F. Fischl Universitätsfrauenklinik Mainz/Wien Universitäts-Kinderwunschzentrum Johannes Gutenberg Universität Mainz

F. FischlF. Fischl

Universitätsfrauenklinik Mainz/WienUniversitäts-Kinderwunschzentrum

Johannes Gutenberg Universität Mainz

26.04.23 FIS Repromed - Gran Canaria 08 2

Image der Reproduktionsmedizin ist nach außen eher schlecht

Ängste - VorbehalteAngst vor Missbrauch„Designerbaby“ zB. durch PID

unter Kollegen : ebenfalls schlechtes ImageReske 2003

Embryonenschutzgesetzdroht mit Gefängnis und hohen Geldstrafen!

„Patienten sehen dies anders“ Seeler, 2003

A R T – Artificial Reproductive Techniques Moderne Stimulationstherapien – long, short, ultra-short (rFSH/rLH -GnRH- Agonisten/Antagonisten etc.)

AIH (artificial insem. homologous)

IUI - intauterine insemination

AID (artificial insem. donor)

IVF – In vitro FertilisationICSI – Intacytoplasmatic Sperm TransferMESA - Mikrochirurgische epidymale Spermatozonaspiration

TESE – Testikuläre Spermien Extraction aus Hoden

IMSI - Intrazytoplasmatische Morphologisch Selektierte Spermien Injektion

PICSI - Methode zur Selektion reifer Spermien in Picsi-Schale

TUNEL -Terminale Desoxyribosyl-Transferase (TdT) mediated dUTP nick end labeling

Assisted Hatching - Schlüpfhilfe

ET „klassischer Embryotransfer“ - Tag 2 - 3

Blastocystentransfer - Tag 4 - 5

Kryoverfahren – „slow cooling“ versus Vitrifikation

Präimplantationsdiagnostik –Polkörperdiagnostik (PKD)

Präimplantationsdiagnostik (PID)

A R T – Artificial Reproductive Techniques


Stimulationsbehandlung

Kontrollierte ovarielle Stimulation

Zielsetzung:

Heranreifen eines od. mehrerer Follikel aus Follikelkohorte

Bei IVF / ICSI: – Vermeidung der spontanen Ovulation – Gewinnung mehrerer reifer Eizellen (Metaphase II)

Bei IUI + VZO*: – Heranreifen von 1 – max. 3 Eizellen

* Verkehr zum Optimum* Verkehr zum ovul. Optimum


Long-Agonisten Schema mit rFSH

GnRH – Agonist Depot Tag 19-21 des Vorzyklus

Menstruation

150 – 300 IE rFSHab Tag 3

vag.Sono ev.E2,

Follikel > 18mmE2> 350pro Follikel

10000 IE HCG

Transvaginale Punktion

EmbryotranferZwei – bis 8zeller

Progesteron Vag.

Nach 2-3 Wochen Kontrolle der „down regulation“


Short Antagonistenschema mit Mehrfachgabe

GnRH-Antagonist0,25 mg

rFSH 1

Stimulationstag

e

2 3 4 5

Tranvaginale Punktion

Embryotransfer 2-8 Zellstadum

5-1000 IE hCG

Progesteron Vag.

Vag. Sono ev. E2

7 8 9

Spermienfaktoren, die negativen Einfluss auf die embryonale Entwicklung haben, sind v.a. durch eine verminderte Spermienreife bedingt. Hierzu zählen u. a. DNA-Fragmentationen. Alle bisher zur Verfügung stehenden Diagnosemittel waren invasiv, wodurch eine Weiterverwendung der Spermien nicht möglich war. Die IMSI erlaubt ein Screening der Spermien bei sehr hoher Vergrößerung mit einem speziellen Invertmikroskop mit Videokamera und Computer (6000x – 10 000x) ohne Färbung in Echtzeit. Dadurch kann ein Spermium bezüglich seiner morphologischen Integrität seines Nukleus analysiert werden.

Zahlreiche Publikationen haben gezeigt, dass eine Prä-Selektion des Spermaozoons für eine erfolgreiche ICSI essentiell ist. ICSI mit Spermien, die mittels hoher Vergrößerung ausgewählt wurden, ergaben eine höhere Schwangerschaftsrate, speziell in Fällen wo das Ausmaß an DNA-Fragmentationen im Spermium besonders hoch war.

