Micrografia da luz imunofluorescente de clulas cancerosas HeLa.
A clula no centro da foto encontra-se no
estgiodeprfasedadivisocelularmittica.Oscromossomoscondensaram-seantesdesedividirparaoriginardoisncleos.
As clulas esto marcadas para mostrar os microfilamentos de actina e
os microtubos do esqueleto celular,os quais aparecem como
estruturas filamentosas ao redor do ncleo da clula. Os ncleos das
clulas so visualiza-dos pela exposio das mesmas a anticorpos
fluorescentes de estrutura especfica, preparados conectando-se
cova-lentementeasmolculasfluorescentesaosanticorposnormais.Osanticorposseaglomeramnoncleodeformaque,quandosoexpostosradiaoUV,brilhamcomomostradonafoto.Umaqumicasimilarempregadanadosagem
imunolgica descrita no Destaque 11-2.Espectroscopia deFluorescncia
MolecularCAPTULO 27Afluorescncia um processo de fotoluminescncia no
qual os tomos ou molculas so excitados porabsoro de radiao
eletromagntica (ver Figura 24-6). As espcies excitadas ento relaxam
ao esta-do fundamental, liberando seu excesso de energia como
ftons. Uma das caractersticas mais relevantesda fluorescncia
molecular est na sua sensibilidade intrnseca, a qual freqentemente
de uma a trsvezes maior que a da espectroscopia de absoro. De fato,
para determinadas espcies sob condies con-troladas, a presena de
uma nica molcula pode ser determinada pela espectroscopia de
fluorescncia.Outravantagemestnafaixalineardeconcentraodosmtodosdefluorescncia,aqualsigni-ficativamentemaiorqueaquelaencontradanaespectroscopiadeabsoro.Contudo,osmtodosde
fluorescncia so muito menos aplicados que os mtodos de absoro em
razo do nmero limitadode sistemas qumicos que fluorescem com
intensidade aprecivel. A fluorescncia est tambm sujeita
amuitosoutrosefeitosdeinterfernciaambientalqueosmtodosdeabsoro.Nestecaptulo,conside-ramos
alguns dos mais importantes aspectos dos mtodos de fluorescncia
molecular.27A TEORIA DA FLUORESCNCIA MOLECULARA fluorescncia
molecular medida excitando-se a amostra no compri-mento de onda de
absoro, tambm conhecido como comprimento deonda de excitao, e
medindo-se a emisso a um comprimento de
ondamaisaltodenominadocomprimentodeondadefluorescncia.Porexemplo,
aformareduzidadacoenzimanicotinamidaadeninadinu-cleotdeo (NADH)
pode absorver radiao a 340 nm. A molcula exibefluorescncia com
emisso mxima a 465 nm. Geralmente, a emisso fluorescente medida em
ngulo retoem relao ao feixe incidente para evitar a interferncia
desse feixe (ver Figura 25-1b). A emisso de curtaA emisso por
fluorescnciaocorre em 105s ou menos. Emcontraste, a fosforescncia
podedurar muitos minutos ou mesmohoras. A fluorescncia muitomais
empregada em anlisequmica que a fosforescncia.durao que ocorre
chamada fluorescncia, enquanto a luminescncia de maior durao
denominadafosforescncia.27A-1 Processos de RelaxaoA Figura 27-1
apresenta um diagrama parcial de nveis de energia para uma espcie
molecular hipottica.Trs nveis eletrnicos de energia so mostrados,
E0, E1e E2; E0 o estado fundamental e E1e E2so esta-dos excitados.
Cada um dos estados eletrnicos apresentado com quatro nveis
vibracionais excitados. Airradiao dessa espcie com a radiao de
banda de l1a l5(Figura 23-12a) resulta na populao momen-tnea dos
cinco nveis vibracionais do primeiro estado eletrnico excitado, E1.
De forma similar, quandoas molculas so irradiadas com uma banda de
radiao mais energtica constituda por comprimentos deonda mais
curtos de l1 a l5, os cinco nveis vibracionais de maior energia
eletrnica E2tornam-se momen-taneamente
populados.UmavezexcitadaparaE1ouE2,
muitosprocessosquecausamaperdadoexcessodeenergiadamolculapodemocorrer.Doisdosmecanismosmaisimportantes,relaxaono-radiativa
eemissofluorescente, soilustradosnaFigura 27-1b e c.
Osdoismtodosderelaxaono-radiativaquecompetemcomafluorescncia so
ilustrados na Figura 27-1b. A relaxao
vibracional,indicadapelassetascurtasonduladasentreosnveisdeenergiavibra-cionais,
ocorreduranteascolisesentreasmolculasexcitadaseasmolculas do
solvente. A relaxao no-radiativa entre os nveis
vibra-cionaismaisbaixosdeumestadoeletrnicoeosnveisvibracionaismais
altos de outro estado eletrnico tambm pode ocorrer. Esse tipo
derelaxao, algumasvezesdenominadoconversointerna, apontadopelas
duas setas onduladas longas na Figura 27-1b. A converso interna
muito menos eficiente do que a relaxao vibracional de forma que
otempodevidamdiodeestadoeletrnicoexcitadoestentre109e106s. O
mecanismo exato pelo qual esses dois processos de relaxaoocorrem
est, no momento, sob investigao, porm, o resultado lquido um
pequeno aumento na temperatura do meio.SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH
CAP. 27 Espectroscopia de Fluorescncia Molecular 783Figura 27-1
Diagrama de nveis de energia mostrandoalguns dos processos
queocorrem durante (a) absoro deradiao incidente, (b)
relaxaono-radiativa e (c) emissofluorescente por
espciesmoleculares. A absorotipicamente ocorre em 1015s,enquanto a
relaxao vibracionalacontece na escala de tempoentre 1011e 1010s.
