Farmacologia Generale e Molecolare

Oscar Mapelli

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1.0 Farmacocinetica I processi che determinano le fasi della farmacocinetica sono tutti legati alla capacità di un farmaco di attraversare le membrane cellulari, le modalità principali per l’attraversamento di tali membrane sono:

Diffusione passiva → è il processo di attraversamento di un farmaco legato al suo coefficiente di ripartizione infatti per diffondere attraverso una cellula il farmaco deve avere un grado di idrofilia tale da tenerlo in soluzione in liquidi acquosi etra ed intra-cellulari ed allo stesso tempo un grado di lipofilia sufficiente per consentirne la diffusione attraverso gli ambienti lipidici come le matrici delle membrane cellulari. Il CR è pertanto il rapporto tra le concentrazioni in fase oleosa ed acquosa, si avvicina a 0 per un composto molto idrofilo. Il CR dipende dal pH dell’ambiente in quanto la quota ionizzata ha CR vicino a 0 e solo la quota non ionizzata potrà penetrare nella fase lipidica, suddetta quota è data dalla differenza di pKa del farmaco e pH della soluzione.

La diffusione tra due compartimenti è mediata inoltre dalla legge di Fick:

Il flusso molare è la velocità di passaggio del soluto da un compartimento 1 a 2. In questa formula c1 e c2 sono le concentrazioni di farmaco nel compartimento, D è il coefficiente di diffusione, A è l’area della membrana, d è lo spessore; da questa legge si deduce che: o Il flusso è maggiore quando la differenza di concentrazione è maggiore o Il flusso è direttamente proporzionale all’estensione della membrana o Il passaggio è più efficiente quanto più sarà lo strato da attraversare

Endocitosi mediata da recettore → molti recettori tendono, quando hanno effettuato il legame, ad aggregarsi ed costituire una struttura sottomemebranaria (coat o mantello) costituita da polimerizzazione della proteina clatrina e la formazione così di una vescicola endocitotica. Successivamente queste vescicole perdono il mantello e si fondono a formare strutture vescicolari più complesse (endosomi) e successivamente possono seguire destini differenti. È possibile che il recettore venga riciclato e riportato in superficie, è possibili altresì che il recettore torni in superficie con il ligando oppure recettore e ligando possono essere entrambe degradati.

Trasporto attivo contro gradiente elettrochimico → è mediato da pompe e trasportatori di membrana, è un processo saturabile in quanto il trasporto massimo è dato dalla densità del trasportatore e dal turnover di questi ultimi.

L’endotelio capillare è una barriera molto piccola caratterizzata da uno spessore limitato, è inoltre ricca di attività di endo ed eso-citosi, l’elevata irrorazione rende quindi disponibile un’ampia superficie di scambio. È determinante in questo caso la dimensione del farmaco, infatti saranno agevolati a questo livello farmaci con basso peso molecolare che farà si che anche piccole molecole ionizzate possano passare attraverso i pori dell’endotelio. Questi pori rappresentano una frazione limitata della superficie dell’endotelio, il loro diametro è valutato intorno ai 10nm pertanto saranno un filtro per quelle molecole con peso molecolare superiore a 60kDa. La permeabilità è differente nei vari distretti dell’epitelio capillare:

La BEE limita l’accesso dei farmaci idrofili al SNC, per giungere li infatti i farmaci possono usufruire di due percorsi: attraverso il sangue o attraverso il liquido cefalo-rachidiano ed in entrambe i casi le barriere sono notevoli, caratterizzate da bassissimi livelli di eso- endo-citosi, assenza di pori di diametro idoneo, presenza di un rivestimento quasi continuo di cellule gliali.

Figura 1: Endocitosi mediata da recettore

Barriera ematoencefalica

Mucose, ghiandole, parenchima renale

Muscoli lisci, striati, glomeruli renali

Milza, midollo rosso

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A causa di ciò la composizione del liquido intersiziale denota una marcata assenza di proteine plasmatiche. Solo farmaci con un elevato CR sono in grado di penetrare efficientemente, questi PA penetrano con grande rapidità e tendono ad accumularsi nel tessuto dell’SNC soprattutto nella materia bianca. I farmaci idrofili non sono in grado di penetrarvi. Pertanto si può concludere che la parmeabilità della BEE dipende da tre fattori: 1. Legame alle proteine plasmatiche: passa solo la quota libera 2. Grado di ionizzazione: la quota ionizzata è esclusa dal SNC 3. Coefficiente di ripartizione La barriera placentare è meno efficace di quella ematoencefalica, manca la totale impermeabilità a farmaci idrofili, la lenta circolazione del sangue materno fa si che le molecole di farmaco abbiano più tempo per penetrare pertanto il passaggio di farmaci idrofili al feto sarà trascurabile solo proporzionalmente alle dimensioni delle molecole. Queste considerazioni portano all’evidenza che eventuali farmaci possono essere poi presenti in concentrazione significativa anche nel latte materno.

1.1 Assorbimento dei farmaci L’assorbimento di un farmaco varia in base alla via di somministrazione: o Via orale → L’assorbimento avviene soprattutto a carico del piccolo intestino che è l’area con maggiore estensione assorbente e con flusso ematico relativamente alto, inoltre tale mucosa è permeabile a molecole di piccole dimensioni anche se dotate di CR basso. Nello stomaco l’assorbimento è scarso in quanto la mucosa gastrica è poco estesa e scarsamente permeabile a molecole poco lipofile, è dunque considerato un organo di deposito la cui velocità di svuotamento influisce sull’assorbimento dei farmaci. La biodisponibilità dei farmaci per via orale può essere inoltre influenzata da modificazioni chimiche dovute all’effetto di primo passaggio. o Via intravascolare → somministrando il farmaco attraverso questa via si ha un maggiore controllo della somministrazione, la massima biodisponibilità del farmaco e la

rapidità di risposta. A parte quest’ultima via di somministrazione, in tutte le altre il farmaco deve diffondere dal compartimento in cui si trova al sangue. La via di somministrazione orale e quella endovenosa presentano una cinetica di assorbimento di I ordine, ossia la quantità di farmaco assorbita per unità di tempo è una percentuale costante rispetto a quella ancora da assorbire. L’emivita è il parametro usato per definire il tempo in cui il 50% del farmaco è eliminato dall’organismo e dipende dalla cinetica. Quando viene somministrato un farmaco l’assorbimento è massimo e l’eliminazione è nulla e, man mano che quest’ultima aumenta, l’assorbimento diminuisce. Si può inoltre aggiungere che più lento è l’assorbimento, più basso e ritardato è il picco di concentrazione plasmatica. In ciascun momento la concentrazione di un farmaco dipende dalla differenza tra quantità assorbita e quantità eliminata, a

parità di via di somministrazione pertanto i livelli saranno dipendenti dalla quantità di farmaco somministrata. Se viene somministrata una dose doppia la quantità di farmaco sarà di conseguenza doppia, nelle cinetiche di primo ordine il rapporto assorbimento/eliminazione è proporzionale alla quantità stessa.

1.2 Distribuzione ed eliminazione dei farmaci Durante la fase di distribuzione si ha la caduta della concentrazione plasmatica del farmaco, in quanto il farmaco si deposita nei vari compartimenti dell’organismo. La fase 2 invece è l’eliminazione in cui la concentrazione plasmatica cala a causa del metabolismo. La distribuzione tuttavia presenta delle problematiche di equilibrio ma anche cinetiche, infatti il farmaco tende a raggiungere nei tessuti concentrazioni diverse avendo anch’essi una diversa avidità per il farmaco, a ciò si aggiunge che certi tessuti richiedono più tempo di altri prima di raggiungere l’equilibrio. Per comprendere la distribuzione è necessario conoscere i due fattori che la influenzano: o Volume di distribuzione apparente → In un individuo adulto circa il 60% del suo peso corporeo è costituito da

acqua, a sua volta l’acqua è suddivisa in tre compartimenti: acqua plasmatica (4%), liquido extracellulare (16%) e liquido intracellulare (40%), ciascuno di questi compartimenti è diviso inoltre in tessuti con caratteristiche differenti. Ogni compartimento, tessuto organo ha un suo volume di distribuzione, la cui somma contribuisce a

Figura 2: Cinetica di I ordine

Figura 3: assorbimento e vie di somministrazione

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formare il valore di volume di distribuzione complessivo. Il Vd è un rapporto tra quantità del farmaco nel corpo all’equilibrio e concentrazione plasmatica del farmaco:

Il Vd dell’organismo non è altro che la somma tra il volume apparente di distribuzione di tutti i compartimenti ed il volume plasmatico. Se il Vd di un farmaco è molto elevato significa che il farmaco tenderà ad accumularsi nei tessuti in quanto la concentrazione plasmatica sarà bassa. Il Vd di un farmaco è solitamente espresso in litri su Kg di peso corporeo pertanto si riduce la variabilità su individui con peso diverso.

o Legame alle proteine plasmatiche → La fase proteica funge da organo deposito pertanto la concentrazione plasmatica di farmaco ne sarà influenzata, bisogna così distinguere tra quota libera e quota legata in quanto sarà la prima ad entrare efficacemente nella cellula epatica per venire metabolizzata o filtrata, il legame con le proteine è definito dal rapporto tra la concentrazione di farmaco legato e quella di farmaco libero, rapporto che solitamente varia da 0 a 1. Se il rapporto è superiore a 0,9 il farmaco è fortemente legato. La proteina plasmatica che più influisce su questo legame è l’albumina che lega principalmente anioni organici oltre che molte altre molecole, un’altra è l’α1 glicoproteina acida, gli steroidi legano la trans cortina. Questo legame segue gli stessi principi del legame farmaco-recettore. È importante sottolineare che la frazione legata dipende dalla concentrazione del farmaco, per concentrazioni più alte una quantità minore sarà legata e viceversa. Anche farmaci o altre sostanze endogene possono spiazzare il farmaco dalle proteine plasmatiche andando così a modificare la quota libera, un esempio tipico è la warfarina, pazienti trattati con questo possono andare incontro a grafi fenomeni emorragici se trattati con sulfamidici, salicilati ecc.. il fenomeno dello spiazzamento può interessare anche sostanze endogene.