IMSI Intrazytoplasmische Morphologisch Selektierte Spermien Injektion

400x

ICSI IMSI

Bartoov etablierte ein System für eine Selektion bei hoher Vergrößerung, ungefärbte, Echtzeit hochauflösende Untersuchung der Organellen von motilen SpermienBartoov et al., NEJM 2001Bartoov et al., J. Androl. 2002 Bartoov et al., Fertil. Steril. 2003ErgebnisseICSI mit abnormalen Spermatozoen: Reduktion der SS-Rate:

20,2% versus 36,7%Reduktion der Implantationsrate: 9,6% versus 18,7%Prä-Selektion der Spermien ist essentiell für eine erfolgreiche ICSI(De Vos et al., Hum. Reprod. 2003)

X 400

IMSI


Nicht invasive Darstellung der Spindel mittels computerassistierter Polarisationsmikroskopie - Darstellung der 3 Schichten der Zona pellucidaMetaphase II – Eizellen

Spindel(view)analyse

Winkel zwischen erstem Polkörperchen(bei 12:00 Uhr) und meiotischer Spindel (ca. 30° abweichend) bei einermenschlichen Eizelle

Kombination von Spindelanalyse & IMSIDie Kombination könnte zur weiteren Steigerung der

Schwangerschaftsraten bei ICSI führen mit Senkung der Abortus-Raten – entsprechende randomisierte multi-center Studien müssen das jedoch noch beweisen

PICSI

Eine Methode zur Selektion reifer Spermien im Rahmen der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI). Die Picsi-Schale ermöglicht in nicht invasiver Form die Auswahl von genetisch integeren, d.h. reifen Spermien durch Hyaluronsäure Spots.

Die Köpfe reifer Spermien tragen eine spezifischen Rezeptor für Hyaluronsäure (Hyaluronan). Hyaluronan ist eine wesentliche Komponente der Hülle, welche die Eizelle umgibt. Unreife Spermien verfügen nicht über diesen Rezeptor

Durch den sogenannten Hyaluronan-Bindungstest werden Spermien aufgrund von bestimmten Membran-Bindungseigenschaften selektiert. Alle bindenden Spermien sind reif und zeigen keine DNA-Degradierung auf. Diese gebundenen Spermien können für die ICSI verwendet werden.


TUNEL - Test

DNA Fragmentierung von Spermatozoen als prognostischer Faktor - Analyse z.B. mittels

SCNA - Chromatine Structure Assay COMET Assay und TUNEL Assay – dieser Assay misst DNA-Brüche direkt. Eine terminale Transferase hängt modifizierte Nukleotide an die 3`OH -Enden der Bruchstelle. Diese Methode ist sowohl für Lichtmikroskope, wie auch Fluoreszenzmikroskope geeignet.

Durch erhöhte DNA-Fragmentierung von Spermatozoen wird die Schwangerschaftsrate bei etwa jedem Paar mehr als halbiert.


IMSI und PICSI, sowie der TUNEL-Test erlauben in bestimmten Fällen eine Verbesserung der Ergebnisse:

Bei fehlender Befruchtung nach ICSI, bei fehlgeschlagener Implantation, bei schwerer Teratozoospermie, bei erhöhter DNA-Fragmentation

und vielleicht auch bei idiopathischer Infertilität?

Es fehlen derzeit Daten aus Studien mit Evidenzklasse I und II

Embryonale Entwicklung - Hatching

Die Blastozyste schlüpft aus der teils aufgelösten Membrana pellucida. Man unterscheidet den Trophoblasten, der die äußere Zellmasse bildet und den Embryoblasten (innere Zellschicht mit Epi- und Hypoblasten) sowie die Blastozystenhöhle. Erst nach dem Schlüpfen aus der Zona pellucida kann der Embryo direkt mit dem Endometrium in Kontakt treten.

1 Zona pellucida2 Trophoblast (äussere Zellmasse)3 Hypoblast (Teil der inneren

Zellmasse)4 Blastozystenhöhle5 Epiblast (Teil der inneren

Zellmasse)

Blastocyste

„hatching“


Erfolgsfaktor Assisted Hatching

Seif MMW, Edi-Osagie ECO, Farquhar C, Hooper L, Blake D, McGinlay P. Assisted hatching on assisted conception (IVF & ICSI). Cochrane Database of Systematic Reviews 2006, Issue 1. Art. No.: CD001894. 23 Studien mit guter Qualität und 2889 Frauen mit 954 Schwangerschaften

Jelinkova L, Pavelkova J, Strehler E, Paulus W, Zivny J, Sterzik K. Improved implantation rate after chemical removal of the zona pellucida. Fertility and Sterility 2003;79 Suppl 6:1299-1303.

