Toxicologie Analytique & Clinique (2014) 26, 139—147

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ARTICLE ORIGINAL

Ethyl glucuronide dans les urines : étude de stabilitéet données en toxicologie clinique

Ethylglucuronide in urine: Stability and data in clinical toxicology

Maxime Le Merdy, Xavier Decleves,Laurence Labat ∗

Plateforme biologie du médicament, bâtiment Jean-Dausset, groupe Cochin, Assistancepublique—Hôpitaux de Paris, 27, rue du Faubourg Saint-Jacques, 75014 Paris, France

Disponible sur Internet le 5 aout 2014

MOTS CLÉSEthyl glucuronide ;Alcool ;Toxicologie clinique

Résumé Dans le cadre d’une étude en milieu ambulatoire ayant pour objectif de montrerl’efficacité du baclofène sur la consommation d’alcool, il est proposé lors de la visite de sortiede réaliser le dosage de l’ethyl glucuronide (EtG) dans les urines. Les inclusions de cette étudeétant multicentriques, le problème de conservation des prélèvements urinaires avant ache-minement apparaît comme une limite au dosage de ce marqueur. Nous avons donc envisagéune étude de stabilité complète sur trois semaines chez différents types de consommateurspour apprécier la faisabilité de ce dosage dans les conditions de cette étude. Les dosages uri-naires lors d’une consommation contrôlée d’alcool chez deux témoins permettent également dedécrire l’élimination urinaire de ce marqueur. Des urines de témoins considérés comme buveurssociaux ou alcooliques chroniques sont recueillies le matin. Les dosages d’EtG (DRI, ThermoFisher Scientific, seuil de positivité 0,5 mg/L), d’éthanol et de créatinine urinaires, ainsi qu’uneanalyse cytobactériologique sont réalisés au moment du recueil. Le dosage d’EtG est testé surdes tubes contenant de l’acide borique et sur des flacons type ECBU sans conservateur. Dans unpremier temps, on réalise l’étude de stabilité pour chaque urine pendant 3 semaines dans desconditions différentes de température (4 ◦C, température ambiante), d’oxydation et de lumièreet pendant 3 mois à −20 ◦C. Puis, on étudie le suivi de l’élimination urinaire de l’EtG chez deuxtémoins après consommation contrôlée de 10 et 30 g d’alcool. Les prélèvements urinaires réali-sés sur des tubes contenant de l’acide borique (pour éviter la prolifération bactérienne pouvant

fausser le dosage de l’EtG) ont tous donné des résultats faussement négatifs. Les concentrationsmesurées dans les flacons type ECBU varient de 0,50 à 17,83 mg/g de créatinine (entre H12 etH18) pour la catégorie des « buveurs sociaux » (n = 7) et beaucoup plus élevées de 88,32 et de125,24 mg/g de créatinine pour deux « alcooliques chroniques ». L’étude menée sur une périodede trois semaines et l’étude de congélation sur trois mois montrent une excellente stabilité pour

∗ Auteur correspondant.Adresse e-mail : laurence.labat@cch.aphp.fr (L. Labat).

http://dx.doi.org/10.1016/j.toxac.2014.07.0042352-0078/© 2014 Société Francaise de Toxicologie Analytique. Publié par Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

140 M. Le Merdy et al.

l’ensemble des conditions étudiées (CV entre 3,1 % et 13,9 %). Des concentrations mesurées àdifférents temps pour deux témoins pour des consommations contrôlées de 10 et 30 g d’alcoolmontrent des résultats très variables. Les estimations de la surface sous la courbe des ciné-tiques d’élimination urinaire en fonction du temps, des demi-vies d’élimination (entre 2,75 et3,50 h) permettent de réaliser une approche de la fenêtre de détection de l’EtG dans les urines(entre 12,1 h pour une dose de 10 g et 30,1 h pour une dose de 30 g). Les résultats sur les tubescontenant de l’acide borique ne sont pas utilisables. Pour l’étude en ambulatoire, nos résultatsde stabilité montrent qu’il n’y a aucune précaution particulière à prendre et que des pots sansconservateur peuvent être utilisés. Les variabilités observées pour les témoins dont l’EtG dansles urines a été mesuré pour différentes quantités d’alcool consommé, peuvent être expliquéespar une saturation des voies oxydatives principales de l’alcool (ADH) à l’origine d’une surex-pression de la voie minoritaire de l’UDP-glucuronosyltransférase (UGT) pour laquelle on décritun polymorphisme génétique.© 2014 Société Francaise de Toxicologie Analytique. Publié par Elsevier Masson SAS. Tousdroits réservés.