In linea di massima i processi che portano all’eliminazione seguono una cinetica di I ordine eccetto quelli per i quali l’eliminazione si basa su processi metabolici o di escrezione saturabili. Quando è di I ordine questa disegnerà una retta in un grafico in scala semilogaritmica, l’emivita è l’intervallo di tempo necessario al dimezzamento della concentrazione del farmaco, ogni farmaco possiede un suo valore di emivita che può variare significativamente. Alterazioni patologiche degli organi adibiti all’eliminazione prolungheranno l’emivita del farmaco. La clearance è il volume di sangue virtualmente ripulito nell’unità di tempo:

La sua unità di misura è volume x unità di tempo, siccome per ogni farmaco in ogni paziente ke è costante e il Vd ha un valore costante si deduce che la clearance ha un valore indipendente dalla concentrazione plasmatica, la clearance permette inoltre di stimare correttamente il volume apparente di distribuzione:

La clearance può essere vista anche sotto l’aspetto di Cl d’organo cioè in funzione dell’eliminazione prodotta da un organo specifico, la Cl totale sarà quindi la somma di tutte le Cl d’organo, nella maggior parte dei casi si parla di Clearance renale e non renale. Le tavole farmacocinetiche riportano solitamente la Cl totale dalla quale si può facilmente ricavare quella renale o epatica conoscendo la percentuale eliminata con le urine.

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1.3 Controllo della concentrazione plasmatica dei farmaci La concentrazione plasmatica raggiunge un valore di picco che è in funzione della dose e del Vd e poi decade in modo esponenziale, per ogni intervallo pari ad un emivita la concentrazione si dimezza, dopo circa 5 emivite è rimasto il 3% del farmaco, se avvengono somministrazioni ripetute ciascuna dose andrà a sommarsi a quella precedente accrescendo così la concentrazione del farmaco che verrà quantificata come conc presente nel corpo + conc somministrata, dopo una fase iniziale la concentrazione plasmatica si stabilizza su uno steady state ossia un andamento periodico stabile, la salita verso lo steady state è descritta da un andamento esponenziale con costante di tempo uguale a quella di eliminazione. Se dopo 5 emivite ciò che rimane è una dose trascurabile, una dose somministrata dopo 5 emivite non farà altro che rimpiazzarla, la successiva rimpiazzerà la

seconda e così via. Ogni somministrazione produce un incremento di concentrazione pari a D/Vd, la concentrazione ad ogni

somministrazione è pari alla metà della concentrazione max indotta dalla somministrazione precedente, l’equilibrio di somministrazione si raggiunge con concentrazioni che oscillano tra un massimo di 2 ed un minimo di 1 D/Vd. Il tempo necessario per il raggiungimento del plateau dipende esclusivamente dall’emivita ed ad essa è legata anche la velocità con cui la concentrazione decade una volta che la terapia è stata sospesa. Anche l’intervallo tra le somministrazioni influenza l’entità delle oscillazioni della concentrazione plasmatica all’equilibrio così come le cinetiche di assorbimento.

2.0 Farmacodinamica Un recettore è una macromolecola biologica che media una determinata azione, anche se non tutti i farmaci necessitino di recettore (es. H2O2) per molti l’attività biologica è dovuta alla formazione di un complesso con quest’ultimo.

Questa interazione che viene a formarsi è solitamente mediata da legami chimici deboli come legami H, forze di WdW, legami ionici tra atomi di carica opposta, interazioni idrofobiche ecc.. Per avere un tempo di legame sufficiente all’insorgere dell’azione biologica è necessario che ci siano molti di questi legami uniti alla complementarietà della superficie del recettore. In base al numero ed al tipo di legami l’interazione può essere reversibile o irreversibile. Sono numerose le tecniche per studiare le interazioni ligando-recettore si possono classificare in due categorie:

Curve Dose-Risposta → Consentono una scelta arbitraria sull’oggetto dello studio (apertura canale, produzione di un secondo messaggero ecc..), i principali vantaggi sono: immediata valutazione della rilevanza biologica, studi di specificità; gli svantaggi sono: ignorano molti fenomeni come metabolismo, distribuzione ecc..

Studi di Binding → Avviene la marcatura radioattiva del ligando, si separa X da RX e si misura la quantità di ligando che interagisce. I principali vantaggi sono: determinare la specificità farmacologica, determinare le caratteristiche dell’interazione, localizzazione ed individuazione di recettori e sottoclassi; i principali svantaggi sono: non si possono distinguere agonisti da antagonisti, non si discrimina con altri legami (es. recettori non funzionali ecc..).

Tecniche di biologia molecolare Questi studi consentono di determinare parametri essenziali come: costante di dissociazione, densità dei siti, costanti cinetiche:

Queste equazioni rappresentano:

Figura 4: Raggiungimento steady state

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1. Ka: costante di associazione 2. Kd: costante di dissociazione 3. Kon: velocità di formazione del complesso RX dipendente dall’accesso al sito di legame 4. Koff: Velocità di scissione del complesso RX dipendente dal numero di legami chimici deboli 5. Bmax = Rt: Densità dei siti recettoriali

Per poter arrivare a parametri utili tuttavia si deve ricavare un’equazione simile alla Michaelis-Menten, nota col nome di Isoterma di Langmuir:

Dove B indica la concentrazione di farmaco legata al recettore dalla quale si ricavano i grafici corrispondenti:

L’isoterma di legame e la sua linearizzazione consentono di ricavare i principali parametri dell’interazione farmaco-recettore. Il più comune metodo di linearizzazione è l’equazione di Scatchard:

Figura 5: Isoterma di Langmuir, iperbole (sx), grafico semi-logaritmico (dx)

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In presenza di sottotipi recettoriali multipli gli ordini di grandezza sull’asse delle ascisse cambiano. Inoltre se si verificano queste condizioni cambia anche il grafico si Scatchard che da retta diventa curvilineo, nel grafico semilogaritmico può comparire un flesso. Solitamente questi dati vengono interpretati da appositi calcolatori per personal computer. Farmaci diversi possono competere per il legame con lo stesso recettore, sarà dunque il farmaco che si associa più velocemente e che si distacca più lentamente ad avere la meglio, tutto ciò dipende dalla Kd del farmaco (vincerà la gara per il legame la molecola con Kd minore), queste affermazioni valgono nel caso di legami reversibili. Il fenomeno della competizione modifica le curve di legame, la curva si sposta verso destra aumentando così la Kd.

2.1 Analisi delle curve dose-risposta Servono ad ottenere informazione quali potenza, efficacia, individuazione di agonisti/antagonisti/agonisti parziali. Le risposte farmacologiche sono classificate in:

1. Risposte graduali → Possono assumere qualsiasi valore, aumentando progressivamente con la dose e preservando un valore massimo.

2. Risposte a stadio o score → Es. Valutazione dello stadio di dolore. 3. Risposte quantali → Risposte “tutto o nulla”, si verificano in casi estremi, solo due risposte possibili es.

guarigione o morte. EC50 → Concentrazione effettiva che genera un effetto massimo del 50%, usata per le sperimentazioni in vitro. ED50 → Concentrazione effettiva che genera un effetto massimo del 50% per le sperimentazioni in vivo.

Non è pratico utilizzare una concentrazione per poter definire l’efficacia di un farmaco, si è quindi studiato un parametro adimensionale che è più facile da interpretare e paragonare ossia il pD2:

Questo parametro adimensionale definisce matematicamente il concetto di potenza. Oltre a questi parametri matematici di interpretazione delle curve DR, sono state formulate nel costo degli anni due teorie per spiegare l’interazione farmaco-recettore: o Teoria dell’occupazione o Teoria dell’efficacia o attività intrinseca

2.1.1 Teoria dell’occupazione

È stata proposta da Clark nel 1933 ed ipotizza che l’effetto di un farmaco (Δ) sia direttamente proporzionale al grado di occupazione del recettore:

Tuttavia questa teoria si è dimostrata valida solo se:

1. La reazione è reversibile 2. È stato raggiunto l’equilibrio 3. I recettori sono omogenei 4. L’interazione è stechiometrica

Prima di spiegare il perché questa teoria sia stata superata è necessario spiegare come mai è più conveniente utilizzare un grafico semilogaritmico per interpretare le curve:

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1. La parte centrale è simile ad una retta 2. I farmaci che attivano gli stessi recettori generano curve parallele 3. Se il farmaco interagisce con 1 sottotipo solitamente la curva si sviluppa su due ordini di grandezza, viceversa

se il farmaco reagisce con più sottotipi gli ordini di grandezza saranno maggiori di 2. Dagli anni 50 si trovò che questa teoria era incompleta, si verifica spesso che la curva dose-risposta è a sinistra della curva farmaco-recettore a causa della presenza di recettori di riserva, inoltre le due curve possono essere separate a causa della presenza di una cascata di segnali in cui l’effetto o gli effetti sopraggiungono in seguito ad una serie di eventi biochimici. Si possono distinguere in base alla teoria dell’occupazione: o AGONISTA → Farmaco che si lega al recettore generando una risposta biologica di per se. o ANTAGONISTA → Farmaco che si lega al recettore ma non genera una risposta biologica bensì inibisce,

impedisce l’effetto di un agonista: a) ANTAGONISTA SORMONTABILE → Sposta la curva verso destra aumentando la concentrazione di

agonista necessaria per ottenere l’effetto desiderato, aumenta EC50 senza variare l’effetto massimo. b) ANTAGONISTA INSORMONTABILE → Sposta la curva verso destra in modo non parallelo, lasciando

invariato l’EC50 ma riducendo l’effetto massimo.

Figura 6: Nella figura a sinistra esempio di un agonista sormontabile, nella figura a destra un agonista insormontabile

Il grafico di Schild è una retta che consente di calcolare l’affinità per un recettore di un agonista competitivo, quest’ultimo infatti sposta la curva verso destra in modo parallelo, la distanza è indipendente dalla concentrazione dell’agonista stesso ma dipende dalla potenza e dalla concentrazione dell’antagonista, indicando con DR la “dose ratio” si ottiene:

Dove [A] è la concentrazione di antagonista, Ka la costante di dissociazione del suo complesso con il recettore, il grafico che si ricava permette di capire se un antagonista è competitivo dalla pendenza della retta, calcolarne l’affinità per il recettore. Nel caso in cui la pendenza sia uguale a 1

allora l’antagonista sarà competitivo, questo implica che l'agonista stia agendo su un singolo tipo di recettore e che il tessuto non abbia meccanismi di assorbimento (uptake) per l'agonista. Quando il coefficiente di Schild non è 1 allora:

L’antagonista non è competitivo

Si osserva un’interazione multi molecolare tra farmaco e recettore

Nel procedimento sperimentale non si sono verificate condizioni di equilibrio

Figura 7: Grafico di Schild

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2.1.2 Teoria dell’efficacia o attività intrinseca

Prevede che i farmaci siano dotati di due proprietà intrinseche: o Affinità per il recettore: o Efficacia o attività intrinseca → Capacità del farmaco di dare inizio ad una risposta biologica una volta che si è

legato al recettore, correlata alla probabilità di indurre un cambiamento conformazionale.

