36 Tabla 13. Datos de contaje de esporas para Trichoderma harzianum........................................ 37

Tabla 14. Datos de contaje de esporas para Trichoderma hamatum .......................................... 38

Tabla 15. Función estimación lineal para los dos microorganismos.......................................... 43

Tabla 16. Resultados de preparación del sustrato para TH en camineras .................................. 46

Tabla 17. Resultados de preparación del sustrato para THa en camineras ................................. 46

Tabla 18. Resultados de humedad del sustrato para TH ........................................................... 47

Tabla 19. Resultados de humedad del sustrato para THa .......................................................... 47

Tabla 20. Resultados de la concentración obtenida de TH en camineras................................... 47 Tabla 21. Resultados de la concentración obtenida de THa en camineras ................................. 48

Tabla 22. Resultados de volumen de agua óptima para TH ...................................................... 50

Tabla 23. Resultados de volumen de agua óptima para THa..................................................... 51

Tabla 24. Resultados de cantidad de agua total en el sustrato de TH ........................................ 51

Tabla 25. Resultados de cantidad de agua total en el sustrato de THa....................................... 51

Tabla 26. Resultados del %H a las diferentes condiciones ....................................................... 52

Tabla 27. Resultados de concentración de TH ......................................................................... 53

Tabla 28. Resultados de concentración de THa ........................................................................ 54


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xiii

Tabla 29. Resultados del logaritmo de la concentración para TH ............................................. 55

Tabla 30. Resultados del logaritmo de la concentración para THa............................................ 56

Tabla 31. Resultados estadísticos corregidos ........................................................................... 63

Tabla 32. Resultados de velocidad específica de crecimiento ................................................... 63

Tabla 33. Promedio de la Concentración ................................................................................. 64

Tabla 34. Mejores condiciones de crecimiento ........................................................................ 66


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xiv

LISTA DE ANEXOS

pág

ANEXO A. Taxonomía de Trichoderma spp. .......................................................................... 80

ANEXO B. Biograma Microbiano .......................................................................................... 81

ANEXO C. Norma INEN 1690 ............................................................................................... 82

ANEXO D. Materiales necesarios ........................................................................................... 83

ANEXO E. Propagación de Trichoderma en cajas Petri ........................................................... 84

ANEXO F. Preparación del sustrato ........................................................................................ 85

ANEXO G. Esterilización del sustrato ..................................................................................... 86

ANEXO H. Preparación del inóculo ........................................................................................ 87

ANEXO I. Inoculación del sustrato ......................................................................................... 88

ANEXO J. Determinación de la concentración de esporas ....................................................... 89

ANEXO K. Incubación de las especies .................................................................................... 90


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xv

SIMBOLOGÍA

TH Trichoderma harzianum

THa Trichoderma hamatum

mab masa de agua absorbida por el sustrato

mH+c masa húmeda más cedazo

mc masa del cedazo

ms masa del sustrato (arrocillo)

Va volumen de agua adicionado

Vab volumen de agua absorbido

Vad volumen de agua adicionado

ma masa de agua para preparar el sustrato

mat masa de agua total

mas masa de agua en el arrocillo

mss masa del sustrato seco

%H humedad expresado en porcentaje

C concentración de esporas Ne Número de esporas contadas

D Dilución

T Temperatura

t tiempo

μ velocidad de crecimiento

Sμ Desviación de la pendiente

%CV Coeficiente de variación

logC logaritmo base 10 de la concentración ̅ Concentración promedio

Vop Volumen óptimo

UFC Unidades formadoras de colonias


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xvi

ESTUDIO DEL ADECUADO CRECIMIENTO DEL HONGO TRICHODERMA

HARZIANUM Y TRICHODERMA HAMATUM EN SUSTRATO SÓLIDO

RESUMEN

Se establecieron las mejores condiciones de crecimiento de los hongos Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum, en arrocillo usado como sustrato sólido. Para ello, se utilizaron cepas

nativas del cantón Ambato, aisladas del suelo por el MAGAP-Tungurahua y purificadas por la

empresa “Plantsphere Laboratories (PSL)”. Se trabajó experimentalmente con cuatro

humedades de sustrato, para la primera especie: 39,6%; 37,7%; 35,7% y 33,2%, para la

segunda: 41,3%; 38,2%; 34,8% y 31%. Las esporas se incubaron a tres temperaturas: ambiente

(21°C), 25°C y 28°C, con exposición natural de luz. Con las mejores humedades obtenidas para

cada especie y temperatura, a partir de las curvas de concentración de esporas versus humedad,

se procedió a una nueva inoculación, que permitió determinar la velocidad de desarrollo deestos microorganismos, mediante las curvas de crecimiento.

Se concluye que a 25°C y 41,3% de humedad, se reduce el tiempo de producción de estos

hongos, obteniendo para las dos especies un valor máximo de 1,5x107 UFC/mL a los 12 días de

incubación.

PALABRAS CLAVES: / CRECIMIENTO / HONGOS / TRICHODERMA HARZIANUM /

TRICHODERMA HAMATUM / SUSTRATO SÓLIDO / TEMPERATURA DE INCUBACIÓN/


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STUDY OF THE APPROPRIATE GROWTH OF THE FUNGI TRICHODERMA

HARZIANUM AND TRICHODERMA HAM ATUM IN A SOLID SUBSTRATE

ABSTRACT

The best conditions were established for the growth of the Trichoderma harzianum and

Trichoderma hamatum fungi, in jungle-rice used as a solid substrate. To achieve this, native

strains from the area of Ambato were used, isolated in the ground by the MAGAP-Tungurahua

(Ministry of Agriculture, Livestock, Aquaculture and Fishing – Tungurahua branch) and

purified by the company “Plantsphere Laboratories (PSL)”. The work was done experimentally

using four levels of substrate moisture, for the first specie: 39,6%; 37,7%; 35,7% and 33,2%; for

the second one: 41,3%; 38,2%; 34,8% and 31%. The spores were incubated at three different

temperatures: environment (21°C), 25°C and 28°C, with natural exposure to light. With the best

moisture for each specie and temperature, and using the curves of spore concentration versusmoisture level, a new inoculation was performed, which allowed the determination of the

growth rate presented by these microorganisms, with the application of growth curves.

The conclusion is that at 25°C and 41,3% moisture level, the production rate presented by these

fungi is reduced, obtaining in both species a maximum value of 1,5x107 UFC/mL after 12 days

of incubation.