KEYWORDSEthylglucuronide;Alcohol;Clinical toxicology

Summary Within the framework of a study in ambulatory world to demonstrate baclofenefficacy on alcohol consumption, measurement of ethyl glucuronide (EtG) in urine was propo-sed at the study exit. For this multicenter study, transit of urine samples is necessary and wedecided to study the stability of EtG in urine to simplify samples conveyance. EtG concentra-tion was determined in a urine sample collected in the morning from subjects considered associal drinkers or chronic alcohol abusers, using the Thermo Fisher Scientific DRI EtG EnzymeImmuno Assay (cut-off 0.50 mg/L). For each sample, alcohol and creatinine were determinedand cytobacteriological analyses were investigated. Measurement of EtG was performed usingboth special tubes with borate and classical flask. First, a stability study was achieved duringthree weeks at different temperature conditions (4 ◦C, ambient temperature), oxidative condi-tions and during 3 months at −20 ◦C. Secondly, we studied urinary elimination for two socialdrinkers for measured alcohol consumption. All the results obtained using tubes with borate (toavoid bacterial glucuronidases hydrolysing EtG) were false negative. Concentrations measuredin classical flask were between 0.50 and 17.83 mg/g creat. (between H12 and H18) for socialdrinkers and between 88.32 and 125.24 mg/g creat. (n = 2) for chronic alcohol abusers. Duringthree weeks, a satisfactory stability was achieved in all the conditions and at −20 ◦C for all thesamples during three months (CV between 3.1% and 13.9%). For two subjects, urinary concen-trations at various times were measured after consumption of 10 and 30 g alcohol. Estimatedarea under curves with kinetic elimination according to time, half lives (between 2.75 and3.50 h) allow detection window determinations between 12.1 h for dose of 10 g and 30.1 h fordose of 30 g. Tubes with borate cannot be used. All the stability results show that no particularprecautions are necessary in this ambulatory study. For LA02 and MA01, the saturation of themajor oxidative pathway (ADH) can explain the differences between the two situations. Forhigher consumption subjects, conjugation of ethanol with activated glucuronic acid in the pre-sence of uridine diphosphate (UDP) glucuronyl transferase, a minor detoxifying pathway (lessthan 0.05% of the dose of ethanol) seem to be excessively increased.© 2014 Société Francaise de Toxicologie Analytique. Published by Elsevier Masson SAS. Allrights reserved.

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ntroduction

e baclofène (LIORESAL®) est un principe actif utilisé depuislus de 40 ans en tant que décontractant musculaire pour lesndications suivantes : sclérose en plaque, affection médul-aire avec spasticité chronique sévère (étiologie infectieuse,égénérative, traumatique) ou secondaire à une infirmitéotrice d’origine cérébrale et certains hoquets résistants.

epuis la parution en 2008 de « Le dernier verre » du Dr Oli-ier Ameisen (Ed. Denoël), un débat sur l’utilisation de cetteolécule pour traiter l’addiction à l’alcool existe.

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Dans ce cadre, une étude randomisée en milieu ambu-atoire a été démarrée. Elle a pour objectif de montrer’efficacité du baclofène versus placebo sur des patientsour leur consommation d’alcool. Un bilan biologique à2 mois lors de la sortie de l’étude est programmé et un suivie gamma glutamyl transferase (�-GT), carbohydrate defi-ient transferrin (CDT), transaminases et une numérationormule sanguine sont réalisés permettant une évalua-

ion indirecte de la consommation d’alcool. L’augmentationignificative et concomitante des transaminases hépatiques,es �-GT et du volume globulaire moyen (VGM) est un

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Ethyl glucuronide dans les urines

moyen clinique indirect pour diagnostiquer l’alcoolisme [1].Le marqueur CDT est un marqueur direct de la consomma-tion d’alcool, mais il ne devient significatif que suite à uneingestion importante et prolongée d’alcool [1].