Dove α è l’attività intrinseca che ha valori compresi tra 0 e 1, al valore 1 corrisponde un agonista ed a 0 un antagonista, quando il valore è compreso in questo intervallo si parla di agonista parziale. Quest’ultimo genera delle curve che hanno effetto massimo minore rispetto a quello dell’agonista pieno. Gli agonisti parziali competono con il sito di legame dell’agonista pieno, possono avere dunque un effetto additivo oppure un effetto competitivo.

Figura 8: Possibilità di interazione di un agonista parziale

Un ultimo tipo di agonista è l’agonista inverso: è una distinzione che avviene per quelle molecole che interagiscono con recettori costitutivamente attivati, ossia quei recettori che naturalmente stanno in uno stato R*, l’agonista inverso ha più affinità per R piuttosto che per R*. Questi farmaci diminuiscono l’attività basale del sistema avendo azione opposta agli agonisti ma attivando di per se una risposta biologica. Nel caso dei recettori costitutivamente attivati si possono quindi verificare diversi casi:

Un agonista pieno ha affinità per R*

Un antagonista a uguale affinità sia per R che per R*

Un agonista parziale ha più affinità per R* piuttosto che per R

Un agonista inverso ha maggiore affinità per R e sposta l’equilibrio su RX Un ultimo fattore da prendere in considerazione nell’analisi delle curve dose-risposta è l’indice terapeutico, un parametro che evidenzia la differenza tra dose efficace LD50 ed ED50:

È in disuso e soppiantato dal rapporto dose tossica / dose efficace.

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3.0 Recettori e modulazione della risposta I recettori per le sostanze modulatorie endogene si dividono in due classi principali:

1. Recettori di membrana → Trasducono il segnale modificando concentrazioni ioniche intracellulari o attraverso la generazione di secondi messaggeri.

2. Recettori intracellulari → Fattori di trascrizione che inducono modificazioni dell’espressione genica e della composizione proteica.

A loro volta si possono raggruppare in grandi famiglie: a) RECETTORI CANALE → Sono complessi macroproteici trans membrana che formano un canale ionico la cui

apertura è regolata dal legame con il neurotrasmettitore o il farmaco. Sono composti da diverse zone tra cui un imbuto extracellulare, un canale ionico trans membrana ed una zona intracitoplasmatica sede delle fosforilazioni.

b) RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G → Sono i più numerosi, sono formati da una singola catena polipeptidica che attraversa sette volte la membrana plasmatica e sono accoppiati a una proteina G che trasduce una cascata di segnali:

c) RECETTORI CON ATTIVITA’ GUANILATO CICLASICA → Sono recettori poco espressi nei mammiferi superiori

nonostante modulino importanti funzioni come la distruzione del gene per il recettore delle endotossine. Sono costituiti da una singola catena che attraversa una sola volta la membrana plasmatica ed il dominio citoplasmatico possiede attività proteinchinasica. Una volta attivato sintetizza cGMP.

d) RECETTORI CON ATTIVITA’ TIROSIN-CHINASICA → A questa famiglia appartengono recettori per molti fattori di crescita e per molte citochine. Sono costituiti da una catena che attraversa una sola volta la membrana plasmatica e possiede attività chinasica sui residui tirosinici sia del recettore stesso che di altri substrati, questo porta ad una modifica strutturale che porta all’associazione con proteine plasmatiche.

e) RECETTORI PER L’ADESIONE CALLULARE → Sono responsabili delle interazioni tra cellule e trasducono i segnali provenienti dalla matrice regolando crescita, motilità, forma, differenziamento in condizioni fisio/patologiche.

f) RECETTORI PER LE CITOCHINE → Sono fattori di regolazione pleiotropici che controllano diverse funzioni del sistema immunitario ed ematopoietico, tra cui proliferazione e differenziamento:

1. I recettori di tipo I sono eterogenei e trasducono segnale attivando le vie JAK/STAT

PROTEINA G

Adenilato Ciclasi

cAMP

Protein Chinasi

Effetto

Fosfolipasi

DAG

PKC

Effetto

IP3

Ca2+

Calmodulina

Protein chinasi calmodulina dipendenti

Effetto

Canale ionico

Ca2+

Fosfatidilserina

Fosfochinasi

Effetto

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2. I recettori di tipo II sono costituiti da due proteine trans membrana con struttura analoga che formano il sito per i ligandi. La trasduzione avviene previa dimerizzazione che attiva STAT/JAK

g) RECETTORI TOLL-LIKE → Recettori in grado di riconoscere complessi motivi molecolari, sono costituiti da una sola catena peptidica che attraversa una sola volta la membrana. Nella parte esterna hanno motivi ricchi di Leucina. Attivano NFкB (tramite MYD88), chinasi, IRAQ, TRAF6, possono attivare anche AP1e MAPK, indurre apoptosi reclutando FADD e caspasi 8. Sono soprattutto deputati alla risposta immunitaria contro i microrganismi.

h) RECETTORI PER LIPOPROTEINE → Sono in grado di riconoscere lipoproteine e molti altri ligandi, hanno una parte extracellulare molto estesa in cui sono presenti LDL e domini EGF. Sono tra l’altro responsabili dell’internalizzazione dei lipidi.

i) DECOY RECEPTORS → Sono recettori che mancano del dominio intracellulare ed esistono solo per competere con il legame agonista o antagonista.

3.1 Modulazione delle risposte farmacologiche La modulazione della risposta ad un determinato farmaco è bidirezionale:

o REFRATTARIETA’ O DESENSITIZZAZIONE → Riduzione della risposta dovuta al trattamento con agonisti, la desensitizzazione può essere omologa o eterologa.

o UP REGULATION → Aumento della risposta in seguito al trattamento con antagonisti. o DOWN REGULATION → Riduzione del numero di molecole recettoriali.

La desensitizzazione è una proprietà intrinseca della molecola recettoriale, paradossalmente la prolungata desensitizzazione può portare a up regulation come quella indotta dalla nicotina. L’iperpolarizzazione accelera la desensitizzazione e viceversa, la succinilcolina è un esempio di farmaco che genera una rapida desensitizzazione. La desesitizzazione dei recettori accoppiati a proteine G è mediata da fosforilazioni. La down regulation provoca un’internalizzazione del recettore che nel caso del β-adrenergico è mediata da clatrina, l’evento fosforilante associa il recettore con β-arrestina. Questo processo non è neutro in quanto può attivare cascate di segnali come le MAP chinasi. L’esposizione cronica a farmaci agonisti può provocare fenomeni di downregulation tardiva.

Nei recettori accoppiati ad attivazione di PLC entrano in gioco due caratteristiche differenti dai β-adrenergici: 1. Desensitizzazione esclusivamente omologa 2. Feedback Negativo di controllo dell’attività GTPasica effettuato da PLC, deplezione di PIP2 che riduce

l’attivazione di Gq. Nella maggior parte dei recettori in cui l’attivazione comporta fosforilazione in tirosina, tale segnale funge da indice di internalizzazione come succede ad esempio nei fattori di crescita (recettore EGF). La up regulation può avvenire in due modi:

1. Fenomeni lenti: modulazione dell’espressione genica (es. ipersensibilità che segue alla denervazione del muscolo scheletrico).

2. Fenomeni rapidi: accelerata inserzione molecolare di recettori contenuti nei pool di riserva. La tolleranza farmacologica è la necessità di aumentare la dose di un farmaco per mantenerne l’intensità d’azione, è un evento progressivo, l’esposizione cronica ad un farmaco non è l’unico requisito della tolleranza. Quando viene interrotta bruscamente la somministrazione di un farmaco che ha generato fenomeni di tolleranza, si può manifestare la sindrome da astinenza, caratterizzata da disturbi psicosomatici, talvolta la sindrome di astinenza può risultare letale per l’individuo.

RECETTORE

RECETTORE

β-arrestina

ENDOCITOS

I

β-arrestina β-arrestina P

↑Erк → MAPK

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I recettori attraverso cui agisce un farmaco possono essere coinvolti nei fenomeni di tolleranza, come nel caso degli oppiacei. La down regulation può essere uno dei fenomeni attraverso il quale gli oppiacei inducono tolleranza, la desensitizzazione da morfina che avviene nei recettori µ e δ è dovuta al disaccoppiamento dei recettori Gi dovuto all’aumentata attività delle chinasi GRKs che fosforilano solo la forma del recettore legata all’agonista. La plasticità sinaptica è un processo dinamico attraverso il quale le connessioni neuronali rispondono a cambiamenti nell’attività del sistema nervoso, si può avere un aumento di attività oppure una depressione di quest’ultima. Questi due fenomeni si possono descrivere come:

LTP (long term potentiation) → è il termine utilizzato per descrivere un potenziamento notevole e duraturo della trasmissione sinaptica che si attua a livello di varie sinapsi del SNC dopo una breve (condizionante) e intensa (burst) stimolazione presinaptica (circa 100 Hz).

LTD (long term depression) → viene invece indotta da una sequenza più lunga di stimoli a frequenze più basse.

Questi fenomeni sono stati studiati nell’ippocampo e sono necessari per l’apprendimento sinaptico, inteso come creazione di circuiti neuronali “preferenziali”. Si caratterizzano per il crearsi di attività elettriche simultanee nei neuroni sia pre- sia post-sinaptici.

4.0 Recettori canale Sono canali ionici la cui apertura è mediata dal legame con sostanze endogene, si dividono in:

RECETTORE SIGLA LIGANDI

Nicotinico muscolare e neuronale AchR Ach

Recettori permeabili a cationi

Ionotropo glutammatergico AMPA, KAR, NMDAR Amminoacidi

Serotoninergico 5-HT3 Serotonina

Purinergico P2X ATP

Aperto da nucleotidi ciclici CNG cAMP, cGMP

Gabaergico GABAA, GABAB GABA Recettori permeabili

ad anioni Glicinergico Gly-R Gly (recettore che

necessita di geferina)

Quasi tutti i tipi cellulari esprimono questi recettori, tuttavia sono concentrati soprattutto nelle cellule del sistema nervoso. Classificandoli in 4 classi sono: A) FAMIGLIA DEI RECETTORI NICOTINICI → Eteropentameri a 4 subunità: 2α1, 1β1, 1ε o 1γ, 1δ. A questa classe

appartengono i GABAA, GABAC, Gly-R, 5-HT3. Sono caratterizzati dalla presenza nella prima regione N-terminale di un’ansa di 13 amminoacidi compresa tra due cisteine (la 128 e la 142) della subunità α1 che formano un ponte disolfuro essenziale per la struttura terziaria. Ciascuna delle subunità è composta da una catena con 4 segmenti idrofobici ed estremità extracellulari.

