Bcitr. Klin. Tuberk. 135, 364--369 (1967)

Experimentelle Chemotherapie yon Mycobacterium kansasii-Infektionen im Tierversuch

B. BunzA~ovX und R. URBAIq~iK Institut fiir Tubcrkulose, Bratislava (Direktor: Dr. reed. J. MARKOVlS)

Eingegangen am 3. M~rz 1967

Die Gruppe der Erkrankungen, welehe durch sog. atypische Mykobakter ien verursacht wird, bedeute t ffir die Chemotherapie ein schwieriges Problem, in erster Linie, weil diese Mykobakter ien in der Regel uncmpfindlich sind gegeniiber den meisten heute zur Verffigung stehenden Tuberkulostat ica. Un te r diesen Mykobakter ien spielt die Gruppe 1 nach R u ~ y o N eine wichtige Rolle, deren St/imme als Mycobacter ium kansasii bezeichnet werden. Zwar ]iegt die Frequenz solcher St/~mme als Erreger einer Lungenmykobakter iose nieht hoch - - in der Tschechoslowakei fand Kv3ai~ [5] insgesamt 22 solche Fiille ill den Jahren 1955 bis 1965 und MmSSNER [6] entdeckte 19 Kranke in den Jahren 1958--1963. Andererseits aber sind bisher keine geeigneten Kombina t ionen gefunden worden, mit denen ein sicherer chemotherapeut ischer Erfolg erzielt werden konnte. Die vorliegende Arbei t bespricht unsere Ergebnisse mit der Empfindlichkeitsbestim- mung verschiedener Kansasii-St/ imme im Reagenzglasversuch und mit der Be- handlung einer experimentellen Mykobakteriose yon weiBen M~usen.

Material und Methoden Tuberkulostatlca. Isoniazid, Dihydros~reptomycin, PAS/Na-Salz, Cycloserin, Viomycin,

Kanamyein, Conteben, Athionamid und Pyrazinamid (Tebrazid) waren die iiblichen Erzeug- nissc versehiedener Herkunft. ~Veiter untersueht wurden Isoxyl 1, Etoxyd 2undT283/2 (-J~thyl- 3-Imino-(9, 10)-As-Phenantrotriazin-Hydroehlorid) a. Fiir die Reagenzglasversuche wurden das t~thionamid und Conteben in J~thylenglykol, Isoxyl und Ethoxyd in 96~) _~thanol und alle anderen Stoffe in destilliertem ~Vasser gel6st. In den M~iuseversuchen wurden die Tuber- kulostatica peroral verabreicht vermischt, mit der Di~,t naeh L~ms~ (Einzelheiten s. TI~e~KA U. Mitarb. [9]).

N~ihrb6den. Die Reagenzglasempfindlichkeit der St~mme gegeniiber den meisten Tuber- kulostatica untersuchten wit am Ei~rnghrboden naeh LSWE~ST~.~-JE~s~¢, fiir l~yrazinamid wurde der flfissige ~ula-N~hrboden (Methodik s, HAVEL u. Mitarb. [4]), fiir Isoxyl, Ethoxyd und T 283 der feste Ni~hrboden naeh ~u]a mit Agar gew~hlt. Die Zahl der lebenden Mykobak- terieneinheiten in den M~useversuehen wurde an dem festen ~ula-N/ihrboden mit Agar bestimmt,.

St~imme. Im Reagenzglasversuch wurde die Empfindlichkeit yon 14 Kansasii-Sti~mmen verschiedener Herkunft (Dr. M. KvBi,-r, Prag; Prof. P. HAUDUROY, Lausanne; Dr. E. H. Ru~YoN, Salt Lake City) verfolgt. Ffir tie Versuche wurden Suspensionen in physiologischer

1 Das Isoxyl verdanken wit Herrn ~ ]?Emir yon der Continental Pharma. 2 Das Ethoxyd verdanken wir Herrn Prof. G. N. PER~I~. a Das Pr/iparat T 283 verdanken wit Herrn Dr. W.-H. ~VACt~EI¢, Hoechst. Einzelheiten

s. Drug. Research 13, 3--7 (1963).