L’éthanol est principalement métabolisé par le foie enacétaldéhyde, puis en acide acétique. Son excrétion estrapide et les fenêtres de détection dans la salive, l’airexpiré et le sang sont classiquement inférieures à 12 heuresavec une fenêtre légèrement plus importante dans l’urineen fonction de la quantité d’alcool ingérée [2,3]. Unefaible quantité (< 0,1 %) d’éthanol est glucurono- ou sulfo-conjuguée et éliminée sous forme d’ethyl glucuronide (EtG)ou de sulfoglucuronide. Les réactions sont catalysées res-pectivement par l’UDP-glucuronosyltransférase (UGT) et lasulfotransférase [4,5]. Les fenêtres de détection de cesdeux marqueurs sont plus larges que celles de l’éthanoldans les urines et leur présence est une forte indicationd’une consommation récente [2]. De nombreuses étudesen clinique et en médecine légale décrivent l’utilisationdu dosage des ces conjugués dans différentes matricespour mettre en évidence l’abstinence à la consommationde boissons alcoolisées dans les programmes de sevrage,dans le suivi des femmes enceintes, dans les plaintesdans le cadre de la conduite automobile ou dans lessurveillances sur les postes à risque en santé au tra-vail ou au contraire, la consommation chronique excessive[6—8].

Dans le cadre de l’étude sur l’efficacité du baclofène,afin de mieux évaluer l’imprégnation alcoolique, il est pro-posé lors de la visite de sortie au douzième mois, d’ajouterau bilan biologique le dosage de l’EtG dans les urines.Le dosage de l’EtG urinaire est classiquement réalisé enméthodes chromatographiques type LC-MS/MS [9]. À côté deces méthodes de référence, nombreuses études décriventl’utilisation d’une méthode immunoenzymatique type DRIen routine clinique [4]. C’est cette dernière méthode dedosage que nous proposons dans le cadre de la surveillancedans cette étude.

Cependant, les inclusions de cette étude multicen-trique étant réalisées dans de nombreuses communes deFrance, le problème de conservation des prélèvements uri-naires avant acheminement apparaît rapidement commeune limite majeure au dosage de ce marqueur dans debonnes conditions.

En raison de résultats dans la littérature pas toujourshomogènes sur la stabilité de ce marqueur dans les urinesdans des conditions variables de conservation [10—12], nousproposons une étude pour l’ensemble des conditions pos-sibles de conservation et pour des prélèvements de niveauxde concentrations différentes. En raison des problèmes dedosage de l’EtG dans les urines liés à la présence bactériennein vitro [11,12], nous étudions également la possibilitéd’utiliser des tubes de recueil urinaire contenant des conser-vateurs, classiquement employés en milieu hospitalier pourprévenir d’une prolifération bactérienne.

Dans le cadre de cette étude multicentrique, nous envi-sageons ainsi une étude de stabilité complète sur troissemaines de différents prélèvements urinaires pour appré-

cier la faisabilité de ce dosage dans les conditions de recueilde cette étude. Nous étudions ainsi les effets de la tempé-rature (4 ◦C, température ambiante), de la lumière, et del’oxydation, sur la stabilité de l’EtG pendant une période

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141

lobale de 3 semaines. En parallèle, une étude de stabilité −20 ◦C est réalisée pendant 3 mois.

Afin de mieux interpréter les résultats de l’étude,uelques données de cinétiques d’élimination urinaire sontécrites chez deux témoins pour des doses contrôlées.

atériels et méthodes

escription des témoins

fin de tester la stabilité de l’EtG dans les urines,es prélèvements ont été réalisés chez sept volon-aires : trois femmes et quatre hommes (âge entre 24 et0 ans, moyenne : 33,2 + 11,1 ans ; poids entre 50 et 100 kg,oyenne : 71,0 ± 19,1 kg). Parmi ces volontaires, cinq sont

onsidérés comme des « buveurs sociaux » ne présentant pase troubles comportementaux et n’étant sous aucun traite-ent particulier. Deux patients en consultation du centree soins et d’accompagnement et de prévention en addic-ologie local (CSAPA), diagnostiqués comme « alcooliqueshroniques » se sont portés volontaires pour cette étude.ous les recueils ont été réalisés le matin.

Cette étude non interventionnelle a commencé par’exposé clair à chacun des témoins des objectifs de l’étude,vant leur accord d’inclusion. Leur participation consiste à’auto-déclaration et à l’évaluation de leur consommation’alcool, et au prélèvement d’un échantillon urinaire.

Deux témoins de la catégorie « buveurs sociaux », unomme ML09 de 24 ans (100 kg) et une femme AN08 de 24 ans60 kg) ont participé à l’étude du suivi du marqueur aprèsonsommation contrôlée. Une période d’abstinence totalee consommation d’alcool dans les 7 jours précédents etendant l’étude a été respectée.

tude de la contamination bactérienne deschantillons de l’étude

our évaluer la contamination bactérienne, 10 mL d’urinee chaque témoin ont été mis dans des tubes contenant de’acide borique (V-Monovette urine, Sarstedt). Ces tubes ontnsuite été testés selon deux méthodes :la numération du nombre de bactéries/mL parl’intermédiaire d’un cytomètre en flux (automateUF1000 Biomérieux) ;la culture en ensemencant 10 �L d’urine sur une gélosechromogène (URI4 Biorad). Cette gélose a ensuite étéincubée 24 h en aérobiose afin de noter la présence oul’absence de croissance bactérienne.

