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Expresión y purificación de antígenos de Mycobacterium bovis mediante la tecnología del DNA recombinante con uso potencial en diagnóstico

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1. TÍTULO: EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE ANTÍGENOS DE Mycobacterium bovis MEDIANTE LA TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE CON USO POTENCIAL EN DIAGNÓSTICO. Presenta: IBQ. Paulina Karely Beltran Medina Tutor Académico: Dr. Ángel Hilario Álvarez Herrera Asesor: Dr. Abel Gutiérrez Ortega


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3. RESUMEN

La tuberculosis bovina (TBb) es causada por Mycobacterium bovis. El método de

diagóstico de rutina es la prueba de la tuberculina. Sin embargo, su sensibilidad y

especificidad son muy variables, ya que los antígenos del PPD no son específicos.

Algunos autores han buscado la sustitución de estos antígenos en las pruebas

serológicas con la utilización de proteínas recombinantes de M. bovis entre ellas están

ESAT6 y CFP10.

Por otro lado se ha descrito que algunas proteínas del complejo de Mycobacterium

tuberculosis cuya expresión se ha asociado a que se codifica en forma de regulón

(regulón DosR) son altamente inmunogénicos, debido a que muestran ser antígenos

fuertemente reconocidas por las células inmunes de humanos infectados por M.

tuberculosis, y además se ha demostrado que tienen un porcentaje de similitud muy alto

con los genes ortólogos de M. bovis, mientras que están ausentes o con muy poca

homología con micobacterias ambientales como M. avium.

El objetivo de este trabajo fue producir las proteínas recombinantes PfkB, HspX y

Mb1762c de M. bovis y evaluar su antigenicidad en sangre de bovinos naturalmente

expuestos a la micobacteria, mediante la inducción de la producción de IFN-γ, y

compararla con aquella provocada por el PPD bovino (PPD-B) y/o ESAT6 y CFP10.

Como resultado se logró producir dos proteínas recombinantes PfkB y HspX, las cuales

fueron probadas cada una por separado y en conjunto en una mezcla junto con el PPD-

B, para estimular sangre de bovinos con diversas prevalencias de infección. La mezcla

de PfkB, HspX y PPD-B demostró incrementar la sensibilidad y la especifidad, que

aquella dada por las proteínas probadas individualente y/o PPD-B solo.


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4. ÍNDICE DE CONTENIDO Páginas

5. ÍNDICE DE CUADROS, GRAFICAS Y FIGURAS 4

6. ANTECEDENTES 9

7. FUNDAMENTACIÓN 11

7.1. Tuberculosis Bovina 11

7.2.Transmisión 12

7.3.Patogenia 12

7.4. Epidemiología 14

7.5. Reacción de la hipersensibilidad tardía de la piel, bases del

diagnóstico de la tuberculosis bovina 16

7.6. Diagnóstico de la tuberculosis bovina 17

7.6.1. Prueba de la tuberculina 18

7.6.2. Prueba del Interferón Gamma (IFN-γ) 19

7.6.2.1. Ventajas prácticas de la prueba del IFN-γ 20

8. JUSTIFICACIÓN 22

9. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA 23

10. HIPÓTESIS 25

11. OBJETIVOS 25

11.1. Objetivo General 25

11.2. Objetivos Específicos 25

12. MATERIALES Y MÉTODOS 26

12.1. Diseño de oligonucleótidos y amplificación de los genes. 26

12.2. Clonación en el vector pET101/D-TOPO para expresión usando

cultivos de E. coli. 27

12.3. Clonación en el vector pIVEX 2.3d para expresión en un sistema de

traducción libre de células. 28

12.4. Expresión de las proteínas recombinantes. 29

12.4.1. Análisis de las proteínas recombinantes mediante electroforesis en 30


4

gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

Páginas

12.4.2. Análisis de las proteínas recombinantes por Western blot con

anticuerpo anti-His6. 30

12.5. Purificación de las proteínas recombinantes mediante columnas de

afinidad. 31

12.6. Evaluación de la antigenicidad de las proteínas recombinantes en

sangre de bovino. 32

12.7. Análisis estadístico. 33

12.7.1. Cumplimiento de supuestos estadísticos 33

12.7.2. Comparación de grupos 33

12.7.3. Curvas ROC (Reciever Operating Characteristics) 33

13. RESULTADOS 35

13.1. Selección de antígenos 35

13.2 Amplificación de los genes seleccionados. 36

13.3. Clonación de gen pfkB en vector de expresión 37

13.4. Clonación de gen hspx en vector de expresión pIVEX2.3d 39

13.5. Síntesis de las proteínas pfkB y hspx en sistema RTS ProteoMaster 40

13.6. Purificación de la proteína PfkB sintetizada con el sistema RTS

proteomaster 40

13.7. Purificación de la proteína PfkB expresada en E. coli BL21 41

13.8. Clonación y purificación de la proteína Hspx en vector de expresión

pET101-TOPO 43

13.9. Clonación y expresión de la proteína Mb1762 en vector de expresión

pET101-TOPO 46

13.10. Evaluación de la antigenicidad de las proteínas recombinantes en

sangre de bovino 47

14. DISCUSION 52

15. CONCLUSION 54

16. REFERENCIAS

17.ANEXO 1 Cartas de Aceptación Congresos Nacionales 68


5

18. ANEXO 2 Copia de articulo de divulgación científica 70

5. Índice de Tablas y Figuras

Tablas

Páginas

12.1 Oligonucleótidos usados para amplificar los genes completos de las

proteínas de este estudio de acuerdo a los vectores de clonación. 27

13.1. Proteínas del regulón DosR de M. bovis consideradas para el estudio 35

13.2. Similitud de los antígenos DosR seleccionados de distintas

micobacterias 36

13.3. Sensibilidad de los antígenos y valores de corte requeridos. 49

Gráficas

13.1. Curva ROC. Determinación y comparación de la sensibilidad de la

mezcla de proteínas que contiene PPD-B, HspX y PfkB contra las proteínas

HspX, PfkB, CFP10/ESAT6 y el PPD-B proveniente del kit comercial

Bovigam 48

13.2. Comparación estadística de animales infectados 49

13.3. Detección de animales infectados con tuberculosis bovina empleando 51

Figuras

Fig. 13.1. Productos de amplificación por PCR de los genes hspX,

mb1762c y pfkB. 36

Fig. 13.2. Productos de digestión con enzimas de restricción NcoI y SmaI. 37

Fig. 13.3. Productos de digestión del vector recombinante pIVEX

2.3d+pfkB con las enzimas SmaI y NcoI. 38

Fig. 13.4. Producto de PCR de pIVEX+pfkB 38

Fig. 13.5. Digestión de pIVEX 2.3d+hspX con enzima SmaI 39

Fig. 13.6. Productos de PCR de pIVEX2.3d+hspX 39


6

Páginas

Fig. 13.7. Western-blot con anticuerpo anti-His6 de la proteína PfkB

sintetizada en RTS Proteo Master 40

Fig. 13.8. Gel de poliacrilamida teñido con azul de Coomassie de las

fracciones eluidas por la columna de afinidad donde se pasó la mezcla de

proteínas sintetizadas en el Proteo Master. 41

Fig. 13.9. Gel teñido con plata de las fracciones purificadas de la proteína

PfkB por columna de afinidad. 42

Fig. 13.10. Western blot con anti-His6 después de la purificación por una

columna de afinidad. 42

Fig. 13.11. PCR de clonas obtenidas en vector pET101/D-TOPO+hspX y

Mb1762c. 43

Fig. 13.12. Purificación de la proteína HspX en vector de expresión

pET101-D/TOPO.

(A) Gel teñido por Comassie de la proteína HspX expresada en E. coli

BL21 inducida con IPTG 1 mM. Fracción soluble de un cultivo de la cepa

recombinante sin inducir

(B) Western blot con anti-His6 de la proteína HspX expresada en E. coli

BL21 inducida con IPTG 1 mM. 44

Fig. 13.13. Gel teñido con plata de fracciones purificadas de la proteína

HspX por columna de afinidad. 45

Fig. 13.14. Western blot de la proteína HspX

(A) Western blot con anticuerpo monoclonal anti-HspX.

(B) Western blot con anticuerpo anti-His.. 45

Fg. 13.15. PCR de clonas obtenidas pET101/D-TOPO+Mb1762c. 46


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Índice de Abreviaturas

BSA seroalbúmuna bovina

CMH Complejo Mayor de Histocompatibilidad

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético

HIS histidina

IFN-γ Interferón-gamma

IPTG isopropil-β-D-tiogalactopiranósido

KCl Cloruro de potasio

kDa kilo daltones

KH2PO4 Fosfatode potasio monobásico

M. africanum Mycobacterium africanum

M. avium Mycobacterium avium

M. avium sp.

paratuberculosis

Mycobacterium avium subesp. paratuberculosis

M. bovis Mycobacterium bovis

M. canetti Mycobacterium canetti

M. microti Mycobacterium microti

M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis

Pb Pares de bases

PCR Reacción en cadena de la polimersa

PPD Derivado Protéico Purificado

PPD-A Derivado Protéico Purificado de M. avium

PPDD-B Derivado Protéico Purificado de M. bovis

ROC Receiver Operating Characteristics

SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

TBb Tuberculosis Bovina

TMB 3, 3´, 5, 5´-tetrametilbenzideno


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6. ANTECEDENTES.

La Tuberculosis bovina (TBb) es una enfermedad que afecta al ganado bovino, la cual

es considerada una zoonosis ya que puede afectar a otras especies de mamíferos

inclusive al humano. El agente causal es Mycobacterium bovis miembro del complejo

M. tuberculosis causante de la tuberculosis en humanos. En países subdesarrollados

como en el caso de México, la TBb es un problema zoosanitario muy frecuente y es

muy importante realizar campañas de erradicación, puesto que al estar los animales

enfermos, predispone alganado a otras enfermedades, limitando el desarrollo de la

ganadería, lo cual causa fuertes perdidas económicas.

Dentro de los métodos de detección existentesla prueba intradérmicatambién conocida

como prueba de la “Tuberculina”, estipulada por la Norma Oficial Mexicana contra la

tuberculosis bovina, (NOM-031-ZOO-1995), la prueba se basa en la respuesta

inmunológica del animal a la inyección intradérmica de 0.1 ml de tuberculina en la

dermis del pliegue caudal derecho con un extracto proteínico purificado (PPD) de M.

bovis AN5 ó Valleé (Monaghan y col 1994), cualquier induración igual o mayor a 5 mm

se considera como una reacción positiva (animal PPD o tuberculina positiva). Se mide

la reacción de hipersensibilidad del tipo retardado al componente. Pero las pruebas no

son muy precisas ya que se dan muchos falsos positivos, debido a la falta de

especificidad, enmascarando si el animal esta realmente infectado por M. bovis o quizá

por otras micobacterias. Además se ha demostrado una disminución de un 5% por año

en su sensibilidad debido a la anergia inmunológica generada por múltiples

aplicaciones. En diferente estudios en el campo se ha determinado una sensibilidad de la

prueba entre el 63-99%, con una media de 83.9% (De la Rua Domenech y col 2006).

Aunado a esta prueba se realiza otra prueba confirmatoria que consiste en el cultivo

microbiológico, donde se puede aislar a M. bovis de biopsias provenientes de animales

sacrificados. Sin embargo, este examen tiene el inconveniente de ser muy tardía, ya que

el microorganismo demora entre 4 y 6 semanas para crecer en medios selectivos y sólo

puede realizarse después del sacrificio.


