244
Globale Phosphoproteomanalyse Gram-positiver Bakterien unter besonderer Berücksichtigung regulatorischer Mechanismen I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald vorgelegt von Katrin Bäsell, geb. Gronau geboren am 21.02.1977 in Kiel Greifswald, 19.11.2012

Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

Globale Phosphoproteomanalyse Gram-positiver Bakterien unter

besonderer Berücksichtigung regulatorischer Mechanismen

I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n

zur

Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

vorgelegt von

Katrin Bäsell, geb. Gronau

geboren am 21.02.1977

in Kiel

Greifswald, 19.11.2012

Page 2: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser

1. Gutachter: Prof. Dr. Michael Hecker

2. Gutachter: Prof. Dr. Dirk Bumann

Tag der Promotion: 27.03.2013

Page 3: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

Inhalt

Zusammenfassung ........................................................................................................ 7

Summary ....................................................................................................................... 9

1 Einleitung ................................................................................................................ 11

1.1 Proteomic/Phosphoproteomic ....................................................................... 11

1.2 Das bakterielle Phosphoproteom ................................................................... 15

1.2.1 Bakterielle Proteinkinasen ........................................................................ 17

1.2.2 Bakterielle Proteinphosphatasen ............................................................. 19

1.2.3 Bacillus subtilis .......................................................................................... 20

1.2.4 Mycoplasma pneumoniae ......................................................................... 24

1.2.5 Staphylococcus aureus .............................................................................. 26

1.3 Methoden zur Analyse des bakteriellen Phosphoproteoms .......................... 28

1.3.1 Gelbasierte Techniken zur Analyse des Phosphoproteoms ..................... 29

1.3.2 Gelfreie Techniken zur Analyse des Phosphoproteoms ........................... 32

1.3.3 Die Rolle der Massenspektrometrie bei der Analyse des

Phosphoproteoms ................................................................................................... 36

1.3.4 Daten-Analyse ........................................................................................... 38

1.4 Quantifizierung des Phosphoproteoms .......................................................... 39

1.5 Zielstellung der Arbeit ..................................................................................... 40

2 Ergebnisse und Diskussion ...................................................................................... 42

2.1 Das Phosphoproteom von Bacillus subtilis ..................................................... 42

2.1.1 Optimierung der 2D-gelbasierten phosphosensitiven Pro-Q® Diamond

Färbemethode ........................................................................................................ 42

2.1.2 Verwendung der Gesamtproteinfärbung zur verbesserten Identifizierung

putativ phosphorylierter Proteine .......................................................................... 46

Page 4: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4

2.1.3 Verifizierung der Pro-Q-Färbung via alkalischer Phosphatase von E. coli

und radioaktiver Markierung mit 33P ...................................................................... 51

2.1.4 Identifizierung von Pro-Q-gefärbten Proteinen aus dem 2D-Gel ............. 55

2.1.5 Dynamik des Phosphoproteoms unter veränderten physiologischen

Bedingungen ............................................................................................................ 62

2.1.6 Untersuchung des Phosphoproteoms einer B. subtilis sigB-Mutante ...... 67

2.1.7 Phosphotyrosin-Detektion via 2D-Westernblot ........................................ 73

2.1.8 Anreicherung von Proteinkinasen mittels Kinaseinhibitoren ................... 75

2.2 Das Phosphoproteom von Staphylococcus aureus ......................................... 82

2.2.1 Identifizierung der P-Stelle von RsbV aus S. aureus via "negative-mode"

an der Q-Trap4000 .................................................................................................. 82

2.2.2 Globale Analysen zum Phosphoproteom von S. aureus ........................... 85

2.2.2.1 2D-gelbasierte Analyse des Phosphoproteoms von S. aureus .......... 85

2.2.2.2 Analyse des Phosphoproteoms von S. aureus via gelfreier

Phosphopeptidanreicherungstechnik ................................................................. 91

2.2.2.3 Vergleich der Resultate aus den gelbasierten und gelfreien

Phosphoproteom-Analysemethoden .................................................................. 98

2.2.2.4 Funktionelle Einordnung der identifizierten phosphorylierten

Proteine .......................................................................................................... 102

2.2.2.5 Infektionsrelevante Phosphorylierungsereignisse ........................... 106

2.2.2.5.1 Enzyme des Metabolismus .......................................................... 106

2.2.2.5.2 Enzyme der Proteolyse ................................................................ 113

2.2.2.5.3 Virulenzregulatoren ..................................................................... 114

2.2.2.6 Zielproteine der Serin/Threoninkinase PknB ................................... 116

2.2.2.7 Dynamic des Phosphoproteoms unter veränderten physiologischen

Bedingungen ...................................................................................................... 119

2.2.2.7.1 Glukosehunger ............................................................................ 121

Page 5: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

Inhalt 5

2.2.2.7.2 Stressinduktion durch Stickstoffmonoxid ................................... 130

2.2.2.7.3 Stressinduktion durch Diamid ..................................................... 135

2.2.2.7.4 Stressinduktion durch Natriumchlorid (osmotischer Stress) ...... 136

2.3 gelbasierte Quantifizierung des Phosphoproteoms von B. subtilis via

metabolischer 14N/15N-Markierung .......................................................................... 137

2.4 Analyse von Argininphosphorylierungen in Bacillus subtilis ........................ 145

2.5 Zusammenfassung und Ausblick ................................................................... 153

3 Material und Methoden ....................................................................................... 159

3.1 Materialien .................................................................................................... 159

3.1.1 Bakterienstämme .................................................................................... 159

3.1.2 Medien und Medienzusätze ................................................................... 159

3.1.3 Antikörper, Beads, Säulenmaterialien .................................................... 163

3.1.4 Antibiotika und Enzyme .......................................................................... 163

3.1.5 Chemikalien und Lösungsmittel .............................................................. 164

3.2 Methoden ..................................................................................................... 166

3.2.1 Stammhaltung ......................................................................................... 166

3.2.2 Proteinextraktgewinnung ....................................................................... 167

3.2.2.1 Zellkultivierung ................................................................................ 167

3.2.2.2 Zellaufschluss ................................................................................... 171

3.2.3 Methoden zur Proteinanalyse ................................................................ 172

3.2.3.1 Proteinbestimmung nach Bradford ................................................. 172

3.2.3.2 Verdau des Proteinextraktes mit alkalischer Phosphatase ............. 173

3.2.3.3 Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) ... 173

3.2.3.4 Färbemethoden für Proteine im 2D-Gel ......................................... 176

3.2.3.4.1 Phosphoproteinfärbung im 2D-Gel mit Pro-Q® Diamond ........... 176

3.2.3.4.2 Gesamtproteinfärbung im 2D-Gel mit Flamingo™ ..................... 177

Page 6: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

6

3.2.3.4.3 Gesamtproteinfärbung im 2D-Gel mit Deep Purple™ ................. 177

3.2.3.4.4 Colloidal Coomassie/ Coomassie "blue silver" ............................ 178

3.2.3.4.5 Gesamtproteinfärbung im 2D-Gel mit Silbernitrat ..................... 179

3.2.3.5 2D-Gel Westernblot mit Phospo-Tyrosin-Antikörper (P-Tyr-100) ... 180

3.2.3.6 Bildananalyse der gefärbten 2D-Gele .............................................. 182

3.2.4 Anreicherung von Proteinkinasen mittels eukaryotischen

Kinaseinhibitoren .................................................................................................. 182

3.2.5 Phosphopeptidanreicherung ................................................................... 183

3.2.5.1 Kationenaustauschchromatographie (SCX-Chromatographie) ....... 184

3.2.5.2 TiO2-Phosphopeptidanreicherung ................................................... 185

3.2.5.3 TiO2-Anreicherung: Peptide mit Argininphosphorylierungen ......... 186

3.2.6 Massenspektrometrische Analyse der Phosphoproteine ....................... 187

3.2.6.1 nanoHPLC-ESI-LTQ-FT-ICR-MS ......................................................... 187

3.2.6.2 nanoHPLC-ESI-Qtrap-MS .................................................................. 188

3.2.6.3 nanoHPLC-ESI-LTQ-OrbitrapXL-MS .................................................. 191

3.2.6.4 nanoHPLC-ESI-LTQ-Orbitrap-Velos-MS ............................................ 194

3.2.7 Quantifizierung der MS-Daten (metabolischer Markierungsansatz) mittels

Census ................................................................................................................. 197

4 Literaturverzeichnis ............................................................................................... 200

5 Anhangsübersicht .................................................................................................. 237

6 Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................... 238

7 Publikationsverzeichnis ......................................................................................... 240

8 Erklärung ............................................................................................................... 242

9 Lebenslauf ............................................................................................................. 243

10 Danksagung ........................................................................................................... 245

Page 7: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

Zusammenfassung 7

Zusammenfassung

Die Analyse bakterieller Phosphoproteome rückt durch die Einflussnahme von

Phosphorylierungsereignissen im Virulenzgeschehen pathogener Mikroorganismen

immer weiter in den Vordergrund.

Der Fokus dieser Arbeit lag auf der globalen Analyse bakterieller Phosphoproteome

unter Anwendung verschiedener Techniken der Proteomforschung. Ziel war es, einen

möglichst umfassenden Überblick über das cytosolische Phosphoproteom zu

gewinnen, die Dynamik der Protein-Phosphorylierungen unter verschiedenen

physiologischen Bedingungen zu analysieren und daraus folgend Hinweise auf

regulatorische Mechanismen zu erhalten. Im Zuge der Untersuchungen zum

Phosphoproteom von Bacillus subtilis wurde das auf den phosphosensitiven Pro-Q®

Diamond-Farbstoff basierende 2D-Gel-Färbeprotokoll optimiert und validiert. Ferner

wurde dieses Protokoll erfolgreich für die Untersuchungen des Phosphoproteoms von

Mycoplasma pneumoniae und Staphylococcus aureus eingesetzt. Durch die Etablierung

einer Methode zur Phosphopeptidanreicherung konnte der Blick auf das

Gesamtphosphoproteom von S. aureus komplementiert werden. Insgesamt war es

dadurch möglich, 103 phosphorylierte Proteine und 68 verschiedene

Phosphorylierungsstellen von S. aureus zu identifizieren, darunter z. B. den

Virulenzregulator SarA, dessen Phosphorylierung einen Hinweis auf seine mögliche

Regulation aufzeigt. Zusätzlich konnten die Phosphorylierungsergebnisse der Fruktose-

1,6-Bisphosphataldolase erste Hinweise auf eine Regulation der Substratbindung

liefern und einen Erklärungsansatz enstehen lassen, der die Wirkungslosigkeit einiger

in der Literatur beschriebenen Enzyminhibitoren (potentielle antimikrobielle

Wirkstoffe) in in vivo Studien darlegt.

In einem auf der Pro-Q® Diamond-Färbung beruhenden Quantifizierungsansatz

konnten 10 signifikante Veränderungen in der Signalintensität der phosphorylierten

Proteine unter Glukosehunger, nitrosativem, oxidativem und osmotischem Stress

festgestellt werden. Diese liefern erste Indizien auf durch Phosphorylierungsereignisse

gesteuerte Regulationsmechanismen. Besonders die unter nitrosativen Stress neu

auftretenden putativ phosphorylierten Proteinspots der Proteine FdaB (Fruktose-

Bisphosphataldolase) und HchA (molekulares Chaperon Hsp31/Glyoxalase 3) lassen

Page 8: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

8

Spekulationen über neue Stoffwechselwege, wie z. B. einen Methylglyoxal

detoxifizierenden Mechanismus, zu. Darüber hinaus konnten durch die

Glukosehungerexperimente und die Spezifizierung der Phosphorylierungsstelle T537

der Pyruvatkinase von S. aureus ein Regulationsmechanismus vorgeschlagen werden,

der das "Finetuning" des Energieladungszustandes der Zelle über einen

Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsmechanismus beschreibt.

Von weiterem Interesse war die Identifizierung von am Arginin phosphorylierten

Peptiden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde hierfür das Phosphopeptid-

anreicherungsprotokoll optimiert, so dass in Zusammenarbeit mit A. Elsholz (Inst. f.

Mikrobiologie, EMAU Greifswald) die Identifizierung von phosphorylierten

Argininresten der Argininkinase McsB und der ATPase ClpC in B. subtilis möglich

wurde. Darüber hinaus wurde die Methode in globalen Untersuchungen einer

Phosphatasemutante (∆ywlE, B. subtilis) angewandt. Mittels der im Rahmen dieser

Arbeit durchgeführten massenspektrometrischen Analyse der angereicherten Peptide

konnten 111 Arginin-Phosphorylierungsstellen identifiziert werden.

Zur Verbesserung der Quantifizierung von phosphorylierten Proteinen in B. subtilis

wurde ein Protokoll entwickelt, indem das Auftrennungspotential des 2D-Gels, die

Identifizierung phosphorylierter Proteine anhand des Pro-Q® Diamond-Farbstoffs und

die auf die metabolische Markierung beruhende Quantifizierung miteinander

kombiniert wurde. Im Ergebnis konnte anhand dieser Methode eine bessere

Reproduzierbarkeit und eine höhere Sensitivität bei geringeren Veränderungen im

Vergleich zu dem Pro-Q® Diamond basierten Quantifizierungsansatz erzielt werden.

Page 9: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

Zusammenfassung 9

Summary

Analysis of bacterial phosphoproteomes becomes an increasing importance due to the

influence of phosphorylation events during virulence of pathogenic microorganisms.

