ETUDE D'UNE LIGNEE DE CELLULES KB INFECTEES CHRONIQUEMENT PAR LE VIRUS PARA-INFLUENZAE TYPE 3 111. PROPORTION DE CELLULES INFECTEES E T PRODUISANT D U VIRUS1

PHILIPPE DANIEL Dtpartement de Microbiologie, Facultt de Midecine, Universitt Laval, Qutbec, Qut.

R e p le 14 fevrier 1966

RdsumQ Three lines of KR cells permanently infected by myxovims para-influenme 3,

but eshbIislied at dillerent times, have 1,cm studied to ascertain the proportion of infected or virus-producing cells. This investigation was carried out try (1) determining the infectious centers induced under agar by monodispersed KB-EA cells plated on KB cell monolayers, ( 2 ) hemad~nrptinn on single I<H.E.A cells, ( 3 ) imn~unofluorescence, (4) looking for the irliect~c>us character of the KB.Eh clones. The data ohtained by cloning and imm~~nofluorescence show that each cell contains viral antigen. Only a part of the cells, however, induce infectious centers by the plaque technique or nre hemadsorhing.

The proportion of hemadsorbing cells and the number of red cells adsorbed by a cell (hemadsorbing ability) are the more important as the KB.EA line is younger. The mitotic cells can hemadsorb like the resting cells. The hemadsorb- ing ability of each cell is stable during a t least 24 hours. The clones exhibit the same stability for observation periods up to 10 days. Furthermore, all cells form- ing a clone have generally the same hemadsorbing ability.

I t is concluded that all the cells are infected but that viral production varies considerably from one cell to the other while i t remains stable enough in each cell.

Introduction I1 a C t C rapport6 prCcCdemment (3) les changements subis par une lignCe

de cellules K B chroniquement infectCes par le myxovirus para-influenzae type 3, souche EA 102 (1igni.e KB.EA I) ainsi que l'ittablissement de deux nouvelles lignites KB.EA I1 e t KB.EA 111.

Nous nous sommes propos6s dans ce travail de d6terminer la fraction des cellules qui, dans ces trois lignhes, produisent du virus ou, tout au moins, sont infectbes pal ce virus.

Cette information est importante B obtenir afin de dkterminer le type de syst6me porteur 6tudiC. Si une fraction seulement des cellules est infectbe il faut considCrer l'hypothese d'une survivance des cultures d6pendante de facteurs extracellulaires tels qu'anticorps ou inhibiteurs non sphcifiques. Au contraire, si toutes les cellules contiennent l'agent viral la cause de la survie cellulaire doit &tre recherchbe dans la cellule elle-meme.

La proportion de cellules KB.EA productrices a 6th dCtermin6e concurrem- ment par quatre diffCrentes mCthodes A savoir la recherche:

(1) de la proportion de cellules KB.EA induisant des plages sur cellules K B ; (2) de la capacitC hkmadsorbante des cellules KB.EA; (3) de la proportion de cellules KB.EA rCagissant avec les anticorps fluores-

cents ; (4) de la proportion des clones KB.EA producteurs du virus.

'Travail realis6 Q I'aide de l'octroi MA-1572 du Conseil Medical des Recherches du Canada e t d'un octroi de la Banting Foundation.

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MatCriel et techniques 1. Cellules

Les dktails concernant les lignCes KB.EA I, I1 et I11 ont kt6 donnCs dans de prkcCdentes publications (2, 3).

Rappelons que les cellules KB.EA I sont cultivkes depuis mars 1959 tandis que les cellules KB.EA I1 e t I11 ont CtC Ctablies respectivement en septembre 1963 et fkvrier 1964.

Au cours des expbriences rapportkes ici les cellules KB.EA I avaient subi environ 250 passages, les cellules KB.EA 11, 60 passages e t les cellules KB.EA I11 50 passages.

2. L a proportion de cellules La proportion de cellules KB.EA induisant des plages sous milieu gelosC a

C t C mesurke selon une technique dkjB dCcrite (3).

