Genetische Untersuchungen zur …ub-dok.uni-trier.de/diss/diss45/20030211/20030211.pdf · 4.5 Statistische Auswertung ... Restriktionsverdau ..... 48 Abb.19: Restriktionsverdau mit

Dominik Eisenbarth

Vom Fachbereich VI

(Geographie / Geowissenschaften)

der Universität Trier

zur Verleihung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium

(Dr. rer. nat.)

genehmigte Dissertation

Genetische Untersuchungen zur Fortpflanzungsstrategie von

Microtus arvalis und ihre genetische Variabilität auf unterschiedlich

genutzten Flächen

Betreuender: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Paul Müller

Berichterstattender: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Paul Müller

Berichterstattender: PD Dr. Martin Paulus

Datum der wissenschaftlichen Aussprache:

11.02.2003

Trier 2003

Inhaltsverzeichniss I

1. Einleitung ................................................................................................................. 1

2. Untersuchungsgebiete ......................................................................................... 9

2.1 Beschreibung des Untersuchungsgebietes Wahlen ............................. 9

2.1.1 Klima und Witterung in Wahlen ............................................................. 10

2.2 Beschreibung des Untersuchungsgebietes Herl .................................. 11

2.2.1 Klima und Witterung ............................................................................ 13

3. Verbreitung und Ökologie .......................................................................... 15

3.1 Systematik ........................................................................................... 15

3.2 Verbreitung .......................................................................................... 15

3.3 Morphologie und Artdifferenzierung ..................................................... 17

3.4 Ökologie ............................................................................................... 19

4. Material und Methoden ...................................................................................... 21

4.1 Material ......................................................................................................... 21

4.1.1 Puffer und Lösungen für Multilocus-

DNA Fingerprinting und RAPD-PCR

............................................................

21

4.1.2 Enzyme und Längenstandards für

Multilocus-DNA Fingerprinting und RAPD-PCR

...................................................

24

Inhaltsverzeichniss II

4.1.3 Primer für RAPD-PCR ................................................................................. 24

4.1.4 Geräte und Sonstiges für Multilocus-

DNA Fingerprinting und RAPD-PCR

..........................................................

25

4.2 Probenahme und Probenmaterial ............................................................. 27

4.3 Methode des DNA - Fingerprinting ........................................................... 28

4.3.1 DNA Isolierung ............................................................................................ 28

4.3.2 Probegel ...................................................................................................... 29

4.3.3 Bestimmung der Konzentration und

der Reinheit der DNA - Stammlösung

............................................................

29

4.3.4 Restriktionsverdau ....................................................................................... 30

4.3.5 Submarine - Agarose - Gelelektrophorese .................................................. 31

4.3.6 Vakuum Blotting .......................................................................................... 31

4.3.7 Prähybridisierung ......................................................................................... 33

4.3.8 Hybridisierung und Blocking ........................................................................ 33

4.3.9 DIG-Antikörperbehandlung

und Immunologische Detektion

..........................................................................

34

4.4 RAPD-PCR ................................................................................................... 35

4.5 Statistische Auswertung ............................................................................. 36

4.5.1 Anzahl der Banden ...................................................................................... 36

Inhaltsverzeichniss III

4.5.2 Berechnung der Bandsharing-Rate

(BSR) bzw. der mittleren Wahrscheinlichkeit

für eine übereinstimmende Bande

.......................................................

37

4.5.3 Wahrscheinlichkeit Pi, dass

zwei Fingerprints identisch sind

.........................................................................

37

4.5.4 Wahrscheinlichkeit Pg, dass Individuum x

die gleichen Banden aufweist wie Individuum y

..................................................

38

4.5.5 Berechnung des Verwandtschaftkoeffizienten ............................................ 38

4.5.6 Populationsdifferenzierung .......................................................................... 39

4.5.7 Genetische Distanz zwischen Populationen ................................................ 39

4.5.8 Durchschnittliche Allelfrequenz q für eine Bande ........................................ 40

4.5.9 Mittlere zu erwartende Wahrscheinlichkeit,

dass ein Individuum mit seinen Nachkommen

eine gemeinsame Bande hat.

.................................................

40

4.5.10 Mittlere zu erwartende Wahrscheinlichkeit,

dass eine Bande zwischen zwei Vollgeschwistern

übereinstimmt

..............................................

41

5. Ergebnisse und deren Diskussion ................................................................... 42

5.1 Fangmethodik .............................................................................................. 42

5.2 DNA-Isolierung ............................................................................................ 45

5.3 Restriktionsverdau und Fluoreszenzfärbung ........................................... 47

Inhaltsverzeichniss IV

5.4 Auswahl der Species-

Enzym-Sonden Kombination

............................................................................

51

5.5 Somatische Stabilität und

Reproduzierbarkeit der Fingerprints

................................................................

54

5.6 Untersuchungen von Feldmäusen mit

nicht bekanntem Verwandtschaftsgrad an

einem Standort

.....................................................

56

5.6.1 Standort: Zill ................................................................................................. 56

5.6.2 Standort: Hohberg ....................................................................................... 57

5.6.3 Standort: Herl-Brache .................................................................................. 58

5.6.4 Standort: Knospenhof .................................................................................. 59

5.6.5 Standort: Eiden ............................................................................................ 60

5.7 Individualisierungspotential ........................................................................ 62

5.8 Populationsgenetische Aussagen

über Feldmäuse mit nicht bekanntem

Verwandtschaftsgrad

.............................................................

63

5.9 Untersuchung von Feldmäusen

mit bekanntem Verwandtschaftsgrad

..............................................................

70

5.9.1 Mutter ma und ihre Nachkommen a1-a5 ..................................................... 71

5.9.2 Mutter mb und ihre Nachkommen b1-b4 ..................................................... 72

5.9.3 Mutter mc und ihre Nachkommen c1-c3 ...................................................... 74

Inhaltsverzeichniss V

5.9.4 Mutter md und ihre Nachkommen d1-d6 ..................................................... 75

5.9.5 Mutter me und ihre Nachkommen e1-e6 ..................................................... 77

5.9.6 Mutter mf und ihre Nachkommen f1-f4 ........................................................ 78

5.9.7 Aussagen über Reproduktionsstrategien

anhand der erhobenen Fingerprintdaten

....................................................

80

5.10 RAPD-PCR (Williams et al.1990) ............................................................ 83

5.10.1 Artdifferenzierung ...................................................................................... 83

5.10.2 Populationsdifferenzierung ........................................................................ 84

6. Zusammenfassung .............................................................................. 87

7. Danksagung ......................................................................................... 90

8. Literaturverzeichnis ............................................................................. 91

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis VI

Abblidungen:

Abb.1: Schematische Darstellung des Verlaufs des

nichtradioaktiv markierten DNA-Fingerprinting

...........................................

5

Abb.2: Arbeitsschritte der PCR ..................................................................................... 7

Abb.3: Untersuchungsfläche Wahlen Zill 2 ................................................................. 9

Abb.4: Untersuchungsfläche Wahlen Hohberg ........................................................... 9

Abb.5: Lage der Untersuchungsgebiete Herl und Wahlen ......................................... 11

Abb.6: Untersuchungsgebiet Herl ................................................................................ 12

Abb.7: Verbreitung von Microtus arvalis ..................................................................... 16

Abb.8: Verbreitung von Microtus agrestris ................................................................. 16

Abb.9: Foto: Microtus arvalis ....................................................................................... 17

Abb.10: Foto: Microtus agrestris .................................................................................. 17

Abb.11: Molaren von Microtus agrestris mit

„agrestris“ und „exsul-Schlinge“

.................................................................

18

Abb.12: Vakuum Blotter ............................................................................................... 32

Abb.13: Aufbau eines Vakuum Blottes ......................................................................... 32

Abb.14: Holzkastenfalle mit Blechwippe ...................................................................... 43

Abb.15: Hengstlerfalle .................................................................................................. 44

Abb.16: Kunststoffwieselfalle ........................................................................................ 45

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis VII

Abb.17: Probegel mit DNA Isolaten aus Leber,

Muskel, Niere und Mausschwanz

...........................................................

46

Abb.18: Vollständiger und unvollständiger

Restriktionsverdau

...................................................................

48

Abb.19: Restriktionsverdau mit der

Restriktionsendonuklease Hinf I

.....................................................................

50

Abb.20: Multilocus-DNA-Fingerprint von Microtus

arvalis mit dem Restriktionsenzym Hinf I

und der Sonde (GACA)4

.......................................................

52

Abb.21: Multilocus-DNA-Fingerprint von Microtus

agrestris und Microtus arvalis mit dem

Restriktionsenzym Hinf I und der Sonde (GTG)5

............................................

53

Abb.22: Isolation by distance ....................................................................................... 64

Abb.23: Flächennutzungskartierung des

Standortes Wahlen mit den

Untersuchungsflächen Zill und Hohberg

........................................................

65

Abb.24: Flächennutzungskartierung des Standortes

Herl mit den 3 Untersuchungsflächen

Eiden, Knospenhof und Herl-Brache

..................................................

66

Abb.25: Dendrogramm der Clusteranalyse

der Standorte

..................................................................

68

Abb.26: Artunterscheidung von Microtus arvails

und Microtus agrestris mit dem RAPD-

PCR Primer Roth A17

..........................................................

84

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis VIII

Abb.27: Unterschiedliche Bandenmuster der

Standorte Herl, Hohberg und Zill von

Microtus arvalis mit dem Primer A19

.............................................................

85

Abb.28: Unterschiedliche Bandenmuster

von Microtus arvalis in Herl

.....................................................................

85

Tabellen:

Tab.1: Testsysteme und ihr Anwendungsspektrum ................................................... 2

Tab.2: Anzahl der gefangenen

Microtus arvalis pro Standort

...........................................................................

27

Tab.3: Die verwendeten Restriktionsenzyme

mit ihren Erkennungsschnittstellen

.............................................................

48

Tab.4: Bandsharingraten Zill ........................................................................................ 56

Tab.5: Durchschnittliche Fingerprintdaten der

Feldmäuse mit unbekanntem

Verwandtschaftsgrad vom Standort Zill

..........................................................

56

Tab.6: Bandsharingraten Hohberg .............................................................................. 57



Verwandtschaftsgrad vom Standort Hohberg

.................................................

57

Tab.8: Bandsharingraten Herl-Brache ........................................................................ 58



Verwandtschaftsgrad vom Standort Herl-Brache

............................................

58

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis IX

Tab.10: Bandsharingraten Knospenhof ....................................................................... 59



Verwandtschaftsgrad vom Standort Knospenhof

............................................

59

Tab.12: Bandsharingraten Eiden ................................................................................. 60



Verwandtschaftsgrad vom Standort Eiden

......................................................

60

Tab.14: Durchschnittliche Bandshraten für

nichtverwandte Individuenpaare

..................................................................

61

Tab.15: Auflistung der Wahrscheinlichkeiten Pi

und Pg für nichverwandte Individuen

.....................................................

63

Tab.16: BSR innerhalb und zwischen den Populationen ............................................. 63

Tab.17: D’ij Werte zwischen den einzelnen Populationen

an den unterschiedlichen Standorten

............................................

67

Tab.18: F`ST Werte zwischen den einzelnen Populationen

an den unterschiedlichen Standorten

..........................................

68

Tab.19: Bandsharingraten der Mutter ma

und ihrer Nachkommen a1-a5

....................................................................

71


Feldmäuse mit bekanntem

Verwandtschaftsgrad vom Standort Hohberg

.................................................

71

Tab.21: Bandsharingraten der väterlichen

Banden der Nachkommen a1-a5

...................................................................

72

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis X

Tab.22: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden

der Nachkommen a1-a5 mit der Mutter ma bzw. mit

dem putativen Vater oder den putativen Vätern pva

......................................

72

Tab.23: Bandsharingraten der Mutter mb

und ihrer Nachkommen b1-b4

....................................................................

72




............................................

72


Banden der Nachkommen b1-b4

...................................................................

73


der Nachkommen b1-b4 mit der Mutter mb bzw. mit

dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvb

......................................

73

Tab.27: Bandsharingraten der Mutter mc

und ihrer Nachkommen c1-c3

....................................................................

74




............................................

74


Banden der Nachkommen c1-c3

...................................................................

74


der Nachkommen c1-c3 mit der Mutter mc bzw. mit

dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvc

.......................................

75

Tab.31: Bandsharingraten der Mutter md

und ihrer Nachkommen d1-d6

....................................................................

75

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis XI




............................................

75


Banden der Nachkommen d1-d6

...................................................................

76


der Nachkommen d1-d6 mit der Mutter md bzw. mit

dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvd

......................................

76

Tab.35: Bandsharingraten der Mutter me

und ihrer Nachkommen e1-e6

....................................................................

77




............................................

77


Banden der Nachkommen e1-e6

...................................................................

78


der Nachkommen e1-e6 mit der Mutter me bzw. mit

dem putativen Vater oder den putativen Vätern pve

......................................

78

Tab.39: Bandsharingraten der Mutter mf

und ihrer Nachkommen f1-f4

.....................................................................

78




............................................

78


Banden der Nachkommen f1-f4

...................................................................

79

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis XII


der Nachkommen f1-f4 mit der Mutter mf bzw. mit

dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvf

........................................

79

Einleitung 1

1. Einleitung

Populationsgenetische Diversitätsstudien bzw. Populationsstruktur-Untersuchungen

illustrieren nicht nur Evolutionsprozesse, sondern liefern Informationen für die biologische

Erhaltung und Bewertung von Ökosystemen (Veith et al. 1999). Unterschiedliche

Landschaftsstrukturen sowie Bewirtschaftungsformen können sich isolierend auf

Populationen auswirken und damit ihre genetische Variabilität beeinflussen (Veith et al.

1999). Die Zusammenhänge von land- bzw. forstwirtschaftlichen

Bewirtschaftungsmethoden auf bestimmte Tier- und Pflanzenpopulationen wurde in den

letzten Jahren von zahlreichen Autoren untersucht (Binet et al. 1997, Dyer et al. 1998,

Malkawi et al. 1999, Müller 1994, 1995, 1996, Vucetich et al. 2001). Genetische

Differenzierungs-, bzw. Anpassungsprozesse wurden dagegen nur in selteneren Fällen

untersucht (Nevo 2001, Pearman 2001, Ross 2001). In diesem Zusammenhang bilden

Rodentia unter anderem auch wegen ihrer hohen Reproduktionsrate und großen

ökologischen Valenz ideale Untersuchungsobjekte für die Indikation von

Flächennutzungswirkungen. Dass darüber hinaus viele Grenzwertbestimmungen und

Risikobewertungen an Rodentia-Systemen erarbeitet wurden, zeigt, dass sie auch als

Modell-Systeme für die Bewertungen von Landnutzungen einsetzbar sind.

Die Fortpflanzungsstrategie spielt natürlich eine entscheidende Rolle für die

Reproduktionsrate und somit für die Populationsgröße. Zum Beispiel bewirken

Mehrfachvaterschaften, d.h. die Nachkommen eines Wurfes stammen von

unterschiedlichen Vätern ab, im Vergleich zu Einfachvaterschaften ein Anwachsen der

effektiven Populationsgröße (Sugg & Chesser 1994, Chesser & Baker 1996).

Mehrfachvaterschaften wurden schon bei verschiedenen Taxa festgestellt ( Tegelström

1991, Avis 1994, Gullberg 1997, Dickinson & Akre 1998, Baker 1999, Wilmer et al. 1999,

Zenuto et al. 1999, Huyvaert et al. 2000, Haydock et al. 2001) nicht jedoch bei Microtus

arvalis.

Deshalb sollen genetische Untersuchungen an freilebenden Microtus arvalis Populationen

durchgeführt mit dem Ziel, etwas über ihre Reproduktionsstrategie zu erfahren und

Zusammenhänge zwischen genetischen Populationsstrukturen und unterschiedlichen

Flächennutzungen herauszufinden.

Auf die Eignung eine solche Fragestellung zu beantworten, wurden verschiedene

molekulargenetische Methoden mit unterschiedlichen Informatonsgehalten getestet,

Multilocus-DNA-Fingerprinting, RAPD-PCR und versuchsweise die Mikrosatelliten-PCR.

Einleitung 2

Von diesen 3 Methoden besitzt das Multilocus-DNA-Fingerprinting den größten und das

RAPD-PCR den kleinsten Informationsgehalt (siehe Tab.1). Testsysteme, die sich mit der

Untersuchung mitochondrialer DNA befassen haben auch einen hohen

Informationsgehalt. Die mitochondriale DNA besitzt z.B. eine höhere Mutationsrate, weil

Reparaturmechanismen fehlen und bietet somit Vorteile in der Identifizierung einzelner

Stämme, da mehr Varietäten unterscheidbar sind. Sie eignen sich jedoch nicht für

Analysen, die Abstammungslinien oder Vaterschaftsnachweise zum Inhalt haben, da sie

überwiegend mütterlich vererbt wird (Davidson et al. 1989, Krawczak & Schmidtke 1994)

Tab.1: Testsysteme und ihr Anwendungsspektrum (verändert nach Krawczak & Schmidtke 1994)

technische

Durchführ-

barkeit

Informa-

tionsge-

halt

Genotyp-

analyse

Vater-

schafts-

nachweis

degra-

dierte

DNA

gemischte

Proben

Sonden

Systeme

multi

locus

++ +++ - +++ - -

single

locus

++ ++ + ++ + ++

PCR

Systeme

Mini-

satelliten

++ + + + + +

Mikro-

satellite

++ + ++ + ++ +

Mitochon-

drien-DNA

+ ++ +++ - ++ -

In der Literatur konnten keine Angaben über die Anwendung von Multilocus-DNA-

Fingerprinting, RAPD-PCR und Mikrosatelliten-PCR auf Microtus arvalis gefunden

werden. Daraus ergab sich die Notwendigkeit die oben genannten genetischen

Untersuchungsmethoden auf Microtus arvalis und die vorhandenen Laborbedingungen zu

optimieren.

Einleitung 3

In der Vergangenheit bis gegen Ende der siebziger Jahre wurden für

populationsgenetische Untersuchungen von Haus- bzw. Wildtieren neben der

Karyotypenanalyse hauptsächlich biochemische Marker, wie zum Beispiel Isoenzyme

oder Allozyme eingesetzt (Ivanov 1989). Ihre Vorteile sind darin zu sehen, dass die

Funktion der Enzyme und ihre Vererbungsmuster weitgehend bekannt ist, und dass sie

relativ kostengünstig sind (Hedrik 1992). Weil die meisten Loci monomorph sind und

dadurch keinen Informationsgehalt besitzen, ist es notwendig, eine hohe Anzahl von

Markern pro Individuum kombiniert mit einer großen Populationsstichprobe zu

untersuchen (Hartl & Reimoser 1988, Wilde et al. 1992, Koller et al. 1993, Allegrucci et al.

1995, Garcia & Benzie 1995, Kantanen et al. 1995, Chan & Sun 1997, Harding et al.

1997). Dadurch ist dieses Verfahren sehr arbeitsaufwendig. Aussagen über

Verwandtschaftsbeziehungen, Vaterschaftsanalysen eingeschlossen, basierend auf

Isoenzymanalysen, sind statistisch unzuverlässig (Chakraborty et al. 1991, Lynch 1991).

Ferner sind die analysierbaren Merkmale von höheren Organismen auf das Gewebe

beschränkt, mit dem auch experimentiert wurde (Pöche et al. 1990, Roewer et al. 1990).

Da die DNA in den Zellkernen aller Körperzellen identisch vorkommt und außerdem im

Vergleich zu Proteinen relativ stabil (Meyer et al. 1995) und unempfindlich ist, war es

sinnvoll, dass eine Verlagerung der Analysen auf die DNA-Ebene erfolgte.

Das Genom der höheren Organismen ist aus codierender DNA (Exons), nichtcodierender

DNA (Introns) und extragener DNA, die vermutlich der Aufrechterhaltung der

Chromosomenstruktur dient, zusammengesetzt. Mindestens 30% bestehen hierbei aus

repetitiven Sequenzen, die in Einzelkopiesequenzen, mittelrepetetiven (1000 bis > 10000

Kopien) und hochrepetetiven Sequenzen (ab einer Million Kopien) unterteilt werden

können (Krawczak & Schmidtke 1994).

Für die codierenden Genloci kommen nur Einzelkopiesequenzen in Betracht. Die

repetetiven Sequenzen (repeats) bestehen aus Basensequenzen unterschiedlicher

Länge, die einzeln oder tandemartig, mehrfach hintereinandergeschaltet im Genom

vorkommen (Schertan 1991, Swatschek 1992). Da diese Sequenzen nicht zu den Exons

zählen, führt die Umordnung ganzer Sequenzteile bzw. Mutationen in diesen Regionen zu

keinen direkten Auswirkungen. Somit weisen Regionen repetetiver Sequenzen eine

größere Diversität als die Einzelkopiesequenzen auf und sind außerdem sehr reich an

interindividueller genetischer Variation (Peters et al. 1991). Daher kommt auch ihre

Bezeichnung „hypervariable regions“ (HVR´s). Die große Variabilität der HVR`s wird

vorwiegend durch die veränderliche Anzahl der mehrfach hintereinandergeschalteten

Wiederholungen (Variable Number of Tandem Repeats: VNTR`s) bestimmt.

Einleitung 4

1985 wurde von Jeffreys et al. (1985a) das DNA Fingerprinting entwickelt. Diese

Methode beruht darauf, dass sogenannte „Restriktions-Fragment-Längen-

Polymorphismen“ (RFLP`s) ihrer Länge nach durch Gelelektrophorese aufgetrennt

werden. RFLP`s entstehen durch hydrolytischen Verdau der genomischen DNA mit einer

häufig schneidenden Restriktionsendonuklease, die nicht innerhalb einer Repeat-Region

schneiden darf. Die Länge der Fragmente beruht zum Einen auf den Änderungen in der

Zahl der tandemartig wiederholten DNA-Einheiten, zum Anderen in den sie flankierenden

Erkennungssequenzen der Restriktionsendonuklease (Jeffreys et al. 1985a, Ryskov et al.

1988). Die im Gel aufgetrennten DNA-Fragmente werden dann auf eine Membran

transferiert. Durch Hybridisierung mit spezifischen DNA-Sonden können viele

hypervariable Loci gleichzeitig erfasst und dargestellt werden (Zischler & Epplen 1989a),

da die repetitiven Sequenzen wiederholt im Genom vorkommen und über das gesamte

Genom verteilt sind (Jeffreys et al 1986, Jeffreys et al.1988, Taylor et al.1991) (vgl.

Abb.1). Das hieraus resultierende Bandenmuster wird als der genetische Fingerabdruck

bezeichnet, der einen sehr hohen Polymorphiegrad zwischen verschiedenen Individuen

aufweist. Identische genetische Fingerprints treten nur bei monozygoten Zwillingen und

Mehrlingen (bzw. Klonen) auf.

Somit handelt es sich beim DNA-Fingerprinting also um die Visualisierung von repetitiven

DNA-Sequenzen, die aus einer kurzen Basenfolge bestehen und unterschiedlich oft

hintereinandergereiht sind. Die dabei entstandenen Banden des DNA-Fingerprints

werden genauso wie Allele nach den Mendel’schen Regeln autosomal weiterverebt

(Jeffreys et al. 1985b, Jeffreys u. Morton 1987a, Ryskov et al. 1988), weshalb alle

Banden eines Nachkommen auf die Eltern zurückzuführen sind (Mutationen

ausgenommen). Da es sich bei den Banden um sichtbargemachte VNTR-Regionen

handelt, also nicht um Einzelkopiesequenzen, werden hierbei nur nichtcodierende DNA-

Loci dargestellt (Epplen 1988, Jeffreys 1985 a + b, Pöche et al 1991).

Einleitung 5

DNA - Isolierung

genomische DNA

Restriktionsverdau Gelelektrophorese

Restriktionsfragmente

Gel

UV - Kontrolle

Gel

Southern - Blot

Membran/Gel

Hybridisierung/Hot wash Antikörperbehandlung

Membran

Farbreaktion

DNA - Fingerprint auf Membran

Abb.1: Schematische Darstellung des Verlaufs des nichtradioaktiv markierten DNA-Fingerprinting

Anhand ihrer Größe und ihres Aufbaus können die VNTR-Regionen als Minisatelliten

oder Mikrosatelliten klassifiziert werden.

Als Minisatelliten werden längere DNA-Sequenzen bezeichnet, die aus 3 bis 29

hintereinandergereihten Wiederholungen von durchschnittlich 16 bis 33 Basenpaaren

(bp) bestehen (Buitkamp et al. 1991b, Peters et al. 1991). Ihre gemeinsame Kernsequenz

beinhaltet zwischen 10 und 15 bp (Jeffreys et al. 1985a). Demgegenüber sind

Mikrosatelliten (Epplen 1988, Haberfeldt et al. 1991) aus nur 2 bis 10 Nucleotiden, die

sich 20 mal bis zu einer Mio. mal tandemartig wiederholen, zusammengesetzt.

Entsprechend den VNTR-Regionen gibt es auch Mini- bzw. Mikrosatellitensonden. Die

Mikrosatelliten- bzw. Oligonukleotidsonden haben gegenüber den Minisatellitensonden

entscheidende Vorteile. So können sie synthetisch hergestellt werden und zeichnen sich

durch konstante Qualität und hohe chemische Reinheit aus (Vergnaud et al. 1991). Auch

sind sie in nicht radioaktiv markierter Form erhältlich, wodurch ihr Einsatz in nicht speziell

überwachten Isotopenlabors möglich gemacht wird (Swatschek 1992). Als Beispiele sind

die Oligonukleotidsonde (GATA)4 und (GTG)5 aufgeführt.