The thesis presented here focuses on the global analysis of bacterial

phosphoproteomes using different proteomic technologies. It was conducted in order

to characterize phosphorylated proteins comprehensively, to investigate their

dynamics under different physiological conditions and to obtain first insights in

regulatory mechanisms.

Therefore a 2D-gel protocol, based on the phosphosensitive stain Pro-Q Diamond, was

optimized, validated and first applied for the analysis of the phosphoproteome of

Bacillus subtilis. In the following work the resulting protocol was also applied for the

investigation of the phosphoproteomes of the human pathogens Mycoplasma

pneumoniae and Staphylococcus aureus.

The establishment of the phosphopeptide enrichment protocol according to Olsen and

Macek completed the analysis of the phosphoproteome of S. aureus. 103

phosphorylated proteins and 68 different phosphorylation sites from S. aureus were

identified including two phosphosites in the virulence regulator SarA. The

phosphorylation events of SarA provide a first hint of its putative control mechanism

similar to that of the transcriptional regulator MgrA. Additionally, the identification of

multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein

(fructose-1,6-bisphosphate aldolase) indicate an active regulation of the substrate

binding. These findings provide first possible explanations for the inefficacy of

substrate-analog FbaA-inhibitors in in vivo analysis experiments.

By quantitation of signal intensities of phosphorylated proteins on 2D-gels, we

observed 10 significant changes during glucose starvation, nitrosative, oxidative and

osmotic stress conditions. Especially, the appearance of two newly phosphorylated

isoforms of FdaB (fructose-bisphosphate aldolase) and HchA (molecular chaperone

Hsp31/glyoxalase 3) may lead to a suggestion of new metabolic pathways such as a

methylglyoxal detoxifying mechanism. Furthermore, due to the identification of the

Page 10: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

10

phosphorylation site T537 of Pyk (pyruvate kinase) it was possible to propose a fine

tuning mechanism in dependency of the energy charge state of the cell.

Of special interest was the identification of arginine phosphorylated peptides in

B. subtilis. Consequently, the phosphopeptide enrichment protocol was optimized. In

cooperation with A. Elsholz (Inst. f. Microbiology, EMAU Greifswald) it was possible to

identify arginine phosphorylation sites in McsB (arginine kinase) and ClpC (ATPase). On

the base of a global phosphatase mutante analysis (ΔywlE) 111 arginine

phosphorylated peptides were identified via mass spectrometry using the optimized

enrichment protocol. To enhance the quality of quantitation of phosphorylated

proteins a protocol was developed in which the potential of the 2D-gel

(protein/-isoform separation), the identification of phosphorylated proteins via Pro-Q

Diamond, and the quantitation via metabolic labeling were combined. In the result an

improved reproducibility and a higher sensitivity compared to the gel-based approach

were reached.

Page 11: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung

1.1 Proteomic/Phosphoproteomic

Ähnlich dem Bauplan einer Fabrik liefert die Genomsequenz den Bauplan des Lebens

mit all seinen in der Theorie verhafteten Möglichkeiten. Der Drang, Leben zu

verstehen, entfachte in den 90er Jahren ein Wettrennen um die vollständigen

Sequenzierungen der Genome von Organismen, einschließlich dem des Menschen

(Venter u. a., 2001). 1995 wurde die erste komplette Sequenzierung des bakteriellen

Genoms von Haemophilus influenzae publiziert (Fleischmann u. a., 1995). Die Euphorie

der ersten Stunde verflog, als klar wurde, dass die Genomsequenzierung nur einen

statischen Bauplan liefern kann, jedoch keine Hinweise auf das reale Geschehen im

Organismus liefert. Die Suche nach den wirklichen Abläufen führte zur Entwicklung der

funktionellen Genomforschung, die beispielsweise mithilfe von Transkriptomanalysen,

die aktuell exprimierten Gene entschlüsselt (Harrington u. a., 2000; Ito & Sakaki, 1996).

Erst mit der Analyse der „aktiven Genprodukte“, nämlich der Proteine, wurde der

Genomsequenz "Leben eingehaucht" (Hecker, 2003), da die Proteine, die

Hauptdarsteller im Zellgeschehen, für alle zellulären Prozesse und insbesondere für

Regulationsmechanismen in Bezug auf sich wechselnde Umweltbedingungen, die dem

Organismus unter verschiedensten Bedingungen das Überleben sichern,

verantwortlich sind.

Die Proteomic beschäftigt sich mit der Analyse des exprimierten Proteinkomplementes

des Genoms einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus, dem Proteom. Der

Begriff des Proteoms und des dahinterstehenden Konzepts wurde erstmals von Marc

Wilkins (Macquarie Universität in Sydney, Australien) definiert (Cordwell u. a., 1995;

Wasinger u. a., 1995; Wilkins u. a., 1996a, 1996b). Die erste Generation der

Proteomforscher befasste sich mit dem Auffinden von Proteinen, deren An- und

Abwesenheit sowie deren Identifikation. Hierbei wurden die Veränderungen im

Proteom mittels der 2D-Gelelektrophorese (Klose, 1975; O’Farrell, 1975), mit der seit

den 70er Jahren eine große Anzahl von Proteinen getrennt und katalogisiert wurden,

Page 12: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

12

visuell dargestellt. Damals erfolgte die Identifizierung der Proteine größtenteils mit

Hilfe der sehr zeitintensiven Edmann-Sequenzierung (Aebersold u. a., 1987; Edman,

1949). In einem automatisierten Ansatz konnte dann Ende der 80er Jahre die

Sequenzierungszeit für eine Aminosäure auf ca. eine Stunde reduziert werden

(Matsudaira, 1987). Durch die immer größer werdende Zahl an kompletten

Genomsequenzen und dem erhöhten Bedarf an Proteinsequenzierungen stieß die

Edmann-Sequenzierung mit ihrem beträchtlichen Zeitbedarf und ihrer relativ geringen

Sensitivität an ihre Grenzen.

Der große Durchbruch gelang Ende der 80er/Anfang der 90er Jahre mit der

Realisierung der analytischen Massenspektrometrie für biologische Moleküle, die die

Edmann- Sequenzierung ablöste. Die Entwicklung der weichen Ionisierungstechniken

ESI und MALDI (electrospray ionisation/matrix assisted laser desorption/ionization)

ermöglichte es, Peptidmassen sensitiv und im Hochdurchsatz zu bestimmen (Fenn u.

a., 1989; Karas & Hillenkamp, 1988). Diese Peptidmassen, in Verbindung mit den aus

der Nukleotidsequenzierung hervorgegangenen Datenbanken, wurden zur

Proteinidentifizierung herangezogen. 1993 fand mehrmals unabhängig voneinander

die Entwicklung des Algorithmus des "peptide-mass fingerprinting" statt (Henzel u. a.,

1993; James u. a., 1993; Mann u. a., 1993; Pappin u. a., 1993; Yates u. a., 1993). Mit

diesem wird eine Korrelation zwischen den Daten der massenspektrometrischen

Analyse (Peptidmasse, Fragmentionenmuster) und denen aus der Proteindatenbank

theoretisch errechneten hergestellt, die Peptidsequenz ermittelt und somit das

Peptid/Protein identifiziert.

Die Identifizierung der Proteine anhand der massenspektrometrischen Analyse und die

Detektion von dynamischen Veränderungen des Proteinmusters im 2D-Gel unter

verschiedenen Bedingungen liefern Erkenntnisse über die Funktionalität der Proteine,

die zur Aufklärung biologischer Prozesse führen. Die Anpassungsreaktionen eines

Organismus spiegeln sich in der Dynamik der verhältnismäßigen und inhaltlichen

Zusammensetzung des Proteoms wider.

Die große Herausforderung in der Proteomforschung liegt in der enormen chemischen

Diversität und der divergenten Synthese der Proteine in der Zelle. Eine weitere

Schwierigkeit besteht in der dynamischen Bandbreite der Proteinmengenverteilung,

Page 13: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 13

die einen Faktor von 105-106 aufweist und somit weit außerhalb des Bereiches eines

2D-Gels avanciert (Rabilloud, 2002). Mit der Entwicklung Massenspektrometrie-

basierter, gelfreier Techniken, wie z. B. der GeLC-MS/MS, konnte der analytische

Bereich enorm vergrößert werden, so dass für S. aureus nahezu Dreiviertel und für

B. subtilis mehr als die Hälfte des vorhergesagten Proteoms detektiert und quantifiziert

werden konnten (Becher u. a., 2009, 2011).

Im Zuge des technologischen Fortschrittes hat sich auch die Proteomic

weiterentwickelt. Durch immer sensitivere und akkuratere Techniken konnten neue

Gebiete erschlossen werden, wie z. B. die der posttranslationalen Modifikationen, der

Protein-Protein-Interaktionen, der Proteinstabilitäten und der Strukturaufklärung

(Patterson & Aebersold, 2003).

Besonders die posttranslationalen Modifikationen (PTM) üben einen

bemerkenswerten Einfluss auf die Aktivität, Stabilität und Lokalisierung der Proteine

aus und beeinflussen somit regulatorische Prozesse (Pandey & Mann, 2000). Die

bedeutendsten PTMs stellen Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsereignisse

dar, denen eine Schlüsselrolle in regulatorischen Netzwerken und in der

Signaltransduktion zukommt (Casino u. a., 2010; Deutscher u. a., 2006; Hancock &

Perego, 2002; Hecker u. a., 2007). Durch den Einfluss der zusätzlich eingeführten

negativen Ladung oder Ladungen wird die Proteinstruktur in der Weise verändert, dass

dies eine Aktivierung, Inaktivierung oder Degradation des Enzyms zur Folge haben

kann (Johnson & Barford, 1993).

Zusätzlich beeinflusst sie die Möglichkeit von Protein-Protein-Interaktionen, als auch

die Proteinlokalisation selbst und stellt somit ein entscheidendes regulatorisches

Schaltwerkzeug der Zelle dar (Jers u. a., 2010; Mann & Jensen, 2003). Durch diese

Vielgestaltigkeit ist die Phosphorylierung ein wichtiges Werkzeug in verschiedenen

physiologischen Prozessen wie z. B. der Stressantwort, dem Glukosemetabolismus,

dem Zellwachstum, der Sporulation und der Biofilmbildung (Eymann u. a., 2007;

Hecker u. a., 2007; Iber u. a., 2006; Kiley & Stanley-Wall, 2010; Macek u. a., 2007;

Madec u. a., 2002). Außerdem konnte gezeigt werden, dass

Phosphorylierungsereignisse im Infektionsverlauf pathogener Mikroorganismen eine

wichtige Rolle spielen, wie z. B. bei der Adhäsion an die Wirtszelle, der Regulation von

Page 14: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

14

Pathogenitätsfaktoren oder der Beeinflussung der Wirtsabwehr (Chao u. a., 2010;

Schmidl u. a., 2010a,b; Sun u. a., 2012).

Bis heute sind Phosphorylierungen an neun verschiedenen Aminosäuren bekannt und

lassen sich in vier verschiedene Gruppen einteilen.

A) Die O-Phosphate (Phosphatester) entstehen durch die Phosphorylierung der

Hydroxylgruppe am Serin, Threonin und Tyrosin.

B) Die N-Phosphate (Phosphoamidate) werden durch die Phosphorylierung der

Aminogruppe von Arginin, Lysin und Histidin gebildet.

C) Die S-Phosphorylierungen bzw. Phosphatthioester werden durch die

Phosphorylierung der SH-Gruppe des Cysteins hervorgerufen und

D) die Acylphosphorylierung (Acylphosphat/gemischtes Anhydrid) entsteht durch die

Phosphorylierung der Carboxylgruppe der Asparaginsäure oder der Glutaminsäure

(Martensen, 1984; Matthews, 1995; Sickmann & Meyer, 2001).

Die unterschiedlichen Phosphorylierungen differieren nicht nur in dem jeweiligen

modifizierten Atom, sondern auch in der daraus resultierenden chemischen Stabilität.

Die Phosphatester verhalten sich unter sauren Bedingungen, die bei den üblichen

Probenaufbereitungsverfahren und Proteomanalysemethoden gebräuchlich sind,

stabil (Martensen, 1984). Im Gegensatz dazu stehen die Phosphoamidate, wie z. B. die

Argininphosphorylierungen, die unter neutralen Bedingungen stabil vorliegen, jedoch

unter zunehmendem sauren pH-Wert einer sauren Hydrolyse unterliegen. Sie

entziehen sich somit weitestgehend den normalen Standardanalysen (Sickmann &

Meyer, 2001).

Die erste Identifizierung eines Phosphats in einem Protein fand vor 106 Jahren statt

(Levene & Alsberg, 1906). 27 Jahre später, 1933, wurde die dazugehörige

phosphorylierte Aminosäure identifiziert (Lipmann & Levene, 1932). Es dauerte jedoch

weitere 21 Jahre, bis die erste enzymatische Proteinphosphorylierung gezeigt werden

konnte. Hierbei wurde in vitro eine Serinphosphorylierung am Casein durch Zugabe

von radioaktivem ATP und Zugabe einer aus dem Lebermitochondrium isolierten

Kinase ausgelöst und nachgewiesen (Burnett & Kennedy, 1954). 1955 konnte die erste

am Serin phosphorylierte Phosphorylase identifiziert werden, die unter Zugabe von

Muskelextrakt und ATP in eine aktive Form übergeht und Glycogen zu

Page 15: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 15

Glukose-1-Phosphat degradiert (Fischer & Krebs, 1955). Der umgekehrte

Mechanismus, die Inaktivierung durch Dephosphorylierung konnte ebenfalls gezeigt

werden (Sutherland & Wosilait, 1955). Hiermit wurde erstmals die Regulierung der

Enzymaktivität über einen Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsmechanismus

beschrieben. Edwin G. Fischer und Edmund H. Krebs erhielten: "for their discoveries

concerning reversible protein phosphorylation as a biological regulatory mechanism"

1992 den Nobelpreis für Physiologie bzw. Medizin.

