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E x p e r i m e n t e l l e U n t e r s u c h u n g e n z u r F r a g e des e x t r a h e p a t i s c h e n S t o f h v e e h s e l s y o n A l d o s t e r o n +

Von

M. MAN~, W. SI~G~CT~raL~, K. K ~ A ~ F u n d E. ZI~GG

Aus tier 1VIedizinischen UniYersit~ts-:poliklinik Ziirich (Direktor: :prof. I~. t tE~I , I~) und dem Experhnen~allabor tier Chirurgischen Universit~tsklinik (Direktor: :Prof. A. SENNI~)

Einleitung Die heute b e k a n n t e n haupts/£ehlichen StoMwschsel.

produkte des Aldosterons sind das Tet rahydroaldo- s te ronglukuronid a n d das 3-Oxo-Conjugat a. Die Um- wand lung in diese beiden Metaboli te sell vorwiegend in der Leber s t a t t f inden 1. Normalerweise finder sieh im Ur in etwa 3,5real mehr Tet rahydroaldos teron als 3-O x o-Conjugal ~.

Ktirzt ieh f anden wir n u n im Ur in yon einigen P a t i e n t e n mi t dekompensierter Lebercirrhose, dab das Verh/il~nis yon Tetrahydroaldos~eron zu 3-Oxo- Conjuga~ zuguns ten des 3-Oxo-Conjugates ver- schoben war. Die Vermehrung des ausgeschiedenen

* Diese Arbeit wurde dureh die Hilfe des Schweizerischen Nationalfonds zur FOrderung der wissenschaftliehen Forschung und der Stiftung fiir wissenschaftliche Forschung an der Uni- versitgt Ziirich ermSglieht.

Klin. Wschr., 42. Jahrg.

3-0xo-Conjugates k a n n dabei derar~ ausgepr~gt sein, dab die absolu~en Werte dieses Metaboh~en h6her sind als diejenigen des Tet rahydroaldos terons s. Diese extreme ErhShung des 3-Oxo-Conjugates bei sehwer Leberkranken lies uns die Frage aufwerfen, ob Aldo- steron grundsatzl ieh such extrahepat isch zum 3-Oxo- Conjuga~ umgewandel t warden kann .

W i t versuch~en d_ieses Problem anzugehen, i ndem wit hepatektomierten Hunden 1,2-H~-Aldosteron inji- zierten u n d anscMieBend die irn Ur in ausgesehiedenen rad ioakt iven F r a k t i o n e n des freien Aldosterons (p i t 6), des 3-Oxo-Conjugates (pH 1) u n d des glukurons/~ure- gebundenen Antei ls (pH 5), in der das Te~rahydro- a ldosteronglukuronid en tha l t en ist, bes t immten . Da- mi t 1/igt sich zeigen, ob u n d bis zu welchem Grade Aldosteron beim H u n d ext rahepat iseh metabolis ier t werden kann .

21a

320 3{. Mx~N et al. : Untersuchungen zur Frage des extrahepatiscben Stoffweehsels yon Aldosteron Klinische Wochenschrift

Methode AIs Versuchstiere w~ht~en wir gesunde, mgnnliche,

25--30 kg sehwere Seh~iYerhunde. Die Hepate~omie wurde bei 3 Hunden in einer Sitzung nach Einleit~tmg der Anaes~hesie mit PentotI~l und n~ch Intubation in Lachgasnarkose durch

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Hi H& H2 3 n/chl hepatektomlezte

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Hunde Abb. 1. Die verschiedenen Aldos~eronfraktionen im 4 Std-Urin yon 3 nicht hepatektomierten und 3 hepa~ektomierten ttunden. [ ~ Freies Aldos~eron

~ [ 3-0xo-Conjuga~, ~ pH 5-)IeCabolit

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Abb. 2. l~Iittelwerte und Einzelwer~e der 3 Aldosteronffak~ionen im 4 Std-Urin yon 3 nich~ hepa~ektomierten und 3 hepatektomierten Hunden.

• freies AldosCeron, ~ 3-0xo-ConjugaQ .~ . p t I 5-Metaboli~

Herstellung einer porto-eavalen Seit-zu-Seit-Anastomose, Ligatur und Durchtrennung der A. hepatica und der Vv. hepatieae und anschlieBender Entfernung der Leber aus- gefiihr~.