3. L a capacitd hdmadsorbante La capacitk hkmadsorbante a C t C recherchCe sur cellules KB.EA isolCes e t

sur des clones issus de ces dernieres. ( a ) Les cellules isolkes adsorbant les hCmaties de cobaye ont CtC recherchCes

selon la technique de Marcus (7). Les cellules KB.EA Ctaient dCtachCes du verre et disperskes par un mClange de trypsine et de versPne B la concentration respective de 1 pour 1,000 et de 1 pour 10,000. Les cellules ainsi monodispersees ktaient inoculkes dans des boites de Petri en polystyr6ne de 60 millimPtres de diamPtre et contenant 5 millilitres de milieu de Eagle additionnb de 30% de sCrum de veau. Chaque boite de Petri recevait 10,000 cellules e t trois boites Ctaient employkes pour chaque dktermination. AprPs une nuit d'incubation A 37 OC les cellules fixCes au substrat Ctaient lavCes trois fois B la solution de Hanks, puis recouvertes de 5 millilitres de milieu de Eagle enrichi de 10% de sCrum de cheval, dkpourvu d'anticorps anti-parainfluenzae type 3, pendant au moins 24 heures. Des hkmaties de cobaye Ctaient alors introduites dans le milieu B une concentration finale de 0.5% et les cultures Ctaient incubCes une heure B la tempCrature de 4 "C. Ces cultures Ctaient ensuite lavkes doucement avec un tampon phosphate B pH 7 jusqu'h klimination des hematies non adsorbCes. Enfin les cellules Ctaient fixCes au Bouin ce qui permettait de conserver les hCmaties adsorbkes sur les cellules sans diminution apparente du taux d'hCmadsorption.

Cette fixation ktait omise quand des Ctudes sur les variations de la capacitC hbmadsorbante au cours du temps ont kt6 entreprises. Dans ce cas les cellules CtudiCes Ctaient rCpCrkes B l'aide d'un quadrillage form6 de carres d'un milli- m2tre de cbtC et colik au fond de chaque boite de Petri. Chaque cellule isolCe Ctait dessinCe. Le nombre d'hkmaties adsorbkes sur chaque cellule ainsi indi- vidualisCe fut comptb. Puis les boites de Petri contenant les cellules Ctaient soigneusement lavCes et rCincubCes B 37 OC en atmosphPre B 5% de COt en prCsence de milieu nutritif.

( b ) Ces clones soumis B 1'Cpreuve de I'hCmadsorption ont CtC prCparCs selon le protocole dCcrit plus bas (cf. section 5 Materiel et techniques). Au quatorziPme jour de leur dCveloppement ceux-ci Ptaient incubes comme prCcCdemment dans le milieu de Eagle complCtC par du sCrum de cheval pendant au moins 24 heures avant de subir l'kpreuve dlhCmadsorption rba- liske comme avec les cellules isolees.

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4. Immunofluorescence La recherche des antigitnes du virus para-influenzae type 3 par les anticorps

fluorescents a C t C faite par la mCthode indirecte de Coons. L'immuns6rum de lapin avait CtC prCparC par inoculation hebdomadaire intraveineuse pendant cinq semaines de virus cultivC sur cellules de rein de singe et d'un titre approxi- matif de lo7 doses infectieuses 50y0 (D.I.60). Le serum immun d i l d 2500 fois, neutralisait 100 D.I.50. Le sCrum conjuguC B la fluorescbine etait un immuns6- rum anti-gammaglobulines de lapin." Les cultures tCmoins Ctaient traitCes par un sQum normal de lapin dCjB mentionne. Afin de pallier A des colorations non spkcifiques affectant principalement le nucl6ole il fut nkcessaire d'absorber les sQums de lapin selon une technique inspirCe de celle de Demont et al. (4). Chaque 0.5 millilitre de sCrum etait absorb6 trois fois par trois millions de cellules KB. Le sQum conjuguC B la fluorescbine Ctait de plus absorb6 une fois avec trois millions de cellules KB.EA I, I1 ou I11 selon la souche utilisCe. Les cellules servant B l'adsorption avaient CtC fixCes comme les cellules utili- s6es dans la &action.