éthodes de dosage

e dosage d’EtG dans les urines est réalisé en utilisant leéactif immunoenzymatique DRI® ethyl glucuronide de chezhermo Fisher Scientific. Une calibration sur cinq points (0,,1, 0,5, 1, 2 mg/L) est réalisée sur un automate de typeDx 90. Deux contrôles (0,375 et 0,625 mg/L, Thermo Fisher)ermettent tous les jours de vérifier la stabilité de la cali-

ration. Le cut-off a été fixé pour une utilisation sur deschantillons urinaires à 0,5 mg/L.

La linéarité du réactif allant jusqu’à 2 mg/L, les échan-illons dont la concentration est supérieure seront dilués

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vant analyse avec de l’urine négative (dilution 1/100e auaximum). L’éthanol urinaire a été dosé par une méthode

n immunoenzymologie de chez Roche Diagnostics Ltd® surn automate d’immunoanalyse type Integra®. La créatininerinaire a été dosée par un test DRI de chez Thermo Fishercientific selon la méthode de Jaffé.

L’ensemble des résultats dans les urines exprimées dansette étude sera rapporté à la quantité de créatinine danses urines exprimées en mg d’EtG par g de créatinine.

tude des effets de l’acide borique utiliséomme conservateur

es échantillons urinaires de deux des témoins ont été répar-is dans un pot classique type ECBU et un tube contenant de’acide borique utilisé dans les laboratoires de bactériologieour éviter la prolifération bactérienne (V-Monovette urine,arstedt). Des dosages d’EtG ont été réalisés à j0.

rotocole de l’étude de stabilité à 21 joursu moment du prélèvement urinaire (j0), chaque témoin de

a catégorie « buveur social » a estimé le nombre de verresonsommés la veille, ainsi que la dernière heure de prise’alcool (Tableau 1).

Pour l’ensemble des témoins, le prélèvement urinaireevait avoir un volume minimum de 80 mL. Les dosages’EtG, d’éthanol et de créatinine urinaires, ainsi qu’unenalyse cytobactériologique ont été réalisés à j0. L’urinest répartie (volumes de 13 mL) dans cinq tubes en poly-ropylène type BD FalconTM. Deux tubes ont été recouverts’aluminium et placés à +4 ◦C. Un de ces tubes a eu le bou-hon percé afin de favoriser l’oxydation.

Deux autres tubes ont été préparés de la même manière,ais laissés à température ambiante. Enfin, un tube a été

aissé à température ambiante, sans protection aluminium.es dosages de l’EtG pour chacune des conditions ont étééalisés à j1, j2, j3, j4, j7, j14 et j21.

rotocole de l’étude de la congélation à20 ◦C pendant 3 mois

j0, six échantillons urinaires de 1 mL ont été préparés danses tubes type Eppendorf® et immédiatement congelés à20 ◦C. Un échantillon a été décongelé pour le dosage de

’EtG à j1-j7-j14-j30-j60-j90.

rotocole de l’étude d’élimination de l’EtGans les urines chez deux patients AN08 etL09 après consommation contrôlée

our chaque patient, après une période d’abstinence de jours, une prise de 10 g d’alcool (équivalent en vin rouge)st réalisée à H0. Des prélèvements urinaires sont réalisésux temps suivants : H0, H2, H4, H5, H6, H8, H12, H18,24 jusqu’à mesure d’une concentration en EtG inférieure

la limite de positivité du test. Après une nouvelle période

’abstinence de 7 jours, une nouvelle prise d’alcool équiva-ente à 30 g d’alcool (équivalent en vin rouge) est réalisée.es prélèvements sont recueillis à H0, H2, H4, H5, H6, H8,12, H18, H24, H30, H36, H42, H48 jusqu’à mesure d’une

arba

M. Le Merdy et al.

oncentration en EtG inférieure à la limite de positivité duest.

L’étude des concentrations urinaires en EtG en mg/g deréatinine en fonction du temps (minutes) est exprimée gra-hiquement en coordonnées semi-logarithmique. À partir dees données, des estimations de la demi-vie d’éliminationcalculée à partir de la pente sur la phase d’élimination) ete la période de positivité du test sont réalisées.