Die intravenSse In]ektlon gere~nigten rad~oaktiven Aldo- sterons (8--22 Millionen cpm 1,2-H~-d-Aldosteron mit einer spezifisehen Aktivit~$ yon 2,0 me/0,022 mg Aldosteron) in einer physiologischen NaCl-absoluten Alkohol-Mischung yon 20:1 effolgte ca. I Std nach Beendig~ang der Operation bzw. bei den 3 als Kontrollen dienenden nich~ operierten Hunden nach Eintritt einer leichten Pentothalanaesthesie.

AnschlieBend wurde der Uric. der katheterisierten Hunde i~ber 4 Std gesammelt. Um die Diurese aufrechtzuerhalten, wurde allen Tieren eine Infusion yon 1--1,5Liter einer Gtueose(5%)-NaCl(0,9%)-LSsung wiihrend des Versuchs verabreieht. Der direkt in der A. femoralis gemessene Blut- druck blieb nach der Hepatek~omie fiber die weitere Versuchs- dauer systolisch konstant nm 120mmHg. Die einzelnen Urinportionen wurden bis zur Verarbeitung im Laboratorinm ira Tiefkiihlschrank aufbewahrt.

Im Urin wurden die bei pH 5, pH 6 und pH 1 extrahierbaren radioaktiven Aldosteron/raktionen bestimmt. Um die bei der Aufarbeitung der Urine eintretenden Verluste berechnen zu k6nnen, wurde bei der pH 6-Fraktion vor der Ex~raktion und bei der pH 1-Fraktion vor der ttydrolyse gereinigtes 4-C ~t- Aldosteron (500 epm zu jeder Probe mit einer spezifischen Aktivit~t yon 1 #c/0,0078 mg Aldosteron) zugegeben. Da kein C14-Tetrahych'oMdosteron zur Berectmung der Verluste zur Verffigung stand, bestimmten wir nach der Extraktion die gesamt~e glukurongebundene pH 5-Fraktion als MaB flit den TetrahydroMdosteronanteil.

Die Extraktion der einzelnen Fraktionen effolgte mit 7 Volumen Methylenehlorid unter kr~ftigem Schfittein w~h- rend ca. 30 see. Die Extr~kte wurden mit 1/10 Vol. 0,1 n Na0H und anschlieBend mit 1/10 Vol. 0,1 m Essigs~ure gewasehen und dana getroelcnet.

Das fi:eie Aldosteron wurde bei pH 6 extrahiert. i i t t e l s Acetatpuffer wurde sodann der iiberstehende,

abpipet4ierte Urin nach Messung des Volumens auf pH 5 gebracht und unter Einwirkung yon t000 E Ketodase/em s Urin (fl-Gtukuronidase Warner-ChilcotQ w~hrend 24 Std bei 370 hydrolisiert.

Naeh Extraktion der pH 5-Fraktion wurde schliel~lieh der iiberstehende Urin abpipettiert und das Volumen genau be- stimmt. Der Urin wurde mit konzentrierter ItC1 auf pH 1 gebracht und w~hrend 24 Std bei Zimmertemperatur hydroli- siert und anschlieBend extrahiert.

Znr weiteren Isolierung und Identifikation wurden die getrockneten Extrakte der pH 6- and der pH 1-Fraktion bei 25 ° C auI Whatman Papier Nr. 1 absteigend je einmat in einem Benzo]-Methanol-Wasser-System 4:2:1 und einem Cycle- hexamDioxan-Wasser- System 4:4:1 ehromatographiert.

Die getrockneten Extrakte der pH 5-Fraktion und die mittels Absorption im UV-Lich~ auf dem Chromatogramm lokalisierten und anseh]ieBend eluierten und getrockneten pH 6- und pH 1-Fraktionen wurden abschlieBend nach Zugabe yon 5 ml Toluol Szintillationsflfissigkeit (Dimethyl POPOP ~- 1,4 bis 2-(4 Methyl-5-Phenylox~zolyl)-Benzol 40 rag, PPO = 2,5-Diphenylozazol 4 g, Toluol ad 1000 em 3) in einem Tricarb Liquid Scintillation Counter (Packard, Mode]l 314 EX) nach dem Doppelisotopenveffahren fib: H ~ und C 1~ auf ihre Radio- aktivitg~ untersucht a. Die Zghlausbeute betrug fiir H 3 bei einem Background von 60--65 cpm 25--27 %, flit C 1~ bei einem BaekgTound yon 10--11 cpm 44-47%. Die Berechnung der nelb cpm H a bzw. C I4 effolgte nach der discriminator ratio method 3. Die auf diese Weise erhaltenen Impulse der einzelnen Fraktionen wurden sodann auf das nrsprfinglich vorhandene Urinvolumen umgerechnet und in °/00 der injizierten Dosis angegeben.

