Chemie lngenieur Technik (70) 4 I98 S. 382-389 D WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69469 Weinheim, 1998

0009-286X/980404-0382 $17.50+.50/0

Experimentelle und theoretische Untersuchungen der Gradientenchroma- tographie von Proteinen

K A T H L E E N M I H L B A C H L E R , F R I E D R I C H B l R G E R A N S P A C H U N D A N D R E A S S E I D E L - M O R G E N S T E R N '

Herrn Prof. Dr.-lng. U L R I C H H O F F M A N N zum 60. Geburtstag

Zur Gewinnung von Proteinen aus

komplexen Gemischen besitzt die

praparative Saulenflussigkeitschro-

matographie in wadrigen Losungen

eine grode Bedeutung. Zur Optimie-

rung des chromatographischen

Trennprozesses hat sich die Anwen-

dung eines Losungsmittelgradienten

bewahrt. Hierbei wird, im Gegensatz

zur isokratischen Arbeitsweise, die

Elutionskraft des Losungsmittels

wahrend der Trennung erhoht. Dazu

wird zu einem Losungsmittel mit

niedriger Elutionskraft ein steigen-

der Anteil eines Losungsmittels mit

hoher Elutionskraft zugemischt. Das

Ziel dieser Arbeit ist es, anhand

eines einfachen experimentellen

Beispiels einen Beitrag zum

Verstandnis und zur quantitativen

Beschreibung der praparativen Gra-

dientenchromatographie geloster

Proteine zu leisten. Basis der Ana-

lyse ist die experimentelle Bestim-

mung verschiedener Chromato-

gramme des Modellproteins Lyso-

zym an einem Kationenaustauscher.

Zeil [s]

1 Einleitung Zur Gewimung von Proteinen aus komplexen Gemischen besitzt die praparative Saulenflussigkeitschromatographie in wagrigen Losungen eine groRe Bedeutung. Zur Optimie- rung des chromatographischen Trennprozesses, insbeson- dere der Reduzierung der Retentionszeiten bei einer mog- lichst hohen chromatographischen Auflosung, hat sich die Anwendung eines Losungsmittelgradienten bewahrt. Hier- bei wird, im Gegensatz zur isokratischen Arbeitsweise, die Elutionskraft des Losungsmittels wahrend der Trennung er- hoht. Dazu wird zu einem Losungsmittel mit niedriger Elu- tionskraft ein steigender Anteil eines Losungsmittels mit hoher Elutionskraft zugemischt.

Die am haufigsten zur Isolierung von Proteinen eingesetzte chromatographische Methode ist die Ionenaus- tauschchromatographie [ 11. Die Trennung beruht auf Unter- schieden der Nettoladung sowie der Ladungsanordnung fur verschiedene Proteine [Z] . Die Wechselwirkung der Ladun- gen rnit einer positiv (Anionenaustauscher) oder negativ (Kationenaustauscher) geladenen stationaren Phase wird zur Trennung ausgenutzt. Zur Stabilisierung des pH-Werts

Experimental and Theoretical Studies on Gradient Chromatography of Proteins

Preparative liquid column chromato- graphy is a powerful method for the isolation of proteins from complex mixtures. The use of solvent gradients has proved invaluable in the optimisa- tion of the chromatographic separation process. In contrast to isocratic chro- matography, the eluting strength of the solvent is increased during the se- paration. To this end, an increasing proportion of a solvent of high eluting strength is added to solvent of low eluting strength. This publication is in- tended to contribute to the general understanding of and to a quantitative description of preparative gradient chromatography of dissolved proteins. The analysis is based on the experi- mental determination of various chro- matograms of the model protein lyso- zyme on a cation exchanger.

werden Pufferlosungen rnit definierten Ionenstarken als mobile Phase eingesetzt. Bei der Gradientenchromatogra- phie wird das zu trennende Gemisch zunachst bei niedriger Salzkonzentration auf die Trennsaule dosiert und der Gra- dient anschliegend durch eine kontinuierliche Erhohung der Salzkonzentration realisiert. Diese fiihrt verglichen mit der isokratischen Arbeitsweise zu kiirzeren Elutionszei- ten.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, anhand eines einfa- chen experimentellen Beispiels einen Beitrag zum Ver- standnis und zur quantitativen Beschreibung der prapara- tiven Gradientenchromatographie geloster Proteine zu lei- sten. Basis der Analyse ist die experimentelle Bestimmung

* K. MIHLBACHLER, University of Tennessee, Knoxville, Departement of Chemistry,

Otto-von-Guericke Universitat Magdeburg, Institut fur Verfahrenstechnik, Universitats-

I" 37996, Prof. Dr.-Ing. A. SEIDEL-MORGENSTERN,

platz 2, D-39106 Magdeburg; F. 8. ANSPACH, GESELLSCHAFT FUR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig.