Aconverso interna entre estadoseletrnicos diferentes tambm muito
rpida (1012s), ao passoque os tempos de vida para afluorescncia
esto tipicamenteentre 1010e 105s.4 3 2 1 04 3 2 1 04 3 2 1 04 3 2 1
0E2E1E015 151 E2E1E0E2E1E04 3 2 1
0RelaxaovibracionalConversointernaFluorescncia(a) Absoro molecular
(b) Relaxao no-radiativa (c) Fluorescncia4 3 2 1 04 3 2 1 04 3 2 1
04 3 2 1 0EnergiaA converso interna um tipo derelaxao que envolve a
transfernciado excesso de energia das espciespresentes no estado
vibracional demais baixa energia de um estadoeletrnico excitado
para as molculasdo solvente e a converso das espcies excitadas para
um estadoeletrnico mais baixo.A relaxao vibracional envolve
atransferncia do excesso de energiade uma espcie excitada
vibracionalmente para as molculasdo solvente. Esse processo
ocorreem menos de 1015s e deixa asmolculas no estado
vibracionalmais baixo de um estado eletrnico
excitado.AFigura27-1cilustraoprocessoderelaxaoquesedeseja:
oprocesso fluorescente. Quase sempre, a fluorescncia observada a
par-tir do estado excitado eletrnico mais baixo E1para o estado
fundamen-talE0.Tambm, geralmente,
afluorescnciaocorresomentedonvelvibracionalmaisbaixodeE1paravrios
nveis vibracionais de E0. Isto porque os processos de converso
interna e a relaxao vibracionalso muito rpidos quando comparados
com a fluorescncia. Portanto, um espectro de fluorescncia con-siste
normalmente em uma nica banda com muitas linhas prximas que
representam as transies do esta-do vibracional mais baixo de E1para
os muitos nveis vibracionais diferentes de
E0.AlinhamostradanaFigura27-1cquedefineoladodabandadefluorescncianocomprimentodeondamaiscurto,
oudeenergiamaisalta,
(l1)idnticaemenergialinharotuladadel1nodiagrama de absoro
apresentado na Figura 27-1a. Uma vez que as linhas de fluorescncia
nessa banda originam-senoestadovibracionalmaisbaixodeE1,
todasasoutraslinhasnabandasodemenorenergia, oudemaior comprimento
de onda, que a linha correspondente a l1. As bandas de fluorescncia
molecular
soconstitudasporlinhasqueapresentamcomprimentodeondamaior,menorfreqncia,
eassimdemenorenergia, queabandaderadiaoabsorvida para sua excitao.
Esse deslocamento para os comprimentosde onda mais longos
denominado deslocamento Stokes.Relao entre os Espectros de Excitao
e de FluorescnciaEm razo do fato de as diferenas de energia entre
os estados excitados vibracionais serem as mesmas paraambos os
estados fundamental e excitado, o espectro de absoro, ou espectro
de excitao, e o espectrode fluorescncia para um composto
freqentemente se mostram como imagens aproximadamente especu-lares
(de espelho) um do outro com sobreposio ocorrendo prximo transio de
origem (nvel
vibra-cional0deE1paraonvelvibracional0deE0).Esseefeitodemonstradopeloespectrodoantracenoexposto
na Figura 27-2. H muitas excees a essa regra da imagem especular,
particularmente quando os784 FUNDAMENTOS DE QUMICA ANALTICA EDITORA
THOMSONAs bandas de fluorescncia consistem em um nmero grande
delinhas prximas umas das outras.A fluorescncia com deslocamento
Stokes apresentacomprimento de ondamais longoque aquele que causou
a excitao.Figura 27-2 Espectro de fluorescncia para uma soluo a 1
ppm de antraceno emlcool: (a) espectro de excitao; (b) espectro de
emisso.300 350Comprimento de onda de excitao, nmComprimento de onda
de emisso, nm400300 350(b)(a)Intensidade de fluorescnciaIntensidade
de fluorescncia400Modelo molecular para o
antraceno.estadosexcitadoefundamentalapresentamgeometriasmolecularesdiferentesouquandoasbandasdefluorescncia
se originam de partes diferentes da molcula.27A-2 Espcies
FluorescentesComo mostrado na Figura 27-1, a fluorescncia um dos
muitos mecanismos pelos quais a molcula retor-na ao seu estado
fundamental original aps ter sido excitada pela absoro de radiao.
Todas as molcu-lasabsorventesapresentampotencialparafluorescerem,
contudo,muitoscompostosnoofazemporquesuasestruturasprovemcami-nhosparaarelaxaono-radiativamaisrpidaqueaemissofluo-rescente.
O rendimento quntico de fluorescncia molecular simples-mente a razo
entre o nmero de molculas que fluorescem e o
nmerototaldemolculasexcitadas, ouarazoentreosftonsemitidoseosftons
absorvidos. As molculas que fluorescem intensamente, como
afluorescena, apresentameficinciasqunticasqueseaproximamdaunidade
sob certas condies. As espcies no fluorescentes
apresentameficincias essencialmente iguais a zero.Fluorescncia e
EstruturaOscompostosquecontmanisaromticosapresentamemissofluo-rescente
mais intensa e mais til. Enquanto certos compostos
carbonli-cosalicclicosealifticos,
bemcomoasestruturasdeligaesduplasaltamente conjugadas, tambm
fluorescem, existem muito pouco
dessescompostoscomparando-secomonmerodecompostosquecontmanis
aromticos e que fluorescem.Muitos hidrocarbonetos aromticos no
substitudos fluorescem emsoluo com uma eficincia quntica que
aumenta com o nmero de anise seu grau de condensao. Os
heterocclicos mais simples, como a piridi-na, o furano, o tiofeno e
o pirrol, no apresentam fluorescncia molecular(Figura 27-3), porm
as estruturas com anis fundidos que contm
essesanisfreqentementefluorescem(Figura27-4).Asubstituionoanelaromtico
causa um deslocamento do comprimento de onda mximo
deabsoroealteraescorrespondentesnospicosdefluorescncia. Almdisso, a
substituio no anel geralmente afeta a eficincia da fluorescn-cia.