(GATA)4 = GATAGATAGATAGATA

(GTG)5 = GTGGTGGTGGTGGTG

Einleitung 6

Zu den Minisatellitensonden gehören die sogenannten Jeffreys Sonden (Jeffreys et al.

1985b)

33.6: { (AGGGCTGGAGG)3 }18

33.15: (AGAGGTGGGCAGGTGG)29

Die oben genannten Mini- bzw. Mikrosatellitensonden gehören zu den Multilocussonden,

neben denen es auch Singlelocussonden gibt, die besonders für Linkage Analysen

interessant sind (Bruford & Burke 1991, Zischler et al. 1991).

Öffentliche Bekanntheit erlangte das DNA-Fingerprinting hauptsächlich durch seine

Anwendung in der Forensik, in der diese Methode in Bereichen wie

Vaterschaftsnachweisen, Identifikation von Spurenmaterial, Personen und Tätern

eingesetzt und zum Teil kontrovers diskutiert wird (Jeffreys et al. 1985 u. 1991,

Pemperton et Amos 1990, Pöche et al. 1990, Peters et al. 1991). Abstammungs- und

Vaterschaftsnachweise werden zudem in der Tier- und Pflanzenzucht eingesetzt, da in

kontrollierten Züchtungsprogrammen das Wissen um die Verwandtschaftsverhältnisse

potentieller Geschlechtspartner zum Heranzüchten ökonomisch wichtiger Charaktere

oftmals Grundvorraussetzung ist. Auch kann die Aufklärung der

Verwandtschaftsverhältnisse dem vorbeugenden Schutz gefährdeter Arten dienen, um

die eliminierende Wirkung von Inzucht zu vermeiden (Lynch 1991, Dolf et al. 1992,

Douglas 1998, Refseth et al. 1998, Parker et al. 1999, Nagaraju et al. 2001). Eine sehr

große Bedeutung kommt dem DNA-Fingerprinting in der Medizin, beispielsweise im

Bereich der Tumordiagnostik und Tumorgenetik (Lagoda et al. 1989, Nürnberg et al.

1991) zu. Dank der somatischen Stabilität des DNA-Fingerprints und der speziellen

Stabilität metastasierender Tumore eignet sich das DNA-Fingerprinting zum Nachweis

und zur Identifikation von Metastasen (Lagoda et al. 1989).

Eine revolutionäre Entwicklung im Bereich der Molekularen Genetik stellte die von Mullis

entwickelte PCR-Methode (PCR= Polymerase Chain Reaction) dar, die als in vitro-

Methode das Zellreperatursystem im lebenden System imitiert (Mullis & Faloona 1987,

Saiki et al. 1988, Mullis 1990). Die PCR beruht auf einer zyklischen Replikation, bei der in

jedem Zyklus die vorhandene DNA verdoppelt wird. So werden, je nach Methode, die

DNA-Fragmente von der Größe eines einzigen Basenpaares (bp) bis zu 10000 bp (plus

Primer) in Abhängigkeit der Zyklenzahl tausend- bis millionenfach vervielfältigt (Erlicher

1989, White et al. 1989, Erlicher et al. 1991, Arnheim et al. 1992). Wegen ihrer

Einfachheit (siehe Abb.2) hat die PCR seit ihrer Entwicklung für viel Aufsehen gesorgt

Einleitung 7

und in Bereiche der medizinischen Diagnostik, Forensik und in die Populationsgenetik

Einzug gehalten (Hanke 1992, Hummel 1992, Lessa 1992, Graham & Newton 1994,

Welsh & McClelland 1994, Fritsch 1996, Hoelzel et al. 1998).

Is o lie r te D N A

V o r b e r e itu n g d e r

P C R - R e a k tio n A m p lif i ka t ion im

T h erm o c y c le r

G e le lek t ro - p h o r e s e

G e le lek t ro - p h o res e

A m p lif i ka t ion s - p rod u k t

Abb.2: Arbeitsschritte der PCR

Die RAPD-PCR (Williams et al. 1990) stelle eine Sonderform der PCR dar, da Primer

ausgewählt werden deren Bindungsstellen zufällig (randomly) über das Genom verteilt

sind. Primer unterschiedlicher Sequenz und unterschiedlicher Länge haben folglich

unterschiedliche komplementäre Bindungsstellen, deren Anzahl ebenfalls primerabhängig

ist.

Durch Erhitzen wird die Doppelstrang- Template DNA denaturiert und in zwei

Einzelstränge zerlegt, wobei ein rasches Abkühlen ein Reassoziieren der Stränge

verhindert. An für den Primer komplementären Basensequenzen der Einzelstränge kann

sich dieser bei geeigneten Temperaturen anlagern (Annealing). Voraussetzung ist das

Vorhandensein zweier Bindungsstellen innerhalb einer bestimmten Distanz an den

gegenüberliegenden Einzelsträngen. Vom freien 3`-OH-Ende des Primers beginnt die

Polymerase unter Anwesenheit der vier Desoxyribunucleosidtriphosphate (dATP, dCTP,

dGTP, dTTP) die Synthese eines zur Template-DNA komplementären Stranges

(extension, polymerisation nach Lachmund u. Sachse 1994). Dies führt zur Bildung eines

neuen Doppelstranges und somit zur Verdopplung der ursprünglichen Template-DNA pro

Einleitung 8

Zyklus. Die erhaltenen Stränge gehen als Matrize in den nächsten Zyklus ein, was

abhängig von der Zyklenzahl zu einer millionenfachen Vervielfältigung führt. Die

Besonderheit besteht darin, dass sich ab dem dritten Zyklus die Sequenzen zwischen

zwei Primerbindungsstellen plus die der beiden begrenzenden Primer exponentiell

vervielfältigen. Von der Anzahl der zwischen zwei Bindungsorten liegenden Basenpaaren

ist es abhängig, ob es zu einer Amplifikation kommt. Nur wenn innerhalb der zur

Verfügung stehenden Zeit die DNA von einer Bindungsstelle zur nächsten synthetisiert,

erhält man ein Amplifikationsprodukt. Für eine erfolgreiche Amplifikation müssen die

Bindungsstellen innerhalb von 4000 bp liegen, wobei generell 120 Sekunden für eine

Synthese von Fragmenten bis zu einer Größe von 5000 bp als ausreichend gelten.

Im Prinzip funktioniert die Mikrosatelliten-PCR genauso wie das RAPD-PCR, nur das bei

der Mikrosatelliten-PCR definierte Stellen mit bekannter Sequenz, die

Mikrosatellitenregionen (die Größe dieser Regionen liegt meist zwischen 50 und 350

Basenpaaren), vervielfältigt werden. Hierzu kommt ein Primerpaar (je 20 – 25 Basen)

zum Einsatz, welches genau diese Stelle im Genom eingrenzt und den entsprechenden

Mikrosatellitenbereich amplifiziert. Da die Mikrosatellitenmarker codominant sind können

aus der Allelfrequenz und dem Heterozygotiegrad Aussagen über die Variabilität und den

Genfluss zwischen Populationen gemacht werden.

Untersuchungsgebiete 9

2. Die Untersuchungsgebiete

2.1 Beschreibung des Untersuchungsgebietes Wahlen

Die beiden Untersuchungsflächen Zill (Abb.3) und Hohberg (Abb.4) liegen in Wahlen, im

nördlichen Saarland. Sie befinden sich ca. 5 km südöstlich von Losheim und etwa 10 km

nordöstlich von Merzig (Abb.5)

Abb.3: Untersuchungsfläche Wahlen Zill 2

Abb.4: Untersuchungsfläche Wahlen Hohberg


Nach der „Naturräumlichen Gliederung Deutschlands“ (Schneider 1972) ist das

Untersuchungsgebiet der sogenannten Wahlener Platte, einer Untereinheit der Merziger

Muschelkalkplatte, zuzuordnen. Die Wahlener Platte bildet den östlichen Ausläufer der

Merziger Muschelkalkplatte und deren Abschluss gegen das Hochwaldvorland. Sie wird

als sanft gewellte Fläche im Niveau 350 m ü. NN charakterisiert, die durch diverse,

verzweigte Systeme von steilwandigen, bewaldeten Talschlüssen gegliedert und von

einer Reihe bewaldeter Kuppen im Süden und Südosten (z.B. Schallenberg 401 m,

Eisenberg 400 m, Oppener Kuppe 396 m) eingerahmt ist.

Der Sockel der Platte und der Kuppen besteht aus dem Hauptbuntsandstein (sm), der in

den Tallagen ansteht. Überlagert wird er von einer ca. 20 m mächtigen Schicht aus

Volziensandstein (so), der die Kuppen aufbaut. Die oberste Schicht, den Stufenbildner

überlagernd und sowohl auf der Platte wie teilweise auch auf den Kuppen vorkommend,

bilden Mergel und Muschelsandstein des unteren Muschelkalks (mu).

Der westliche Teil des Untersuchungsgebietes zeichnet sich durch mit Lößlehm bedeckte

Flächen aus, die einer intensiven landwirtschaftlichen Nutzung (Getreide-, Futteranbau)

unterliegen und somit eine fast komplette Ausräumung aufweisen. Die mit Bodenzahlen

zwischen 40 und 69 als gut bewerteten lehmig-tonigen Böden sind als

Verwitterungsprodukt der Deckschichten unter den periglazialen Verhältnissen der

Würmkaltzeit aus einem Gemisch von Anstehendem, Fließerden und äolisch

abgelagertem Material entstanden (Portz 1992).

In den steileren Hanglagen finden sich unterschiedlich stark verbuschte Streuobstwiesen,

Feldgehölze, Hecken und Gebüsch in ganz unterschiedlichen Sukzessionsstadien, die

oftmals durch Beweidung stark beeinflußt werden. Diese greifen kleinflächig, mosaikartig

ineinander und tragen somit zur Vernetzung der Landschaft bei.

Die bewaldeten Flächen setzen sich hauptsächlich aus in Nadelholzparzellen eingestreute

Perlgras- und Waldmeister-Buchenwälder zusammen (Müller & Paulus 1987).

2.1.1 Klima und Witterung in Wahlen

Laut dem „Deutschen Planungsatlas“, Band Saarland (Minister des Inneren), liegt der

mittlere Jahresniederschlag im Untersuchungsgebiet zwischen 900 und 950 mm/a, wobei

der größte Teil der Niederschläge in den Monaten Juli, August und Dezember fällt. Im

Großen und Ganzen ist die Niederschlagsverteilung jedoch ausgeglichen.

Die mittlere Jahresdurchschnittstemperatur wird im Planungsatlas mit 8,7°C, die mittlere

Januartemperatur mit 0,5°C und die mittlere Julitemperatur mit 15,0°C angegeben. Somit

gehört das Untersuchungsgebiet dem sommerkühlen, humid-subatlantischen Bereich

Mittel- und Westeuropas an. Innerhalb des Saarlandes liegt das Gebiet zwischen den


sogenannten klimatischen „Gunsträumen“ (Saar-, Moseltal) und den „Ungunsträumen“

(Hochwald).

Abb.5: Lage der Untersuchungsgebiete Herl und Wahlen

2.2 Beschreibung des Untersuchungsgebietes Herl

Das Untersuchungsgebiet Herl (Abb.6) liegt im Südwesten der Rheinland-Pfalz, etwa 10

km östlich von Trier und ca. 30 km nördlich des Untersuchungsgebietes Wahlen (Abb.5).

Wahlen

Herl


Abb.6: Untersuchungsgebiet Herl

Der Landschaftsraum Trier, zu dem Herl gehört, kann in zwei große naturräumliche

Regionen unterteilt werden, dem Rheinischen Schiefergebirge und dem Lothringischen

Stufenland. Die Grenze dieser beiden Regionen verläuft mitten durch die Trierer Talweite

und die Stadt, wobei sie von der Gesteinsgrenze des gefalteten paläozoischen

Grundgebirges (vorwiegend Devonschiefer) gegen jüngere Gesteinsserien gebildet wird.

Die Gesteinsgrenze verläuft vom Südwestrand des Hunsrück über die untere Saar nach

Norden bis zur Saarmündung in die Mosel und durch die Trierer Talweite. Dort umrundet

sie dann in weitem Bogen Bitburg und das Bitburger Gutland. Dann schwenkt sie in die

SW-Richtung zurück und folgt ihr als Südrand der Ardennen über Vianden in Richtung

nördlich von Arlon, gleichzeitig als Nordgrenze der Luxemburger und Ferschweiler

Sandsteinplatten, des Ettelbrücker Stufenlandes sowie der Landschaft „Belgisch-

Lothringen“ (Richter 1983).

Die geomorphologische Gliederung des Landschaftsraumes lehnt sich eng an ihren

geologischen Bau an. So dominieren im devonischen Grundgebirge weite

Flächensysteme mit Trogflächen in 300-400 m ü. NN und Rumpfflächen zwischen 500 m

und 600 m ü. NN. Über diese Rumpfflächen erheben sich nur noch die Härtlingszüge der

Quarzitkämme wie zum Beispiel der Schneifel und des Osburger und Schwarzwälder

Hochwaldes (Richter 1983).

Das Spektrum der Bodentypen entspricht der Gliederung in Landschaftsräume. So

kommen in der Tal- und Senkungszone der Mosel mittel- bis tiefgründige Braunerden vor.

Auf den Terrassen finden wir Parabraunerden , in ebener Lage Lößlehm und an den


Steilhängen auf Schiefer Braunerde-Ranker und Rigosole. Die Ertragsmesszahlen liegen

bei 40-60.

Auf den Trogflächen dominieren auf Schiefer mittelgründige Braunerden, an den

Talflanken der steil eingeschnittenen Seitentäler auch Braunranker und an den

Rebhängen Rigosole. Die Ertragsmesszahlen dieser Böden reichen von 33-40.

Die Rumpfflächen weisen mittel- bis flachgründige Braunerden und podsolige Braunerden

auf, die meist einen hohen Skelettanteil besitzen. Die Ertragsmesszahlen liegen hierbei

vorherrschend zwischen 25-35.

Durch den vielfältigen Wechsel von Ausgangsgestein, Boden und Relief entstand eine

vielgestaltige Ackerflur mit Wechsel von Acker, Grünland und Wald, die eine offenen,

insgesamt jedoch waldarmen Charakter hat. Ausnahmen hierzu bilden die weiten

Buntsandsteingebiete vom N-Rand des Moseltales über den Meulenwald bis nach

Herforst-Speicher, sowie die hochgelegenen Waldländer in Eifel und Hunsrück mit Ihren

Rodungsinseln.

Traditionsgemäß hat der Raum Trier eine kleinbäuerlich Struktur und eine

Besitzzersplitterung, die sich aus der Erbsitte der Realteilung ständig regeneriert. Durch

die Flurbereinigung, rückläufige Zahl der landwirtschaftlichen Betriebe und

Besitzkonzentrationen bei den Vollerwerbsbetrieben wurde dieser Zersplitterung zwar

entgegengewirkt, doch verändert hat dies die vorherrschende klein- bis mittelbäuerliche

Agrarstruktur des Trierer Raumes nicht.

Eine Hinwendung zur Grünlandwirtschaft ist daran zu erkennen, dass die Ackerflächen im

Vergleich zu den Dauergrünlandflächen viel stärker geschrumpft sind. Trotz der Abnahme

der Ackerflächen ist eine deutliche Zunahme der Getreide Anbaufläche zu Lasten des

arbeitsintensiveren Hackfruchtanbaus zu verzeichnen (Richter 1983).

2.2.1 Klima und Witterung

Die thermische Bevorzugung der Moseltalzone und des Gutlandes gegenüber den

höheren Gebieten von Hunsrück und Eifel lassen sich deutlich am Temperaturprofil

erkennen. So liegt die Jahresmitteltemperatur in der Moseltalzone bei über 9,0°C, im

Stufenland und auf den Trogflächen zwischen 8,0°C und 9,0°C und in den höheren

Regionen bei unter 8,0°C.

Betrachtet man die Jahresniederschläge, so lässt sich eine umgekehrte Tendenz

erkennen. Während die mittleren Jahresniederschläge in der Eifel und im Hunsrück bei

800 mm bis > 1000 mm liegen, bleiben sie im Stufenland, auf den Trogflächen und

besonders in der zentralen Talzone meist deutlich unter 800 mm. Die höchsten

Monatssummen der Niederschläge werden im Hochsommer, bzw. im Spätherbst


registriert, wobei gerade dieses Spätherbst Maximum ein Ausdruck der atlantischen

Klimaprägung ist, die den gesamten Trierer Raum charakterisiert. Das Ausmaß dieser

atlantischen Klimaprägung weist jedoch starke Unterschiede auf. So ist in den Höhen von

Eifel und Hunsrück ein ausgeprägtes atlantisches, feucht-kühles Mittelgebirgsklima zu

finden, während das Stufenland und die Trogflächen etwas wärmer und trockener sind

und die zentrale Talzone der Mosel sogar eine Wärmegasse mit kontinentalem Einschlag

bildet. Diese Wärmegasse ist mit ausschlaggebend für das Schlagwort „Trier sei

Deutschland nördlichster Süden“, was auch anhand der Flora und der Vegetation

festgestellt werden kann.

Verbreitung und Ökologie 15

3.Verbreitung und Ökologie

3.1 Systematik

Microtus arvalis (Pallas, 1779), die Feldmaus, und Microtus agrestris (Linnaeus, 1761),

die Erdmaus, gehören zu der Familie der Wühler (Rodentia: Cricetidae) und der

Unterfamilie der Wühlmäuse (Microtinae) (Urania 2000). Weltweit gibt es etwa 60 Arten

der Gattung Microtus, davon kommen 18 Arten in Europa vor. Diese lassen sich

wiederum in 3 Untergattungen (Chionomys, Microtus und Pitymys) unterteilen. Von diesen

3 Untergattungen ist Microtus mit seinen 6 in Europa vorkommenden Arten (M.agrestris,

M.arvalis, M.cabrerae, M.epiroticus, M.guentheri und M.oeconomus), von denen 4

(M.agrestris, M.arvalis, M.epiroticus, und M.oeconomus) weit verbreitet sind, die

ökologisch wichtigste Wühlmausgruppe (Niethammer 1981).

Die Gattungen Microtus sowie Arvicola gehen auf die fossile Gattung Mimomys zurück,

die vom Pliozän bis ins Altpleistozän belegt ist. Aus ihr hat sich dann wahrscheinlich an

der Grenze vom Oberpliozän zum Altpleistozän die Gattung Allophaiomys entwickelt.

Dadurch, dass sich bei der Gattung Allophaiomys am Vorderlobus des M1 durch seitliche

Einfaltungen weitere Dentindreiecke abgetrennt haben ist die Microtus Gruppe

hervorgegangen. Weitere Dentindreiecke bedeuten eine Vermehrung der Schneidekanten

und somit eine Leistungssteigerung (Chaline 1974).

3.2 Verbreitung

Abgesehen von einigen Randformen in Spanien erstreckt sich das Areal von Microtus

arvalis von den Pyrenäen und der französischen Atlantikküste im Westen bis zum Ob und

dem Altai Gebirge im Osten. Die NS-Ausdehnung ihres Areals liegt in etwa zwischen dem

40° nördl. Breite in Spanien und der Türkei und 60° nördl. Breite in Russland (Abb.7). Ihre

vertikale Verbreitung reicht von Meeresniveau bis 2250m in den Pyrenäen und bis zu

3000m in den westlichen Zentralalpen (Niethammer 1981).


Abb.7:Verbreitung von Microtus arvalis

Der Verbreitungsschwerpunkt von Microtus agrestris liegt nördlicher als der von Microtus

arvalis. Die NS-Ausdehnung reicht von etwa 40° nördl. Breite in Portugal bis zu 70° nördl.

Breite in Skandinavien. Von Westen her erstreckt sich ihr Areal von der Portugisischen

und Französischen Atlantikküste bis zum Ural im Osten. Ein weiteres großes Teilareal

befindet sich in den Altai- und Sajan- Gebirgsländern. Andere Fundorte im Osten, wie

zum Beispiel um die Stadt Sidorovsk, sind eher sporadisch (Abb.8).

In vertikaler Ebene kommt Microtus agrestris von Meeresniveau an bis zu 1950m am

Klausenpass in den Alpen vor (Niethammer 1981).

Abb.8: Verbreitung von Microtus agrestris


3.3 Morphologie und Artdifferenzierung

Laut Niethammer (1981) ist es unmöglich, einen Bestimmungsschlüssel für Microtus Arten

nach äußeren Merkmalen, dem Schädel und den Zähnen getrennt abzugeben. Vielmehr

ist eine genaue Unterscheidung der einzelnen Arten oftmals so schwierig, dass selbst

eine Kombination dieser Merkmale noch nicht ausreicht, und Kenntnisse über die

Herkunft oder das Karyogramm ebenfalls zur Artbestimmung herangezogen werden

müssen.

So ist es auch nicht möglich, Microtus arvalis (Abb.9) und Microtus agrestris (Abb.10)

nach äußeren Merkmalen zu unterscheiden. Es wird zwar in der Literatur beschrieben,

dass dort wo beide Arten sympatrisch verbreitet, sind Microtus arvalis meist etwas kleiner

ist als Microtus agrestris, oder dass der Rücken der Erdmaus weniger grau ist, als der der

Feldmaus (Niethammer 1981, Urania 2000), jedoch sind diese Merkmale so variabel,

dass sie für eine ernsthafte Artunterscheidung nicht in betracht gezogen werden können.

Abb.9: Foto: Microtus arvalis

Abb.10: Foto: Microtus agrestris


Auch die Schädelmerkmale, nach denen die Schädelkapsel von Microtus arvalis etwas

breiter, kürzer und flacher ist und rundere Umrisse hat wie die Schädelkapsel von

Microtus agrestris (Niethammer 1981), können aufgrund ihrer Varianz nicht zur

Artdifferenzierung herangezogen werden.

Ein genaueres Unterscheidungsmerkmal bieten da schon die Zähne. So ist das Gebiss

von Microtus agrestris dadurch charakterisiert, dass der M2 fast immer eine 3. linguale

Zacke, die sogenannte „agrestris-Schlinge“ besitzt. Auch ist der M1 von Microtus arvalis

immer ohne „exsul-Schlinge“ (vgl. Abb.11).

Abb.11: Molaren von Microtus agrestris mit „agrestris“ und „exsul-Schlinge“.

Eine genaue Differenzierung der beiden Arten kann jedoch über die Genetik erfolgen.

Eine Methode, die sich hierzu eignet ist das Erstellen eines Karyogramms. Denn obwohl

beide Arten diploid sind, gibt es doch erhebliche Unterschiede bezüglich ihrer

Chromosomensätze. So hat Microtus arvalis eine Karyotyp von 2n=46 und Microtus

agrestris einen Karyotyp von 2n=50. Auch gibt es große Unterschiede in der Struktur der

Chromosomen. Während bei Microtus agrestris das kleinste Autosomenpaar

metazentrisch und die übrigen akrozentrisch sind, besitzt Microtus arvalis 4 große

submetazentrische Autosomenpaare und 1 subtelozentrisches Autosomenpaar

(Niethammer 1981). Zwei weitere genetische Methoden zur genauen Identifikation der

Arten (RAPD-PCR, Multilocus-DNA-Fingerprinting) werden später noch ausführlich

besprochen (vgl. Kap. 5.3 & 5.10.1)

„agrestris-Schlinge“

„exsul-Schlinge“


3.4 Ökologie

Im folgenden Ökologieteil wird nur Bezug auf Microtus arvalis genommen, da die Ökologie

von Microtus agrestris für diese Arbeit nicht relevant ist.

Microtus arvalis bevorzugt primär offenes, nicht zu feuchtes Grasland mit nicht zu dichter

Vegetation. Sekundär kann sie auch auf Wiesen, Getreidefelder oder Gärten ausweichen

(Stein 1952). In geschlossenen Wäldern, auf Mooren, Sumpfwiesen und in Felsen fehlt

sie ganz.

Sie leben in Gängen mit etwa 3,5cm Durchmesser. Diese lassen sich in Nest- und

Versteckbaue unterscheiden. Die Versteckbaue sind kurze einfache Systeme mit selten

mehr als 3 Zugängen, die oft Fraßkammern enthalten. Die Baue der Feldmaus werden so

angelegt, dass sie möglichst wassergeschützt liegen (Pelikan 1959).

Ihre Nahrung besteht in erster Linie aus den grünen Teilen von Gräsern und krautigen

Dikotylen, aber auch aus Samen, unterirdischen Pflanzenteilen, Rinde, Moosen und

tierischer Nahrung (Niethammer 1981). Laut Stein (1958a) fressen Feldmäuse vermutlich

auch die bei Auseinandersetzungen getöteten Artgenossen. Verzehrt wird die Nahrung an

versteckten Stellen an der Oberfläche oder in Fraßkammern im unterirdischen

Gangsystem (Stein 1958a, Pelikan 1959).