Experimentelle Chemotherapie v. Mycobacterium kansasii-Infektionen im Tierversuch 365

KochsalzlSsung yon einer 21 Tage al ten Kul tu r (1 mg pro ml) hergestellt, 1 : 100 verdfinnt und die einzelnen ]~prouvetten mit 0,1 ml dieser Verdiinnung beimpft. :Die Ergebnisse wurden nach 14 Tage Bebrii tung bei 37°C abgelesen. Ffir die M~useversuche wurde der Stature ,,Pkg 8" (Dr. RUNYON) gew~hlt wegen seiner relativ hohen Virulenz ffir weil3e M/iuse (BuRJA~OV~ [1]). Die Infekt ion erfolgte intraven6s, die entsprechenden Infektionsdosen sind weiter angegeben.

)liiuse. Alle Versuche wurden an weiBen weiblichen M~usen des Stammes H/Asw, Durch- sehnittsgewicht 18 g, durchgefiihrt. Im Verl~uf der Versuche wurden die Tiere mi t der Digit nach LARSE~ und mi t Wasser gefiittert.

Bestimmunff der Aktivitdt des Sto//es im Tierversuch. Als Hauptkr i te r ium fiir die Aktivit~ts- best immung eines Stoffes galt das Verfolgen der Z~hl lebender Mykobakterieneinheiten (LME) in der Lunge (Einzelheiten s. URnA~fK u. Mitarb. [11]) yon je 3 zugleich getSteten M~usen. Weiter bes t immten wir die Zahl der LME in einigen anderen Organen, das spontane Verenden der Tiere, Durchschnit tsgewichte der Tiere im Verlauf der Versuche, Durchschnit tsgewichte versehiedener Organe im Verlauf der Versuche und in einigen :F~llen aueh die makroskopischen und histologisehen Befunde. In einigen F~illen wurde auch die Resistenzentwicklung der Keime im Verlauf der Behandlung verfolgt.

E r g e b n i s s e

D ie E m p f i n d l i c h k e i t d e r 14 K~nsas i i -S tb , m m e i m R e a g e n z g l a s v e r s u c h gegen-

f ibe r v e r s c h i e d e n e n T u b e r k u l o s t a t i c u i s t i n d e r T a b e l l e z u s a m m e n g e f a l 3 t . Gewisse

Tabelle. Emp/indlichkeit yon M. kansasii gegeniiber Tuberkulostatica

Stamm M. kan- sasii

Tuberkulostat ica gq

PKG8 I~101 R 5 R10 R40 S 2 R10 S 3 _ a R8 S S S K a r n o l d . R10 R10 1%10 R40 S S S -- R16 S S S J .C.521c 1%10 R10 R10 R40 S S S -- - - S - - S Westphal R10 R10 R I 0 R20 S R30 R 5 R40 R 8 S S -- P K G 1 8 R0,2 R5 R10 R40 S S S -- R 8 S S S

226 R1 R10 R I 0 R40 S S S R40 -- S -- - - 232 R0,2 R I 0 R10 S S S S S . . . .

1416 R0,2 R10 R10 S 1%30 S S R20 -- S -- - - 1425 R10 1%10 R10 R20 S S S R40 -- S -- - - 1431 R1 R 3 R10 S S S S S -- S -- - - 2550 R0,2 R10 R1 R30 S S S R20 . . . . 2436 ~0 ,2 1%3 1%1 S S S S S . . . . 2437 R1 R 3 1%10 R30 S t¢10 S S . . . . Posvanec R0,2 S R0,3 S S S S -- R16 -- S S

1 Die Nummern bezeichnen die Konzentra t ion in ~g/ml, gegen welehe die St//mme resistent sind.

2 Empfindlieh auf die niedrigste angegebene Konzentrat ion. 3 Auf der Grenze der Resistenz gegen/iber 1 ~zg/ml. a Nicht durchgefiihrt.

t, u b e r k u l o s t a t i s c h e A k t i v i t i ~ t f i n d e r m a n be i Cyc lose r in , / ~ t h i o n a m i d , C o n t e b e n

u n d te f lweise a u c h be i K a n a m y c i n , w e i t e r h i n ' auch be i I s o x y l , E t h o x y d u n d ge-

w i s se rma l~en a u c h be i T 283.