B) RECETTORI DEL GLUTAMMATO → Appartengono a questa classe i recettori ionotropi del glutammato (AMPA, Kainato, NMDA) in base al legame. Le subunità sono costituite da un’unica catena polipeptidica con ampia regione N-terminale extracellulare, quattro regioni tra cui M2 intracellulare.

M1 M2 M3 M4

γ2 α1 β2 β2 α1

Recettore GABAA

COOH H2N

M1 M2 M3 M4

H2N

COOH

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C) RECETTORI DI cGMP ed cAMP → Il sito del ligando è intracellulare, anche le due estremità carbossi- ed ammino-terminale sono intracellulari, è composto da 6 regioni trans membrana ed una regione P tra M5 ed M6.

D) RECETTORI IONOTROPICI DI ATP P2X → Sono costituiti da due regioni trans membrana ed un ampia regione extracellulare.

Nei recettori A il canale è formato essenzialmente dalle subunità M2 attorno alle quali sono posizionate le altre. Le M2 presentano amminoacidi carichi posizionati in modo tale che quando le 5 subunità sono affiancate formano il canale la cui composizione amminoacidica varierà in base allo ione ed al tipo di canale. Nei recettori B e C il poro è rappresentato dalle zone P ed M2. L’entità della risposta di questi recettori è modulabile da: differenza di potenziale e durata della stimolazione, a ciò fanno eccezione i recettori attivati da amminoacidi eccitatori che richiedono anche una parziale depolarizzazione della membrana. La desensitizzazione è una proprietà intrinseca di questi recettori.

5.0 Recettori accoppiati a proteine G (GPCR) Questi sono i recettori più numerosi e si stima che il 50% dei farmaci agiscano su di essi, le loro funzioni possono essere riassunte come:

a) Vista: le opsine usano la fotoisomerizzazione del retinale per tradurre l’energia elettromagnetica in segnali cellulari. La rodopsina, ad esempio, usa la conversione dell’11-cis-retinale a all-trans-retinale.

b) Olfatto: recettori dell’epitelio olfattivo legano gli “odori” (recettori olfattori) e feromoni (recettori vomeronasali).

c) Regolazione del comportamento e dell’umore: recettori centrali per serotonina e dopamina. d) Regolazione del sistema immune e dell’infiammazione: chemochine legano recettori medianti la

comunicazione tra cellule del sistema immune; recettori per l’istamina attivano mediatori della flogosi. e) Trasmissione del sistema nervoso autonomo: simpatico e para- usano recettori GPCR.

Si dividono in 3 classi principali: Classe I: Rhodopsin-like

vista (rodopsina)

recettori dei neurotrasmettitori (muscarinico, dopaminergico ecc..)

recettori di peptide (TSH, FSH ecc..)

recettori di glicoproteine e ormoni (bradichidina, vasopressina, endotelina)

recettori attivati da proteasi (Trombina) Classe II: Glucagon-like

Calcitonina

Fattore di rilascio della corticotropina (CRF)

Glucagone

Ormone paratiroideo (PTH)

M1 M2 M3 M4 M5 P M6

H2N COOH

1 2

2 1

M1 M2

COOH H2N

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PACAP Classe III: Metabotropic Glutamate-like

Sensori del calcio

GABAB

Metabotropico del glutammato mGlu Sono costituiti da una catena polipeptidica che attraversa 7 volte la membrana, l’estremità ammino-terminale è extracellulare, la carbossi-terminale è intracellulare. Il sito di legame con il ligando e con l’ormone sono in due zone distinte. Il cambiamento conformazionale in seguito all’attacco con il ligando avviene soprattutto nelle regioni del 3° territorio citoplasmatico e nell’estremità carbossi-terminale. Questa classe di recettori è soggetta a dimerizzazione ad esempio i β2 adrenergici formano omodimeri così come i muscarinici M2 ed M3, tra GABAB1 e GABAB2 si formano etero dimeri. Anche il recettore AT2 con quello della Bradichidina. Molte mutazioni di questi recettori sono alla base di patologie come la retinite pigmentosa autosomica dominante.

La desensitizzazione di questi recettori avviene tramite GRK:

1. Il complesso attiva la GRK (chinasi del recettore) 2. La GRK fosforila il recettore nei suoi loop intracellulari (secondo o terzo)

3. La -arrestina riconosce il recettore fosforilato legandosi ad esso 4. Proteine del citoscheletro “tirano” il complesso arrestina/recettore per internalizzarlo

Le proteine G possiedono attività GTPasica intrinseca e svolgono la loro azione in 3 passaggi principali: I. Formazione di etrodimero GDP-α-βγ

II. Legame con il ligando: dissociazione di GDP che viene sostituito da GTP, separazione del complesso βγ ed interazione con gli effettori.

III. Spegnimento del segnale: α idrolizza GTP e si ritorna al primo stadio. In alcuni casi l’effettore di α può accelerare l’idrolisi di GTP (come nel caso delle proteine Gq).

H2N

COO-

E1 E3 E4

i1 i2

i3

i4

α β γ

E2

α β γ

GDP

GTP EFF

α EFF

β γ

GTP

GDP

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La subunità α può differenziarsi in classi:

SUBUNITA’ ES. DI RECETTORI AZIONE

αS TSH, β ↑Adenilato ciclasi αi1 αi2 αi3 α0 αt

Somatostatina, neurotrasmettitori, peptidi

↓Adenilato ciclasi

αq TRH, M1 ↑Fosfolipasi C α12 α13 A2 per il trobossano ↑Rho, GEF

La proteina GT accoppia la rodopsina e ↑fosfodiesterasi che idrolizza cGMP. Tossine come quella del colera e quella della pertosse hanno come bersaglio le subunità α. Le subunità βγ sono in grado di regolare diversi enzimi: ↑PLC, ↑↓cAMP, ↑PI3K, ↑K+, ↓Ca2+.

5.1 Sistemi effettori o ADENILATO CICLASI → Enzima ubiquitario in grado di convertire ATP in cAMP, ne esistono 9 forme differenti

espresse nei vari tessuti, sono formate da due regioni a 6 termini trans membrana e due estese regioni citoplasmatiche. Il principale meccanismo di stimolazione è da parte di proteine GS viceversa le proteine Gi inibiscono l’enzima tramite la subunità α. Il cAMP regola diverse proteine, in particolare le PKA, formate da 2 subunità una regolatoria ed un’altra catalitica. In assenza di cAMP formano un complesso inattivo, quando la subunità catalitica si stacca è libera di fosforilare serina e treonina regolandone l’attività; in questo modo il cAMP può controllare reazioni metaboliche, attività di canali, proliferazione ecc.. il cAMP viene distrutto da fosfodiesterasi una volta che ha svolto la sua azione.

o FOSFOLIPASI C → La sua attivazione ↑ uno specifico fosfolipide PIP2 (fosfatidilinositolo-4,5-bifosfato) localizzato nel foglietto interno della membrana; la sua idrolisi origina due secondi messaggeri: IP3 e DAG che regolano numerosi processi cellulari. Esistono 11 isoforme di fosfolipasi C: 4 tipi di PLCβ, 2 di PLCγ, 4 di PLCδ e 1 PLCε. Nonostante la loro sequenza sia differente, presentano tutte siti attivi XY. L’attività delle fosfolipasi è calcio-dipendente, le PLC sono attivate da vari meccanismi: 1. PLCβ sono ↑ da proteine Gq, dalla subunità αq e talvolta da βγ. 2. PLCγ sono ↑ da recettori per fattori di crescita. 3. PLCε sono ↑ da Ras

↑PLC

•β → Gq

•γ → Rec. fattori di crescita

•δ → Rec. intracellulari

•ε → Ras

PIP2

•DAG → PKC

•IP3 → ↑Ca2+

Fosfatidilinositolo Fosforilazione 1,2

H2N

C1

COO-

C2

α5GTP ATP cAMP PKA

5’-AMP

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Il DAG attiva le PKC che fosforilano serina e treonina in numerosi substrati, il DAG è rapidamente metabolizzato da specifiche lipasi. IP3 è idrofilo, diffonde nel citoplasma dove lega specifici recettori sul reticolo endoplasmatico, sono canali che liberano calcio in un rapido passaggio in quanto IP3 è subito metabolizzato.

I recettori a 7 domini trans membrana interagiscono inoltre con proteine ed enzimi coinvolti nell’endocitosi come le proteine HOMER che guidano la localizzazione dei recettori nella membrana post-sinaptica. Le β-arrestine si legano ai recettori attivati e ↑ endocitosi.

6.0 Omeostasi del calcio intracellulare Il calcio gioca un ruolo molto importante, contribuisce al potenziale di membrana, partecipa alla regolazione di moltissime funzioni cellulari come la proliferazione, il differenziamento, secrezione, la memoria ecc..

La concentrazione di calcio è influenzata da differenti canali: o Canali ionici voltaggio-dipendenti (VOCCs) → Il calcio entra nella cellula in seguito a depolarizzazione, si possono

dividere in HVA (ad alto voltaggio) o LVA (basso voltaggio), i secondi si aprono in seguito a piccole depolarizzazioni, i primi hanno cinetica più lenta. Sono VOCCs i canali di neuroni e di tessuti eccitabili, nelle fibre muscolari si hanno le “diadi” e i canali del RE.

o Canali ionici controllati da recettore (ROCCs) → La loro apertura è regolata dall’interazione con l’agonista, sono principalmente espressi a livello neuronale, mediano meccanismi di LTP ed LTD, sono recettori per amminoacidi eccitatori, sottotipi di AMPA e NMDA.

o Canali ionici controllati da secondi messaggeri (SMCCs) → Sono ubiquitari. o Canali ionici attivati dallo svuotamento degli organelli di deposito es. reticolo endoplasmatico (SOCs) → il

meccanismo è ancora incerto, esistono due ipotesi, una di attivazione da parte di IP3 e l’altra da parte di un mediatore diffusibile.