KEYWORDS: / GROWTH / FUNGI / TRICHODERMA HARZIANUM / TRICHODERMA

HAMATUM / SOLID SUBSTRATE / INCUBATION TEMPERATURE /


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1

INTRODUCCIÓN

El Ecuador es considerado un país netamente agrícola. Grandes extensiones de tierras son

cultivadas para satisfacer la demanda de los consumidores, que día tras día se incrementa por el

constante crecimiento de la población. Los agricultores elevan la productividad del campo,

garantizan sus cosechas utilizando elevadas cantidades de plaguicidas, para controlar las

enfermedades de las plantas, siendo perjudiciales para los consumidores y el medio ambiente.

Además con el paso del tiempo este uso indiscriminado de productos tóxicos se ha vuelto

ineficaz, induciendo a la generación de plagas resistentes y difíciles de controlar.

La conciencia social que se ha generado en los últimos años ante el enorme deterioro

medioambiental por el uso abusivo de compuestos contaminantes, ha generado un gran interés

en la búsqueda de nuevas estrategias de producción, que sean ambientalmente sostenibles para

el control de plagas y enfermedades.

Una de las alternativas más innovadoras para garantizar la seguridad alimentaria, para disminuir

los residuos tóxicos, los contaminantes del suelo y los recursos hídricos que alteran el equilibrioecológico es la utilización del control biológico, un método que recurre a la ayuda de

microorganismos antagonistas de los agentes infecciosos para controlarlos de forma natural.

En el suelo se encuentran una gran cantidad de microorganismos benéficos, entre estos el hongo

Trichoderma. Constituyen un grupo de microorganismos filamentosos, que producen sustancias

antibióticas, metabolitos antifúngicos, son competidores por espacio y nutrientes frente a otros

microorganismos. Protegen las raíces de las plantas, desdoblan la materia orgánica facilitando la

asimilación de nutrientes, son fáciles de aislar, crecen en una amplia gama de sustratos siendofactible su propagación masiva. También tiene capacidad de adaptación y supervivencia en

cultivos de alta contaminación producida por fungicidas.

El interés actual de disminuir el impacto ambiental con producciones más limpias para proteger

los recursos naturales ha generado que hace poco tiempo estas especies adquieran un valor

comercial importante. Aunque en el mercado mundial ya se cuentan con formulados a base de

Trichoderma para el control de microorganismos, en el país existe muy poca información. Por


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2

tal razón este proyecto consiste en el estudio de la adecuada producción masiva de dos especies

endémicas del cantón Ambato, Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum en sustrato

sólido, con ayuda de curvas de crecimiento desarrolladas a condiciones controladas.

En el crecimiento de estos hongos se estudiaron dos variables esenciales que son; la cantidad de

agua para la preparación del sustrato y la temperatura de incubación, permitiendo generar mayor

producción de esporas en un menor tiempo. Como primer punto se replicó las especies en cajas

Petri, luego se multiplicó en botellas de vidrio “camineras” y finalmente en fundas de

polietileno.

Se realizó ensayos de humedad del sustrato para determinar el mejor valor, además para generar

comparaciones las especies fueron sometidas a tres temperaturas: al ambiente (21°C), 25°C y

28°C, dando como resultado una máxima concentración de esporas a la humedad del 41,3% y

temperatura de 25°C a los doce días de tratamiento.

Como etapa final los biofungicidas obtenidos, fueron aplicados en plantas de moras y fresas

dando como resultado mayor rapidez de desarrollo, mejor intensidad del color y brillo,

indicativos de que plantas se encuentran sanas y que los microorganismos estudiados si ejercen

un efecto positivo en ellas.

Este análisis además de generar información propia y vital para el laboratorio, permitió conocer

el comportamiento de los microorganismos frente a los tratamientos realizados y optimizar dos

variables del proceso productivo, obteniendo un bio fungicida que ejercerá una acción efectiva

en los diferentes cultivos donde sean aplicados, logrando cosechas más sanas.


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3

1. MARCO TEÓRICO

1.1 Los hongos

Son microorganismos eucarióticos, heterótrofos, que requieren de compuestos orgánicos para su

nutrición. Secretan enzimas hidrolíticas, como lipasas, pectinasas y proteinasas que ayudan a

descomponer una gran variedad de sustratos, para absorber los nutrientes que hay en las hojas

muertas y otros materiales orgánicos del suelo.

Se alimentan de materia orgánica muerta, por lo que se les conoce como saprofitos, estos

generalmente no causan enfermedades. Solo descomponen restos complejos de vegetales y

animales, degradándolos a sustancias químicas más sencillas que son devueltas al suelo,

aumentando así su fertilidad. [1]

Algunos hongos pueden prosperar como parásitos invadiendo a sus hospedadores vivos

causando enfermedades (hongos patógenos) en plantas, animales y seres humanos. Los hongos

fitopatógenos ejercen un gran impacto económico en la industria agrícola debido a lasenfermedades que les pueden causar a los cultivos.

Poseen una pared celular que contiene quitina, están formados por largas fibras ramificadas,

llamadas hifas, las cuales forman el cuerpo principal del hongo o micelio. En la figura 1 se

indica una hifa con los principales organelos celulares.[2]

Figura 1. Hifa mostrando los principales organelos celulares.


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4

Las hifas están rodeadas de una pared celular en forma de tubo que rodea una cavidad central o

lumen, donde se encuentra el protoplasma. La pared es de consistencia rígida y está compuesta,

principalmente, de hemicelulosa y quitina (dos polímeros fibrilares, el primero de N-

acetilglucosamina y el segundo de glucosa). [3]

La reproducción puede ser: [4]

1) Asexual, por fisión binaria, gemación o formación de esporas

2) Sexual, por fusión de los núcleos de dos células afines.

Se desarrollan prácticamente sobre cualquier sustrato pero necesitan de humedad, la cual la

obtienen de la atmósfera o del medio sobre el cual están creciendo. Si las condiciones son

adversas y el hábitat se vuelve muy seco, estos sobreviven entrando en una fase latente o

produciendo esporas resistentes a la deshidratación.