9

Para tratar de disminuir los errores de interpretación de la prueba intradérmica, se

desarrollo una prueba comercia para medir directamente el interferón gamma (IFN-γ) en

la sangre del bovino (Bovine Gamma Interferon Test-Bovigam®). La prueba consiste

en incubar sangre completa de bovinos sospechosos de tuberculosis con PPD bovino

(PPD-B) bajo condiciones especiales. Si el animal ha estado en contacto con el

microorganismo, sus linfocitos liberarán IFN-γ, el cual será detectado a través de un

sistema de ELISA sándwich, donde los anticuerpos anti- IFN-γ unidos a una placa de 96

pozos capturan el IFN-γ bovino. La reacción se detecta por la adición de un segundo

anticuerpo específico anti- IFN-γ conjugado a una peroxidasa la cual reacciona con un

sustrato produciendo una coloración (Wood y col 2001).

Una desventajas importante de esta prueba, es que también está basada en la

sensibilización de los linfocitos usando el PPD-B para la identificación de los animales

infectados, por lo que algunos reportes indican la identificación de falsos positivos

producto de coinfecciones con micobacterias ambientales que cruzan antigénicamente

con el PPD (Aranaz y col 2006)., con una sensibilidad que varia entre el 69 y el 99%

con una media de 88%, por tales motivos se ha tratado de utilizar la prueba usando

antígenos mas específicos como ESAT-6 y CFP10 (Aagaard y col 2006).

Debido a que las pruebas de diagnóstico existentes hasta el momento, como son la

prueba de la tuberculina y la del IFN-γ, están basadas en la estimulación de la respuesta

inmune usando derivados proteícos complejos (PPD-B y PPD-A) para hacer un

diagnóstico diferencial, la especificidad se ve comprometida debido a que los PPD-B y

PPD-A comparten diversos antígenos comunes entre ambos microorganismos (Borsuk y

col 2009). Por ello, se ha sugerido usar proteínas que sean más especificas, así como

también la inclusión de nuevos criterios de interpretaciones (Cockle y col, 2006).

En los últimos años se ha debido un significativo progreso en la identificación de

algunas proteínas antigénicas de M. bovis, en un intento por identificar aquellas que

sean más especificas que las presentes en el PPD (Aagaard y col, 2003). La utilización

de algunas proteínas recombinantes en la prueba del IFN-γ como ESAT-6, CFP-10 y


10

MPB70, h permitido sugerir sustituiral PPD-B en las pruebas intrdérmica y del IFN-γ

(Whelan y col 2010, Casal y col, 2010.)

7. FUNDAMENTACIÓN

7.1. Tuberculosis Bovina

La tuberculosis bovina es una enfermedad crónica de los animales provocada por M.

bovis, bacteria que se considera GRAM-positiva y que guarda una estrecha relación con

la bacteria causante de la tuberculosis humana, siendo miembro del complejo M.

tuberculosis caracterzados por provocar infecciones con lesiones granlomatosas.

M. bovis pertenece a la clase Actinomycetes, Orden Actinomycetales, Familia

Mycobacteraceae, género Mycobacterium(Biet y col, 2005). Estas bacterias se

caracterizan por ser bacilos ácido-alcohol resistentes, es decir, resisten a la decoloración

con alcohol acidificado una vez que se han teñido con carbol-fucsina (tinción de Ziehl-

Neelsen).

El género está dividido en dos grandes grupos: 1) el complejo M. tuberculosis (M.

tuberculosis, M. bovis, M. canetti, M. microti,M. africanum, entre otras) y 2)

micobacterias no-tuberculosas (Biet y col,2005).

Estas bacterias principalmente se transmiten por vía aerógena, y en estados avanzados

de la infección pueden causar una enfermedad diseminada en la mayoría de órganos, sin

embargo la tuberculosis pulmonar es la más común (Ward 2005, Lopez de Buen y col,

2007, Flynn y col, 2001).

Las principales especies que afectan al ganado bovino son: M. bovis, M. tuberculosis,

M. avium y M. avium ssp paratuberculosis. Aunque se considera que el verdadero

hospedador de M. bovis es el ganado bovino, la tuberculosis bovina también se

considera una zoonosis , ya que también se ha encontrado la bacteria en los humanos

(López de Buen y col, 2007, de Ward 2005), y en otras especies de mamíferos, por

ejemplo en búfalos, venados, bisontes, ovejas, cabras, caballos, camellos, cerdos y

tejones. Por lo cual es una enfermedad que puede permanecer en reservorios naturales y


11

volver a infectar al ganado sano por lo que se considera muy difícil de erradicar (Aranaz

y col. 2006, Vordemeier y col. 2006).

7.2.Transmisión

En el bovino la vía más importante de infección por M. bovis es la respiratoria y esto

ocurriría por inhalación de partículas de polvo contaminados con el bacilo. En animales

adultos infectados naturalmente, se puede apreciar una marcada predominancia de

lesiones tisulares en ganglios retrofaríngeos, traqueobronquiales y/o mediastínicos

(Perdomo y col, 1986).

La infección por vía digestiva se da en casos en que los animales ingieren leche, agua o

forraje contaminado y se evidencia por la reacción inmunológica del complejo inmune

celular o primario en órganos digestivos y ganglios regionales (Perdomo y col, 1986).

A pesar de que la vía aerógena es la principal fuente de infección en el bovino, 80 a

90% de los casos, se estima que los bovinos expuestos se contagian entre un 10 a un

20% por vía digestiva. Esta forma de infección es presentada en terneros que se

alimentan de vacas tuberculosas o por leche contaminada no pasteurizada. De 1 a 3% de

vacas presentan mastitis tuberculosa, convirtiéndose en diseminadoras permanentes de

bacilos. También se contagian consumiendo alimentos y agua contaminados por los

bacilos que están en contacto con el suelo que contiene heces de animales infectados.

Otras vías no comunes pero probables son: la cutánea, la congénita y la genital.

(Abalosy col, 2004, Biet y col, 2005) .

Los factores de predisposición para el contagio de la tuberculosis bovina son: el

hacinamiento, la poca ventilación, descarga de secreciones respiratorias, acumulación

de heces fecales, descargas uterinas, monta natural y alimentación de becerras con leche

sin pasteurizar (de Ward 2005, Perdomo y col, 1986, Soto 2007).

7.3.Patogenia


12

En cuanto a la evolución de la tuberculosis se describen tres etapas clásicas, las cuales

no se dan todas obligatoriamente:

a) Período de primo-infección. La lesión inicia en el órgano que actúa como puerta de

entrada, en este lugar se establece el primer contacto de la bacteria en el organismo

(foco primario), en este punto donde el bacilo se aloja se desencadenan una serie de

reacciones histológicas y orgánicas. Posteriormente los bacilos se drenan por vía

linfática a los nódulos linfáticos de la zona, vehiculizados por los macrófagos. En

estados más avanzados, el bacilo puede penetra en los pulmones, se multiplica y se

disemina en el órgano, produciendo lesiones en forma de tubérculo al igual que

cuando infectan a los nódulos linfáticos bronquiales (Soto 2007).

b) Procesos post-primario. Las manifestaciones observadas en este período son:

- Reactivación de una lesión antigua, ya que el animal posee inmunidad adquirida

durante la primera infección ó la sobreinfección, es decir una reinfección sobre

agregada por los bacilos venido del exterior (reinfección exógena).

- La exacerbación de focos preexistentes de la primo infección con siembra por

vía hemolinfática de bacilos provenientes de esos focos.

- La formación de granulomas en los órganos donde se detienen, la extensión o

diseminación de las lesiones se puede realizar por vía linfática, sanguínea o por

contacto seroso.

La primo infección, rara vez se elimina en los animales, casi siempre progresa lenta o

rápidamente según la condición inmunológica del hospedero. La diseminación a través

del torrente sanguíneo y de las vías linfáticas puede ser generalizada y causar muerte

rápida en el animal. La mayoría de las veces la tuberculosis bovina tiene un curso

crónico y limitado a un sólo órgano: el pulmón (Manual de Merck de Veterinaria 2000).

Experimentalmente el foco primario visible se desarrolla en ocho días y la calcificación

en un plazo de tres semanas (Liébana y col, 1998).

c) Agravamiento

La resistencia adquirida o pre munición es vencida a consecuencia de ciertas

influencias (mala higiene, subalimentación, agotamiento, enfermedades


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intercurrentes, etc.) llevando a la bacilemia, luego a la generalización y por último a

la muerte(Ward 2005, Soto 2007, Manual de Tuberculosis bovina de Uruguay

1986).

7.4. Epidemiología

Aproximadamente el 30% de los animales expuestos llegan a ser infectados, los bacilos

micobacterianos al entrar al organismo del animal, pueden ser fagocitados por

macrófagos; éstos pueden eliminar a las micobacterias o permitir que proliferen dentro

de ellos, en este ultimo caso, se puede formar un foco primario, ya que la bacteria

prolifera intracelularmente e induce a que las citocinas inicien la respuesta inflamatoria;

y esta respuesta caracteriza por una reacción de hipersensibilidad tipo IV, esta lesión es

formada por macrófagos muertos, rodeados por granulocitos, linfocitos y otras células

del sistema inmune (Aranaz y col 1996, Tizard 1995).

El organismo ha desarrollado mecanismos para evadir la eliminación de los bacilos

gracias a una fuerte respuesta inmune mediada por células. La resistencia natural del

animal destruye algunos bacilos, liberando ciertas moléculas que actúan como

antígenos. Cuando se activan los linfocitos estimulados inmunológicamente, los

macrófagos muestran actividad antimicobacteriana (Pollock y col 2005). Sin embargo

algunos bacilos no pueden ser destruidos, ya que durante la infección, el macrófago

juega un papel contradictorio ya que es la unidad primaria de defensa y además, el sitio

primario de la replicación de la bacteria (Flynn y col 2001).

Puesto que M. bovis persiste en los macrófagos dentro de un granuloma en los órganos

de los huéspedes infectados, estos bacilos son los que llegan a los nódulos vía vasos

linfáticos produciendo un proceso inflamatorio inespecífico hasta que el nivel de

hipersensibilidad sea lo suficientemente acentuado como para producir una necrosis

caseosa.

Los granulomas recién formados están compuestos por fagocitos mononucleares

inmaduros rodeados de células efectoras linfocíticas como las células T CD4+ y CD8+.

Durante el proceso de maduración a granulomas productivos, los fagocitos

mononucleares se diferencian en macrófagos y llegan a ser activados, agregándose en


14

células gigantes multinucleares y células “epiteloidales” (Flynn 2001, Waters 2011,

Welsh 2005, Pollock 2005).

Las células inmunológicamente competentes son los linfocitos T. El periodo de latencia

para alcanzar el pico de actividad requiere varios días a dos semanas frente a un

segunda exposición, se produce una respuesta lenta cuyo pico se alcanza entre 24 y 72

hrs. Los antígenos son procesados primero por los macrófagos análogos a los del

sistema humoral inmunitario y luego presentado a las células T. Estas células T

sensibilizadas atraen macrófagos adicionales que se acumulan en el lugar de reacción.

Dichos macrófagos son los componentes celulares principales de la respuesta

inflamatoria mediada por la inmunidad celular. Una vez, reconocido el antígeno, los

linfocitos liberan sustancias denominados linfocinas que atraen monocitos (macrófagos)

del torrente sanguíneo. Los linfocitos sensibilizados pueden participar directamente en

la destrucción del antígeno, (células T citotóxicas o killer cells) pero los macrófagos

atraídos también elaboran materiales citotóxicos y presentan su capacidad fagocítica

aumentada, requiriendo activación por la linfocinas. Esta reacción es una especifica

pero una vez activados los macrófagos se convierten en citotóxicos inespecíficos (, Roitt

y col 1998, Abbas y col 2004).