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%.I

383

q k q X+I

verschiedener Chromatogramme des Modellproteins Lyso- zym an einem Kationenaustauscher.

Einen aerbl ick uber bisherige Arbeiten zur Gra- dientenelution geben G U I OC H 0 N et al. [3]. Ausgangspunkt einer mathematischen Modellierung sind in der Regel Zel- lenmodelle sowie auf dem Dispersionsmodell aufbauende Konzepte [4-71. E B L E et al. [7] konnten fir verschiedene Stoffsysteme aerladungseffekte bei der isokratischen Chromatographie mit Umkehrphasensaulen unter Venven- dung des besonders einfachen und anschaulichen Zellen- modells nach C R A l G [8] erfolgreich beschreiben. Dieses Mo- dell wird auch fur die in dieser Arbeit durchgefuhrte Ana- lyse eingesetzt.

2 Theorie 2.1 Zellenmodell nach C R A I G

Die Venvendung eines Zellenmodells ist eine einfache Mog- lichkeit der mathematischen Beschreibung des chromato- graphischen Prozesses und der Simulation des ortlichen und zeitlichen Verlaufs der Konzentrationen in einer Trenn- saule. Das auch bei der Beschreibung von Extraktionspro- zessen eingesetzte Craig-Mode11 basiert auf einer Einteilung der Saule in N gleich groRe Zellen, in denen sich jeweils Gleichgewichtszustande einstellen'). Abb. 1 zeigt schema- tisch eine Reihenschaltung solcher Zellen. In jeder Zelle be- findet sich ein Volumenanteil E an flussiger Phase und ein Volumenanteil (1 - E ) an stationarer Phase. Nach Einstel- lung des Gleichgewichts wird jeweils die flussige Phase mit der gelosten Substanz an die folgende Zelle weitergege- ben und durch das entsprechende Volumen der Zelle davor ersetzt. Danach stellt sich wiederum ein Gleichgewicht ein. Eine Massenbilanz f i r eine Zelle k mit dem Volumen v k ( v k = Vside/N) liefert im Gleichgewicht vor dem Weiter- geben der Flussigphase (Zeitpunkt j ) :

Die Beladung q: der stationaren Phase ist dabei eine uber die Adsorptionsisotherme festgelegte Funktion der Flussigphasenkonzentration c$;. Durch den beschriebe- nen Weitertransport der flussigen Phase ergibt sich zum Zeitpunkt j + 1 folgende neue Gesamtmenge in der Zelle k:

(3)

Eine Kombination der Gln. (1-3) liefert folgende Bilanzgleichung fiir die Zelle k des Craig-Prozesses:

~(6:' - .',-,) + (1 - ~)($k+'($') - dk(Ck)) = 0 k = 1..N (4)

Diese Gleichung gestattet bei Kenntnis von c"k, dk-', E sowie der Adsorptionsisothermen, q(c), die Ermittlung der neuen Gleichgewichtskonzentration 6;'. Fur nichtli- neare Isothermen ist dazu in der Regel eine iterative Be- rechnung erforderlich.

Um das Craig-Mode11 Wr die Beschreibung des chromatographischen Trennprozesses verwenden zu kon- nen, verbleibt die Angleichung der Zeitdauer zwischen zwei Verschiebungen At = tj+' + tj, an den Volumenstrom der mobilen Phase V. Es gilt zu sichern, daR eine am Saulen- eingang aufgebrachte Menge an Losungsmittel nach Ver- streichen der Totzeit to am Saulenende b m am Ausgang der N-ten Craig-Zelle ankommt. Dazu muR gelten:

EV t At N = to = - b m . At = 1 V N (5)

Mit der Zeitschrittweite At ist fur alle Zellen ( k = 1, N ) die Bilanzgleichung (4) zu losen. Um die Berech- nung zu initialisieren, verbleibt zum einem die Festlegung einer Anfangsbelegung. Geht man von einer nicht vorbela- denen Saule aus, gilt:

c:.= 0, & = 0 k = 1..N ( 6 )

Weiterhin ist am Sauleneingang (k = 0) die Dosie- rung der Probe zu beriicksichtigen. Dies kann in der Regel einfach uber eine Rechtecldunktion erfolgen:

cinj fur j * At 5 tinj 0 fur j * At > tinj b0= ( (7)

G1. (7) beschreibt, daR am Sauleneingang wah- rend der Injektionszeit tinj die Dosierkonzentration cinj vor- liegt. Danach wird reines Losungsmittel zugefiihrt. Die in der Regel experimentell zu bestimmenden freien Parameter des beschriebenen Craig-Modells sind die Porositat E , die Zellenzahl N und die Adsorptionsisotherme q(c) . Insbeson- dere die experimentelle Ermittlung und die genaue Be- schreibung der Adsorptionsisothermen ist in der Regel keine triviale Aufgabe.