Proteine G0 ma soprattutto Gq sono legate alla liberazione del calcio intracellulare. Per la sua rimozione entrano in gioco pompe e trasportatori:

Pompa Ca2+ → Localizzata a livello della membrana plasmatica, lega uno ione calcio con alta affinità e lo espelle consumando una molecola di ATP, la sua attività è modulata da Calmodulina, una proteina capace di legare Ca2+, quando la concentrazione intracellulare di quest’ultimo aumenta, il complesso si lega al sito regolatorio aumentando la Vmax della pompa.

Scambiatore Na+/Ca2+ → ha affinità per il calcio inferiore e scambia 1Ca2+ con 3Na+, la sua attività dipende quindi dal gradiente di Na+ generato dalla pompa Na+/K+ ATPasi e da tutti gli altri sistemi di scambio di sodio. I glicosidi cardioattivi inibiscono l’attività di questa pompa riducendo l’estrusione con modesta depolarizzazione ed accumulo.

Il reticolo endoplasmatico è la sede dei pool di riserva di Ca2+, è un deposito intracellulare a rapido scambio, le pompe calcio sono indicate come SERCA e trasportano 2Ca2+ per ogni molecola di ATP. Le proteine luminali leganti il calcio fanno si che questo non precipiti riducendo la concentrazione dello ione libero. I canali ionici sono deputati a mettere in comunicazione il lume dell’organulo con il citosol e sono canali sinsibili a IP3 e Rianodina.

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Il calcio stesso può giocare il ruolo di induttore (CICR), liberazione di calcio indotta da calcio. Oltre al RE anche i mitocondri sono importanti ammortizzatori locali di calcio essendo caratterizzati da un altissimo potenziale di membrana che costituisce una forza di trazione per il trasportatore specifico a bassa affinità di Ca2+. Il citosol risulta essere quindi un luogo dove avvengono scambi e movimenti di Ca2+, al suo interno si riconoscono una serie di proteine che interagiscono con il calcio caratterizzate da un motivo EF-HAND comune, un esempio sono annessine e calmudulina. I depositi di Ca2+ a scambio rapido permettono che la concentrazione di calcio intracellulare aumenti e muti continuamente anche in zone profonde della cellula. La regolazione dell’omeostasi è importante per la prevenzione di patologie e necrosi cellulari improvvise (eccitotossicià neuronale). Le proteasi calcio-dipendenti come le calpaine partecipano alla rimodulazione di molti processi fisiologici come il turnover dei recettori, il rimaneggiamento del citoscheletro e la mitosi.

7.0 Recettori ad attività tirosin-chinasica Per iniziare è opportuno introdurre le principali classi di PK protein-chinasi:

1. AGC → PKA, PKG, PKC, Rac, G-protein kinases 2. CaMK → chinasi regolate da Ca2+/CaM 3. CMGC → chinasi ciclina dipendenti ERK, MAP, Casein kinase 4. PTK → Proteine tirosin-chinasiche Src, Abl, Fak, PDGF, IR 5. OPK → Other Protein Kinases

Queste proteine possono trovarsi nel citosol o essere integrate in recettori presenti sulla membrana. I fattori di crescita hanno struttura tirosin-chinasica e controllano l’ingresso e la progressione delle cellule nel ciclo duplicativo, si dividono in fattori di competenza (reclutamento cellule quiescenti) e fattori di progressione (transizione dalla fase G1 alla fase S del ciclo). L’attività tirosin-chinasica non è altro che il trasferimento di gruppi fosfato da ATP a substrati proteici fosforilando residui di tirosina. Di questi recettori si distinguono diverse classi:

EGFreceptor, NEU/HER2,HER3

Insulin receptor

PDGF

FGF

VEGF

Eph I recettori RTKs presenti sulla membrana sono costituiti da un solo filamento trans membrana ma divisi in 5 domini funzionali: o DOMINIO EXTRACELLULARE (Binding domain) → Comprende il sito di legame ad altissima affinità per il ligando. È

formato da circa 250 aa e contiene numerosi siti di glicosilazione, ha un terminale –NH2 e una variabilità di sequenza molto elevata.

o DOMINIO TRANS-MEMBRANA → Costituito da 25 residui amminoacidici idrofobici che attraversano il doppio strato lipidico, è seguito da una serie di residui basici di ancoraggio, ha una scarsa variabilità di sequenza, media alla trasmissione intramolecolare del segnale.

o DOMINIO IUXTA-MEMBRANA → Separa il secondo dominio da quello catalitico, è costituito da circa 50 aa, contiene alcuni siti di fosforilazione, è una regione ben conservata in molti recettori, contiene i siti di modulazione del recettore (è coinvolto nella trans modulazione), ha un ruolo centrale nel reclutamento e nell’attivazione degli effettori.

o DOMINIO CATALITICO → Conserva un’omologia del 90%, è costituito da circa 250 aa, responsabile dell’attività chinasica, in alcuni casi è interrotto da una funzione regolatoria. Si divide in due sottodomini:

N-terminale: lega ATP

C-terminale: contiene il loop catalitico che presiede alla funzione fosfotrasferasica ed il loop di attivazione che è oggetto della trans/auto-fosforilazione attivatoria.

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o CODA CITOPLASMATICA → Contiene circa 250 aa, presenta residui di Tyr e sequenze consenso fondamentali per innescare la trasduzione del segnale nel citosol.

Questo tipo di recettori si attivano per dimerizzazione che stabilizza lo stato attivo ed avvicina il substrato (dominio intracellulare di un altro recettore), in modo che si verifichi la trans-fosforilazione. Un esempio di questi recettori è l’IRK (insulin receptor kinase) che è un etero tetramero (2α, 2β) il cui legame con insulina ne cambia la conformazione dell’unità β che è responsabile dell’attività chinasica, quest’ultima fosforila i residui di tirosina nel dominio citoplasmatico così come i substrati IRS. Il legame di dimerizzazione è reversibile, una volta avvenuta la fosforilazione di Tyr, le fosfo-tirosine si associano mediante domini SH2 (Src homology domain 2) che legandole localizzano diverse proteine idonee a svolgere la funzione di trasmissione del segnale. Nonostante Src e analoghi siano citoplasmatiche, queste possono legarsi a RTKs, Scr sono tirosin-chinasi non recettoriali.

SH2 recluta quindi trasduttori intracitoplasmatici e la scelta discrimina quale via verrà attivata. Una di queste è la via Ras: è una piccola GTPasi monomerica di 21KDa

espressa ubiquitariamente, potente induttore della proliferazione cellulare, funge da interruttore alternando uno stato attivo (Ras-GTP) da uno inattivo (Ras-GDP), l’interconnessione è mediata da GNRF (general nucleotide release factor) e scambiatori GDP/GTP. Le proteine Ras mutanti non sono in grado di dissociare GTP rimanendo sempre in uno stato “on” proliferativo, questa mutazione è stata riscontrata nel 30% dei tumori.

Il GNRF caratterizzato è SoS, si associa alla tirosina fosforilata e a Grb2 ed innescano la cascata Ras-Raf-MEK-MAPK con conseguente attivazione di fattori trascrizionali che modulano l’espressione genica (proliferazione e differenziamento).

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8.0 Recettori intracellulari Si distinguono dagli altri recettori in quanto il meccanismo d’azione non richiede sempre un ligando specifico e l’attività intracellulare non è mediata da secondi messaggeri in quanto possono legare direttamente il DNA. Hanno un’organizzazione strutturale simile, sono tutti formati da una catena polipeptidica di 400-1000 aa:

Nella zona C troviamo il DNA binding domain che è responsabile di legare il DNA, LBD è il Ligand binding domain, gli AF sono siti di interazione con l’apparato trascrizionale. I recettori intracellulari sono veicolati nel nucleo una volta terminata la sintesi nel reticolo endoplasmatico, i recettori senza ligando non possono completare la trascrizione in quanto sono associati a proteine inibitorie, un’eccezione sono gli ormoni tiroidei. I recettori del progesterone, estrogeni e COUP possono essere attivati in seguito all’attivazione di recettori di membrana come EGF, IGF, TGF o neurotrasmettitori come la dopamina. I meccanismi d’azione sono due: uno in presenza di ligando e l’altro in assenza di ligando:

Anche i recettori intracellulari sono passibili di regolazione che può essere indotta dalla propria attivazione, via regolazione autologa sia in seguito all’attivazione di altri recettori come nella regolazione eterologa.

9.0 Farmacologia della trascrizione genica Trascrizione e traduzione sono i due processi attraverso i quali le informazioni contenute nel DNA sono convertite in proteine. L’inizio della trascrizione è un processo altamente regolato ed avviene per mezzo di molte proteine ed enzimi, la RNAPII è l’enzima che catalizza la sintesi di mRNA, è assistita da fattori generali di trascrizione GTF della polimerasi II indicati con lettere alfabetiche. Il complesso di pre-inizio è RNAPII-TFIID-TFIIB-TFIIF-TFIIE-TFIIH, il TFIID inizia la sequenza che porta alla formazione del complesso. I TFIID sono presenti in due componenti TBP (TATA binding protein) e TAFs (TBP associated factors):

Il TFIIH è reclutata per lo srotolamento e la denaturazione locale del DNA. Si è scoperto dell’esistenza di cofattori che non si legano direttamente al DNA ma formano un ponte attivatore: o TAF → Riconoscono elementi del DNA come Inr (iniziatore) o DPE (downstream promoter element). o MEDIATOR → Complesso multi modulare che interagisce con RNAPII stimolando la fosforilazione del dominio

carbossi-terminale.

A | B | C | D | E | F

COOH H2N

AF1 DBD LBD AF2

HRE DNA

Extracell.

Nucleo

HRE DNA

Extracell.

Nucleo

Segnale

Figura 9: A sinistra l'attivazione con ligando, a destra senza ligando

TATA box

D

B F

RNAPII

TATA box D

B F RNAPII E

H

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Il DNA è organizzato in una struttura nucleo-proteica nota come cromatina, organizzata in nucleo somi ossia 146 paia di basi di DNA arrotolato due volte attorno ad un core proteico contenente due copie di ciascuna delle proteine isotoniche H2A, H2B, H3 ed H4, pertanto per iniziare la trascrizione si necessita di riorganizzazione che è mediata da due complessi: o COMPLESSI ATP-DIPENDENTI → Usano l’energia derivata dall’idrolisi dell’ATP per promuovere lo slittamento del

nucleo soma esponendo e mascherando specifiche sequenze di DNA. Sono strutture multi proteiche con una subunità ad attività ATPasica, nell’uomo si riconoscono 3 distinte famiglie. Si ipotizza che le proteine accessorie promuovano la localizzazione.

o COMPLESSI MODIFICATORI DEGLI ISTONI → Sono elementi in grado di modificare covalentemente gli istoni all’estremità N-terminale attraverso reazioni di acetilazione, metilazione e fosforilazione.