Los hongos alcanzan un óptimo desarrollo en ambientes oscuros y húmedos con temperaturas

entre 22 y 30°C aunque algunos pueden crecer a temperaturas tan altas como 62 °C, tan bajas

como 0 °C o menos y toleran amplios rangos de pH de 2 a 9 pero casi todos crecen mejor en un

pH ácido. [5]

Son importantes porque permiten la elaboración de pan, cerveza, quesos maduros, bebidas

espirituosas (vinos, champañas), son la base de medicinas como la penicilina, se utilizan en la

biorremediación, en la agricultura, la horticultura y la silvicultura. Pero pueden ser dañinos

cuando pudren madera, textiles, papel, alimentos, etc. [6]

1.2 Trichoderma spp.

Las especies de este género se encuentran ampliamente distribuidas por todas las latitudes, y se presentan naturalmente en diferentes ambientes, especialmente en aquellos que contienen

materia orgánica o desechos vegetales en descomposición. [7]

Este beneficioso hongo es filamentoso, heterótrofo, aerobio, su pared celular está compuesta de

quitina, coloniza fácilmente las raíces de las plantas, las mejora e impide que nuevos hongos

colonicen la zona donde éste se desarrolla. Son los antagonistas más utilizados para el control

biológico debido a su facilidad para ser aisladas y cultivadas en un gran número de sustratos.

Además no son patógenos de plantas, ni peligrosos para los humanos o animales.


22/107

5

Su presencia puede ser detectada por un ligero olor a coco en el sustrato, así como por su color

verde y blanquecino. Producen enzimas y vitaminas, “antibióticos” que al ser absorbidos por las

raíces de las plantas generan un crecimiento más rápido. En ciertos casos el antibiótico formado

es específico contra el patógeno de las plantas, garantizando así su eficacia.

La población de Trichoderma decrece especialmente cuando la humedad del ambiente

desciende por largos períodos de tiempo. Otros estudios han determinado que el pH, la

concentración de CO2, HCO3, sales y el contenido de materia orgánica son factores físicos y

químicos determinantes para la variación de la cantidad de estas especies, además de la

presencia o ausencia de otros microorganismos en el ambiente. [8]

Trichoderma spp. durante su proceso de producción genera metabolitos volátiles antifúngicos

como la lactona 6-pentil -α-pirona (6PAP) con aroma a coco, que es un líquido de color amarillo

a naranja, tiene la fórmula molecular C10H14O2. La figura 2 presenta la estructura del 6PAP.[9]

CH3(CH2)3CH2 O O

Figura 2. Estructura del 6-pentil-α-pirona

1.2.1 Clasif icación Taxonómica. Las especies del género Trichoderma spp. pertenecen a un

grupo de hongos filamentosos que han sido caracterizados por sus aplicaciones en el sector

agrícola como controladores biológicos de una amplia gama de organismos patógenos.

La clasificación taxonómica del género Trichoderma es:

[10]

Reino: Fungi

División Ascomycota

Subdivisión: Pezizomycota

Clase: Sordariomycetes

Orden: Hypocreales

Familia: Hypocreaceae

Género: Trichoderma


23/107

6

1.2.2 Reproducción . Las especies Trichoderma spp. se reproduce asexualmente, pueden utilizar

una gran variedad de sustratos complejos como celulosa, quitina, pectina y almidón como fuente

de carbono. Muchas cepas crecen eficientemente en medios sólidos o líquidos y en un amplio

rango de temperaturas, son relativamente tolerantes a humedades bajas y crecen en suelos

ligeramente ácidos.

1.2.3 Morfología .

1.2.3.1 Car acterísticas macroscópicas . Las colonias se reconocen fácilmente por su rápido

crecimiento y sus coloraciones son: blancas – verdes o amarillo – verdosas; las áreas con

colonias se presentan con anillos concéntricos. El revés de las colonias son usualmente de

colores, amarillo, ámbar o amarillo – verde. En la figura 3 se observan las características que

presenta Trichoderma. [11]

Figura 3. Características macroscópicas de Trichoderma spp.

1.2.3.2

Car acterísticas microscópicas.

Conidióforos. Son erectos, hialinos, no verticilados, en su mayoría ramificados, parecen un

árbol pequeño con un sistema de ramas irregulares de manera piramidal y pueden estar

solitarios o en grupos (figura 4). [12]

Fiálides. Son en forma de botella, pueden estar solas o en grupos, hinchada en la región

central pero delgada hacia el ápice: son hialinas y en ángulo recto con respecto a los


24/107

7

conidióforos. Es donde se forman las esporas asexuales o conidios, de gran importancia para

la identificación taxonómica a nivel de especies. [13]

Conidios. Son esporas asexuales de color verde – amarillo – blanco, con esporulación densa

que aseguran la generación del hongo durante gran parte del período vegetativo de las

plantas. Su pared está compuesta por quitina y glucanos. Su función es la reproducción

rápida, dispersión y supervivencia. [14]

Figura 4. Características microscópicas de Trichoderma spp.

La mayoría de las especies de Trichoderma tienen la capacidad de producir clamidosporas en

sustratos naturales, estructuras de vital importancia para la sobrevivencia del género en el suelo

ya que soportan condiciones ambientales adversas.

1.3 Tr ichoderma harzianum .

Sus colonias son de color amarillo verdoso (Figura 5). Interviene como digestor del nitrógeno

orgánico. Es tolerante a la tensión impuesta por escasez de nutrientes, se utiliza en el control

biológico como fungicida, en aplicación foliar, tratamiento de semillas y el tratamiento del suelo

para la supresión de diversos patógenos que provocan enfermedades fúngicas. También controla

el marchitamiento (una enfermedad que mata las plantas jóvenes, ennegreciendo y encogiendo

los tallos). [15]


25/107

8

Figura 5. Tr ichoderma harzianum

Penetra las raíces de las plantas sin causar daños, provocando cambios bioquímicos y formación

de barreras físicas. Los metabolitos que produce esta especie se encuentran relacionados con la

composición del medio en el que se encuentra, es decir los nutrientes que tiene disponible.

Disminuye su población conforme aumenta la altura sobre el nivel del mar. Su ambiente óptimo

son climas templados. [16]

1.4 Tr ichoderma hamatum

Al ser incorporada en el suelo adquiere un potencial como agente de biocontrol, regulando

poblaciones de nemátodos que generan un especie de marchitamiento de las plantas dañando las

raíces e impidiendo la absorción de los nutrientes. Por tal motivo mejora la supervivencia de las

plantas de caña de azúcar, de tomate de árbol, de plátano, de papa, etc. En la figura 6 se observa

a esta especie. [17]

Figura 6. Tr ichoderma hamatum


26/107

9

1.5 Mecanismos de Acción

El hongo Trichoderma presenta distintos mecanismos de acción para ejercer su antagonismo,

dependiendo de las características de la cepa de Trichoderma, del patógeno y las condiciones

ambientales, entre estos tenemos competencia, parasitismo y antibiosis.