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komplizierte Isothermenverlaufe zu beobachten. Im Fall der Ionenaustauschchromatographie ist der Verlauf der Isother- men starkvom pH-Wert, der LeitfZhigkeit, dem PI-Wert des Proteins und der Art des Austauschers [ll] abhangig.

In der Regel ist es zweckmadig, zunachst zu ver- suchen, das Adsorptionsgleichgewicht mit dem einfachen Langmuir-Model1 zu beschreiben [3]:

wobei qs die Sattigungsbeladung und a eine die Adsorpti- onsenergie bewertende Konstante sind. G1. (8) hat sich je- doch fiir viele Systeme zur Beschreibung der Isothermen als nicht genau erwiesen [3]. Zur Erhohung der Flexibilitat des Isothermenmodells wird deshalb haufig eine Erweite- rung um ein quadratisches Glied vorgenommen! Die mit Me- thoden der statistischen Thermodynamik ableitbare Ad- sorptionsisothermengleichung lautet [ 141 :

(9)

G1. (9) wird im folgenden enveiterte Langmuir- Isotherme genannt und enthalt die drei freien Parameter qs, a und b. Mit dieser Gleichung konnen im Unterschied zu G1. (8) auch Isothermen mit Wendepunkt beschrieben werden.

Wie dargestellt, kann der zeitliche und ortliche Verlauf der Konzentration in einer chromatographischen Trennsaule mit dem Craig-Modell, GI. (4). numerisch be- rechnet werden. Bei Verwendung der Isothermengleichung (9) ist fiir die Berechnung der jeweils unbekannten Konzen- tration d:' in jedem Gitterpunkt k eine Iteration erforder- lich. GI. (10) zeigt die verwendete aus G1. (4) in Verbindung mit G1. (9) ableitbare Interationsvorschrift zur Berechnung einer verbesserten (n + 1)-ten Nahemng aus einer n-ten Ntiherung:

Zur Initialisierung wurde der Wert des vorherge- henden Zeitschritts iibernommen ($2; = Sk). In der Regel wurde nach 4-5 Iterationen das vorgegebene Abbruchkrite- rium erreicht (A&:' I . $zt+l).

2.3 EinfluB des Salzgradienten auf die Adsorptionsisothermen

Fiir eine Simulation der Gradientenchromatographie ist zu beriicksichtigen, daB der Verlauf der Adsorptionsisother- menvon der Salzkonzentration in der Pufferlosung abhangt. Die Beladung q muls folglich sowohl als Funktion der Kon- zentration der gelosten Stoffe c als auch als Funktion der Salzkonzentration 4 beschrieben werden:

9 = q(c, 4) (11)

Die Salzkonzentration 4 ist dabei wahrend des chromatographischen Prozesses von der Zeit t und vom Ort in der Trennsaule abhangig. Haufig wird die Salzkon- zentration der Pufferlosung von einer geringeren zu einem

hoheren Wert linear erhoht. Bei Anwendung eines idealen linearen Gradienten, der unmittelbar nach Beendigung der Dosiemng beginnt, kann 4 ( f , k) folgendermafien formuliert werden:

4 a fiir t < tinj - $ t o ) fur tinj I t < tinj + toad + $to

fur t 2 tinj + tSad + 6 to

wobei und 4e der Anfangs- bzw. der Endsalzgehalt des Gradienten, tFad die Zeitdauer des Gradienten und tinj die Dosierzeit sind. p beschreibt damit die Steilheit des Gradien- ten.

Die Beschreibung des Zusammenhangs q(c, 4) ist die Voraussetzung fiir eine quantitative Beschreibung der praparativen Gradientenchromatographie. Geht man davon aus, daB eine Adsorptionsisothermengleichung q(c) fiir ver- schiedene Salzkonzentrationen 4 anwendbar bleibt und die Abhangigkeit q(c, 4) lediglich durch eine Anpassung der Pa- rameter beschrieben werden kann, gilt fiir die enveiterte Langmuir-Isotherme (Gl. 9): .

Die funktionellen Zusammenhange fur die Mo- dellparameter:

sind durch experimentelle Untersuchungen zu ermitteln.