La cromatina si può a sua volta classificare in due categorie:

EUCROMATINA → Meno condensata, corrisponde a zone dove vi è un’intensa attività trascrizionale.

ETEROCROMATINA → Componente più condensata, corrisponde a zone prive di attività trascrizionale. La trascrizione è inducibile da stimoli extracellulari, esistono almeno 3 classi di fattori di trascrizione in grado di generare questo tipo di risposta:

1. Fattori attivati da ligando: es. recettori per ormoni steroidei 2. Fattori attivati da modificazioni post-traduzionali: correlate allo stato di fosforilazione di specifici residui di

serina e di treonina 3. Fattori regolati a livello trascrizionale.

10.0 Il ciclo cellulare La mitosi è il fenomeno che determina la scissione della cellula madre dalla sua copia, il ciclo cellulare è un processo che dura dalle 16 alle 24 ore e viene diviso in 4 fasi più una fase G0 di quiescenza. Il ciclo necessita di 3 componenti principali:

1. CDK (Cyclin dependent kinases) → sono sintetizzate in sequenze ordinate durante il ciclo, nei vertebrati la loro azione è regolata dalle cicline. Le Cdk sono divise in 7 specie.

2. Cicline → Sono un gruppo ristretto di proteine con una sequenza denominata Cyclin-Box che funge da interazione con le Cdk. Si dividono in base al loro ruolo nel ciclo cellulare (ecco le principali):

Ciclina B => Fase G2/M con Cdk1

Ciclina A => Fase S e G2 con Cdk2

Ciclina E => Fase G1/S con Cdk4/6 poi con Cdk2

Ciclina D => G1 con Cdk4, 5, 6

Ciclina C => Presente in tutto il ciclo: CTD di RNAPII 3. Fattori di regolazione di Cicline e CDK → attivazione di fosfatasi, inibitori delle chinasi, inibitori non chinasici.

L’attività di Cdk1 è modulata da fosforilazione di un residuo di treonina 160/161 situato in un’ansa che, nella conformazione inattiva, blocca il sito attivo. È responsabile della fosforilazione il complesso Cdk7. L’attività di Cdk1 è inibita dalla fosforilazione di un residuo di treonina ed uno di tirosina nell’estremità N-terminale, questa fosforilazione è dovuta a Wee-1, la defosforilazione che porta alla forma attiva è dovuta a Cdc25.

Nel caso in cui avvenga un danneggiamento del DNA entrano in gioco gli inibitori delle Cdk che fungono da punti controllo nel ciclo cellulare:

G1 S G2 M G0

Cdk 4, 5, 6 Cdk 2 Cdk1

ClnD ClnE ClnA ClnB

ClnB Cdk1

Thr161

Thr14

Tyr15

ClnB Cdk1

Wee1

Cdk7

Cdc25 ClnB Cdk1

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10.1 Inibitori del ciclo cellulare o Rb → è una piccola proteina ubiquitaria che prende nome dal fatto che la sua mutazione può essere causa del

retino blastoma, il prodotto di rb è una proteina che svolge un ruolo chiave nella transizione da G1/S, controllando l’attività del fattore di trascrizione E2F che attiva una varietà di geni che codificano per enzimi indispensabili per la duplicazione. Rb inibisce E2F sequestrandolo in una tasca della molecola, tale legame dipende dallo stato di fosforilazione di Rb; quest’ultima inizia ad essere fosforilata in G1 da parte di ClnD/Cdk4 e ClnD/Cdk6 e per finire da ClnE/Cdk2.

o p21, p27, p57 → inibiscono principalmente Cdk4 e 2 (G1/S, S/G2) legandosi al complesso con la rispettiva Ciclina in rapporto di 2:1 (inibitore:complesso).

o p16 → può indurre l’arresto del ciclo in G1, circostanza che si verifica solo prima che venga superato il primo punto di transizione in presenza di Rb funzionante, ciò suggerisce che p16 svolga la sua funzione bloccando la fosforilazione di Rb operata da ClnD/Cdk4.

o p53 → regolatore della progressione della mitosi ed induttore di apoptosi. Svolge la sua funzione non solo nel passaggio G1/S ma anche in quello G2/M (il trattamento con nocodazolo blocca le cellule in G2 solo in presenza di p53). La sua attività è regolata a livello di sintesi post-traduzionale. In condizioni normali la proteina è normalmente sintetizzata e si mantiene con livelli cellulari molto bassi.

Tra gli inibitori del ciclo cellulare troviamo anche chemioterapici, anti-tumorali: o Attivatori della via di p53:

attivatori del DNA-damage (classici etoposide, cisplatino, doxorubicina, antracicline

antimetaboliti (metotrexate, 5-FU, etc.)

"small peptides" che attivano direttamente p53

inibitori del proteasoma che ne impediscono la degradazione (bortemizib) o Inibitori delle Cdk:

SNS-032 inibitore dei complessi CDK2/Cicline E,A e del CAK

Inibitori della cdc25 (il naphtofurandione, derivati della dysidiolide, etc.) o Inibitori del fuso mitotico

modulatori della polimerizzazione della tubulina, alterazione del fuso mitotico (Tassani, Combretastatani, Colchicina)

modulatori del "Kinetocore assembling" (inibitori delle cinasi Aurora e Polo-like, peptidi che mimano la Survivina)

10.2 Morte cellulare La morte cellulare è un meccanismo di eliminazione evoluto e conservato, esiste tuttavia una sostanziale differenza tra necrosi ed apoptosi. La prima per definizione è una morte accidentale patologica, dal punto di vista morfologico differiscono in quanto nella necrosi si ha un aumento di volume e viceversa. Anche la disponibilità di ATP è essenziale in quanto la necrosi può instaurarsi anche con bassi livelli di ATP. Necrosi ed apoptosi hanno tuttavia in comune eventi come la transizione della permeabilità della membrana mitocondriale interna. L’apoptosi coinvolge generalmente le singole cellule, ed anche quando porta alla rimozione di più cellule non è accompagnata da fenomeni infiammatori. L’apoptosi si può schematizzare in due passaggi:

1. Formazione di corpi apoptotici → Questa fase è caratterizzata da una diminuzione del volume citoplasmatico con aumento della densità cellulare, attivazione di caspasi, alterazione della membrana esterna dei mitocondri, rilascio di CYP450(c), alterazioni della superficie e frammentazione del DNA.

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2. Eliminazione di corpi apoptotici → I macrofagi riconoscono queste cellule dall’alterazione delle glicoproteine di membrana e le fagocitano, degradando i corpi all’interno dei fagosomi. I corpi non fagocitati possono andare incontro a degradazione incontrollata che potrebbe produrre una risposta infiammatoria.

Sono state identificate due possibili vie apoptotiche in cui le caspasi e le proteine della famiglia Bcl-2 giocano un ruolo molto importante. Bisogna tenere presente che anche p53 svolge un ruolo importante nel processo di apoptosi, qualora avvenga un’interruzione del ciclo e questa non si possa riparare, p53 può indurre apoptosi inducendo sintesi proteica specifica. o VIA INTRINSECA → Le caspasi, Bcl-2 e Bax giocano un ruolo fondamentale. Bcl-2 è una proteina anti-apoptotica

che omodimerizza per svolgere la sua funzione, quando eterodimerizza con Bax può avvenire induzione dell’apoptosi dovuta allo squilibrio di interazioni. Questo fenomeno può avvenire in seguito a radiazioni, somministrazione di farmaci, segnali recettoriali che inducono Bax che una volta legato a Bcl-2 con l’aiuto del citocromo c rilasciato dai mitocondri contribuisce all’attivazione della caspasi-9 che attiva la caspasi-3 che taglia i

vari strati proteici della cellula: o VIA ESTRINSECA → Questo sistema dipende dall’attivazione di CD95-R, un recettore di morte con DD in grado di

legare FADD. Il legame di CD95-R con il dominio extracellulare di CD95-L permette l’attivazione del recettore e l’innesco dell’apoptosi. Questa via di morte è caratteristica non solo dei recettori della famiglia CD95 ma anche di altri come Fas ecc..

Caspasi-9

APAF-1

Caspasi-3

Morte Mitocondrio

Citocromo C Bax; Bak Bcl-2

Caspasi-9

CD95-R CD95-L

DD FADD

DED

DED

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11.0 Recettori che mediano l’adesione cellulare La matrice extracellulare (ECM) è quella parte di tessuto che provvede alle funzioni di supporto ed ancoraggio della cellula, formazione di tessuti ma anche altre funzioni in base alle componenti che la caratterizzano: Collagene Insolubile: componente strutturale, responsabile della resistenza e resilienza dell’ECM. Proteoglicani: ammortizzatori cellulari Proteine della matrice con funzioni adesive: legano le componenti sopracitate ai recettori cellulari.

Le differenti combinazioni di queste tre componenti contribuiscono alla caratterizzazione di ECM peculiari e sono inoltre capaci di influenzare il comportamento cellulare. L’interazione dell’ECM con specifici recettori fa si che si sviluppino segnali on-off diretti alla cellula in diversi pathway, è oltretutto in grado di sequestrare growth factors ed ormoni legandoli e modulandone la capacità di attivare i segnali cellulari.

Le molecole che mediano all’adesione cellulare sono implicate in fenomeni adesivi, controllo della migrazione, riparazione di danni a strutture vascolari e trasmettono segnali all’interno della cellula regolando anche proliferazione, sopravvivenza e trascrizione. Questi recettori si possono legare in modi differenti tra loro:

Si dividono in 4 categorie principali: o CADERINE → Partecipano alla formazione delle giunzioni aderenti (interazioni cellulari come le giunzioni

sinaptiche, organizzazione dei tessuti solidi) formano una cintura continua di caderine negli epiteli, si associano in omodimeri e reagiscono con caderine simili su cellule omologhe, la loro funzione è Ca2+-dipendende. Le caderine si associano a proteine dette catenine presenti in tre isoforme (α, β, γ) che sono in grado di legare actina, questo forma un complesso composto da caderina-catenina-actina che consente l’ancoraggio. Oltre alle giunzioni aderenti sono responsabili della formazione di desmosomi ossia densità proteiche costituite da caderine e dalle proteine dei filamenti intermedi legati alla membrana plasmatica tramite di esse. I desmosomi

legano una rete di filamenti intermedi. Le caderine svolgono un ruolo molto importante nello sviluppo ossia la formazione della blastula e la definizione delle tipologie tessutali embrionali, la migrazione e la distribuzione delle cellule in questa fase in quanto riconoscono cellule simili, se la loro espressione è bloccata la blastula non si forma oppure viene alterata.