1.5.1 Competencia . Para que exista competencia es necesario la escasez o limitación de un

requerimiento (espacio y/o nutrientes), por lo que la competencia puede definirse como el

comportamiento desigual de dos o más organismos ante un mismo requerimiento, siempre y

cuando la utilización por uno de ellos, reduzca la cantidad necesaria para los demás. [18]

La presencia natural de Trichoderma en diferentes ambientes demuestra que son excelentes

competidores por espacio y recursos nutricionales. Este modo de acción se ve favorecido por la

velocidad de crecimiento que presentan la mayoría de estas especies que frenan el desarrollo a

los competidores.

1.5.2 M icoparasiti smo. Se refiere al hecho de que un microorganismo parasita a otro, en este

caso a un patógeno de plantas. Consiste en la utilización del patógeno como alimento por su

antagonista. [19]

Trichoderma es un hongo muy favorable porque no ataca a los seres vivos. Producen enzimas

como la β-1,3-glucanasa que ayudan a degradar las paredes celulares de las hifas del hongo a

destruir (huésped), consiguiendo así absorber los nutrientes del interior del hongo atacado.

En Biocontrol (2004) se indica que el proceso micoparasítico incluye las siguientes etapas: [20]

Crecimiento de Trichoderma. Reconocimiento superficial del huésped.

Secreción de enzimas.

Penetración de las hifas.

Lisis del huésped.

1.5.3 Antibiosis. Se define como la inhibición del crecimiento de un microorganismo por

sustancias producidas y liberadas por otro microorganismo.


27/107

10

“Los metabolitos con actividad antifúngica secretados por Trichoderma constituyen un grupo de

compuestos volátiles y no volátiles, muy diverso en cuanto a estructura y función. Muchas cepas

de Trichoderma producen estos metabolitos secundarios, algunos de los cuales inhiben otros

microorganismos, con los que no se establece contacto físico, estas sustancias inhibitorias son

consideradas como antibióticos”. [21]

1.6 Factores que influyen en el crecimiento

1.6.1 Temperatura . La temperatura influye notablemente en el crecimiento fúngico y en la

formación y germinación de conidios. El rango de temperatura para el crecimiento de

Trichoderma se encuentra entre 10 - 40°C y tiene su óptimo de crecimiento alrededor de los 25

y 30°C. Pueden soportar temperaturas extremas y, aunque no pueden crecer, sus conidios se

mantienen viables y germinarán cuando recuperen las condiciones apropiadas. El descenso de la

temperatura provoca una ralentización del metabolismo, y es una medida que se utiliza para

frenar, en general, el deterioro de productos almacenados. [22]

1.6.2 Humedad . La actividad metabólica del hongo depende estrechamente de la humedad del

medio (sustrato), ya que esta variable influye significativamente en el crecimiento microbiano,

en la biosíntesis y la secreción de diferentes metabolitos.

Un bajo contenido de humedad limita la difusión de los nutrientes y la degradación del sustrato,

dando como resultado un bajo crecimiento microbiano. Mientras que, altos valores de humedad

en la matriz sólida disminuye la porosidad del sustrato dificultando la transferencia de oxígeno.

Por este motivo, es conveniente buscar el nivel óptimo de humedad con el objeto de optimizar el

crecimiento del microorganismo o, en su caso, obtener una mayor producción de metabolitos

(enzimas, ácidos orgánicos, etc.).

[23]

En general, los contenidos de humedad encontrados en los procesos de fermentación sólida se

encuentran entre el 30% y 85%. Para cultivos bacterianos, la humedad del sustrato debe ser

superior al 70%, mientras que en el caso de los hongos filamentosos, ésta podría encontrarse en

un rango que oscila entre el 20% y el 70%. [24]

1.6.3 Aireación . Dos componentes del aire son esenciales para los hongos: el oxígeno y el

dióxido de carbono, sin embargo es necesario tener en cuenta que altas concentraciones de CO 2


28/107

11

como resultado de la respiración celular se puede acumular en ambientes cerrados, inhibiendo el

crecimiento de este microorganismo. [25]

1.6.4 pH . El hongo Trichoderma soporta un rango de pH relativamente amplio para su

crecimiento. Presenta crecimiento a valores de pH comprendidos entre 2.0 y 9.0, con un

intervalo de pH óptimo que se encuentra entre 4.0 y 7.0. A pH ácido, la asimilación de

nutrientes como glucosa ejerce una influencia importante sobre el crecimiento del hongo y su

posterior esporulación. Además, procesos como la germinación, se ven afectados por la escasez

de nutrientes y por niveles de pH por encima de 9.0. [26]

1.6.5 Tamaño de partícula del sustrato . El tamaño de partícula es un factor importante a tener

en cuenta. Los sustratos de partículas pequeñas proporcionan una gran área específica, lo que

afecta de manera positiva al desarrollo del microorganismo. Sin embargo, un tamaño de

partícula demasiado pequeño, que genere a su vez un espacio interarticular reducido, disminuye

la eficiencia de la respiración/aireación dificultando el crecimiento microbiano. [27]

1.6.6 Exposición de luz . La mayoría de especies del género Trichoderma son fotosensibles,

puesto que se presentan una mayor esporulación al ser expuestas a la luz. Sin embargo, cuando

se someten a períodos alternados de luz y oscuridad, se favorece la colonización del hongo

sobre diferentes sustratos sólidos. [28]

1.7 Los hongos en el control biológico

El control biológico puede definirse como un método de control de plagas, enfermedades y

malezas que consiste en utilizar organismos vivos con objeto de controlar las poblaciones de

otros organismos. Tienen una serie de ventajas como: son más seguros, pueden persistir durante

más tiempo, producen un balance ecológico.

El control biológico se produce de forma natural sin intervención del hombre, permite modificar

el equilibrio entre las poblaciones microbianas gracias a los mecanismos de acción entre los

patógenos y los microorganismos antagonistas. Los hongos poseen un conjunto de

características que los hacen agentes de biocontrol potencialmente ideales. [29]

1. Muchas de las especies saprofitas antagonizan a la mayoría de los organismos de las plagas.


29/107

12

2. Se desarrollan fácilmente en medios de cultivo pudiendo producirse en grandes cantidades y

ser liberados al medio ambiente como esporas o fragmentos de micelio.

3. Los inóculos liberados crecerán y producirán un nuevo micelio que parasitará o inhibirá la

plaga sin causar daño a las plantas.

4.

Tienen la facilidad de sobrevivir durante períodos de tiempo relativamente largos.