Klare Aussage! Definitiv wird die Schwangerschaftsrate erhöht bei Frauen... mit mehreren Misserfolgen bei IVF/ICSImit reduzierter PrognoseOR 1,33 (95% CI 1,12 bis 1,57)Beispiel: von 25% auf 28% bis 39%Auch die Mehrlingsrate steigt.

„Hatchende“ Blastocyste


Präimplantationsdiagnostik

PreimplantationGenetic Testing

(PGT)

Preimplantation Genetic Diagnosis

(PGD)

Preimplantation Genetic Screening

(PGS)

Polkörperdiagnostik (PKD)

Entfernung eines/mehrerer Nuclei von Oozyten (Polkörperchen) oder Embryonen (Blastomere/Trophektoderm)

Untersuchung einer mütterlichen genetischen oder chromosomalen Veränderung des haploiden weibl. Chromosomensatzes durch die Untersuchung es ersten und zweiten Polkörper im Ablauf einer IVF/ICSI – indirekte Diagnostik einer EizelleTestung auf

Mutationen von GensequenzenAneuploidie

Polkörperdiagnostik (PKD)Gilt als ein in Erprobung befindliches Verfahren

Indikationen:

Erkennung eines spezifischen genetischen, einschließlich chromosomalen kindlichen Risikos mittels indirekter Diagnostik der Eizelle

Erkennung unspezifischer chromosomaler Risiken im Rahmen von IVF zur möglichen Erhöhung der Geburtenrate – bisher in der Literatur sehr kontroversiell beurteilt, nach letzten Studien Vorteil eher nicht gegeben

Polkörperdiagnostik (PKD) Die PKD ist an die Anwendung an eine IVF/ICSI Behandlung geknüpft, auch wenn keine Fertilitätsstörung vorliegt Nachdem diese Untersuchung vor Bildung eines Embryos durchgeführt wird, ist das Embryonenschutzgesetz davon nicht berührt Nur Veränderungen ♀ können damit festgestellt werden Die Untersuchung am 2. Polkörperchen gelingt nicht mmer FISH X/Y, 13, 16, 18, 21, 22FISH X/Y, 13, 16, 18, 21, 22


PGD bei fortgeschrittenem mütterlichen AlterDie Wirksamkeit der Präimplantationsdiagnostik (PGD) bei Frauen mit "fortgeschrittenem Alter" wurde vorausgesetzt, ohne in RCTs überprüft zu sein. Die neue große Multizenterstudie findet nun keinen Vorteil der PGD, sondern ganz im Gegenteil, signifikant weniger Schwangerschaften (ongoing) und Lebendgeburten als bei Verzicht auf die Diagnostik.Mastenbroek S, Twisk M, van Echten-Arends J, et al.In vitro fertilization with preimplantation genetic screening. N Engl J Med 2007;357:9-17

Was bringt PGD wirklich?


Durchführung eines Blastozystentransfers (BcT) abhängig von Alter der Frau Anzahl der Oocyten Qualität der Oocyten Qualität der kommerziell erhältlichen

Medien nicht bei poor Respondern

(keineVerbesserung der Ergebnisse)


Vorteile der Blastozystenkultur

Gewinnung der besten lebensfähigen Embryonen nach Überwindung der Entwicklungsblockade in den in vitro Kulturen zwischen Tag 2-3 (4-8 Zellstadium)

Bessere physiologische Bedingungen und Synchronisation zwischen Endometrium und Embryo-Entwicklungsstadium

Im 2-4 Zellstadium ist die Zona pellucida durch die Kulturbedingungen in vitro so verhärtet, dass es nur schwer zum Hatchen kommt

Völlige Entfernung der Zona pellucida mit enzymatischen Methoden und Transfer von zona pellucida freien

Blastozysten für eine bessere Implantation (Eine Möglichkeit in der Zukunft?)