Resultate I m 4 S~d-Urin yon 3 normalen Hunden Ianden wi t

1,4--5,1°/00 der Impu l se des in j iz ie r ten r ad ioak t iven Aldos~erons in freier F o r m , 2,9--6,1°/oo als 3-Oxo- Conjuga~ ;and 14,5--27,1°/oo als g lukuron idgebundene p ~ 5-Frak~ion. Bei den 3 hepatektomierten Hunde~ da- gegen lagen 5,1--33,4°/o0 des in j iz ie r ten AldosSerons in freier F o r m , 1,0--4,7°/00 als 3-Oxo-Conjuga~ u n d 2,2--4,60/00 als Glukuron id der p t I 5 - F r a k t i o n vor (Abb. 1).

Die bei den 3 n icht hepagek~omiergen H u n d e n er- mit te l~en Durchsehni~swer~e ergeben fiir das freie Ald:osteron 3,1°/00, for das 3-Oxo-Conjuga~ 4,00/00, f~r die bei p ~ 5 f l -Glukuronidase labi le Frak~ion 20,0°/oo. Die aus d e m 4= S td -Ur in de r 3 hepatek~omier~en H u n d e be rechne ten D ure hse hn i~sw e r t e be t ragen da- gegen fiir das Ireie Atdos te ron 23,3°/oo, fiir das 3-Oxo- Conjuga~ 2,8°/00 und fiir d ie bei p H 5 f l -Glukuronidase labi le F o r m 3,60/00 des in j iz ie r ten Aldos~erons (Abb. 2).

Jg. ~2, Heft 7 M.M. FORELL und H. S T A ~ E ~ : Trypsininhibitor im menschlichen Pankreassekret und Duodenalsaft 321 1. April 1964

Diskussion Exogen zugelfihrtes d-Aldosteron is~ kinsiehtlieh

ehemischer Struktur und Stereoisomerie mit dem endogenen Aldosteron identiseh und unterliegt den- selben Sto//wechselvorgi~ngen wie das endogene Aldo- steron 5. Die clnantitative Zufuhr sollte allerdings m6glichst gering sein, damit keine Uberlastung des Stoffwechse]s mit Aldosteron stattfindet. Wir ver- wendeten deshalb radioaktiv markiertes d-Aldosteron mit einer hohen spezifisehen Aktivitgt. Unter diesen Bedingungen dal~ der Stoffweehsel des radioaktiven d-Aldosterons ftir den Metabolismus des endogenen Aldosterons als reprfi.sentativ angesehen werden.

Die Resultate unserer naeh Injektion yon 1,2-H s- d-Aldosteron im Urin yon hepatektomierten und yon nm:malen Hnnden untersuchten verschiedenen Aldo- steronfraktionen zeigen, dab die Aldosteronmetabolite auch bei allen 3 hepatektomierten Tieren naehweisbar waren.

Auffallend ist dabei, dab die Tetrahydroaldo- steronglukuronid enthaltende fl-Glukuronidase labile plI 5.Fralction im Urin der hepatektomierten IIunde bedeutend geringer ist als bei Normaltieren. Die Bildung des Te~rahydroaldosterons ist also beim Hund weitgehend leberabhgngig. Zu einem geringen Prozent- satz k6nnen jedoeh die p i t 5-Metabolite aueh extra- hepatiseh gebildet werden.

Dagegen finder sich bei den hepatektomierten Tieren im Urin eine Vermehrung des /reien, nieht metabolisierten Aldosterons (pH 6-Fraktion).

Von besonderer Bedeutung sind die Ergebnisse der im Urin vorgenommenen Bestimmungen des 3-Oxo- Conjugates (pI-I 1-Fraktion). Diese Werte liegen bei den hepatektomier~en Hunden in der gleiehen GrSBen- ordnnng wie bei den Normaltieren. Dies zeigt, daft beim Hund die Bildun~ des 3-Oxo-Con]ugates weitgehend extrahepatiseh er]olgen kann.

Zusammen]assung. Nach Injek~ion yon t,2-H s- d-Aldosteron wurden im Urin yon 3 normalen und yon 3 hepatektomierten t Iunden die prozen~ualen Anteile der injizierten ~adioaktivitgt bestimmt, die ale freies Atdosteron (pH 6-Fraktion), als 3-Oxo-Conjugat (pit 1-Fraktion) und Ms fl-Glukuronidase labile pH 5-Fraktion ausgesehieden werden.

