Exposiciòn Probióticos Final

Identificación y caracterización de una cepa de Bifidobacterium como

probiótico

Aquino Ortega, RonaldPalomino Salazar Jonathan

Retamozo Gamarra, Milka Modesta

Familia Bifidobacteriaceae• Agrupa actualmete 5 géneros:

Bifidobacterium, Gardnerella,

Aeriscardoria, Parascardovia,

Scardovia.

• Genero Bifidobacterium agrupa

actualmente 33 especies, siendo

las mas importantes:

Bifidobacterium bifidum

Bifidobacterium breve

Bifidobacterium dentium

Hábitats• Habitantes normales del

tracto gastrointestinal humano y de diversos animales.

• Se encuentran en niveles de 108 a 1011 bacterias por gramo de material del colon.

Características morfológicas

• Gram positivos

• Bacilos pleomorfos, individuales, en

cadenas o grupos.

• Bacilos con una pared externa irregular,

usualmente cóncavos y con extremos

en forma de espátula.

• No tienen cápsula

• No forman esporas

• No son móviles ni presentan filamentos

Características bioquímicas

• Anaerobio estricto, tolerante al oxigeno solo en

presencia de CO2

• Catalasa negativas

• Oxidasa negativas

• No utilizan el indol

• No hidrolizan la gelatina

• Producción de acido acético

y acido láctico.

• Las hexosas son degradadas

por la ruta de la fructuosa 6

fosfato

• Empleo de amonio como fuente de nitrógeno.

Características culturales

• Crece óptimamente a una temperatura de 35 a 39ºC.(<20

y >46)

• Requiere un pH de 6,5 a 7.(<4 y >8)

• Utilizan como fuente de nitrógeno, sales de amonio (en

ausencia generan treonina, valina, alanina, valina, acido

ascórbico)

• El acido ascórbico y el sodio son utilizadas como

sustancias selectivas

Las bifidobacterias son capaces de metabolizar

carbohidratos tales como los fructo-oligosacáridos y

galactosil-oligosacáridos



CRITERIOS DE EVALUACIÓN SISTEMATICA DE PROBIOTICOS

Identificación del género, la especie y la cepa probiótica

Estudios «in vitro» para la selección de probióticos de uso en humanos

Seguridad de los probióticos

Estudios «in vivo» utilizando animales y humanos

Etiquetado

Viabilidad e identidad de cepas declaradas en productos probióticos comerciales

Adherencia a la mucosa intestical y celulas

epiteliales

Ensayos de actividad antagonista.

Resistencia a diferentes concentraciones de Na Cl ,

sales biliares y lisozima

Sensibilidada a antibioticos

Estudios toxicologicosResistencia a H2O2

Resistencia a cambios de pH

AISLAMIENTO DE CEPAS DE BIFIDOBACTERIUM Y SUS CONDICIONES DE CRECIMIENTO

1g

9mLBPS

SE HOMOGENIZA 3’

1mL

MRS-C

MB

17 h a 37ºC Anaerobiosis

100 µL

Se encontraran colonias típicas de Bifidobacterium sp y Seleccionan las Gram + y las catalasa negativas

36 a 72 h A 37ºC

Técnicas usadas para identificación de bifidobacterias a nivel de género, especie y cepa

100 µL

Técnicas usadas para identificación de bifidobacterias a nivel de género, especie y cepa

IDENTIFICACION-GÉNERO

TEST DE LA FRUCTOSA-6-FOSFATO FOSFOCETOLASA (F-6-PPK)

1. Se centrifuga a 14000 x g x 3’.2. Se lava el sedimento dos veces con PBS (pH6.5+cisteina).3. Se suspende en 1 mL de tampon.4. Las celulas se rompen por ultrasonido en hielo durante 2’5. El sonicado se mezcló con 0,25 ml cada unode soluciones de 2 (6 mg NaF y 10

mg de yodoacetato de sodio en 1 ml H2O destilada) y fructosa 6 fosfato 80mg/L destilada

1 2 3 4 5

30’37ºC

TÉCNICAS USADAS PARA IDENTIFICACIÓN DE BIFIDOBACTERIAS A NIVEL DE GÉNERO, ESPECIE Y CEPA

6.- Se adiciona de 1,5 ml de solución (Hidroxilamina HCl, 13,9 g/100 ml de H20 d, recién neutralizó con NaOH a pH 6,5). 7.- La mezcla se mantuvo durante 10 minutos a temperatura ambiente y después 1 ml de cada una de soluciones TCA 15% (w / v) en agua) y solución de HCl 4 M se añadieron. 8.-Se añade 1 ml de la solución de desarrollo de color [FeCl3.6H2O 5% (w / v) en 0,1 M HCl]

LA DESARROLLO DE UN COLOR ROJO-VIOLETA INMEDIATAMENTE DESPUÉS AGITANDO EL TUBO INDICA LA PRESENCIA DE FRUCTUOSO-6- FOSFATO

FOSFOCETOLASA.