Celle-ci fut menee comme suit: (A) fixation 10 minutes dans I'acetone, puis sCchage dans un courant d'air; (B) lavage trois fois dans un tampon phosphate pH 7; (C) incubation 30 minutes B la tempCrature du laboratoire avec I'immunsC-

rum ou le s6rum de lapin normal diluC au 1/5 &me; (D) lavage trois fois dans le tampon phosphate; (E) incubation 30 minutes B la temperature du laboratoire avec le sCrum

conjuguC anti-lapin dilu6 au 1/5 &me; (F) lavage trois fois dans le tampon phosphate; (G) montage sous lamelle dans le tampon phosphate contenant 20 pour

100 de glycerine.

5 . Proportion de clones KB.EA producteurs de virus Les cellules KB.EA ont CtC clonCes selon la technique de Puck (8) apr&s

dispersion par le melange trypsine-verscne dCjA mentionnC (cf. section 2). La suspension contenant 90 pour 100 de cellules isolCes Ctait filtrke sur laine de verre pour Climiner les amas cellulaires Cventuels. Les boites de Petri en polystyr&ne, de 60 millim6tres de diam&tre, Ctaient employCes. Chacune recevait 100 B 200 cellules KB.EA en suspension dans 5 millilitres de milieu de Eagle enrichi de 30 pour 100 de serum de veau, et Ctait incubCe B 37 "C dans une atmosphhe B 5% de Con.

Apr&s 24 heures les cultures Ctaient examinCes avec un microscope de chimiste, B optique renversee, de fason B verifier que les cellules fixCes Ctaient bien isolCes. Au bout de 15 jours les colonies dCveloppCes Ctaient cerclCes par un manchon de verre, puis trypsinkes e t repiquCes dans des tubes, eux-memes incubCs B 37 OC dans une atmosph2re de 5% de COz. Dans ces conditions I'Cchange de particules infectieuses entre les colonies Ctait rendu impossible par la faible concentration en cellules et surtout par l'emploi du d r u m de veau B la concentration de soy0. Ce dernier, meme au taux de 10yo inhibait compl6tement le virus contenu dans le liquide surnageant des trois lign6es KB.EA.

*Baltimore Biological Laboratory, Baltimore 18, Md., U.S.A.

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RBsultats 1. Centres infectieux

Le pourcentage des centres infectieux induit par les trois types de cellules KB.EA Ctait trPs variable d'une lignCe Q une autre. Les rCsultats obtenus sont comparb avec les rCsultats globaux obtenus par les trois autres mCthodes employCes (tableau I).

2. Htmadsorption ( a ) Capacitk htmadsorbante des cellules K B . E A Les rCsultats donnCs dans le tableau I reprCsentent la proportion des cellules

adsorbant au moins une hematie de cobaye. Cette proportion est d'autant plus i.levke que la 1igni.e considCree est plus jeune. L'Ctude de la rkpartition du nombre de cellules hkmadsorbantes en fonction du nombre d'hbmaties adsor- bCes rCvPle en plus que le nombre moyen d'hkmaties adsorbbes par cellule varie dans le meme sens (fig. 1). Les cellules KB.EA I , les plus anciennes, fixent, quand elles sont hkmadsorbantes, un nombre d'hkmaties plus faible que les cellules KB.EA 111 qui sont les plus jeunes, les cellules KB.EA I1 ayant un pouvoir hkmadsorbant intermediaire.

Les cellules en mitose peuvent Cgalement &re hkmadsorbantes comme cela a kt6 observk avec les cellules KB.EA I (tableau 11).

( b ) Evolution de la capacitk htmadsorbante en fonction d u temps Les observations pour des raisons pratiques telles que perte des cellules au

cours du lavage, doute quant Q leur identification n'ont pu &re poursuivies au delQ de 24 heures Q l'exception d'un seul cas (tableaux I11 e t IV). Les rC- sultats obtenus montrent que dans les limites de temps de l'expkrimentation la production virale des cellules conserve la meme intensitk.