Die Aktionsräume von erwachsenen männl Feldmäusen werden von Reichstein (1960)

mit zwischen 1200-1500m2 angegeben, die von adulten weibl Feldmäusen mit zwischen

300-400m2. Je nach Populationsgröße ändert sich die räumliche Struktur einer

Feldmauspopulation. So sinkt mit steigender Dichte die Reviergröße der Weibchen

soweit, dass sich schließlich 2 oder mehr Weibchen ein Gebiet teilen und darin

fortpflanzen können, womit eine exklusive territoriale Nutzung eines bestimmten Revieres

aufgehoben ist (Frank 1957, Schön 1995).

Weibliche Feldmäuse können bereits in einem Alter von 11-13 Tagen geschlechtsreif

werden. Die männlichen hingegen werden erst deutlich später geschlechtsreif. Bei zu

hoher Feldmausdichte oder anderen widrigen Umständen wie Nahrungsmangel oder

schlechten Witterungsbedingungen stagniert die Entwicklung der im Sommer geborenen

Jungen und die Geschlechtsreife tritt erst mit dem folgenden Frühjahr ein. Die am häufigst

auftretende Tragzeit bei Microtus arvalis liegt zwischen 19-21 Tagen (Frank 1956a). Die

Fortpflanzungszeit liegt in Deutschland je nach Witterung zwischen März und Oktober.

Die in weiblichen Feldmäusen gefundene Embryonenzahl variiert zwischen 1-13, liegt

jedoch in dem Großteil der Fälle zwischen 3-8 Embryonen (Reichenstein 1957, 1960a),

bei bis zu 7 Würfen im Freiland pro Jahr. Da die Fortpflanzungszeit von Microtus arvalis


hauptsächlich auf die Sommermonate beschränkt ist, erreichen sie gewöhnlich ihre

höchste Dichte im Herbst, im Frühjahr hingegen ihren Tiefststand.

Die Höchstdichten des Feldmausbestands ändert sich außerdem von Jahr zu Jahr. Heise

und Stubbe (1987) wiesen eine 2-4 jährige Periodenlänge im Massenwechsel der

Feldmaus nach, wobei der Anteil eines 3 jährigen Zyklus dominierte. Erklärt werden diese

Zyklen durch die Witterung. Aber auch der Nahrungsmangel spielt mit zunehmender

Dichte durch die Verschlechterung der Nahrungsgrundlage der Feldmäuse im Herbst eine

große Rolle. Eine besondere Wirkung auf den Massenwechsel von Microtus arvalis

zeigen starke klimatische Schwankungen und Abweichungen vom langjährigen

Durchschnitt. Hierbei spielt der klimatische Verlauf des Winters und des Frühjahrs eine

wesentlich größere Rolle im Zyklus der Feldmaus als die Sommerwitterung, da hier über

das Überleben der Tiere in der für sie ungünstigen Jahreszeit entschieden wird (Heise &

Stubbe 1987).

Da die Feldmaus in weiten Teilen ihres Areals zu der am häufigst vorkommenden

Säugetierart gehört, spielt sie als Nahrung von Greifvögeln (z.B. Buteo buteo, Falco

tinnunculus), Eulen (z.B. Asio otus) und carnivoren Säugern (z.B. Vulpes vulpes, Mustela

nivalis, Mustela erminea) eine große Rolle. Eine nicht zu unterschätzende Todesursache

ist auch in der Elimination von männl Feldmäusen infolge innerartlicher

Auseinandersetzungen zu sehen. Diese ist natürlich um so größer, je höher die Dichte ist

(Stein 1953b).

Material und Methoden 21

4. Material und Methoden

4.1 Material

4.1.1 Puffer und Lösungen für Multilocus-DNA Fingerprinting und RAPD-PCR

Autoklaviertes H2O deion.

PCR-Puffer 10x 100 mM Tris-HCl (pH 8,8)

15 mM MgCl2

500 mM KCl

1 % Triton X-100

SE - Puffer 25 mM NaCl

75 mM Na2EDTA

1 % SDS

pH 8,0

TBE - Puffer 10x 0,9 M Tris

0,9 M Borsäure

0,1 M Na2EDTA

pH 8,0 - 8,2

=> (Amresco Inc., Solon, Ohio)

TBS - Puffer 0,9 M NaCL

0,1 M Tris

pH 7,5


NaCl - Lösung 6,0 M NaCl

NaAcetat - Lösung 3,0 M NaAcetat


SSC 6x 0,9 M NaCl

0,09 M Na3Citrat

pH 7,0


Stop - Lade - Mix 100 mg Bromphenolblau / 100 ml

40 % Saccharose

0,1 M EDTA

Bisbenzimidlösung 1 mM = 0,6 mg/ml Bisbenzimid

(Hoechst H33258)

Ethidiumbromidlsg. 1 µg/ml Ethidiumbromid

=> (Boehringer, Ingelheim)

Depurinationslösung 0,25 M HCl

Blottinglösung 0,4 M NaOH

Denaturierungslösung 0,5 M NaOH

1,5 M NaCl

Tris/HCl 0,9 M NaCl

0,1 M Tris

0,05 M MgCl2

pH 9,5

Antikörperlösung 10 µl Antikörperkonjugat in 10 ml TBS - Puffer

=> (Boehringer, Mannheim; Dig Detection Kit)

SSPE 20x 3,0 M NaCl

0,2 M NaH2PO4 x H2O

0,02 M Na2EDTA x 2 H2O

pH 7,4



Präblocking - Lösung 0,5 % Blocking Reagenz


Blocking - Lösung 0,5 % Blocking Reagenz


Denhardts - Lösung 100x => (Amresco Inc., Solon, Ohio)

Prähybridisierungslösung 2,5 ml 20x SSPE

0,5 ml 100x Denhardts-Lösung

0,1 ml 10 % SDS

100 µg E. coli DNA (denaturiert und fragmentiert)

auf 10 ml Endvolumen mit sterilem H2O deion.

auffüllen

Hybridisierungslösung 2,5 ml 20x SSPE

0,5 ml 100x Denhardts-Lösung

0,1 ml 10 % SDS

100 µg E. coli DNA (denaturiert und fragmentiert)

140 pmol Sonde

auf 10 ml Endvolumen mit sterilem H2O deion.

auffüllen

Sonden (GTG)5 digoxigenin markiert

(CA)8 digoxigenin markiert

(GATA)4 digoxigenin markiert

(GACA)4 digoxigenin markiert

=> (Firma Biometra, Göttingen)

Färbelösung 10 ml Tris/HCl

200 µl NBT/BCIP in Dimethylformamid

pH 9,5


Chloroform p.a. => (Merck, Darmstadt)


Phenol - Chloroform pH 8,0


Ethanol absolut p.a. => (Merck, Darmstadt)

Ethanol 70 %

4.1.2 Enzyme und Längenstandards für Multilocus-DNA Fingerprinting und RAPD-

PCR

Polymerase DNAZymeII

=> (Firma Biometra)

Restriktionsenzyme Eco R1

Hae III

Hind III

Hinf I

Taq I

=> (Takara Shuzo Co., LTD, Japan)

Längenstandard Hind III verdaute Lambda DNA


100 bp DNA Ladder

=> (Takara Shuzo Co., LTD, Japan)

Proteinase K => (Amresco Inc., Solon, Ohio)

4.1.3 Primer für RAPD-PCR

Kit Roth-A 20 Primer

Kit Roth-B 20 Primer

Kit Roth-C 20 Primer

Kit Roth-D 20 Primer

Kit Roth-180 10 Primer





4.1.4 Geräte und Sonstiges für Multilocus-DNA Fingerprinting und RAPD-PCR

Agarose Serva for DNA Elektrophoresis – Analytical Grade

=> (Boehringer, Ingelheim)

Agarose Type 1


Elektrophoresekammer: Sub-Cell GT Agarose Gel Electrophoresis System

=> (BIO-RAD, München)

Filme: SW-Film Polaroid Typ 667, ISO 3000

=> (Polaroid GmbH, Offenbach)

Gelgießstand: => (BIO-RAD, München)

Hybridisierungsgefäß: => (Techne, Cambridge, United Kingdom)

Hybridisierungsofen: HB-1D

=> (Techne, Cambridge, United Kingdom)

Kunststoffpipetten: 3 ml

=> (Fischer Labortechnik, Frankfurt)

Mikrowelle: Micromat 135

=> (AEG)

Netzgerät: PowerPac 300

=> (BIO-RAD, München)

Photometer Gene Quant II

=> (Pharma Biotech, Cambridge, U.K.)

Photosystem: Polaroid MP-4, Filter#15 orange

=> (Polaroid GmbH, Offenbach)


Pipettenspitzen: Plasti - Brand 0,5 - 10µl, 10 - 100µl, 100 - 1000µl

=> (Brand, Wertheim/Main)

Reaktionsgefäße: 1,5 ml

=> (Eppendorf, Hamburg)

2 ml

=> (Biozym, Hess. Oldendorf)

0,2 ml PCR-Gefäße

=> (Biozym, Hess. Oldendorf)

Thermocycler Gene A. PCR System 9700, PE (Applied Biosystems)

=> Perkin Elmer, Norwalk, USA)

UV - Transilluminator: N-90M (INTAS)

=> (Konrad Bender)

Pipetten: 0,5 - 10µl, 10 - 100µl, 100 - 1000µl

=> (Eppendorf, Hamburg)

Waage: Precisa 160 A

=> (PAG Oberlikon AG, Zürich)

Wärmeschrank: U 40

(Memmert, Schwabach)

Zentrifuge: Universal Tischkühlzentrifuge Z 320K

=> (Hermle GmbH & Co., Gosheim)


4.2 Probenahme und Probenmaterial

Zum Fang der Feldmaus werden drei verschiedene Fallensysteme eingesetzt, die

Holzkastenfalle mit Blechwippe (Abb.14), die Hengstlerfalle (Abb.15) und die Kunststoff-

Wieselfalle mit feingehendem Wippbrett (Abb.16). Die Fallen werden auf den einzelnen

Standorten so ausgebracht, dass sie über die ganze Fläche verteilt sind. Die Mäuse, die

in der Hengstlerfalle und der Kunststoff-Wieselfalle gefangen werden, werden lebend in

einen durchsichtigen Nylonbeutel überführt und auf Gattungsniveau bestimmt. Mäuse, die

in der Holzkastenfalle gefangen worden sind, können durch die Bauart der

Holzkastenfalle bedingt direkt bestimmt werden.

Beködert werden die Fallen mit Haferflocken, Haselnüssen, Erdnussbutter, Katzenfutter

oder Früchtemüsli.

Auf diese Art konnten an den 5 Standorten insgesamt 161 Microtus arvalis gefangen

werden (Tab.2).

Tab.2: Anzahl der gefangenen Microtus arvalis pro Standort

Standort Gefangene

Mäuse

Zill (Brachfläche bei Wahlen) 53

Hohberg (Brachfläche bei Wahlen) 32

Knospenhof (ökologisch, mit Gerste bewirtschaftete Fläche bei Herl) 31

Eiden (intensiv, mit Gerste bewirtschaftet Fläche bei Herl) 19

Herl Brache (Brachfläche bei Herl) 26

Alle dieser 161 Feldmäuse wurden mit der RAPD-PCR, 99 von ihnen mit dem Multilocus-

DNA-Fingerprinting untersucht.

Unter den 161 gefangenen Feldmäusen sind 6 trächtige Weibchen mit zwischen 3 und 6

Föten gewesen.

Nach dem Fang werden die Mäuse der Gattung Microtus getötet und bei –20°C, einzeln

in Gefrierbeuteln verpackt, eingefroren.

Zur Isolierung hochmolekularer genomischer DNA werden den Mäusen in noch

gefrorenem Zustand Muskelgewebe und die Leber entnommen. Nach der Entnahme wird

das Gewebe entweder direkt weiterverarbeitet oder wieder eingefroren.


4.3 Methode des DNA - Fingerprinting

4.3.1 DNA Isolierung

Die Isolierung chromosomaler DNA aus dem Gewebe von Microtus arvalis wurde mit der

Salz-Chloroform-Methode (Lagoda et al. 1989 bzw. Müllenbach et al. 1989) durchgeführt.

Dazu werden ungefähr 200 mg der tiefgefrorene Leber in einem Mörser unter Zugabe von

flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zerrieben. Nachdem der Stickstoff verdampft

ist, wird die Probe in ein mit 2,5 ml SE-Puffer gefülltes Zentrifugenröhrchen übertragen.

Der SE-Puffer bricht hierbei die Zellmembran auf und unterdrückt DNase-Aktivitäten.

Danach wird das Gemisch mit 70 µl Proteinase K-Lösung (20 mg/ml), welche die Proteine

verdaut, versetzt und für 12 - 18 h bei 65°C im Hybridisierungsofen inkubiert. Nach einer

Inkubationszeit von 2 h werden wiederum 40 µl Proteinase K hinzupipettiert.

Am folgenden Tag wird diesem Verdau zuerst 0,9 ml 6 M NaCl, welche auf 65° C

vorgewärmt ist, und nach kurzem Schwenken 3,5 ml Phenol-Chloroform hinzugefügt. Das

Zentrifugenröhrchen wird nun zwischen Kühlakkus liegend für 30 Minuten in einem

Überkopfschüttler (kleinste Stufe) gemischt. Durch 30 minütige Zentrifugation bei ca.

5500 U/min wird eine Phasentrennung zwischen der wässrigen und der organischen

Phase erreicht. Möglichst viel von der wässrigen Phase wird nun sehr vorsichtig mit einer

Kunststoffpipette abgehoben und in ein anderes Zentrifugenröhrchen überführt. Die

organische Phase und die Interphase, in welcher sich Proteinreste, degradierte DNA und

RNA absetzen, werden verworfen. Die wässrige Phase wird mit 7 ml eisgekühltem

absolutem Ethanol versetzt und durch leichtes Schwenken wird die DNA zum Ausfallen

gebracht. Mit Hilfe eines sterilen Glashäkchens (= Pasteurpipette, deren Spitze mit einem

Bunsenbrenner zu einem Häkchen gebogen und zugeschmolzen wurde) wird der DNA-

Knäul der wässrigen Phase entnommen und zum Reinigen über Nacht in 70 % igem

Ethanol aufbewahrt.

Zur Isolierung der DNA eignet sich sowohl die Muskulatur als auch die Innereien.

Vorwiegend wurde jedoch die Leber verwendet, da es sich hierbei um ein relativ weiches

Gewebe handelt, welches sehr gut und schnell von der Proteinase K verdaut werden

kann. Die Menge an DNA, die aus der Leber gewonnen werden kann ist um ein

vielfaches höher, als die Menge an DANN, welche aus der gleichen Masse an Muskulatur

bzw. Niere zu isolieren ist.


4.3.2 Probegel

Zur Überprüfung des Reinheitsgrades und zur Konzentrationsabschätzung der isolierten

DNA wird ein Probegel verwendet. Nach der Elektrophorese erfolgt eine Betrachtung

dieses Gels auf dem Transilluminator. Ist die DNA gut aufgereinigt und hochmolekular,

erscheint diese als klare, scharfe Bande nahe der Auftragstelle. Verunreingungen und

degradierte DNA laufen dieser scharfen Bande als Schmier voraus; die Konzentration

verhält sich ungefähr proportional zur Intensität der Bande.

Zur Herstellung eines 0,8 %-igen Probegels wird 1,2 g Agarose (Serva, Nr. 11404) in

einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben abgewogen, in 150 ml TBE-Puffer suspendiert und in

der Mikrowelle durch Erwärmen aufgelöst. Während die klare Lösung langsam auf 55°C

abkühlt, wird der Gießtrog in den Gelgießstand eingespannt und der Slot-Kamm in etwa 3

cm Entfernung vom Gießtrog-Anfang gesetzt. Ist eine Temperatur von 55°C erreicht,

werden 5 µl Ethidiumbromid zur Agarose hinzupipettiert und gemischt. Die Agarose wird

vorsichtig in den Gießtrog gegossen, wobei auftretende Luftblasen mit einer

Pasteurpipette entfernt werden. Nach Erkalten der Agarose wird diese mit dem Gießtrog

in die Elektrophoresekammer, die mit TBE-Puffer ca. 5 mm über Gelhöhe gefüllt ist,

gesetzt und der Slot-Kamm entfernt. Hierbei muss darauf geachtet werden, dass der

Gießtrog-Anfang mit dem Slot-Kamm auf der Kathodenseite in die Kammer gesetzt wird,

da die DNA negativ geladen ist und somit Richtung Anode wandert. Aus den

Stammlösungen der DNA Proben werden jeweils 20 µl in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß

abpipettiert, mit 4 µl Stop-Lade-Mix versetzt, gemischt und mit einer Pipette (10 - 100 µl)

in die Kammtaschen gefüllt. Die Elektrophorese läuft etwa 120 Minuten bei 50 mA. Nach

dem Ende der Elektrophorese wird das Gel mit dem Gießtrog der Elektrophoresekammer

entnommen, auf dem Transilluminator begutachtet und fotografiert.

4.3.3 Bestimmung der Konzentration und der Reinheit der DNA - Stammlösung

Nachdem der DNA-Gehalt und die Reinheit anhand des Probegels grob abgeschätzt

worden sind, erfolgt eine genaue Qualitäts- und Quantitätsbestimmung an einem UV-

Photometer.


Die Bestimmung des DNA-Gehaltes erfolgt unter der Annahme, dass 1 OD (optische

Dichte), bei 260 nm gemessen, einer Konzentration von 50 µg/ml (Wieacker und Müller

1985) doppelsträngiger DNA entspricht. Dazu werden 100 µl der DNA-Stammlösung für

die photometrischen Messungen 1:20 verdünnt. Um Verunreinigungen durch Proteine

und aromatischen Aminosäuren feststellen zu können, wird zusätzlich die Extinktion bei

280 nm gemessen. Die Reinheit der DNA ergibt sich aus dem Quotienten der

Extinktionen bei 260 nm und 280 nm. Reine DNA hat einen Wert von 1,8. Werte, die

darunter liegen, weisen auf Verunreinigungen durch Phenol, Chloroform oder Proteine

hin. Werte über 1,8 deuten auf das Vorhandensein von RNA oder degradierter DNA hin.

4.3.4 Restriktionsverdau

Beim Restriktionsverdau wird die doppelsträngige DNA mittels Restriktionsendonukleasen

(DNA-spaltende Enzyme) an kurzen, jeweils spezifischen Erkennungssequenzen

geschnitten. Da diese Erkennungssequenzen in unterschiedlichen Abständen im Genom

vorkommen, entstehen Fragmente unterschiedlicher Länge.

Die genomische DNA wird hierfür in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit dem

Restriktionsenzym Hinf I und der entsprechenden Menge Verdaupuffer versetzt und über

Nacht bei 37°C verdaut.

Am nächsten Morgen werden die Restriktionsfragmente gefällt.

Zum Restriktionsverdau werden bei Raumtemperatur 30 µl Na-Acetat-Lösung (3 M)

gegeben und gemischt. Anschließend werden 500 µl eisgekühlter Ethanol zum Fällen der

Restriktionsfragmente hinzugegeben und die Probe für 30 min im Gefrierschrank bei -

20°C gelagert. Die Lösung wird danach bei 4°C für 30 min mit 14000 U/min zentrifugiert,

so dass der Überstand nach der Zentrifugation verworfen werden kann. Das Pellet wird

zweimal mit 70 %-igem Ethanol gespült und wiederum für 30 min mit 14000 U/min

zentrifugiert. Nachdem der Überstand abermals verworfen und das Pellet bei

Raumtemperatur angetrocknet worden ist, bleibt die fragmentierte DNA zum Auflösen in

20 µl H2O deion. über Nacht im Kühlschrank.


4.3.5 Submarine - Agarose - Gelelektrophorese

Die durch den Restriktionsverdau erhaltenen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge

werden mittels der Submarinen-Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Hierzu wird eine

elektrische Spannung an ein Gel, welches als ein engmaschiges dreidimensionales Gitter

vorzustellen ist, gelegt. Die einzelnen Fragmente (negativ geladen) wandern in dem

elektrischen Feld bei gleicher Ladung aufgrund ihrer unterschiedlichen Länge

verschieden weit in das Gel in Richtung Anode, wobei lange Fragmente aufgrund der

sterischen Hinderung nicht so schnell durch das Gel wandern können wie kürzere.

Zur Submarinen-Agarose-Gelelektrophorese wird ein 0,8 %iges Agarosegel verwendet.

Dabei werden 1,6 g Agarose in einen 250 ml Erlenmeyer-Kolben eingewogen, in 200 ml

TBE-Puffer suspendiert und in der Mikrowelle aufgelöst. Das weitere Vorgehen wurde

bereits unter dem Punkt Submarine-Agarose-Gelelktrophorese (15 x 15 cm Probegel)

beschrieben, abgesehen von folgenden Abwandlungen:

- bei 55°C werden 1 µl Ethidiumbromid zur Agarose pipettiert und gemischt

- der verwendete Gießtrog hat die Maße 15 x 25 cm

- der Slot-Kamm wird in nur 1 cm Entfernung vom Gießtrog-Anfang gesetzt

- als DNA-Fragment-Längenstandard diente Hind III-verdaute λ-DNA

- die Elektrophorese läuft für 24 h bei 25 mA

Das Ergebnis der Trennung wird über einem UV-Transilluminator begutachtet und

fotografiert. Die durch den DNA-Längenmarker gekennzeichneten DNA-Fragmente

werden mit einer Pasteurpipette ausgestanzt.

4.3.6 Vakuum Blotting

Beim Vakuum Blotting wird mit einem Vakuum Blotter (Abb.12) die negativ geladene DNA

aus dem Agarosegel auf die darunter liegende positiv geladene Nylonmembran

transferiert. Dies geschieht dadurch, dass ein Vakuum erzeugt wird, welches die

Blottinglösung, die als Transportmedium für die DNA dient, durch das Gel und die

Membran transferiert. Da nun die DNA Fragmente größer sind, als die Porengröße der

Nylonmembran, können diese die Membran nicht durchdringen und bleiben an ihr haften.


Abb.12: Vakuum Blotter

Um den Vakuum Blot ausführen zu können, sind einige Vorbereitungen nötig. Zuerst

werden die Geltaschen mit 1,0 %-iger Agarose verschlossen. Danach wird das Gel in

einer Wanne auf dem Schütteltisch 30 min mit der Denaturierungslösung denaturiert und

anschließend 15 min mit der Blottinglösung inkubiert. Während dieser Zeit werden nun

der Gelgröße entsprechend das Filterpapier und die Nylonmembran zurechtgeschnitten

und zuerst mit destilliertem Wasser angefeuchtet, später dann in der Blottinglösung

getränkt. Der Aufbau des Vakuum Blottes erfolgt so, wie in Abb.13 dargestellt. Eventuell

auftretende Luftblasen zwischen Filterpapier und Membran sind durch Abrollen der

Membran mit einer 10ml Glaspipette zu entfernen.

Abb.13: Aufbau eines Vakuum Blottes

Ist die Apparatur aufgebaut, werden ca. 1,5 l Blottinglösung in das Reservoir über dem

Gel geschüttet. Der Unterdruck wird zwischen 3 und 4 Inches Hg eingestellt. Die durch

Abdichtrahmen

Agarosegel

Gummidichtung mit Fenster

Positiv geladene Nylonmembran

Filterpapier Poröse Platte

Basis Modul

Glaskolben zum Auf- fangen der Blottinglösung

Vakuum Pumpe

Basismodul

Blottinglösung


das Gel und die Membran gesogene Blottinglösung wird in einem Glaskolben mit

seitlichem Anschluss, der zwischen Blot und Vakuumpumpe geschaltet ist, aufgefangen.

Nach 4 Stunden wird der Vakuum Blot wieder abgebaut und das Resultat auf dem UV-

Transilluminator begutachtet.

Anschließend wird die Membran kurz in 6x SSC gespült und zur DNA Fixierung für 2 h bei

80°C im Trockenschrank gebacken. Die so präparierte Membran kann nun bis auf

Weiteres im Kühlschrank gelagert werden.

4.3.7 Prähybridisierung

Die Prähybridisierung soll unspezifische Bindungen an die Membran verhindern. Hierbei

wird die einzelsträngige DNA mit fragmentierter und denaturierter DNA von Echerischia

coli komplementiert.

Die gebackene Membran wird zuerst mit 70 %-igem Ethanol, dann mit deionisiertem

Wasser und anschließend mit 6 x SSC gespült und mit Hilfe einer Pipette in einem

zylinderförmigen Hybridisierungsgefäß so abgerollt, dass die DNA Seite innen ist. Danach

wird die Membran mit der Prähybridisierungslösung bei 25°C im Hybridisierungsofen

inkubiert.

4.3.8 Hybridisierung und Blocking

Eine Stunde später wird die Prähybridisierungslösung gegen die Hybridisierungslösung

ausgetauscht. Die Hybridisierung erfolgt über einen Zeitraum von 5 Stunden bei 38°C im

Hybridisierungsofen. Beim Hybridisierungsvorgang wird die Mikrosatelliten Sonde

(GACA)4, die mit Digoxigenin markiert ist, an die DNA angelagert. Die sondenspezifische

Hybridisierungstemperatur wird nach folgender Formel berechnet:

Ti = Tm - 10°C

wobei

Ti: Hybridisierungstemperatur der Sonde

Tm: Schmelztemperatur der Oligonukleotid - Sonde = 4 × (Anzahl der Basen

an Guanin und Cytosin) + 2 × (Anzahl der Basen an Adenin und Thymin)

Bsp.:

Sonde (GACA)4 = (GACAGACAGACAGACA)


Ti = {4 × (GGGG) + 4 x (CCCC) + 2 × (AAAAAAAA)} - 10°C

ð Ti = (4 × 4 + 4 x 4 + 2 × 8) - 10°C = 38°C

Nach der Hybridisierung wird die Membran dreimal je 30 min mit 6 x SSC bei 25°C

gewaschen, um unspezifisch angedockte Sonde abzuwaschen. Anschließend wird die

Membran über Nacht mit 0,5 %iger Blocking-Lösung bei 25°C im Hybridisierungsofen

inkubiert, um unspezifische Bindungen des Antikörpers an die Membran zu verhindern.