Esses efeitos so demonstrados pelos dados da Tabela 27-1.Efeito da
Rigidez EstruturalExperimentos mostram que a fluorescncia
particularmente favorecidaem molculas rgidas. Por exemplo, sob
condies similares, a eficinciaquntica do fluoreno aproximadamente
igual a 1,0, enquanto aquela dabifenila de cerca de 0,2 (Figura
27-5). A diferena de
comportamentooresultadodoaumentoderigidezdeterminadopelogrupopontemetilenopresentenofluoreno.Essarigidezdiminuiavelocidadedarelaxaono-radiativa
ao ponto em que a relaxao por fluorescnciatenha tempo de ocorrer.
Existem muitos outros exemplos similares dessetipo de
comportamento. Alm disso, freqentemente, uma
intensificaodafluorescnciaresultadaabsorodecorantesfluorescentessobresuperfcies
slidas; nesse caso, novamente, o acrscimo de rigidez incor-porado
pelo slido pode ser responsabilizado pelo efeito observado.A
influncia da rigidez tambm explica o aumento da fluorescncia
decertosagentesorgnicosquelantesquandoestessocomplexadoscomSKOOG,
WEST, HOLLER, CROUCH CAP. 27 Espectroscopia de Fluorescncia
Molecular 785Figura 27-3 Molculas aromticastpicas que no
fluorescem.HOSpiridina furanoNNtiofeno pirrolFigura 27-4
Compostosaromticos tpicos que
fluorescem.quinolinaNHNisoquinolinaindolNAs molculas ou
complexosrgidos tedem a fluorescer.Muitos compostos
aromticosno-substitudos fluorescem.A eficincia quntica descritapelo
rendimento quntico de fluorescncia, F.Fem que kF a constante de
velocidade de primeira ordem paraa relaxao por fluorescncia e
knrcorresponde constante de velocidade para a relaxao no-radiativa.
Ver o Captulo 29para uma discusso sobre as constantes de
velocidade.kFkF knronsmetlico.Porexemplo,
aintensidadedefluorescnciada8-hidroxi-quinolina muito menor que a
do seu complexo com zinco (Figura 27-6).Efeito da Temperatura e do
SolventeEmmuitasmolculas,
aeficinciaqunticadafluorescnciadecrescecomoaumentodatemperatura,
porque, atemperaturaselevadas, oaumento da freqncia de colises leva
maior probabilidade de
relaxa-ocolisional.Umadiminuiodaviscosidadedosolventelevaaomesmo
resultado.EFEITO DA CONCENTRAO NA 27B INTENSIDADE DE FLUORESCNCIAA
potncia da radiao fluorescente F proporcional potncia do feixede
excitao absorvido pelo sistema:F K(P0P)
(27-1)emqueP0apotnciadofeixeincidentesobreasoluoeP, asuapotncia aps
ter percorrido um comprimento b do meio. A constante
Kdependedaeficinciaqunticadafluorescncia.ParacorrelacionarFcomaconcentraoc
dapartculafluorescente, escrevemosaleideBeer na seguinte
forma10ebc(27-2)na qual e a absortividade molar da espcie
fluorescente e ebc, a absor-bncia A. Substituindo-se a Equao 27-2
na Equao 27-1, obtemosF KP0(1 10ebc) (27-3)A expanso do termo
exponencial da Equao 27-3 leva aF KP02,3ebc (27-4)Quando ebc A 6
0,05, o primeiro termo dentro dos colchetes, 2,3ebc, muito maior
que os termos subseqentes e podemos escreverF 2,3KebcP0(27-5)ou,
quando a potncia incidente P0for constante,F Kc (27-6)Assim, um
grfico da potncia de fluorescncia de uma soluo versus aconcentrao
das espcies emissoras deve ser linear para baixas
concen-traes.Quandoc
torna-sealtaosuficienteparaqueaabsorbnciasejamaiorque0,05(ouatransmitnciamenorquecercade0,9),
arelaorepresentada pela Equao 27-6 torna-se no-linear e F situa-se
abaixo
daextrapolaodapartelineardogrfico.Esseefeitoresultadaabsoroprimria,
na qual a radiao incidente absorvida to intensamente
queafluorescncianomaisproporcionalconcentraocomomostradodp(2,3ebc)33!(2,3ebc)22!cPP0786
FUNDAMENTOS DE QUMICA ANALTICA EDITORA THOMSONTABELA 27-1Efeito da
Substituio sobrea Fluorescncia de Derivadosdo Benzeno*Intensidade
RelativaComposto da FluorescnciaBenzeno 10Tolueno 17Propilbenzeno
17Fluorbenzeno 10Clorobenzeno 7Bromobenzeno 5Iodobenzeno 0Fenol
18on fenolato 10Anisol 20Anilina 20on anilnico 0cido benzico
3Benzonitrila 20Nitrobenzeno 0*Em soluo de etanol. Extrado da
obrade W. West, Chemical Applications ofSpectroscopy, Techniques of
OrganicChemistry, v. IX, p. 730. Nova York:Interscience,
1956.Figura 27-5 Efeito da rigidezmolecular sobre o
rendimentoquntico. A molcula do fluoreno mantida rgida pelo anel
central, osdois anis benznicos da bifenilapodem girar um em relao
ao outro.fluoreno 1bifenila 0,2CH2Figura 27-6 Efeito da rigidez
norendimento quntico em complexos.As molculas livres de
8-hidroxiquinolina em soluo sofacilmente desativadas por meio
decolises com as molculas do solventee no fluorescem. A rigidez
docomplexo Zn-8-hidroxiquinolinaintensifica a
fluorescncia.no-fluorescenteOHNfluorescenteZn2ON ) (pela Equao 27-4
mais completa. A concentraes muito altas, F atingeum mximo e pode
mesmo comear a decrescer com o aumento da
con-centraodevidoabsorosecundria.Essefenmenoocorreporcausadaabsorodaradiaoemitidaporoutrasmolculasdoanalito.Um
grfico tpico de F versus a concentrao exibido na Figura
27-7.Observe que os efeitos primrios e secundrios, algumas vezes
denomi-nadosefeitosdefiltrointerno, podemtambmocorreremrazodaabsoro
por outras molculas presentes na matriz da amostra.27C INSTRUMENTOS
PARA
FLUORESCNCIAExistemmuitostiposdiferentesdeinstrumentosparamedidasdefluo-rescncia.