2.4 Simulation von Chromatogrammen mit dem Craig-Mode11

Zur Demonstration des Einflusses der Isotherme und der Zellenzahl auf die Lage und Form der Chromatogramme zeigt Abb. 2 die Ergebnisse einer Simulationsstudie unter Verwendung des Craig-Modells. Variiert wurde zunachst fiir eine konstante Dosierkonzentration cinj die Dosierzeit finj. Man erkennt die durch die Nichtlinearitat der verwen- deten Isothermen deutlich von einer GauR-Verteilung ab- weichenden Peakformen. Aufgrund der fiir die Berechnung venvendeten Parameter der Isothermengleichung (9) er- hoht sich die Retentionszeit mit zunehmender Dosierzeit, verglichen mit der durch eine Pfeil markierten Retentions- zeit einer sehr kleinen (analytischen) Probemenge. Ein Ver- gleich der Kurven 1, 1' und 1" zeigt weiterhin den EinfluB der Zellenzahl N. Eine grogere Zellenzahl fiihrt in erwarte- ter Weise zu "scharferen" Peaks und hoheren Konzentratio- nen im Peakmaximum. Im Fall des Chromatogrammes 1' wird dabei ein Wendepunkt im Verlauf der Adsorptionsiso- therme uberschritten, so da13 sich das Peakmaximumwieder in Richtung kleineren Retentionszeiten verschiebt. Weitere durchgefiihrte parameterische Studien belegen die Flexibi- litat des verwendeten Modells hinsichtlich einer Beschrei- bung sehr unterschiedlicher Peakfonnen.

Chemie lngenieur Technik (70) 4 198 385

Abbildung 2. Simulation einer Uberladungsreihe unter isokratischen Bedingungen; Parameter: V = 2.04 cm2, E = 0.79. cini = 3 g/l, V = 0,4 ml/min, 9, = 103,12 g/l, a = 0,178 l/g und

1 t. . = 5 min und N = 100; 2 tini = 2,5 min und N = 100; 3 fini = 1,25 min und N = 100; 1’ fini = 5 min und N = 2000; 1” fini = 5 min und N = 50.

b = 0,0404 I2/g2;

‘nl

Zeit [ s ]

3 Materialien und experimentelle Methoden

Fur die Durchfiihrung der Experimente wurden ein Katio- nenaustauscher und eine FPLC-Anlage von PHARMACIA (Uppsala, Schweden) venvendet. Die FPLC-Anlage bestand aus Controller LCC-500 Plus, zwei Hochprazisionspumpen P-500 mit hochdruckseitigem Mischer, Motorventil MV-7, Fraktionssammler und PC mit dem Programm FPLC-Mana- ger. Ein Thermostat gewahrleistete eine konstante Saulen- temperatur von 25 “C. Der Kationenaustauscher SP-Sepha- rose HP wurde in eine Saule HR 5/10 (Durchmes- ser = 5 mm) bis zu einer Hohe von 10,4 cm nach einer Vor- schrift von PHARMACIA unter Druck gepackt. Der mittlere Partikeldurchmesser des Packungsmaterials lag bei 34 pm. SP-Sepharose HP ist ein starker Kationenaustauscher, an dessen Agarosematrix Sulfopropylgruppen gebunden sind. Die Sulfonsaure ist eine starke Saure, die unter den gewahl- ten Umgebungsbedingungen (pH = 5,O) vollstandig disso- ziert vorliegt und somit als Anion uber einen weiten pH-Be- reich existiert [12]. Als Modellproteinwurde Lysozym einge- setzt (SIGMA, Munchen, dreifach kristallisiert, dialisiert), welches eine Molmasse von 14 100 g/mol hat. Fur die Expe- rimente wurde eine Losung mit einem pH-Wert von 5 aus einem 0,l M Natriumacetat-Puffer hergestellt. Dabei zeigt das Protein eine gute Loslichkeit bis zu einer Konzentration von 3 g/l. Ein W-Detektor mit einer Detektionswellenlange von 280 nm wurde zur Bestimmung der Flussigphasenkon- zentration am Saulenausgang eingesetzt.

Die Porositat E der Saule wurde durch Auswertung der Retentionszeit von 100 p1 einer 2%igen Acetonlosung er- mittelt. In Anlehnung an die in der analyhschen Chromato- graphie ubliche Methode wurden die Trennstufenzahlen N bei verschiedenen Salzkonzentrationen aus der Retentions- zeit und der Peakverbreiterung einer kleinen Menge dosier-

ten Lysozyms berechnet. Dazu wurden jeweils 25pl einer Lysozymlosung von 0,02 gA dosiert.