El granuloma tuberculoso contiene ambas células T CD4+ y CD8+ que probablemente

participan en la batalla continua para contener la infección dentro de los granulomas y

la prevención de la reactivación (Pollock 2005, Flynn 2001, Skinner 2003, Mcaulay

2003)

Se encontró que el interferón gama(IFN-γ) es un citocina clave en el control de la

infección por M. bovis. Esta citosina es producida tanto por linfocitos T CD4+ como por

CD8+ en la tuberculosis, así como por las células NK(Flynn y col 2001, Waters 2010,

Welsh 2005). El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), aunque es ineficaz cuando se

usa solo, tiene un efecto sinérgico con el IFN-γ para inducir los efectos

antimicobacterianos de macrófagos. Un importante mecanismo efector responsable de

la actividad antimicobacteriana del IFN-γ y TNF-α, es la inducción de la producción de

la producción de óxido nítrico y intermediarios de nitrógeno reactivo (RNI) por lo

macrófagos a través,de la acción de la forma inducible de la sintetasa del óxido nítrico


15

(NOS2), de hecho, estas dos citocinas actúan de forma sinérgica para inducir la

expresión de la vía de generación de RNI (Flynn y col 2001, Pollock 2005).

La formación del fagolisosoma es otra función de los macrófagos, que es dirigida a

controlar la infección intracelular; principalmente el lisosoma es un complejo de

orgánulos vacuolares de la vía endocítica tardía. Dentro de las vacuolas lisosomales

existen potentes enzimas hidroliticas, capaces de degradar una amplia gamma de

macromoléculas incluyen microbios. La función óptima de estas enzimas es que

trabajan a un PH acido (una condición encontrada en el medio intralisosomal). El

lisosoma trabaja en un ambiente muy acido en las células animales: pH 4.5-5.0; este

ambiente acido se mantiene gracias a las bombas de membranas de protones

dependiente de ATP, la H+ATPasa (Flynn 2001, Welsh 2005).

7.5. Reacción de la hipersensibilidad tardía de la piel, bases del diagnóstico de la

tuberculosis bovina

El conocimiento de este mecanismo comenzó con la descripción que hizo Koch de un

fenómeno que lleva su nombre; en cobayos infectados por vía sistémica con

Mycobacterium tuberculosis, luego de 3 semanas aplicaba una nueva dosis de bacilos

por vía intradérmica Koch observó, que en el lugar de la segunda inoculación, después

de producirse un nódulo que alcanzaba su mayor tamaño luego de las 72 hrs, se curaba

espontáneamente aunque el cobayo moría por tuberculosis debida a la primera

inoculación (Soto 2007).

Esta inmunidad de manifestación local tiene un carácter diferente de la inmunidad por

anticuerpo circulantes y por el papel fundamental desempeñado por los leucocitos

mononucleares, se le ha denominado inmunidad celular o mediada por células.

También demostró que la inoculación intradérmica de tuberculina podría producir una

reacción local, que es manifestación de la hipersensibilidad retardada que se produce

luego de 3 semanas post-infección. Luego de la infección primaria, lo bovinos

desarrollan inmunidad celular e hipersensibilidad. La inmunidad adquirida puede

retardar la evolución de la lesión, pero no la detiene (Gómez y col, 1986).


16

Entre las especies de micobacterias más comunes que causan sensibilidad tuberculínica

en la ausencia de infección de M. bovis se pueden encontrar:

1. M. tuberculosis. Causa predominante de tuberculosis humana. Esta bacteria no

provoca enfermedad progresiva en el bovino, pero es una importante causa de

reactividad en bovinos expuestos a personas enfermas de tuberculosis.

2. Complejo M. avium. La exposición ambiental de bovinos con M. avium es una

causa muy importante de sensibilidad heteroespecífica en el bovino.

3. M. paratuberculosis (M. johnei). Es la causa de la paratuberculosis (enfermedad

de Johne) en bovino y es una causa de sensibilidad hetero-específica en el

bovino.

4. Otras micobacterias no patógenas( M. chelonae, M. abscessus), como las

especies de micobacterias que se encuentran en las lesiones de piel (dermatitis

tuberculosa), capaces de causar sensibilidad tuberculínica.

Cabe destacar, que la micobacteria tiene más de 1000 antiígenos (Ag) diferentes,

algunos inmunogénicos, otros inmunosupresores. Unos son presentados por el

Complejo Mayor de histocompatibilidad clase II de los macrófagos a los linfocitos

CD4+ y/o linfocitos B, otros por el CMH clase I., de células somátivas a los linfocitos

CD8+. Así algunas proteínas unidas a una fracción cérea pueden mediante inyección

inducir una respuesta inmune celular (sensibilidad a la tuberculina) y provocar la

formación de diversos anticuerpos. (Soto 2007).

7.6. Diagnóstico de la tuberculosis bovina

Existen métodos directos e indirectos para diagnosticar la tuberculosis bovina. En los

directos se determina la presencia del agente en el huésped, esto es en las plantas de

sacrificio, la inspección epidemiológica es una actividad básica en la vigilancia de la

tuberculosis bovina, ya que es ahí donde se detectan en los bovinos las lesiones

macroscópicas asociadas a la infección que se ven a simple vista. La presencia de

tumoraciones en los diferentes órganos. El foco de necrosis presenta una coloración

amarillenta con apariencia caseificada (como queso) y es posible detectar la presencia

de calcio; durante la necropsia se perciben como pequeñas granulaciones blanquecinas


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que crepitan al cortar con el cuchillo. También puede observarse exudado de apariencia

purulenta en meninges.

La prueba confirmatoria de la tuberculosis bovina es el cultivo microbiológico donde se

puede aislar a M. bovis en biopsias de animales sacrificados. Sin embargo, esta prueba

tiene el inconveniente de ser muy tardía, ya que el microorganismo demora entre 4 y 6

semanas para crecer en medios selectivos y sólo puede ser realizada después del

sacrificio.

Los métodos indirectos son aquellos que determina la respuesta inmune del huésped al

agente, ya sea esta de tipo celular o humoral. La prueba más utilizada, como ya se

mencionó anteriormente y la cual es mundialmente practicada es la prueba de la

tuberculina o de intradermo-reacción con PPD bovina (es un derivado proteico

purificado producido a partir de cultivos inactivados de Mycobacterium bovis).

La Secretaria de agricultura, ganadería y desarrollo rural, mediante la Norma Oficial

Mexicana NOM-031-ZOO-1995, para la campaña nacional contra la Tuberculosis

Bovina (Mycobacterium bovis), declara que las pruebas diagnósticas autorizadas son:

a) Prueba de la tuberculina

b) Histopatología

c) Aislamiento bacteriológico e identificación

d) Tipificación

7.6.1. Prueba de la tuberculina

Es el método oficial para detectar a los animales con tuberculosis bovina, sin embargo,

esta prueba posee algunas desventajas relacionadas con la sensibilidad de la prueba. Se

basa en la inducción de una respuesta celular de hipersensibilidad tardía a la inyección

intradérmica de PPD. Cuando se inyecta PPD a un animal sensibilizado por la infección

con M. bovis o por la exposición a antígenos de reacción cruzada de micobacterias

ambientales, hay una respuesta inflamatoria e hinchazón en el sitio de inyección con

mayor intensidad 48-72 horas después de la inyección y es rápidamente reversible.

Debido a la reactividad cruzada con infecciones por micobacterias ambientales tiene

baja sensibilidad que aún provoca numerosos diagnósticos falsos positivos (de Ward


18

2005). En diferentes estudios en el campo se ha determinado una sensibilidad de la

prueba entre el 63-99%, con una media de 83.9% (De la Rua Domenech y col 2006).

Entre los incovenientes de la aolicación de la preuba y que son la causa de que en

animales PPD (+) no se muesten lesiones visibles, se destacan las siguientes causas:

- Muchos de estos animales pueden estar en estados iniciales de la enfermedad por

lo que son sensibles a la tuberculina pero no muestran lesiones visibles.

- Muchos de estos animales tienen lesiones localizadas en partes del cuerpo que

generalmente no se examinan durante el trabajo sistemático de inspección de

carnes.

- Los animales que han estado en contacto con el bacilo tuberculoso aviario,

ordinariamente muestran lesiones discretas o invisibles, siendo sensible a la

tuberculina.

- Puede haber anergia inmunológica al componenete PPD debido a coinfecciones

que abaten el sistema inmune, o también debido a múltiples aplicaciones de la

prueba.

7.6.2. Prueba del Interferón Gamma (IFN-γ)

Por otro lado, existe una prueba comercial, la cual consiste en incubar sangre completa

de bovinos sospechosos de tuberculosis diagnosticados con PPD bovino (PPD-B). Si el

animal ha estado en contacto con el microorganismo, sus linfocitos liberarán IFN-γ, el

cual será detectado a través de un sistema de ELISA sándwich. La desventaja es que la

prueba es comparativamente cara, y además, debido a que también usa el derivado PPD-

B para la identificación de los animales infectados, algunos reportes indican la

identificación de falsos positivos producto de co-infecciones con micobacterias

ambientales que cruzan antigénicamente con el PPD (Aranaz y col. 2006), sin embargo,

sólo se utiliza como prueba de diagnóstico complementario o confirmativa en países

como Australia, Nueva Zelanda y los EEUU (De Ward 2005).

La prueba del interferón gama (IFN-γ) (Bovine Gamma Interferon Test-BOVIGAM)

(Wood y Jones 2001) es una prueba especifica que evalúa la inmunidad celular que se

desarrollo para la detección del IFN- γ principalmente por parte de las células T, y no


19

tanto en la respuesta innata. La sangre completa del bovino sospechoso de estar

infectado primeramente se incuba con antígenos como el PPD bovino, PPD aviar y

control negativo, durante toda la noche y el IFN-γ liberado en el plasma sobrenadante,

es detectado por un ensayo inmuno-enzimático empleando anticuerpos monoclonales.

La infección de tuberculosis es indicada por la liberación predominante de IFN-γ en

respuesta al PPD-B (de la Rua Domenech 2006, Palmer 2006, Rangen 2009).

La desventaja importante de esta prueba es que también está basada en la

sensibilización de los linfocitos usando una mezcla compleja de antígenos, el PPD-B y

PPD-A, para la identificación de los animales infectados, por lo que algunos reportes

indican la identificación de falsos positivos producto de coinfecciones con

micobacterias ambientales que cruzan antigénicamente con el PPD (Aranaz y col 2006),

con una sensibilidad que varía entre el 69 y el 99%, con una media de 88%; por tales

motivos se ha tratado de utilizar la prueba usando antígenos más específicos como

ESAT-6 y CFP10 (Aagaard y col 2006).