Todos seguem o diagrama de blocos da Figura 25-1b. Os
dia-gramaspticosdeinstrumentostpicossoapresentadosnaFigura
27-8.Seosdoisseletoresdecomprimentodeondaforemmonocro-madores, o
instrumento um espectrofluormetro. Alguns instrumentosso hbridos e
empregam um filtro de excitao com um monocromador120 100 80 60 40
200 2 4Concentrao, (mol L1) 1076 8Potncia fluorescente relativa,
FSKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH CAP. 27 Espectroscopia de Fluorescncia
Molecular 787Figura 27-8 Instrumentos tpicospara fluorescncia.Um
fluormetro defiltro mostrado em (a). Observe queas emisses so
medidas em nguloreto em relao fonte da lmpada dearco de mercrio. A
radiao fluorescente emitida em todas asdirees e a geometria de
90oevita aobservao da fonte pelo detector. O espectrofluormetro (b)
empregadois monocromadores com grades etambm observa a emisso em
nguloreto. Os dois monocromadores permitem a varredura do espectro
deexcitao (o comprimento de onda de excitao varrido a um
comprimento de onda de emissofixo), do espectro de emisso(varredura
do comprimento de onda de emisso a um comprimento de onda de
excitao fixo) ou de umespectro sncrono (varredura de ambosos
comprimentos de onda com uma diferena fixa entre os dois
monocromadores).Lmpada de arcode mercrioLentes dequartzo ou
vidroAberturas paraa definio do feixe de luzFiltro
deexcitaoSuperfcie absorvedorade luzMonocromador de excitaoFiltro
deemissoFeixe defluorescncia (a)(b)Dispositivo de
leituraDispositivode leituraClulaFeixe de
excitaoFonteTransdutorClula daamostraMMonocromador de excitaoFigura
27-7 Curva de calibraopara determinao espectrofluorimtricade
triptofano em protenas solveis deum cristalino de olho de
mamfero.para a emisso. Os instrumentos para fluorescncia podem
incorporar um esquema de feixe duplo para com-pensar por flutuaes
na potncia da fonte radiante com o tempo e com o comprimento de
onda. Os instru-mentos que corrigem pela distribuio espectral da
fonte so denominados espectrofluormetros corrigidos.As fontes para
fluorescncia so geralmente mais potentes que as fontes tpicas para
a absoro. Emfluorescncia,
apotnciaradianteemitidadiretamenteproporcionalintensidadedafonte(Equao
27-5), masaabsorbncia, pelofatodeestaserrelacionadarazodaspotncias,
comomostradonaEquao 27-7, essencialmente independente da
intensidade da fonte.c kA k log(27-7)Como resultado dessas
diferenas sobre a dependncia da intensidade dafonte, os mtodos de
fluorescncia so geralmente de uma a trs
ordensdegrandezamaissensveisqueosmtodosbaseadosemabsoro. Aslmpadas
de arco de mercrio, as lmpadas de arco de xennio-mercrioe os lasers
so as fontes tpicas para a fluorescncia. Os monocromadores e os
transdutores so tipicamentesimilares queles empregados nos
espectrofotmetros de absoro, exceto pelo fato de que as
fotomultipli-cadoras so empregadas invariavelmente nos
espectrofluormetros de alta sensibilidade. Os fluormetros e
osespectrofluormetrosvariamamplamentenascaractersticasdesofisti-cao,
de desempenho e de custo, como o fazem os espectrofotmetros
deabsoro.Emgeral, osinstrumentosparafluorescnciasomaiscarosque os
instrumentos de absoro de qualidade correspondente.APLICAES DOS
MTODOS27D DE
FLUORESCNCIAAespectroscopiadefluorescncianoconsideradaumaferramentaimportanteparaaanliseestruturalouqualitativa,
poisasmolculascompequenasvariaesestruturaisfreqentementeapresentamespec-tros
de fluorescncia similares. Tambm, as bandas de fluorescncia
emsoluosorelativamentelargastemperaturaambiente.Contudo,
afluorescncia tem demonstrado ser uma ferramenta valiosa na
identifi-cao de derramamentos de petrleo. A fonte de um
derramamento de
pe-trleopodesvezesseridentificadaporcomparaodoespectrodeemisso de
fluorescncia de uma amostra do derramamento com um dafonte
suspeita. A estrutura vibracional dos hidrocarbonetos
policclicospresentes no petrleo torna esse tipo de identificao
possvel.Os mtodos de fluorescncia so empregados para se estudar
equi-lbriosqumicosecinticadamesmaformaqueosmtodosespec-tromtricos
de absoro. Freqentemente possvel estudar-se as reaesqumicas a
menores concentraes em decorrncia da alta sensibilidadedos mtodos
de fluorescncia. Em muitos casos, nos quais a monitoraoda
fluorescncia no exeqvel de forma ordinria, as sondas fluores-centes
ou marcadores podem ser ligados covalentemente a stios espec-ficos
em molculas, como as protenas, tornando-as assim detectveis
viafluorescncia.Essesmarcadorespodemserutilizadosparafornecerinformaes
sobre a energia de processos de transferncia, sobre a
polari-dadedaprotenaesobreadistnciaentreosstiosreativos(ver,
porexemplo, o Destaque 27-1).aP0Pb788 FUNDAMENTOS DE QUMICA
ANALTICA EDITORA THOMSONOs mtodos baseados em fluorescncia so 10 a
1.000 vezesmais sensveis que os mtodos de absoro.Figura 27-9 Alguns
agentes quelantes fluorimtricos para ctionsmetlicos. A alizarina
garnet R podedetectar Al3+em nveis to baixosquanto 0,007 mg/mL. A
deteco deFcom a alizarina garnet R baseadana supresso da
fluorescncia do complexo com o Al3+. O flavanol podedetectar o
Sn4+no nvel de 0,1 mg/mL.H8-hidroxiquinolina(reagente para Al, Be
eoutros ons metlicos)alizarina garnet R(reagente para Al, F)NC
COOOOH OHOH HOSO3NaHOHO N Nflavanol(reagente para Zr e
Sn)benzona(reagente para B, Zn, Ge e Si)SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH
CAP. 27 Espectroscopia de Fluorescncia Molecular
789Osindicadoresfluorescentestmsidoampla-menteempregadoscomosondasdeeventosbiolgicos
em clulas isoladas. Uma sonda parti-cularmenteinteressantea,
assimdenominada,sonda de on, que altera seu espectro de emisso ede
excitao quando ligada a ons como o Ca2+ouNa+. Esses indicadores
podem ser utilizados pararegistrar eventos que ocorrem em
diferentes partesdeneurniosisoladosouparamonitorarsimul-taneamente
a atividade de um grupo de neurnios.Em neurobiologia, por exemplo,
o corante
Fura-2temsidoempregadoparamonitoraraconcen-traodeclciolivreintracelularqueacompa-nhaumestmulofarmacolgicooueltrico.Acompanhandoasmudanasdefluorescnciacom
o tempo em stios especficos no neurnio, ospesquisadores podem
determinar quando e onde oevento eltrico dependente do clcio
ocorre. UmaclulaquetemsidoestudadaadoneurnioPurkinjedocerebelo,
queumdosmaioresdosistema nervoso central. Quando essa clula
car-regadacomoindicadorfluorescenteFura-2, asalteraes bem definidas
de fluorescncia podemser medidas em correspondncia ao do
poten-cialindividualdeclcio.Asmudanassocor-relacionadascomstiosespecficosnaclulapormeiodetcnicasdefluorescnciadeimagem.