„slow cooling“ – langsames Einfrieren mittels computergesteuerten Freezingapparaten (z.B. – 0,30C/min., bei niedrigen Kryoprotektiva ~10%)

Vitrifikation – ultraschnelles Abkühlen > -10.000oC/min wobei die Zellen direkt in einen amorphen Zustand (Verglasung) übergehen (Martino et al., 1996) Anwendung im medizinischen Bereich

Reproduktionsmedizin Fertilitätsprophylaxe Stammzellforschung

Methoden der Kryokonservierung

Methode der aseptischen Vitrifikation

Isachenko V, Montag M et al., Human Reproduction, 2005

Relativ langsames Abkühlen (-600oC/min)

Ultraschnelles Erwärmen (6.000oC/min)

Parallel Entfernung der Kryoprotektoren

Kein Risiko einer Kontamination

ZusammenfassungVitrifikation ist die Methode für Germinal Vesikel Eizellen Metaphase-II-Eizellen (Eizellspende) Blastozysten Ovargewebe ?Kommerzielle Medien verfügbar – Asept. Vitrifikation ist möglich

Andrologie: Kryokonservierung ist fester Bestandteil zur FertilitätserhaltungGynäkologie: Kryokonservierung erhöht die kumulative Schwangerschaftsrate bei IVF/ICSI Kryokonservierung nach in-vitro Maturation ist derzeit eher umstritten (ethisch/biologisch)Onkologie: Kryokonservierung primär zur Autotransplantation und Hormonsubstitution, sekundär zur Fertilitätserhaltung

Eizell- Embryo- und Samenbanken Selektion durch Präimplantationstechniken? Ovarian tissue banking (OTB) In vitro maturation (IVM) Autologe Ovartransplantation nach Kryopreservation Schwangerschaften in den Wechseljahren mit Hilfe kryokonservierter Eizellen (aktuell durch starken Anstieg der Lebenserwartung!)

Zukunftsaspekte in der ART

Zukunftsaspekt - Ovarian Tissue Banking

Grosse Anzahl an Primordialfollikeln im Gewebe vorhanden höhere Erfolgschancen?

Keine Stimulation, dafür aber LSK notwendig

Kurzfristig durchführbar (Op. Freigabe)

Natürliche Empfängnis denkbar

Als autologe Hormonersatztherapie denkbar ______________________________________________________

Ovarielle Gewebeentnahme Bestrahlung/Chemotherapie/OP Retransplantation des ovariellen Gewebes

Primäres Kriterium: Erhaltung der Fertilität

- Altersgrenze: ca. 35 - 37a- FSH < 10 - LSK möglich - Keine anamnestische Bestrahlung- Frühes Stadium der Chemotherapie

Ganzes Ovar oder Teilovarektomie?

Ovarektomie: Lokale oder Ganzkörperbestrahlung

Tangentiale Resektion: Chemotherapie ohne Bestrahlung

Ovarian Tissue Banking - Einschlusskriterien


In-vitro-Maturation (IVM)Gewinnung von OvargewebeIsolierung von unreifen Oozyten (Primordialfollikel, Primärfollikel) künstliche Reifung (FSH / HCG) IVF/ICSI-TherapieIn-Vitro-Maturation bisher nur im Mausmodell gelungen (Smitz et al., Hum Reprod, 1999)

Erfolgsfaktor IVM?

IVM ist die in vitro Reifung der Oocyten vom GV-Stadium zum Metaphase II Stadium

IVM-Methodik: Aspiration unreifer Oocyten in nicht oder niedrig dosiert stimulierten Zyklen

In vitro Maturation (IVM) ist bisher wenig untersucht in RCTs. Keine valide Aussage aus prospektiv kontrollierten Vergleichstudien zum Erfolg gegen „normale IVF“ möglich. Priming mit FSH/hMG oder unstimuliert punktieren? Mit oder ohne hCG Gabe?Diese Fragen sind nicht zuverlässig beantwortet.

Hesham Al-Inany. Female infertility. Clinical Evidence 2005

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=15949216&query_hl=8&itool=pubmed_docsum

„Future Perspectives“

Prophylaktische bilaterale Ovarektomie bei Risikopatientinnen (z.B. BRCA 1 & 2) aber auch OTB bei erst späteren Kinderwunsch ohne Erkrankung

Vorsorgliche Einlagerung zur späteren biologischen HRT ev. anti aging bzw. „better aging“ Therapie

dadurch Erhaltung der Fertilität bei möglichenspätem Kinderwunsch

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