7.6.2.1. Ventajas prácticas de la prueba del IFN-γ

La sensibilidad aunque es muy similar a la prueba de la tuberculina doble comparativa,

el tiempo necesario para desarrollar una respuesta es ligeramente menor. También

permite mayor repetición de la prueba, debido a que se puede utilizar la misma sangre

que se evaluó, no se inyecta la tuberculina, por lo tanto, no hay interferencia con el

sistema inmune del huésped; no es necesaria una segunda visita a la granja para leer la

prueba, lo cual permite una interpretación más objetiva y estandarizada de los resultados

puesto que todas las mediciones son basadas en el laboratorio; reduce muchos

problemas prácticos asociados a las prueba intradérmica (ejemplo: malas

interpretaciones, error de operador); se pueden incluir antígenos específicos definidos.

permitiendo la diferenciación de la respuesta de IFN-γ debido a la infección con

micobacterias patógenas de las micobacterias ambientales (Dela Rua Domenech 2006,

Vordermeier y col 1999; Pollock y col 2005, 2001; Buddle y col 1999; Waters y col

2006). Se menciona que la prueba tiene la flexibilidad para establecer los criterios de

interpretación y puntos de corte necesarios para obtener un resultado positivo más

apropiado para una situación endémica de tuberculosis bovina específica (Vordermeiery


20

col, 2008.); además, también se menciona que la prueba es susceptible de ser

enriquecida con la adición de antígenos que sean más específicos para M. bovis.

En los últimos años ha habido un significativo progreso en la identificación de algunas

proteínas antigénicas de M. bovis, en un intento por identificar aquellas que sean más

específicas que las presentes en el PPD (Aagaard y col 2003). La utilización de algunas

proteínas recombinantes en la prueba del IFN-gamma como ESAT-6, CFP10, MPB70

y Rv3615c, ha permitido sugerir sustituir al PPD-B en las pruebas intradérmica y del

IFN-γ (Whelan y col 2010, Casal y col 2012).

Ahora bien, en relación a la utilización de los antígenos ESAT-6 y CFP10 con la prueba

Bovigam®, algunos estudios han revelado que en regiones con bajas prevalencias de la

infección, es posible mejorar la especificidad (99%) de la prueba in vitro del IFN-γ de

los animales reactores positivos a la prueba de la tuberculina, aunque la sensibilidad

esté por debajo de un 90%(Pollock y col, 2000), sin embargo, en regiones con altas

prevalencias hasta un 85% de los animales positivos fueron confirmados utilizando

estos dos antígenos en la prueba del IFN-γ (Aagaard y col 2010). lo cual demuestra la

necesidad de seguir buscando nuevos antígenos que puedan aumentar la sensibilidad de

la prueba en sangre en hatos ganaderos independientemente del estatus de la infección

en la región.


21

8. JUSTIFICACIÓN

Un estudio comparativo reciente de los genomas de varias micobacterias para estudiar

la presencia y homología de un grupo de genes denominado regulón DosR, reveló que

existen diferencias significativas entre los genomas de M. bovis y M. avium. Se observó

que aunque algunos de estos genes están presentes en M. avium spp. paratuberculosis,

tienen diversos grados de identidad, y otros están totalmente ausentes en su genoma

(Lin y col 2009), lo que los hace fuertes candidatos para ser utilizados para discriminar

una infección entre M. bovis y una de M. avium. Cabe hacer notar que algunos de los

antígenos DosR, mostraron tener antigenicidad al ser usados para estimular la respuesta

inmune de pacientes con tuberculosis humana (Leyten y col 2006), provocando

satisfactoriamente la proliferación de células T y liberación de IFN-gamma, haciendo

viable su uso para el diagnóstico de la infección por M. tuberculosis.

Debido a que aún falta definir una mezcla de antígenos que sea totalmente específica

para detectar una infección por M. bovis en el ganado bovino en este trabajo se optó por

producir los antígenos recombinantes Mb1762c, PfkB y HspX pertenecientes al

regulón DosR de M. bovis, con la finalidad de comprobar si estos son realmente

antigénicos promoviendo la estimulación de la respuesta inmune celular con uso

potencial en el diagnóstico de la TB bovina.


22

9. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

La ganadería bovina y la industria de la carne y leche representan una de las principales

actividades del sector agropecuario de muchos estados de la República Mexicana. Las

pérdidas económicas en el sector agropecuario por infecciones como la tuberculosis en

el ganado han originado una constante preocupación de la industria alimenticia y

productores nacionales e internacionales porque genera muchas pérdidas en la

producción de carne y leche limitando el comercio internacional.

La experiencia acumulada indica que la tuberculosis bovina es controlable y erradicable

mediante la detección y eliminación de los animales infectados, sin embargo, la alta

incidencia de tuberculosis en el ganado productor de leche hace al sacrificio una medida

de control difícil de aplicar por las pérdidas económicas que representa al productor.

Durante años, la prueba oficial para detectar a los animales con tuberculosis bovina ha

sido la tuberculina, sin embargo, esta prueba posee algunas desventajas relacionadas

con la sensibilidad de la prueba. Métodos comerciales de detección más recientes están

basados básicamente en la sensibilización de los leucocitos de los animales infectados a

secretar IFN-gama por su estimulación in vitro con mezclas de antígenos

micobacterianos de M. bovis (PPD-B) o de M. avium (PPD-A), con una sensibilidad

igualmente variable.

Debido a que aún falta identificar nuevos antígenos de M. bovis que puedan ser

utilizados para detectar una población infectada de una forma más confiable, esta

propuesta plantea utilizar los antígenos específicos PfkB, HspX y Mb1762c de este

microorganismo para aumentar la sensibilidad y el valor predictivo de la prueba de

diagnóstico comercial contra la tuberculosis bovina que está basada en la detección de

la producción de IFN-γ en sangre.


23

10. HIPÓTESIS

Los antígenos recombinantes PfkB, HspX y Mb1762c de M. bovis son los bastante

antigénicos para utilizarlos en el diagnóstico de la TB bovina.


24

11. OBJETIVOS

11.1. Objetivo General

Producir las proteínas recombinantes PfkB, HspX y Mb1762c de M. bovis y evaluar su

antigenicidad en sangre de bovinos naturalmente expuestos a la infección con M. bovis

11.2. Objetivos Específicos

� Purificar las proteínas recombinantes Mb1762c, PfkB y HspX producidas en

cualquiera de dos sistemas de expresión de E. coli.

� Comprobar la antigenicidad de las proteínas recombinantes mediante la

inducción de la producción de IFN-γ en sangre de bovinos de hatos ganaderos

con diferentes prevalencias de la infección.

� Comparar la estimulación de la respuesta celular producida por las proteínas

recombinantes contra la provocada por los antígenos PPD-B, ESAT-6 y CFP10.


25

12. MATERIALES Y MÉTODOS

12.1. Diseño de oligonucleótidos y amplificación de los genes.

Para sintetizar las proteínas de M. bovis, primero se diseñaron los oligonucleótidos

específicos utilizando el software CLC BIO DNA workbench (Tabla 1) para poder

amplificar los genes Mb1762c, pfkB y hspX completos de las proteínas. Los oligos

fueron diseñados de acuerdo a las recomendaciones del manual para poder integrar el

amplificado a los vectores de expresión correspondientes de acuerdo a las

especificaciones de cada kit de expresión. Los fragmentos de los genes Mb1762c, pfkB

y hspX, de 633 pb, 1020 pb y 435 pb, respectivamente, fueron amplificados a partir de

DNA genómico de M. bovis de la cepa AN5 por una reacción de PCR) de alta fidelidad

utilizando la enzima PfuUltra High-Fidelity DNA polimerasa (Stratagene). La mezcla

de reacción de la PCR conteniauna concentración final de 200 nM de cada uno de los

oligos F y R 10 µM, 100 ng/µl de DNA templado , 2.5U de PFU DNA polimerasa

(Stratagene). La mezcla de reacción fue llevada a un volumen final de 50 µl con agua

desionizada esteril. Las condiciones para la PCR fueron las siguientes:

desnaturalización inicial a 95ºC por 2 min, 30 ciclos de 95ºC por 30 seg, 60ºC por 30

seg y 72ºc por un min, y un paso final de extensión de 72ºC por 10 min. se analizaron

por electroforesis 10 µL de las mezclas resultantes, cargándose en un gel de agarosa al

1% preparado con SYBR-Safe (Invitrogen), y se corrieron durante 45 min a un voltaje

constante de 80 V. Las bandas de los productos de amplificación en el gel se

visualizaron mediante un transiluminador de luz UV y un sistema analizador de

imágenes GelDoc XR (Bio-Rad). Los fragmentos de DNA amplificados fueron

purificados directamente de la mezcla de reacción con el kit MinElute PCR purification

kit de QIAGEN.


26

Tabla 12.1. Oligonucleótidos usados para amplificar los genes completos de las

proteínas de este estudio de acuerdo a los vectores de clonación.

Vector pIVEX2.3d Gen Oligo Forward Oligo Reverse hpsX ttttttccatggccaccacccttc ttttttgatatcgttggtggaccggatct pfkB tatantaccatggcggagccagcagcggcgtg tatatacccgggtggcgaggcttccgggttaac Mb1762 ttttttccatgggaatcgccacaacccgc ttttttcccgggccgctgcgtgcagaa

Vector pET101/D-TOPO

Gen Oligo Forward Oligo Reverse

hpsX caccatggccaccacccttc gttggtggaccggatct

pfkB caccatgacggagccagcgg tggcgaggcttccgg

Mb1762 caccatgatcgccacaacccg ccgctgcgtgcagaa

12.2. Clonación en el vector pET101/D-TOPO para expresión usando cultivos de E.

coli.

Los fragmentos amplificados de los genes completos Mb1762c, pfkB y hspX, fueron

sujetos a clonación en el vector pET101/D-TOPO (Invitrogen) de acuerdo a la técnica

del manual de inserción del propio vector, y posteriormente se transformó cada uno de

los vectores recombinantes a la cepa de E. coli DH5αmediante electroporación a 200

Ohms, 25 µF y 2.5 kV en celdas para electroporación de 0.1 cm (Sigma), utilizando un

electroporador Gene Pulser II (BioRad). Las células transformadas se incubaron en 1 ml

de caldo LB durante 1 hr y después se recuperaron por centrifugación para sembrarse

todas en medio LB sólido con ampicilina 100 mM y finalmente se incubaron por 16 h a

37°C.

Para la comprobación de la presencia del plásmido recombinante, se eligieron algunas

colonias al azar y se cultivaron toda la noche en 3 ml de caldo LB, posteriormente se les

extrajo el DNA plasmídico con el kit GeneJET Plasmid Miniprep (Fermentas). Se

realizó un PCR usando el kit DreamTaq PCR Master Mix (Fermentas), utilizando los

oligos específicos de cada gen con el DNA plasmídico de las colonias recombinantes


27

con los insertos de cada gen, de acuerdo a las siguientes condicione: La mezcla de

reacción del PCR contenía, 26 ng de DNA moldedel templado de M. bovis, 0.5 µl de

cada oligo 10 µM, y 10 µl de Dream Tag Master Mix 2X; la mezcla se llevó a un

volumen final de 20 µl con agua desionizada esteril. Las condiciones de PCR fueron las

siguientes: desnaturalización inicial a 95ºC por 5 min; 30 ciclos de 95ºC por 30 seg,

60ºC por 30 seg y 72ºC por 40 seg; y un paso final de extensión a 72ºC por 7 min.. Los

amplificados fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa como se

describió anteriormente.

12.3. Clonación en el vector pIVEX 2.3d para expresión en un sistema de traducción

libre de células.

Simultaneamentese diseñaron los oligos usando el software CLC BIO DNA workbench

para la amplificación del gen pfkB y clonarlo en el vector de expresión pIVEX.2.3d

(Roche) para la expresión en un sistema de traducción in vitro de E. coli. El gen

completo se amplificó mediante PCR de alta fidelidad con el kit PlatinumTaq DNA

polimerase High Fidelity (Invitrogen), de acuerdo a las siguientes condiciones: La

mezcla de reacción del PCR constó de 150 ng/µl de DNA templado, 0.5 µl de oligo F y

R 10 µM, y 10 µl de Dream Tag Master Mix 2X. La mezcla se llevó a un volumen final

de 20 µl con agua desionizada esteril. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes:

desnaruralización inicial a 95ºC por 5 min; 30 ciclos a 95ºC por 30 seg, 60ºC por 30

seg, y 72ºC por 40 seg; y un paso final de extensión a 72 ºC por 7 min.