AFigura27D-1mostraaimagemdefluorescncia direita juntamente com os
transientes de fluores-cncia,
registradoscomoaalteraonafluo-rescnciarelativafluorescnciaestacionria
F/F,
correlacionadacomasvariaesabruptasnaaodopotencialdosdio.Ainterpretaodesse
tipo de padres pode ter importantes impli-caes na compreenso dos
detalhes da atividadesinptica.Uso de Sondas Fluorescentes em
Neurobiologia: Investigando a Mente IluminadaDESTAQUE27-150%F/F50
mV01 sddpp ssFigura 27D-1 Transientes de clcio em uma clula
cerebelar Purkinje. A imagem direita da clula preenchida com
ocorante fluorescente, que responde concentrao de clcio. Os
transientes de fluorescncia so mostrados acima, esquerda,como
registrados para as reas d, p e s na clula. Os transientes na regio
d correspondem regio do dendrito da clula. Os sinais especficos
para clcio podem ser correlacionados com a ao do potencial
apresentado esquerda, embaixo. (De V. Lev-Ram, H. Mikayawa, N.
Lasser-Ross, W. N. Ross, J. Neurophysiol., 1992, v. 68, p. 1170.
Com permisso daAmerican Physiological
Society).Josmtodosquantitativosbaseadosemfluorescnciatmsidodesenvolvidosparaasespciesinorgnicas,
orgnicas e bioqumicas. Os mtodos fluorescentes inorgnicos podem ser
divididos em duasclasses: mtodos diretos, que so baseados na reao
do analito com um agente complexante para formarum complexo
fluorescente; e indiretos, que dependem do decrscimo da
fluorescncia, tambm denomi-nado supresso (quenching), resultante da
interao do analito com o reagente fluorescente. Os
mtodosdesupressosousadosprimariamenteparaadeterminaodenionseoxigniodissolvido.Algunsreagentes
fluorescentes para ctions so mostrados na Figura
27-9.Arelaxaono-radiativadequelatosdemetaldetransiotoeficientequeessasespciesrara-mente
fluorescem. importante notar que a maioria dos metais de transio
absorve na regio do UV evisvel, enquanto os ons de metais que no so
de transio no o fazem. Por essa razo, a fluorescncia freqentemente
considerada complementar absoro para a determinao de ctions.O nmero
de aplicaes dos mtodos de fluorescncia a problemas orgnicos e
bioqumicos impres-sionante. Entre os tipos de compostos que podem
ser determinados por fluorescncia esto os aminoci-dos, protenas,
coenzimas, vitaminas, cidosnuclicos, alcalides, porfirinas,
esterides, flavonidesemuitos metablitos.1Em razo de sua
sensibilidade, a fluorescncia amplamente empregada como
tc-nicadedetecoemmtodosdecromatografialquida(verCaptulo32), em
anlise em fluxo e em eletroforese. Alm dos mtodos que
es-tofundamentadosnaintensidadedefluorescncia, hmuitosoutros
queestobaseadosnamedidadotempodevidadafluorescncia.Muitosinstrumentosforamdesenvolvidosparafornecerimagensmi-croscpicas
de espcies com base no tempo de vida de fluorescncia.227D-1 Mtodos
para Espcies InorgnicasOs reagentes mais bem-sucedidos para a
determinao de ctions so
oscompostosaromticoscontendodoisoumaisgruposfuncionaisqueformam
quelatos com o on metlico. Um exemplo tpico a 8-hidro-xiquinolina,
cujaestruturadadanaSeo12D-3.AlgunsoutrosreagentesfluorimtricosesuasaplicaespodemserencontradosnaTabela27-2.Comamaioriadessesreagentes,
octionextradoemuma soluo do reagente em um solvente orgnico
imiscvel, tal como790 FUNDAMENTOS DE QUMICA ANALTICA EDITORA
THOMSON1Ver, por exemplo, O. S. Wolfbeis, in Molecular Luminescence
Spectroscopy: Methods & Applications Parte I, Captulo 3, S. G.
Schulman, Ed.Nova York, Wiley-Interscience, 1985.2Ver J. R.