3. Recherche des antigines viraux par immunoJEuorescence Les antigenes viraux dktectCs par immunofluorescence sont exclusivement

localisCs dans le cytoplasme soit d'une fason diffuse Q la pCriphCrie de la cellule, soit sous forme de granulations. Bien que la fluorescence soit mani-

TABLEAU I Proportion de cellules produisant du virus ou contenant de l'antigene viral

Technique employee KB.EA I KB.EA I1 KB.EA 111

yo des cellules inoculCCs induisant des plages en 4 jours 30 < 1 90-100

% des cellules hemadsorbant les hematies de 35.91 63.01 92.40 cobaye (27.849)* (61-65)* (90-94)*

yo des cellules fixant les anticorps fluorescents 90-100 90-100 90-100

% des clones produisant du virus 100 100 100

'Les chiEres entre parentheses indiquent les valeurs extiCmes obtenues au cours d'au moins trois experiences.

FIG. 1. Pourcentage de cellules hemadsorbantes en fonction du nombre d'hematies absorbees par cellule. La ligne pointillee indique le pourcentage de cellules absorbant entre 10 et 30 hematies. KB.EA I : nombre total de cellules examinbes, 375; proportion en cellules hemadsorbantes, 35.91y0. KB.EA 11: nombre total de cellules examinees, 205; proportion en cellules hemadsorbantes, 63.01%. KB.EA 111: nombre total de cellules examinees, 152; proportion en cellules hemadsorbantes, 92.40%.

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72.60% do ce l lu les odsorbonh plus d e I0 h6mol ies

11.27% dece l lu los adsorbants p lus de I0 he'maties

IO.53% de c e l l u l e s adsorbants p l u s de I0 hdmo t i e s

n o m b r e d ' h e 'mat ies a d s o r b i e s par ce l lu le

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TABLEAU I1 H6madsorption par les cellules KB.EA I en mitose

Nombre de mitoses observees 73 Nombre de mitoses hemadsorbantes 13* % de mitoses hemadsorbantes 17.80%

-

'Parmi lesquelles: neuf metaphases, trois anaphases, une telophase.

TABLEAU I11 Conservation au cours des temps de la capacit6 hemadsorbante des cellules KB.EA isol6es

KB.EA KB.EA KB.EA Cellules I I I 111

Nombre de cellules observCes Duree de l'observation Nombre de cellules hemadsorbant au temps 0 0 hCm.* 10 2 7

1-10 him. 7 5 1 10 hCm. 3 1 7

Nombre de cellules conservant la m&me ca- 0 hCm. 8 2 5 pacite hemadsorbante pendant la d u d e de 1-10 hem. 6 5 0 I'observation 10 hem. 1 1 5

.hem. = hematie.

TABLEAU I V ' Exemples de 1'6volution au cours du temps de la capacit6 hemadsorbante des cellules KB.EA

Nombre d'hematies absorbees sur les cellules Temps (heures) a * b E d e f I? h

*Les lettres a, b, c, etc., designent les cellules isolees examin6es.

TABLEAU V Production virale dans les liquides surnageants des clones KB.EA I et KB.EA I11

Nombre de clones Nombre de clones JCB.EA I positif3 KB.EA I11 positifs Nornbre de clones Nombre de clones

MCthode de detection observes observes

HCmadsorption/cellules de rein de singe (M. Rlzesus)

Pas fait

*e.c.p. = effet cytopathog5ne. tLes chilTres entre parenthsses indiquent le nombre de cultures pr6sentant des lesions syncytiales.

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feste dans au moins 90 pour 100 des cellules, celle-ci reste faible et dlintensitC inCgale selon les cellules.

4. Proportion des clones KB.EA producteurs de virus Des clones furent Ctablis selon la technique de Puck (cf. Materiel et tech-

niques) B partir de trois lignkes KB.EA I, I1 et 111. Le virus fut d'abord recherchC dans le liquide surnageant par observation de l'effet cytopathogene e t par hCmadsorption. La recherche du virus dans le liquide surnageant se rCv&la suffisante pour les clones KB.EA I et 111 (tableau V). I1 fut meme facile de dCtecter le virus dans le liquide surnageant des clones KB.EA 111. Db le premier passage sur cellules KB des lesions syncytiales apparurent avec le liquide surnageant de tous les clones CprouvCs.