5. Los compuestos biológicamente activos no causan daño al medio ambiente.

1.8 Sustratos en la producción de Trichoderma spp.

Los sustratos empleados para la producción de microorganismos, en lo posible deben contener

todos los elementos necesarios para una adecuada síntesis del material celular y para la

producción de metabolitos, cuando son requeridos. [30]

En el proceso de esporulación de Trichoderma spp. la fuente de carbono (C) presente en el

sustrato es el reactivo en exceso, mientras que el contenido de nitrógeno (N) es el factor

limitante de crecimiento. La relación carbono: nitrógeno es esencial ya que de este balance

dependerá la formación de las esporas deseadas. [31]

Generalmente se utilizan compuestos procedentes de la agricultura, subproductos de la

agroindustria aunque se prefiere el desecho de compuestos orgánicos debido a que suplen la

demanda de nutrientes requeridos por los microorganismos a un bajo costo. En la figura 7 se

indican algunos tipos de sustratos. [32]

Figura 7. Tipos de sustratos


30/107

13

Arroz. Es el cereal más rico en almidón y la estructura química de este es relativamente

sencillo comparado con otros sustratos.

Esencialmente el almidón está compuesto de dos polímeros relacionados en diferentes

proporciones: amilosa (16 – 30%) y amilopectina (68 – 85%). La amilosa es un polímero de

glucosa unido por enlaces α-1,4 glucosídicos principalmente cadenas lineales. La

amilopectina es un polímero de glucosa altamente ramificado incluyendo también enlaces

α-1,6 glucosídicos en los puntos de ramificación. De esta manera el hongo Trichoderma

spp., hidroliza el polímero del almidón mediante enzimas como glucoamilasas, α –

amilasas, β – amilasas, [33] permitiendo el crecimiento micelial y la producción de esporas.

1.9 Fermentación

Desde el punto de vista microbiológico, se entiende por fermentación aquel proceso en el que

los microorganismos producen metabolitos o biomasa, a partir de la utilización de sustancias

orgánicas, en ausencia o presencia de oxígeno. La descomposición de los sustratos se lleva a

cabo por enzimas producidas por los microorganismos. [34]

Los microorganismos implicados en los procesos fermentativos pueden obtener su energía y su

fuente de carbono por la degradación de los compuestos orgánicos. La producción comercial de

productos de fermentación ha empleado principalmente diversas especies de bacterias,

levaduras y hongos. En general, la producción masiva de microorganismos biocontroladores

puede llevarse a cabo mediante dos técnicas: fermentación líquida o sumergida y fermentación

sólida o en superficie. [35]

1.9.1 Fermentación en medio líqui do . También es conocida como fermentación sumergida. En

este proceso se da la producción de microorganismos en medio líquido donde todos losnutrientes están disueltos en el medio de cultivo y se desarrolla por medio de condiciones

fisicoquímicas. [36]

Este método es el más usado por la industria biotecnológica gracias a las siguientes ventajas: se

obtiene un producto más homogéneo, es más sencillo el control de la temperatura, aireación,

agitación, y pH, además se puede llevar a cabo la medición directa de la biomasa. [37]


31/107

14

1.9.2 Fermentación en medio sól ido . Las fermentaciones en sustratos sólidos, utilizadas para el

cultivo de microorganismos en materiales sólidos que contienen o no una cantidad limitada de

agua libre, se emplea en la obtención de enzimas fúngicos por cultivo en superficie. En este

proceso el sustrato sirve como soporte para que los microorganismos crezcan sobre él. Presenta

algunas ventajas como un menor costo de inversión, la reducción del costo energético y un

menor volumen de aguas residuales producidas. [38]

La técnica de fermentación en medio sólido consiste de las siguientes etapas: [39]

1. Preparación de la mezcla sólida

2. Reducción de la carga microbiana del sustrato mediante la inyección directa de vapor de

agua o por esterilización en autoclave

3. Inoculación de la matriz sólida con un inóculo líquido

4. Ajuste de la humedad y pH

5. Puesta del medio en el fermentador

6. Inyección continua o intermitente de aire a temperatura y humedad controladas

7. Secado hasta obtener la humedad residual

8. Molienda o adecuación de tamaño de partícula

9. Obtención del ingrediente activo.

Los hongos filamentosos son los microorganismos más adaptados para crecer en sustratos

sólidos con un bajo contenido de agua libre, reduciendo la probabilidad de contaminación por

bacterias o levaduras: además tienen la capacidad de utilizar polisacáridos como fuentes de

carbono.

1.9.3 Comparación entre la fermentación en medio sól ido y en medio líqui do. En la tabla 1 se

observan las diferencias que presenta estas fermentaciones.

[40]


32/107

15

Tabla 1. Comparación entre la fermentación líquida y sólida

Factor Fermentación líquida Fermentación sólida

Sustratos Sustratos solubles (azúcares)

Sustratos económicos de carácter

agroindustrial y biopolímeros

insolubles (almidón, celulosa,

pectina, lignina)

Agua Elevado consumo de aguaConsumo limitado de agua y baja

actividad de agua

TemperaturaFácil control de la temperatura,

alta transferencia de calor

Capacidad de transferencia de calor

bajo

Aireación

Se requiere la inyección de altos

volúmenes de aire, el oxígeno

soluble es limitado

Fácil aireación y elevada superficie

de intercambio de aire / sustrato

Control de pHFácil control de pH por la

homogeneidad del sistema

Difícil control de pH. Se deben

emplear sustancias o sustratos con

propiedades amortiguadoras

Agitación

Mecánica

Se requiere para lograr una buena

homogenizaciónSe opera bajo condiciones estáticas

EscalamientoDisponibilidad de equipos a nivel

industrial

Necesita el diseño de nuevos equipos

y de un desarrollo ingenieril

InoculaciónFácil inoculación, proceso

continuoLa inoculación de esporas es por lote

ContaminaciónAlto riesgo de contaminación

bacteriana

El bajo contenido de humedad hace

menos probable la contaminación por

bacterias

Gasto EnergéticoGenera un elevado consumo

energético

Los requerimientos de energía son

bajos

Tamaño y volumen

del equipo

Se manejan altos volúmenes y lainversión en equipos y tecnología

es elevada

Se manejan volúmenes más bajos y

el costo de los equipos es menor

Efluentes y

contaminación

Altos volúmenes de efluentes y

contaminación

Bajos volúmenes de efluentes y

contaminantes

Concentración del

producto

Dependiendo del producto de

interés

Fácil producción de propágulos y

esporas fúngicas


33/107

16

1.10 Curva de crecimiento microbiano

Esta curva representa el comportamiento del crecimiento del microorganismo a través del

tiempo. En la figura 8, se muestran las fases de crecimiento de los microorganismos. [41]

Figura 8. Curva de crecimiento microbiano

En la curva de crecimiento se diferencian cuatro fases, la fase de latencia, la fase de crecimiento

exponencial o logarítmico, la fase estacionaria y la fase de muerte celular. Aunque el tiempo de

duración de cada una de estas etapas, puede variar según el tipo de microorganismo, la familia ala cual pertenece, entre otras características.