Lakowicz, H. Szmacinski, K. Nowacyzk, K. Berndt e M. L. Johnson, in
Fluorescence Spectroscopy: New Methods and Applications,Captulo 10,
O. S. Wolfbeis, Ed. Berlim: Springer-Verlag, 1993.Alguns dos
hidrocarbonetosaromticos policclicos encontradosem derramamentos de
petrleo soo criseno, o perileno, o pireno, ofluoreno e o
1,2-benzofluoreno. A maioria desses compostos carcinognica.Modelo
molecular do pireno.TABELA 27-2Mtodos Fluorimtricos Selecionados
para Espcies Inorgnicas*Comprimento de onda, nmsensibilidade,on
Reagente Absoro Fluorescncia mg/mL InterfernciasAl3Alizarina garnet
R 470 500 0,007 Be, Co, Cr, Cu, F, NO3, Ni, PO34, Th, ZrFComplexo
de alizarina 470 500 0,001 Be, Co, Cr, Cu, Fe, Ni, PO34, Th,
Zrgarnet R com alumnio(supresso)B4O72Benzona 370 450 0,04 Be,
SbCd22-(o-Hidroxifenil)- 365 Azul 2
NH3benzoxazolLi8-Hidroxiquinolina 370 580 0,2 MgSn4Flavanol 400 470
0,1 F, PO34, ZrZn2Benzona Verde 10 B, Be, Sb, ons coloridos*De J.
A. Dean, Analytical Chemistry Handbook, Nova York, McGraw-Hill,
1995, p. 5,605,62.o clorofrmio. A fluorescncia da soluo orgnica ,
ento, medida. Para um resumo mais completo sobreos mtodos
fluorimtricos para a determinao de substncias inorgnicas, ver o
manual escrito por
Dean.3Arelaxaono-radiativadequelatosdemetaldetransiotoeficientequeessasespciesrara-mente
fluorescem. importante observar que a maioria dos metais de transio
absorve na regio do UVe visvel, enquanto os ons de metais que no so
de transio no o fazem. Por essa razo, a fluorescn-cia freqentemente
considerada complementar absoro para a determinao de ctions.27D-2
Mtodos para Espcies Orgnicas e BioqumicasO nmero de aplicaes de
mtodos fluorimtricos a problemas orgnicos impressionante. Dean
resumeasaplicaesmaisimportantesemumatabela.4Maisde200entradassoencontradassobocabealhoEspectroscopiadeFluorescnciade
AlgunsCompostosOrgnicos, incluindovrioscompostoscomoadenina, cido
antranlico, hidrocarbonetos policclicos aromticos, cistena,
guanina, isoniazida, naftis,gasesdenervosarinetabun, protenas,
cidosaliclico, escatol, triptofano,
cidoricoevarfarina(Coumadin).Muitosagentesmedicinaisquepodemserdeterminadosfluorimetricamentesolistados,incluindo
a adrenalina, morfina, penicilina, fenobarbital, procana, reserpina
e cido lisrgico dietilamida(LSD). Sem sombra de dvida, a mais
importante aplicao da fluorimetria est na anlise de produtos
ali-mentcios, frmacos, amostras clnicas e produtos naturais. A
sensibilidade e seletividade do mtodo o
tor-namumaferramentaparticularmentevaliosanessescampos.Umaquantidadenumerosadecompostosfisiologicamente
importantes fluorescem.27E ESPECTROSCOPIA DE FOSFORESCNCIA
MOLECULARA fosforescncia um fenmeno de fotoluminescncia bastante
similar fluorescncia. A compreenso dadiferena entre esses dois
fenmenos requer a compreenso do spin eletrnico e da diferena entre
o estadosingleto e o estado tripleto. As molculas comuns que no
sejam radicais livres existem no estado funda-mental com seus spins
de eltrons emparelhados. Um estado eletrnico molecular no qual
todos os spins
doseltronsestoemparelhadosdenominadoestadosingleto.Oestadofundamentaldeumradicallivre,
poroutro lado, um estado dubleto, porque o eltron pode assumir duas
orientaes em um campo magntico.Quando um eltron de um par de
eltrons excitado em uma molcula para um nvel de energia maisalto,
um estado singleto ou tripleto pode ser produzido. No estado
excitado singleto, o spin do eltron pro-movido ainda oposto quele
do eltron que permaneceu no nvel fundamental. No estado tripleto,
contu-do, os spins dos dois eltrons tornam-se desemparelhados,
sendo ento paralelos. Esses estados podem serrepresentados como
ilustrado na Figura 27-10. O estado excitado tripleto menos
energtico que o estadoexcitado singleto correspondente.SKOOG, WEST,
HOLLER, CROUCH CAP. 27 Espectroscopia de Fluorescncia Molecular
7913J. A. Dean, Analytical Chemistry Handbook, p. 5,60-5,62. Nova
York: McGraw-Hill, 1995.4J. A. Dean, Analytical Chemistry Handbook,
p. 5,63-5,69. Nova York: McGraw-Hill, 1995.Figura 27-10 Estados de
spin eletrnico dasmolculas. Em (a) apresentado o estado eletrnico
fundamental. No estado de menor energiaou fundamental, os spins so
sempre emparelhados eo estado dito ser do tipo singleto. Em (b) e
(c) somostrados os estados eletrnicos excitados. Se osspins
permanecem emparelhados no estado excitado,a molcula est no estado
singleto (b). Se os spinstornam-se desemparelhados, a molcula est
em umestado excitado tripleto (c).Estado excitadosingleto(b)Estado
excitadotripleto(c)Estado
fundamentalsingleto(a)Afluorescnciaemmolculasenvolveatransiodeumestadoexcitadosingletoparaoestadofundamentalsingleto.Essatransioaltamente
provvel e, assim, o tempo de vida do estado excitado
single-tomuitocurto(105soumenos).Afosforescnciamolecular,
poroutrolado, envolveatransiodeumestadoexcitadotripletoparaoestado
fundamental singleto. Em virtude de essa transio alterar o
spineletrnico, ela menos provvel. Portanto, um estado tripleto
apresentaum tempo de vida mais longo (tipicamente, 104a 104s). As
substn-cias fosforecentes slidas so empregadas para recobrir a tela
de tubosderaioscatdicos,
sendoresponsveispelahabilidadedeseobservaraaodefeixesdeeltronsemmuitos
osciloscpios, televisores e monitores de
computadores.Otempodevidalongodafosforescnciatambmumadesuaslimitaes.Emdecorrnciadesselongotempo,
osprocessosno-radiativospodemcompetircomafosforescnciaparadesativaroestadoexcitado.