Les deux autres lignkes se comporterent differemment. Sur sept clones KB.EA I, deux donnerent des lesions syncytiales au premier passage, lCsions peu nombreuses, discretes e t arrstant de progresser pour finalement disparaf- tre (tableau V). Les autres clones prksenterent un effet cytopathog2ne (e.c.p.) tardif e t non specifique caractCrisC par l'arrondissement des cellules qui se dhtachaient du verre. Ce e.c.p. progressait lentement apres le cinquieme jour de l'inoculation. Le test dlhCmadsorption effectuC sur cellules de rein de singe avec le liquide surnageant des troisieme passages Ctait positif sur tous les clones B l'exception d'un seul oii la reaction ktait tr2.s faible.

La mise en evidence du virus fut encore plus difficile avec les cellules KB.EA I1 (tableau VI).

Au premier passage aucun liquide surnageant de clone ne donna de lbions, meme non spkcifiques. Quelques lesions dont certaines de type syncytial apparurent au deuxieme passage. Cependant le test d'hCmadsorption etait positif 4 fois sur 5 au deuxi&me passage.

Pour contrhler ces premiers rksultats et afin de savoir si du virus syncytio- formateur Ctait produit meme quand le liquide surnageant des cellules clonCes ne semblait pas en contenir, 1000 cellules KB.EA I1 de chaque clone furent inoculCes sur des cultures KB normales comme indique plus haut. Au premier

TABLEAU VI Production virale des clones KB.EA I1

--

Nombre de clones positifs Materiel analvs6 MCthode de detection Nombre de clones observCs

Liquide surnageant e.c.p.* sur cellules KB - 0 au premier passage 20

Hemadsorption sur cellules - 5 au deuxihme passage KB 5

Cellules KB.EA I1 e.c.p. sur cellules KB - 12 (I)$ au premier passage 15

Hbmadsorption sur cellules 14 au premier et deuxihme KB

- 15 passage

Interf6rencet avec virus - 12 para-influenzae type 3 12

*e.c.p. = effet cytopathog2ne. tInterfCrence r6alisCe par inoculation de 100 doses infectieuses 50% de virus para-influenzae 3. t(l) = une culture prkentant des lesions syncytiales.

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TABLEAU VII Proportion des colonies clonales KB.EA hdmadsorbantes

Nombre de colo- yo de colonies Lignde cellulaire nies* observdes hkmadsorbantes

*Les colonies soumises au test d'hemadsorption 6taient Pg6es de 14 jours.

passage une culture sur seize prksenta des lCsions syncytiales, 4 sur 16 ne prCsentaient aucune 1Csion et 11 sur 16 eurent un effet cytopathoghne non spkcifique. Au cinquihme passage des l6sions syncytiales Ctaient observkes dans 9 cultures sur 16. L'kpreuve d'hkmadsorption pratiquCe au premier e t deuxihme passage fut positive sur 14 des 15 cultures testkes.

Enfin une C~reuve d1interf6rence Dar surinfection des clones avec 100 doses infectieuses 50% de virus para-influenzae type 3 montrait une protection dans 100% des cas.

Les diffkrents tests pratiquks sur les clones KB.EA, soit recherche de I'effet cytopathog&ne, hkmadsorption, interfkrence avec le virus para-influenza type 3 ont donc kt6 positifs avec une intensitk trhs variable selon les clones. M&me avec les clones KB.EA I11 dont les liquides surnageants entraidrent tous un effet cytopathoghne au premier passage, les Ibions survenaient entre 1 e t 5 jours.

Ces faits sont en accord avec ceux obtenus par hCmadsorption sur ceIIules isolkes et sont confirmks par I'Ctude de la capacitk hkmadsorbante des colonies clonales. Certains clones hCmadsorbent fortement, d'autres plus faiblement, enfin certains, pas du tout (tableau VII) (fig. 2, 3 e t 4).