Lange Zeit wurde angenommen, dass die Phosphatester sich auf das eukaryotische

Reich beschränken, da bis dato in Bakterien keine Serin-, Threonin- und Tyrosin-

Phosphorylierungen nachgewiesen werden konnten und in Eukaryoten 30 % aller

zellulären Proteine als phosphoryliert detektiert wurden (Pawson & Scott, 2005;

Ubersax & Ferrell, 2007). Es bestand die weitläufige Meinung, dass anstelle der

Phosphatester in der bakteriellen Signaltransduktion ausschließlich Phosphoamidate

bzw. Acylphosphate zur Anwendung kommen (Hoch, 2000; Mitrophanov & Groisman,

2008; Stock u. a., 1990). In den zur bakteriellen Signaltransduktion gehörenden

Zweikomponentensystemen findet eine Autophosphorylierung im Zuge der

Signalerkennung der Sensorkinase statt. Durch die Phosphatübertragung auf den

Responseregulator wird die zelluläre Antwort ausgelöst, indem z. B. durch DNA-

Bindung die Transkription bestimmter Gene reguliert wird (Stock u. a., 1990).

Diese Unterteilung der verschiedenen Phosphorylierungsarten auf die Eukaryoten und

Prokaryoten wurde im Laufe der Zeit mit der Entwicklung immer besserer Techniken

und optimierten Methoden grundlegend widerlegt.

1.2 Das bakterielle Phosphoproteom

Im Jahre 1979, 24 Jahre nach dem Auffinden der ersten enzymatischen

Phosphorylierungsreaktion, wurde das erste O-phosphorylierte bakterielle Enzym, die

Isocitratdehydrogenase von Escherichia coli, als Substrat einer Proteinkinase detektiert

(Garnak & Reeves, 1979). Garnak und Mitarbeiter beschrieben die in vivo

Phosphorylierung der Isocitratdehydrogenase während der Anpassung des Bakteriums

an die Nutzung von Acetat mittels radioaktivem Puls-Chase Experiment. Die für diese

Page 16: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

16

Reaktionen verantwortliche Kinase und Phosphatase wurde im Jahre 1985 von LaPorte

und Chung näher beschrieben (LaPorte & Chung, 1985). Diese Ergebnisse resultierten

in einem Umdenken in der bakteriellen Phosphoproteomforschung und in einer

vermehrten Analyse von Serin-, Threonin- und Tyrosin-Phosphorylierungsreaktionen.

1983 wurde ein weiteres wichtiges, am Serin phosphoryliertes bakterielles Protein

identifiziert, das Phosphattransportprotein Hpr des Phosphotransferasesystems von

Streptococcus pyogenes (Deutscher & Saier, 1983).

Die ersten globalen Untersuchungen zum bakteriellen Phosphoproteom entstanden

1986. Cortay und Mitarbeiter analysierten mittels radioaktiver 32P-Markierung in

Verbindung mit einem 2D-gel basierten Ansatz das Phosphoproteom von E. coli unter

verschiedenen Wachstumsbedingungen und Stressfaktoren (Cortay u. a., 1986). Sie

untersuchten die jeweils phosphorylierte Aminosäure und entdeckten die erste

bakterielle Phosphorylierung an einem Tyrosinrest. Die Ergebnisse beinhalteten jedoch

keine Identifizierung der phosphorylierten Proteine sowie keine Spezifizierung der

Phosphorylierungsstelle, so dass die phosphorylierten Proteine nur aufgrund ihrer

molekularen Masse und ihres isoelektrischen Punktes katalogisiert werden konnten

(Cortay u. a., 1986).

Durch den rasanten technologischen Fortschritt, besonders bei der

massenspektrometrischen Analyse von Proteinen und der Entwicklung eines phospho-

sensitiven Farbstoffes, konnten in 2D-gelbasierten Phosphoproteomuntersuchungen

die phosphorylierten Proteine identifiziert und die spezifische phosphorylierte

Aminosäure detektiert werden (Eymann u. a., 2007; Lévine u. a., 2006; Lomas-Lopez u.

a., 2007; Schmidl u. a., 2010a). 2004 wurde damit begonnen, gelfreie

Phosphoproteomanalysen durchzuführen, in denen Phosphopeptide aus einem

komplexen Peptidgemisch mit Hilfe von Kationenaustauschchromatographie und

Titandioxid angereichert und massenspektrometrisch analysiert wurden (Pinkse u. a.,

2004). Bis heute wurden mit dieser Methode zahlreiche bakterielle Phosphoproteome

katalogisiert, so z. B. für B. subtilis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Lactococcus lactis,

Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas spec.,

Streptococcus pneumoniae und Streptomyces (Lin u. a., 2009; Macek u. a., 2007, 2008;

Page 17: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 17

Manteca u. a., 2011; Misra u. a., 2011; Parker u. a., 2010; Prisic u. a., 2010;

Ravichandran u. a., 2009; Soufi u. a., 2008; Sun u. a., 2010).

1.2.1 Bakterielle Proteinkinasen

Eine wichtige Entdeckung gelang mit der Aufreinigung der ersten bakteriellen,

autophosphorylierenden Protein-Tyrosinkinase von Acinetobacter johnsonii durch

Antiphosphotyrosin-Immunochromatographie (Duclos u. a., 1996).

Im Laufe der Zeit konnten weitere bakterielle Kinasen, ihre Antagonisten die

Phosphatasen und ihre Substrate identifiziert und charakterisiert werden.

Aufgrund ihrer Ähnlichkeiten zu den eukaryotischen Kinasen und ihren

Substratspezifitäten werden die bakteriellen Kinasen in verschiedene Gruppen

eingeteilt. Eine Gruppe umfasst die Serin- und Threoninkinasen, die den

eukaryotischen Hanks-Kinasen ähneln. Die Hanks-Kinasen wurden durch Hanks und

Mitarbeiter nach ihren katalytischen Domänen, in denen 12 konservierte Subdomänen

auftreten, klassifiziert (Hanks u. a., 1988). Diese Subdomänen formen gemeinsam

durch spezielle Faltung den katalytischen Kern der Kinase (Hanks & Hunter, 1995). Die

erste bakterielle Hanks-ähnliche Kinase wurde in Myxococcus xanthus identifiziert

(Pkn1) (Muñoz-Dorado u. a., 1991). Später konnte gezeigt werden, dass das Bakterium

eine Kaskade von Hanks-ähnlichen Kinasen in Verbindung mit einem Prokaryoten

typischen His-Asp-Phosphorelay-System zur Regulation der Fruchtkörperbildung

einsetzt (Lux & Shi, 2005; Nariya & Inouye, 2005). Des Weiteren konnten für bakterielle

Hanks-ähnliche Kinasen auch "house-keeping"-Funktionen detektiert werden, darunter

z. B. Funktionen im Zellwandaufbau und im Zellzyklus (Kang u. a., 2005; Pietack u. a.,

2010; Shah u. a., 2008).

Hanks-ähnliche Kinasen wurden ebenfalls in humanpathogenen Bakterien identifiziert

und spielen dort oftmals eine wichtige Rolle in der bakteriellen Pathogenität/Virulenz

(Echenique u. a., 2004; Faucher u. a., 2008; Miller u. a., 2010). Ein bekanntes Beispiel

ist die sekretierte Kinase YpkA von Yersinia pestis. Diese beschädigt das Cytoskelett der

Wirtszelle und unterstützt durch einen bislang unbekannten Mechanismus die

Page 18: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

18

Replikation und das Überleben des Bakteriums (Galyov u. a., 1993; Juris u. a., 2000;

Wiley u. a., 2009; Yang u. a., 2011).

Ein Überblick über die bisher sequenzierten bakteriellen Genome zeigt, dass die Hanks-

ähnlichen Kinasen eine weite Verbreitung aufweisen, da nur sieben Genome keine

Hanks-ähnliche Kinase codieren (Mijakovic & Macek, 2012). In Bakterien zeigen sie

eine relative Unspezifität und phosphorylieren eine große Gruppe unterschiedlichster

Enzyme (Absalon u. a., 2009; Lomas-Lopez u. a., 2007; Pietack u. a., 2010).

Eine weitere wichtige Gruppe von bakteriellen Serin- und Threoninkinasen befasst sich

mit den Hanks-unähnlichen Kinasen, die keine Ähnlichkeit zu den eukaryotischen

Proteinkinasen aufweisen. Unter diesen befinden sich z. B. die Hpr-Kinase und

verschiedene Anti-Sigmafaktoren; letztere sind in der Regulation Stress bedingter

Antworten, wie z. B. der generellen Stressantwort oder Sporulation beteiligt (Carniol

u. a., 2004; Deutscher & Saier, 1983; Hecker u. a., 2007; Price u. a., 2001).

Bakterielle Proteintyrosinkinasen (PTKs/BY-Kinasen) unterscheiden sich von den

eukaryotischen durch ein ATP/GTP-Walkerbindemotif im aktiven Zentrum (Mijakovic u.

a., 2003). In Bezug auf die Zelllokalisation und Struktur wird zwischen PTKs von

Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien unterschieden. In Gram-negativen

Bakterien liegt die Kinase als Membran-spannendes Multidomänenprotein vor. In

Gram-positiven Bakterien besteht die Kinaseeinheit aus zwei getrennt vorliegenden

Proteinen. Das eine Protein ist in die Membran integriert und interagiert mit dem

zweiten cytosolisch vorliegenden Protein, das die Autophosphorylierungsdomäne

aufweist (Grangeasse u. a., 2007; Jadeau u. a., 2008; Mijakovic u. a., 2003; Niemeyer &

Becker, 2001). PTKs besitzen die Fähigkeit zur Autophosphorylierung und sind in

Verbindung mit den korrespondierenden Proteintyrosinphosphatasen an der

Regulation verschiedener Prozesse wie der kapsulären Polysaccharidsynthese,

Zellzykluskontrolle oder an der zellulären Lokalisation ihrer Proteintargets beteiligt

(Grangeasse u. a., 2007; Jers u. a., 2010; Petranovic u. a., 2007; Vincent u. a., 2000).

Kürzlich wurde die erste prokaryotische Argininkinase in B. subtilis identifiziert

(Fuhrmann u. a., 2009). Es wurde gezeigt, dass neben

Autophosphorylierungsreaktionen unter Hitzestress, der Repressor der

Hitzeschockantwort CtsR als Zielprotein der Kinase fungiert (Elsholz u. a., 2010;

Page 19: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 19

Fuhrmann u. a., 2009) und dass Argininphosphorylierungsreaktionen in Verbindung mit

der Dephosphorylierung durch eine Argininphosphatase einen sensitiven

Regulationsmechanismus in B. subtilis darstellen und somit eine bedeutende

physiologische Relevanz besitzen können (Elsholz u. a., 2012).

1.2.2 Bakterielle Proteinphosphatasen

Die Proteinphosphatasen stellen die Antagonisten der Proteinkinasen dar. Sie werden

in vier verschiedene Hauptklassen eingeteilt, in die konventionellen

Proteinphosphatasen PTPs ("protein tyrosine phosphatases"), die PPP

("phosphoprotein phosphatases"), die PPM ("metal-dependent phosphatases") und

die LMWPTP ("low molecular weight protein-tyrosine phosphatases") und zeigen eine

starke Ähnlichkeit zu den aus Eukaryoten bekannten Phosphatasen (Kennelly & Potts,

1999; Kennelly, 2002). Innerhalb der PPM-Phosphatasen bilden die PP2C-

Phosphatasen ("protein phosphatase 2C-family") die größte Gruppe. Ihr

charakteristisches Merkmal sind 11 konservierte Motive und eine Mg2+- oder Mn2+-

abhängige Phosphataseaktivität an Phosphoserin- und Phosphothreoninresten (Bork u.

a., 1996; Das u. a., 1996). Vertreter dieser Phosphatasen finden sich z. B. in dem

Regulationsmechanismus der generellen Stressantwort von B. subtilis (Yang u. a.,

1996) sowie in der Kontrolle des Phosphorylierungsstatus des Enzyms HPr

("phosphocarrier protein") in Mycoplasma pneumoniae (Halbedel u. a., 2006) und in

der Regulation des Sporulationsgeschehens (Arigoni u. a., 1996).

Die Vertreter der PPP-Familie zeichnen sich durch drei konservierte Aminosäuremotive

aus (Barton u. a., 1994). In E. coli wurde für zwei PPP-Phophatasen Funktionen in der

Weiterleitung von durch fehlgefaltete Proteine hervorgerufenen Stresssignalen

beschrieben (Missiakas & Raina, 1997).

Die bakteriellen Proteintyrosinphosphatasen werden in zwei verschiedene Klassen

eingeordnet. In der ersten Klasse sind die konventionellen PTP und die "dual-specific

protein phosphatases" (DSPs) zusammengefasst, letztere verfügen über eine

Serin/Threonin- und Tyrosinspezifität (Shi u. a., 1998). Die konventionellen PTPs

Page 20: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

20

spielen bei der Wirtsinfektion durch pathogene Bakterien eine entscheidende Rolle

(Black & Bliska, 1997; Kaniga u. a., 1996).