Zur Ermittlung der Adsorptionsisothermen wur- den Durchbruchskurven mit verschiedenen Eingangskon- zentrationen aufgenommen. Im AnschluR wurden bei ver- schiedenen Salzkonzentrationen sowohl unter isokrati- schen Bedingungen als auch unter Venvendung unter- schiedlich steiler Gradienten Chromatogramme aufgenom- men. Dabei wurde das Dosiervolumen und damit die Dosier- zeit variiert, um die Saule unterschiedlich zu beladen.

4 Resultate und Diskussion 4.1 Bestimmung der Porositat und der

Zellenzahl

In Analogie zur in der analytischen Chromatographie ubli- chen Vorgehensweise kann die Porositat der Saule aus der Retentionszeit einer nicht adsorbierenden Substanz be- stimmt werden. Im vorliegenden Fall wurde dazu Aceton venvendet. Die Retentionszeit lag fiir eine Salzkonzentrati- on von 0.4 M und einem Volumenstrom von 0,4 ml/min bei 295s. Mit Hilfe von GI. (5) und unter Beriicksichtigung des Totvolumens der Anlage ergibt sich fiir die verwendete Saule eine Porositat E von 0.79.

Um die Zellenzahl der Trennsaule abzuschatzen, wurden Chromatogramme fiir eine geringe Lysozymkon- zentration aufgenommen. Diese Experimente wurden eben- falls bei einem Volumenstrom von 0,4 Wmin durchgefiihrt. Fur die Salzkonzentrationen von 0.25; 0.3 und 0,4 M wurden aus den Retentionszeiten und Peakbreiten auf halber Hohe [lo] Zellenzahlenvon 127, 117 bzw. 109 ermittelt. Durch die Abweichung der beobachten Peakform von einer idealen GauR-Kurve, die Grundlage der durchgefiihrten abschat- zenden Berechnung ist, sind die ermittelten Zellenzahlen lediglich als Orientierung f i r die nachfolgenden Simula- tionen anzusehen.

4.2 Bestimmung der Adsorptions- isothermen

Zur Bestimmung der Adsorptionsisothermen wurden Durchbruchskurven fiir drei Salzkonzentrationen (0.25; 0,3 und 0,4M NaC1) und acht Proteinkonzentrationen (0.02; 0,04; 0,08; 0.16; 0,32; 0.64; 1.28 und2.56 gA) experimen- tell ermittelt. Bei einem Volumenstromvon 0,4 ml/min lagen die Durchbruchszeiten fiir alle drei Salzkonzentrationen in einem gut auswertbaren zeitlichen Rahmen (400 bis 2000 s). Abb. 3 zeigt exemplarisch die gemessenen Durchbruchskur- ven fiir die Salzkonzentration von 0.4 M und fiinf verschie- dene Proteinkonzentrationen. Die Detektorsignale wurden unter Verwendung einer nichtlinearen Kalibrierungskurve in Konzentrationen umgerechnet. Nach Integration wurde aus jeder Durchbruchskurve die Gleichgewichtsbeladung, d.h. ein Punkt der Isotherme, errechnet [9]. In Abb.4a sind die auf diese Weise experimentell ermittelten, anna- hernd linearen Isothermen fiir die drei Salzkonzentrationen dargestellt.

Eine kritische Analyse in Form der Auftragung q/c uber c, Abb. 4b, zeigt die insbesondere fiir 4 = 0.25 M vor-

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Abbildung 3. Durchbruchskurven fur funf verschiedene Proteinkonzentra- tionen; 4 = 0.4 M, V = 0.4 ml/min, c& = 0.08; 0,32; 0.64; 1,28, 2,56 gll.

3.0

.-

A 1.0

s f ;/I handene konkave Kriimmung der Isothermen. Da ben geringfiigige Abweichungen vom linearen Verhalten starke Auswirkungen auf die Peakform haben konnen [4], wurde zur Anpassung der Isothermenpunkte die enveiterte Lang- muir-Gleichung, G1. (9). venvendet. Die durch nichtlineare

Abbildung 4. a) Adsorptionsisothermen q(c); b) q / c uber c, jeweils bei den Salzkonzentrationen 4 = 0,25; 0.3; 0,4 M, Symbole: Me& werte, Linien: Anpassung basierend auf GI. (9).

60 -I I I

0,o 0 3 1 .o 1.5 2,o 2:5 3.0

Konzentration c [ gll ]

" 8 ' I ' I - I I - ,

0,o 0.5 1 ,o 1.5 2.0 2S 3.0

Konzentration c [ gll ]

Regression ermittelten Parameter fiir die Salzkonzentra- tionen 0,25 M 0,3 M und 0,4 M sind in der Tab. 1 aufgefiihrt.