Posteriormente, el fragmento completo del gen pfkB se insertó en el vector pCR-TOPO

2.1 (Invitrogen) mediante una reacción de inserción de acuerdo al manual de

procedimiento del propio vector, y se transformó a la cepa de E. coli DH5αmediante el

procedimiento descrito anteriormente. Se seleccionaron las cepas sugestivas de contener

el vector recombinante, en agar LB con ampicilina y se obtuvieron los plásmidos

recombinantes de un cultivo en medio líquido mediante el procedimiento descrito

anteriormente. Se cortaron los dos vectores (pCR2.1-TOPO recombinante y pIVEX

2.3d) con las enzimas NcoI y SmaI (Promega) incubándolos en un Termoblock

(Labnet): primero a 37 ºC por 1 hr, y luego a 30 ºC por 1 hr, respectivamente,. Los


28

productos de restricción se corrieron en un gel de agarosa como se describió

anteriormente, y los fragmentos de interés

Los fragmentos se ligaron en una proporción vector digerido-inserto de 1:4, es decir,

2.5 µl del vector pIVEX 2.3d y 10 µl de fragmento pfkB liberado del pCR2.1-TOPO,

además, la mezcla llevó 4 µl de buffer de ligación 5X, 2 µl de DNA ligasa T4

(Invitrogen) y se llevó a un volumen del 20 µl con agua desionizada esteril, se incubó

por 18 h a 16°C. Posteriormente, la mezcla de ligación resultante, se transformó

directamente a células electrocompetentes de la cepa E. coli DH5α mediante el

procedimiento de electroporación descrito; las cepas transformantes se seleccionaron

como ya se indicó en medio LB y ampicilina. Después de aislar los plásmidos

recombinantes, se usó el kit libre de células RTS 100 E. coli HY (Roche) en el equipo

ProteoMaster de Roche para la síntesis de 20 µg de proteína.

12.4. Expresión de las proteínas recombinantes.

Los plásmidos recombinantes resultantes de la clonación de los tres genes en el vector

pET101/D-TOPO se transformaron a la cepa de E. coli BL21 Star (DE3) (Invitrogen)

mediante electroporación de la forma descrita. Las transformantes se seleccionaron en

agar LB con ampicilina. De las clonas obtenidas, se seleccionó sólo una colonia, la cual

se comprobó que contuviera el plásmido mediante aislamiento de plásmidos. Las

colonias se inocularon en 5 ml de caldo LB con ampicilina y se incubaron a por 16 h a

37°C con agitación de 250 rpm. Posteriormente, los cultivos de 5 ml se transfirieron a

200 ml de caldo LB en un matraz de 1 lt y se continuaron incubando a 37°C con

agitación de 250 rpm, hasta llegar a una densidad óptica de 0.5 unidades medida a 600

nm en un espectrofotómetro Genesys 10uv (ElectronCorporation). Inmediátamente

después, se les adicionó isoprpil-β-D-tiogalactósido (IPTG) a una concentración de 1

mM, continuando con la incubación en agitación durante 4 h más. Posteriormente, se

consecharon las células por centrifugación a 5000 rpm por 15 min a 4°C en botellas de

100 ml para rotor de centrifuga Universal 320R (Itettich Zentrifugen). Las pastillas

celulares se lisaron en buffer de lisis PBS (buffer salino de fosfatos con triton X-100 al

0.1% y un coctel de inhibidores de proteasas (Leupeptina al 10 mM, 4-2 Aminoetil

benceno sulfonilfloruro hidrocloruro al 0.1 mM, Antipaina al 50 mM, EDTA al 10 mM)


29

mediante 4 pulsos de 1 min de sonicación en hielo con un sonicador de punta metálica

Misonix XL-2000 y se separó la fracción soluble de la insoluble por centrifugación a

5000 rpm y 4°C, la fracción soluble posteriormente se filtró por una membrana de 0.45

µm de diámetro del poro. Ambas fracciones se guardaron a -20°C hasta su posterior uso

para comprobar la presencia de la proteína expresada mediante electroforesis y Western

blot.

Además, la expresión de la proteína PfkB clonada en el vector pIVEX 2.3d se llevó a

cabo mediante el kit RTS 100 E. coli HY (Roche) como se describe brevemente a

continuación. Quinientos ng de plásmido recombinante disueltos en 10 µl, se mezclaron

con 12 µl de un lisado de E. coli, 10 µl de mezcla de reacción, 12 µl de mezcla de

aminoácidos, 1 µl de metionina y 5 µl de buffer de reconstitución (Roche,

proporcionados por el kit); la mezcla final (50 µl), se incubó durante 6 h a 37°C y 300

rpm en un equipo RTS ProteoMaster (Roche). Posteriormente, se tomaron 5 µl de la

reacción final para su análisis por electroforesis y Western blot como se describe a

continuación. Los 45 µl restantes se guardaron a -20°C hasta su uso.

12.4.1. Análisis de las proteínas recombinantes mediante electroforesis en gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE).

Una alícuota de 20 µl de las fracciones soluble e insoluble de los lisados celulares

obtenidos después de la inducción con IPTG, se incubaron con buffer de Laemmli 2X

(Tris base 12M, SDS 0.12M, glicerol 2M, β-mercaptoetanol al 10% y azul de

bromofenol) y se calentaron en baño María hirviendo por 5 min y posteriormente se

corrieron en un gel de poliacrilamida al 12% mediante electroforesis desnaturalizante

(SDS-PAGE) por 1 h a un voltaje constante de 120 V en una cámara Mini-Protean II

(BioRad). El gel se tiñó con azul de Coomassie y después de desteñirse con una

solución de ácido acético al 10% y metanol al 40%, se observó en un analizador de

imágenes GelDoc XR (BioRad).

12.4.2. Análisis de las proteínas recombinantes por Western blot con anticuerpo anti-

His6.


30

Una réplica del gel de poliacrilamida con las fracciones subcelulares obtenidas, se

colocó en un sándwich sobre una membrana de nitrocelulosa Hybond ECL (Amersham)

y se sometió a una electrotransferencia durante 1 h a 100 V constantes en buffer de

transferencia (Tris base 25 mM, glicina 192 mM y metanol al 20%). Posteriormente, la

membrana se bloqueó durante 1 h a 4oC con amortiguador PBS-Tween 20 al 0.1% con

leche sin grasa al 5% y después de algunos lavados con el mismo amortiguador sin

leche, se incubó 1 h con el anticuerpo IgG anti-His6 de ratón (Roche) en una

concentración de 0.2 µg/ml en PBS-Tween con leche al 5%. Posteriormente se lavó de

nuevo la membrana con el buffer PBS-Tween por 3 ocasiones y se incubó durante 2 h

con un segundo anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (Sigma) en

dilución 1:2000 en amortiguador PBS-Tween 20 al 0.05% con leche al 2.5%. Después

se lavó por 3 ocasiones más y se reveló con 25 ml de solución reveladora de PBS con

sustrato TMB (3, 3´, 5, 5´-tetrametilbenzideno, BioRad) al 0.3%, metanol al 16% y 30

µl de peróxido de hidrógeno al 30%, hasta la aparición de las manchas de color marrón.

12.5. Purificación de las proteínas recombinantes mediante columnas de afinidad.

Las fracciones solubles de los lisados bacterianos, se pasaron por una columna de

afinidad BIO-SCALE Mini Profinity IMAC (Bio-Rad) de 5X5 ml. La columna de

afinidad se equilibró previamente con 5 volúmenes de buffer de equilibrio (KCl 300

mM, KH2PO4 50 mM e imidazol 5 mM). Después, se pasó por gravedad la fracción

soluble con la proteína recombinante, y posteriormente se lavó la columna con 6

volúmenes de buffer de lavado (KCl 300 mM, KH2PO4 50 mM e imidazol 10 mM), por

último, se agregaron 10 volúmenes de buffer de elución (KCl 300 mM, KH2PO4 50 mM

e imidazol 250 mM) para despegar la proteína, recolectándose en alícuotas de 5 ml. Las

fracciones de lavado y elución, se guardaron a -20°C hasta su uso, y solamente unas

alícuotas de 20 µl de cada fracción se analizaron mediante electroforesis SDS-PAGE en

geles de poliacrilamida al 12%, tinción de Coomassie y Western blot, usando el mismo

procedimiento descrito anteriormente.

Con el fin de eliminar cualquier contaminante de la proteína se realizó una

electroelución,se sometieron las fracciones de elusión a una concentración por

deshidratación en vacío mediante SpeedVac a 45°C hasta tener alícuotas de 200 µl


31

aproximadamente en tubos de 1.5 ml. Posteriormente, las fracciones concentradas se

corrieron en geles preparativos de SDS-PAGE al 10% a 120 V por 1 hr, el gel se tiñó

por la técnica reversible de Zn-imidazol para visualizar las bandas más ricas de la

proteína recombinante y estas se cortaron del gel para colocar los fragmentos de gel con

la proteína en una celda para electroelución armada con los frits de filtración (BioRad).

Para la electroleución se corrió primero con buffer de corrida 1X con SDS durante 4 hr

a 12 mA, posteriormente con buffer de corrida 1X sin SDS durante otras 2 hr. Por

último, se recuperó con micropipeta la suspensión concentrada de la proteína de la celda

de electroelución. La solución de proteína en buffer Tris se colocó en membrana para

diálisis (Sigma) con diámetro de poro de 10 kDa y se dializó contra buffer PBS frío

estéril (1:200 v/v) con 4 cambios de buffer de cada 4 hr cada uno a 4°C. Finalmente, la

proteína pura se concentró en el tubo de diálisis por ósmosis reversa con polvo

Aquacide II (Calbiochem). La suspensión de proteína en PBS se guardó hasta su uso a -

70°C en alícuotas de 100 µl a una concentración de proteína aproximada de 50 mg/ml,

estimada mediante el método de Bradford adaptado a microplaca. Para la cuantificación

se tomó en cuenta una curva de estándar de seroalbúmina bovina (BSA) con un rango

de concentración entre 0 y 400 µg/ml, calculando la concentración directamente por el

método de regresión lineal simple.

12.6. Evaluación de la antigenicidad de las proteínas recombinantes en sangre de

bovino.

Para medir la antigenicidad de las proteínas recombinantes mediante la estimulación de

la inmunidad celular, se usó el kit de diagnóstico complementario de la tuberculosis

bovina conocido como prueba de Bovigam (Prionics), el cual se basa en medir la

producción de IFN-γ en sangre de bovinos. Se tomaron en tubos de heparina de litio

alrededor de 6 a 10 ml de sangre de bovinos naturalmente expuestos a M. bovis,

habiéndose muestreado animales de zonas con diferente prevalencia de la infección

algunos de los cuales dieron negativa la tuberculina pero están expuestos a animales

positivos, y otros, que en su mayoría tuvieron una prueba de la tuberculina positiva. La

sangre se estimuló tal y como lo indica el manual con los propios antígenos del kit

(PPD-B y PPD-A), y con las proteínas recombinantes HspX y PfkB, a una


32

concentración de 4 µg/ml, así como también en mezcla con los antígenos ESAT6 y

CFP-10.