In die zweite Klasse werden die "Low-molecular-weight protein tyrosine phosphatases"

(LMPTPs) eingeordnet (Musumeci u. a., 2005). Die LMPTPs Gram-negativen Bakterien

sind z. B. an der Kontrolle der kapsulären Exopolysaccharidsynthese beteiligt (Preneta

u. a., 2002; Vincent u. a., 1999, 2000).

Eine weitere Gruppe der Phosphatasen wurde vor kurzem beschrieben, von der erst

ein Vertreter im Reich der Bakterien identifiziert werden konnte. Hierbei handelt es

sich um die Phosphatase YwlE von B. subtilis, bei der es sich nicht, wie vormals

dargestellt, ausschließlich um eine Tyrosinphosphatase handelt (Kirstein u. a., 2005),

sondern um eine Argininphosphatase (Elsholz u. a., 2012).

Im Laufe der Jahre erfolgte lawinenartig die Erforschung des bakteriellen Serin-,

Threonin- und Tyrosin-Phosphoproteoms sowie der Hauptakteure, der Kinasen und

Phosphatasen. Es wurde deutlich, dass die physiologische Bedeutung von

Proteinphosphorylierungen in Bakterien sehr vielgestaltig ist.

1.2.3 Bacillus subtilis

Das im Boden lebende, sporenbildende und stäbchenförmige Bakterium B. subtilis

stellt einen apathogenen Modellorganismus für Gram-positive Bakterien dar. Es wurde

erstmals 1835 von Christian Gottfried Ehrenberg als Vibrio subtilis beschrieben und

1875 von Ferdinand Cohn in Bacillus subtilis umbenannt (Cohn, 1872; Ehrenberg,

1835).

1997 wurde die vollständige Genomsequenz von Kunst und Mitarbeitern veröffentlicht

(Kunst u. a., 1997) und 2009 von Barbe u. a. resequenziert und überarbeitet (Barbe u.

a., 2009).

Die Lebensbedingungen von B. subtilis sind dem ständigen Wandel von

Nährstoffbedingungen, Osmolarität, Sauerstoffgehalt und dem Klima des Lebensraums

unterworfen. Um unter diesen sich dauernd wechselnden Habitats-Bedingungen ihr

Überleben sichern zu können, besitzen die Bakterien ein komplexes Netzwerk von

Adaptionsmechanismen (Hecker & Babel, 1988). B. subtilis ist befähigt, in resistenten

Page 21: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 21

Dauerformen, den Sporen, selbst den unwirtlichsten Situationen trotzen zu können

(Yudkin, 1993). Da die Sporenbildung jedoch ein sehr aufwändiger Prozess ist,

"versucht" das Bakterium diese durch andere Mechanismen, wie z. B.: Produktion von

Exoenzymen zur Erschließung alternativer C-Quellen, C-Katabolitenrepression,

"stringent response" und durch die generelle Stressantwort, zu umgehen (Hecker &

Völker, 2004). Besonders die Fähigkeit zur Exoenzymsynthese und Enzymsekretion

lässt dem Bakterium als Produzent in der biotechnologischen Anwendung eine große

Bedeutung zukommen. Diese Mechanismen werden biotechnologisch genutzt, um

verschiedenste Enzyme zu produzieren, darunter z. B. alkalische Proteasen für die

Waschmittelherstellung oder Amylasen für die Stärkeindustrie (Westers u. a., 2004).

Die Phosphorylierung als regulatorisches Element wurde in B. subtilis erstmals bei

Hpr/PtsH im PTS-System und der Regulation der Aktivität der Sigmafaktoren B und F in

den Vordergrund gerückt (Alper u. a., 1994; Eisermann u. a., 1988; Garsin u. a., 1998;

Price u. a., 2001; Reizer u. a., 1989; Stülke & Hillen, 2000). Später konnten

Tyrosinphosphorylierungen bei der UDP-Glukose-Dehydrogenase und bei

Einzelstrangebindeproteinen detektiert werden, die auf eine wichtige Rolle dieser

Modifikation in der Exopolysaccharidsynthese und in der Transkription schließen

lassen (Mijakovic u. a., 2003, 2006; Vujaklija & Macek, 2012).

Bisher konnten in B. subtilis zwei Hanks-ähnliche Kinasen charakterisiert werden (PrkC

und PrkD). PrkC, die mit der PP2C-ähnlichen Phosphatase PrpC cotranskribiert wird,

weist 10 der 12 katalytischen Subdomänen auf (Madec u. a., 2002; Obuchowski u. a.,

2000). Anhand der evolutionsähnlichen Entwicklung der Charakterisierung dieser

Kinase lässt sich die technische Revolution, die in der letzten Dekade stattgefunden

hat, erkennen (siehe Tabelle 1).

Aus der Tabelle wird ersichtlich, dass die Funktion der PrkC Kinase sehr vielgestaltig ist,

ebenso wie die angewandten Untersuchungsmethoden. Der Kinase werden Aufgaben

in der stationären Phase, in der Sporen- und Biofilmausbildung, in der

Phosphorylierung von Substraten des Metabolismus sowie dem "sensing" von

Muropeptiden zugesprochen (Referenzen siehe Tabelle 1).

Page 22: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

22

Tabelle 1: Aufstellung der bisher publizierten Ergebnisse für die Kinase PrkC und den zur Untersuchung verwendeten Methoden.

Erkenntnisse über PrkC Methode Referenz

2000: - Substrat der Phosphatase PrpC

Autophosphorylierung der aufgereinigten Kinase mit radioaktivem 32P-ATP --> Dephosphorylierungsreaktion mit PrpC

(Obuchowski u. a., 2000)

2002: - wichtige Rolle in der stationären Phase - ElongationsfaktorG als Substrat

Deletionsmutanten Analyse, Betagalaktosidase-Assay, Western Blot , Immunopräzipitation, Kinase-Assay, Massenspektrometrie

(Gaidenko u. a., 2002)

2002: - Dimerbildung - Autophosphorylierung - Phosphorylierung von MBP an Threonin - Funktion in der Sporen-ausbildung u. Biofilmproduktion

Mutantenanalyse, Dimerisationstests, RNA-Analysen und RT-PCR, Western-Immuno-Blot-Analyse, Kinase-Assay, Phosphoaminosäure-Analyse mit radioaktivem 32P, Sporulation und Biofilm Assays

(Madec u. a., 2002)

2003: - 7 phosphorylierte Threoninreste und ein phosphorylierter Serinrest durch Autophosphorylierung - erstes Strukturmodell

Mutagenesis, in vitro Protein Kinase Assay, LC-MS/MS, 3D-Modelierung

(Madec u. a., 2003)

2005: - Operon- und Promoterstruktur

Genetische Analysen (Iwanicki u. a., 2005)

2009: - Substrate: CpgA, EF-Tu, YezB

Mutantenanalyse, Kinase-Assay, Phosphoaminosäure-Analyse, 32P-Markierung, 2D-Gel, MS-Analyse

(Absalon u. a., 2009)

2010: - Substrate im Metabolismus

MS-Analyse (Pietack u. a., 2010)

2010: - Konformationsstudien Strukturmodelierung (Gruszczyński u. a., 2010)

2011: - Röntgenstruktur Röntgenstrukturanalyse (Ruggiero u. a., 2011)

2011: - "Sensing" von Muropeptiden

NMR-Analyse, Proteinmutagenese (Squeglia u. a., 2011)

2012: - Subtrat: CpgA in vitro Phosphorylierungs-Assay mit radioaktivem Phosphat

(Pompeo u. a., 2012)

In B. subtilis wurden ebenfalls Hanks-unähnliche Ser/Thr-Kinasen beschrieben. Eine

große Gruppe bilden die Kinasen und Phosphatasen der Regulationsysteme

verschiedener Sigmafaktoren. Hierbei lösen Phosphorylierungs- und

Dephosphorylierungsgeschehnisse Partner-Switching-Reaktionen aus, die wiederum

zur Aktivität oder Inaktivierung des Sigmafaktors führen (Carniol u. a., 2004; Hecker

u. a., 2007; Price u. a., 2001). Die Hpr-Kinase des Phosphotransferasesystems stellt

Page 23: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 23

ebenfalls eine Hanks-untypische Kinase dar. Die Phosphorylierung des Hpr-Proteins am

Ser-46 ist die Voraussetzung für die Interaktion mit CcpA dem globalen Regulator der

C-Katabolitenrepression und somit der DNA-Bindungsaffinität des Proteins an die

"catabolite-responsive-elements" cre (Fujita, 2009; Fujita u. a., 1995).

Die Proteintyrosinkinase PtkA von B. subtilis phosphoryliert zwei unterschiedliche

Klassen von Enzymen, die UDP-Glukose-Dehydrogenasen und die DNA-

Einzelstrangbindeproteine und besitzt somit eine wichtige Funktion in der

Zellzykluskontrolle und in der DNA-Replikation (Mijakovic u. a., 2003, 2006; Petranovic

u. a., 2007). Des Weiteren konnte der PtkA und der entsprechenden Phosphatase PtpZ

eine Rolle in Biofilmbildung nachgewiesen werden (Kiley & Stanley-Wall, 2010).

Zusätzlich wurde gezeigt, dass PtkA für die zelluläre Lokalisation ihrer Zielproteine

bedeutend ist (Jers u. a., 2010).

Erst vor kurzem wurde die erste prokaryotische Argininkinase in B. subtilis identifiziert.

In einem in vitro-Assay konnten Phosphorylierungsstellen am Arginin synthetischer

Peptide nachgewiesen werden (Fuhrmann u. a., 2009).

Die erste globale Phosphoproteomanalyse von B. subtilis publizierten Levine und

Mitarbeiter im Jahre 2006 (Lévine u. a., 2006). In dieser Studie wurde das

Phosphoproteom von B. subtilis 2D-gelbasiert mit Hilfe der radioaktiven 32P-Markierung analysiert. Sie detektierten 65 32P-markierte Spots aus dem

Proteinextrakt von Bakterien, die sich in der frühen stationären Phase befanden. 29

konnten mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert werden. Sechs zusätzliche

Spots konnten mithilfe der Pro-Q-Färbung detektiert werden. Eine Spezifizierung der

Phosphorylierungsstellen wurde nicht unternommen. Des Weiteren wurde der Einfluss

verschiedener Stressfaktoren auf das Phosphoproteom von sich in der stationären

Phase befindlichen Zellen untersucht und eine Dynamik des Phosphoproteoms

festgestellt. Ein Vergleich mit dem Phosphoproteom von Zellen aus der exponentiellen

Wachstumsphase blieb jedoch aus.

Im Jahre 2007 wurde der erste globale gelfreie Phosphoproteomansatz von Macek und

Mitarbeiter durchgeführt. Unter Verwendung der Kationenaustauschchromatographie

und einer auf Titandioxid basierenden Anreicherung konnten 78

Phosphorylierungsstellen identifiziert werden (Macek u. a., 2007). 2010 wurden in

Page 24: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

24

einem gelfreien Quantifizierungsansatz 27 Phosphopeptide unter verschiedenen

Wachstumsbedingungen quantifiziert (Soufi u. a., 2010).

1.2.4 Mycoplasma pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae ist ein humanpathogenes Bakterium, das als

Hauptverursacher der atypischen Pneumonie sowie chronischen Erkrankungen wie

z. B. Asthma und Arthritis bekannt ist (Atkinson u. a., 2008). Es wird aufgrund seiner

Zellwandlosigkeit in die Klasse der Mollicutes eingeordnet. 1944 wurde es von Eaton

erstmals isoliert und im Folgenden "eaton agent" genannt (Eaton u. a., 1944). 1962

gelang es Chanock und Mitarbeitern das Bakterium in Zellkultur zu züchten und es als

Mycoplasma zu identifizieren (Chanock u. a., 1962). Weitere bedeutende

Charakteristika des Bakteriums sind die kleine Genomgröße und die geringe Anzahl

von vorhergesagten Proteinen (< 700) (Catrein & Herrmann, 2011). Die Mollicuten sind

zudem die kleinsten, sich selbst replizierenden lebenden Organismen und stellen somit

optimale Modelle für pathogene Minimalorganismen dar, da die Größe des Genoms

das Vorhandensein komplexer Regulationssysteme minimiert. Es fehlen z. B. die

Enzyme des Tricarbonsäurezyklus und mehrere Enzyme des Pentosephosphatwegs

(Halbedel u. a., 2007). Stresseinwirkungen und sich dauernd ändernde

Umweltbedingungen stellen das Bakterium vor große Herausforderungen, die, um

überleben zu können, vom Organismus gemeistert werden müssen.

In Organismen, die nur ein minimales Repertoire an Regulationssystemen aufweisen,

könnte der Mechanismus der Phosphorylierung/Dephosphorylierung ein

entscheidendes regulatorisches Werkzeug darstellen. Als erstes wurde die

Phosphorylierung des HPr-Proteins beschrieben (Halbedel & Stülke, 2005). Des

Weiteren konnten mehrere Adhäsionsproteine als phosphoryliert identifiziert werden

(Dirksen u. a., 1994; Krebes u. a., 1995).