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o INTEGRINE → Mediano l’adesione con l’ECM ed il citoscheletro, sono etero dimeri costituiti dall’associazione di una catena α ed una β e vengono classificate in base a quest’ultima. Le integrine agiscono come punto di aggregazione per complessi multi proteici all’interno della cellula che interagiscono con actina formando una struttura tridimensionale (adesioni focali) e connettono la ECM con il citoscheletro, sono giunzioni non ancoranti e calcio-dipendenti. Il legame ha come cofattore dei cationi divalenti di Mg2+ o Mn2+. L’adesione è regolata tramite up-regulation/down-regulation delle integrine. Sono responsabili della formazione di emidesmosomi

ossia desmosomi tra la cellula e la lamina basale che sono costituiti da filamenti di collagene e laminina. Entrambi i tipi di giunzione (adesioni focali ed emidesmosomi) coinvolgono le integrine quali proteine trans membrana. Le integrine sono connesse alla matrice extracellulare tramite fibronectina e laminina. Differiscono per gli elementi citoscheletrici citoplasmatici a cui le integrine sono collegate: i microfilamenti nei contatti focali; i filamenti intermedi negli emidesmosomi. L’attivazione delle integrine genera una serie di segnali come l’attivazione e formazione di adesioni focali innesca la segnalazione da parte di FAK (focal adhesion kinase) che media alla motilità ed alla crescita della cellula. Il controllo della segnalazione integrinica è regolata dallo stato di attivazione, serve un attivatore come ad esempio la β-endonexina.

o SELECTINE → Mediano adesioni transienti nel circolo sanguigno, i leucociti usano le loro proprietà adesive per passare da un tessuto all’altro, le selectine sono lectine (proteine che legano i carboidrati), sono calcio-dipendenti, sono proteine trans membrana con dominio lectinico altamente conservato che lega specifici residuo oligosaccaridici, si dividono in 3 tipologie:

L-Selectina = molecola di adesione caratteristica dei leucociti.

P-Selectina = piastrine e cellule endoteliali

E-Selectina = cellule endoteliali attivate I passaggi che caratterizzano la migrazione leucocitaria sono:

1. I leucociti interagiscono con l’endotelio (rolling) mediante mucine (PSGL-1 sul leucocita e GlyCam e MadCam sull’endotelio) e selectine (L-selectina sul leucocita ed E-selectina sull’endotelio). L’espressione di P-selectina (contenuta normalmente in vescicole) endoteliale è in risposta a diversi agenti quali la trombina, l’istamina mentre la E-selectina è regolata da meccanismi trascrizionali in risposta a citochine.

2. Adesione salda della cellula leucocitaria mediata dall’interazione tra integrine β1-2 e i loro ligandi endoteliali VCAM-1 e ICAM-1,2. Questa adesione dipende dallo stato di attivazione delle integrine, ossia deve esserci un segnale chemiotattico dall’interno dela cellula che le attivi.

3. Transmigrazione: i leucociti si muovono insinuandosi tra le cellule endoteliali, movimento dettato dall’esistenza di un gradiente di sostanze chemiotattiche che orienta la cellula verso il punto con maggiore concentrazione di esse. In questo passaggio le interazioni PECAM-1-PECAM-1 e CD99-CD99 delle cellule endoteliali vengono sostituite dalle stesse interazioni con le proteine del leucocita.

o Ig-LIKE → Sono proteine di adesione della famiglia delle immunoglobuline, hanno interazioni omofiliche ed eterofiliche deboli e transitorie, sono specifiche per il tessuto, legano varie componenti dell’ECM tra cui Ig-CAM ed integrine.

Le integrine ed altri recettori adesivi sono responsabili dell’adesione ed aggregazione delle piastrine, il processo di emostasi avviene qualora ci sia un danno tissutale, ma altresì può essere causa della formazione di trombi. Le piastrine sono cellule contenenti actina, gli attivatori sono ADP, epinefrina, collageno, trombina, PAF (platelet activating factor), una volta attivate si innesca una serie di passaggi:

1. Adesione al collagene tramite il VWF che legandosi al collagene ha un cambiamento conformazionale che rende riconoscibile alla glicoproteina Ib-IX-V, inoltre riconosce l’integrina αIIbβ3.

2. Attivazione che induce un cambiamento conformazionale da discoide a sferica con rilascio di attivatori.

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3. Outside-in signaling tramite PAF e trombossani. 4. Degranulazione con conseguente rilascio di ADP, trombossano, fattori della coagulazione, serotonina

(vasocostrittore), fattori di crescita (riparazione dei vasi).

5. Inside-out signaling Polimerizzazione e Aggregazione (esposizione ed attivazione II3 integrine, recettore per il fibrinogeno).

Nella trasduzione del segnale da parte delle molecole di adesione sono coinvolte delle tirosin chinasi, in particolare FAK e Src, sembrano essere implicate in un circuito di feedback positivo nella generazione di una serie di meccanismi:

I. Fosforilazione di proteine citoscheletriche (↑associazione), transfosforilazione tra integrina e FAK in Y397 II. Fosforilazione di enzimi (PLCγ, PIPK)

III. Autofosforilazione e fosforilazione adattatori (Cas, Crk, Shc) per il riconoscimento dei domini IV. Fosforilazione GEF (↑Rac ↓Rho)

Il CD44 partecipa alla trasduzione legando precursori di GF facilitandone la conversione nella forma attiva, organizzare complessi multi molecolari legando proteine della famiglia ERM. FANS e corticosteroidi inibiscono l’espressione di selectine su leucociti e cellule endoteliali.

12.0 Meccanismi di rilascio neurotrasmettitoriali Nella trasmissione del segnale i precursori ed i prodotti di secrezione vengono impacchettati in granuli secretivi a livello dell’apparato di Golgi e successivamente trasportati verso la membrana plasmatica. Sia neurotrasmettitori che neuro peptidi sono immagazzinati in vescicole e liberati nello spazio extracellulare in seguito all’aumento della concentrazione citosolica di calcio. I neurotrasmettitori classici sono immagazzinati in vescicole con diametro di 40-50nm, i neuro peptidi in vescicole con diametro di 100-300nm, in questo processo entrano in gioco diverse proteine:

a. Sinapsine → Interagiscono con il citoscheletro regolando il traffico delle vescicole b. Rab3, sinaptotagmine, csp, DOC2 → mediano all’ancoraggio delle vescicole c. Sinaptotagmina, rabfilina → Sono sensori di Ca2+ d. Sinaptofisine, SV2 → Biogenesi delle vescicole e. v-SNARE, sinaptobrevina → Sono proteine di fusione

Il meccanismo di rilascio può essere schematizzato in alcuni passaggi: 1. INDIRIZZAMENTO delle vescicole ed ancoraggio a zone attive della membrana presinaptica, è mediato da

proteine G monomeriche che si associano alla membrana in presenza di GTP. L’ancoraggio in prossimità dei canali calcio avviene tramite interazioni tra proteine vescicolari e proteine della membrana.

2. FORMAZIONE DEL COMPLESSO DI FUSIONE → Le sinaptobrevine formano un complesso di fusione costituito da SNARE-SINTAXINA-SNAP25 che porta le due membrane a stretto contatto.

3. INGRESSO DI CALCIO → il calcio si lega alla sinaptotagmina inducendo fusione dei foglietti lipidici e rilascio del neurotrasmettitore.

4. RIGENERAZIONE SNARE → NSF usa ATP per riassemblare il complesso rigenerando le sinaptobrevine monomeriche per futuri eventi di fusione.

Un altro meccanismo importante è quello del recupero dei neurotrasmettitori che è mediato da endocitosi dipendente da clatrina che forma delle fossette ed insieme ad altre proteine favorisce l’internalizzazione:

GTP

Ca2+

Actina

SNARE-SINTAXINA-SNAP25

Rab3

Rilascio

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13.0 Canali ionici Oltre che consentire il corretto svolgimento delle funzioni come movimento e regolazione del volume cellulare, sono responsabili della generazione e regolazione dei segnali elettrici mediante i quali le cellule sono in grado di comunicare. I canali si distinguono in base allo ione che permea ed al tipo di segnale che ne determina l’apertura. Nei canali voltaggio-dipendenti il meccanismo di innesco è la variazione del voltaggio trans membrana, i gradienti di concentrazione ed il potenziale di membrana impongono definite regole di permeazione, l’equilibrio tra le forze alle quali sono soggetti gli ioni si chiama potenziale di Nernst. Il comportamento del potenziale d’azione può essere descritto in questo modo:

1. La cellula subisce uno stimolo depolarizzante fino al valore di soglia che apre i canali Na+ voltaggio dipendenti e lo ione sodio entra nella cellula, i canali del K+ iniziano lentamente ad aprirsi

2. Il rapido ingresso di Na+ depolarizza la cellula 3. Si chiudono i canali Na+ e si aprono i canali K+ il cui ione si sposta dalla cellula al liquido extracellulare 4. Il K+ continua ad uscire della cellula iperpolarizzandola, questi canali si chiudono gradualmente così che la cellula

impiega più tempo a tornare ad uno stato di riposo. Da questo si deduce che il meccanismo principale di depolarizzazione della cellula è dovuto all’entrata di ioni Na+ e Ca2+ che restano normalmente chiusi a potenziali inferiori di -60mV, viceversa l’uscita di ioni K+ e Cl- rappresenta il principale meccanismo di iperpolarizzazione. In alcuni canali oltre allo stato chiuso-aperto esiste anche uno stato inattivo.

I canali ionici sono proteine integrali di membrana che si possono assemblare in tetrameri. La componente principale del canale è costituita da una struttura il cui peso molecolare è circa 200-250kDa, nel caso del canale del sodio, si ha una struttura composta da una singola catena α organizzata a tetramero, mentre nel caso di K+ si associano 4 distinti polipeptidi per ottenere un tetramero con lo stesso ruolo funzionale. I quattro domini del canale del sodio costituiti ciascuno da circa 300-400aa si possono considerare ad ogni effetto delle subunità, l’omologia tra i vari domini è molto alta. Questa struttura consente di recepire gli stimoli di voltaggio grazie ad un sensore che rappresenta il “cancello” di attivazione del canale. Per questo ruolo è stato preposto il segmento transmembranario S4, infatti ciascuno di questi presenta residui amminoacidici carichi positivamente (Arg o Lys) che si ripetono ad intervalli regolari.