A) Fase de latencia.

También es conocida como fase lag; coincide con el período de adaptación del microorganismo

a las nuevas condiciones nutricionales y ambientales. Se presenta inmediatamente después de la

inoculación y su duración depende del estado fisiológico de la célula inoculada y de las

condiciones ambientales. Durante este periodo, el número de células no se incrementa, pues elmicroorganismo utiliza la energía disponible con el fin de sintetizar las enzimas que requiere

para su desarrollo en el nuevo medio.

B) Fase logarítmica.

Esta fase presenta mayor interés por ser la etapa donde las células se multiplican a la máxima

velocidad, su crecimiento puede ser cuantificado con base en el número de células que se

producen por unidad de tiempo (para levaduras y bacterias) o por el aumento en la biomasa por


34/107

17

unidad de tiempo (para hongos filamentosos). La velocidad de crecimiento durante este periodo

permanece constante y es independiente de la concentración del sustrato, siempre y cuando esta

sustancia se encuentre en exceso.

C)

Fase estacionaria.

En esta etapa, la velocidad de crecimiento (reproducción) del microorganismo es igual a la

velocidad de mortalidad. Si la población no se reproduce ni muere, el número de células

permanece constante y la longitud de la fase varía y depende del balance que logren las células

con el medio ambiente. Se llega a un período de equilibrio celular.

La fase estacionaria termina cuando se produce alguna de estas tres situaciones: los nutrientes se

agotan, las condiciones ambientales indispensables para la célula se modifican o cuando las

células produce metabolitos tóxicos que inhiben su reproducción.

D) Fase de muerte.

Se inicia cuando los nutrientes que están en el medio de cultivo no son suficientes para que el

microorganismo pueda producirse y aunque quedan células vivas, su número es superado por el

de las células muertas. También se debe a la acumulación de sustancias tóxicas generadas por el

metabolismo del microorganismo.

1.11 Aplicaciones de Trichoderma spp.

El hongo Trichoderma es utilizado en la industria alimenticia ya que produce enzimas

hidrolíticas tales como glucanasas, quitinasas, proteasas, y xilanasas, que son usadas como

aditivos en la elaboración de alimentos para el ganado, aves y mascotas.

El hongo Trichoderma spp. también se usa ampliamente en la producción de aditivos

alimentarios y productos relacionados. Actualmente varias enzimas de este género son utilizadas

para mejorar el proceso de elaboración de la cerveza (β-glucanasa), y en la producción de zumos

de frutas (pectinasas, celulasas, hemicelulasas). Las celulasas son aplicadas principalmente en la

cocción, el malteado, y la producción de alcohol de grano. [42]

Las celulasas producidas por el hongo Trichoderma son utilizadas en la industria textil para

suavizar y acondicionar los textiles, así como para producir polvos de lavado de alta calidad.


35/107

18

Las enzimas obtenidas a partir de estos microorganismos también son usadas en la industria del

papel para modificar las propiedades de la fibra y para reducir el contenido de lignina. [43]

Se ha demostrado que algunas especies de Trichoderma tienen potencial para ser aplicadas en la

biorremediación de sitios contaminados con sustancias de origen orgánico (hidrocarburos del

petróleo, explosivos y plaguicidas) e inorgánico (metales pesados y cianuro). [44]

También existen reportes de T. polysporum, T.koningii, T. pseudokoningii y T. harzianum con

la capacidad para degradar hidrocarburos saturados y aromáticos presentes en aceites

combustibles. Así mismo, Trichoderma sp. se ha empleado para la detoxificación de cianuro

usando dos enzimas (rodanasa y cianuro hidratasa) capaces de degradarlo. [45]

La lanctona 6PAP con aroma a coco es considerada como un agente saborizante no tóxicoutilizado para la aromatización de artículos alimenticios, lo que le confiere importante interés

comercial en la industria de alimentos y aroma. Además tiene función antifúngica.


36/107

19

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1 Pruebas preliminares

Para el desarrollo de esta investigación se utilizaron cepas nativas de la provincia de

Tungurahua Cantón Ambato, aisladas del suelo por el Ministerio de Agricultura Ganadería

Acuacultura y Pesca (MAGAP), identificadas y purificadas por Plantsphere Laboratories. Las

especies a estudiar fueron: Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum. (Ver anexo A y

B).

Como medios de propagación se emplearon: Agar Patata Dextrosa (PDA) y arrocillo, El

primero usado para reproducir las especies en cajas Petri, como respaldo de la materia prima y

el segundo empleado en la producción masiva de estos microorganismos, esta etapa fue

enfocada en la preparación de sustrato (arrocillo).

El arrocillo fue sometido a cuatro tratamientos diferentes durante la preparación (Ver tabla 2),

los criterios considerados fueron: la baja cantidad de agua en el sustrato limita la accesibilidadde nutrientes obteniéndose un mínimo crecimiento y el exceso de humedad disminuye la

porosidad del sustrato dificultando la oxigenación.

Tabla 2. Volumen de agua adicionada en la preparación del sustrato

EspecieVolumen de agua adicionado (Va), mL

1 2 3 4

Trichoderma harzianum (TH) 367 330 295 255

Trichoderma hamatum (THa) 400 340 280 220

Primero se trabajó con Trichoderma harzianum para observar cómo se desarrolla a las

condiciones planteadas y finalmente se procedió con Trichoderma hamatum, incrementándose

el rango de volumen de agua adicionado al sustrato es su preparación, para determinar hasta qué

punto es fácilmente manipulable.


37/107

20

La siembra de los microorganismos en esta fase se realizó en botellas de vidrio (camineras)

conteniendo 80 gramos de sustrato cada una, con una concentración inicial de esporas (C i). En

la tabla 3 se muestra un resumen de las repeticiones realizadas en esta etapa.

La etapa de prueba inicial es indispensable en este proyecto. A partir de los datos obtenidos se

elaboraron curvas de concentración de esporas (logC) versus cantidad de agua adicionada al

arrocillo (Va) (Ver gráfico 1 y 2) para cada temperatura de incubación (T), importante en la

obtención de la mayor cantidad de esporas de los hongos a estudiar.

La incubación de los microorganismos se efectuó en vitrinas de vidrio, con la finalidad de

proveer luz natural al cultivo, en su base se acondicionó un foco para generar calor, este lugar se

cubrió con papel aluminio, creando un ambiente de periodos alternados de luz y obscuridad,

también se adecuó un sensor de temperatura para fijar esta variable de 25°C, 28°C y para la

temperatura a condición ambiental 21°C no se le suministró calor.