Paradoxalement et Dour une raison inconnue les clones KB.EA I hkmad- sorbaient dans une proportion beaucoup plus grande que les cellules isolkes.

I1 a kt6 observC A plusieurs reprises des colonies contigues dont I'une est fortement hCmadsorbante tandis que I'autre ne l'est pas (fig. 5).

La comparaison du diamhtre moyen des colonies hkmadsorbantes et non hkmadsorbantes ne rCvhle pas de diffkrence significative (tableau VIII).

TABLEAU VIII Diametre moyen des colonies clonales KB.EA hCmadsorbantes (Hd+) ou

non-hdmadsorbantes (Hd - )

~~~b~~ de % ,je cola- Diamhtre moyen colonies Hd+ Cellules colonies nies Hd+ Diamhtre moyen colonies Hd-

KB.EA I 72 84% 0.37 mm*- 0 -43 rnm

0.86

KB.EA I1 65 34% 1.06 mm 0.98 1.08 mm

KB.EA 111 64 66 % 1.16 mm 1.12 rnm = 1.03

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FIG. 2. Clone KB.EA I11 fortement hemadsorbant. Fixation au liquide de Bouin. Coloration h6matoxyline-eosine. X 134.

FIG. 3. Clone KB.EA 111 h6madsorbant faiblement. Fixation au liquide de Bouin. Coloratioil hCmatoxyline4osine. X 134.

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FIG. 4. Clone KB.EA I11 non h4madsorbant. Fixation au liquide de Bouin. Coloratioil hematoxyline-4osine. X 134.

FIG. 5. Zone froutikre entre deux clones KB.EA 111 contigus dont I'un est forteinent hemadsorbailt e t l'autre nor1 h6inadsorbant. Fixation au liquide de Bouin. Coloration h~matoxylii1ee6osine. X 134.

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DANIEL: PARA-INFLUENZAE VIRUS

TABLEAU IX Conservation du caractere hemadsorbant (Hd+) et non-

hemadsorbant (Hd-) des clones KB.EA 111

Nombre de clones

Observation Observation Experience initiale finale

1 Hd + 24 29 (1 jour) Hd - 21 16 (1 jour)

2 Hd + 3 3 (10 jours) Hd - 2 2 (10 jours)

3 Hd + 10 11 (4 jours) Hd - 2 1 (4 iours)

NOTE: H d + = hbmadsorbant: Hd - = non-h6madsorbant; les chiffres entre parentl~eses indiquent la duree de L'observation.

Enfin la recherche du pouvoir hemadsorbant en fonction de temps a CtC menbe sur des clones KB.EA I11 dCve1oppi.s depuis 14 jours. Celle-ci a montrC que la majorit6 des clones conservaient leur caracdre h6madsorbant pendant la durCe de I'observation (tableau IX).

Discussion et conclusions Les rCsultats obtenus peuvent &re classCs en deux groupes d'apr&s les

informations qu'ils apportent. Dans un premier groupe nous pouvons classer les renseignements donnCs par I'immunofluorescence et la recherche du virus dans les clones. Au deuxiBme groupe appartiennent Ies rbultats fournis par la dCtection des centres infectieux e t I'hCmadsor~tion.

Le premier groupe de rCsultats dCmontre que toutes les cellules contiennent de I'antig&ne viral. Avec un syst&me tr&s voisin du nbtre (cellules conjonc- tivales humaines - para-influenzae type 3) Cole e t Hetrick (1) ont abouti rCcemment B une conclusion semblable. La transmission du virus se fait donc de la cellule m&re aux cellules filles sans intervention de facteurs extCrieurs tels qu'anticorps, ou prCsence de particules incompl&tes protkgeant par neu- tralisation du virus ou par interfbrence des cellules rest6es non infectees. Pour expliquer la rksistance des cellules infectkes 2 l'action destructrice du virus il faut donc supposer I'existence d'un inhibiteur intracellulaire soit du type interfkron soit du type rCpresseur conformCment A l'hypoth6se de Walker e t Hinze (9, 10). Cette derniitre hypoth&se a CtC formul6e 2 la suite de I'Ctude d'un systitme porteur (cellules conjonctivales humaines - virus rougeoleux) oii I'interfCron ne semble pas devoir expliquer la persistance de l'infection.

