MahmutÇerkezErgören,PhD

GENOMİKANALİZLER

UygulamalıHücreKültürüKursu

3-4Haziran2016LeFoşa,KKTC

YAKINDOĞUÜNİVERSİTESİ

Genomik/ProteomikAnalizler-omiks(ing.–omics):Biyolojideçalışılanalanırefereeder,örneğin;genomiks,proteomiks.

-om(ing.–ome):Çalışmaalanlarınhedeflerinigösterir,örneğin;genom,proteom.

Genomiks:Organizmagenomlarınınçalışılması.

Proteomiks:Proteinyapıveişlevleriningenişölçekteçalışılması.

ProteomAnaliziGenlerinModifikasyonuveKlonlanması

TranskriptomAnalizleriiçinGenomikTestler

FizyolojikRekonstrüksüyonlar ModellemeAnalizleri

Genomikanalizyapılabilmesiiçin:

invitrohücreha_

Hücre/Doku/Organ NükleikAsit(DNAveRNA)ektraksiyonu

ANALİZ

FENOTİP

GENOTİP

İkincilveÜçüncülYapısıKarakterizasyonu

YADAİşlevselanalizler(invitrotest)

Proteinizolasyonu

PROTEOMİKS

Hücregenomdizianalizindeişakışı:

invitrohücreha_

Doku/Organ

DNAekstraksiyonuGenocpleme:DizianaliziANALİZ

SNP/CNVHücrecpikimliklendirmesiGenommodifikasyonu

TEKhücregenomdizianalizindeişakışı:LazerYakalamaMikrodissessiyon(LCM)

invitrohücreha_

Doku/Organ

veya

Flowsitometriveya

FloresanAkcveHücreAyırma(FACS)veyaMikrofluidler

Tekhücreizolasyonu

DNAekstraksiyonuGenocpleme:DizianaliziANALİZ

SNP/CNVHücrecpikimliklendirmesiGenommodifikasyonu

DNAekstraksiyonu

Tümgenomhaplocpanalizler

Ayda1yumurta

HerbirejakulaPa106

sperm

Genocpleme:Dizianalizi

BüyükölçekliGerm-linedenovomutasyon

tayini

“Mayockyönlendirme”

Genharitalama/SNPkimliklendirme/Popülasyonçalışmaları

•  MolekülerbiyolojitekniklerikullanılarakbireyinDNAdizisininincelenmesi,başkabireylerleyadareferansDNAdizisiilekarşılaşTrarak,bireyingenoUpfarklılıklarınıbelirlemeişlemidir.

•  BireylerinebeveynlerindenkalıTlanalellerigösterir.

Genocpleme

Aynı türün genomları arasındaki varyasyonçeşitlilikleridir.

1. İnsan genomlarındaki genom değisiklikleri kisileregöredeğismelerinerağmenetkileriyoktur.

2.Diğer değisiklikler fenoUpi, vücut yapısını belirleyennormal değerleri, metabolizmayı, pigmentasyonu vbetkileyebilirveherkisiyiözelyapar.

3.Bazıvaryantlarpatojenikcr.

6 milyondan fazla SNPkimliklendirildi.

Her500bazda0.5-10kezgözlenebilirler.~60,000genleriniçinde

Myerset.al.2008NatureGene,cs40,1124-1129

TekNükleocdPolimorfizmi(SingleNükleocdPolimorfizm–SNP)

İnsanGenomProjesi–1990/2004“TheLanguageofGod”FrancisCollins

3milyarnükleocd300bingen

11farklıpopülasyon~21bingen~Her50/100bç1SNP

~33bingen~GenomdaSNP’lervar

UluslararasıİnsanHaplocpHaritaProjesi(HapMap)–2005/-

GenocplemedeKullanılanTeknikler:1.  RestriksiyonFragmentUzunlukPolimorfizmi(RFLP)

2.  RastgeleÇoğalTlmışPolimorfikTanımlama(RAPD)

3.  ÇoğalTlmış Fragment Uzunluk Polimorfizmi Tanımlama(AFLPD)

4.   Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) / Gerçek Zamanlı – PCR(RT-PCR)

5.   Alel-SpesifikOligonükleocdProb–Hibridizasyon

6.   DNAdizianalizi

7.   DNAmikroarray/SNParray

Alel-SpesifikOligonükleocdProb–Hibridizasyon

GenomikDNA

ASO(C) ASO(T)AlelSpesifikOligonükleocdler

Genocp

ProbProb

Dot-blotüzerindekiDNAörnekleri

! BilinenSNPler.