4.3.9 DIG-Antikörperbehandlung und Immunologische Detektion

Am nächsten Morgen wird die Blocking Lösung durch zweimaliges kurzes (ca. 5 min)

Spülen in je 20 ml TBS-Puffer bei 25°C entfernt und die Membran gleichzeitig auf den

benötigten pH Wert von 7,5 äquilibriert. Danach wird die Membran ebenfalls bei 25°C für

20 min mit der Antikörperlösung inkubiert, um das Anti-Digoxigenin-Alkalische-

Phosphatase-Konjugat an die hybridisierten, mit Digoxigenin markierten Nukleinsäuren zu

binden. Die Antikörperlösung wird nach der Inkubation verworfen. Zum völligen Entfernen

der Antikörperlösung wird die Membran dreimal je 10 min bei 25°C mit 10 ml TBS-Puffer

gespült. Anschließend wird die gespülte Membran für 15 min mit 10 ml Färbe-Puffer

(ohne Farbstoff) auf pH 9,5 äquilibriert. Die äquilibrierte Membran wird im

Hybridisierungsofen bei 37°C im Hybridisierungsgefäß mit 20 ml Färbe-Lösung

behandelt. In der nachfolgenden Enzym- katalysierten Farbreaktion mit BCIP (5-Brom-4-

chlor-3-indolyl-phosphat) und NBT (Nitroblau-Tetrazoliumsalz) entsteht ein brauner, bei

längerer Behandlung, blauer Niederschlag, der die Hybridmoleküle sichtbar macht. Der

Niederschlag rührt daher, dass die Alkalische Phosphatase Phosphat spaltet und bei

dieser Reaktion Elektronen freigesetzt werden, die den Farbstoffvorläufer NBT in einen

unlöslichen Farbstoff umwandeln. Die Phosphatase-Farbreaktion wird bei pH 9,5 und

Anwesenheit von Magnesium-Ionen durchgeführt. Wenn das Ziel, ein möglichst gutes

Banden / Hintergrund-Verhältnis, was sich nach etwa 30 - 60 Minuten eingestellt hat,

erreicht ist, wird die Farbreaktion durch Waschen mit H2Odeion. beendet. Die Membran mit

den Hybridisierungsmustern wird anschließend getrocknet und lichtgeschützt in einer

Klarsichtfolie aufbewahrt.


4.4 RAPD-PCR

Für die RAPD-PCR wird dieselbe DNA verwendet, die bereits zuvor mit der Salz-

Chloroform-Methode isoliert und für das Multilocus-DNA-Fingerprinting verwendet worden

ist. Da die Konzentration dieser DNA-Lösung für die RAPD-PCR zu hoch ist, wird ihr ein

Teil entnommen, und auf einen Wert von 0,1 µg DNA pro µl Lösung verdünnt.

Um das Auftreten von unerwünschten Reaktionen zu vermeiden, sollen die Schritte von

der Vorlage der DNA bis zum Einsetzen der Proben in den Thermocycler in möglichst

kaltem Milieu stattfinden. Aus diesem Grund werden alle Vorgänge bis zum Einsetzen der

Proben in den Thermocycler auf Eis durchgeführt.

Je Probe werden 2 µl dieser DNA Lösungen (200 ng Template DNA pro Probe) in

beschriftete und im Eisblock stehende 0,2 ml PCR-Gefäße übertragen.

Der Mastermix für 20 Proben setzt sich aus 400 µl gekühltem H2Obidest., 58 µl Puffer, 58

µl Primer, 12 µl dNTP`s und 6 µl Polymerase, die in einem 1,5 ml Eppendorf

Reaktionsgefäß gemischt werden, zusammen. Pro Probe werden 23 µl dieses

Mastermixes zu den 2 µl DNA Lösung hinzupippetiert und gut vermischt. Die so

vorbereiteten Proben werden nun in den Thermocycler gestellt.

Bevor die 40 Zyklen beginnen, sollte die DNA 5 min auf 94°C erhitzt werden, um sie

vollständig zu denaturieren und um eventuelle Endonukleasen oder sonstige Störfaktoren

zu deaktivieren.

Darauf folgen 40 Zyklen, wobei die DNA bei jedem Zyklus 30 sek bei 94°C denaturiert

wird, die RAPD-Primer sich 1min bei 36°C an die denaturierte DNA anlagern können, und

der DNA Strang zwischen den Primern 2 min bei 72°C synthetisiert wird.

Der letzte Sytheseschritt wird noch für 10 min gehalten. Danach werden die Proben auf

4°C heruntergekühlt.

Die elektrophoretische Auftrennung der Amplifikationsprodukte erfolgt in einem 1,4

%igem Agarosegel. Wie auch beim Probegel wird hierbei ein 15 x 15 cm großes Tray und

ein Slotkamm mit 20 Zähnen verwendet. Um ein 1,4 % iges Gel herzustellen werden 2,1

g Agarose Typ 1 (Amresco Inc., Solon, Ohio) in 150 ml TBE-Puffer unter Hitzeeinwirkung

gelöst. Damit die Amplifikationsprodukte auf dem UV-Transilluminator sichtbar werden,

wurden die Lösung bei 60°C mit 7,5 µl Ethidiumbromid versetzt.

Zu den 25 µl PCR-Proben (2 µl DNA Lösung + 23 µl Mastermix) werden noch 4 µl Stop-

Lade-Mix hinzugegeben. Anschließend werden die Proben in die Taschen des

Agarosegels einpipettiert. Zur elektrophoretischen Auftrennung wird eine Stromstärke von

40 mA über einen Zeitraum von 4 h angelegt, was einer Laufstrecke von etwa 10 cm


entspricht. Nach der Elektrophorese werden die Amplifikationsprodukte auf dem UV-

Transilluminator betrachtet und fotografisch festgehalten.

4.5 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der Fingerprints erfolgte nach den „klassischen“

Auswertverfahren von Lynch (1991), die für codominante Marker im DNA-Fingerprinting

entwickelt wurden.

In die Wertung kamen bei der vorliegenden Arbeit nur Banden, die innerhalb eines

Auswertbereiches von 1000 bis 23500 bp lagen. Diese Banden wurden dann im Hinblick

auf jede Bandenposition mit (I) für anwesend und (0) für nicht anwesend beurteilt, in eine

0/I Matrix übertragen und ausgewertet

4.5.1 Anzahl der Banden

Die durchschnittliche Anzahl von polymorphen Banden (∈) (Banden, die nicht in allen

Individuen vorkommen) pro Individuum, wird aus der Summe der polymorphen Banden

(ni) aller Individuen durch Bildung des arithmetischen Mittels bestimmt.

inx

∑∈=1

ni : Anzahl der polymorphen Banden

x : Stichprobengröße

Zusätzlich dazu wurde die Standardabweichung (s) bestimmt:

( )11

2

2

1−

−=

∑

=∑=

nn

nS

n

iii

n

ixx


4.5.2 Berechnung der Bandsharing-Rate (BSR) bzw. der mittleren

Wahrscheinlichkeit für eine übereinstimmende Bande

Die Bandsharing-Rate für zwei Individuen x und y berechnet sich aus der doppelten

Anzahl gemeinsamer Banden in ihrem Fingerprint-Profil dividiert durch die Summe der

individuellen Bandenzahlen. Sie entspricht gleichzeitig der mittleren Wahrscheinlichkeit Pb

(von einigen Autoren auch x genannt, u.a.: Jeffreys et al. 1985, Georges et al. 1988),

dass eine Bande bei nichtverwandten Tieren gleichzeitig vorkommt. Verschiedene

Autoren bezeichnen die Bandsharing-Rate auch als Ähnlichkeitskoeffizient, Band-

Similary-Index, Bandsharing-Frequency, Bandsharinglevel oder D-Wert (Nei & Li 1985,

Wetton et al. 1987, Haberfeldt et al. 1991, Lynch 1991, Nybom 1991, Wagner 1995,

Dahle 1996)

yx

xyb

nnn

PBSR+⋅

==2

nx : Zahl der Banden von Individuum x

ny : Zahl der Banden von Individuum y

nxy : Zahl der Banden, die Individuum x und Individuum y gemeinsam haben

4.5.3 Wahrscheinlichkeit Pi, dass zwei Fingerprints identisch sind

Die Wahrscheinlichkeit von zwei absolut identischen Fingerprints (Pi) berechnet sich aus

der Wahrscheinlichkeit, dass eine Position von zwei zufällig ausgewälten Individuen einer

Population identisch ist [ (1 - 2 Pb) + (2Pb2) ], und dem Exponenten N, der die Anzahl der

beurteilten Positionen bezeichnet.

( ) ( )[ ]bb

Ni PPP 2

221 +−=

Pb : Wahrscheinlichkeit, für eine übereinstimmende Bande

N : Anzahl der beurteiten Positionen


4.5.4 Wahrscheinlichkeit Pg, dass Individuum x die gleichen Banden aufweist wie

Individuum y

Pg gibt die Wahrscheinlichkeit an, dass ein zufällig aus einer Population entnommenes

Individuum x die gleichen Banden aufweist, wie ein Individuum y. Hierbei kann Individuum

y noch zusätzliche Banden zeigen. Somit gibt Pg also nicht die Wahrscheinlichkeit für

identische Muster an.

Pb: Wahrscheinlichkeit für eine übereinstimmende Bande ∈: Durchschnittliche Zahl der polymorphen Banden

4.5.5 Berechnung des Verwandtschaftkoeffizienten

Anhand der Bandsharing-Rate von Individuen einer Population ist es nicht möglich auf die

Verwandtschaftsverhältnisse zu schließen, besonders nicht bei Individuenpaaren mit

geringem Verwandtschaftsgrad (Burke & Bruford 1987, Lynch 1988 & 1991, Jones et al.

1991). Das ist dadurch zu erklären, dass unverwandte Individuen ein gewisses

Hintergrund-Bandsharing aufweisen. Die Gründe dieses Hintergrund-Bandsharing sind

zum Einen darin zu sehen, dass Banden auch bei unverwandten Individuen

übereinstimmen können, wenn die betreffenden Allele per Zufall identisch sind, zum

Anderen kann es sich hierbei auch um komigrierende Banden handeln, die jedoch keine

identischen Allele beinhalten.

Den Zusammenhang zwischen Verwandtschaftskoeffizienten, Bandsharing-Rate und

Hintergrund-Bandsharing stellt folgende Formel dar:

( )eeBSR

r−

−=

1

r : Verwandtschaftskoeffizient

BSR : Bandsharingrate

e : Hintergrund Bandsharing (gemeinsame Banden von nichtverwandten Individuen)

∈= bg PP


4.5.6 Populationsdifferenzierung

In Analogie zu Wright`s Index der Populationsdifferenzierung, F´ST (1976), gibt Lynch eine

Näherungsformel an, mit der man die Differenzierung von Populationen bestimmen kann.

bw

bST SS

SF −−−= 2

1`

Sb: durchschnittliche BSR für alle Paare der Populationen x und y

Sw: durchschnittliche BSR der Population y

Die Formel geht auf Wight`s „Index of population subdivision“ zurück. Der F´ST Wert ist

definiert als der Bruchteil der genetischen Diversität, der auf ein

Populationsdifferenzierung zurückzuführen ist. Er gilt als Maß der genetischen

Verarmung einer Population und kann in zwei Richtungen berechnet werden. Der Index

berechnet die Abweichung der BSR einer Population von den BSR zwischen den

Populationen. Die hierbei errechneten Werte können zwischen 0 und 1 liegen. Der

Maximalwert von 1 wird dann erreicht, wenn in lokalen Populationen alternierende Allele

fixiert werden und somit ein Verlust jeglicher genetischen Variablität eintritt.

4.5.7 Genetische Distanz zwischen Populationen

Die genetische Distanz (D’ij) zwischen Populationen kann nach Lynch (1991), in Analogie

zu Nei’s Schätzung (1972) auch mit den DNA Fingerprint Daten berechnet werden. Sie ist

definiert als arithmetisches Mittel aller an einem Genort festgestellten genetischen

Distanzen und gilt als Maß für die genetische Unterscheidbarkeit von Populationen. Bei

großer Übereinstimmung strebt dieser Wert gegen 0, bei geringer Übereinstimmung

gegen 1, bzw. formelbedingt gegen ∞.