Dabei zeigt sieh, dab die 3-Oxo-Conjuga£-Frak~ion bei den hepatektomier~en Hunden in der gleiehen Gr6genordnung vorliegt wie bei den Normaltieren. Die an Glukuronsgure gebundene pK 5-Fraktion ist bei den hepatektomierten t Iunden dagegen deutlieh ver- mindert, wghrend das freie Aldosteron infolge nnge- niigender Metabolisierung stark erhSht ist.

Summary. After injection of 1,2-H~-d-aldosterone in 3 normal and 3 hepatectomized dogs, the percentage of the injected radioactivity in urine was determined in the 3 frac- tions: free a, ldosterone (pH6), 3-oxo-eonjugate (p t i l ) and tetrahydroMdost~rone-glueuronide (pl~ 5). We found that the 3-oxo-conjugate fraction in hepatectomized dogs was in the same range as in the normal ones. The pll 5 fraction was decreased in the hepatectomized dogs while the free aldosterone increased markedly.

U n s e r e n Laborantinnen 2¢[iss A~CD~E¥ ALBE~GA u n d Fraulein MAI~I~IES APPEN~EI~EI~ sind wit fiir ihre Wcrtvolle Mitarbeit zu groBem Dank verpflichtet.

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[Jber die Ausscheidung des Trypsininhibitors im menschlichen Pankreassekret und Duodenalsaft* V o n

M. M. FOI~ELL und I{. STAI~LI~EBEt¢**

Aus der II. l~[edizinischen Klinik der llniversitiit, ~Ifinchen (Direktor: Prof. Dr. Dr. G. ]~CDI~CltTt3,)

Einleitung Im Pankreas konnte 1936 yen NoI~HnoP und

Ku~ITZ a ein Inhibitor des Trypsins nachgewiesen und in kristalliner Form dargestellt werden, der mit dem Trypsin, abh~ngig vom bestehenden pK-Wert, eine Komplexbildung im Alkalischen eingehg und eine Dissoziation im sauren Bereich erf/ihrt.

Im menschlichen t)ankreassekret, durch Drainage in reiner Form gewonnen, haben t{AVEI~BAI?K U. Mit- arb/ ' den Trypsininhibitor naehgewiesen. Seine An- wesenheit bedeutet neben der Tatsaehe, dag alle im Pankreassekrelb vorliegenden proteolytisehen Enzyme in ihrer inaktiven Vorstufe in der Dr/ise gebildet und normalerweise als solche in das Duodenum ausge- sehieden werden, einen wirkungsvollen Schutz gegen jegliche vorzeitige Aktivierung des Trypsins in der Drtise und auf dessen }Veg in das Duodenum.

* Herrn Prof. I)r. Dr. G. BODEC~TEL zum 65. Geburtstag gewidmet

** Dieser Arbeit liegt ein Teil der Dissertation yon I-Ierrn cand. reed. I-L STA~IE]3]~ zugrunde.

In der vorliegenden Arbei?~ soltte untersueht wer- den, ob der Trypsininhibitor auch im Duodenalsaft angetroffen wird und ob seine Bestimmung dort mSg- lieh ist. Ferner sollge fes~gestellt werden, welehen Einfliissen der Inhibitor unterliegt, in welcher GrSgen- ordnung er ausgesehieden wird und wie seine Ausschei- dung sich nach Sekretin- und Pankreoz)mareiz verMlt.

Methodik Die B e s t i m m u n g des T ryps in s erfolgte n a c h der y o n

ScKS~ u. N! i ta rb) a n g e g e b e n e n Modi f ika t ion dcr Me thod e y o n B~ACCTO~C-MAr~S~ALL 5, wobei als Substrat N-benzoyI-dI-arginin- fl~naphthylamid hyclrochlorid, und als Farbreagens N- (1-naphthyl)-i~thylendiamin-dihydrochlorid verwendet wnrde. Die Messung erfolgte im Zeiss-Photometer Elko I I I mit dem Filter S 57 E bei einer Cuvettenschichtdicke yon 0,5 era.

Bei der Messung des Trypsininhibitors im Pankreas- bzw. Duodeualsekret wird kristallines Trypsin*** ira lJ~berschul3 znm Sekretansatz hinzugegeben, 10 rain bei 37 o C mit diesem vor- inkubierf~ und die verbMbende t~estaktivit~t gemessen. Die hinzugeftigte Trypsinmenge betr/igt 10O y, die in 1 mI Aqua

*** Zweima] kristallisiertes Trypsin der Fa. Worthington in USA.