Clatrina

Sinaptotagmina

AP180

AP2

Dinamina

Endocitosi

+30 mV

-40mV

-70mV

Soglia

Riposo Iperpolarizzazione Riposo

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13.1 I canali al sodio ed anestetici locali Questi canali sono responsabili della fase di depolarizzazione del potenziale d’azione, questi possono contribuire a determinare la soglia per la generazione dei potenziali d’azione ed influenzare il rilascio di neurotrasmettitori. Questo canale nelle regioni S5 ed S6 contiene siti di legame per tossine ed altri farmaci, la fosforilazione tramite PK-cAMO-dipendente causa riduzione del flusso ionico sia a livello cerebrale che cardiaco, mentre la fosforilazione via PKC rallenta la velocità di inattivazione nelle cellule nervose. Sono presenti diverse forme di subunità α. Questi canali sono ubiquitari, nei neuroni sono concentrati nelle terminazioni pre-sinaptiche altri, in densità post-sinaptiche. Il blocco dei canali sodio voltaggio-dipendenti è mediato da:

Anestetici locali, che bloccano i canali dei nervi periferici (Lidocaina, Benzocaina) o Il sito di legame è situato all’interno del poro ionico e gli anestetici accedono prevalentemente dal lato

intracellulare, quelli idrofilici possono legarsi soltanto quando il “cancello” è aperto mentre quelli idrofobici quando il cancello è chiuso.

Antiaritmici di classe I, che bloccano i canali cardiaci (Propranololo, Atenololo)

Anticonvulsivanti sottoclasse I che bloccano i canali dei neuroni centrali. L’interazione di questi farmaci è dipendente dallo stato in cui si trova il canale del sodio, infatti quest’ultimo assume conformazioni distinte per ogni fase del processo depolarizzazione-ripolarizzazione, ad esempio l’anestetico locale accede al canale solo quando quest’ultimo è attivato e poi ha alta affinità di legame per lo stato inattivato.

14.0 Trasmissione colinergica Il mediatore della trasmissione colinergica è l’acetilcolina, responsabile degli impulsi nervosi nelle sinapsi periferiche:

Giunzioni parasimpatico e cellule effettrici ghiandolari, pace-maker cardiache e muscolari lisce.

Giunzioni fibre simpatiche post-gangliari e ghiandole sudoripare.

Sinapsi pre e post-gangliari sistema neurovegetativo

Giunzioni simpatiche tra le fibre della ghiandola surrenale e le cellule della midollare surrenale

Terminazione dei motoneuroni spinali e le cellule muscolari striate (induce la contrazione muscolare depolarizzando la placca terminale delle giunzioni neuro-muscolari)

L’Ach è metabolizzata dalle colinesterasi di cui si conoscono alcune famiglie, i principali inibitori di queste ultime sono Fisostigmina, Neostigmina, Sarin (irreversibile) ecc.... La liberazione di acetilcolina è Ca2+-dipendente, infatti avviene in seguito a depolarizzazione. Esistono due classi di recettori colinergici:

RECETTORI NICOTINICI → Sono recettori canale permeabili a ioni Na+ e nel caso di α7 a Ca2+, possono essere attivati da Ach o da nicotina, sono soggetti a desensitizzazione in seguito all’assunzione di grandi dosi di nicotina o dopo il trattamento con bloccanti neuromuscolari di tipo depolarizzante come la succinilcolina. Si dividono in:

o Muscolari: canale di 5 subunità α, β, γ, δ, o ε, il sito di legame è sulla subunità α, sono presenti su giunzioni-neuromuscolari, i loro antagonisti sono i curari, in particolare α-bungarotossina mentre gli agonisti sono succinilcolina oltre a Ach e nAch.

o Neuronali: sono anch’essi pentameri e si possono suddividere in due grandi famiglie, quelli monomerici come gli α7 e gli eteromerici composti da α e β. I loro agonisti sono Nicotina, Epibatidina, Citisina ed i loro antagonisti sono curari, Conotossina, β-Eritroidina, sono implicati in severe patologie del cervello come processi degenerativi di memoria, depressione, ansia, schizofrenia. Questi recettori sono localizzati prevalentemente nell’SNC in gangli pre e post-sinaptici ma anche nella retina ecc….

Muscolari Neuronali

Subunità α1-β1-γ/ε-δ α7 α4-β2 α4-β4 α3-β4 α4-α6-β2 Localizzazione Neuromuscolare SNC, gangli pre

e post-sinapsi SNC, presinapsi

Abenula Gangli post SNC pre

Retina Striato Postinaptico

Ioni Na Ca Na Na Na Na Agonisti Ach,

Succinilcolina Colina Epibatidina

Nicotina Epibatidina Nicotina

Citisina Ach

Ach

Antagonisti Curaro-α-Bungarotossina

Bungarotossina β-eritroidina curaro

β-eritroidina curaro

β-eritroidina curaro

Conotossina M2

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RECETTORI MUSCARINICI → Sono recettori accoppiati a proteine G, presentano un alto grado di omologia soprattutto nella regione trans membrana con meno omologie nella regione delle anse intracitoplasmatiche. I recettori M1, M3 ed M5 stimolano la PLC inducendo la formazione di IP3 e DAG, gli M2 ed M4 interagiscono con Gi/o sensibile alla tossina della pertosse, inibendo adenilato ciclasi e stimolando PLC, inoltre aprono conduttanze di ioni K+ in entrata, inibendo Ca2+. Gli M2 sono accoppiati ad una G0 a canali potassio la cui apertura è responsabile di bradicardia dovuta ad Ach.

Nome / Tipo M1 nervoso

M2 cardiaco

M3 ghiandolare

M4 M5

Localizzazione Corteccia, ippocampo,

gangli, cellule parietali e gastriche

SNC presinaptico Ghiandole esocrine, muscoli

lisci, endotelio

SNC, polmone, utero

SNC

Agonisti Ach Ach Ach Ach Ach

Antagonisti sel. Pirenzepina Tripitramina 4-DAMP MT3 (tossina mamba

verde)

?

Trasduzione ↑IP3, DAG ↑Ca2+ intracell ↑cAMP

↓cAMP ↑Correnti K ↓Correnti Ca

↑IP3, DAG ↑Ca2+ intracell ↑cAMP

↓cAMP ↑Correnti K ↓Correnti Ca

↑IP3, DAG ↑Ca2+ intracell ↑cAMP

Proteine G q/11 i/0 q/11 i/0 q/11

Per quanto riguarda i farmaci attivi sui recettori nicotinici, la nicotina è l’unico usato su larga scala, la d-tubocurarina, l’atracurio e il vecuronio sono antagonisti competitivi, insieme alla succinilcolina sono usati in anestesia per indurre rilassamento muscolare. La galantamina è un inibitore delle colinesterasi che ha anche effetto sui nicotinici ed è utilizzata per il morbo di Alzheimer. Per i recettori muscarinici la pilocarpina è usata come miotico e per stimolare la salivazione, il cabacolo come miotico nel glaucoma, il betanecolo usato per la ritenzione urinaria e nell’ileo paralitico. Gli antagonisti sono numerosi, l’atropina, la scopolamina, sono usati come midriatici o per ridurre la secrezione gastrica, antispastici in coliche intestinali e biliari.

15.0 Trasmissione GABAergica Il GABA è il neurotrasmettitore inibitorio più diffuso, le massime concentrazioni si trovano nella sostanza nera, nell’ipotalamo, nella corteccia, nel cervelletto e nell’ippocampo. La liberazione di GABA è indotta da depolarizzazione Ca2+-dipendente. Esistono due differenti recettori per il GABA:

RECETTORE GABAB → Hanno struttura comune a recettori accoppiati a proteine G, si trovano come etero dimeri GABAB1-GABAB2, queste due subunità interagiscono mediante i domini carbossi-terminali intracellulari, formando una struttura ad α-eliche chiamata coiled coil. Si ritiene che B1 formi il sito di legame per agonisti ed antagonisti mentre B2 si accoppi alla proteina G e consenta al complesso B1-B2 di raggiungere la membrana cellulare. La proteina G appartiene alla classe Gi/o sensibili alla tossina della pertosse. I sistemi effettori di questo recettore sono ↓cAMP, ↑conduttanza K+ (a livello postsinaptico, ↓conduttanza Ca2+ (a livello presinaptico). Questi recettori inoltre sono insensibili alla bicucullina e a GABAmimetici, sono attivati in modo stereospecifico da GABA e Baclofen.

RECETTORE GABAA → Sono recettori canale permeabili agli ioni Cloro, che fissa il potenziale di membrana a quello di equilibrio del cloro che normalmente è -70mV, l’attivazione di questo recettore induce quindi iperpolarizzazione inibendo l’eccitabilità cellulare. Tuttavia in alcune terminazioni come nel midollo spinale o alcuni dendriti specifici ippocampali o corticali il Cl- è spostato verso livelli meno elettronegativi, pertanto la sua attivazione può produrre una perdita di carica negativa con conseguente depolarizzazione che genera in questo modo un potenziale d’azione per i canali Na-voltaggio-dipendenti. Il recettore GABAA è un etero pentamero che contiene siti di legame per:

Figura 10: Recettore GABA B

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Benzodiazepine ed altre molecole BZD-mimetiche, che si trova sui recettori formati dalle subunità αβγ ed è riconosciuto anche da ligandi agonisti inversi come le beta-carboline. Questo sito è riconosciuto anche da farmaci privi di attività intrinseca come antagonisti competitivi (Flumazenil).

Barbiturici e il loro antagonista, la picrotossina. Si trovano all’interno del canale per lo ione, importanza funzionale in quanto possono potenziare il flusso anche in assenza di GABA al contrario delle benodiazepine.

L’inibizione o l’attivazione di uno qualsiasi di questi siti porta conseguenze sulla capacità di interagire con altri ligandi specifici, modulando così l’attività recettoriale. Le benzodiazepine hanno siti di legame distinti da quello per il GABA pertanto fungono anch’essi da modulatori allosterici. Inoltre è stato verificato che sono sottotipi recettoriali a mediare i veri effetti delle benzodiazepine ed ogni sottotipo reagirà in modo differente.