Dans le deuxi&me groupe de rksultats soit ceux obtenus par la determination des centres infectieux e t I'hCmadsorption il y a une grande variabilite dans les rCsultats selon la lignCe KB.EA considCrCe.

Les diffkrences observCes selon les souches dans le pourcentage de centres infectieux induits s'explique facilement par les caract&res diffCrents du virus produit selon les lignCes KB.EA. Comme il a CtC rapport6 pr6cCdemment (3) les cellules KB.EA I et I1 produisent trits peu de virus syncytioformateur e t inducteurs de plages, contrairement aux cellules KB.EA 111.

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1064 CANADIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY. VOL. 12. 1966

Les donnkes fournies par I'hkmadsorption semblent montrer que l'intensitk de la production virale varie d'une cellule B une autre ce que l'on pouvait dCjB soupsonner en ktudiant la production virale des clones. En se basant sur le nombre d'hkmaties absorbkes par cellule on peut considher qu'il y a des cellules fortement productrices, modkrkment productrices e t faiblement ou non productrices de virus. Ces diffkrences pouvaient Ctre dues B une kvolution cyclique de la production virale de chaque cellule qui passerait pkriodique- ment de l'ktat fortement producteur B I'ktat faiblement producteur. Cependant les expkriences d'hkmadsorption en fonction du temps semblent montrer qu'il s'agit d'un caractitre cellulaire stable dans les limites de temps des obser- vations puisque les cellules cultivkes isolkment e t fortement hkmadsorbantes le restent pendant au moins 24 heures. Inversement les cellules non hkmadsor- bantes conservent cette propriktk pendant le mCme temps.

Les clones KB.EA, qui prksentent la mCme variabilitk dans leur capacit6 hkmadsorbante, conservent kgalement leur caractitre hkmadsorbant pendant un temps d'observation allant parfois jusqu'B 10 jours. De plus les cellules constitutives d'un mCme clone hkmadsorbent avec la mCme intensitk ce qui est un nouvel argument en faveur de la stabilitk du caractitre hkmadsorbant. Cependant les clones non hkmadsorbant peuvent prksenter parfois une cellule ou un petit groupe de cellules qui hkmadsorbent, montrant ainsi que le ca- ractitre hkmadsorbant peut apparaitre kventuellement.

L'ktude du pouvoir hbmadsorbant des clones a permis kgalement d'observer B plusieurs reprises deux colonies clonales en contact ktroit dont l'une hk- madsorbait tr6s fortement, alors que I'autre ne fixait aucune hkmatie. Ce qui montre I'immunitk des clones non hkmadsorbant vis-8-vis du virus. En outre la comparaison des diamPtres moyens des colonies clonales dans les trois lignbes KB.EA, qu'elles soient hbmadsorbantes ou non ne montre aucune diffkrence significative. La croissance cellulaire n'est donc pas affectke par le caractitre hkmadsorbant. Ceci ne doit pas surprendre puisque nous savons que toutes les cellules KB.EA sont infectkes.

En conclusion il ressort des expkriences exposkes plus haut que toutes les cellules contiennent de l'antigitne viral, mais que la production de virus est trits variable d'une cellule B une autre e t semble constituer un caractitre stable propre B chaque cellule. Ce caractitre hkmadsorbant est peut-Ctre en relation avec le genotype cellulaire puisqu'il a pu Ctre montrk que la distribu- tion chromosomique des cellules KB.EA diffkrait de celle des cellules KB e t ce d'autant plus que les cellules KB.EA sont plus 3gkes (5, 6) ce qui va de pair avec la production virale dont l'intensitk diminue avec I12ge des cultures.

Remerciement Nous sommes heureux de remercier ici Madame Murielle Samson pour

son excellente assistance.

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