⋅−≅

```´

ln`SS

Sji

ijijD

Si : durchschnittliche BSR innerhalb der Population x

Sj : durchschnittliche BSR innerhalb der Population y

′Sij : durchschnittliche BSR (zufälliger Individuenpaare) der Populationen y und y


4.5.8 Durchschnittliche Allelfrequenz q für eine Bande

Bei Vorliegen eines genetischen Gleichgewichtes und unter der Annahme, dass

comigrierende Banden immer dasselbe Allel darstellen und alle Banden Allele eines

Locus sind, ist die mittlere Frequenz für eine Bande gleich der Summe aus heterozygot

und homozygot bedingten Banden. Daraus ergibt sich dann eine durchschnittliche

Allelfrequenz q für eine Bande (Jeffreys et al. 1985, Georges et al. 1988):

q = 1 - )1( uS−

Su: Bansharingrate zwischen nichtverwandten Eltern (Hintergrundbandsharingrate)

4.5.9 Mittlere zu erwartende Wahrscheinlichkeit, dass ein Individuum mit seinen

Nachkommen eine gemeinsame Bande hat.

Ein Individuum hat eine Wahrscheinlichkeit von )2( 2

2

qqq−

homozygot für eine bestimmte

autosomale Bande zu sein (Genotyp +/+). Wenn ein Nachkomme homozygot ist, muss

natürlich auch ein Elternteil diese Bande teilen. Mit einer Wahrscheinlichkeit von

)2()1(2

2qqqq

−−

wird eine Bande erwartungsgemäß heterozygot sein (Genotyp +/-). In der

hälfte der Fälle wird dann die Bande von der Mutter oder vom Vater geerbt. Der Elternteil,

der ein `-` Allel vererbt hat, kann dennoch diese Bande mit dem Nachkommen teilen,

wenn sein anderes Allel `+` ist (Wahrscheinlichkeit q). Daraus folgt die Wahrscheinlichkeit

So, dass eine Bande im Fingerprint eines Nachkommen auch in dem eines Elternteils

vorkommt (Jeffreys et al. 1985, Georges et al. 1988), mit:

So = qqq

−−+

21 2

q: Allelfrequenz


4.5.10 Mittlere zu erwartende Wahrscheinlichkeit, dass eine Bande zwischen zwei

Vollgeschwistern übereinstimmt

Nach Jeffreys et al. 1985, Georges et al. 1988, Nybom 1990 und Haydock et al. 1996 ist

die mittlere zu erwartende Wahrscheilichkeit, dass eine Bande zwischen Vollgeschwistern

übereinstimmt, gleich:

Ss = )2(4

654 32

qqqq

−+−+

q: Allelfrequenz

Ergebnisse und deren Diskussion 42

5. Ergebnisse und deren Diskussion

5.1 Fangmethodik

Von den 3 eingesetzten Fallensystemen, der Holzkastenfalle mit Blechwippe (Abb.14),

der Hengstlerfalle (Abb.15) und der Kunststoff-Wieselfalle (Abb.16) hat sich die

Kunststoff-Wieselfalle als die zum Fang von Microtus arvalis am besten geeignetste

herausgestellt.

Sowohl bei der Holzkastenfalle, als auch bei der Hengstlerfalle traten bei Nässe massive

Probleme auf. Durch Feuchtigkeit quellte das Holz der Holzkastenfalle so stark auf, dass

die Klappe, welche den Eingang verschließen sollte, blockiert wurde und nach dem

Auslösen des Trittmechanismus (einer Blechwippe) nicht mehr funktionierte. Nach einigen

Witterungswechseln (Aufquellen und Trocknen der Fallen) war das Holz meist so

verzogen, dass sie überhaupt nicht mehr auslöste. Zudem ist es 2 Individuen gelungen

sich durch das Holz wieder in die Freiheit zu nagen. Ohne diese Probleme wäre die

Holzkastenfalle die Optimallösung zum Fang von Microtus arvalis gewesen, denn sie

wurde sehr gerne angenommen. Außerdem ist sie die Falle mit der besten Handhabung.

Sie nicht so groß, sperrig und schwer wie die Kunststoff-Wieselfalle, was das Ausbringen

der Holzkastenfalle sehr erleichtert. Auch ist diese Art von Fallen sehr gut zu beködern,

da der Auslösemechanismus nicht wie bei der Hengstlerfalle mit dem Köder in direkter

Verbindung steht. Somit kann die Falle mit viel Futter versehen, und bei der Beköderung

nicht versehendlich ausgelöst werden. Durch das Drahtgitter, welches die obere

Fallenabdeckung bildet ist eine direkte Ansprache möglich, so dass Fehlfänge direkt

wieder in die Freiheit entlassen werden konnten, ohne vorher, zwecks Bestimmung auf

Gattungsniveau, in einen durchsichtigen Nylonbeutel überführt worden zu sein. Da die

Holzkastenfallen von oben mit einem Blech abgedeckt waren (Feldmäuse fühlen sich in

der Dunkelheit wohlig), außerdem reich beködert waren und von ihrer Größe her

ausreichend sind, wurden nur wenige Mäuse tot in der Holzkastenfalle aufgefunden.


Abb.14: Holzkastenfalle mit Blechwippe (H: 75 mm x B: 60 mm x T: 270 mm)

Bei der Hengstlerfalle handelt es sich um eine Fallenart, bei welcher der Köder auf einer

Plexiglaswippe präsentiert wird. Betritt die Maus die Wippe und geht über einen

bestimmten Punkt hinaus, klappt die Wippe um und der Eingang wird von einer

Plexiglastür verschlossen. Bei Nässe jedoch sammelte sich unter der Plexiglaswippe ein

Feuchtigkeitsfilm, der diese oftmals so stark zurückhält, dass das Gewicht einer Feldmaus

nicht ausreicht die Wippe zum umklappen zu bewegen, um damit den Eingang zu

verschließen. Filterpapierstreifen, die bei Nässe unter die Wippe gelegt wurden,

verbesserten die Ergebnisse geringfügig. Da der Wippmechanismus dieses Fallentypus

sehr sensibel reagiert und der Köder auf diesen Auslösemechanismus gelegt wird, kann

die Hengstlerfalle mit nur wenig Köder ausgestattet werden. Bei der Beköderung selbst

muss aufgepasst werden, dass nichts von dem Köder unter die Wippe gerät, da diese

sonst nicht weit genug umklappt, um den Eingang zu verschließen. Auch getrocknete

Fäkalien sowie Schneckenschleim verkleben oder behindern oft den

Auslösemechanismus, so dass eine ständige Funktionskontrolle und Instandsetzung

(auch bei nicht ausgelöstem Mechanismus) bei dieser Fallenart unerlässlich ist. Die

Mortalität in der Hengstlerfalle war im Vergleich zu den 2 anderen Fallentypen bei weitem

am höchsten. Dies ist darauf zurückzuführen, dass diese Fallen für Microtus arvalis zum

einen zu klein sind, und das Futterangebot mit welchem man diese Fallen beködern kann

sehr spärlich ist. Abhilfe dagegen schaffen entsprechend den Vorschlägen von Halle

(1994), Schutzkästen aus Holz, die auch für Hengstlerfallen erhältlich sind. Diese werden

an der geöffneten Rückwand der Falle befestigt und mit Köder und Nestmaterial bestückt,

damit sich das gefangene Tier dorthin zurückziehen und so in Gefangenschaft einen

längeren Zeitraum überleben kann. Durch diese Maßnahmen werden jedoch die einzigen


Vorteile, die die Hengstlerfalle gegenüber der Holzkastenfalle und im besonderen

gegenüber der Kunststoff-Wieselfalle hat, nämlich ihre geringe Größe und Gewicht (190

gr.) und der relativ niedrige Preis, aufgehoben.

Abb.15: Hengstlerfalle (H: 50 mm x B: 50 mm x T: 145 mm)

Die Kunststoff-Wieselfalle ist eine Wippfalle mit freiliegendem Wippbrett. Geht die Maus

über das Wippbrett und gelangt zu einem bestimmten Punkt, so klappt das Wippbrett um

und versperrt somit den Eingang. Gleichzeitig arretiert ein Eisenbügel das Wippbrett in

genau dieser Position, um zu verhindern, dass die Maus durch Zurücklaufen auf diesem

Wippbrett den Eingang wieder öffnet und ins Freie gelangt. Diese Fallen stellten sich am

fängigsten für Microtus arvalis heraus. Darüber hinaus sind sie witterungsbeständig und

verbissfest, was eine lange Lebensdauer mit sich bringt. Die Mortaliät dieses Fallentyps

war absolut gering, was der Größe dieser Fallen und damit natürlich auch dem

Futterangebot, welches man in dieser Falle unterbringen konnte, zu verdanken ist.

Microtus arvalis hat diese Kunstoff-Wieselfallen sehr gerne angenommen. Dies ist

dadurch zu erklären, dass diese Falle mit einem gelochten verzinktem Stahlblech

abgeschlossen ist, was bewirkt, dass die Wieselfalle ständig durchlüftet ist. Somit stellt

dieses „Gebilde“ für die Maus kein Gefahrenpotetial dar, da sie es ja nur als Röhre

wahrnimmt, die nach beiden Seiten offen ist. Der einzige Nachteil dieser Fallen liegt in der

durch ihre Größe bedingte Unhandlichkeit.


Abb.16: Kunststoffwieselfalle(∅: 95 mm x T: 470 mm)

Als Beifang traten Apodemus spec., Arvicola terrestris, Clethrionomys glareolus,

Micromys minutus, Microtus agrestris und Sorex spec. auf. Wobei Micromys minutus und

Sorex spec. fast ausschließlich mit den Hengstlerfallen gefangen wurden, was auf die

Sensibilität des Auslösemechanismus dieser Fallen rückzuführen ist.

Von den eingesetzten Ködern (Haferflocken, Haselnüsse, Erdnussbutter, Katzenfutter

oder Früchtemüsli) wurde das Früchtemüsli am liebsten angenommen. Probleme

machten in dieser Beziehung Schnecken, die sich über die eingesetzten Köder

hermachten und die Fallen oft leerfrassen.

5.2 DNA-Isolierung

Die DNA Ausbeute, gemessen anhand des Gene Quant II ergab einen durchschnittlichen

Gehalt von 500 µg - 1000 µg chromosomaler DNA. Die Menge an eingesetztem Gewebe

lag hierbei zwischen 150 mg und 200 mg. Ausschlaggebend für die Menge an

chromosomaler DNA, die aus dem Gewebe isoliert werden konnte, war nicht allein die

Masse an eingesetztem Gewebe, sondern auch die Gewebeart spielte hierbei eine

entscheidende Rolle. So konnte aus der Leber die meiste, aus den Muskeln wesentlich

weniger, und aus dem Schwanz die geringste Menge an hochmolekularer genomischer

DNA gewonnen werden.

Die mit dem Gene Quant II gemessene Reinheitsbestimmung ergab durchschnittliche

Werte zwischen 1,75 – 1,90 (vgl. Wieacker & Müller 1985). Diese entsprechen in etwa


den von Lagoda et al. (1989) ermittelten Werten; der die Salz-Chloroform-Methode

entwickelte.

Bei der Überprüfung der DNA im Probegel konnte man eine scharfe Bande unzerstörter

hochmolekularer genomischer DNA erkennen. Aber auch eine leichte Verunreinigung der

Proben mit RNA und einem sehr geringen Teil an degradierter DNA fiel auf. Dies war

aufgrund der hier angewandten Isolierungsmethode (Salz-Chlorform-Methode) nicht

vollständig zu vermeiden.

Leichte Verunreinigungen der DNA durch RNA störten die Fingerprintmuster in keinster

Weise. Auch eine leichte Degradation der DNA hat keine Einfluss auf die

Fingerprintmuster, wie am Beispiel von alten und unter extremen Bedingungen

gelagertem Spurenmaterial gezeigt wurde (Pöche et al. 1990, Roewer et al. 1990). Es

treten hierbei keine zusätzlichen Banden auf, sondern die bereits vorhandenen

hochmolekularen Banden verlieren lediglich an Intensität und bleichen mit zunehmender

Degradation aus.

Das Gewebe, das sich nach dieser Isloierungsmethode sowohl von der Quantität an

gewonnener DNA als auch der Qualität der DNA am schlechtesten eignete, war der

Mäuseschwanz (siehe Abb.17). Bei Leber, Muskelgewebe und Niere wurden mit der Salz-

Chloroform-Methode durchweg gute Ergebnisse erzielt. Da aus der Leber aber bei

gleicher Einwaage mehr DNA isoliert werden konnte, die von der Qualität nicht schlechter

war, als die der Muskeln, wurde hauptsächlich mit Lebergewebe gearbeitet.

Abb.17: Probegel mit DNA Isolaten aus Leber, Muskel, Niere und Mausschwanz. Weißer Pfeil kennzeichnet

die DNA die aus dem Mausschwanz isoliert werden konnte.

Dass die hier erzielte Ausbeute an DNA sehr hoch ist, lässt sich an Vergleichen mit

Mörsch (1992) bzw. Buitkamp (1989) erkennen. Mörsch konnte mit der Salz-Chloroform-

Methode aus zwischen 100 mg und 200 mg Rehgewebe 300 µg – 600 µg (also gerade


mal die Hälfte) gewinnen. Diese Menge entsprach in etwa auch der von Buitkamp

gewonnen DNA Menge, jedoch setzte dieser 4 g Knorpelgewebe ein und benutzte zudem

noch eine andere Isolierungsmethode.

5.3 Restriktionsverdau und Fluoreszenzfärbung

Zur Absicherung, dass genügend DNA pro Probe eingesetzt wurde und der

Restriktionsverdau vollständig stattgefunden hat, ist es unerlässlich, dieses nach der

Elektrophorese und der Anfärbung mit Ethidiumbromid auf dem UV-Tisch zu kontrollieren.

Um optimale Ergebnisse zu erhalten, musste der Restriktionsverdau mit einer Menge von

50 µg bis 60 µg genomischer DNA durchgeführt werden. Geringerer DNA Gehalt führte

nur zu einem, im Verhältnis zum Hintergrund, sehr schwachen Erscheinen einiger

hochmolekularer Banden, was wiederum Schwierigkeiten bei der Auswertung nach sich

zog.

Um einen vollständigen Restriktionsverdau zu gewährleisten, wurden bei EcoR1, Hae III

und Hinf I 2 Units Restriktionsenzym pro µg DNA eingesetzt. Bei Hind III musste die

Enzymkonzentration auf 5 Units Restriktionsenzym pro µg DNA erhöht werden, um

gesichert einen vollständigen Restriktionsverdau zu erhalten. Die 50 µg bis 60 µg DNA

aus der Stammlösung mussten vor dem Restriktionsverdau auf ein Endvolmen von 200 µl

mit H2Odeion. verdünnt werden. Dieselbe DNA Menge, aber in höherer DNA

Konzentrationen, d.h in weniger H2Odeion. gelöst, eingesetzt, führte erst bei stark erhöhter

Zugabe von Restriktionsenzym pro µg DNA regelmäßig zu einem vollständigen Verdau.

Für den Restriktionsverdau kamen die Restriktionsendonukleasen EcoR1, Hae III, Hind III

und Hinf I zum Einsatz (vgl. Tab.3). Von diesen stellte sich Hinf I als das am besten

Geeignetste heraus, um in Kombination mit den im Verlaufe dieser Arbeit getesteten

Sonden, variable genetische Fingerprints zu produzieren. Alle Restriktionsenzyme

erzielten einen vollständigen Verdau, der sich auf dem UV-Tisch als Fluoreszenzschmier

von Restriktionsfragmenten darstellte. Lediglich die Intensitätmaxima der von den

verschiedenen Restriktionsenzymen verdauten DNA lagen in unterschiedlich hohen

molekularen Bereichen (Abb.18).


Tab.3: Die verwendeten Restriktionsenzyme mit ihren Erkennungsschnittstellen, der optimalen

Restriktionsverdautemperatur und der Inaktivierungstemperatur

Restriktionsenzym Erkennungs-

schnittstelle

Optimale Temperatur

für Restriktionsverdau

Inaktivierungs-

temperatur

Eco R1 5’-G↓AATTC-3’ 37°C 65°C

Hae III 5’-GG↓CC-3’ 37°C 85°C

Hind III 5’-A↓AGCTT-3’ 37°C 85°C

Hinf I 5’-G↓ANTC-3’ 37°C 65°C

A B C D E

Abb.18: Vollständiger Restriktionsverdau der DNA von Microtus arvalis mit den Restriktionsenzymen Hae III

(A), Hind I (C), Hinf I (E). Unvollständiger Restriktionsverdau der DNA von Microtus arvalis mit dem

Restriktionsenzym Hind I (B).

Ein vollständiger Restriktionsverdau ist die Grundvoraussetzung um reproduzierbare

Fingerprints zu erhalten. Ein unvollständiger Verdau kann zu Fehlinterpretationen führen

(Nürnberg et al. 1991). Im Gegensatz zu dem vollständigen Restriktionsverdau, der als

kontinuierlicher Fragmentschmier nach der Gelelektrophorese auf dem UV-Tisch zu


sehen ist, tritt beim unvollständigen Verdau eine Bande unverdauter, hochmolekularer

DNA (> 23 kb) auf (Pena et al. 1991). Diese ist auch nachher im Fingerprint als Bande zu

erkennen (Nürnberg et al. 1991). Ein unvollständiger Verdau kann sich im Falle repetitiver

Sequenzen auch in einem leiterartigen Fragmentmuster im Fluoreszenzgel äußern (siehe

Abb.18, B).

Für alle untersuchten Mäuse war ein solcher unvollständiger Verdau auszuschließen, da

bei allen Mäusen, der erwähnte kontinuierliche Fragmentschmier, ein charakteristisches

Indiz für die Vollständigkeit des Restriktionsverdaus auftrat und kein leiterartiges

Fragmentmuster als Zeichen eines unvollständigen Restriktionsverdaus zu erkennen war.

Ferner wurden als Versuch, ob sich etwas am Restriktionsverdaus ändert,

Konzentrationen bis zu 15 Units Restriktionsendonuklease pro µg DNA eingesetzt. Da

sich bei so hohen Konzentrationen an Restriktionsenzym weder am Erscheinungsbild des

Fluoreszenzschmiers, noch am Fingerprint selbst etwas änderte, ist davon auszugehen,

das die eingesetzte Menge von 2 Units pro µg DNA ausreichend war. Nürnberg und

Mitarbeiter benutzten bei ihren Konzentrationsversuchen in der stärksten Konzentration 5

Units pro µg DNA (Nürnberg et al. 1991).

Verschieden hohe DNA Mengen zeigten keinen Einfluss auf das Hybridisierungsmuster.

Lediglich die Intensität der Banden veränderte sich.

Nach dem Hinf I Verdau war bei Microtus agrestris nach der Gelelektrophorese im DNA

Schmier eine fluoreszierende Bande im Bereich von etwa 2000 Basenpaaren (bp) zu

erkennen (siehe Abb.19). Die Fluoreszenzbande war absolut reproduzierbar und bei allen

Microtus agrestris monomorph. Auch eine höhere Enzymkonzentration hatte keinen

Einfluss auf diese Bande. Dass die Sequenzen bereits als Banden im Fluoreszenzschmier

erscheinen, deutet darauf hin, dass es sich hierbei um Sequenzen gleicher Länge

handelt, die sehr oft wiederholt im Genom vorkommen, also repetitive Sequenzen. Pena

et al. stellte 1991 beim Menschen nach einem Restriktionsverdau mit dem Enzym BspR I

bei Männern eine scharfe Bande im Bereich von 3400 bp fest. Sie stammte von repetitiver

DNA des menschlichen Y-Chromosoms und ist auf große Mengen an DNA von gleicher

Fragmentlänge zurückzuführen. Dies wiederum ist nur dann der Fall, wenn es sich um

repetitive Sequenzen (gleiche Länge und somit gleiche Laufstrecke) handelt (Mörsch

1992). Der Beweis, dass es sich hierbei um simpel repetitive DNA Sequenzen handelt,

konnte durch die Hybridisierung mit der Oligonukleotidsonde (GTG)5 erbracht werden.

Denn durch Hybridisierung mit dieser Sonde wurde die Fluoreszenzbande auf der

Membran sichtbar gemacht.

Da sie nur bei Microtus agrestris, nicht aber bei Microtus arvalis auftrat, diente sie als

erstes genetische Unterscheidungsmerkmal der beiden Arten, die ansonsten nur sehr

schwer, durch Untersuchungen des Gebisses, voneinander zu unterscheiden waren.


Leider wurden nur diese beiden Arten der Gattung Microtus gefangen, denn es wäre

interessant gewesen festzustellen, ob diese fluoreszierende Bande als artspezifischer

Marker herangezogen werden könnte. Das Auftreten solcher speciesspezifischer Banden

ist auch von anderen Tierarten (Gelter & Tegelström 1990, Mörsch 1992) beschrieben

worden und wird bei schwer zu unterscheidenden Arten bzw. Gattungen als

Unterscheidungsmerkmal erfolgreich eingesetzt (Anopheles: Yasothornsrikul el al. 1988,

Cervide: Lima de Farina u. Mitarbeiter 1984, Nematoden: Zarlenga et al. 1991, Mosquito:

Kedrova et al. 1991, Passeriformes: Gelter u. Tegelström 1990).

Abb.19: Restriktionsverdau mit der Restriktionsendonuklease Hinf I. Weißer Pfeil kennzeichnet

fluoreszierende Bande bei Microtus agrestris.

Nach der Meinung von Gelter und Tegelström (1990) sind die repetitiven Banden

entweder auf multiple Schnittstellen innerhalb der repetitiven Sequenzen, oder aber auf

das Vorhandensein derselben Schnittstellen in verschieden repetitiven Sequenzen

zurückzuführen. Sie vermuten außerdem, dass die Amplifikation der repetitiven

Sequenzen zu einer Differenzierung dieser Sequenzen und weitergehend zu einer

Isolierung zwischen Species und damit zu einer fortschreitenden Specification führt.

Auch Scherthan (1991) untersuchte diese Fluoreszenzbanden bei Capreolus capreolus.

Auch er führte sie auf repetitive Sequenzen zurück, die er in zwei Arten unterteilte: in eine

„interspersed“ DNA, deren sich wiederholende Sequenzen über das gesamte Genom

verteilt sind, und in die Satelliten DNA, die durch tandemartige Wiederholungen in

Assoziation mit Heterochromation gekennzeichnet ist. Nach Krawczak & Schmidtke


(1994) beläuft sich der Anteil von Satelliten DNA im Säugergenom von wenigen auf bis zu

50 %.

5.4 Auswahl der Species-Enzym-Sonden Kombination

Um die Fragestellung dieser Arbeit beantworten zu können, war das erste Ziel die richtige

Restriktionsenzym-Sonden Kombination für die Feldmaus zu finden, und das Multilocus-

DNA-Fingerprinting auf die vorhandenen Laborbedingungen so anzupassen, dass man

informative und individualspezifische Fingerprints erhält.

Wie entscheidend die Wahl der richtigen Restriktionsendonuklease ist zeigt sich allein

schon daran, dass von den 4 eingesetzten Restriktionsenzymen EcoR1, Hae III, Hind III

und Hinf I nur 2 (Hae III und Hinf I) in Kombination mit den getesteten Sonden ( (CA)8,

(GTG)5, (GACA)4, und (GATA)4 ) überhaupt Fingerprints bei Microtus hervorbrachten. Das

beste Resultat für Microtus arvalis lieferte das Restriktionsenzym Hinf I mit der Sonde

(GACA)4. Hae III lieferte zwar auch Banden in Kombination mit den Oligonukleotidsonden

(CA)8, (GTG)5 und (GACA)4, jedoch waren diese Fingerprints von der Schärfe der

Banden, der Auswertbarkeit oder ihres Polymorphiegrades als qualitativ wesentlich

geringer anzusehen. Somit war die Wahl von Hinf I als Restriktionsendonuklease für alle

weiteren Ansätze durchaus gerechtfertigt. Gegen ein weiteres Ausprobieren von noch

mehr Restriktionsenzymen sprechen der zum Einen nicht unerhebliche finanzielle

Aufwand (Restriktionsenzyme sind sehr teuer), zum Anderen aber auch der zeitliche

Aufwand. Außerdem wurden mit Hinf I so gute Ergebnisse erzielt, dass es fraglich

erschien, ob bei anderen Restriktionsenzymen noch bessere Ergebnisse erzielt werden

könnten.

In der Literatur wird einerseits die Wahl des richtige Restriktionsenzyms für qualitativen

Unterschiede von Fingerprints verantwortlich gemacht (Nybom 1991), andererseits zeigen

andere Autoren (Buitkamp 1989), dass verschiedene Enzyme bei gleicher Sonde lediglich

eine Änderung der Bandenpositionen bewirken. Die Fragmentlängenunterschiede

zwischen den Allelen und die damit verbundenen Bandenmuster bleiben somit erhalten.

Das heißt, dass andere Enzyme bei gleicher Sonde nicht unbedingt andere Fingerprints

bedeuten müssen. Es kommt hierbei darauf an, wo die Erkennungsstellen, an welchen die

Restriktionsenzyme schneiden, liegen. Sind die Sequenzeinheiten lang, verändert sich

das Fingerprintmuster kaum (Beyermann et al. 1992).

Ein weiterer wichtiger Punkt beim Multilocus-DNA-Fingerprinting ist die Wahl der richtigen

Sonde, an die man allgemein folgende Anforderungen stellt: Zum Einen sollte mit der

ausgewählten Sonde ein möglichst großer Molekulargewichtsbereich detektierbar sein.


Da die Anzahl und die Frequenz der polymorphen Banden die Genauigkeit der Methode

bestimmen, muss der Polymorphiegrad der Banden möglichst hoch sein (Gilbert et al.

1991). Das war mit der Enzym-Sonden Kombination Hinf I und (GACA)4 gegeben

(Abb.20). Diese Sonde hybridisierte zwar relativ schwach (d.h. die Banden traten nicht so

deutlich hervor, wie es zum Beispiel bei (GTG)5 der Fall war), es fand sich keine

monomorphe Hybridisierungsbande bei Microtus arvalis und der auswertbare Bereich

reichte von 23500 bp bis zu 1000 bp.

Abb.20: Multilocus-DNA-Fingerprint von Microtus arvalis mit dem Restriktionsenzym Hinf I und der Sonde

(GACA)4

Im Vergleich dazu zeigte die Enzym-Sonden Kombination Hinf I mit der Sonde (GTG)5

zwar auch einen auswertbaren Bereich zwischen etwa 24000 bp und 2500 bp mit sehr

hoher Bandenschärfe, hoher Bandenintensität und einer viel höheren Bandenanzahl;

jedoch war der Polymorphiegrad dieser Kombination bei Microtus arvalis gering. Setzt

man diese Kombination nun bei Microtus agrestris ein ergibt sich wiederum ein völlig

anders Bild. Hier zeigen sich mit Hinf I und (GTG)5 weniger Banden als bei Microtus

arvalis, aber der Polymorphiegrad ist wesentlich höher, so dass diese Enzym-Sonden

Kombination zur genetischen Untersuchung von Microtus agrestris die geeignete wäre

(Abb.21).


Abb.21: Multilocus-DNA-Fingerprint von Microtus agrestris ( Individuen: A, B und F)und Microtus arvalis

(Individuen: C, D, E und G) mit dem Restriktionsenzym Hinf I und der Sonde (GTG)5

Diese großen Unterschiede der Fingerprintmuster sind eventuell dadurch zu erklären,

dass die Sonden (GTG)5 und (GACA)4 in verschiedenen Regionen hybridisieren. So

hybridisiert (GTG)5 beim Menschen hauptsächlich in den R-Banden positiven, GC-reichen

Regionen der menschlichen Autosomen, während die (GACA)4 Sonde hauptsächlich in

den „ nucleolus organizer regions (NOR`s)“ hybridisiert (Zischler et al. 1989a, Roewer et