Su und Mitarbeiter veröffentlichten 2007 erste Studien zum Phosphoproteom von

M. pneumoniae und M. genitalium, mit dem Ergebnis, dass 18 Phosphoproteine

mithilfe des 2D-gelbasierten Ansatzes, der Pro-Q-Färbung und der radioaktiven 33P-Markierung für M. pneumoniae identifiziert werden konnten. Es wurde die

Page 25: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 25

Hypothese aufgestellt, dass Phosphorylierungsgeschehnisse einen Einfluss auf die

Zytoskelett-ähnliche Struktur ausüben und an der Regulation der Adhäsion an die

Wirtszelle beteiligt sind (Su u. a., 2007).

Diese Hypothese und das Interesse an regulatorischen Ereignissen führten Sebastian

Schmidl (Universität Göttingen) zu weitergehenden Untersuchungen bezüglich des

Phosphoproteoms, des kompletten Kinoms und der Proteine des Adhäsionsapparates

von M. pneumoniae. Hierbei entstand in Kooperation mit dem Institut für

Mikrobiologie der EMAU Greifswald die Arbeiten "The phosphoproteome of the

minimal bacterium Mycoplasma pneumoniae " (Schmidl u. a., 2010a) und "The stability

of cytadherence proteins in Mycoplasma pneumoniae requires activity of the protein

kinase PrkC" (Schmidl u. a., 2010b).

In diesen Studien, in denen die gelbasierten Untersuchungen und

massenspektrometrischen Analysen im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden,

konnten 63 phosphorylierte Proteine und 16 Phosphorylierungsstellen von

M. pneumoniae identifiziert werden. Außerdem konnte in einer 2D-Gel basierten

Mutantenanalyse der zwei bekannten Kinasen (HprK/PrkC) und der

Phosphatasemutante (PrpC) festgestellt werden, dass das Protein HPr das Zielprotein

der HprK (Kinase) darstellt und die Kinase PrkC für die Phosphorylierung von vier

Proteinen (den Zelladhäsionsproteinen HMW3 und P41, dem Zelloberflächenprotein

MPN474, dem uncharakterisierten MPN 256 Protein) verantwortlich ist. Fortführend

wurde gezeigt, dass PrkC zusätzlich die Zelladhäsionsproteine P1 und HMW1

phosphoryliert. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde geschlussfolgert, dass PrkC für die

Zelladhäsion essentiell ist, um den Adhäsionskomplex zu stabilisieren und somit einen

wichtigen Virulenzfaktor darstellt. Mit diesen beiden Studien, die auf der optimierten

2D-Gel- und Pro-Q-basierten Phosphoproteommethode und auf akkuraten und

sensitiven massenspektrometrischen Analysen (die beide im Rahmen dieser Arbeit

durchgeführt wurden) basierten, konnte gezeigt werden, dass eine Verbindung

zwischen Phosphorylierungsereignissen und Virulenz besteht und dass das Werkzeug

der Phosphorylierung komplexe Regulationssysteme in Minimalorganismen

kompensieren kann.

Page 26: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

26

In einer kürzlich erschienenen Studie von Van Noort und Mitarbeitern, in der die

Wechselwirkungen von Phosphorylierungs- und Acetylierungsereignissen analysiert

wurden, konnten in einem SCX-basierten gelfreien Ansatz 93 Phosphorylierungsstellen

in 72 Proteinen von M. pneumoniae identifiziert werden (van Noort u. a., 2012). Von

den phosphorylierten Proteinen wurden 30 schon vormals gelbasiert durch die

Detektion mit dem Pro-Q Diamond Farbstoff von Schmidl und Mitarbeitern

identifiziert, wobei 4 gemeinsame Phosphorylierungsstellen gefunden wurden

(Schmidl u. a., 2010a). Die gelfreien Identifizierungen phosphorylierter Proteine durch

van Noort u. a. validieren somit die durch den Pro-Q-Farbstoff detektierten

phosphorylierten Proteine. Darüber hinaus konnte der Einfluss der pknB-Deletions-

Mutante (PknB = PrkC = MPN248) auf die Zytoadhärenzproteine bestätigt werden. Es

wurden 12 Proteine beschrieben, auf die die pknB-Mutation einen negativen Einfluss

zeigte, darunter 8 Proteine, die von Schmidl u. a. schon vormals in diesem

Zusammenhang beschrieben wurden. Ferner wurden quantitative Analysen von zwei

Kinase- und einer Phosphatasemutante durchgeführt, mit dem Ergebnis, dass 76,1 %

der quantifizierbaren Phosphorylierungsstellen durch eine der beiden Kinasen

beeinflusst werden. Für die restlichen Nichtbetroffenen 23,9 % werden drei mögliche

Gründe für das Phosphorylierungsereignis vorgeschlagen:

a) es findet eine Kompensation durch die jeweils andere Kinase statt,

b) es finden Kinase-unabhängige Autophosphorylierungsreaktionen statt oder

c) sie stellen metabolische Intermediate dar (van Noort u. a., 2012).

Dieses steht im Gegensatz zu den Kinase-Untersuchungen von Schmidl u. a., in denen

nur fünf phosphorylierte Proteine (von 63 untersuchten) als Substrat detektiert

werden konnten (Schmidl u. a., 2010a).

1.2.5 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus wurde 1881 von Alexander Ogston entdeckt und aufgrund der

Traubenform Staphylokokken genannt. Anton J.F. Rosenbach konnte es 1884 erstmals

isolieren. Es handelt sich hierbei um ein unbewegliches, kugelförmiges,

koagulasepositives, Gram-positives und fakultativ anaerobes Bakterium (Le Loir u. a.,

Page 27: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 27

2003), welches aufgrund seiner goldgelben Farbe den Namen aureus verliehen

bekommen hat. S. aureus kommt als humanpathogener, opportunistischer

Krankheitserreger auf der Haut und in Schleimhäuten vor (Harris u. a., 2002; Kloos &

Lambe, 1991). Er ist zu einem bedeutenden und gefürchteten Krankenhauskeim

avanciert und ist der Auslöser vieler unterschiedlicher invasiver, systemischer

Erkrankungen wie Osteomyelitis, Pneumonie, Endokarditis oder Sepsis

(zusammengefasst in Musher & McKenzie, 1977). Des Weiteren ruft er

toxinvermittelte Erkrankungen (Toxinosen), wie das "Staphylococcal-Scaled-Skin-

Syndrom" (SSSS), das Toxische Schocksyndrom (TSS) sowie Nahrungs-

mittelvergiftungen hervor und ist Verursacher von Wundinfektionen und Abszessen

(Le Loir u. a., 2003; Musser u. a., 1990).

In der heutigen Zeit der vermehrt auftretenden Multiresistenzen zählt Staphylococcus

aureus als humanpathogener Keim zu den gefürchtesten bakteriellen nosokomialen

Erregern. Hochrechnungen des Robert-Koch-Instituts ergaben für das Jahr 2008 eine

MRSA-Last (Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus) von 132000 Fällen in

Deutschland (http://www.rki.de/cln_117/nn_504504/DE/Content/Infekt/EpidBull/

Archiv/2010/36__10,templateId=raw,property=publicationFile.pdf/36_10.pdf).

Zur Eindämmung dieser beträchtlich angestiegenen Gefahr besteht ein erhöhter

Bedarf an Aufklärung, insbesondere im Hinblick auf den Infektionsprozess, dessen

Regulation und der beteiligten Enzyme.

Bisher ist relativ wenig über das Phosphoproteom und die regulatorischen Einflüsse

der Phosphorylierungsreaktionen von S. aureus bekannt.

S. aureus besitzt eine Hanks-ähnliche MAP-Kinase (PknB, bzw. Stk1), deren Gen mit

dem Gen der Phosphatase Stp cotranskribiert wird (Beltramini u. a., 2009;

Débarbouillé u. a., 2009; Miller u. a., 2010). Verschiedene Aufgaben werden für die

Kinase beschrieben, darunter eine Rolle in der Zellwandarchitektur und damit in der

Regulierung der antimikrobiotischen Resistenz (Beltramini u. a., 2009; Tamber u. a.,

2010) sowie eine Aufgabe in der Regulation der Hämolysin Expression (Burnside u. a.,

2010). Des Weiteren wird durch die Kontrolle des Phosphorylierungslevels ein Einfluss

auf die Pathogenität und somit auf das Überleben im Wirt ausübt (Débarbouillé u. a.,

2009). Neun glykolytische Enzyme konnten als Substrate identifiziert werden (Lomas-

Page 28: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

28

Lopez u. a., 2007). Als weiteres Substrat, das über den Phosphorylierungsstatus

reguliert wird, wurde PurA identifiziert und PknB somit eine Rolle in der

Purinbiosynthese zugewiesen. Zusätzlich konnten Funktionen in der Autolyse und in

zentral metabolischen Prozessen festgestellt werden (Donat u. a., 2009). Ferner übt

PknB einen Einfluss auf die Antibiotikaresistenz durch die Regulation der Expression

der von dem globalen Regulator MgrA kontrollierten "multidrug-efflux pumps" NorA

und NorB aus (Truong-Bolduc & Hooper, 2010). Die Pathogenität des Organismus wird

aufgrund der Phosphorylierung des Virulenzregulators SarA ebenfalls beeinflusst

(Didier u. a., 2010). Kürzlich wurde von Rakette und Mitarbeitern die Struktur der

Kinase aufgeklärt und eine erste Basisidee für den funktionellen Mechanismus

beschrieben (Rakette u. a., 2012). Neuerdings konnte in in vitro Ansätzen eine durch

die Kinase PknB (Stk1) vermittelte Cysteinphosphorylierung nachgewiesen werden, die

einen positiven Einfluss auf die Antibiotikaresistenz gegenüber Vancomycin und auf die

Produktion von Virulenz bestimmenden Faktoren ausüben soll (Sun u. a., 2012).

2007 wurde eine globale 2D-gelbasierte Phosphoproteomstudie von Lomas-Lopez und

Mitarbeitern durchgeführt (Lomas-Lopez u. a., 2007). Die Detektion der

phosphorylierten Proteine erfolgte über eine radioaktive 32P-Markierung. Insgesamt

konnten 11 verschiedene Phosphoproteine, der Hauptteil davon glykolytische,

identifiziert werden. Eine Spezifizierung der genauen Phosphorylierungsstellen fand

nicht statt, jedoch konnte für den Großteil der identifizierten phosphorylierten

Proteine in vitro eine Phosphorylierung durch PknB gezeigt werden.

1.3 Methoden zur Analyse des bakteriellen Phosphoproteoms

Die besonderen Eigenschaften der Proteinphosphorylierung beruhen auf der geringen

Abundanz der phosphorylierten Proteine, auf den verschiedenen chemischen

Eigenschaften und auf dem großen dynamischen Bereich, in dem sie anzutreffen sind.

Diese Charakteristika bedeuten bei der Analyse eine große technische

Herausforderung und bedingen ein weitgefächertes Methodenarsenal, da jede

einzelne Methode nur einen begrenzten dynamischen Bereich aufweist (Mann u. a.,

2002).

Page 29: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 29

Das grundlegende Prinzip der Analyse von phosphorylierten Proteinen/Peptiden

beruht auf deren Trennung von den in hoher Anzahl vorliegenden Nicht-

phosphorylierten Proteinen/Peptiden. Verschiedenste Methoden sind bis heute

entwickelt worden. Die gebräuchlichsten Techniken dieser Zeit zur Untersuchung von

Phosphoproteomen wurden in der Tabelle 2 zusammengestellt.

Hierbei wird zwischen den Methoden zur Untersuchung von phosphorylierten

Proteinen oder Phosphopeptiden und den gelbasierten oder gelfreien Methoden

unterschieden. Die intelligente Kopplung von Vorfraktionierungs-, Anreicherungs- und

Detektionsmethoden garantiert den Erfolg bei der Analyse des Phosphoproteoms.

Tabelle 2: Zusammenfassung der gebräuchlichsten Methoden zur Untersuchung bakterieller Phosphoproteome.

Proteine Peptide

Methode: gelbasiert gelfrei gelfrei

Vorfraktionierung: 1D-Gel/2D-Gel SCX-/HILIC-Chromatogr.

Anreicherung:

Immunopräzipi-tation

Calciumphosphat-präzipitation Phosphoamidat-Chemie (PAC) chem. Modifizierung

TiO2-/ZrO2- Phosphopeptid-anreicherung

Detektion:

Pro-Q Diamond 32/33P-Detektion Phospho-Antikörper

Identifizierung: Massenspektrometrische Analyse: MALDI-TOF-MS, LC-ESI-MS/MS

Massenspektrometrische Analyse: LC-ESI-MS/MS

Quantifizierung: Relative Quantifizierung über Signalintensitäten

über SILAC-, iTRAQ-, Dimethyl-, 14N/15N-metabolische Markierung

1.3.1 Gelbasierte Techniken zur Analyse des Phosphoproteoms

Die gelbasierten Methoden beruhen auf dem Prinzip der ein- oder zweidimensionalen

Gelelektrophorese. Mit der 2D-Gel-Methode werden ca. 40 % der vorhergesagten

Page 30: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

30

Proteine eines bakteriellen Organismus visualisiert, darunter viele Proteine der

metabolischen Stoffwechselwege und vieler anderer zellulärer Komponenten (Hecker

u. a., 2008). Die große Stärke dieser Methode liegt in der Auftrennung verschiedener

Proteinisoformen, die durch nachträgliche Prozessierung oder durch posttranslationale

Modifikationen, wie z. B. Phosphorylierungen entstehen. Diese Trennung von

Proteinisoformen lässt sich fast ausschließlich mit der 2D-Gelelektrophorese erreichen.