Die B e h a n d l u n g m i t e i n i g e n h e u t e i ib l i ch b e n u t z t e n T u b e r k u l o s t a t i c a ( A b b . 1)

bewies , d a b d e r e n W i r k u n g be i e x p e r i m e n t ' ] l e r M i ~ u s e m y k o b a k t e r i o s e n i c h t n u t

Abb. 1

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Abb. 2

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Abb. 4

Legenden zu Abb. 1--4 gegeniiberliegende Seite

B. BV-e~A~OV~[ u. R. URBAN~iK: Exp. Chemotherapie v.M.kansasii-Infektionen 367

weniger Ms gering ist, sondern dal~ die Verabreichung von Isoniazid oder PAS eine ErhShung der LME in den Lungen zur Folge hat.

Die Zahlen der LME in den Lungen der Tiere im Verlauf der Behandlung mit Isoxyl, Ethoxyd, T 283 und Conteben sind in Abb. 2 dargestellt. Zur t terab- setzung der Zahl der LME kam es bei Isoxyl-behandelten M~usen, weniger im Verlauf der T 283-Behandlung und praktisch nicht w~hrend der Ethoxyd- und Conteben-Therapie.

Die Ergebnisse der Hilfskriterien (s. Material und Methoden) waren in guter l~bereinstimmung mit den oben erw£hnt~en Feststellungen. Kein Tier der Isoxyl- Gruppen verendete spontan im Gegensatz zu den anderen Gruppen. Bei vielen Tieren der behandelten Gruppen kam es zur mehrfachen Herabsetzung der Empfindlichkeit der Keime auf die verabreieh~n Stoffe.

Histologische Untersuehungen bewiesen Unterschiede nur zwischen den un- behandelten und den Isoxyl-behandelten Mgusen. Bei den Kontrollm/iusen war das Lungengewebe ditfus befallen (Abb. 1), wogegen wit bei den behandelten Tieren (4 mg pro Maus t~glich) nu t disperse Herde (Abb. 2) sehen konnten. Das fiir die Infektion allgemein charakteristische Bild besteht in der Infiltration vom Intersti t ium dutch Monoeyten, teilweise auch dutch Granulocyten, und die Alveolen sind iiberfiillt mit Histiocyten, die ein schaumiges Protoplasma auf- weisen. Nekrosen sahen wir nicht. Die Leber aller Mguse wies dasselbe Bfld einer produktiven Granulomatose auf.

Diskussion Die Ergebnisse der Reagenzglasversuche sind in guter Ubereinstimmung mit

den Erfahrungen anderer Verfasser (TARSHIS U. Mitarb. [8] ; GuY u. CHAPMAN [3] ; WOL~SKY U. Mitarb. [13] ; Vn~TANF, N [12]) sowie aueh unserer friiheren Versuche (URBANSIX [10]). Unter den Antibiotica findet man gewisse antimykobakterielle Aktivitiit bei Cycloserin und Kanamycin, weiter bei Erythromyein (GuY u. C~ArMA~ [3]; UI~BAI~SIK [10]), unter den synthetischen Stoffen sind die aktivsten neben den Thiosemiearbazonen die Thioharnstoffderivate, wie es auch unsere Erfahrungen mit Isoxyl und Ethoxyd beweisen. Im Gegensatz zu den Er- fahrungen mit; M . tuberculos is bestehen aber bei den Kansasii-St£mmen teilweise Unterschiede in der Empfindlichkeit der i n d i v i d u e l l e n St~mme, wie es bereits in den erw~hnten Arbeiten erSrtert wurde.

Der Tierversueh weist -- wieder im Gegensatz zum M . tuberculos i s - - zah]reiehe Schwierigkeiten auf. Die Maus erseheint als das geeignetste Tier in dieser Hinsicht, aber auch in diesem Fall muB die Methode der Bestimmung von LME in Organen angewandt werden, weft die iibliehen statistisehen Kriterien (z.B. die mittlere ~berlebensdauer) wegen des Oberlebens eines Tefles aueh der unbehandelten Tiere nieht geeignet sind ( B u ~ z ~ o v ~ [l]). In diesem Zusammenhang erseheint die Auswertung makroskopischer Ver~nderungen an Organen yon STEENKEN U. Mitarb. [7] aueh nieht geeignet. Da bei Kansasii-Infektion bei M~usen eine aus-