Posteriormente, se utilizó solamente el plasma que se obtuvo por centrifugación de la

sangre, para medir indirectamente la proporción de IFN-γ producido después del

estímulo con los antígenos, midiendo la densidad óptica (450 nm) de la muestra

mediante la prueba de ELISA tipo sándwich de doble anticuerpo monoclonal, tal y

como lo indica el manual del kit. Los resultados se expresaron como índices de la

densidad óptica obtenida por antígeno o mezcla de antígenos usados para la

estimulación.

12.7. Análisis estadístico.

12.7.1 Cumplimiento de supuestos estadísticos

Se sometieron los datos de absorbancia de cada antígeno a diferentes pruebas para ver si

cumplían con los supuestos estadísticos para poder ser analizados mediante estadística

inferencial. Se realizó la prueba de Shapiro-Wilks para determinar la normalidad de los

datos. Para determinar la homogeneidad de varianzas se uso la prueba de Bartlett. Los

datos con un valor de p<0.05 no cumplen con el supuesto de normalidad o de

homogeneidad de varianzas.

12.7.2 Comparación de grupos

Se analizó si existían diferencias estadísticas significativas entre las muestras

estimuladas con los diferentes antígenos del grupo de alta prevalencia de TBb con el

grupo de baja prevalencia. Este análisis se realizó mediante la prueba U de Mann-

Whitney, que es la versión no paramétrica de la habitual prueba de t de Student. Un

valor de p<0.05 fue considerado significativo. El análisis estadístico se realizó con el

software SigmaStat 8.0®.

12.7.3 Curvas ROC (Receiver Operating Characteristics)

Evaluamos mediante curvas ROC el potencial de diagnóstico, calculando la sensibilidad

y la DO de corte, tanto para el antígeno PPD-B del Bovigam®, como para las distintas

mezclas de antígenos recombinantes. Las curvas ROC (Receiving Operating


33

Characteristic Curve) son particularmente útiles para comparar el desempeño de dos o

más pruebas diagnósticas (Greiner y col, 2000).Las curvas ROC se realizaron con

SigmaPlot® 10.0 y un valor de p<0.05 se consideró significativo. Estas curvas

correlacionan la sensibilidad (proporción de verdaderos positivos) con la especificidad

(falsos positivos) en una prueba diagnóstica. El área bajo la curva indica la probabilidad

de clasificar correctamente un par de muestras tomadas al azar. El punto de corte y la

sensibilidad fueron calculados a una especificidad del 85% en la curva ROC de cada

antígeno.


34

13. RESULTADOS

13.1. Selección de antígenos

Un estudio comparativo reciente de los genomas de varias micobacterias para estudiar

la presencia y homología de un grupo de genes denominado regulón DosR, reveló que

existen diferencias significativas entre los genomas de M. bovis y M. avium. Se observó

que aunque algunos de estos genes están presentes en M. avium spp. paratuberculosis,

tienen diversos grados de identidad, y otros están totalmente ausentes en su genoma

(Lin y col, 2009), lo que los hace fuertes candidatos para ser utilizados para discriminar

una infección entre M. bovis y una de M. avium. Cabe hacer notar que algunos de los

antígenos DosR, mostraron tener antigenicidad al ser usados para estimular la respuesta

inmune de pacientes con tuberculosis humana (Leyten y col, 2006), provocando

satisfactoriamente la proliferación de células T y liberación de IFN-gamma, haciendo

viable su uso para el diagnóstico de la infección por M. tuberculosis.

Así, se seleccionaron 3 proteínas del regulón DosR de M. bovis (Tabla 1) ya que están

ausentes o con muy poca homología en M. avium spp. paratuberculosis (Tabla 2), lo

que los hace fuertes candidatos para comprobar si poseen alguna antigenicidad en

sangre de bovino Infectado por M. bovis.

Tabla 13.1. Proteínas del regulón DosR de M. bovis consideradas para el estudio.

Antígeno de

M.

tuberculosis

Antígeno de

M. bovis

Gen Peso

molecular

(kDa)

Tamaño

del gen

(pb)

Producto

Rv1733c Mb1762c mb1762c 22.4 633 Probable proteína

transmembranal conservada


35

Rv2029c Mb2054c pfkB 35.4 1020 Fosfofructocinasa

Rv2031c Mb2057c hspX, acr 16.3 435 Proteína de choque térmico

HspX ( α-cristalina)

Tabla 13.2. Similitud de los antígenos DosR seleccionados de distintas micobacterias.

Mycobacterias tuberculosas aMNT

Antígeno

H37Rv

M. tuberculosis CDC15

51

M. tuberculosis

M. tuberculosis F1

1

M. tuberculosis “H

aarlem

”

M. bovis AF21

22/97

M. bovis BCG Pasteur

M. avium sub

sp.

paratuberculosis K10

Rv1733c 98 99 99 99 99 99 NPb

Rv2029c 100 100 100 100 100 100 NP

Rv2031c 100 100 100 100 100 100 59

aMicobacteria no tuberculosa. bAusencia del antígeno.

13.2 Amplificación de los genes seleccionados.

Se amplificaron los genes completos de los antígenos por PCR de alta fidelidad, (Figura

1). Indistintamente, los productos génicos obtenidos de cada una de las proteínas se

intentaron introducir en los vectores de expresión pIVEX2.3d y pET101-D/TOPO.


36

Fig. 13.1. productos de amplificación por PCR de los genes hspX, mb1762c y pfkB.

Carriles: 1) hspx,2) mb1762c, 3) pfkB y M) marcador de peso molecular de 250 pb.

13.3. Clonación de gen pfkB en vector de expresión

El gen pfkB se insertó en el vector de subclonación pCR-TOPO 2.1 y se transformó por

electroporación a la cepa E. coli DH5α, posteriormente se aisló de E. coli mediante

aislamiento del DNA plasmídico y se cortó con las enzimas de restricción NcoI y SmaI.

El vector pIVEX2.3d también se cortó de la misma forma(Figura 2). Las bandas de

DNA correspondientes al inserto pfkB liberado de 1,000 pb y del vector linearizado de

3,560 pb se purificaron del gel de agarosa .

5000

1000

1 2 3 4 M

M 1 2 3

1000

750

500


37

Fig. 13.2. productos de digestión con enzimas de restricción NcoI y SmaI. Carriles: 1 y

2) vector pCR-TOPO 2.1 con inserto del gen pfkB ; 3 y 4) vector pIVEX 2.3d y M)

marcador de peso molecular d 250 pb.

Posteriormente a la subclonación de pfkB en pIVEX2.3d, se procedió a comprobar la

construcción cortando el vector con la enzima de restricción SmaI esperando un

fragmento de 4500 pb correspondiente a pIVEX2.3d+pfkB (Figura 3). También se

comprobó el inserto liberando nuevamente el inserto pfkB del vector con las enzimas de

restricción SmaI y NcoI, (Figura 3).

Fig. 13.3. Productos de digestión del vector recombinante pIVEX 2.3d+pfkB con las

enzimas SmaI y NcoI. El vector recombinanate se incubó durante 1 hr a 37°C con las

enzima de restricción. . Carriles: 1) pIVEX2.3d+pfkB digerido con SmaI y 2)

pIVEX2.3d+pfkB digerida con SmaI y NcoI. M) marcador de peso molecular de 1 kb.

A su vez, para confirmar la presencia del gen pfkB en el vector recombinante, se realizó

una PCR lo cual confirma la presencia del gen en el vector de expresión(Figura 4).

M 1 2

1000

3000

2000

M 1 2


38

Fig. 13.4. Producto de PCR de pIVEX+pfkB. Carriles: 1) pIVEX2.3d+pfkB, 2)

pIVEX2.3d. M) marcador de peso molecular de 250 pb.

13.4. Clonación de gen hspx en vector de expresión pIVEX2.3d

Por otro lado, después de amplificar por PCR el gen hspX, se clonó el fragmento

amplificado en el vector pIVEX2.3d linearizado, posteriormentese comprobó la

presencia del gen en el vector con la enzima de restricción SmaI observándose una sola

banda de….correspondiente al vector más inserto (Figura 5).

Fig. 13.5. Digestión de pIVEX 2.3d+hspX con enzima SmaI. Carriles: 1, 2 y 3) vector

recombinante pIVEX+hspX; M) marcador de peso molecular de 1 kb.

1000

500

250

1 2 3 M

3500

2000

1000


39

Por PCR confirmatorio para amplificar el gen hspX directamente del vector pIVEX2.3d-

hspX obtenido a fin de corroborar dicha construcción, se observó un amplificado de

435 pb, del gen hspX en el vector (Figura 6). Lo cual indica que si hubo inserción del

gen hspX en el vector de expresión.

Fig. 13.6. Productos de PCR de pIVEX2.3d+hspX. Carriles: 1, 2 y 3) pIVEX+hspX, 4)

pIVEX2.3d M) marcador de peso molecular de 250 pb.

13.5. Síntesis de las proteínas pfkB y hspx en sistema RTS ProteoMaster

Una alícuota de 10 µl de proteína sintetizada en el equipo RTS-Proteomaster (Roche)

usando cada uno de los dos vectores recombinantes pIVEX2.3d+pfkB y hspX fue

sometida a electroforesis en SDS-PAGE al 12% y transferida a membrana de

nitrocelulosa para poder ser detectada con anticuerpos anti-His6 mediante Western blot.

La proteína PfkB de 37 kDa pudo ser detectada, confirmando su síntesis in vitro (Figura

7), sin embargo la proteína HspX de 16 kDa no fue posible observarla mediante Western

blot (dato no mostrado), existiendo la posibilidad de que el gen no se haya insertado en

el marco de lectura adecuado para que se le incorporen las etiquetas His6.

M 1 2 3 4

1000

500

250


40

Fig. 13.7. Western-blot con anticuerpo anti-His6 de la proteína PfkB sintetizada en RTS

Proteo Master. M) marcadores de peso molecular (kDa).

13.6. Purificación de la proteína PfkB sintetizada con el sistema RTS Proteo Master

Ya que la proteína PfkB se sintetizó correctamente con la etiqueta de histidinas, se

realizó la purificación de acuerdo al manual de procedimiento de las columnas de

afinidad His-Spin Proteinminiprep (ZymoResearch). La proteína PfkB de 37 kDa de

interés no se purificó completamente pura ya que eluye con al menos otra proteína

quizás con una cierta afinidad a la matríz de afinidad (Figura 8). Por otro lado, también

observamos que la cantidad de proteína es muy pequeña ya que en la elución no la

podemos observar muy bien debido a que la banda es muy tenue.

250

75

50

37

25

kDa M PfkB

M 1 2 3 4 5 6 7


41

Fig. 13.8. Gel de poliacrilamida teñido con azul de Coomassie de las fracciones eluidas

por la columna de afinidad donde se pasó la mezcla de proteínas sintetizadas en el

Proteo Master. Carriles: M) marcador de peso molecular (kDa), 1) mezcla completa, 2)

fracción no unida, 3) fracción del lavado 1, 4) lavado 2, 5) lavado 3, 6) fracción de

elución 1 y 7) elución 2.

13.7. Purificación de la proteína PfkB expresada en E. coli BL21

Debido a que la cantidad de proteína PfkB obtenida en el sistema RTS-Proteo Master

fue inferior a la esperada, se decidió transformar por electroporación el vector

recombinante a E. coli BL21, para la producción de proteína. El vector pIVEX 2.3d

también posee los promotores de la transcripción para E. coli BL21, basados en el

sistema de transcripción de la RNA polimerasa del fago T7, para la expresión de las

proteínas in situ.