al. 1990, Nanda et al. 1991, Nürnberg et al. 1991). Diese detektierten Sequenzen sind

nicht codierend und über das gesamte Genom verteilt, wodurch deren Einsatz

Veränderungen im gesamten Genom aufdecken kann (Pöche et al.1991).

Welchen Einfluss die Wahl der richtigen Sonde auf das Ergebnis hat, zeigt auch die Arbeit

von Moritz et al. (1991), der bei der Honigbiene mit der (CAC)5 Sonde

(Komplementärsonde zu (GTG)5, die laut Roewer et al. (1990) absolut identische Muster

wie (GTG)5 erzeugt) kein Hybridisierungssignal bekam, während er mit (GATA)4 gleich für

3 Restriktionsenzyme polymorphe Fragmente und somit individualspezifische Fingerprints

erhielt.

Laut Taylor et al. (1991) ist es möglich, dass die gleiche Sonde bei verschiedenen

Species unterschiedlich stark hybridisieren kann. So wurden mit den Jeffreys Sonden bei

den Koalas in Australien schwächere Hybridisierungen erzielt, wie beim Menschen.

Durch den direkten Einfluss der Sonde auf das Fingerprintmuster ist von ihrer Wahl auch

die Bandsharingrate abhängig. So ermittelte Wolfes et al. (1991) mit der Sonde (GGAT)4


bei nichtverwandten Vögeln eine Bandsharingrate (BSR) von 0,199 und bei der F1

Generation eine BSR von 0,431, während sich mit der Sonde (GACA)4 bei

nichtverwandten Vögeln eine BSR von 0,402 und bei verwandten Tieren eine BSR von

0,773 ergab.

Nach Roewer (1991) ist die Wahl der Sonde aber auch von der Menge an DNA, die

aufgetrennt werden soll und von dem Fragmentlängenbereich in welchem hybridisiert

werden soll abhängig. So hybridisiert (GTG)5 hauptsächlich im hochmolekularen Bereich,

während (GACA)4 und (GATA)4 dafür bekannt sind, hauptsächlich im niedermolekulareren

Bereichen zu hybridisieren. Dies kann bei Microtus arvalis dahingehend bestätigt werden,

dass sich bei der Hybridisierung mit (GACA)4 der größte Teil der Banden in dem Bereich

zwischen 9500 und 1000 bp verteilte, während sich bei der Hybridisierung mit (GTG)5 die

Banden relativ gleichmäßig von 23500 bp bis hin zu 2500 bp verteilten.

Die Eigenschaft der Sonden (GACA)4 und (GATA)4, hauptsächlich in niedermolekulareren

Bereichen zu hybridisieren, spielt eine wichtige Rolle bei teilweise degradierter DNA, die

meist in den niedermolekularen Bereichen noch intakt ist. So haben nach Pöche et al.

(1990) und Roewer et al. (1990) die Oligonukleotidsonden (GACA)4 und (GATA)4 den

besonderen Vorteil, dass sie auch nach langer Lagerung von Spurenmaterial oder

Gewebe, auch bei schon teilweise stattgefundener Degradation der DNA noch

unveränderte Fingerprints liefern.

5.5 Somatische Stabilität und Reproduzierbarkeit der Fingerprints

Am Anfang dieser Arbeit war nicht klar, ob aus der Leber jeder Microtus arvalis genug

DNA für das Multilocus-DNA-Fingerprinting gewonnen werden konnte, oder ob die DNA

der inneren Organe durch Degradation, bzw. apoptotische Prozesse (vgl. Eisenbarth

1999) für diese Methode unbrauchbar geworden ist. Daher musste sichergestellt werden,

dass die hypervariablen Hybridisierungsmuster eine gewebeunabhängige Stabilität

zeigen. Bei einem Vergleich unterschiedlicher Gewebearten von verschiedenen

Individuen dürfen somit die Unterschiede nicht zwischen den einzelnen Gewebearten,

sondern zwischen den einzelnen Individuen auftreten.

Zur Untersuchung dieser somatischen Stabilität wurden 10 Feldmäusen jeweils die Leber,

die Nieren und Muskelgewebe entnommen. Von diesen Gewebetypen wurde dann die

DNA isoliert und Fingerprints angefertigt. Erwartungsgemäß zeigte sich bei allen

Individuen kein Unterschied zwischen den einzelnen Gewebetypen, wohl aber zwischen

den einzelnen Individuen.


Damit konnte auch die somatische Stabilität der DNA aus verschiedenen Geweben der

Feldmaus, die beim Menschen schon mehrfach auch bei Langzeitlagerung des Gewebes

beschrieben wurde (Jeffreys et al. 1985, 1987, Nürnberg et al. 1989, Pöche et al. 1990,

Roewer et al. 1990, 1991), bestätigt werden.

Das es doch zu unterschiedlichen Fingerprintmuster in Abhängigkeit von den

verschiedenen Gewebearten bei einem Individuum kommen kann ist eventuell auf

unterschiedliche Methylierungszustände der DNA zurückzuführen. Da Hinf I jedoch ein

methylierungsunabhängiges Enzym ist und jedes Gewebe gleichartig verdaut, kann

dieses Problem hier weitgehend ausgeschlossen werden.

Diese hier nachgewiesene somatische Stabilität des Gewebes bedeutet jedoch noch

lange nicht, dass in allen Zellen eines Organismus die DNA Sequenzen übereinstimmen

müssen und somatische Mutationen nicht vorkommen können. Nach Jeffreys und

Mitarbeitern (1991) ist die Mutation von Minisatelliten nämlich nicht nur auf die Keimbahn

begrenzt, sondern kommt auch in somatischem Gewebe vor. Sie gehen davon aus, dass

jedes Gewebe eine Mehrzahl an Zellen mit den Minisatelliten-Allelen der beiden

Vorfahren plus eine bestimmte Zahl von Zellen, die verschiedene mutierte neue Längen-

Allele enthalten, beinhalten.

Ein Tumor ist beispielsweise eine Population verwandter Zellen mit sehr heterogenem

Phäno- bwz. Genotyp (Kimmel & Axelrod 1990)

Natürlich ist es nicht auszuschließen, dass sich unter einer Gewebeprobe, die schließlich

nur einen Teil der Zellen eines Gewebes darstellt, Zellklone befinden könnten, die ein

unterschiedliches Fingerprintmuster besitzen könnten. Jedoch muss man nach Nürnberg

et al. (1989) beachten, dass die Vielzahl der Zellen einen Fingerprint bestimmt und dass

wenige eventuell vorhandene mutierte Zellen im Fingerprintmuster nicht sichtbar sind und

somit nicht erfasst werden können.

Um Fehler oder Probleme bei der Auswertung zu minimieren wurden, von jeder Probe

mehrere Fingerprints auf verschiedenen Membranen mit verschieden anderen Proben

kombiniert. Das ist wichtig, da oft gerade die Auswertung zwischen 2 Membranen

Probleme bereiten kann. Aufgrund der Tatsache, dass von jeder Probe mehrere

Fingerprints angefertigt und miteinander verglichen wurden, konnte festgestellt werden,

dass ausnahmslos alle Fingerprints einer Probe absolut identisch und reproduzierbar

waren.


5.6 Untersuchungen von Feldmäusen mit nicht bekanntem

Verwandtschaftsgrad an einem Standort

Alle folgenden Daten beruhen auf der Grundlage der mittels dem Multilocus-DNA-

Fingerprinting hergestellten Fingerprints und der im Teil Material und Methoden

vorgestellten statistischen Auswertverfahren.

5.6.1 Standort: Zill

Tab.4: Bandsharingraten Zill

m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 m11 m12

m1 0,538 0,417 0,429 0,286 0,356 0,487 0,212 0,526 0,364 0,369 0,487

m2 0,667 0,636 0,364 0,583 0,431 0,286 0,449 0,384 0,588 0,289

m3 0,600 0,200 0,501 0,488 0,347 0,522 0,447 0,239 0,355

m4 0,333 0,524 0,362 0,510 0,268 0,651 0,568 0,436

m5 0,458 0,533 0,487 0,395 0,476 0,398 0,482

m6 0,294 0,456 0,584 0,481 0,486 0,443

m7 0,268 0,564 0,458 0,466 0,594

m8 0,398 0,497 0.522 0,489

m9 0,574 0,483 0,397

m10 0,488 0,459

m11 0,443

Tab.5: Durchschnittliche Fingerprintdaten der Feldmäuse mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad vom

Standort Zill

n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi

12 62 11,6 (± 0,4) 0,447 (± 0,107) 8,78 ⋅ 10-5 4,34 ⋅ 10-19

n = Anzahl der untersuchten Tiere.

N = Anzahl der beurteilten Positionen der Population Zill (Anzahl der Gesamtpositionen: 328)

∈ = durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro Individuum.

Pb = mittlere Wahrscheinlichkeit, dass eine Bande in den Fingerprints zweier zufällig aus der Population

entnommenen Tiere gleichzeitig vorliegt.

Pg = Wahrscheinlichkeit, dass der Fingerprint eines zufällig aus der Population entnommenen Tieres alle

Banden aus dem Fingerprint eines anderen aufweist (durchaus jedoch noch zusätzliche).

Pi = Wahrscheinlichkeit, dass 2 zufällig aus einer Population entnommene Individuen identische

Fingerprints haben.


Die 12 untersuchten Feldmäuse an dem Standort Zill besitzen in ihrem gesamten

Auswertbereich zwischen 18000 bp und 1000 bp eine durchschnittliche Anzahl von 11,6

(± 0,4) polymorphen Banden (Banden, die nicht in allen Mustern vorkommen) pro

Individuum. Es wurden insgesamt 62 Positionen untersucht. Die paarweise ermittelten

Bandsharingraten reichen am Standort Zill von 0,200 (m3/m5) bis zu 0,667 (m2/m3)

(Tab.4). Aus diesen paarweise ermittelten Bandsharingraten ließ sich dann eine

durchschnittliche Bandshringrate von 0,447 (± 0,107) berechnen. Daraus wiederum

konnten die beiden Wahrscheinlichkeiten Pg = 8,78 ⋅ 10-5 und Pi = 4,34 ⋅ 10-19 abgeleitet

werden (siehe Tab.5)

5.6.2 Standort: Hohberg

Tab.6: Bandsharingraten Hohberg

m13 m14 m15 m16 m17 m18 m19 m20 m21 m22 m23 m24

m13 0,452 0,875 0,222 0,276 0,250 0,250 0,439 0,478 0,352 0,512 0,367

m14 0,516 0,692 0,429 0,696 0,435 0,540 0,423 0,605 0,334 0,242

m15 0,296 0,345 0,250 0,333 0,452 0,258 0,488 0,249 0,384

m16 0,333 0,632 0,632 0,518 0,498 0,335 0,352 0,522

m17 0,190 0,476 0,338 0,357 0,487 0,487 0,298

m18 0,375 0,457 0,432 0,538 0,356 0,412

m19 0,566 0,437 0,452 0,221 0,385

m20 0,452 0,575 0,323 0,444

m21 0,623 0,484 0,435

m22 0,419 0,432

m23 0,375


Standort Hohberg n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi

12 65 12,4 (± 0,4) 0,426 (± 0,130) 4,26 ⋅ 10-5 1,11 ⋅ 10-19


N = Anzahl der beurteilten Positionen der Population Hohberg (Anzahl der Gesamtpositionen: 328)







Fingerprints haben.


Am Standort Hohberg wurden wie am Standort Zill ebenfalls 12 Individuen untersucht. Der

Auswertbereich dieses Standortes liegt zwischen 17100 bp und 1000 bp. Insgesamt

wurden in diesem Bereich 65 Positionen beurteilt. Pro Individuum kommen hier

durchschnittlich 12,4 (± 0,4) polymorphe Banden vor. Die Bandsharingraten reichen am

Hohberg von 0,190 (m13/m16) bis 0,875 (m14/m18) (Tab.6). Aus all diesen paarweise

ermittelten Bandsharingraten ergibt sich nun eine durchschnittliche Bandsharingrate

(BSR) von 0,426 (± 0,130), woraus sich nun die Wahrscheinlichkeiten Pg mit 4,26 ⋅ 10-5

bzw. Pi mit 1,11 ⋅ 10-19 ableiten lassen (Tab.7).

5.6.3 Standort: Herl-Brache

Tab.8: Bandsharingraten Herl-Brache

m25 m26 m27 m28 m29 m30 m31 m32 m33 m34 m35 m36 m37 m38

m25 0,267 0,457 0,182 0,316 0,379 0,467 0,297 0,381 0,504 0,626 0,459 0,355 0,187

m26 0,276 0,370 0,375 0,352 0,198 0,298 0,432 0,312 0,364 0,190 0,253 0.333

m27 0,188 0,324 0,264 0,215 0,483 0,581 0,266 0,382 0,370 0,285 0,418

m28 0,686 0,346 0,293 0,222 0,187 0,358 0,457 0,221 0,637 0,343

m29 0,443 0,349 0,618 0,343 0,176 0,188 0,337 0,200 0,432

m30 0,512 0,625 0,188 0,424 0,265 0,686 0,247 0,469

m31 0,264 0,315 0,196 0,283 0,326 0,311 0,324

m32 0,192 0,446 0,310 0,185 0,324 0,391

m33 0,384 0,184 0,243 0,358 0,267

m34 0,254 0,417 0,202 0,186

m35 0,277 0,646 0,344

m36 0,387 0,375

m37 0,283


Standort Herl-Brache n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi

14 83 16,4 (± 0,5) 0,344 (± 0,128) 2,5 ⋅ 10-8 2,31 ⋅ 10-22


N = Anzahl der beurteilten Positionen der Population Herl-Brache (Anzahl der Gesamtpositionen: 328)







Fingerprints haben.


Der Ausgewertete Bereich, in dem die 83 Positionen beurteilt wurden lag am Standort

Herl-Brache zwischen 23500 bp und 1900 bp. Durchschnittlich kamen hier 16,4 (± 0,5)

polymorphe Banden pro Individuum vor. Die Bandsharingraten der 14 untersuchten

Individuen von reichen 0,176 (m25/m28) bis zu 0,686 (m28/m29) (Tab.8). Aus ihnen

ergabt sich eine durchschnittliche BSR von 0,344 (± 0,128), die zu den beiden

Wahrscheinlichkeiten Pg mit 2,5 ⋅ 10-8 und Pi mit 2,31 ⋅ 10-22 führte (Tab.9).

5.6.4 Standort: Knospenhof

Tab.10: Bandsharingraten Knospenhof

m39 m40 m41 m42 m43 m44 m45 m46 m47 m48 m49 m50 m51 m52

m39 0,485 0,129 0,069 0,118 0,138 0,323 0,276 0,138 0,142 0,074 0,128 0,380 0,305

m40 0,158 0,111 0,195 0,167 0,263 0,156 0,447 0,294 0,167 0,137 0,184 0,422

m41 0,118 0,256 0,118 0,167 0,321 0,158 0,254 0,426 0,197 0,158 0,062

m42 0,703 0,250 0,059 0,356 0,248 0,069 0,335 0,111 0,079 0,216

m43 0,324 0,103 0,138 0,059 0,125 0,202 0,462 0,177 0,262

m44 0,000 0,218 0,153 0,132 0,341 0,059 0,083 0,144

m45 0,073 0,173 0,256 0,058 0,152 0,425 0,117

m46 0,226 0,273 0,103 0,472 0,096 0,059

m47 0,182 0,048 0,049 0,142 0,212

m48 0,235 0,338 0,124 0,138

m49 0,138 0,263 0,318

m50 0,323 0,153

m51 0,213


Standort Knospenhof n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi

14 134 17,4 (± 0,4) 0,202 (± 0,124) 8,19 ⋅ 10-13 2,24 ⋅ 10-23


N = Anzahl der beurteilten Positionen der Population Knospenhof (Anzahl der Gesamtpositionen: 328)







Fingerprints haben.


Wie von dem Standort Herl-Brache, so wurden auch vom Standort Knospenhof 14

Feldmäuse untersucht. In dem Auswertbaren Bereich von 23200 bp bis 1150 bp wurden

134 Positionen beurteilt. Die durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro

Individuum betrug 17,4 (± 0,4). Die paarweise ermittelten Bandsharingraten lagen hier

zwischen 0,000 (m44/m45) und 0,703 (m42/m43) (Tab.10). Aus diesen paarweise

ermittelten BSR konnte dann die durchschnittliche Bandsharingrate mit 0,202 (± 0,124)

ermittelt werden, aus der dann im weiteren die beiden Wahrscheinlichkeiten Pg mit 8,19 ⋅

10-13 und Pi mit 2,24 ⋅ 10-23 errechnet werden konnten (Tab.11).

5.6.5 Standort: Eiden

Tab.12: Bandsharingraten Eiden

m53 m54 m55 m56 m57 m58 m59 m60 m61 m62 m63 m64 m65

m53 0,105 0,083 0,080 0,400 0,000 0,286 0,154 0,000 0,314 0,069 0,000 0,185

m54 0,087 0,000 0,000 0,167 0,000 0,252 0,240 0,078 0,142 0,317 0,000

m55 0,138 0,167 0,483 0,240 0,000 0,321 0,119 0,176 0,096 0,121

m56 0,000 0,200 0,000 0,313 0,196 0,000 0,329 0,279 0,136

m57 0,000 0,762 0,082 0,236 0,138 0,057 0,000 0,132

m58 0,000 0,104 0,168 0,184 0,219 0,118 0,049

m59 0,257 0,000 0,325 0,046 0,186 0,304

m60 0,143 0,178 0,000 0,087 0,131

m61 0,080 0,289 0,105 0,193

m62 0,177 0,344 0,080

m63 0,000 0,169

m64 0,257


Standort Eiden n N ∈ Pb = ∅ BSR Pg Pi

13 125 12,0 (± 0,4) 0,152 (± 0,134) 1,52 ⋅ 10-10 6,54 ⋅ 10-17


N = Anzahl der beurteilten Positionen der Population Eiden (Anzahl der Gesamtpositionen: 328)







Fingerprints haben.


Am Standort Eiden wurden 13 Feldmäuse untersucht. Bei diesen gab es im Bereich von

22800 bp bis 1000 bp 125 Positionen zu beurteilen. Im Durchschnitt kamen pro

Individuum 12,0 (± 0,4) polymorphe Banden vor. Die paarweise ermittelten

Bandsharingraten reichten von 0,000 (z.B. bei m54/m56) bis zu 0,762 (m57/m59)

(Tab.12). Die daraus resultierende durchschnittliche Bandsharingrate lag somit bei 0,152

(± 0,134). Daraus ließ sich dann für Pg ein Wert von 1,52 ⋅ 10-10 und für Pi ein Wert von

6,54 ⋅ 10-17 errechnen (Tab.13).

Durchschnittlich ergibt sich für alle untersuchten Individuen mit nicht bekanntem

Verwandtschaftsgrad eine BSR von 0,172 (± 0,133). Bedenkt man nun, dass sich unter

diesen Feldmäusen mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad sicherlich eng verwandte

Microtus arvalis (z.B.: m13 und m14 mit einer BSR von 0,875, oder m57 und m59 mit

einer BSR von 0,762) befinden, so muss dieser Wert mit Sicherheit noch nach unten

korrigiert werden. Vergleicht man diesen Wert mit den durchschnittlichen

Bandsharingraten für nichtverwandte Individuenpaare, die ebenfalls mit dem Multilocus-

DNA-Fingerprintverfahren erzielt wurden (siehe Tab.14), fällt auf, dass hier keine zu

hohen Werte ermittelt wurden, die wiederum auf ein mangelndes Auflösevermögen und

damit auf eine geringere Aussagekraft der Methode hindeuten würden.

Tab.14: Durchschnittliche Bandshraten für nichtverwandte Individuenpaare

Natürliche Populationen:

Capreolus capreolus 0,3 Mörsch 1992

Passer domesticus 0,1-0,3 Burke u. Bruford 1987

Ficedula hypolenca 0,2 Wetton et al. 1987

Progne subis 0,2 Morton et al. 1990

Prunella modularis 0,2 Burke et al. 1989

Urocyon littoralis 0,7-1,0 Gilbert et al. 1990

Homo sapiens 0,2 Jeffreys et al. 1985b

Haustiere:

Hühner 0,4-1,0 Kuhnlein et al. 1990

Hunde 0,5 Jeffreys u. Morton 1987a

Katzen 0,5 Jeffreys u. Morton 1987a

Rinder 0,3-0,4 Georges et al. 1988

Pferde 0,3-0,7 Georges et al. 1988

Schweine 0,5-0,7 Georges et al. 1988


Auch die durchschnittliche Anzahl von 14,0 (± 0,4) polymorphen Banden pro Individuum

im gesamten Auswertbereich von 23500 bp bis zu 1000 bp ist mit den von Nybom (1991)

erzielten Ergebnissen (zwischen 10 und 30 Banden), bzw. mit den von Wetton et al.

(1987) erzielten Werten von durchschnittlich 14,3 polymorphen Banden pro Individuum

durchaus vergleichbar.

5.7 Individualisierungspotential

Das diese Methode ein großes Individualisierungspotential besitzt, ist allein schon daran

zu erkennen, dass alle Fingerprints bis auf einen, der im Kapitel „Untersuchung von

Feldmäusen mit bekanntem Verwandtschaftsgrad“ behandelt wird, ein unterschiedliches

Bandenmuster aufweisen. Als Maß für das Individualisierungspotential dieser Methode

und der erzielten speziesspezifischen Hybridisierungsmuster gelten die beiden

Wahrscheinlichkeiten Pg und Pi.

Die Pg Werte, als die Wahrscheinlichkeiten, dass der Fingerprint eines zufällig aus der

Population entnommenen Tieres alle Banden aus dem Fingerprint eines anderen aufweist

(durchaus jedoch noch zusätzliche) betragen 8,78 ⋅ 10-5 für den Standort Zill, 4,26 ⋅ 10-5

für den Standort Hohberg, 2,5 ⋅ 10-8 für den Standort Herl-Brache, 8,19 ⋅ 10-13 für den

Standort Knospenhof und 1,52 ⋅ 10-10 für den Standort Eiden.

Die Wahrscheinlichkeit Pi, dass 2 zufällig aus einer Population entnommene Individuen

identische Fingerprints haben liegt, am Standort Zill bei 4,34 ⋅ 10-19, am Standort Hohberg

bei 1,11 ⋅ 10-19, am Standort Herl-Brache bei 2,31 ⋅ 10-22, am Standort Knospenhof bei

2,24 ⋅ 10-23 und am Standort Eiden bei 6,54 ⋅ 10-17.

Vergleicht man diese Werte nun mit den von anderen Autoren ermittelten

Wahrscheinlichkeiten (siehe Tab.15), so ist festzustellen, dass die hier ermittelten Werte

sehr gering sind. Dies ist wiederum ein Indiz dafür, dass das Individualisierungspotential

dieser Methode, angewandt auf Microtus arvalis, sehr hoch ist. Letztlich kann daran

natürlich auch eine hohe Variabilität der Fingerprintmuster der Feldmäuse abgelesen

werden. Die sehr geringen Wahrscheinlichkeiten Pi und Pg beruhen neben den

durchschnittlichen BSR auf der Anzahl der untersuchten Positionen. Je mehr Positionen

in die Berechnung dieser Wahrscheinlichkeiten eingehen, um so geringer werden ihre

Werte.


Tab.15: Auflistung der Wahrscheinlichkeiten Pi und Pg für nichverwandte Individuen

Species Pg Pi Autor

Schwäne 7,4 ⋅ 10-15-1,2 ⋅ 10-19 Meng et al. 1990

Hunde 5 ⋅ 10-10 Jeffreys u. Morton 1987

Katzen 7 ⋅ 10-7 Jeffreys u. Morton 1987

Rinder 1,7 ⋅ 10-7 - 1,2 ⋅ 10-12 Buitkamp 1989

Geflügel 1,5 ⋅ 10-9 – 8,7 ⋅ 10-17 Hillel et al. 1989

Truthähne 9,4 ⋅ 10-6 Hillel et al. 1989

Amseln 4,8 ⋅ 10-4 Gibbs et al. 1990

Mensch 2 ⋅ 10-8 Schäfer et al. 1988

5.8 Populationsgenetische Aussagen über Feldmäuse mit nicht bekanntem

Verwandtschaftsgrad

Zur Ermittlung der Bandsharingraten zwischen den einzelnen Standorten wurden die

Fingerprints der Feldmäuse von verschiedenen Standorten paarweise miteinander

verglichen. Die daraus ermittelten durchschnittlichen Bandsharingraten (siehe Tab.16)

bildeten dann die Grundlage zur Berechnung der Dìj und F`ST Werte (Tab.17, Tab.18)

Tab.16: BSR innerhalb (grau Unterlegt) und zwischen den Populationen

∅ BSR Zill Hohberg Knospenhof Herl-Brache Eiden

Zill 0,447 0,264 0,111 0,069 0,037

Hohberg 0,426 0,093 0,038 0,092

Knospenhof 0,202 0,094 0,091

Herl Brache 0,344 0,115

Eiden 0,152

Die Ergebnisse in Tab.16 belegen, dass die Bandsharingraten innerhalb eines Standortes

deutlich höher sind als die zwischen den einzelnen Standorten. Einzig der Standort Eiden

weist eine relativ geringe Differenz zu den BSR der anderen Standorte auf. Das ist aber

darauf zurückzuführen, dass die Bandsharingrate innerhalb des Standortes Eiden nicht

hoch ist. Auffallend ist, dass die Bandsharingraten innerhalb der Brachflächen (Zill,

Hohberg, Herl-Brache) wesentlich höher sind als die Bandsharingraten auf den

bewirtschafteten Flächen. Innerhalb der bewirtschafteten Flächen kann man erkennen,

dass die durchschnittliche Bandsharingrate der Feldmäuse des Standorts Knospenhof

(Gerste ökologisch, Herl) eine höhere Bandsharingrate aufweist, wie der Standort Eiden

(Gerste konventionel, Herl).


Die geringen durchschnittlichen BSR (siehe Tab.16) der Wahlener Standorte Zill und

Hohberg zu den Trierer Standorten Knospenhof, Herl-Brache und Eiden lassen sich durch

die geographische Distanz der Flächen zueinander erklären. Bestätigt wird dies durch

Abb.22, in der die genetischen Distanzen aus Tab.17 mit den geographischen Distanzen

in Korrelation gesetzt wurden. Einen Trend für Isolation by distance zeichnet sich zwar ab,

dieser ist jedoch nicht signifikant (P=0,094). Die Berechnungen ergaben, dass 53,2% der

gesamten Varianz auf die geographische Distanz zurückzuführen ist. Beachtet man nun

die geographischen und die genetischen Distanzen (Tab.17) zwischen den Wahlener

Standorten und den Untersuchungsflächen bei Herl, so wird deutlich, dass der Großteil

der 53,2% auf die geographischen Distanzen der Wahlener und der Herler

Untersuchungsflächen zurückzuführen sind.

Isolation by distanceCorrelation: r = 0,72990

Geographische Distanz (km)

Gen

etis

che

Dis

tanz

Dij

(Lyn

ch, 1

991)

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

0 5 10 15 20 25 30 35

Abb.22: Isolation by distance.

Die beiden Wahlener Standorte Zill und Hohberg liegen nur etwa 400m auseinander

(siehe Abb.23). Dennoch lassen sich auch hier die Populationen eindeutig genetisch

unterscheiden (Abb.25) (die durchschnittliche BSR innerhalb eines Standortes ist höher

als die BSR zwischen den Standorten). Die Hauptfaktoren hierfür sind in einer Strasse,

Feldgehölz und Wald zu sehen, die diese beiden Standorte voneinander trennen. Diese

Isolationsbarrieren reichen bei Microtus arvalis offensichtlich schon aus, damit sich

genetisch zu unterscheidende Populationen ausbilden können


Abb.23: Flächennutzungskartierung des Standortes Wahlen mit den Untersuchungsflächen Zill und Hohberg.

Schwieriger ist jedoch eine Erklärung zu finden, warum die BSR zwischen den

unterschiedlich genutzten Flächen in Trier, trotz ihrer geringen Entfernungen zueinander,

so geringe Werte aufweisen und genetisch voneinander unterschieden werden können

(Abb.25), bzw. warum die durchschnittlichen BSR an den genutzten Standorten

vergleichsweise niedrig sind. Die geographische Distanz ist auszuschließen. Versuche

dazu wurden am Standort Zill durchgeführt. Hierzu wurde dieser Standort wurde in 3

einzelne Flächen unterteilt, die durch selten befahrene Feldwirtschaftswege voneinander

getrennt waren. Der Abstand von der ersten Fläche zu der zweiten Fläche betrug etwa

20m, der Abstand von der zweiten Fläche zur dritten Fläche etwa 200m (siehe Abb.23).

Bei einer Untersuchung dieser Mäuse stellte sich dann heraus, dass die

durchschnittlichen BSR zwischen den Flächen nicht niedriger waren als die

durchschnittlichen BSR innerhalb der einzelnen Flächen. Das wiederum bedeutet, dass

es sich an diesem Standort um eine Population handelt, die genetisch nicht unterteilt

werden kann. Da die Flächen Herl-Brache, Knospenhof und Eiden von ihrer Entfernung

zueinander durchaus mit dem Standort Zill vergleichbar sind (siehe Abb.23, Abb.24) ist

auch bei ihnen in der geographischen Distanz kein Grund dafür zu sehen, dass die BSR