2.2 Diseño experimental

La investigación experimental está orientada al estudio del adecuado crecimiento de los

microorganismos Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum, en la cual se propone

modificar variables fundamentales como: cantidad de agua presente en la preparación del

sustrato y temperatura.

Las curvas obtenidas en las pruebas preliminares proporcionan datos óptimos de agua (Vop), los

cuales permitieron preparar el sustrato a una humedad establecida y generar un excelente

crecimiento las dos especies de Trichoderma. En la determinación del porcentaje de humedad

(%H), se incluyó también la humedad del arrocillo que establece la Norma INEN 1690 para su

comercialización.

En esta etapa se elaboraron las curvas de crecimiento para cada microorganismo, a las distintas

temperaturas planteadas, el proceso de propagación se efectuó en fundas de polietileno con 160g

de sustrato cada una, realizando varias repeticiones por precaución ante la contaminación de

microrganismos del ambiente y para verificar la repetibilidad del proceso. (Ver tabla 3).


38/107

21

Tabla 3. Número de repeticiones realizadas

EspecieTemperatura,

°C

Volumen de

agua,

mL

Pruebas

preliminares

Diseño

experimental

# botellas #fundas

21

1

36 102

Trichoderma 3

harzianum 4

25

1

36 10y 2

3

4Trichoderma

28

1

36 10hamatum 2

3

4

Total 96 30

En las figuras 9 y 10 para Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum respectivamente, se

muestra el diseño experimental utilizado en la producción de la mayor cantidad de esporas

(logC) de los microorganismos en un menor tiempo (t).


39/107

22

TH

T1

V2, Ci

V1, Ci

V3, Ci

V4, Ci

V2, Ci

V1, Ci

V3, Ci

V4, Ci

V2, Ci

V1, Ci

V3, Ci

V4, Ci

T2

T3

VoplogC = f(Va) logC = f(t)

VoplogC = f(Va)

Curva de

crecimiento

logC = f(t)

VoplogC = f(Va)

Curva de

crecimiento

logC = f(t)

Curva de

crecimiento

Figura 9. Diseño experimental para la producción de esporas y construcción de la curva de crecimiento del hongo Tr ichoderma harzianum (TH)


40/107

23

THa

T1

V2, Ci

V1, Ci

V3, Ci

V4, Ci

V2, Ci

V1, Ci

V3, Ci

V4, Ci

V2, Ci

V1, Ci

V3, Ci

V4, Ci

T2

T3

Vop

Vop

Curva de

crecimiento

logC = f(t)

Curva de

crecimiento

Curva de

crecimiento

logC = f(t)

logC = f(Va)

logC = f(Va)

logC = f(Va)

Vop

logC = f(t)

logC = f(t)

Figura 10. Diseño experimental para la producción de esporas y construcción de la curva de crecimiento del hongo Tr ichoderma hamatum

(THa).


41/107

24

2.3 Aplicación del hongo Trichoderma en plantas

Los mejores productos obtenidos de cada especie fueron aplicados en matas de fresas y moras,

teniendo en cuenta un testigo para observar las diferencias que presentan luego de un tiempo de

aplicación, proceso necesario para verificar que los microorganismos generados, sí, mantienen

sus características esenciales, de protección e inducción a un rápido crecimiento de las plantas.

Se utilizaron cinco plantas de fresas del mismo tamaño. A tres de ellas se aplicaron una mezcla

de las especies estudiadas, las dos restantes se las estableció como testigos. Para la aplicación en

plantas de moras se usaron tres plantas las cuales no fueron del mismo tamaño (Ver figura 18).

Sin embargo se consideró escoger a la planta más grande como testigo y a las restantes

adicionarles las especies Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum individualmente.

A las plantas utilizadas no se les adicionó ningún componente extra, a parte de los

microorganismos y tierra que contenía abono orgánico al momento de ser trasplantadas.

2.4 Materiales y equipos

Balanza R;(0 - 500)g Ap±0,1g

Vasos de precipitación V = 500mL Ap±100mL

Vasos de precipitación V = 100mL Ap±10mL

Frascos con tapa rosca V = 500mL Ap±100mL

Probeta graduada V = 100mL Ap±1mL

Pipeta graduada V = 25mL Ap±1mL

Pipeta Pasteur V = 3mL Ap±0,5mL

Pera de succión

Pisetas V = 500mL Ap±100mL

Cintas de pH R;(0 - 14) Ap±0,5mL Autoclave R;(100 - 133) °C Ap± 2,4 °C

R;(0 - 30)psi Ap±0,5psi

Termohigrometro R;( 0 - 50 ) °C Ap±0,1°C

R;(30 - 90) %HR Ap±1%

Tubos de ensayo

Atomizadores V = 500mL

Gradilla de plástico

Porta y cubre objetos

Microscopio óptico Aumento: 40X


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Cámara de Neubauer

Cámara de Siembra

Asa bacteriológica

Equipo de disección

Cajas Petri

Botellas de vidrio (camineras) V = 375mL

Mecheros de alcohol

Olla arrocera V = 1800mL

Embudo plástico mediano

Colador de cocina

Fundas de polietileno, 15 x 25 cm

Tapones de gasa y algodón

Incubadoras de vidrio (Ver anexo K)

Guantes de nitrilo

Guantes de cuero

Grapadora

Marcador para vidrio

Papel parafilm “M”

Papel toalla

2.5 Sustancias y reactivos

Agua destilada H2O(l)

Alcohol industrial (Metanol) 99,9% CH3OH

Alcohol antiséptico 70% C2H5OH

Hidróxido de sodio 0.1N NaOH(sol)

Ácido clorhídrico 0.1N HCl(sol)

Hipoclorito de sodio 4,5 p/v NaClO (sol) Cepa de Trichoderma harzianum

Cepa de Trichoderma hamatum

Agar Patata Dextrosa (PDA)

Arrocillo

2.6 Procedimientos

2.6.1

Producción de Tri choderma spp. En la figura 11 se muestra el proceso de producción deesporas de los hongos Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum planteados en esta


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investigación. Consta de algunos subprocesos como: preparación del medio de cultivo a

condiciones donde los microorganismos puedan desarrollarse con facilidad, la esterilización que

permite disminuir la carga microbiana contaminante, la inoculación donde se provee del

material genético al medio de crecimiento, y en la incubación se condiciona al microorganismo

para observar cómo se desarrolla al tratamiento dado. Si estos se adaptan se tendrá un buen

crecimiento caso contrario no propagarán. Luego de un tiempo prudente se tiene la cosecha,

proceso en el cual se determinar la concentración con la técnica de contaje de esporas,

finalmente se almacena a temperaturas bajas para preservan el bioformulado.