ésultats

tude des effets de l’acide borique utiliséomme conservateur

es deux échantillons urinaires testés sur des tubes avec ouans acide borique montrent des concentrations en EtG de,08 et 1,21 mg/g de créatinine sur les tubes sans conser-ateur. Pour les deux échantillons des tubes contenante l’acide borique, les résultats sont négatifs (concentra-ions < seuil de positivité).

tude de stabilité à 21 jours

j0, les cinq « buveurs sociaux » ont des concentrations uri-aires en EtG comprises entre 0,5 et 5,1 mg/g créatininelors que pour les deux « buveurs chroniques », on observees concentrations beaucoup plus élevées de 88,32 et25,24 mg/g de créatinine (Tableau 1). Les dosages de’alcool dans les urines de ces témoins, réalisés au momentu prélèvement sont tous négatifs. La recherche bacté-ienne a été négative pour tous les témoins, à l’exception deA02 (témoin féminin) où une flore vaginale était présente.

On observe que pour les témoins masculins et en particu-ier pour CH05 et MA01, les concentrations sont aux environsu seuil de positivité de 0,5 et 0,6 mg/g de créatinine plusaibles que pour les deux témoins de sexe féminin LA02 etU04 qui pour des consommations estimées plus basses ontes concentrations urinaires en EtG plus élevées (2,30 et,29 mg/g de créatinine). On notera qu’avec un seuil deositivité décidé à 0,5 mg/L, le résultat de CH05 après uneonsommation estimée de 100 g est à la limite de la positi-ité 18 heures après.

Pour l’ensemble de ces témoins, les CV % calculésendant les 21 jours pour l’ensemble des conditions étu-iées sont tous mesurés entre 3,1 et 13,5 %. La Fig. 1écrit l’évolution de la concentration d’EtG pour chacunes témoins, sous différentes conditions de température,’oxydation et de lumière. La grande similitude d’évolutiones courbes au cours du temps, pour l’ensemble des condi-ions, montre que la concentration de l’EtG dans les urinesst stable quelle que soit la valeur de cette concentrationur une période de trois semaines dans des pots classiquese prélèvements urinaires sans conservateur.

Le témoin ME06 de type « alcoolique chronique » a uneoncentration en EtG de 156,10 mg/L, soit 125,24 mg/g deréatinine. Les échantillons de ce témoin ont tous été dilués

u centième avec de l’urine vierge d’EtG. Les variationsetrouvées entre les différents temps dans l’étude de sta-ilité sont plus importantes ici que pour les autres témoinsvec des CV % calculés compris entre 7,8 et 11,0 % (Fig. 2).

Ethyl glucuronide dans les urines 143

Tableau 1 Description des témoins de l’étude de stabilité.

Âge(sexe)

Poids(kg)

Délai entredernièreconsommationet prélèvement(heure)

Quantitéd’alcoolconsomméeestimée(g)

Quantité d’alcoolconsommée estiméepar poids patient(g d’alcool/kg)

EtG à j0(mg/L)

EtG à j0(mg/g decréatinine)

Éthanolurinaire(g/L)

MA01 24 (M) 100 15 30 0,3 1,23 0,60 < LdqLA02 47 (F) 55 13 10 0,2 0,62 2,30 < LdqAP03 34 (M) 75 12 50 0,7 6,86 5,10 < LdqAU04 30 (F) 52 15 25 0,5 0,90 2,29 < LdqCH05 24 (M) 85 18 100 1,2 0,94 0,50 < LdqME06 24 (F) 50 Chronique ? ? 156,10 125,24 < LdqXX07 50 (M) 80 Chronique ? ? 140,00 88,32 < LdqMA01 24 (M) 100 15 75 0,75 11,80 4,75 < Ldq

0,

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LA02 47 (F) 55 13 50

On remarque que pour les cinq conditions testées, la concen-tration en EtG varie dans le même sens.

Étude de la congélation à −20 ◦C pendant3 mois

La Fig. 3 représente l’évolution de la concentration en EtGen fonction du temps pour les échantillons d’urines congelésà −20 ◦C. Pour l’ensemble des témoins « buveurs sociaux »,

dét

Figure 1. Étude des effets de la température (température ambiantstabilité de l’EtG urinaire chez cinq témoins « buveurs sociaux ». Avecéchantillons à température ambiante ; O− : condition non oxydative ; O+

de la lumière ; L+ : échantillons non protégés de la lumière.

9 13,80 17,83 < Ldq

a concentration d’EtG ne varie pas en fonction du temps deongélation. Les CV exprimés en % après 90 jours de congé-ation sont tous inférieurs à 10 %. La congélation à courtu à long terme n’a donc aucun effet sur la stabilité de’EtG.