zwischen den einzelnen Standorten so niedrig sind. Auch sind keine Isolationsbarrieren

wie zwischen den Standorten Zill und Hohberg vorhanden, die diese niedrigen


Bandsharingraten zwischen den Populationen erklären können. Ebenfalls können

aufgrund der geringen Distanzen der Flächen zueinander irgendwelche natürlichen

Umweltfaktoren ausgeschlossen werden, die einen Einfluss auf die Genetik der

Feldmäuse besitzen (z.B. erhöhte Radioaktivität, extreme klimatische Unterschiede

zwischen den Flächen, etc.). Bleibt als Grund die unterschiedliche landwirtschaftliche

Nutzungsform. Studien über den Einfluss von unterschiedlichen landwirtschaftlichen

Nutzungsformen auf die Genetik von Kleinsäugern sind mir nicht bekannt, so dass leider

nicht auf bereits vorhandene Literatur zurückgegriffen werden konnte.

Abb.24: Flächennutzungskartierung des Standortes Herl mit den 3 Untersuchungsflächen Eiden, Knospenhof

und Herl-Brache.

Den Einfluss von landwirtschaftlicher Nutzung an den Standorten Eiden und Knospenhof

lässt sich schon an den verglichen mit dem Standort Herl-Brache niedrigen

durchschnittlichen BSR innerhalb der Standorte erkennen (Herl-Brache: 0,344, Eiden:

0,152, Knospenhof: 0,202). Die durchschnittliche BSR ist auf der ökologisch

bewirtschafteten Fläche Knospenhof höher als auf der intensiv bewirtschafteten Fläche

Eiden. Das könnte ein Indiz dafür sein, dass eine verminderte Ausbringung von

Düngemitteln und Pestiziden eine Erhöhung der durchschnittlichen BSR innerhalb einer


Fläche bewirkt. Dies würde sich dadurch erklären lassen, dass durch das Ausbringen von

Pathogenen, die eventuell in Düngemitteln, Jauche und/oder Pestiziden enthalten sind,

ein großer Anteil der Nachkommenschaft der auf dieser Fläche vorkommenden

Feldmäuse stirbt. Diese Microtus arvalis mit hohen BSR untereinander stehen zur

weiteren Reproduktion nicht mehr zur Verfügung, was in einer niedrigeren

durchschnittlichen BSR resultieren würde. Dafür spricht auch die Fangquote auf der

intensiv genutzten Fläche. Im Vergleich mit allen anderen Flächen war diese viel geringer.

Um die 19 Feldmäuse auf dem konventionel genutzten Standort zu fangen mussten die

Fallen über einen wesentlich längeren Zeitraum aufgestellt werden.

Ein anderer Grund könnte in der Attraktivität der Fläche liegen. Durch das intensive

Bewirtschaften einer Fläche könnte die Attraktivität dieser Fläche so weit heruntergesetzt

werden, dass ein Großteil der Nachkommen diese Fläche vor der Reproduktion wieder

verlässt, was nicht zu einer Erhöhung der BSR innerhalb dieser Fläche beitragen würde.

Diese beiden Thesen würden auch die im Vergleich zu den beiden genutzten Standorten

hohe Bandsharingrate am Standort Herl-Brache, auf den keine Düngemittel, Pestizide

oder sonstige Störfaktoren einwirken, erklären.

Trotz dieser niedrigen Bandsharingraten innerhalb der Flächen Knospenhof und Eiden

sind die Bandsharingraten zwischen den einzelnen Flächen noch niedriger, was darauf

hinweist, dass sich hier Populationen gebildet haben, die genetisch unterschieden werden

können. Bestätigt wird dieses Ergebnis durch die D’ij Werte in Tab.17

Tab.17: D’ij Werte zwischen den einzelnen Populationen an den unterschiedlichen Standorten

D’ij Zill Hohberg Knospenhof Herl Brache Eiden

Zill 0,573 0,996 1,737 1,952

Hohberg 1,149 2,310 1,017

Knospenhof 1,031 0,655

Herl Brache 0,687

Die genetische Distanz (D’ij) gilt als Maß für die genetische Unterscheidbarkeit von

Populationen. Bei großer Übereinstimmung strebt dieser Wert gegen 0, bei geringer

Übereinstimmung gegen 1, bzw. formelbedingt gegen ∞.

Die genetische Distanz zwischen den Wahlener Standorten Zill und Hohberg (0,573) ist

erwartungsgemäß wesentlich geringer, als die genetische Distanz zwischen den

Wahlener und den Trierer Standorten (0,996 – 2,310) (Abb.25). Was jedoch auffällt ist die

hohe genetisch Distanz zwischen Herl Brache und dem Knospenhof (1,031) und die dazu

relativ „geringen“ genetischen Distanzen zwischen Knospenhof und Eiden (0,655)

(Abb.25), bzw. zwischen Herl Brache und Eiden (0,687). Dies lässt vermuten, dass

zwischen Herl Brache und Knospenhof schon wesentlich länger kein Austausch von


genetischer Information und/oder einzelnen Individuen mehr stattgefunden hat als

zwischen Knospenhof und Eiden, bzw. zwischen Herl Brache und Eiden.

UPGMA-Dendrogramm (Microtus arvalis)Genetische Distanz (LYNCH 1991, Multilocus DNA Fingerprinting)

Euklidische Distanz

Linkage Distance

Brache Herl

Gerste konvent. Herl

Gerste ökolog. Herl

Brache Hohberg

Brache Zill

1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0

Abb.25: Dendrogramm der Clusteranalyse der Standorte

Der F’ST Wert gilt als Maß der genetischen Verarmung einer Population und kann in zwei

Richtungen berechnet werden. Der Maximalwert von 1 wird dann erreicht, wenn in lokalen

Populationen alternierende Allele fixiert werden und somit ein Verlust jeglicher

genetischen Variablität eintritt.

Tab.18: F`ST Werte zwischen den einzelnen Populationen an den unterschiedlichen Standorten

F`ST Zill Hohberg Knospenhof Herl Brache Eiden

Zill 0,577 0,617 0,627 0,635

Hohberg 0,568 0,612 0,626 0,613

Knospenhof 0,527 0,532 0,532 0,533

Herl Brache 0,532 0,595 0,580 0,574

Eiden 0,526 0,517 0,517 0,511

Wie in der Tabelle 18 zu erkennen ist, liegen alle F’ST Werte zwischen 0,511 und 0,635,

also durchaus im mittleren Bereich, so dass von einer Allelfixierung und einer damit

einhergehenden Abnahme der genetischen Variabilität nicht die Rede sein kann.


Genau so auffallend wie die niedrigen Bandsharingraten der Flächen Eiden und

Knospenhof sind die hohen BSR der Brachflächen Zill und Hohberg, obwohl die

Variabilität zwischen den Fingerprintmustern einzelner Individuen innerhalb einer Fläche

hoch ist (Pg Zill: 8,78 ⋅ 10-5, Pg Hohberg 4,26 ⋅ 10-5). Die Tatsache, dass innerhalb dieser

beiden Standorte eine höhere Ähnlichkeit herrscht wie an den anderen Standorten, ist

eventuell auf die vorher schon angesprochenen Isolationseffekte und einem damit

verringertem Gen-Austausch zurückzuführen. So besteht natürlich die Möglichkeit, dass

Inzuchteffekte an den Standorten Zill und Hohberg eine gewisse Rolle spielen, jedoch

sollten diese nicht zu hoch bewertet werden. Dafür sprechen auch die F`ST Werte aus

Tab. 18, die im mittleren Bereich liegen, und nicht auf eine Fixierung von Allelen

hindeuten.

Diese Isolationseffekte sind am Standort Herl-Brache, der weiträumig nach allen Seiten

offen ist, nicht vorhanden. Dadurch würde sich die niedrigere durchschnittliche BSR

dieses Standortes gegenüber den anderen beiden Brachen erklären.

Die Auswirkungen von Inzuchteffekten auf Fingerprintmuster wurden in diversen

Publikationen veröffentlicht.

So zeigte Nybom 1991, dass bei nordamerikanischen Pflanzen (paw paws) in kleinen

isolierten Gebieten wesentlich höhere Bandsharingraten auftraten als zwischen

Individuen, die über die ganze USA verteilt verglichen wurden. Dadurch wurde in den

Fingerprintmustern Inzucht infolge von Isolation festgestellt.

Ebenfalls in der Haustiergenetik und Haustierzucht konnte nachgewiesen werden, dass

sich Inzucht auf die Bandenmuster auswirkt (Dunnington et al. 1990, Ellegren et al. 1985).

Meistens wird Inzucht, wie bei ingezüchteten Hühnerlinien, anhand von erhöhten

Bandsharingraten festgestellt (Dolf et al. 1992).

Auch beim Nacktmull, einem sozial lebenden Nagetier, wurde aufgrund seiner

Lebensweise ein hoher Grad an Inzucht innerhalb und zwischen den Kolonien

nachgewiesen (Breuer 1991). Dieser Inzuchtgrad ist vergleichbar mit der Inzucht bei

Labor-Nagern über eine Zeitspanne von 60 Generationen (Breuer 1991).

Die Ergebnisse dieses Kapitels belegen, dass das Multilocus-DNA-Fingerprinting sich für

populationsgenetische Fragestellungen eignet. Die Eignung dieser Methode auf

populationsgenetische Fragestellungen wurde auch schon von anderen Autoren

festgestellt. So haben Gilbert et al. (1991) mit Hilfe des Multilocus-DNA-Fingerprinting

Unterschiede bei Löwenpopulationen festgestellt, die sie als Folge unterschiedlicher

demographischer Geschichte der Population gedeutet haben.

Von Tylor et al. (1991) sind in Australien Koalas untersucht worden, die Bandsharingraten

von zwischen 0,750 und 1,000 aufwiesen. Dies ist laut der Autoren darauf

zurückzuführen, dass die Koalas kurz vor der Ausrottung standen und dass somit die


Nachkommen eine schmale genetische Basis haben. Dieser bottleneck-Effekt wurde auch

bei Falco peregrinus in Skandinavien festgestellt (Lifjeld et al.2002)

In fischereiwirtschaflichen Fragestellungen wurde das Multilocus-DNA-Fingerprinting zur

Identifizierung von Stämmen herangezogen (Castelli et al. 1990, Harris et al. 1991,

Bentzen et al. 1993, Wright 1993, Laughlin u. Turner 1994, Heath et al. 1995, O`Reilly u.

Wright 1995, Dahle 1996).

Mit dem Multilocus-DNA-Fingerprinting kann man also die unterschiedliche

demographische Geschichte von Populationen nachvollziehen, bzw. Unterschiede

zwischen Populationen, die diesen Mechanismen in verschieden starkem Maße

ausgesetzt waren, erkennen (Gilbert et al. 1990 und 1991, Taylor et al. 1991 und Ely et al.

1991, Call et al. 1998).

Als Ausblick wäre es hochinteressant, die beiden Flächen Knospenhof und Eiden, bei

gleichbleibender Nutzung, weiter zu beobachten, um zu kontrollieren, ob Veränderungen

in den BSR der Feldmäuse dieser Flächen stattfinden (Gen-Monitoring). Außerdem

sollten ergänzend zu den genetischen Untersuchungen auch toxikologische

Untersuchungen stattfinden, um festzustellen, ob Pathogene und wenn ja, welche

Pathogene auf die Feldmäuse einwirken, und wie diese auf die Flächen gelangen.

Es wäre auch interessant Studien durchzuführen, was nach einem Zusammenbruch einer

Feldmauspopulation passiert. Ob von anderen Flächen neues genetisches Material

hereingetragen wird, oder ob die kommenden Generationen auf einem schmalen Genpool

basieren. Ebenso nachforschenswert wäre in diesem Zusammenhang die Frage, welche

Rolle die Genetik bei einem Zusammenbruch der Feldmauspopulation spielt.

5.9 Untersuchung von Feldmäusen mit bekanntem Verwandtschaftsgrad

Während der Fangaktionen wurden an 3 Standorten 6 trächtige Mäuse mit zwischen 3

und 6 Embryonen gefangen. So wurde am Standort Hohberg eine Maus (ma) mit 5

Embryonen (a1-a5), am Standort Knospenhof wurden 3 Mäuse (mb, mc und md) mit 4

(b1-b4), 3 (c1-c3) bzw. 6 (d1-d6) Embryonen und am Standort Herl-Brache 2 Mäuse (me

und mf) mit 6 (e1-e6), bzw. 4 (f1-f4) Embryonen gefangen.

Da die Fingerprintbanden als Allele betrachtet werden, die nach den Mendelschen Regeln

weitervererbt werden, ist jede Bande eines Nachkommen auf eine Bande eines Elternteils

zurückzuführen. Die Gesamtzahl der Banden des Nachkommen muss aber nicht gleich

der Summe der Elterlichen Banden sein, weil heterozygote Banden nicht auf die

Nachkommen vererbt werden müssen. Fehlt der Fingerprint eines der Eltern, kann man


durch einen Vergleich der Fingerprintbanden von dem bekannten Elternteil und den

Nachkommen (wenn man die Banden des oder der Nachkommen betrachtet) darauf

schließen, welche Banden die Nachkommen vom unbekannten Elternteil geerbt haben

(diese fehlen beim bekannten Elternteil), bzw. welche Banden des bekannten Elternteils

heterozygot sein müssen (diese fehlen dann bei dem oder den Nachkommen) (Mörsch

1992).

5.9.1 Mutter ma und ihre Nachkommen a1-a5

Tab.19: Bandsharingraten der Mutter ma und ihrer Nachkommen a1-a5

ma a1 a2 a3 a4 a5

ma 0,824 0,788 0,500 0,647 0,727

a1 0,903 0,667 0,750 0,774

a2 0,690 0,710 0,800

a3 0,800 0,690

a4 0,581

Tab.20: Durchschnittliche Fingerprintdaten der Feldmäuse mit bekanntem Verwandtschaftsgrad vom Standort

Hohberg


6 24 8,7 (± 0,5) 0,723 (± 0,101) 5,95 ⋅ 10-2 4,64 ⋅ 10-6


N = Anzahl der beurteilten Positionen der Mutter ma und ihren Nachkommen a1-a5 .







Fingerprints haben.

Im gesamten Auswertbereich von 24200 bp bis 2200 bp gab es 24 zu beurteilende

Positionen mit durchschnittlich 8,7 (± 0,5) polymorphen Banden (Tab.20). Die

Bandsharingraten lagen zwischen 0,500 (a4/a5) und 0,903 (a1/a2) (Tab.19), woraus sich

dann eine durchschnittliche BSR von 0,723 (± 0,101) ergab. Daraus konnte die beiden

Wahrscheinlichkeiten Pg und Pi mit den Werten Pg = 5,95 ⋅ 10-2 und Pi = 4,64 ⋅ 10-6

errechnet werden (Tab.20).


Tab.21: Bandsharingraten der väterlichen Banden der Nachkommen a1-a5

a1 a2 a3 a4 a5

a1 1,000 0,500 0,571 0,400

a2 0,500 0,571 0,400

a3 0,727 0,667

a4 0,500

Tab.22: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden der Nachkommen a1-a5 mit der Mutter ma bzw. mit

dem putativen Vater oder den putativen Vätern pva

ma a1 a2 a3 a4 a5

ma 11 8 7 2 5 6

pva 1 1 5 4 2

Gesamt 9 8 7 9 8

Die BSR der Banden, die von dem putativen Vater, oder den putativen Vätern an ihre

Nachkommen weitergegeben wurden lagen zwischen 0,400 (a1/a5, a2/a5) und 1,000

(a1/a2) (Tab.21). Für 2 Banden, die von der Mutter an keines der Nachkommen

weitervererbt worden sind, und für 9 weitere Banden, die nicht alle Nachkommen haben

ist die Mutter ma heterozygot. 6 weitere Banden sind monomorph, da sie bei allen

Individuen vorkommen. Die 13 heterozygoten Banden (Tab.22), die von väterlicher Seite

an die Individuen weitergegeben wurden, verteilen sich auf 7 Positionen. Eine weitere

Bande ist von dem Vater oder den Vätern an alle weitergegeben worden.

5.9.2 Mutter mb und ihre Nachkommen b1-b4

Tab.23: Bandsharingraten der Mutter mb und ihrer Nachkommen b1-b4

mb b1 b2 b3 b4

mb 0,850 0,810 0,872 0,629

b1 0,810 0,821 0,743

b2 0,878 0,595

b3 0,588


Standort Knospenhof


5 28 11,2 (± 0,5) 0,760 (± 0,114) 4,63 ⋅ 10-2 3,03 ⋅ 10-6



N = Anzahl der beurteilten Positionen der Mutter mb und ihren Nachkommen b1-b4.







Fingerprints haben.

Der Auswertbereich der Mutter mb und ihrer Nachkommen b1-b4 liegt zwischen 18500 bp

und 1000 bp. Die Bandsharingraten liegen zwischen 0,588 (b3/b4) und 0,878 (b2/b3)

(Tab.23). Bei den 5 Individuen wurden 28 Bandenpositionen mit durchschnittlich 11,2 (±

0,5) polymorphen Banden berücksichtigt. Die durchschnittliche Bandsharingrate wurde mit

0,760 (± 0,114) berechnet. Daraus ergaben sich für die Wahrscheinlichkeiten Pi und Pg

die beiden Werte Pg = 4,63 ⋅ 10-2 und Pi = 3,03 ⋅ 10-6 (Tab.24).

Tab.25: Bandsharingraten der väterlichen Banden der Nachkommen b1-b4

b1 b2 b3 b4

b1 0,500 0,400 0,571

b2 0,286 0,444

b3 0,333

Tab.26: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden der Nachkommen b1-b4 mit der Mutter mb bzw. mit

dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvb

mb b1 b2 b3 b4

mb 11 8 8 8 2

pvb 2 4 1 3

Gesamt 10 12 9 5

Die Bandsharingraten der Nachkommen, berechnet aus den vom Vater oder den Vätern

vererbten Banden, liegen zwischen 0,286 (b2/b3) und 0,571 (b1/b4) (Tab.25). Von den 11

heterozygoten Banden der Mutter wurde eine an keine der Nachkommen weitervererbt. 9

Banden der Mutter waren monomorph und wurden an alle Nachkommen weitervererbt.

Die 10 Banden (Tab.26), die von dem Vater oder den Vätern stammen, verteilen sich auf

7 Positionen. Eine zusätzliche Bande dieses Elternteils kommt bei allen Nachkommen

vor.


5.9.3 Mutter mc und ihre Nachkommen c1-c3

Tab.27: Bandsharingraten der Mutter mc und ihrer Nachkommen c1-c3

mc c1 c2 c3

mc 0,826 0,780 0,683

c1 0,711 0,844

c2 0,650


Standort Knospenhof


4 29 11,5 (± 0,5) 0,749 (± 0,079) 3,60 ⋅ 10-2 1,15 ⋅ 10-6


N = Anzahl der beurteilten Positionen der Mutter mc und ihren Nachkommen c1-c3.







Fingerprints haben.

Im Auswertbereich von 23400 bp bis 1000 bp liegen die BSR zwischen 0,650 (c2/c3) und

0,844 (c1/c3) (Tab.27). Daraus ergibt sich eine durchschnittliche Bandsharingrate von

0,749 (± 0,079). An den 29 untersuchten Positionen der 4 Individuen wurde eine

durchschnittliche Anzahl von 11,5 (± 0,5) polymorphen Banden pro Individuum festgestellt

(Tab.28). Für die Wahrscheinlichkeiten Pg bzw. Pi wurden Werte von 3,60 ⋅ 10-2 bzw. 1,15

⋅ 10-6 ermittelt.

Tab.29: Bandsharingraten der väterlichen Banden der Nachkommen c1-c3

c1 c2 c3

c1 0,400 0,833

c2 0,400


Tab.30: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden der Nachkommen c1-c3 mit der Mutter mc bzw. mit

dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvc

mc c1 c2 c3

mc 10 9 6 4

pvc 4 2 4

Gesamt 13 8 8

Errechnet man die Bandsharingraten von dem putativen Vater oder den putativen Vätern

und seinen bzw. ihren Nachkommen ergeben sich Werte von 0,400 (c1/c2, c2/c3) und

0,833 (c1/c3) (Tab.29). Die Mutter mc besitzt 20 Banden, von denen 10 heterozygot sind

(Tab.30) und 10 an alle Nachkommen weitergegeben wurden. Die 10 Banden (Tab.30)

des unbekannten oder der unbekannten männl. Elternteile verteilen sich auf 7 Positionen.

2 weitere monomorphe Banden des putativen Vaters oder der putativen Väter sind bei

allen Nachkommen zu finden.

5.9.4 Mutter md und ihre Nachkommen d1-d6

Tab.31: Bandsharingraten der Mutter md und ihrer Nachkommen d1-d6

md d1 d2 d3 d4 d5 d6

md 0,927 0,905 0,821 0,706 0,895 0,778

d1 0,977 0,900 0,743 0,872 0,757

d2 0,927 0,778 0,900 0,737

d3 0,727 0,865 0,686

d4 0,750 0,600

d5 0,824


Standort Knospenhof


7 25 11,6 (± 0,5) 0,813 (± 0,096) 9,06 ⋅ 10-2 1,16 ⋅ 10-4


N = Anzahl der beurteilten Positionen der Mutter md und ihren Nachkommen d1-d6.







Fingerprints haben.


Bei diesen 7 Individuen konnte der Bereich zwischen 20000 bp und 1000 bp ausgewertet

werden. Hierbei wurden 25 Positionen berücksichtigt. Die Bandsharingraten reichten von

0,600 (d4/d6) bis 0,977 (d1/d2) (Tab.31). Die durchschnittliche Anzahl polymorpher

Banden betrug 11,6 (± 0,5) pro Individuum. Als durchschnittliche BSR aller Individuen

konnte der Wert 0,813 (± 0,096) ermittelt werden. Für die beiden Wahrscheinlichkeiten Pg

und Pi wurden die Werte Pg = 9,06 ⋅ 10-2 und Pi = 1,16 ⋅ 10-4 errechnet (Tab.32).

Tab.33: Bandsharingraten der väterlichen Banden der Nachkommen d1-d6

d1 d2 d3 d4 d5 d6

d1 0,800 0,800 0,500 0,000 0,000

d2 1,000 0,800 0,500 0,000

d3 0,800 0,500 0,000

d4 0,667 0,000

d5 0,000

Tab.34: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden der Nachkommen d1-d6 mit der Mutter md bzw. mit

dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvd

md d1 d2 d3 d4 d5 d6

md 13 12 12 9 5 10 7

pvd 2 3 3 2 1 2

Gesamt 14 15 12 7 11 9

Die Bandsharingraten der putativen Väter bzw. des putativen Vaters mit ihren/seinen

Nachkommen liegen zwischen 0,000 (alle Kombinationen mit d6) und 1,000 (d2/d3)

(Tab.33). Von den 20 Banden mütterlicherseits sind 13 heterozygot, von denen 1 an keine

ihrer Nachkommen weitergegeben wurde. Die restlichen 7 Banden konnten in allen

Nachkommen nachgewiesen werden. Die auf die 6 Nachkommen verteilten 13 Banden

(Tab.34) von dem Vater, bzw. den Vätern verteilen sich auf 5 Positionen. Keine dieser

Banden wurde an alle Nachkommen weitergegeben.


5.9.5 Mutter me und ihre Nachkommen e1-e6

Tab.35: Bandsharingraten der Mutter me und ihrer Nachkommen e1-e6

me e1 e2 e3 e4 e5 e6

me 0,857 0,917 0,605 0,844 0,549 0,538

e1 0,818 0,667 0,829 0,426 0,500

e2 0,578 0,894 0,566 0,593

e3 0,667 0,542 0,571

e4 0,560 0,510

e5 0,737


Standort Herl-Brache


7 44 14,7 (± 0,5) 0,656 (± 0,148) 2,03 ⋅ 10-3 3,39 ⋅ 10-12


N = Anzahl der beurteilten Positionen der Mutter me und ihren Nachkommen e1-e6.







Fingerprints haben.

Die Fingerprints der Mutter me und ihrer Nachkommen e1-e6 konnten in einem Bereich

zwischen 21700 und 1000 bp ausgewertet werden. Die hier ermittelten BSR lagen

zwischen 0,426 (e1/e5) und 0,917 (me/e2) (Tab.35). Bei den 7 Individuen wurden

insgesamt 44 Positionen beurteilt. Pro Individuum wurden durchschnittlich 14,7 (± 0,5)

polymorphe Banden nachgewiesen. Die durchschnittliche BSR wurde mit 0,656 (± 0,148)

berechnet und die aus ihr hervorgehenden Wahrscheinlichkeiten mit Pg = 2,03 ⋅ 10-3 bzw.

Pi = 3,39 ⋅ 10-12 festgelegt (Tab.36).


Tab.37: Bandsharingraten der väterlichen Banden der Nachkommen e1-e6

e1 e2 e3 e4 e5 e6

e1 0,500 0,250 0,500 0,000 0,125

e2 0,200 0,667 0,118 0,333

e3 0,400 0,286 0,346

e4 0,235 0,222

e5 0,621

Tab.38: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden der Nachkommen e1-e6 mit der Mutter me bzw. mit

dem putativen Vater oder den putativen Vätern pve

me e1 e2 e3 e4 e5 e6

me 14 9 13 4 10 5 5

pve 1 3 7 3 14 15

Gesamt 10 16 11 13 19 20

Die Bandsharingraten der Nachkommen e1-e6 mit den Banden ihres putativen Vaters

oder ihrer putativen Väter liegen zwischen 0,000 (e5/e1) und 0,667 (e2/e4) (Tab.37). Die

43 Banden (Tab.38) der Väter oder des Vaters sind auf 21 Positionen verteilt. Keine der

väterlichen wurde an alle Nachkommen weitergegeben. Von den 23 Banden der Mutter

sind 14 heterozygot und 9 monomorph.

5.9.6 Mutter mf und ihre Nachkommen f1-f4

Tab.39: Bandsharingraten der Mutter mf und ihrer Nachkommen f1-f4

mf f1 f2 f3 f4

mf 0,579 0,684 0,615 0,683

f1 0,474 0,872 0,683

f2 0,615 0,780

f3 0,810


Standort Herl-Brache


5 32 12,8 (± 0,5) 0,680 (± 0,118) 7,18 ⋅ 10-3 1,10 ⋅ 10-8


N = Anzahl der beurteilten Positionen der Mutter mf und ihren Nachkommen f1-f4.








Fingerprints haben.

Im Bereich zwischen 17500 bp und 1000 bp lagen die BSR der Mutter mf mit ihren

Nachkommen zwischen 0,474 (f1/f2) und 0,872 (f1/f3) (Tab.39). Es standen 5 Individuen

zur Verfügung, deren Fingerprints 32 Positionen beinhalten. Die durchschnittlich Anzahl

an polymorphen Banden pro Individuum beläuft sich auf 12,8 (± 0,5). Die

Wahrscheinlichkeiten Pg = 7,18 ⋅ 10-3 und Pi = 1,10 ⋅ 10-8 resultieren unter anderem aus

der durchschnittlichen BSR von 0,680 (± 0,118) (Tab.40).

Tab.41: Bandsharingraten der väterlichen Banden der Nachkommen f1-f4

f1 f2 f3 f4

f1 0,286 0,875 0,750

f2 0,429 0,429

f3 0,875

Tab.42: Gemeinsame Anzahl der heterozygoten Banden der Nachkommen f1-f4 mit der Mutter mf bzw. mit

dem putativen Vater oder den putativen Vätern pvf

mf f1 f2 f3 f4

mf 12 4 6 5 7

pvf 6 4 6 6

Gesamt 10 10 11 13

Die Bandsharingraten der Nachkommen f1-f4, die sich aus den 30 väterlichen Banden

(Tab.42) ableiten lassen liegen zwischen 0,286 (f1/f2) und 0,875 (f1/f3, f3/f4) (Tab.41).

Diese 30 Banden sind auf 13 Positionen verteilt. 2 Banden vom Vater finden sich in den

Fingerprints aller Nachkommen wieder. Von den 19 Banden (Tab.42) der Mutter sind 12

heterozygot, 2 von diesen kommen überhaupt nicht in den Fingerprints ihrer

Nachkommen vor. Die restlichen 7 Banden erscheinen in den Fingerprints aller

Nachkommen.


5.9.7 Aussagen über Reproduktionsstrategien anhand der erhobenen

Fingerprintdaten

Insgesamt liegen die BSR der sicher verwandten Mäuse zwischen 0,426 und 0,927 (bei

der Mutter und ihren Nachkommen) bzw. zwischen 0,000 und 1,000 (bei dem Vater oder

den Vätern und seinen bzw. ihren Nachkommen). Betrachtet man nun die Verteilung der

heterozygoten Banden zwischen den Eltern und ihren Nachkommen (siehe Tabellen: 22,

26, 30, 34, 38, 42), so fällt auf, dass im Durchschnitt mehr Banden von der Mutter (64%),

als vom Vater (36%) an die Nachkommen weitergegeben werden. Das dies nicht an der

Wahl der Sonde liegt (es könnte ja sein dass diese Sequenzen zu einem hohen

Prozentsatz nur in den weiblichen Tieren von Microtus arvalis vererbt werden) kann an

den Individuen f1 bis f4 gesehen werden, die ja etwa 50% ihrer Banden vom Vater und

50% ihrer Banden von der Mutter geerbt haben.

Durch Vergleiche der väterlichen Bandenmuster der Nachkommen, mit den