También se debe tener presente la inspección constante para observar si existe contaminación.

De así serlo se esteriliza en autoclave a 1 atm y 121°C por un tiempo de 20 min para garantizar

la muerte del o los agentes contaminantes presente y así proceder a su descarte.

INCUBACIÓN

INOCULACIÓN

COSECHA

ALMACENAMIENTO

PREPARACIÓN DEL

SUSTRATO

ACONDICIONAMIENTO

Y ESTERILIZACIÓN DEL

SUSTRATO

CONTAMINACIÓN ESTERILIZACIÓN

DILUCIONES

SERIADAS

DESCARTE

TRICHODERMA SPP.

Figura 11. Diagrama de flujo del proceso de producción de Trichoderma spp.


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2.6.2 Preparación del medio de cul tivo a base de agar patata dextr osa (PDA)

Pesar una cantidad determinada de PDA y diluirlo en agua según las especificaciones del

fabricante que son: 39 g del medio en 1000 mL de agua destilada

Ajustar el pH a 7 adicionando hidróxido de sodio 0.1 N cuando la mezcla es ácida o con

ácido clorhídrico 0.1 N si la mezcla es básica.

Calentar la mezcla hasta el punto de ebullición para que se disuelva por completo, agitar

levemente para evitar que el medio se queme o se chorree.

Esterilizar por 20 min a 121°C y 1 atm de presión

Esperar a que el envase contenedor del medio de cultivo se enfríe hasta que sea manipulable

para evitar quemaduras

Dispensar el medio en cajas Petri evitando la formación de burbujas de aire.

Esperar a que el medio se solidifique.

Nota: Evitar que el medio de cultivo en el envase alcance la temperatura ambiente, porque se

solidificará e impedirá la dosificación en las cajas Petri.

2.6.3 Procedimiento de resiembra en el medio de cul tivo PDA

Tomar una caja con medio y otra con la cepa a utilizar

Coger una pequeña parte del microorganismo con el asa bacteriológica y colocarlo en el

nuevo medio donde se propagará

Rotular y sellar con papel parafilm para evitar que se contamine con microorganismos del

ambiente.

Esperar hasta que el microorganismo se desarrolle en toda la caja Petri antes de utilizarlo.

2.6.4 Preparación del sustrato en botell as de vidr io y en fundas de poli eti leno

Pesar 800 g de arrocillo y lavarlo hasta que el agua salga transparente, durante 5 min

aproximadamente. Escurrir el agua por el alrededor de 1 min.

Pesar el arrocillo mojado para determinar la cantidad de agua absorbida por este.

Poner el arrocillo lavado en la arrocera luego añadir la cantidad de agua necesaria para la

cocción.

Mezclar continuamente para que toda la cocción sea uniforme.

Depositar la preparación en un recipiente limpio y seco hasta que se enfríe.

Colocar una cantidad fija de sustrato en las camineras con la ayuda de un embudo.

Sellar con un tapón de algodón, previamente esterilizado.


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Adicionar 160 g de sustrato en cada una de las fundas y sellar con dos dobleces pequeños

para evitar la contaminación con microorganismos del ambiente.

Grapar las esquinas de la funda para evitar que se riegue en el proceso de esterilización

Esterilizar en autoclave a 121°C y 1 atm de presión por un período de 20 min.

Agitar efusivamente las botellas esterilizadas para que el sustrato quede lo más suelto

posible.

2.6.5 Siembra del i nócul o de Tr ichoderma spp. en botellas y en fundas . En este proceso es

necesario recurrir a la ayuda del recuento celular con la cámara de Neubauer para determinar la

concentración de esporas presente en un volumen determinado.

Procedimiento

Tomar la cepa a utilizar y añadir una pequeña cantidad de agua destilada esterilizada.

Separar las esporas con una asa bacteriológica y diluirlo a 100 mL

Determinar la concentración de UFC/mL con la técnica del recuento celular y la cámara de

Neubauer, realizando varias repeticiones para tener un valor más exacto.

Colocar las botellas de vidrio con el sustrato previamente esterilizadas en la cámara de

siembra

Rotular para evitar confusiones de cepa, humedad y temperatura.

Poner 2 mL de la solución madre en cada caminera y agitarlo suavemente para que las

esporas se dispersen por el sustrato.

Finalmente colocarlas en las incubadoras que se encuentran a temperatura fija.

2.6.5.1 Recuento celul ar. El recuento celular es una técnica que tiene por objeto determinar el

número de células que están comprendidos en una unidad de volumen de muestra.

Todos los recuentos celulares constan de 3 fases que son:

1. Dilución de la muestra (Diluciones seriadas)

2. Determinación del número de células

3. Cálculo matemático del número de células presentes en 1 mL de muestra

2.6.5.2 Diluciones seriadas. Es la dilución repetida de una solución para reducir la

concentración de una sustancia de una solución original. Frecuentemente se realiza en

experimentos que requieran soluciones altamente diluidas con gran exactitud, tales comoaquellas que impliquen curvas de concentración en una escala logarítmica. (Ver figura 12)


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Figura 12. Diluciones seriadas

Procedimiento

Poner 9 mL de agua destilada en cada uno de los tubos de ensayo y rotularlos de la siguiente

manera 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 ,10-5, etc.

Coger 1 ml de la solución madre y colocarlo en el primer tubo, agitarlo para que la mezcla

se homogenice. La dilución será de 10-1.

Tomar 1 ml del tubo 10 -1 y colocar en el segundo tubo de dilución 10 -2 y así sucesivamente

hasta que los microorganismos puedan ser contados.

Determinar la concentración en Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por mL con la

ayuda de la cámara de Neubauer.

2.6.5.3 Cámara de Neubauer . También conocida como hematocitómetro, es una cámara de

contaje, se utiliza para contar células u otras partículas en suspensión bajo el microscopio.

Consiste en una placa gruesa de cristal con forma de portaobjetos de unos 30 x 70 mm y unos 4

mm de grosor y un cubre objetos que suele ser un poco más grueso que los normalmente

utilizados.

8/17/2019 ESTUDIO DEL A

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ESTUDIO DEL ADECUADO CRECIMIENTO DEL HONGO TRICHODERMA HARZIANUM Y TRICHODERMA HAMATUM EN SUSTRATO SÓLIDO