Der Parameter qs, der die Sattigungsbeladung der Isothermen darstellt, hat bei der niedrigsten Salzkonzentra- tion den grodten Wert. Diese Tendenz ist verstandlich, da qs ein Mad der effektiv nutzbaren Anzahl von Bindungsplatzen fiir das Protein am Ionenaustauscher darstellt. Der Einflud des Salzgehaltes auf die beiden anderen Parameter a und b ist geringer. Der Parameter a hat mit groder werdender Salz- konzentration eine steigende und der Parameter b eine fallende Tendenz.

Die mit der erweiterten Langmuirisotherme erzielte Anpassungsgiite ist in Abb. 4b an Hand eines Ver- gleiches der theoretischen und experimentellen Kurven q / c uber den Proteinkonzentrationen c zu erkennen.

Fur die Berechnung der Adsorptionsisotherme fur eine beliebige Salzkonzentration ist eine Analyse des funktionellen Zusammenhangs zwischen den Isothermen- parametern und der Salzkonzentration notwendig. Um eine gute Anpassung zu erzielen, wurden in Analogie zur Beschreibung des Einflusses der Konzentration des organi- schen Losungsmittelbestandteils bei der Umkehrphasen- Chromatographie [ 131 verschiedene empirische Funktionen untersucht [9]. Fur eine genaue Beschreibung der vermes- senen Isothermen envies sich der Parameter qs als beson- ders wichtig. Die venvendeten einfachen funktionellen Zusammenhange und die durch Regression ermittelten Parameter sind in Tab. 2 aufgefiihrt.

4.3 Simulation von Chromatogrammen fur isokratische Bedingungen

Zur Beurteilung des Craig-Modells und der ermittelten Pa- rameter wurden zunachst Chromatogramme unter isokrati- schen Bedingungen aufgenommen. Die Saule wurde dabei wiedemm mit einem Volumenstrom von 0,4 ml/min durch- stromt. Eine Proteinkonzentration von 3 g/l wurde injiziert. Die Dosiervolumina wurden schrittweise erhoht (0,025; 0,l; 0.5 und 2 ml).

Tabelle 1. Parameter der Adsorptionsisothermen, GI. (9). fur die Salz- konzentrationen 4 von 0,25; 0,3 und 0,4 M.

Salzgehalt Sattigungsbeladung Parameter Parameter 4 [MI q s W I a Wgl b [l2/gZ]

0.25 103.12 0,178 0,0404 0.3 61.96 0,178 0,0329 0.4 13.43 0,206 0,0280

Tabelle 2. Empirischer Zusammenhang zwischen den Isothermenpara- meter 9u a, b und der Salzkonzentration 4.

Parameter Abhangigkeit von 4 [MI

a [ lk l 0,123 + 0,2034 b [12/g2] 0,0584 - 0,07784 q s [g/ll 14.16/@2 - 29.44314

Chernie lngenieur Technik (70) 4 I 9 8 387

Die Chromatogramme wurden zuerst mit den ab- geschatzten Zellenzahlen (127, 117 und 109) fiir die drei Salzkonzentrationen simuliert. Die dabei errechneten Peak- formen erwiesen sich jedoch als zu ,,scharf". Dies ist in Abb. 5 durch den durchgezogenen hochsten theoretischen Peak verdeutlicht, der fiir ein Dosiervolumen von 2 ml mit 127 Zellen berechnet wurde. Deshalb wurde in weiteren Rech- nungen eine visuelle Anpassung der Zellenzahl vorgenom- men, mit dem Ziel, eine gute ijbereinstimmung zwischen den experimentell ennittelten und den simulierten Chroma- togrammen zu erreichen. Die Abbn. 5 und 6 zeigen den Ver- gleich der berechneten mit den experimentell bestimmten Chromatogrammen fiir isokratische ijberladungsreihen bei Salzkonzentrationen von 025 und 0,4 M. In &erein- stimmung mit den Isothermenverlaufen zeigt sich, daR sich mit abnehmender Salzkonzentration die Retentionszeit verlangert.

Bei den Simulationen wurde die jeweils erforder- liche optimale Zellenzahl geringer, je groI3er das Dosiewo- lumen und je hoher die Salzkonzentration waren. Dies deu-

Abbildung 5. Uberladungsreihe bei Q = 0.25 M, cini = 3 g/I, V = 0,4 rnl/min, Vin. = 0,025; 0,l; 0.5; 2 rnl und N = 90 (bei Vini = 2 rnl auck N = 127); Vergleich der MeBwerte (Syrnbole) rnit den Nachrechnungen (Linien).