! Ucuz.

! Radyasyonyadafloresanboya.

DiziAnalizi•  Verilen DNA fragmenUnin nükleoUd (adenin, guanin, sitozin, Umin)

sıralamasınıbelirlemeişlemidir.

DNAdizianalizinedenönemlidir?!  Dizinin sıralanışını belirler, böylece organizmanın neden ve nasıl

yaşadığıhakkındabilgiverir.

!  Bireylerin genleri, geneUk bölgeleri (genler ya da operonlar), birkromozomuyadatümgenomudizianalizleriilebelirlenebilir.

!  Hayvanlar, bitkiler, bakteri vb gibi geneUk bilgi taşıyan her kaynaktanelde edilen DNA veya RNA moleküllerinden nükleoUd dizi analiziyapılabilir.

Geneck

DNADiziAnalizi

EvrimBiyolojisi

Metagenomik

Tıp

AdliBilimler

Mikrobiyoloji

MolekulerBiyoloji

DiziAnaliziYöntemleri1.SangerDiziAnalizi(DideoksiDNAdizianaliziveyazincirsonlandırma)

invitroDNAreplikasyonuesnasındaDNApolimeraz taracndan zincir sonlandırandideoksinükleoUtlerirastgeleseçerekdizibelirlemesinedayanmaktadır.

Sanger dizi analizi tekniği hala büyükölçüdekullanılmaktadır.

500bç<dizileriçinideal.

3.Shotgundizianalizi

1000bç-tümkromozomanalizi

KaTbiryüzeyebağlananprimerlerlegüçlendirilmiş"DNAkolonileri"yada"DNAkümelenmeleri"dizianaliziformudur.

Dideoksi nükleoUdleri ile zincir sonlandırmayerine “sentezle dizi analizi” yönteminedayanır.

2.Pyrosekanslama

4.KöprüPCR

5.YeniNesilDizileme(NextGeneraconSequencing–NGS)

Yeniden-sekanslamabirbireyeaitgenomanalizi,aynıtürünfarklıbireylerindeki geneUk varyasyonları temsil etmediği içingereklidir.

•  Varyasyonprofilendirilmesi

–  GeneUkvaryasyon–  Transkriptvaryason–  EpigeneUkvaryasyon–  Metagenomikvaryasyon

•  Keşif

–  Yenigenomlar

–  Yenigenler–  Yenitranskriptler–  Küçük/uzunnon-codingDNA

RNADizianalisi(RNASeq)

• Kodlayanveyakodlanmayanbölgelerdekitransciprtprofillendirilmesi

Epigenomik

• Tümgenomprotein-DNAetkileşimi

• Genregülasyonununkalıtsalvegeridönüşümlüifadesi

Bugün

YeniNesilDizilemeMetodları1.  Massivelyparallelsignaturesequencing(MPSS)

2.  Polonysequencing

3.  454pyrosequencing(beadmicroreactor)

4.  Illumina(Solexa)sequencing

5.  SOLiDsequencing(2baseencoding)

GenelÖzellikeri

A.GenomikDNA’nınrastgelefragmentasyonu

B.BoncukyadadüzlemselkaTyüzeydesteklerkullanılaraktektekDNAfragmentlerininimmobilizasyonunusağlamalı.

C. PCR kullanarak DNA fragmentlerinin kaT yüzeyde amplifiyeetmekveböylecepolimerazkolonilerioluşturmak.

D. Dizi analizi ve floresan ya da kemilüninesans kullanarak herdöngüdensonrainsitusorgulamak/kontroletmek.

DNAmikroarray(DNA-chips,Gene-Chips,SNP-chips)

!  Silikon,camveyanaylontabakaüzerindesabitkonumlardabilinenkısakomplementerDNAoligonükleoUtlerisıraylayerleşUrirler.

!  OligonükleoUdler deneysel olarakbelirlenirler ve (1)microspotlama yada (2) bir çipüzerindesentezlenirler.

!  Kullanıcı tanımlı SNP çipleri Ucari olarak temin edilebilir, ve> 400,000 farklı probuiçerebilir.

HuangH.etal.2015Microarrays4(4),570-595

Genlerinekspresyonseviyeleriniölçmekyadabirgenomdabirdenfazlagenbölgesindegenocplemesikullanilır.

Her bir DNA probu (veya oligo)10-12 pikomol özel DNA dizisiniiçerir.

cDNA örneği hibridizasyon içinkullanılanbirgenyadabaşkaDNAelemanınınkısaparçasıolabilir.