Abb. 1--4. M. Kansasi i (PKG-8)-M~uselungea

Abb. 1 und 2. Zahl lebender Mykobakterieneinheiten in den Lungen (jeder Punkt bedeutet den log der Durchschnittszahl der LME yon 3 Tieren)

25 Beitr. Klin. Tuberk., Bd. 135

368 B. BURJANOVk und R. URBAN6iK:

gesprochenc Tendenz zur Regression des Befundes besteht (vgl. die Kurven der LME-Zahlen bei unbehandelten Tieren, Abb. I), kann der Behandlungseffekt nur in einem gewissen Zeitabsehifitt verfolgt werden.

In guter Ubereinstimmung mit F~Ev.Rxs~.~ [2] war das Isoxyl das relativ wirksamste Priiparat unter den yon uns untersuehten Stoffen, iiberraschender- weise aber nieht das Ethoxyd oder Conteben. Eine m~Bige Wirkung vermerkten wir auch bei dem Triazin T 283. Die anderen Stoffe waren praktiseh wirkungslos, oder sic versehleehterten den Verlauf der Krankheit (INH, PAS), wie es bereits auch yon FgW~gKSE~ [2] berichtet wurde. Leider ist die Wirks~mkeit yon Cyclo- serin und gewissermaBen auch Kanamycin bei kleinen Versuchstieren bekannter- weise sehr niedrig, und die M~useversuche sind deswegen nicht geeignet zur Be- urteilung yon deren Aktivit~t bei photochromogenen Infektionen.

Wcnn auch unsere Versuche keine betr~ichtliche Aktivit~Lt bei J~thionamid in M~useinfektionen beweisen konnten, erlauben uns die relativ gfinstigen Er- fahrungen yon F~EEgKSE~ [2] mit hSheren ~thionamid-Dosen zu schlieBen, dab sowohl im Reagenzg|as wie im M£useversueh die Thio-Stoffe allgemein und insbesondere die Thioharnstoffderivate (CIBA SU 1906, Isoxyl) als potentielle ,,Mykobakteriostatica" fiir die Behandlung yon Kansasfi-Erkrankungen bei Menschen erseheinen. Die endgi~tige Entseheidung bedarf jedoeh kllnlscher Versuehe.

Zusammenfassung Auf Grund der Reagenzglasversuche bei 14 verschiedenen St~mmen von

M. kansasii sowie der experimentellen Chemotherapie einer M~usemykobakteriose (Stamm ,,Pkg 8") erscheint das Isoxyl (4,4-Diisoamyloxythiocarbanilid) und gewissermaBen aueh das Triazin T 283 als wirksam. Im Reagenzglasversuch konnte antimykobakterielle Aktivit~t auch bei Cycloserin, Kanamyein, Conteben und Ethoxyd (4,4'.Di~thoxyearbanilid) fcstgestellt werden. Sowohl Contebcn wie Ethoxyd waren unter den Bedingungen dieser Veisuehe bei Tieren wirkungs- los. Es werden die methodologischen Schwierigkeitcn des Tierversuches bei experimenteller Chemotherapie yon Kansasii-Infektionen besproehen.

Far technische Mitarbeit danken wit herzlichst E. D~cHo~ov~.

Experimental Chemotherapy of Myeobaeterium kansasii Infection in Animal Experiment

Summary The results of our experiments in vitro (14 strains of photochromogens) and

in vivo (M. kansasii, strain "Pkg 8") suggest that Isoxyl (4,4-Diisoamyloxythio- carbanilide) had marked effect upon the experimental disease of white mice provoked by M. kansasii whereas Triazin (T 283) displayed only limited effect upon this infection.

In the tests in vitro Cycloserine, kanamycin, Conteben and Ethoxyd (4,4'- Diethoxyearbanilide) were active against the strains of group I tested. Conteben and Ethoxyd in the dosage used had practically no effect upon the infection in white mice.

Several difficulties of provoking and treating the experimental mycobacteriose of white mice are discussed.

Experimentelle Chemotherapie v. Mycobacterium-kansasii-Infektionen im Tierversuch 369

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Dr. reed. BLANKA BURJANOVk Ustav Tuberkulozy Palisady 47, Bratislava/OSSR

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