Der 2D-gelbasierte Ansatz bietet mehrere Möglichkeiten zur Analyse des

Phosphoproteoms. Zum einen wird eine Auftrennung der phosphorylierten Proteine

und der unphosphorylierten Spezies voneinander gewährleistet, so dass es möglich

wird, diese aus dem Gel zu separieren und massenspektrometrisch zu identifizieren.

Zum anderen eignet sich dieser Ansatz um herauszufinden, welche regulatorische

Bedeutung und Aufgabe den identifizierten Phosphoproteinen zukommt. Ein Vergleich

des Phosphoproteoms ist unter verschiedenen Wachstumsbedingungen möglich, so

dass Veränderungen im Proteommuster sehr schnell aufgespürt und die

verantwortlichen Enzyme und Regulatoren der anpassenden Zellantwort identifiziert

werden können (Eymann u. a., 2007).

Die 2D-Gelelektrophorese, die von Klose und O´Farrell 1975 unabhängig voneinander

entwickelt wurde, beruht auf der Auftrennung der Proteine nach dem isoelektrischen

Punkt in der horizontalen Ebene (1. Dimension: Isoelektrische Fokussierung) und dem

Molekulargewicht in der vertikalen Ebene (2. Dimension) (Klose, 1975; O’Farrell, 1975).

Die isoelektrische Fokussierung erfolgt in IPG-Gelstreifen (Bjellqvist u. a., 1982), die aus

einem immobilisierten in Polyacrylamid eingebetteten pH-Gradienten bestehen, an

denen ein elektrisches Feld angelegt wird. Die Proteine wandern dann aufgrund ihrer

Eigenladung an die Stelle im IPG-Streifen, an der ihre Nettoladung gleich 0 ist. Dies

entspricht dem isoelektrischen Punkt des Proteins. In der 2. Dimension werden die

durch die Äquilibrierung entfalteten und mit dem negativen Detergenz (SDS)

beladenen Proteine gemäß ihrer Masse im Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Beladung

der Proteine mit negativen Ladungsträgern maskiert deren Eigenladung, so dass die

Trennung nur hinsichtlich der molekularen Größe erfolgt. Hierbei wandern die

Proteine aufgrund der negativen Ladungen im elektrischen Feld zur Anode. Die

kleineren Proteine wandern schneller als die durch die Gelmatrix behinderten

größeren Proteine. Durch einen anschließenden Fixierungsschritt werden die Proteine

Page 31: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 31

im Gel denaturiert/präzipitiert und somit deren weitere Diffusion verhindert

(zusammengefasst in Rabilloud & Lelong, 2011; Rabilloud u. a., 2010).

Durch verschiedene Markierungs- und Färbemethoden werden die Proteine im Gel

visualisiert und können durch einen Scanvorgang digitalisiert werden. Die

digitalisierten Bilder können mithilfe von computergestützter Auswertetechnik (z. B.

Decodon Delta2D, Greifswald) analysiert und quantifiziert werden.

Die Detektion der phosphorylierten Proteine erfolgt größtenteils anhand drei

verschiedener Techniken. Zum einen ist es durch eine in der Zellkultur vorangegangene

radioaktive 32/33P-Markierung oder durch eine in vitro Kinase-Reaktion unter Gebrauch

von 32P markiertem gamma-ATP möglich, die radioaktiv markierten Phosphoproteine

in einem Autoradiogramm sichtbar zu machen (Bendt u. a., 2003; Eymann u. a., 2007;

Grangeasse u. a., 2003; Lévine u. a., 2006).

Zum anderen kommen gegen die phosphorylierte Aminosäure gerichtete Antikörper

bei 1D- oder 2D-Westernblotanalysen zum Einsatz (Bendt u. a., 2003; Mijakovic u. a.,

2003; Soung u. a., 2009).

Des Weiteren kann zur Detektion von phosphorylierten Proteinen ein

phosphosensitiver Farbstoff (Pro-Q® Diamond, life technologies™) verwendet werden

(Steinberg u. a., 2003). Mit der Entwicklung dieses phosphosensitiven

Fluoreszenzfarbstoffes (im Folgenden Pro-Q genannt) und dessen

massenspektrometrische Kompatibilität wurde dem Experimentator nicht nur die

Möglichkeit der Detektion von phosphorylierten Proteinen, sondern auch die

Möglichkeit der massenspektrometrischen Identifizierung der spezifischen

Phosphorylierungsstelle gegeben (Martin u. a., 2003a, 2003b; Steinberg u. a., 2003).

Zusätzlich kann ein quantitativer Vergleich zwischen Phosphoproteomen

unterschiedlicher physiologischer Bedingungen und somit eine funktionelle

Einordnung der Phosphoproteine vorgenommen werden (Schulenberg u. a., 2004).

Die Identifikation der Phosphoproteine erfolgt häufig über ESI-LC-MS/MS-Analysen.

Hierfür wird der zu analysierende phosphorylierte Proteinspot aus dem Gel

ausgeschnitten und mit Trypsin oder einer anderen Protease verdaut. Nach der Elution

der Peptide aus dem Gelstück werden die Peptide mithilfe der

Umkehrphasenchromatographie vorfraktioniert und online massenspektrometrisch

Page 32: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

32

analysiert (Eymann u. a., 2007). Trotz der geringen Proteinausgangsmenge ist eine

Identifizierung des Phosphoproteins und oft auch der spezifischen phosphorylierten

Aminosäure möglich.

1.3.2 Gelfreie Techniken zur Analyse des Phosphoproteoms

Die gelfreie Analyse des Phosphoproteoms erfolgt größtenteils auf Peptidebene. Das

vorherrschende Ziel ist die Identifizierung der phosphorylierten Peptide, einschließlich

der phosphorylierten Aminosäuren. Um diese zu verbessern, ist eine Anreicherung der

phosphorylierten Peptide aus den in einem großen Überschuss vorliegenden nicht-

phosphorylierten Peptiden notwendig. Zahlreiche Anreicherungstechniken basieren

auf der koordinativen Bindung der Phosphatgruppen an dreiwertige Metallionen

(IMAC = "Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography"). Hierbei finden

Metallionen wie Ga3+, Fe3+, Ti4+ und Zr4+ eine vermehrte Anwendung (Andersson &

Porath, 1986; Steen u. a., 2007; Feng u. a., 2007; Zhou u. a., 2008). Der IMAC-Ansatz

eignet sich im Besonderen bei mehrfach-phosphorylierten Peptiden (zusammengefasst

in Dunn u. a., 2010).

Des Weiteren kann eine Anreicherung über phosphospezifische Antikörper im Zuge der

Immunopräzipitation oder über eine chemische Derivatisierung durchgeführt werden

(Blagoev u. a., 2004; Oda u. a., 2001). Die chemische Modifikation kann z. B. in einer

ß-Eliminierung der Phosphatgruppe bestehen (Jaffe u. a., 1998). Die Eliminierung

dieser vom Serin oder Threonin resultiert in der Umwandlung in eine im

Massenspektrometer detektierbaren Dehydroaminobuttersäure oder eines

Dehydroalanins. An diese kann durch "Michael-Addition" ein Aufreinigungstag wie z. B.

Biotin gekoppelt werden (McLachlin & Chait, 2003; Oda u. a., 2001). Somit können

aufgrund dieses Taggings die am Serin oder Threonin phosphorylierten Proteine

aufgereinigt und massenspektrometrisch analysiert werden. Eine ähnliche Strategie

verfolgt der Ansatz der Phosphoamidatchemie (PAC). Hierbei werden über mehrere

Schritte die Phosphatgruppe z. B. mit Cystamin und einer reduzierenden Reagenz

derivatisiert. Die SH-Gruppe des Cystamins wird mit Maleimid-aktivierten Glasbeads

Page 33: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 33

verbunden und somit das Phosphopeptid an der Matrix immobilisiert und aufgereinigt.

Die Elution erfolgt durch saure Hydrolyse (Bodenmiller u. a., 2007).

Den Durchbruch in der bakteriellen Phosphoproteomanalyse brachte die Anwendung

von Titandioxid als Anreicherungsmaterial (Pinkse u. a., 2004; Macek u. a., 2007), da es

sich besonders zur Anreicherung von den in Bakterien vorherrschend vorkommenden

einfach-phosphorylierten Peptiden eignet.

Olsen und Mitarbeiter entwickelten einen Workflow zur Anreicherung von

Phosphopeptiden unter Verwendung einer Kationenaustauschchromatographie und

einer Titandioxidanreicherung (Macek u. a., 2007; Olsen & Macek, 2009). Diese

Methode wird bisher sehr erfolgreich in der gelfreien Analyse bakterieller

Phosphoproteome eingesetzt.

Die Vorfraktionierung erfolgt hier mithilfe der SCX-Chromatographie ("strong-cation-

exchange chromatography"). Das Prinzip basiert auf der Trennung von den in

verschiedenen Ladungszuständen gelöst vorliegenden Peptiden und wurde 2004 von

Beausoleil und Mitarbeitern zur Vorfraktionierung von phosphorylierten Peptiden

eingeführt (Beausoleil u. a., 2004). Bei einem pH-Wert von 2,7 der mobilen Phase

liegen die tryptisch verdauten Peptide doppelt protoniert vor und weisen somit einen

Ladungszustand von zwei auf. Befindet sich jedoch eine negative Phosphatgruppe an

dem Peptid, so verringert sich die Gesamtladungszahl des Peptides um eins. Diese

geringere Gesamtladungszahl begründet die schwächere Affinität zum Säulenmaterial

und führt zu einer frühen Elution im linearen Salzgradienten. Gleiches gilt jedoch auch

für andere, durch Modifikationen in ihrer Gesamtladungszahl reduzierten Peptide, so

dass keine spezifische Abtrennung von nicht-phosphorylierten Peptiden erfolgt,

sondern nur eine Reduzierung der Komplexität und eine Erhöhung des

Phosphopeptidvorkommens innerhalb der ersten entstehenden Fraktionen. Peptide

mit einer Gesamtladungszahl von 0 oder kleiner werden nicht von dem Säulenmaterial

retardiert (Beausoleil u. a., 2004).

Nachfolgend werden die einzelnen Fraktionen mit Titandioxid im sauren Milieu

inkubiert. Titandioxid wurde erstmals von Pinkse und Mitarbeitern in einer globalen

Phosphoproteomstudie eingesetzt (Pinkse u. a., 2004). Die Adsorption der anionischen

Phosphatgruppe an die Oberfläche des Titandioxids erfolgt über einen zweizähnigen

Page 34: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

34

(bidentalen) Bindungskomplex (Larsen u. a., 2005). Aber nicht nur phosphorylierte

Peptide adsorbieren an die Titaniumdioxidoberfläche, sondern ebenfalls anionische,

aber nicht-phosphorylierte Peptide. Zur Vermeidung dieser ungewollten koordinativen

Bindungen der Carbonsäuren wird eine Maskierungsreagenz hinzugegeben. Hierbei

handelt es sich häufig um DHB (2,5-Dihydroxybenzoesäure), die die Adsorptionsstellen

am Titandioxid für Carbonsäuren, aber nicht für Phosphatgruppen belegt. Aber auch

Milchsäure oder Glutaminsäure werden als kompetitive Reagenzien eingesetzt (Larsen

u. a., 2005; Pinkse u. a., 2004). Dies erhöht die Selektivität des Titandioxids für

phosphorylierte Peptide.

Nach mehreren Waschritten erfolgt die Elution der phosphorylierten Peptide im

basischen Milieu durch die Zugabe einer Ammoniumhydroxid-Lösung. Die eluierten

Peptide werden der massenspektrometrischen Analyse zugeführt und können

beispielsweise mit der MaxQuant-Software (Cox & Mann, 2008) ausgewertet werden.

In Abbildung 1 ist der von Olsen und Macek propagierte Workflow vereinfacht

dargestellt.

Es liegen weitere Anreicherungs-Protokolle vor, die sich in den einzelnen Bausteinen

sowie in den verwendeten Substanzen unterscheiden und somit auf das zu

untersuchende System speziell aufeinander abgestimmt werden können. Dabei

kommen z. B. andere Vorfraktionierungtechniken wie beispielsweise HILIC

(Hydrophilen-Interaktions-Chromatographie) oder ERLIC (Electrostatische Repulsions-

hydrophile Interaktionschromatographie) zum Einsatz.

Das Prinzip der HILIC beruht auf der Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen

zwischen dem Peptid, das sich in einer organischen mobilen Phase befindet und einer

neutralen und hydrophilen stationären Phase. Die Elution erfolgt durch eine

Reduzierung des organischen Lösungsmittelanteils in der mobilen Phase und die

Peptide eluieren somit entsprechend ihrer Polarität (McNulty & Annan, 2008;

Thingholm u. a., 2009).

Page 35: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 35

Abbildung 1: Workflow zur globalen Analyse von Phosphopeptiden gemäß Olsen und Macek, 2009.

Eine weitere Vorfraktionierungsmethode ist ERLIC. Sie beruht auf dem Prinzip der

HILIC-Chromatographie, jedoch wird als stationäre Phase anstatt einer

neutralen/hydrophilen Phase eine schwache Ionenaustauschsäule verwendet (Alpert,

2008). Durch die negativ geladene Phosphatgruppe bestehen elektrostatische

Interaktionen zwischen den Phosphopeptiden und dem Säulenmaterial. Des Weiteren

führt die Verwendung eines organischen Lösungsmittels dazu, dass hydrophile

Interaktionen zwischen Phosphopeptid und Säulenmaterial auftreten. Das resultiert in

einer vermehrten Retention der phosphorylierten Peptide im Gegensatz zu den nicht-

phosphorylierten (Alpert, 2008).