Pour le témoin ME06, un CV % légèrement plus élevée 13,5 est mesuré. L’obligation de diluer au centième leschantillons et la variabilité supplémentaire explique cer-ainement cette valeur.

e, +4 ◦C), de l’oxydation et de la lumière pendant 21 jours sur la : 4 : conservation des échantillons à 4 ◦C ; 22 : conservation des: condition oxydative ; L− : conservation des échantillons à l’abri

144

Figure 2. Étude des effets de la température (températureambiante, +4 ◦C), de l’oxydation et de la lumière pendant 21 jourssur la stabilité de l’EtG urinaire chez le témoin « alcoolique chro-nique » ME06. Avec : 4 : conservation des échantillons à 4 ◦C ; 22 :conservation des échantillons à température ambiante ; O− : condi-tion non oxydative ; O+ : condition oxydative ; L− : conservation deséd

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chantillons à l’abri de la lumière ; L+ : échantillons non protégése la lumière.

onnées de concentrations urinaires en EtGesurées en toxicologie clinique

our les témoins MA01 et LA02, de nouveaux échan-illons d’urines ont pu être recueillis aux lendemains deonsommations différentes de la première fois. Pour MA01sexe masculin), deux consommations estimées à 30 et5 grammes d’alcool permettent de mesurer des concen-rations urinaires d’EtG, respectivement de 0,60 et de,40 mg/g de créatinine (H15). Pour LA02 (sexe féminin), leseux consommations estimées à 10 et 50 grammes d’alcoolermettent d’observer des concentrations urinaires d’EtG,espectivement de 2,30 et 17,83 mg/g de créatinine (H13).ur ces deux témoins, nous observons donc que la concentra-ion urinaire d’EtG à un temps similaire après consommation’est pas directement proportionnelle à un volume d’alcoolonsommé.

De nouvelles données obtenues dans le cadre d’une étudee cinétique d’élimination urinaire de l’EtG avec des dosesdministrées contrôlées (doses de 10 et 30 g d’alcool) pour

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igure 3. Étude des effets de la congélation à −20 ◦C pendant mois sur la stabilité de l’EtG urinaire chez les témoins « buveursociaux ».

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M. Le Merdy et al.

eux témoins montrent des résultats très variables. Lesoncentrations urinaires en EtG de ces témoins ont étéesurées à t = 0 avec une valeur inférieure à la limite deositivité du test.

La Fig. 4 décrit pour le patient AN08 l’évolutiones concentrations urinaires en coordonnées semi-ogarithmiques (mg/g de créatinine) en fonction duemps (minutes) pour des doses de 10 et 30 g d’alcool. Laême étude réalisée chez un second patient ML09 permete comparer plusieurs paramètres cinétiques dont les Cmax,max, aire sous la courbe (AUC) et demi-vies. Ainsi, à partire l’équation des concentrations urinaires en fonctionu temps calculée sur la phase d’élimination, on peutpprocher une estimation de la fenêtre de détection poures deux témoins en fonction de la dose (Tableau 2).

On observe ainsi quelle que soit la dose, une demi-vietable de 3,1 h ± 0,3. La concentration maximum est propor-ionnelle à la dose pour chaque témoin, mais très différententre les deux témoins pour une même dose.

Les différences de Tmax observées chez les deux témoinseuvent s’expliquer par des heures de prélèvement diffé-entes lors de la réalisation de l’étude. L’AUC est égalementroportionnelle à la dose pour chaque témoin et mesuréerès différente entre les deux témoins.

L’estimation de la fenêtre de détection de l’EtG dans lesrines, estimée pour une concentration supérieure au seuile positivité de 0,5 mg/L montre une fenêtre plus impor-ante de 1 à 2 jours pour le patient AN08. Cette fenêtre resteependant pour chaque témoin proportionnelle à la dose. Leatient ME6 est quant à lui limité à un dépistage positif danses urines pendant une durée inférieure à 24 h pour les deuxoses.

iscussion

près l’ingestion d’une dose définie d’éthanol, la litté-ature décrit de grandes variations interindividuelles dea concentration urinaire d’EtG [3,4,6,13]. Celle-ci peuttre influencée par de nombreux facteurs qui sont enlus de la quantité d’alcool consommée et de l’intervallee temps depuis la dernière consommation, la dilutione l’urine en fonction, notamment du volume d’eaungéré, l’activité enzymatique hépatique, la cinétique’élimination, l’éventuelle contamination bactérienne initro.