IDENTIFICACION-GÉNERO

TEST DE LA FRUCTOSA-6-FOSFATO FOSFOCETOLASA (F-6-PPK)

6 87 +


IDENTIFICACION A NIVEL DE ESPECIESistema API 50CH


IDENTIFICACION A NIVEL DE ESPECIE


IDENTIFICACION A NIVEL DE CEPA


Estudios “in vitro” para la selección de probióticos de uso en humanos

Ensayos de actividad antagonista.

Resistencia a diferentes

concentraciones de lisozima, sales

biliares, NaCl y H2O2

Resistencia a la variación de pH.

Capacidad de adherencia a la

mucosa intestinal y células

epiteliales

Sensibilidad a antibióticos

Estudios toxicológicos

Ensayo de actividad antagonista H. pylori

Se utiliza el sobrenadante de los caldos MRSC de las cepas asiladas.

1. Se centrifuga a 1200 x g x 10’2. Neutraliza a pH 6.5 con

NaOH(1N)3. Los sobrenadantes se esterilizan

por filtración en una membrana de 0.22 µm

1 2 3MRS-C24H 37ºC

ANAEROBIOSIS

1. Se centrifugo a 4000 x g x 10’2. Se lavo y resuspendió en

solución salina3. Difusión sobre la superficie.4. Se carga 50 µL de la solución

neutralizada .5. Las zonas de inhibición se leen

a los 3 dias de incubación a 37ºC

1BHI

MICROAEROBIA 37ºC X 3 DIAS

3

2

4

ENSAYO DE INHIBICION POR DIFUSION EN AGAR

Ensayo de actividad antagonista a H. pylori

MRS-C24H 37ºC

ANAEROBIOSIS

300 µg.L200 µg.L100 µg.L50 µg.L

200 µl

20 µl

18 h a 37 ºC

DO a 650 nm utilizando un espectrofotómetro (SPECORD 200)para la determinación de la MIC

de H2O2 para cada cepa

Resistencia a H2O2

Resistencia a lisozima

MRS-C24H 37ºC

ANAEROBIOSIS

1mL

MRS-CLISOZIMA

(0.5 mg.mL)

24 horas a 37 ° CANAEROBIOSIS

Resistencia a sales biliares , Na Cl y pH acido

RESULTADOS

Viabilidad al paso por el tubo digestivo

pepsina de cerdo (3g/l) y S.S (0,5%).

Pancreatina de cerdo (1g/l) y S.S (0.5%).

Cepas problema de Bifidobacterium en medio MRS incubadas 24h a 37°C bajo CA.

Cepa de referencia prebiótica. L. rhamnosus GG (control)

Lavar dos veces con solución salina ( 0.09%).

Añadir 0,1ml de células resuspendidas en ss.

10ml de pepsina ( pH 3).10ml de pepsina ( pH 3).

Incubar a37°C x 2 h en anaerobiosis.Incubar a37°C x 2 h en anaerobiosis.

Neutralizar con buffer fosfato ph7.Neutralizar con buffer fosfato ph7.

Resuspender con 10ml de pancreatina (pH 8).

Incubar a 37°c x 4h en anaerobiosis.Incubar a 37°c x 4h en anaerobiosis.

Recuento del total en placa de células al minuto y alas 2 h.




Resultados: Epifluorescencia

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA

“CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DEL GÉNERO Bifidobacterium CON CARÁCTER PROBIÓTICO “

María Carmen Collado Amores Valencia, Noviembre de 2004

Adhesión ala mucosa intestinal

Resultados

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA

“CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DEL GÉNERO Bifidobacterium CON CARÁCTER PROBIÓTICO “

María Carmen Collado Amores Valencia, Noviembre de 2004

Desplazamiento de patógenos del mucus intestinal por cepas pertenecientes al género Bifidobacterium.

Porcentaje de adhesión de las cepas prebióticas

INHIBICIÓN DE LA ADHESIÓN DE PATÓGENOS

• Se ha demostrado que algunas bifidobacterias comparten uniones de carbohidratos específicas con algunos enteropatógenos (Fujiwara et al., 2001).

• Novel Probiotic Bifidobacterium bifidum CECT 7366 Strain Active against the Pathogenic Bacterium Helicobacter pylori

• E. Chenoll, ,B. Casinos,E. Bataller, P. Astals,J. Echevarrıa. • Department of Food Biotechnology, Biopolis S.L. Parc Científic, Universidad de Valencia.

Sensibilidad a antibióticos

Resultados

ESTUDIO TOXICOLÓGICO

Ingestión aguda

Efectos de Reversión de B. bifidum después del desafío con H. pylori en ratones.

Purificación de la sustancia de interés

EFECTOS BENEFICIOSOS DE LOS PROBIÓTICOS

• Atenuación de la intolerancia a la

lactosa y consiguiente mejora de la

digestibilidad

• Efectos sobre el sistema inmunológico

• Mantenimiento de la flora intestinal

normal

• Prevención del cáncer

• Reducción en las alergias

• Reducción del colesterol

• Salud gástrica

• Efectos nutricionales

Gracias

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Exposiciòn Probióticos Final