Page 36: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

36

1.3.3 Die Rolle der Massenspektrometrie bei der Analyse des Phosphoproteoms

Die massenspektrometrische Analyse von Phosphopeptiden stellt eine große

Herausforderung an das technische Equipment und an den Experimentator. Mehrere

charakteristische Faktoren behindern eine erfolgreiche Untersuchung und müssen

durch verbesserte Analysemethoden umgangen werden. Durch die geringe

Stöchiometrie, die schlechteren Fragmentierungseigenschaften und die Suppression

durch andere höher abundant vorliegende Peptide ist eine massenspektrometrische

Detektion der phosphorylierten Peptide erschwert (Mann u. a., 2002). Das

Grundprinzip der massenspektrometrischen LC-ESI-MS/MS-Analyse phosphorylierter

Peptide ist in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2: Grundlegendes Schema einer massenspektrometrischen LC-ESI-MS/MS-Analyse (modifiziert nach Gafken, 2009).

Das aus der Umkehrphasenchromatographie kommende vorfraktionierte

Peptidgemisch, bestehend aus phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Peptiden,

Page 37: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 37

wird über Elektrosprayionisation als positiv geladene Ionen dem Massenspektrometer

zugeführt. Es erfolgt ein Übersichtsscan, in dem das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis und

die Intensität bestimmt werden (MS-Spektrum). Gleichzeitig werden die Peptide

isoliert und fragmentiert. Die Fragmente werden dann im Massenanalysator detektiert

(MS2 (MS/MS)-Spektrum) (Macek u. a., 2009). Verschiedenste Fragmentierungs- und

Analysetechniken wurden im Laufe der Zeit entwickelt. Die klassische

kollisionsinduzierte Fragmentierung (CID) besteht in einer langsamen Erhöhung der

internen Energie der Ionen und einer induzierten Fragmentierung durch die Kollision

mit Edelgasatomen (z. B. Helium) (Jennings, 1968; Jones & Cooper, 2011; McLafferty &

Bryce, 1967). Die labilsten Bindungen dissoziieren mit dieser Methode zuerst und

verhindern eine weitere Fragmentierung des Peptidrückgrats des Ions. So entsteht bei

phosphorylierten Serinen und Threoninen der klassische Neutralverlust von

ungeladener (neutraler) Phosphosäure (H3PO4) im positiven Ionenmodus. Dies

resultiert in fragmentarmen Spektren, die oftmals nicht genug Informationen

enthalten, um das Phosphopeptid zu identifizieren, beziehungsweise die genaue

phosphorylierte Aminosäure zu detektieren (Boersema u. a., 2009a). Williamson und

Mitarbeiter entwickelten 2006 einen automatisierten Workflow zur Identifizierung von

Phosphorylierungsstellen für ein Hybrid-Gerät aus drei Quadrupolen, das eine

Einsatzmöglichkeit als lineare Ionenfalle beinhaltete. Innerhalb dieser Methode wird

zuerst ein Vorläuferscan auf m/z -79 (≙ -HPO3) im negativen Ionenmodus

durchgeführt, der bei Auftreten dieses Massenverlustes einen hochauflösenden Scan

(MS), eine Fragmentierung und einen Produktionenscan (MS/MS) im positiven

Ionenmodus auslöst (Williamson u. a., 2006).

Eine weitere Lösung der Neutralverlustproblematik bietet der MS3-Ansatz. Hierbei

triggert der Neutralverlust von Phosphorsäure (m/z -98) eine zusätzliche

Fragmentierung des Neutralverlust-Vorläuferions, und es entsteht somit ein qualitativ

hochwertigeres Spektrum (Wolschin & Weckwerth, 2005). Die restlichen Fragmente

der ersten Aktivierung gehen jedoch verloren und stehen der Analyse nicht mehr zur

Verfügung.

Durch die Einführung der Multistage-Aktivierung (bzw. pseudo-MS3) von Schroeder

und Mitarbeitern 2004 konnte durch die Anwendung einer weiteren Aktivierung des

Page 38: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

38

putativ entstehenden Neutralverlustions die Anzahl der Fragmente erhöht und die

Identifizierung verbessert werden. Hierbei findet im Gegensatz zum klassischen

MS3-Ansatz zwischen den beiden Aktivierungen keine Leerung der Ionenfalle statt, so

dass alle entstehenden Fragmente dem Analysator zugeführt werden (Schroeder u. a.,

2004).

Weitere Fragmentierungstechniken wie "electron capture dissociation" (ECD),

"electron transfer dissociation" (ETD) und "higher energy collision activated

dissociation" (HCD) werden zur Analyse von phosphorylierten Peptiden angewandt. Bei

diesen Methoden tritt der Neutralverlust nicht oder nur kaum auf. Die HCD-

Fragmentierungstechnik basiert auf der hochenergetischen Kollision mit

Stickstoffatomen und liefert eine höhere Dissoziationsenergie als die

CID-Fragmentierung, so dass eine Fragmentierung des Peptidrückgrats stattfindet und

b- und y-Ionen generiert werden. Die labilen Phosphatbindungen bleiben

weitestgehend erhalten. Die daraus resultierende höhere Anzahl intensiverer

Fragmentionen produziert qualitativ hochwertige Spektren (Jedrychowski u. a., 2011;

Olsen u. a., 2007; Zhang u. a., 2009).

ECD, basierend auf der Fragmentierung mit niedrig energetischen thermischen

Elektronen und ETD, basierend auf der Fragmentierung mit Radikalionen, resultieren in

einer Dissoziation des Peptidrückgrats zwischen dem Stickstoff und dem C-alpha Atom

und somit in der Bildung von c- und z-Ionen (Molina u. a., 2007; Stensballe u. a., 2000).

Diese beiden Fragmentierungstechniken eignen sich jedoch vorwiegend für höher

geladene Ionen (z>3). 2007 wurde ein Ansatz vorgestellt, indem die CID-Methode für

zweifach geladene Ionen und die ETD-Methode für mehrfach geladene Ionen

miteinander kombiniert wurde (Good u. a., 2007; Molina u. a., 2007).

1.3.4 Daten-Analyse

Eine klassische Datenbankanalyse zur Interpretierung der gewonnen Spektren und

Daten bedingt oft eine manuelle Durchsicht der Spektren potentiell phosphorylierter

Peptide, da aufgrund der mäßigen Qualität der Spektren nur ein geringer Score

erreicht wird. Dies ist in komplexen Phosphoproteomansätzen nicht mehr möglich,

Page 39: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 39

und daher wurden im Laufe der Zeit mehrere Programme/Algorithmen entwickelt, die

im Speziellen die gefundene Phosphorylierungsstelle beurteilen.

In Tabelle 3 sind die am häufigsten verwendeten Programme zur Validierung der

Phosphorylierungsstelle aufgelistet.

Tabelle 3: Auflistung der gebräuchlichsten Algorithmen/Programme zur Validierung von Phosphorylierungsstellen.

Programm Referenz

Ascore Basiert auf der Intensität und dem Vorkommen der der Phophorylierungsstelle benachbarten Ionen im MS/MS Spektrum

(Beausoleil u. a., 2006)

MSQuant Wahrscheinlichkeits-Score + "Localizations-Score" = PTM-Score

(Mortensen u. a., 2010)

MaxQuant Lokalisationswahrscheinlichkeits-Score (Prinzip wie MSQuant)

(Cox & Mann, 2008)

ProPhosSI Automatische Validierung mittels aufgestellten Kriterien

(Martin u. a., 2010)

PhosphoRS/ Proteome Discoverer

Determinierung der dynamischen Peaktiefe, individuelle Phosphorylierungsstellen-Wahrscheinlichkeiten, Anwendbarkeit für alle Fragmentierungstechniken

(Taus u. a., 2011)

1.4 Quantifizierung des Phosphoproteoms

Ein tieferes Verständnis der durch Phosphorylierungsgeschehnisse gesteuerten

Regulationsprozesse kann nur entstehen, wenn ein quantifizierender Vergleich von

verschiedenen Zuständen und Bedingungen möglich ist. In einem gelbasierten Ansatz

können die Signalintensitäten der phosphorylierten Proteine, die durch den phospho-

spezifischen Farbstoff Pro-Q angefärbt wurden, relativ zueinander quantifiziert werden

(siehe Abschnitt 2.1.5).

Mehrere verschiedene Quantifizierungsmethoden wurden im Laufe der Zeit für die

gelfreien Ansätze entwickelt und basieren auf stabilen Isotopen-Markierungen (z. B.

Page 40: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

40

SILAC (stable isotope labeling of amino acids in cell culture) und 14N/15N-metabolischer

Markierung (Conrads u. a., 2001; Wu u. a., 2004; Ong u. a., 2002)), die in der Zellkultur

eingeführt werden können, oder auf Tags, die nachträglich auf Peptidebene (iTRAQ

(isobaric tags for relative and absolute quantitation), 18O-Markierung,

Dimethylmarkierung) eingebaut werden (Ross u. a., 2004; Muñoz & Heck, 2011;

Mirgorodskaya u. a., 2000; Yao u. a., 2001; Andersen u. a., 2009; Mertins u. a., 2012;

Boersema u. a., 2009b).

Die häufigsten Anwendungen zum Quantifizieren von phosphorylierten Peptiden

besteht in der SILAC-, in der iTRAQ-Methode und in der 14N/15N-metabolischen

Markierung (Gruhler u. a., 2005; Jones & Nühse, 2011; Liao u. a., 2012). Das Prinzip der

SILAC-Markierung beruht auf dem Vergleich der Proteine aus zwei unterschiedlichen

Zellkulturen, bei der in dem Medium einer Zellkultur eine Aminosäure gegen eine

durch stabile Isotope veränderte Aminosäure ausgetauscht wurde. Werden die zwei

Zellkulturen gemischt und die Peptide massenspektrometrisch analysiert, so können

die Peptide der Zellkulturen aufgrund des Massenshifts voneinander unterschieden

und quantifiziert werden (Ong & Mann, 2007). Die auf dem SILAC-Ansatz beruhende

Quantifizierung wurde von Soufi und Mitarbeitern für die Analyse des bakteriellen

Phosphoproteoms von B. subtilis angewendet (Soufi u. a., 2010). Eine weitere

Möglichkeit für die Quantifizierung von phosphorylierten Peptiden aus bakteriellen

Phosphoproteomen zeigten van Noort und Mitarbeitern, indem sie für M. pneumoniae

die Dimethyl-Markierung einsetzten (van Noort u. a., 2012).

1.5 Zielstellung der Arbeit

Im Rahmen dieser Dissertation sollte die Analyse verschiedener bakterieller

Phosphoproteome durchgeführt und innerhalb dieser Untersuchungen die aktuellsten

analytischen Methoden etabliert, angewendet und auf die jeweilige Fragestellung

angepasst werden.

Am Anfang stand die Optimierung der 2D-gelbasierten Phosphoproteomanalyse am

Modellorganismus B. subtilis im Vordergrund, die sich auf die Detektion der

phosphorylierten Proteine im 2D-Gel durch den phosphosensitiven Farbstoff Pro-Q

Page 41: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

1 Einleitung 41

Diamond stützen sollte. Die Anwendung sollte sich dann auf die Erstellung einer

Phosphoproteommasterkarte sowie auf die Untersuchung der Veränderungen des

Phosphoproteoms bei unterschiedlichen physiologischen Bedingungen erstrecken.

Eine weitere Aufgabe bestand in der vergleichenden gelbasierten

Phosphoproteomanalyse einer sigB-Mutante von B. subtilis. Ziel dieser

Untersuchungen war es, Phosphorylierungsereignisse innerhalb der generellen

Stressantwort aufzudecken. Mutanten von bisher unbekannten Kinasen und

Phosphatasen des Bodenbakteriums sollten ebenfalls 2D-gelbasiert untersucht

werden, um potentielle Zielproteine der Kinasen und Phosphatasen zu identifizieren.

Darüber hinaus bestand die Aufgabe in der Anreicherung von weiteren unbekannten

Kinasen mittels eukaryotischer Kinaseinhibitoren.

Die Anwendung der 2D-gelbasierten Methode war dann für die

Phosphoproteomanalysen des humanpathogenen S. aureus vorgesehen. Um

verschiedene durch Phosphorylierungsereignisse gesteuerte Anpassungsmechanismen

und Regulationsprozesse aufzudecken und zu analysieren, sollten die Veränderungen

im Phosphoproteom im Hinblick auf verschiedene physiologische Bedingungen oder

Stresssituationen aufgezeigt werden.

Aufgrund des limitierten dynamischen Bereiches des 2D-Gels sollte der gelfreie

Phosphopeptidanreicherungsansatz für S. aureus etabliert und genutzt werden, um die

gelbasierten Untersuchungen zu komplettieren. Ferner wurde nach für die Virulenz

oder Regulation metabolischer Prozesse wichtigen Phosphorylierungsereignissen

gesucht.

Da die relative Quantifizierung über die Signalintensitäten der phosphorylierten

Proteine einen hohen technischen Aufwand erfordert und abhängig von der Qualität

der Pro-Q Diamond-Färbung ist, wurde nach einem alternativen Ansatz zur

gelbasierten Quantifizierung von phosphorylierten Proteinen gesucht.

Für diese Arbeit durfte und sollte der technologische Fortschritt genutzt werden, um

die aktuellsten auf Massenspektrometrie basierende Analysemethoden zu etablieren

und anzuwenden.