En 2009, Helander et al. [8] montrent que la conta-ination éventuelle du prélèvement urinaire peut être

ource de faux résultats. La solution alors proposée a été’utiliser un conservateur antimicrobien classiquement uti-isé par les microbiologistes : l’acide borique qui éviten vitro toute prolifération bactérienne. Dans cette étudee stabilité, pour éliminer tout biais lié à une éventuelleontamination, nous avons vérifié que tous les échantillonstaient stériles avant inclusion. Nos résultats prouventue l’utilisation de l’acide borique n’est pas envisageablear la présence de cet acide est à l’origine de résul-ats faussement négatifs. La solution retenue sera alors

e faire des prélèvements urinaires selon la même procé-ure que pour la réalisation d’un ECBU dans des pots sansonservateur, afin de limiter au maximum le risque de conta-ination.

Ethyl glucuronide dans les urines 145

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dose 10 g

dose 30g

AUC = 53104 mg.m in/L C max = 105,0 mg/g créat. T max = 360 min (6h)

AUC = 5564 mg.min/L C max = 15,7 mg/g créat. T max = 240 min (4h)

Pa�ent AN08

Figure 4. Évolution des concentrations urinaires en EtG (mg/g de créatinine) en fonction du temps (minutes) en coordonnées semi-logarithmiques chez un patient AN08 pour des doses contrôlées d’alcool de 10 et 30 g.

Tableau 2 Paramètres cinétiques de l’élimination urinaire de l’EtG chez deux patients AN08 et ML09 pour des consom-mations contrôlées de 10 et 30 g d’alcool.

Patient AN08 Patient AN08 Patient ML09 Patient ML09

Dose (g) 10 30 10 30Cmax (mg/g de créatinine) 15,7 105,0 3,2 40,5Tmax (min) 240 360 240 210Équation conc. urinaires en

fonction du tempsC = 41,8 e−0,0042t C = 398,0 e−0,0037t C = 5,5 e−0,0033t C = 59,3 e−0,0038t

Aire sous la courbe (AUC enmg.min/L)

5564 53 104 16 66 15 605

Demi-vie (h) 2,75 3,12 3,50 3,03Fenêtre de détection (h) 26,7 30,1 12,1 20,9

EtG : l’ethyl glucuronide ; AUC : aire sous la courbe.

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La littérature apporte déjà des réponses à la questionde stabilité de l’EtG dans les urines. En 1999, une pre-mière étude réalisée sur un échantillon urinaire montrel’excellente stabilité de ce marqueur sur une périodede 140 h à température ambiante [6]. Stephanson et al.montrent des variations inférieures à 10 % de la concen-tration urinaire en EtG en 4 jours à 4 ◦C et à températureambiante [14]. De plus, cette étude démontre qu’il n’y apas de formation d’EtG in vitro, et ce, même en présenced’éthanol [14]. Cependant, une étude récente menéependant cinq semaines montre une augmentation de laconcentration urinaire d’EtG de 37,5 %, dans des condi-tions de température ambiante et d’oxydation [10]. Eten 2005, Helander et al. s’intéressent à la contaminationbactérienne urinaire et montrent qu’une contaminationpar Escherichia coli peut soit détruire l’EtG in vitro, soiten former s’il y a présence d’éthanol dans le prélèvementurinaire à l’origine de faux négatifs ou de faux positifs [15].

Dans le cadre de l’étude de faisabilité de l’étudemulticentrique, une mauvaise stabilité de l’EtG in vitro

dans des conditions de conservation pas toujours idéales(temps d’acheminement au laboratoire disparate) apparais-sait potentiellement comme une limite majeure au suivide ce marqueur. De l’ensemble des résultats de stabilité

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e notre étude, nous concluons que l’EtG est stable surne période de trois semaines, aussi bien à températurembiante et à 4 ◦C, avec ou sans lumière, dans un tube ferméu à l’air libre. De plus, les échantillons peuvent être conge-és pendant une période de trois mois, sans que cela modifiee résultat. En effet, les CV % calculés sont tous inférieurs à3,9 %.

Par ailleurs, les coefficients de variation (CV %) desontrôles de qualité analysés pendant l’étude sur uneériode de trois semaines sont observés inférieurs à 10 %our les deux contrôles. Ces valeurs démontrent que laariabilité observée au cours du temps correspond certaine-ent à une variabilité analytique classique pour le dosage de

e marqueur sur un automate d’immunochimie. Ces résul-ats sont en accord avec ceux décrits dans la littérature à’exception de l’étude de Schoegl en 2006 qui montre desvolutions importantes de la concentration d’EtG à tempé-ature ambiante sur cinq semaines [10].