Assim, a eficincia do processo fosforescente e a intensidade
correspondente da
fosforescnciasorelativamentebaixas.Paraaumentaressaeficincia,
afosforescncianormalmenteobservadaabaixastemperaturasemmeiorgido,
comovidros.Nosanosmaisrecentes, a fosforescncia temperatura
ambiente tem-se tornado popu-lar.Nessatcnica,
amolculaabsorvidasobreumasuperfcieslidaou encerrada em uma cavidade
molecular (micela ou em uma cavidadede ciclodextrina), a qual
protege o frgil estado tripleto.Por causa de sua fraca intensidade,
a fosforescncia muito menosaplicada que a fluorescncia. Contudo, a
fosforimetria tem sido empre-gada para a determinao de uma
variedade de compostos orgnicos ebioqumicos, incluindo cidos
nuclicos, aminocidos, pirino, pirimidi-na, enzimas, hidrocarbonetos
policclicos e pesticidas. Muitos
compos-tosfarmacuticosexibemsinaisdefosforescncia.Ainstrumentaopara
fosforescncia tambm um pouco mais complexa que para
fluo-rescncia.Geralmenteuminstrumentoparafosforescnciapermiteadiscriminaoentreafosforescnciaeafluorescnciapeloatrasodamedidadafosforescnciaatqueafluorescnciatenhadecadoprxi-moazero.Muitosinstrumentosparafluorescnciaapresentamumacessrio,
chamadofosforoscpio, quepermitequeomesmoinstru-mento seja empregado
para as medidas de fosforescncia.27F MTODOS DE QUIMIOLUMINESCNCIAA
quimioluminescncia produzida quando uma reao produz uma molcula
eletronicamente excitada,a qual emite luz para retornar ao estado
fundamental. As reaes quimioluminescentes so encontradas
eminmerossistemasbiolgicos,
nosquaisoprocessofreqentementedenominadobioluminescncia.Exemplosdeespciesqueexibembioluminescnciaincluemovaga-lume,
opepino-do-mar, algumasmedusas, bactrias,
protozoriosecrustceos.Umacaractersticainteressantedaquimioluminescnciaparafinsanalticosestnasimplicidadedainstrumentao.Umavezquene-nhuma
fonte externa necessria para a excitao, o instrumento
podeserconstitudosomenteporumfrascodereaoeporumtubofoto-multiplicador.Emgeral,
nenhumdispositivodeseleodocompri-mento de onda necessrio porque a
nica fonte de radiao a reaoqumica.792 FUNDAMENTOS DE QUMICA
ANALTICA EDITORA THOMSONNo-polarNo-polarMicela em solvente
no-aquosoPolarPolarMicela em solvente aquosoO vaga-lume produz luz
por meio do fenmeno de bioluminescncia. As espciesdiferentes de
vaga-lumes piscamcom ciclos de tempo ligado-desligado diferentes.
Os vaga-lumesse cruzam somente com os de suaespcie. A reao
bioluminescenteque nos mais familiar ocorrequando um vaga-lume est
procurando por um parceiro.Estrutura das micelas.Na fosforescncia
temperaturaambiente, o estado tripleto do analito pode ser
protegido por suaincorporao em um agregado tensoativo denominado
micela. Em solues aquosas o agregadoapresenta um ncleo
no-polardevido repulso dos grupospolares. O oposto ocorre em
solventes
no-polares.Osmtodosdequimioluminescnciasoconhecidospelasuaaltasensibilidade.
Os limites de deteco tpicos esto na faixa de partes
pormilhoapartesporbilhooumenores.Asaplicaesincluemade-terminaodegases,
taiscomoosxidosdenitrognio, oznio,
com-postosdeenxofre;adeterminaodeespciesinorgnicas,
comooperxidodehidrognioealgunsonsmetlicos;tcnicasdeimunoen-saio;
sondas para a dosagem de DNA; e mtodos para a reao de cadeiade
polimerase.5SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH CAP. 27 Espectroscopia de
Fluorescncia Molecular 793Utilizeseunavegadorde
Webparaconectar-sepginadolivronositehttp://www.thomsonlearning.com.br.
Noitemmaterialsuplementarparaestudantes, cliqueemResources
eescolhaWeb Works.LocalizeaseoChapter
27ecliquenaconexocomoUKNationalPhysicalLaboratorysNationalReferenceSpectrofluorimeter
Esseinstrumentoempregaummonocromadordevarreduraparaexcitao.Oqueeleusaparaaemisso?Qualavantagemdessearranjo?
Aqualngulo, comrespeito radiao incidente, a emisso da amostra
coletada? Qual aresoluo do detector em nanmetros por elemento? Para
qual propsito
oUKNPLutilizaessefluormetro?UseoGoogleparaencontraroutrosespectrofluormetros
na Web e compare suas especificaes e caractersti-cas com aquelas do
instrumento do UK NPL.EXERCCIOS NA WEB5 Ver, por exemplo, T. A.
Nieman, in Handbook of Instrumental Techniques for Analytical
Chemistry, Captulo 27, F. A. Settle, Ed. Upper SaddleRiver, NJ:
Prentice-Hall, 1997.Muitos analisadores comerciaispara a determinao
de gases sobaseados em quimioluminescncia.O xido ntrico (NO) pode
serdeterminado pela sua reao com o oznio (O3). A reao converte oNO
em NO2, excitado, com a subseqente emisso de luz.27-1. Descreva
brevemente ou defina*(a) fluorescncia de ressonncia.(b) relaxao
vibracional.*(c) converso interna.(d) fluorescncia.*(e)
deslocamento Stokes.(f) rendimento quntico.*(g) auto-supresso
(self-quenching).27-2. Porqueaespectrofluorimetriapotencial-mente
mais sensvel que a espectrofotometria?27-3. Quais compostos dos
seguintes pares espera-se que apresente maior rendimento qunticode
fluorescncia? Explique.bis(o-hidroxifenil) hidrazinaNOH HONH
Ho,o-diidroxiazobenzenoNOH HON(b)COHCO2HO
OfluorescenaCOHCO2HOfenolftalena*(a)QUESTES E PROBLEMAS27-4.