A

Zeit [ s ]

Abbildung 6. Wie Abb. 5, Q = 0.4 M und N = 50.

. . . 3 8

z ' I - I 2 -

0.5 -

0 , o ; : = ; = ? = :: 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Zeit [ s ]

tet darauf hin, daI3 bei zunehmender ijberladung der Trenn- saule der im Model1 nicht beriicksichtigte EinfluR kineti- scher Effekte starker zum Tragen kommt und durch eine Verringerung der Zellenzahl beriicksichtigt werden muI3. Tab. 3 gibt einen &erblick uber den festgestellten Zusam- menhang zwischen optimaler Zellenzahl, Salzkonzentration und ijberladung.

4.4 Berechnung von Chromatogrammen beim Einsatz von Gradienten

In den Gradientenversuchen wurden ausgehend von & = 0,25 M NaCl drei verschieden steile lineare Gradienten auf einen Endsalzgehalt 4e = 0,4 M gewahlt. Die Anstiegs- zeiten tSad 500,750 und 1250 s lagen zwischen den Elutions- zeiten der isokratischen Versuche bei den Salzkonzentration von 0,4 bzw. 0.25 M. Die mittleren Retentionszeiten der Elu- tionsprofile faI3t Tab. 4 zusammen. Die ortlichen und zeitli- chen Salzkonzentrationen wurden mit G1. (12) berechnet. Der Salzgradient startete jeweils unmittelbar nach dem Ende der Proteindosierung.

In den Abbn. 7,8 und 9 sind f i r die drei Gradien- tenanstiege die experimentell ermittelten und die nachge- rechneten Chromatogramme fur die variierten Dosiervolu- mina von 0,025; 0,l; 0.5 und 2 ml dargestellt. Um eine gute fiereinstimmung in der Form der Chromatogramme zu er- reichen, konnten bei der Nachrechnung wiederum keine einheitlichen Zellenzahlen verwendet werden. Die jeweils optimalen Zellenzahlen wurden erneut visuell angepaRt. Bei dem steilsten Gradienten von 500 s wurden fiir die drei kleineren Dosiervolumina bei der Simulation 50 Zellen und fiir das groRte Dosiervolumen (2 ml) zehn Zellen ver- wendet. Fur den Gradienten von 750 s wurden die Simula- tionen mit 90 Zellen bei dem Meinsten Volumen, 50 bei den beiden mittleren und 20 Zellen bei dem grogten Dosiervolu- men durchgefuhrt. Die hochsten Zellenzahlen wurden fur den flachsten Gradienten eingesetzt. Sie lagen bei 90 mit

Tabelle 3. Bereich der optimalen Zellenzahlen N als Funktion der Do- siervolumina Vini und der Salzkonzentration +(cini = 3 g/l).

Dosiervolumen Vlnj Salzkonzentration 6 [MI [mil 0.25 0.4

analytisch 127 0,025 > 90 0.1 = 90 0,5 25 90 2 < 90

103 > 50 = 50 = 50 < 50

Tabelle 4. Abgeschatzte Retentionszeiten fur kleine (analytische) Do- sierungen des Lysozyrns (W = 0.4 ml/rnin).

Salzkonzentration 6 [MI Retentionszeit tR [s]

0.25 = 1700 0.3 = 950 0.4 = 490 0 2 5 + 0,4(tgrad = 500 S ) % 700 0.25 -+ 0,4(tgrad = 750 S ) = 850

= 1000 0.25 + 0,4(tgrad = 1250 S)

Chemie lngenieur Technik (70) 4 I 9 8

Ausnahme des grogten Dosiervolumens, fiir das N = 30 ver- wendet wurde. Wie bei den isokratischen Chromatogram- men (Tab. 3) nimmt auch bei der Gradientenelution die An- zahl der erforderlichen Zellen mit steigender Dosiermenge ab.

Aus den Abbn. 7 bis 9 ist mit steigender Dosier- menge und Gradientendauer eine Verschiebung nach ho- heren Retentionszeiten und eine immer starker werdende Verformung der Chromatogramme zu beobachten. Bei dem steilen Gradienten gleichen die Chromatogramme mehr der idealen Gad-Kurve, Abb. 7, und bei dem flachen Gradienten tritt eine zunehmende Verzogerung und Verfor- mung der Elutionsprofile auf, Abb. 9. Dies wird durch das venvendete Modell relativ gut beschrieben.