Ces nouveaux résultats présentent l’avantage de ras-embler dans une même étude les différentes conditions

e conservation et de permettre de valider la stabilité duosage de ce marqueur. Ainsi, nous pouvons admettre que leransport des échantillons pourrait être fait dans toutes lesonditions avec si possible une recommandation de stockage

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+4 ◦C afin de limiter le développement d’une contamina-ion bactérienne.

Les données de deux témoins testés deux fois aprèses consommations d’alcool différentes montrent, pour uneonsommation multipliée par deux pour le premier (MA01,exe masculin) et par cinq pour le deuxième (LA02, sexeéminin), une concentration en EtG multipliée environ parept. Pour ces deux témoins, nous n’observons pas deorrélation directe entre la consommation d’alcool et laoncentration en EtG.

Nos observations montrent que pour de faibles quantités’alcool (< 30 g), on observe des concentrations inférieures

3 mg/g de créatinine ; des consommations plus élevées,llant jusqu’à 80 g d’alcool correspondant à des concentra-ions comprises entre 10 et 20 mg/g de créatinine. Enfin,es deux témoins « alcooliques chroniques » ont une concen-ration en EtG urinaire beaucoup plus importante et assezimilaire de l’ordre de 100 mg/g de créatinine.

Les résultats des cinétiques mesurées chez les deuxatients AN08 et ML09 montrent des demi-vies stablesndépendantes de la dose, des fenêtres de détectionrès variables pour les deux témoins mais qui semblentroportionnelles individuellement aux doses contrôléesonsommées en une seule prise. Ces fenêtres sont prochese celles observées par Dahl et al. en 2002 entre 22,5 et1,5 h pour des consommations contrôlées entre 25 et 41,5 g16].

Toute la difficulté de l’utilisation de ce marqueur danses urines réside dans l’interprétation d’un résultat chez unatient non connu. Sur un suivi dans le cadre d’un sevrage,lusieurs prélèvements réalisés à des heures bien définieseraient déjà susceptibles de fournir des informations sup-lémentaires ; néanmoins, il faut rester prudent quant à’interprétation considérant qu’on ne maîtrise pas la ciné-ique d’élimination de chaque individu, ni la consommation’alcool éventuellement en plusieurs prises dans le cadre’une consommation chronique. On rappelle ainsi que dansotre étude, les cas étudiés ne reflètent que la cinétique’élimination de l’EtG suite à une seule prise.

D’une facon générale, les différences de concentra-ions observées entre les différentes situations peuventtre expliquées par une saturation des voies oxydativesrincipales de l’alcool (voie de l’ADH) à l’origine d’une sur-xpression de la voie minoritaire de l’UGT et ainsi d’uneugmentation importante de l’EtG et des capacités méta-oliques différentes chez les témoins étudiés [17]. On peutenser que la voie métabolique de l’ADH du témoin AN08 estlus déficiente que celle du témoin ML09. D’ailleurs, cheze dernier, les concentrations en éthanol urinaire sont tou-ours inférieures à la limite de quantification de 0,1 g/L,lors qu’elles sont supérieures à 0,1 g/L pendant 5 h pour laose de 30 g chez le patient AN08 (données non montrées).

D’autre part, des fonctions rénales différentes entre lesémoins peuvent également être à l’origine d’une élimina-ion différente des métabolites de l’alcool, expliquant enartie les concentrations urinaires observées.

onclusion

fin de mieux comprendre et d’étudier cette voie deétabolisation de l’éthanol, et d’observer les variations

M. Le Merdy et al.

nterindividuelles, une étude de pharmacocinétique d’élimi-ation urinaire serait intéressante sur un nombre de témoinslus important.

Il convient de rappeler que dans le cadre d’un suivie la consommation d’alcool comme dans le cadre d’unraitement sous baclofène, l’analyse des marqueurs de’alcoolisme et en particulier de l’EtG et du dérivé sulfo-onjugué dans une matrice alternative comme le cheveuxrésente de nombreux avantages en termes de fenêtre deétection et de stabilité du marqueur [18—20].

éclaration d’intérêts

es auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts enelation avec cet article.

emerciements

es auteurs remercient le Dr Hélène Poupet du laboratoiree bactériologie du groupe Cochin (AP—HP) pour l’étudeytobactériologique réalisée chez les témoins de cettetude.

Ils remercient tout particulièrement Marie-Christine Koe-ele et la Société Thermo Fisher Scientific pour son soutienans cette étude.

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