Prob-hedefleyerek hibritlemedehedef nükleik asit sekanslarınıngöreceli olarak belirlemek için -gümüş- veya kemilüminesanseUketlemeiletespitedilir.

DNAMikroarrayUygulamaAlanları:

1) GenEkspresyonProfilendirilmesi

2)  KomperacfGenomHibridizasyon(CGH)

3) GeneID

4)  KromacnimmünopresipitasyononChip

5) DamID

6)  SNPdeteksiyonu

7) AlternacfKesimDeteksiyonu

8)  FüzyonGenArray

9)TilingArray

invitrohücreha_

Doku/Organ

RNAdizianalizindeişakışı:

RNA

RT&Ikinci-zincirsentezi

cDNA

ÇoğalmışcDNA

PCR

DiziAnaliziEkspresyonProfilleri

RealTimeKonfirmasyon

RNAdizianaliziuygulamarı:•  Genekspresyonu

•  SNPkeşfi

•  Post-transkripsiyonelSNP

•  Ko-ekspresyonyolakları

bgisequence.comsitesindenalindi.

HedefBölgeSeçimi

PCRAmplifikasyonu

DiziAnalizi(ShortgunyadaYüksekverimlilikli)

GenomAnotasyon

DNAdizianalizi

KomperacfAnalizProteinTahminiYolaklar

GELECEK…

Hedeflenen nükleazların rekombinasyon vektörlerikullanarak ya da kullanılmayarak uygulanmasına“genomdüzenleme"denir.

GenomDüzenleme

Genom düzenleme araçları, in vitro ve in vivo olarakhedeflenen mutasyonların elde edilmesinde, gen yerdeğişcrmesindevegendüzelclmesindekullanılabilir.

Nükleazakcvitesinin sekansıspesifikveDNA'yabağlanabilmesi için, istenilen bölgeye özgü DNA-bağlamaproteinlerikullanılabilir(DNA-binding).

Buproteinler:(1)Zinc-fingerproteinleri(ZFPs)

(2) Transkripsiyon akUvatörü benzer efektör (TALE)(transcripUonacUvator-likeeffector)proteinleri

(3)Kümelenmişdüzenliaraboşluklukısapalindromiktekrarlar (CRISPR/Cas) (Clustered regulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats)

FDAonayıalındıktansonra...

ZFNsklinikdeneylerletestediliyor.

TALENveCRISPR/CasteknolojilerinispetenyenivehenüzklinikuygulamalardatestedilmemişUr.

CRISPR / Cas İngiltere'de insan embriyo ediUngiçinonaylanmışTr.

ZincFingerNükleaz(ZFN)

3+ZFModül,herbiri3bçNükleazfüzyonu

TALEfektorNükleaz(TALEN)

10+TALModül,herbiri1bçNükleazfüzyonu

CRISPR/Cas9

1hedefRNANükleazabağlanma

Clustered,Regularly-Interspaced,ShortPalindromicRepeats(CRISPR)–Associatedproteinsystem(/Cas)

VirusveplasmidlerekarşıprokaryoUkimmünsistem.S.pyogenesSF370TipIICRISPRlokusu4geniçerir:I.Cas9nükleazII.2non-codingCRISPRRNA(crRNA)III.trans-akUvatörcrRNA(tracrRNA)

IV.Prekürsör(oncu)crRNA(pre-crRNA)özdeşdoğrudantekrarlartaracndanaraboşluklunükleazkılavuz

CRISPR/CasSistemi

RNAbileşenleri,buyabancıgeneckdizileriDSB(double-strandbreak,ci|-zincirkırıkları)

oluşturmakiçinspesifikDNAdizilerineCas9endonükleaziniyönlendirmekcr.

CRISPR/Cas9TeknolojisindenSonraBiyolojisinSonAdımıTamamlanmışOldu

DNAyapısı/dizilenmesi

PCR

SNPtayini/Ekspresyoncalismlari

Genomdüzenleme

KökHücre-CRISPR/Cas9GenomModifikasyonu

CRISPR/Cas9+ESCveyaiPSC=TEDAVİ

HücreKültürü

Geneck

Tıp

MolekülerBiyoloji

Workshop:1. İstenilengenbölgesininnükleoUddizisinenasılulaşabiliriz?

2. DNAdizisindekitekrarlıbölgelerintespitedilmesi?

3.HedefbölgedekiSNPtayinivepopulasyondakiönemi?

4.HedefSNP’inhastalıkyapıcıözelliklerininaraştırılması?