Porquealgunscompostosfluorescemeoutros no?*27-5. Descreva as
caractersticas dos compostosorgnicos que fluorescem.27-6.
Expliqueporqueafluorescnciamole-cularsempreocorreacomprimentosdeonda
mais longos que o da radiao de ex-citao.27-7.
Descrevaoscomponentesdeumfluor-metro.*27-8.
Porqueamaioriadosinstrumentosdefluorescnciaapresentaodesenhodedu-plo
feixe?27-9. Porqueosfluormetrossomaisteis
queosespectrofluormetrosemanlisequantitativa?27-10.
Aformareduzidadanocotinamidaadeni-na dinucleotdeo (NADH) uma
coenzimaimportante e altamente fluorescente.
Apre-sentaumaabsoromximaa340nmeummximodeemissoa465nm.AssoluespadrodeNADHforneceramasseguintes
intensidades de fluorescncia:Concn NADH, Intensidademmol/L
Relativa0,100 2,240,200 4,520,300 6,630,400 9,010,500 10,940,600
13,710,700 15,490,800 17,91(a)
Construaumaplanilhaeuse-aparatraarumacurvadecalibraopa-ra NADH.*(b)
Encontreainclinaoeointerceptodogrficoem(a)atravsdequadra-dos
mnimos.(c) Calcule o desvio padro da
inclinaoeodesviopadrosobrearegressopara a curva.*(d) Uma amostra
desconhecida exibe
umafluorescnciarelativade12,16.Em-pregueaplanilhaparacalcularasuaconcentrao
de NADH.*(e) Calcule o desvio padro relativo parao resultado da
parte (d).(f) Calcule o desvio padro relativo
paraoresultadodaparte(d)sealeitura12,16 for a mdia de trs
medidas.27-11. Os seguintes volumes de uma soluo
con-tendo1,10ppmdeZn2+forampipetadosemfunisdeseparaocontendo5,00mLdeumasoluodesconhecidadezinco:0,00;1,00;4,00;7,00e11,00.Cadaumadelasfoiextradacomtrsalquotasde5mLdeCCl4,
contendoexcessode
8-hidroxiquinolina.Osextratosforamdi-ludosa25,0mLeassuasfluorescnciasforammedidasemumfluormetro.Osresultados
foram:Volume de SoluoLeitura do Zn2, mL Fluormetro0,000 6,124,00
11,168,00 15,6812,00 20,64(a) Construaumacurvaanalticaapartirdos
dados.(b) Calcule a equao linear para os
dadosatravsdaregressodequadradosmnimos.(c)
Calculeodesviopadroparaaincli-nao e o desvio padro da regresso.(d)
Calculeaconcentraodezinconaamostra.(e)
Calculeodesviopadroparaoresul-tado da parte (d).*27-12. O quinino
presente em um comprimido
deantimalricodemassaiguala1,664gfoidissolvido em HCl 0,10 mol
L1suficienteparafornecer500mLdesoluo.Umaalquotade15,00mLfoientodiludaa100,0mLcomocido.
Aintensidadedefluorescnciaparaaamostradiludaa347,5 nm forneceu uma
leitura igual a 288emumaescalaarbitrria.Umasoluopadro de 100 ppm de
quinino registrou
aleiturade180quandomedidasobcondi-esidnticasquelasdaamostradiluda.Calcule
a massa em miligramas de quininono comprimido.27-13.
AdeterminaodescritanoProblema27-12 foi modificada para empregar o
mtododasadiesdepadro.Comoanterior-mente, um comprimido de 2,196 g
foi dis-solvidoemHCl0,10molL1suficienteparafornecer1,000L.
Adiluiodeumaalquotade20,00mLa100mLproduziuumasoluocomleituraiguala540a347,5
nm. Uma segunda alquota de
20,00mLfoimisturadacom10,0mLdeumasoluode50ppmdequininoantesdadiluio
a 100 mL. A intensidade de fluo-rescncia dessa soluo foi 600.
Calcule aconcentraoempartespormilhodequinino no tablete.794
FUNDAMENTOS DE QUMICA ANALTICA27-14. Problema Desafiador. Os
seguintes volu-mesdeumasoluopadrodeconcen-trao 10,0 ppb de Fforam
adicionados aquatroalquotasde10,00mLdeumaamostradegua:
0,00;1,00;2,00e3,00mL. Precisamente 5,00 mL de uma soluocontendo
excesso do complexo absorventemuito intenso Al-Alizarina Garnet R
cidaforamadicionadosacadaumadasquatrosoluese, ento,
cadaumadelasfoidi-ludaa50,0mL. Asintensidadesdefluo-rescncia para
as quatro solues foram:Vp, mL Leitura do medidor0,00 68,21,00
55,32,00 41,33,00 28,8(a) Expliqueaqumicadomtodoana-ltico.(b)
Construa um grfico dos dados.(c)
Useofatodequeafluorescnciade-cresce com o aumento do padro de
FparaderivarumarelaocomoadaEquao26-1paraasadiespadromltiplas.Utilizearelaoparaobteruma
equao para a concentrao des-conhecida cxem termos da inclinao
edointerceptodogrficodeadiesdepadro, similar da Equao 26-2.(d) Use
quadrados mnimos linear para
en-contraraequaoparaalinhaquere-presenta o decrscimo da
fluorescnciacomovolumedepadrodefluoretoVp.(e) Calcule o desvio
padro da inclinao edo intercepto.(f) Calcule a concentrao de Fna
amos-tra em ppb.(g) Calculeodesviopadroparaoresul-tado de
(e).SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH CAP. 27 Espectroscopia de
Fluorescncia Molecular 795