Bandenmustern der männlichen Tiere, die an dem jeweiligen Standort gefangen wurden,

konnte kein Vater ermittelt werden, so dass bei allen Nachkommen nur eine Elternteil

bekannt war.

Untersuchungen zur genetischen Verwandtschaft von Individuen innerhalb einer

Population ist eine wichtige Aufgabenstellung in der Populationsgenetik (Burke et al.1991,

Dickinson & Akre 1998, Gompper et al. 1998, Wilmer et al. 1999, Parker et al. 1999,

Huyvaert et al. 2000, Taylor et al. 2000, Baumel 2001, Haydock et al. 2001). Hierbei ist

die wichtigste statistische Größe, die ermittelt werden kann, die Bandsharingrate

zwischen den Individuen. Sie beträgt bei dieser Untersuchung zwischen verwandten

Individuen ersten Grades im Schnitt 0,730 und ist somit deutlich höher, als die

durchschnittliche Bandsharingrate von Individuen mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad

(0,172).

Diese Ergebnisse stimmen tendentiell mit den von Gilbert et al. 1991 ermittelten Werten

von wildlebenden Löwen überein. Er errechnete eine durchschnittliche Bandsharingrate

von 0,796 für verwandte und eine BSR von 0,490 für Löwen mit unbekanntem

Verwandtschaftsgrad. Auch die von Mörsch 1992 bei wildlebenden Rehpopulationen

ermittelten Werte sind mit den in dieser Arbeit herausgefundenen Werten durchaus

vergleichbar. Die Bandsharingraten betrugen bei erstgradig verwandten Rehen im Schnitt

0,640 bzw. bei Rehen mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad 0,275. Bestätigt werden die

hier erzielten Ergebnisse auch von Jarne et al. (1990) der bei verwandten Schnecken

BSR von 0,612 errechnete.

Betrachtet man diese Arbeiten liegt die Vermutung nahe, dass anhand der

Bandsharingrate infolge linearer Regression der Verwandtschaftsgrad abgelesen werden


kann. Zunächst einmal fallen aber nur die wesentlichen höheren Bandsharingraten der

verwandten, gegenüber den Individuen mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad auf. Einige

Autoren haben auch schon versucht die Verwandtschaftsverhältnisse anhand der

Bandsharingrate zu schätzen. So haben Wetton et al. 1987 bei der Untersuchung einer

Haussperling-Population die Schätzung des Verwandtschaftsgrades sehr einfach

gehalten (vgl. auch Hoagland et al. 1991). Für Verwandte ersten Grades wurde eine BSR

von 0,5 festgelegt. Unverwandte Individuen zeigen eine BSR unter 0,25. Da in dieser

Haussperling-Population die meisten BSR unter 0,25 lagen und nur ein Wert von 0,730

bei einer bestimmten Individuenkombination aus den niedrigen Werten hervortrat, konnte

so tatsächlich ein Sperling als Vater eines Jungen, der aus einer extra pair copulation

stammen musste, enttarnt werden. Auch andere soziobiologischen Vorkommnisse sind

schon mit Hilfe des Multilocus-DNA-Fingerprinting aufgeklärt worden (Burke 1989, Burke

et al. 1991, Swatschek 1992, Huyvaert et al. 2000).

Nach dieser These wären also auf jeden Fall zwischen Müttern und ihren Nachkommen

eine BSR von etwa 0,5 zu erwarten gewesen. Zwischen den Nachkommen kann nicht von

einer Bandsharingrate von 0,5 ausgegangen werden, da hier die Möglichkeit von

multiplen Vaterschaften berücksichtigt werden muss, worauf ich aber später noch zu

sprechen kommen werde. Eine BSR von 0,5 zwischen den Müttern und ihren

Nachkommen ist aber relativ selten der Fall. Meist liegt diese Bandsharingrate deutlich

über 0,5 (siehe Tab.: 19, 23, 27, 31, 35, 39). So konnten also auch hier die Ergebnisse

von Jones et al. (1991) bestätigt werden, die bei den Bienenfressern ebenfalls

herausfanden, dass die Verwandtschaft nicht immer direkt über die Bandsharingrate

bestimmt werden kann.

Lynch hat 1991 erkannt, dass zwischen unverwandten Individuen einer Population eine

gewisse Hintergrund-Bandsharingrate (BSR zwischen unverwandten Individuen) besteht

und dass bei der Schätzung des Verwandtschaftsgrades zwischen 2 Individuen diese

Hintergrund-Bandsharingrate berücksichtigt werden muss. Je entfernter die

Verwandtschaft zwischen 2 Individuen umso eher wird der Verwandtschaftsgrad durch die

Bandsharingrate überschätzt. Zur Schätzung des Verwandtschaftsgrades ist die

Hintergrung-Bandsharingrate ein entscheidender Faktor. Als Hintergrund-Bandsharingrate

wurde der Wert 0,172 die durchschnittlichen Bandsharingraten der 5 Standorte (Hohberg,

Zill, Eiden, Knospenhof und Herl-Brache) für Individuen mit unbekanntem

Verwandtschaftsgrad gewählt. Mit der von Lynch (1991) entwickelten Formel BSR = e

+ r ⋅ (1 - e ) (siehe Material und Methode) kann durch einen vorgegebenen

Verwandtschaftskoeffizienten r und eine Hintergrund-Bandsharingrate e eine zu


erwartende BSR für einen durch den Verwandtschaftskoeffizienten bestimmten

Verwandtschaftsgrad errechnet werden.

Für Verwandte ersten Grades (Verwandtschaftskoeffizient r = 0,5) ergibt sich daraus für

die eine zu erwartende BSR von 0,586.

Vergleicht man die ermittelten Werte zwischen den Müttern und ihren Nachkommen (weil

hier ganz sicher ein Verwandtschaftsverhältnis ersten Grades vorliegt) mit der zu

erwartenden BSR, so fällt auf, dass die meisten BSR darüber liegen. Nur 4 (ma/a3: 0,500;

me/e5: 0,549; me/e6: 0,538 und mf/f1: 0,579) dieser 28 Werte (14%) liegen darunter.

Eine weitere Möglichkeit der Berechnung einer zu erwartenden BSR für verwandte

Individuen kann über die Allelfrequenz erfolgen. Ausgehend von einer hier errechneten

Allelfrequenz q = 0,090 ergibt sich eine zu erwartende BSR für verwandte ersten Grades

von 0,566. Dieser Wert weicht nicht stark von dem vorherigen nach Lynch (1991)

ermittelten Wert ab. Aus einem Vergleich der Werte zwischen den Müttern und ihren

Nachkommen geht hervor, dass hier nur 3 (ma/a3: 0,500; me/e5: 0,549 und me/e6: 0,538)

der 28 Werte (11%) darunter liegen.

Nach Haydock et al. (1996) ist es weiterhin möglich über die Allelfrequenz eine zu

erwartende Bandsharingrate für Vollgeschwister zu errechnen.

Dass es multiple Vaterschaften bei verschiedenen Species (Sorex araneus, Apodemus

agrarius, Lacerta agilis) gibt ist unbestritten (vgl. Tegelström 1991, Gullberg 1997, Baker

1999). Diese sind auch oftmals durch das Multilocus-DNA-Fingerprinting belegt worden.

Bei einer Mehrvaterschaft sind die Nachkommen Halbgeschwister. Die nach Haydock et

al. (1996) ermittelte BSR für Vollgeschwister liegt bei 0,576. Vergleicht man diesen Wert

mit den tatsächlich ermittelten Bandsharingraten, so fällt auf, dass die beiden

Nachkommen e5 und e6 mit fast allen anderen Geschwistern (Ausnahme: e6/e2) Werte

aufweisen, die unter der zu erwartenden BSR für Vollgeschwister liegen (vgl. Tab.35).

Untereinander weisen die beiden Geschwister e5 und e6 jedoch eine BSR von 0,737 auf.

Dieser Verdacht, dass es sich bei e5 und e6 um Geschwister handeln könnte, die zu ihren

anderen Geschwistern aber eher in einem Halbgeschwisterverhältnis stehen wird auch

durch die niedrigen, aus väterlichen Banden resultierenden Bandsharingraten (Tab.37)

erhärtet. Die hohe BSR von 0,621 zwischen e5 und e6, aus den väterlichen Banden

errechnet, kann wiederum als Indiz ihrer Vollgeschwisterschaft gewertet werden. Bei

Freilanduntersuchungen sind solche Sachverhalte natürlich sehr schwer nachzuweisen,

da meistens, wenn überhaupt, nur ein Elternteil vorhanden ist. Anhand von

Züchtungsversuchen im Labor, bei welchen die putativen Väter bekannt sind, dürfte es

kein allzu großes Problem darstellen, mit dem Multilocus-DNA-Fingerprinting den

Nachweis für multiple Vaterschaften bei Microtus arvalis zu erbringen.


5.10 RAPD-PCR (Williams et al.1990)

Zusätzlich zu der Methode des Multilocus-DNA-Fingerprinting wurde auch noch die

RAPD-PCR angewendet. Diese Methode hat gegenüber dem Multilocus-DNA-

Fingerprinting den Vorteil, dass sie kostengünstiger ist, mit sehr wenig DNA auskommt

und dass mit ihr sehr schnell Daten erzeugt werden können. Dadurch ist diese Methode

natürlich sehr gut geeignet, um eine große Anzahl von Proben zu untersuchen. Der

Nachteil dieser Methode liegt aber in ihrem wesentlich geringeren Informationsgehalt

gegenüber dem Multilocus-DNA-Fingerprinting. Im Verlauf dieser Arbeit wurden

insgesamt 120 RAPD-PCR-Primer (Roth Kit: 180, 280, 380, 480, A, B, C und D) auf ihre

Eignung bei Microtus arvalis getestet.

5.10.1 Artdifferenzierung

Da eine Unterscheidung zwischen Microtus arvalis und Microtus agrestris nicht anhand

von morphologischen Gesichtspunkten vorgenommen werden kann, erfolgte eine erste

Differenzierung der beiden Arten über die Zähne (siehe: Verbreitung und Ökologie). Die

Präparation des Gebisses und die anschließende Untersuchung brauchten jedoch zuviel

Zeit und waren des öfteren nicht mit Erfolg gekrönt, da auch in den Gebissen eine sehr

hohe Variationsbreite von unterschiedlichen Ausprägungen vorlag. So waren Exsul-

und/oder agrestris- Schlinge bei Microtus agrestris nur noch rudimentär oder überhaupt

nicht mehr vorhanden, bzw. bei Microtus arvalis Zahndeformationen ausgebildet, die

durchaus mit der Exsul- und/oder agrestris- Schlinge hätten verwechselt werden können.

Daraufhin wurden von den eindeutig bestimmbaren Microtus arvalis und Microtus

agrestris Multilocus-DNA-Fingerprints angefertigt. Anhand dieser Fingerprints konnten die

beiden Arten eindeutig als Microtus arvalis und Microtus agrestris unterschieden werden.

Verglich man diese Multilocus-DNA-Fingerprints mit dem Restriktionsverdau, so fiel auf,

dass schon durch die Fluoreszenzbande im Restriktionsverdau eine Artunterscheidung

möglich war (siehe: Restriktionsverdau und Fluoreszenzfärbung). Weil aber auch diese

beiden Möglichkeiten zu kosten- und zeitintensiv waren wurde auf die RAPD-PCR

zurückgegriffen, das heißt, es wurden so lange verschiedene Primer auf die eindeutig

bestimmten Microtus arvalis und Microtus agrestris angewandt, bis ein Primer gefunden

wurde, mit dessen Hilfe die beiden Arten differenziert werden konnten. Das die RAPD-

PCR sehr gut zur Artunterscheidung geeignet ist, belegen auch einige Beispiele aus der

Literatur. So untersuchten Hunt u. Page mit RAPD-PCR (1992) Artdifferenzierungen bei

der Honigbiene, Castiglione et al. (1993) bei Pappeln, Patwary et al. (1994) bei

Kammuschel und Quack (2000) bei Brassen, Rotaugen und Güstern.


Als hierzu bestens geeignet stellte sich der Primer A17 von der Firma Roth (Karlsruhe)

heraus. Er ermöglichte eindeutige und absolut reproduzierbare Ergebnisse in der

Artunterscheidung von Microtus arvalis und Microtus agrestris (siehe Abb.24). Die Qualität

dieser Artunterscheidung mittels RAPD-PCR wurde dadurch gefestigt, dass weder in

einem Restriktionsverdau einer Probe, die durch RAPD-PCR als Microtus arvalis

bestimmt wurde, eine Fluoreszenzbande auftrat, noch später in dem Fingerprint selbst

Banden auftraten, die auf eine andere Species als Microtus arvalis hindeuteten.

Abb.26: Artunterscheidung von Microtus arvails und Microtus agrestris mit dem RAPD-PCR Primer Roth A17

5.10.2 Populationsdifferenzierung

Basierend auf den mit dem Multilocus-DNA-Fingerprinting festgestellten Ergebnissen,

dass es zwischen den einzelnen Standorten, bzw. zwischen den einzelnen

Nutzungsformen Populationsdifferenzierungen gibt, wurde versucht, Primer zu finden, die

diese Ergebnisse bestätigen. Dies macht in Bezug auf eventuell kommende Arbeiten in

diesem Sektor deshalb Sinn, da die Menge an Probenmaterial so groß werden kann, dass

sie nicht mehr mit dem Multilocus-DNA-Fingerprinting zu bewältigen ist.

Warum diese Methode nicht direkt ohne das Multilocus-DNA-Fingerprinting auf diese

Fragestellung hin angewandt wurde, ist mit dem sehr hohen Informationsgehalt des

Multilocus-DNA-Fingerprinting gegenüber dem RAPD-PCR zu erklären. Das heißt, dass

die mit dem Multilocus-DNA-Fingerprinting erzielten Ergebnisse von der Methode her

wesentlich gesicherter sind als die mit dem RAPD-PCR erzielten Ergebnisse. Arbeiten,

bei denen versucht wurde populationsgenetische Fragestellungen mit dem RAPD-PCR zu

beantworten sind schon von diversen Autoren veröffentlicht worden (Macaranas et al.

1995, Caccone et al. 1997, Harding et al. 1997, Quack 2000).

Unter den 120 RAPD-PCR Primern befand sich nur einer, der Primer A19 von der Firma

Roth, der Populationsunterschiede zwischen den Standorten, bzw. zwischen den


unterschiedlich genutzten Flächen aufzeigte (siehe: Abb.25, Abb.26). Diese Unterschiede

zwischen den Standorten, bzw. den unterschiedlich genutzten Flächen waren jedoch

mehr an der Struktur (u.a. die Intensität einzelner Banden) der verschiedenen

Bandenmuster, als an der Vielzahl der polymorpher Banden festzumachen. Das

wiederum ist aber auf das Problem zurückzuführen, dass nur ein Primer gefunden werden

konnte, der die populationsgenetische Unterschiede aufwies. Bei mehreren solcher

Primer, wären natürlich auch mit einer größeren Anzahl von polymorphen Banden zu

rechnen, auf die dann eine statistische Auswertung hätte erfolgen können.

Abb.27: Unterschiedliche Bandenmuster der Standorte Herl, Hohberg und Zill von Microtus arvalis mit dem

Primer A19

Abb.28: Unterschiedliche Bandenmuster von Microtus arvalis in Herl (A: Standort Eiden, B: Standort

Knospenhof, C: Standort Herl-Brache)


Die Reproduzierbarkeit der mit dem RAPD-PCR erzielten Ergebnisse war im Großen und

Ganzen relativ hoch. Ein Problem, welches jedoch öfter auftrat, waren Unterschiede in der

Bandenstärke. Manche Banden erschienen intensiver und manche schwächer. Die

intensiven Banden verursachten keine großen Probleme, da sie auch noch in ihrer

schwächesten Erscheinungsform immer noch gut zu deuten waren. Anders hingegen die

schwachen Banden, die je nach PCR manchmal schwach vorhanden waren, manchmal

jedoch fehlten. Da die Anzahl polymorpher Banden sehr gering war, konnten Proben, bei

denen die schwachen Banden fehlten, oft nicht mehr einem bestimmten Standort zugeteilt

werden.

5.11 Fazit

Abschließend möchte ich feststellen, dass das Multilocus-DNA-Fingerprinting besser

geeignet war, genetische Untersuchungen von verschiedenen Standorten bzw.

Flächennutzungsformen an freilebenden Microtus arvalis durchzuführen als das RAPD-

PCR. Dies ist nicht nur auf den viel höheren Informationsgehalt des Multilocus-DNA-

Fingerprinting, sondern auch auf die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse dieser Methode

zurückzuführen. Das Verfahren wäre geeignet ein genetisches Monitoring von Microtus

arvalis im Hinblick auf bestimmte Umweltfaktoren (Inzucht, Populationsdezimierung,

Isolationsphänomene etc.) durchzuführen, bzw. den Einfluss von Umweltchemikalien auf

das Genom nachzuweisen. Die Grenzen der Anwendung dieser Methode sind jedoch in

der Probenanzahl zu sehen. Wird diese zu hoch, kann sie mit dem Multilocus-DNA-

Fingerprinting nicht mehr bewältigt werden, da es zu lange dauert, mit dieser Methode

einen Fingerprint herzustellen. Eine Alternative zu dem Multilocus-DNA-Fingerprinting

würde ich in der Mikrosatelliten-PCR sehen. Diese Methode wurde von mir versuchsweise

auch auf Microtus arvalis angewandt. Das Problem bestand darin, dass keine Literatur

gefunden werden konnte, in denen Mikrosatelliten-Primer für Microtus arvalis benannt

wurden. Deshalb wurden Mikrosatelliten-Primer von Microtus montebelli (Ischibaschi et al.

1998) und Microtus oeconomus (van de Zande et al. 2000), zweie nahe verwandte Arten,

auf Microtus arvalis angewandt. Leider konnten mit diesen Primern keine Mikrosatelliten

Regionen amplifiziert werden. Aber aufgrund der eindeutigeren statistischen

Auswertbarkeit der Mikrosatellite-PCR gegenüber der RAPD-PCR ist davon auszugehen,

dass diese Methode für populationsgenetische Untersuchungen besser als das RAPD-

PCR geeignet ist und somit eventuell wenigstens auf der Ebene von genetischen

Untersuchungen verschiedener Standorte bzw. Flächennutzungsformen eine Alternative

zu dem Multilocus-DNA-Fingerprinting darstellt.

Zusammenfassung 87

6. Zusammenfassung

Von den 3 eingesetzten Fallensystemen stellte sich die Kunststoff Wieselfalle als die für

den Fang von Microtus arvalis am besten Geeignetste heraus. Sie wurde sehr gerne

angenommen und die Mortalität in diesem Fallentyp war sehr gering. Durch ihre

Witterungsbeständig- und Verbissfestigkeit sind die Funktionsfähigkeit und eine lange

Lebensdauert garantiert. Von den angebotenen Ködern wurde am liebsten das

Früchtemüsli angenommen.

Alle der insgesamt 161 gefangenen Feldmäuse wurden mit der RAPD-PCR Methode

untersucht. Auf 99 dieser Microtus arvalis (65 mit unbekanntem, 34 mit bekanntem

Verwandtschaftsgrad) aus Wahlen und Herl wurde das Multilocus-DNA-Fingerprinting

angewandt.

Für alle verschiedenen Gewebetypen (Leber, Muskel und Niere) eines Individuums waren

die Fingerprintmuster identisch und somit somatisch stabil. Meist wurde jedoch die DNA

aus Lebergewebe isoliert, da sowohl die Qualität, als auch die Quantität der aus ihr

gewonnenen DNA sehr hoch war.

Bereits nach der Gelelektrophorese war zwischen den beiden phänotypisch nicht zu

unterscheidenden Arten Microtus arvalis und Microtus agrestris eine Fluoreszensbande

im Bereich um 2000 bp zu erkennen, die monomorph für alle Microtus agrestris war und

somit als eindeutiges Unterscheidungsmerkmal diente. Da dieses Vorgehen jedoch recht

zeit- und geldaufwendig war, wurde die Artunterscheidung später mit der RAPD-PCR

Methode durchgeführt. Hierbei wurden die besten Ergebnisse mit dem Primer A 17 der

Firma Roth erzielt.

Durch eine Kombination der Restriktionsendonuklease Hinf I mit der Digoxigenin

markierten Multilocus Sonde (GACA)4 gelang es hypervariable und absolut

individualspezifische DNA Fingerprintmuster zu erzielen.

Zusammenfassung 88

Im Fragmentlängenbereich zwischen 23500 bp und 1000 bp ließen sich bei den 65

Microtus arvalis mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad im Schnitt 14,25 polymorphe

Banden pro Individuum nachweisen. Die Anzahl der beurteilten Positionen lag innerhalb

der einzelnen Populationen zwischen 62 und 134. Die Wahrscheinlichkeiten (Pg), dass

alle Banden einer Feldmaus im Fingerprint einer anderen nichtverwandten Feldmaus

vorkamen, betrugen je nach Untersuchungsfläche zwischen 4,26 ⋅ 10-5 und 8,19 ⋅ 10-13.

Die Wahrscheinlichkeiten (Pi), dass zwei Individuen absolut identisch Fingerprintmuster

aufweisen, lag je nach Standort zwischen 6, 54 ⋅ 10-17 und 2,24 ⋅ 10-23. Die hier ermittelten

Wahrscheinlichkeiten Pg und Pi sind verglichen mit den von anderen Arbeiten sehr gering

und sprechen für das hohe Individualisierungspotential dieser Methode, angewandt auf

Microtus arvalis.

Ein Vergleich zwischen den verschiedenen Standorten Zill, Hohberg, Herl-Brache,

Knospenhof und Eiden hat gezeigt, dass die BSR innerhalb dieser Standorte höher waren

als zwischen den einzelnen Standorten, wodurch die einzelnen Populationen voneinander

differenziert werden konnten. Bestätigt wurde diese Differenzierung auch durch die

Clusteranalyse. Das Maß dieser genetischen Differenzierung konnte mit den Dìj Werten

beschrieben werden. Zusätzliche Berechnungen ergaben, dass nur 53,2% der gesamten

Varianz auf die geographische Distanz zurückzuführen sind. Bei Betrachtung der

geographischen und der genetischen Distanzen zwischen den Wahlener Standorten und

den Untersuchungsflächen bei Herl wird deutlich, dass der Großteil der 53,2% auf die

geographischen Distanzen der Wahlener und der Herler Untersuchungsflächen

zurückzuführen sind. Die Gründe bzw. Ursachen der Populationsdifferenzierung der

anderen Standorte wurden diskutiert.

Außer den 65 Feldmäusen mit unbekanntem Verwandtschaftsgrad konnten noch 34 mit

bekanntem Verwandtschaftsgrad gefangen werden: am Standort Hohberg eine Maus mit

5 Embryonen, am Standort Knospenhof 3 Mäuse mit 3, 4 bzw. 6 Embryonen und am

Standort Herl-Brache 2 Mäuse mit 4 bzw. 6 Embryonen.

Der auswertbare Fragmentlängenbereich von diesen Feldmäusen mit bekanntem

Verwandtschaftsgrad erstreckte sich von 24200 bp bis zu 1000 bp. Erwartungsgemäß

waren hier die durchschnittliche Anzahl polymorpher Banden pro Individuum (11,75), die

Anzahl der beurteilten Positionen (je nach Untersuchungsfläche zwischen 24 und 44) und

die Wahrscheinlichkeiten Pg (zwischen 3,60 ⋅ 10-2 und 7,18 ⋅ 10-3) und Pi (zwischen 1,16 ⋅

10-4 und 3,39 ⋅ 10-12) wesentlich geringer als bei den Feldmäusen mit unbekanntem

Verwandtschaftsgrad.

Zusammenfassung 89

Im Zusammenhang mit der Untersuchung der Fingerprints verwandter Microtus arvalis

konnten für alle Mütter die Banden benannt werden, für die sie heterozygot sein müssen,

da sie in den Bandenmuster der Nachkommen fehlten. Ferner konnte dargelegt werden,

warum zwischen den Nachkommen e5/e6 und den Nachkommen e1, e2, e3 und e4 eine

Halbgeschweisterschaft, und somit eine multiplen Vaterschaft, wahrscheinlicher ist als

eine Vollgeschwisterschaft.

Ein Vergleich zwischen den beiden Methoden Multilocus-DNA-Fingerprinting und RAPD-

PCR zeigte die sehr gute Eignung des Multilocus-DNA-Fingerprinting bei Fragestellungen

die Species- bzw. Populationsdiversiät betreffend sowie bei genetischen

Verwandtschaftsanalysen. Die RAPD-PCR hingegen konnte lediglich bei der genetischen

Charakterisierung verschiedener Arten überzeugen; bei der Populationsdifferenzierung

stieß die Methode jedoch in diesem Fall auf ihre Grenzen.

Danksagung 90

7. Danksagung

Im folgenden möchte ich mich bei all jenen Personen, die am Gelingen und

Zustandekommen dieser Arbeit mitgewirkt haben recht herzlich bedanken. Ohne diese

Personen hätte mir die Beantwortung der dieser Arbeit zugrundelegenden Fragestellung

wahrscheinlich nur halb soviel Freude bereitet.

An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Paul Müller für die

Überlassung des Themas, die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes und die nicht

unerheblichen finanziellen Mittel, mit der er meine Arbeit unterstützte, bedanken.

Für seine Freundschaft, fachkundigen Ratschläge, Diskussionsbereitschaft und die

kritische Durchsicht der Arbeit danke ich Herr Dr. Ralf Kautenburger.

Bei den Herren Dr. Gerhard Wagner, PD. Dr. Martin Paulus und PD. Dr. Roland Klein

möchte ich mich für die Anstellung bei der UPB bedanken, und dafür, dass sie mir genug

Freiraum gelassen haben, meine Promotion zu beenden. Das Arbeiten in einem so

kollegialen Team zusammen mit allen Hiwis der UPB, bei denen ich mich auch an dieser

Stelle bedanke, hat mir sehr viel Spaß gemacht.

Ganz besonderen Dank möchte ich Frau Tanja Rölker aussprechen, die unermüdlich für

alle am Projekt beteiligten Personen DNA isolierte.

Bedanken will ich mich auch bei den Herren Dr. Ortwin Elle sowie Markus Quack, für die

Bereitstellung der Flächennutzungskartierungen der Untersuchungsgebiete bzw.

statistischer Auswertprogramme, die mir die Arbeit sehr erleichterten.

Last but not least möchte ich meiner Freundin Heike Theisen, den Herren Franz Gassert,

Dr. Joachim Krüger und Bernd Fontaine, sowie den technischen Angestellten des

ehemaligen FPP´s Irmtraud Reinert, Gabi Marmann, Renate Engel und Nicole Finkler für

ihre aufmunternden Worte, Hilfsbereitschaft, guten Ratschläge und ein super Arbeitsklima

im Labor Dank sagen.

Literatur 91

8. Literaturverzeichnis

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Genetische Untersuchungen zur …ub-dok.uni-trier.de/diss/diss45/20030211/20030211.pdf · 4.5 Statistische Auswertung ... Restriktionsverdau ..... 48 Abb.19: Restriktionsverdau mit