Ya que la proteína recombinante PfkB contiene etiquetas His6x y se realizó un cultivo

masivo de E. coli BL21, para su purificación se utilizarón columnas de afinidad Bio-

Scale Mini Profinity IMAC con capacidad de flujo para 5 ml . Se recolectó cada una de

las fracciones, , y se tomó una alícuota de 10 µl para comprobar la presencia de la

proteína PfkB mediante tinción y Western blot En el gel de poliacrilamida al 12%

teñido con plata se muestra la banfa de 37 kDa de PfkB totalmente pura (Figura 9).

37 PfkB


42

Fig. 13.9. Gel teñido con plata de las fracciones purificadas de la proteína PfkB por

columna de afinidad. L) lisado total de E. coli, 1) eluido 1, 2) eluido 2, 3) eluido 3, PM)

marcadores kDa

Posteriormente, mediante un Western blot se comprobó la presencia de la proteína en

las fracciones de elución, así como también en las fracciones previas de lavados, es

probable que la presencia en todas las fracciones de purificación sea debida a la alta

concentración de proteína recombinante producida en el cultivo de células masivo

(Figura 10).

Fig 13.10. Western blot con anti-His6 después de la purificación por una columna de

afinidad. Carriles: 1) extracto total, 2) fracción no unida, 3) lavado 1, 4) lavado 2, 5)

elución 1 y 6) elución 2. M) marcador de peso molecular (kDa),

L 1 M 2 3

50

15

20

25

37 PfkB

1 2 M 3 4 5 6

37 PfkB


43

13.8. Clonación y purificación de la proteína HspX en vector de expresión pET101-

D/TOPO.

La segunda opción para intentar producir las proteínas, fue clonar los genes hspX y

Mb1762c en el vector de expresión pET101-D/TOPO para la expresión en E. coli.

.Posterior a la clonación y transformación química a la cepa BL21, para comprobar si

realmente las colonias adquirieron el vector con el inserto del gen de interés, se realizó

el aislamiento de plásmidos de las clonas seleccionadas en agar LB con ampicilina y el

consecuente PCR, en las cuales se observó la amplificación de los genes Mb1762c y de

hspX (Figura 11).

Fig. 13.11. PCR de clonas obtenidas en vector pET101/D-TOPO+hspX y Mb1762c.

Carriles: 1) plásmido recombinante aislado de la clona 1, 2) plásmido recombinante

aislado de la clona 2; 3 y 4) PCR de clonas con gen Mb1762c; 5 y 6) PCR de clonas con

gen hspX . M) marcador de peso molecular de 1kb.

Una vez seleccionadas las clonas positivas de tener el gen hspX, se realizó una cinética

de expresión para determinar el tiempo óptimo de expresión de la proteína en una de

las clonas con el vector recombinante pET101-hspX. Se tomaron muestras de 1 ml del

cultivo a diferentes tiempos de la cinética de inducción, se lisó el cultivo y se corrió en

un gel de poliacrilamida comprobando la presencia de la banda de la proteína

recombinante expresada (Figura 12 y B).

M 1 2 3 4 5 6

5000

600

400


44

Posteriormente, se eligió el mayor tiempo de inducción de 4 hr para la síntesis de

proteína en un cultivo masivo de E. coli en 500 ml de medio con IPTG. Después de la

inducción y lisado de las células, se procedió a purificar la fracción soluble mediante

columna de afinidad de la forma descrita anteriormente, obteniéndose las fracciones

correspondientes, las cuales se analizaron mediante una tinción de plata,

comprobándose la ausencia de cualquier otra proteína (Figura 13). Así, se observó el

reconocimiento y la presencia de una proteína de 16 kDa correspondiente a la proteína

HspX con etiquetas de His6, y además detectada con un anticuerpo monoclonal

específico anti-HspX (Figura 14).

(A) (B)

Fig. 13.12. Purificación de la proteína HspX en vector de expresión pET101-D/TOPO.

(A) Gel teñido por Comassie de la proteína HspX expresada en E. coli BL21 inducida

con IPTG 1 mM. Fracción soluble de un cultivo de la cepa recombinante sin inducir (1);

fracción soluble de un cultivo lisado de la cepa recombinante a 2 hr de inducción con

IPTG (2), a 4 hr, (3) a 6 hr (4) de inducción. (5) marcadores de peso molecular (kDa).

(B) Western blot con anti-His6 de la proteína HspX expresada en E. coli BL21 inducida

con IPTG 1 mM. Marcadores de peso molecular (kDa) (1), fracción soluble de un

cultivo lisado de la cepa recombinante sin inducir (2), fracción soluble a 2 hr (3) , a 4 hr

(4), y a 6 hr (5) de inducción.

20

25

50

250

15


45

Fig. 13.13. Gel teñido con plata de fracciones purificadas de la proteína HspX por

columna de afinidad. L) lisado total de E. coli, 1) fracción de elución 1, 2) fracción de

elución 2, 3) fracción de elución 3, 4) fracción de elución 4, M) marcadores de peso

molecular kDa.

Fig. 13.14. (A) Western blot con anticuerpo monoclonal anti-HspX. Carriles: 1) eluido

4, 2) eluido 3, 3) eluido 2, 4) eluido 1, M) marcador de peso molecular (kDa) y 5) lisado

total. (B) Western blot con anticuerpo anti-His.. Carriles: 1) lisado total, M) marcador

de peso molecular (kDa), 2) elución 1, 3) elución 2, 4) elución 3, y 5) elución 4.

250

37

20

a) b)

L M 1 2 3 4

10

15

20

25 37

HspX


46

13.9. Clonación y expresión de la proteína Mb1762c en vector de expresión pET101/D-

TOPO

Como ya se mencionó , después de la clonación y transformación a la cepa BL21, para

comprobar si realmente las colonias adquirieron el vector con el inserto del gen de

interés, se realizó una PCR con las clonas seleccionadas en las cuales se observó la

amplificación del fragmento completo del gen Mb1762c (Figura 15) .

Fig. 13.15. PCR de clonas obtenidas pET101/D-TOPO+Mb1762c. Carriles: 1)

Marcador de peso molecular de 250 pb, 2) amplificado de Mb1762c de la clona 1, 3)

amplificado de Mb1762c de la clona 2.

Para la expresión del la proteína recombinante se llevó a cabo una inducción piloto en

un matraz de 20 mL de caldo LB, después de lisar el paquete celular, se realizó el

análisis de la proteína; primeramente se analizó la parte soluble de la proteína inducida,

obteniendo resultados no satisfactorios ya que la proteína no se alcanzó a percibir por

tinción en geles de poliacrilamida, ni por Western blot con anticuerpo anti-His6 (dato

no mostrado).

Por otro lado, al analizar la fracción insoluble del lisado celular agregando hidrocloruro

de guanidina 6 M al buffer de lisis, para solubilizar la proteína en caso de que estuviera

en cuerpos de inclusión. Aún así tampoco observamos la presencia de la proteína (dato

no mostrado).

M 1 2

1000

500

250


47

Debido a que en diversos intentos, variando las condiciones de la inducción de la

expresión, no encontramos la proteína del tamaño esperado, como último paso se

mandó a secuenciar el plásmido pET101-Mb1762c; y lo que se encontró, después de

conocer la secuencia y aplicar un análisis BLAST y comparación con la base de datos

GeneBank (NCBI), es que el gen clonado fue el de la proteína PhdA (subunidad A de la

piruvato deshidrogenasa de M. bovis) (dato no mostrado).

13.10 Evaluación de la antigenicidad de las proteínas recombinantes en sangre de

bovino

Como ya se describió, la evaluación de la antigenicidad de las proteínas recombinantes

obtenidas, se llevo a cabo utilizando para tal fin el kit de diagnóstico BOVIGAM

(Prionics). Las muestras de sangre de bovinos de hatos con diferentes prevalencias, se

estimularon con PPD-B, PDD-A y con una solución fisiológica (PBS) de tal manera

que se usaron como estándares para comparar la estimulación de la producción de IFN-γ

por las proteínas recombinantes en la sangre. .

Actualmente de acuerdo a la prueba comercial Bovigam® para considerar un animal

positivo a tuberculosis, la relación de la densidad óptica (DO) a 450 nm, producto de la

estimulación del IFN-γ por el PPD-B, menos la DO de aquella obtenida por la adición

de PBS, debe ser mayor o igual a 0.1, y además, la relación entre la DO producto de la

estimulación del IFN-γ por el PPD-B, menos la DO provocada por la estimulación el

PPD-A, igualmente debe ser mayor o igual a 0.1.

Así, de acuerdo a los criterios antes mencionados, para la clasificación de bovinos

infectados y bovinos no infectados con tuberculosis bovina, además nosotros evaluamos

mediante curvas ROC el potencial de diagnóstico, calculando la sensibilidad y la DO de

corte, tanto para el antígeno PPD-B del Bovigam®, como para los antígenos

recombinantes PfkB, HspX y ESAT6/CFP10 solos y en mezcla.Por separado en cada

muestra de sangre, se estimuló con 4 µg/ml de proteínas recombinantes PfkB, HspX,

ESAT-6/CFP10, así como también por la mezcla compuesta por 2 µg/ml de PfkB, 2

µg/ml de HspX y 10 µg/ml de PPD-B.


48

De acuerdo a la curva ROC, la mejor sensibilidad para el PPD-B fue del 84.6% a una

especificidad fija del 85% (Figura 16). Asimismo, cuando las proteínas PfkB, HspX y

ESAT6/CFP10 son usadas de manera individual para discriminar entre bovinos

infectados y no infectados a tuberculosis, se obtiene una baja sensibilidad del 23.1%,

53.9% y 25%, respectivamente, a la especificidad fija de 85%. A esa especificidad, la

mezcla PPD-B+PfkB+HspX muestra tener la mayor sensibilidad 99% (Tabla 2), con

una área mayor bajo la curva (Figura 16).

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

1 - Especificidad

Sensibilidad

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Bovigam, A = 0.93

PFKB, A = 0.71

HSPX, A = 0.72

ESAT6, A = 0.52

Mezcla 1, A = 0.93

Gráfica 13.1. Curva ROC. Determinación y comparación de la sensibilidad de la

mezcla de proteínas que contiene PPD-B, HspX y PfkB contra las proteínas HspX,

PfkB, CFP10/ESAT6 y el PPD-B proveniente del kit comercial Bovigam®. Mezcla

(conformada por PPD-B, HspX y PfkB); PPD-B; PfkB; HspX;

ESAT6/CFP10.


49

Tabla 13.3. Sensibilidad de los antígenos y valores de corte requeridos.

Antígeno ______________________Especificidad (%)a__________________

_____________________________80 85 90 93__________

PPDB 84.6 (0.17) 84.6 (0.21) 69.2 (0.24) 53.9 (0.29)

PfkB 69.2 (0.18) 23.1 (0.31) 15.4 (0.36) 7.7 (0.38)

HspX 69.2 (0.19) 53.9 (0.22) 46.2 (0.25) 46.2 (0.26)

ESAT-6/CFP10 25.0 (0.34) 25.0 (0.35) 15.3 (0.52) 15.3 (0.52)

PPDB+PfkB+HspX 99.0 (0.23) 99.0 (0.25) 76.9 (0.29) 76.9 (0.34)

aSensibilidad de los antígenos expresada en % con los valores de corte requeridos

entre paréntesis (DO 450 nm), usando los datos obtenidos de los animales

sensibilizados en campo (n=68).