5 Zusammenfassung Fur die Modellierung eines chromatographischen Trenn- prozesses ist die Bestimmung der Adsorptionsisothermen eine wichtige Voraussetzung. Zur Berechnung von Elutions-

Abbildung 7. Vergleich der experimentell ermittelten (Symbole) und der simulierten (Linien) Chromatogramme fur Vini = 0,025; 0.1; 0.5; 2 ml bei Gradientendauer von tgrad = 500 s(cini = 3 g/l, V = 0.4 ml/rnin).

3,5 j

Zeit [ s ]

Abbildung 8. Wie Abb. 7, Gradientendauer von tgrad = 750 5.

3.0 1 - 2.0 c 0 .- - 22*51 m 1 6

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300

Zeit [ s ]

Abbildung 9. Wie Abb. 7, Gradientendauer von tgrad = 1250 s.

-...

3.0 - 2.5 - -

7 - m - 2.0-

P)

0 Y

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Zeit [ s ]

profilen bei der Gradientenchromatographie ist die zeitliche und ortliche Veranderung der thermodynamischen Daten zu beriicksichtigen. Deshalb wurde aufbauend auf unabhangi- gen experimentellen Untersuchungen die Adsorptionsiso- therme als Funktion der Salzkonzentration empirisch be- schrieben.

Die mit dem einfachen Zellenmodell nach C R A I G

durchgefiihrten Simulationen der Chromatogramme liefern eine relativ genaue Vorhersage der Retentionszeiten. Diese verliingern sich fiir das als Modellprotein verwendete Lyso- zym mit abnehmender Salzkonzentration bei den isokrati- schen Versuchen und flacheren Salzgradienten bei der Gra- dientenchromatographie.

Ebenso konnen herladungseffekte vom Modell relativ genau beschrieben werden. Grenzen des Craig-Mo- dells liegen in der beschrankten Moglichkeit einer quantita- tiven Wiedergabe der Peakformen. Diese Einschrankung gewinnt an Bedeutung, wenn in Mehrkomponentensyste- men Aussagen uber die chromatographische Auflosung zu machen sind.

Die Schwache des eingesetzten Craig-Modells driickt sich auch in der beobachten Abhangigkeit der Zellenzahl von der Salzkonzentration und von der Protein- konzentration aus. Beides ist in erster Linie auf den EinfluR vernachlassigter Stofftransporteffekte zuriickzufiihren, 1aRt aber auch Ungenauigkeiten bei den ermittelten Adsorp- tionsisothermen vermuten.

Um das verwendete Modell zu beurteilen, ist das Ziel der Simulation des chromatographischen Trennprozes- ses wichtig. 1st eine schnelle abschatzende Vorausberech- nung eines Chromatogrammes gefragt, so erscheint das vor- gestellte Modell als ausreichend. Es liefert mit minimalem Rechenaufwand ein relativ genaues Bild der Retentionszei- ten. Wird allerdings Wert auf eine genaue Wiedergabe von Elutionsprofilen gelegt, so mussen die kinetischen Einfliisse im Modell beriicksichtigt werden. Dies vervielfacht den Auf- wand der Modellierung und Parameterbeschaffung.

Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse bei der chromatographischen Trennung eines Modellpro- teins bilden die Grundlage fiir weitere Untersuchungen zur chromatographischen Trennung mittels Gradienten-

Chemie lngenieur Technik (70) 4 I 9 8 389

chromatographie. Fiir die Modellierung des komplexeren Verhaltens mussen dabei insbesondere Gemischadsorpti- onsisothermen und deren Abhangigkeit von der Salzkon- zentration ermittelt werden.

DieAutoren danken H e m Professor ~Ec~W~Rfird ieMogIich- keit, die experimentellen Untersuchung in seinem Arbeitskreis an der GBF in Braunschweig durchfihren zu konnen, sowie dem Fond der Chemischen Industrie f i r die jinanzielle Unter- stiitzung.

Eingegangen a m 23. Juli 1997 [B 59611

Formelzeichen a

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Parameter der Adsorptionsiso- therme, Gln. (8) und (9) Parameter der Adsorptionsiso- therme, G1. (9) Flussigkeitsphasenkonzentration Dosierkonzentration Konzentration in der N-ten Zelle Laufvariable fiir Zeitschritte Zahlparameter fiir Zellen Dosiermasse Zellenanzahl Beladung Sattigungsbeladung, Gln. (8) und (9) Zeit Zeitdauer des Gradienten Totzeit Dosierzeit Volumen Dosiervolumen Saulenvolumen Volumenstrom Ortskoordinate

g r i e c h i s c h e B u c h s t a b e n At [SI Zeitschrittweite 4 [MI Salzkonzentration B [WSl Steilheit des Salzgradienten E [-I Porositat

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