Así, cuando se utiliza la mezcla de proteínas conformada por PPD-B+HspX+PfkB, a la

especificidad de 85% y un punto de corte de 0.25, se obtiene una diferencia de 14.4% de

incremento en la sensibilidad (99%), con respecto a la sensibilidad obtenida por el PPD-

B (84.6%) usado de manera individual para estimular la sangre, lo cual indica que con

esta mezcla de antígenos hay una mayor probabilidad de encontrar a los animales

infectados realmente por M. bovis detectados como positivos (Figura 17).

Gráfica 13.2. Comparación estadística de animales infectados (A) de no infectados (B)

con la estimulación del IFN-γ por el PPD-B proveniente del kit comercial Bovigam®,

así como los animales infectados (C) de no infectados (D) debido a la estimulación del

IFN-γ con la mezcla que contiene PPD-B, HspX y PfkB. Se empleó la prueba U de

Mann-Whitney. Los asteriscos indican diferencias significativa (* < 0.001 y **

<.000001).


50

Una vez determinado el punto de corte, se procedió a determinar si existieron

diferencias estadísticas significativas en los ensayos de liberación de IFN-γ estimulados

con el PPD-B y con la mezcla PPD-B+HspX+PfkB usando el punto de corte de 0.25

obtenido, empleando la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney. Los valores de p

<0.05 fueron considerados significativos. Los análisis estadísticos se realizaron con

SigmaStat® v8.0. Comparando los animales que dan positivos contra los que dan

negativos empleando la prueba de Bovigam®, se tiene una diferencia estadística

significativa con un valor de p < 0.001, sin embargo, como se puede notar, existe un

número de muestras que se traslapan entre los que deben ser positivos y los negativos

(Figura 17). Mientras que con la mezcla del PPD-B+HspX+PfkB, se tiene una

significancia estadística aún mayor con un valor de p <0.000001 dejando notar que

existe una mejor separación, y a su vez, ningún traslape entre los animales positivos y

los negativos con la nueva mezcla (Figura 17), lo cual también nos indica que hay

menor probabilidad de detectar animales falsos positivos usando la mezcla de PPD-

B+HspX+PfkB con el nuevo criterio de interpretación, que cuando se utiliza el único

componente antigénico (PPD-B) de la prueba comercial.

Una vez que se demostró que la adición de las proteínas HspX y PfkB al PPD-B

incrementan un 14.4% la sensibilidad del kit comercial Bovigam®, se procedió a

validar la prueba con muestras de 91 bovinos, comparando la mezcla de antígenos

(PPD-B+HspX+PfkB) con respecto al criterio del kit Bovigam®. Con el kit Bovigam®

se detectaron sólo 18 infectados, mientras que con la mezcla conformada por PPD-

B+HspX+PfkB y el nuevo criterio de interpretación a un punto de corte de D.O. de

0.25, se logran detectar 32 infectados (Figura 18); cabe mencionar que dentro de estos

32 detectados, 18 son los mismos que se logran detectar con el criterio del kit

Bovigam®.


51

0

5

10

15

20

25

30

35

1 2

Animales

Gráfica 13.3. Detección de animales infectados con tuberculosis bovina empleando (1)

la prueba comercial del kit Bovigam®, y (2 ) la mezcla de proteínas conformada por

PPD-B, HspX y PfkB. Animales positivos con PPD-B (negro); animales adicionales

positivos con la mezcla de PPD-B con HspX y PfkB (gris).


52

14. DISCUSION

Para evaluar el potencial de las proteínas recombinantes como marcadores de

diagnóstico, se compararon las características antigénicas de las diferentes proteínas

recombinantes con el antígeno comercial usado para el diagnóstico de la TBb (PPD-B).

Se incluyeron todos los animales muestreados, los cuales todos mostraron un resultado

positivo a la prueba de la Tuberculina intradérmica simple o TST (de sus siglas en

inglés), pero que no forzosamente dieron una prueba positiva a la prueba

complementaria del IFN-γ en sangre (BOVIGAM).

Dado que estos no se distribuyen normalmente, a los resultados obtenidos

mediante la prueba in vitro del BOVIGAM para medir la estimulación de la secreción

de IFN-γ en todas las muestras, se les realizó un análisis estadístico mediante el uso de

una prueba no paramétrica Mann-Whitney, al comparar la liberación de IFN-γ obtenida

con los antígenos PfkB, HspX, ESAT-6/CFP10, solos y en mezcla de antígenos con

PPD-B, revelando que hubo una mayor liberación de IFN-γ cuando la mezcla

conformada por PfkB, HspX y PPD-B se utilizó para estimular, que aquella dada solo

por el PPD-B.

La medición del IFN-γ producido por las proteínas recombinantes en el plasma,

muestran que la mezcla de proteínas dan mayor respuesta que el PPD-B. Nuestros

hallazgos concuerdan con lo reportado por otros al trabajar con proteínas puras, donde

hay mayor probabilidad de incrementar la antigenicidad frente al PPD-B (Whelan y

col. 2010).

Para calcular los valores de la nueva sensibilidad y especificidad de la prueba

optimizada con la mezca de antígenos recombinantes y PPD-B, se realizó una curva

ROC con los todos los datos obtenidos de la medición del IFN-γ con las distintas

opciones antigénicas evaluadas a una misma D.O. de 450 nm, donde se observa que en

comparación a todos los antígenos probados, la mezcla optimizada da un área bajo la

curva mayor. Dicha área bajo la curva puede interpretarse como la probabilidad de que

la nueva mezcla de PfkB, HspX y PPD-B al probarse con la sangre de cualquier animal

de un resultado mayor o parecido al PPD-B, aumentando su sensibilidad. Cuando las

D.O. de todos las muestras de sangre de bovinos fueron aplicadas al análisis ROC, se


53

observa que la mezcla de antíganos tuvo un área bajo la curva de 0.9259 (95% intervalo

de confianza (IC), Dando un valor muy parecido al PPD-B que mostró un valor de

0.9273, estimando una sensibilidad de 99% y una especificidad de 85% para la mezcla

y para el PPD-B se estimo una sensibilidad de 92% a una especificidad de 84.6%.

A su vez, de acuerdo a la curva ROC para la mezcla compuesta de PPD-B+HspX+PfkB,

se determinó un punto de corte de 0.25 de D.O. para obtener la sensibilidad del 99%, lo

cual no se contrapone a los principios de la prueba, ya que se menciona que la prueba

tiene la flexibilidad para establecer los criterios de interpretación y puntos de corte

necesarios para obtener un resultado positivo más apropiado para una situación

endémica de tuberculosis bovina específica (Vordermeier y col. 2008, Aranaz y col,

2006); además, también se menciona que la prueba es susceptible de ser enriquecida

con la adición de antígenos que sean más específicos para M. bovis, para lo cual se

tienen que modificar los criterios de interpretación basados en los puntos de corte

obtenidos a la mejor sensibilidad establecida (Aagaard y col. 2006, Cockle 2006).

En un trabajo muy reciente realizado por Casal y col. (2012), encontraron que al evaluar

a las proteínas ESAT-6, CFP10 y Rv3615c, en forma de péptidos o de proteínas

recombinantes, no hubo un aumento en la sensibilidad al probarlos tanto de una forma

intradérmica como de una forma in vitro, con sensibilidades entre el 52.2% para el

coctel peptídico y 47.8% para el coctel de proteínas. Lo cual demuestra que es necesario

seguir analizando más proteínas específicas para elevar la sensibilidad de las pruebas

usando antígenos específicos. En otro trabajo en regiones con bajas prevalencias de la

infección, se observó que un 60% de los animales positivos a las pruebas de la

tuberculina e IFN-γ, no respondieron a los antígenos específicos ESAT-6 y CFP10, sin

embargo, en regiones con altas prevalencias hasta un 85% de los animales positivos

fueron confirmados utilizando estos dos antígenos en la prueba (Aagaard y col. 2010),

lo cual demuestra la necesidad de seguir buscando nuevos antígenos que puedan

aumentar la sensibilidad de la prueba en sangre en hatos ganaderos independientemente

del estatus de la infección en la región.

En los últimos años ha habido un significativo progreso en la identificación de algunas

proteínas antigénicas de M. bovis, en un intento por identificar aquellas que sean más

específicas que las presentes en el PPD (Aagaard y col. 2003). La utilización de algunas


54

proteínas recombinantes en la prueba del IFN-γ como ESAT-6, CFP10 y MPB70, ha

permitido sugerir sustituir al PPD-B en las pruebas intradérmica y del INF-γ (Whelan y

col. 2010).

La prueba actual para el diagnóstico de la TBb en sangre (BOVIGAM) está basada en la

sensibilización de los linfocitos usando una mezcla compleja de antígenos, el PPD-B y

PPD-A, para la identificación de los animales infectados, por lo que algunos reportes

indican la identificación de falsos positivos producto de coinfecciones con

micobacterias ambientales que cruzan antigénicamente con el PPD (Aranaz y col.

2006), con una sensibilidad que varía entre el 69 y el 99%, con una media de 88%; por

tales motivos se ha tratado de utilizar la prueba usando los antígenos más específicos

como ESAT-6 y CFP10 (Aagaard y col. 2006), lo cual todavía no ha demostrado ser

una estrategia totalmente eficaz para el diagnóstico de M. bovis en bovinos.

Nuestros datos sugieren fuertemente que los antígenos PfkB y HspX, podrían ser

buenos candidatos para utilizarlos en pruebas basadas en la medición de IFN-γ ya sea en

mezcla con el PPD-B o con otros antígenos específicos como ESAT6/CFP10. Koo y

col. (2005) obtuvieron una sensibilidad de 98% y una especificidad de 96% utilizando

ESAT-6 y MPB70. Por otro lado, un coctel peptídico con las proteínas Rv3873,

Rv3879c, Rv0288 y Rv3019c demostró tener una mayor sensibilidad en la respuesta

celular que la dada por ESAT-6/CFP10 o PPD, destacando así su ventaja en la

identificación correcta de animales infectados (Cockle y col 2006). Nuestros datos

concuerdan con estas observaciones, en donde nuestras proteínas antigénicas

demuestran proporcionar una mayor sensibilidad que ESAT-6/CFP10.

En nuestro trabajo se estudiaron los antígenos recombinantes PfkB y HspX, los cuales

lograron detectar un mayor número de animales positivos a la prueba del IFN-γ, sin

embargo es necesario seguir en la búsqueda de nuevas mezclas de antígenos que sirvan

para enriquecer la sensibilidad y especificidad.

Con nuestros datos se sugiere incrementar el punto de corte de la prueba a una

absorbancia de 0.25 mediante el uso de la mezcla de proteínas recombinantes, a fin de

detectar con mayor sensibilidad los casos de animales verdaderamente infectados por

M. bovis, sin embargo, se necesita seguir evaluando si en distintas zonas afectadas por


55

la infección animal con diversas prevalencias si nuestros valores diagnósticos, nuestras

consideraciones son extrapolables a las distintas situaciones.

15. CONCLUSIONES

1. Las proteínas PfkB y HspX fueron correctamente producidas en E. coli mediante el uso

de dos vectores de expresión distintos.

2. La antigenicidad de las proteínas recombinantes fue mayor al utilizarse en mezcla con el

antígeno PPD-B que al utilizarse por separado.

3. Se logró detectar un aumento de 14.4% en la sensibilidad en la prueba comercial

mediante el uso de los antígenos recombinantes.

4. La mezcla de proteínas recombinantes PfkB y HspX con PPD-B demostró un valor

mayor de sensibilidad que el obtenido por los antígenos ESAT-6/CFP10.

5. Mediante el uso de la mezcla de proteínas recombinantes PfkB y HspX con PPD-B se

logra detectar un mayor número de animales positivos a la prueba del IFN-γ.

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