Page 42: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

42

2 Ergebnisse und Diskussion

Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden zur Untersuchung

bakterieller Phosphoproteome angewandt. Darunter die auf der Pro-Q® Diamond-

Färbung basierende 2D-Gel-Methode und die gelfreie Phosphopeptid-

anreicherungsmethode gemäß Olsen und Macek (Olsen & Macek, 2009). Mit Hilfe

dieser Methoden war es möglich, die Phosphoproteome von B. subtilis und S. aureus

global zu charakterisieren, die Dynamik zu verfolgen und spezifische Fragestellungen

zu beantworten. Diese Untersuchungen werden nachfolgend dargestellt.

2.1 Das Phosphoproteom von Bacillus subtilis

Aufgrund der wachsenden Erkenntnis der Bedeutung von

Phosphorylierungsereignissen im physiologischen Zellgeschehen von Bakterien geriet

die globale Analyse von Phosphoproteomen bakterieller Organismen in den Fokus des

Interesses. Als Gemeinschaftsarbeit entstand „Dynamics of protein phosphorylation on

Ser/Thr/Tyr in B. subtilis“ (Eymann u. a., 2007), in der das Phosphoproteom von

B. subtilis umfassend gelbasiert charakterisiert wurde. Insgesamt konnten 32 potentiell

phosphorylierte Proteine mittels phosphospezifischer Fluoreszenzfärbung

nachgewiesen und neun Phosphorylierungsstellen massenspektrometrisch identifiziert

werden. Zusätzlich wurde die Dynamik des Phosphoproteoms unter verschiedenen

physiologischen Bedingungen untersucht, wobei die größten Veränderungen unter

Glukosehunger beobachtet werden konnten. Im Folgenden sind die in dieser Arbeit

entstandenen Beiträge zu diesem Werk aufgeführt.

2.1.1 Optimierung der 2D-gelbasierten phosphosensitiven Pro-Q® Diamond Färbemethode

Als Basis für die Untersuchungen des Phosphoproteoms wurde die zweidimensionale

(2D)-Gelelektrophorese in Verbindung mit dem phosphosensitiven Farbstoff Pro-Q®

Diamond gewählt. Aufgrund der sehr niedrigen Abundanz der phosphorylierten

Page 43: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 43

Proteine werden sehr hohe Anforderungen an die Färbemethode gestellt. Zum einen

müssen eine hohe Sensitivität und ein großes Maß an Spezifität gewährleistet sein,

zum anderen stellt die Quantifizierung von unterschiedlichen Signalintensitäten eine

große Herausforderung an die Reproduzierbarkeit der Methode. Die Handhabung des

Pro-Q-Farbstoffes war anfänglich problematisch, da vermehrt unregelmäßige

Hintergrundfärbungen, Schlieren- und Schmutzpartikelbildung auftraten (siehe

Abbildung 3). Diese Verunreinigungen erschwerten die Identifikation der

phosphorylierten Proteinspots sowie die relative Quantifizierung verschiedener

Signalintensitäten der phosphorylierten Proteine und erforderten eine Optimierung

der Methode.

Abbildung 3: Darstellung von Pro-Q-gefärbten Proteinspots in 2D-Gelen. Einige Schmutzpartikel wurden exemplarisch durch Pfeile hervorgehoben. Deutlich sind das verminderte Kontrastverhältnis zwischen dem Hintergrund und den einzelnen Proteinspots und die Schlierenbildung zu erkennen.

Zahlreiche unterschiedliche Pro-Q-Färbeprotokolle sind in der Literatur beschrieben

worden, die in der nachfolgend dargestellten Tabelle aufgeführt sind (siehe Tabelle 4).

Basierend auf diesen von Steinberg, Schulenberg und Agrawal und Thelen (Agrawal &

Thelen, 2005; Schulenberg u. a., 2004; Steinberg u. a., 2003) beschriebenen Methoden

wurde im Rahmen dieser Arbeit das neue Protokoll entwickelt.

Page 44: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

44

Tabelle 4: Darstellung der verschiedenen in der Literatur beschriebenen Pro-Q-Färbemethoden. Diese wurden als Grundlage für die Optimierung der Pro-Q-Färbung herangezogen. Die optimierte Methode ist am Tabellenende aufgeführt. (AA = Essigsäure; MeOH = Methanol; EtOH = Ethanol; ACN = Acetonitril).

Hersteller: Invitrogen (2D-Gel):

Fixieren 1 x 30 min und 1 x ÜN in 50 % MeOH/10 % AA Waschen 3 x 15 min in Wasser Färben 1 x 1,5-2 h in 500 ml Pro-Q Entfärben 3 x 30 min in 20 % ACN, 50 mM Natriumacetat pH 4 Waschen 2 x 5 min in Wasser Schulenberg, 2003 (2D-Gel): Fixieren 1 x ÜN in 45 % MeOH/5 % AA Waschen 3 x 10-20 min in Wasser Färben 1 x 180 min in Pro-Q Entfärben 3 x hintereinander in 50 mM Natriumacetat, pH 4/15 % 1,2-Propandiol Steinberg, 2003 (1D-Gel): Fixieren 45 % MeOH / 5 % AA , 1 x 90 min bis ÜN Waschen 2 x 10-20 min in Wasser Färben 25-50 ml Pro-Q, 1 x 75-120 min Entfärben 3 x hintereinander in 50 mM Natriumacetat, pH 4, 3 x; oder 3 x hintereinander in 50 mM Natriumacetat, pH 4/4 % ACN; oder 3 x hintereinander in 50 mM Natriumacetat, pH 4/15 % 1,2-Propandiol Agrawal und Thelen, 2005 (2D-Gel): Fixieren 2 x 30 min in 50 % MeOH/10 % AA Waschen 2 x 15 min in Wasser Färben 1 x 120 min in 3 x verdünntem Pro-Q Entfärben 4 x 30 min in 20 % ACN/50 mM Natriumacetat pH 4 Waschen 2 x 5 min in Wasser Optimiertes Protokoll (diese Arbeit) (2D-Gel): Fixieren 2 x 30 min in 50 % EtOH/12 % AA Waschen 4 x 15 min in Wasser oder 2 x 15 min, 1 x ÜN und 1 x 15 min in Wasser Färben 1 x 150 min in 3x verdünntem Pro-Q Entfärben 3 x 30 min, 1 x 45 min in 20 % 1,2-Propandiol/50 mM Natriumacetat pH 4 Waschen 2 x 10 min in Wasser

Im Zuge der Optimierung wurden die jeweiligen Inkubationszeiten und die

Konzentration der Färbelösung angepasst, so dass ein sehr gutes Ergebnis in Bezug auf

Bildreinheit (Schmutzpartikel- und Schlierenfreiheit), Spotklarheit und

Page 45: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 45

Reproduzierbarkeit erzielt wurde (siehe Abbildung 4). Des Weiteren wurden die zu

vergleichenden Gele parallel aus denselben Gellösungen hergestellt, die 2. Dimension

in derselben Laufkammer durchgeführt und dieselbe Färbemittel-Charge benutzt.

Als besonders wichtig in der Färbeprozedur stellten sich dabei die Länge der

Waschschritte und deren Wiederholungen nach dem Fixieren und dem Entfärben

ebenso wie das optimale Verhältnis von Färbezeit und der Länge der

Entfärbungsschritte dar. Eine vermehrte Schmutzpartikelreduzierung konnte durch

intensiveres Waschen nach dem Fixierschritt erreicht werden und die Schlierenfreiheit

durch mehrmaliges und verlängertes Waschen nach den Entfärbeschritten. Ferner

wurde darauf geachtet, dass die Verwendung gesundheits- und umweltschädlicher

Chemikalien vermieden wurde, so dass Methanol durch Ethanol und Acetonitril durch

1,2-Propandiol ersetzt wurde.

Abbildung 4: Das linke Gelbild zeigt das Ergebnis der optimierten Pro-Q-Färbemethode. Deutlich ist eine verminderte Hintergrundfärbung sowie Schlierenfreiheit und eine Schmutzpartikelreduzierung gegenüber den in Abbildung 3 dargestellten Bildern zu erkennen. Vergleichend wurde ein Gelbild (rechts) aus der Abbildung 3 dem Bild der optimierten Methode (links) gegenübergestellt.

Page 46: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

46

2.1.2 Verwendung der Gesamtproteinfärbung zur verbesserten Identifizierung putativ phosphorylierter Proteine

Martin und Mitarbeiter beschrieben, dass der Pro-Q-Farbstoff nicht nur spezifisch

Serin-, Threonin- und Tyrosinphosphorylierungen anfärbt, sondern auch saure,

nicht-phosphorylierte Proteine. Es konnte jedoch bei Auswertung eines Pro-Q-Arrays

durch Martin u. a. festgestellt werden, dass diese unspezifischen Signale 64- bis

128-mal schwächer sind, als die Signale der eigentlichen phosphorylierten Proteine

(Martin u. a., 2003a, 2003b). 2009 zeigten Hempel und Mitarbeiter, dass ultrasaure

Proteine ebenfalls durch den Farbstoff angefärbt werden (Hempel u. a., 2009).

Zusätzlich ruft die unterschiedliche Selektivität aufgrund verschiedener Bindungsarten

des Farbstoffes an das phosphorylierte Protein divergente Färbeintensitäten hervor

(Steinberg u. a., 2003). Diese Eigenschaften erschweren die bildliche Identifikation der

phosphorylierten Proteine.

Die unspezifische Färbung des Pro-Q-Farbstoffes bringt jedoch einen großen Vorteil

mit sich, der sich insbesondere im Vergleich zu der früher üblichen radioaktiven 33/32P-Markierung zeigt. Aufgrund der Tatsache, dass bei der 33/32P-Markierung nur die

radioaktiv phosphorylierten Proteine dargestellt werden können, fehlt der Bezug zu

den unphosphorylierten Proteinen, die durch die Gesamtproteinfärbung angezeigt

werden. Dies erschwerte nicht nur die Identifizierung, sondern verhinderte ebenfalls

die Gegenüberstellung verschiedener Proteinisoformen (z. B. phosphoryliert und

unphosphoryliert). Durch das Vorhandensein der unspezifischen Proteinfärbung

(bedingt durch den Pro-Q-Farbstoff) ist es möglich, ein Zweikanalfarbenbild von der

Pro-Q-Färbung und der Gesamtproteinfärbung zu erstellen, indem die

korrespondierenden Proteinspots aufeinandergelegt werden.

Der Vorteil der Vergleichsmöglichkeit von Gesamtproteinfärbung und

Phosphoproteinfärbung wurde nun des Weiteren genutzt, um die genaue

Identifizierung der phosphorylierten Proteinspots zu ermöglichen. Die

Signalintensitäten der Pro-Q-Färbung (Bild der Pro-Q-Färbung im Zweikanalfarbenbild:

falschfarben rot) und der Gesamtproteinfärbung (Bild der Flamingo-Färbung im

Zweikanalfarbenbild: falschfarben grün) wurden zueineinander ins Verhältnis gesetzt.

Gemäß Jörg Bernhardt (Inst. f. Mikrobiologie, Universität Greifswald) wurden

Page 47: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 47

diejenigen Ratios als signifikant für phosphorylierte Proteine angesehen, die außerhalb

einer Normalverteilung liegen, die aus den Verhältnissen von

Proteinmengensignalintensität und unspezifischer Signaltintensität des Pro-Q-

Farbstoffes resultiert (Eymann u. a., 2007). Im Zweikanalfarbenbild können diejenigen

Proteinspots, die eine Ratio außerhalb der Normalverteilung aufweisen und deren

Pro-Q-Signalintensität deutlich höher ist als die der Flamingo-Färbung, visuell als rote

Spots erkannt werden. Proteinspots deren Signalverhältnis innerhalb der

Normalverteilung liegt erscheinen gelb (nicht phosphoryliert) und Proteinspots ohne

Pro-Q Signal grün (nicht phosphoryliert). Die visuellen Eindrücke müssen jedoch immer

über die Berechnung der Ratios bestätigt werden. Als Gesamtproteinfärbung wurde

anfänglich die Colloidal Coomassie Färbung ausgewählt, da es sich um eine leicht zu

handhabende Färbemethode handelt, die sowohl preiswert als auch

massenspektrometrisch kompatibel ist (Harris u. a., 2007; Neuhoff u. a., 1988; Zhu u.

a., 2005). Nachteilig waren jedoch die geringere Sensitivität und der geringe lineare

Bereich dieser Färbemethode gegenüber den sich auf dem Markt befindlichen

Fluoreszenzfarbstoffen und letztendlich der Pro-Q-Färbung.

Tabelle 5: Darstellung von unterschiedlichen Gesamtproteinfarbstoffen und ihrer spezifischen Charakteristika.

Farbstoff Detektionslimit Linearer Bereich

Colloidal Coomassie 30 ng (Neuhoff u. a., 1988) eine Zehnerpotenz (Patton, 2002)

Silberfärbung ~0,5 ng (Blum u. a., 1987) eine Zehnerpotenz oder weniger (Patton, 2000)

Deep Purple™ Total Protein Stain (Fluoreszenz)

0,5 ng (Herstellerangaben) 4 Zehnerpotenzen (Bell & Karuso, 2003)

Flamingo™ Fluorescent Gel Stain (Fluoreszenz)

0,25 ng (Herstellerangaben) 3 Zehnerpotenzen (Herstellerangaben)

Pro-Q® Diamond (Fluoreszenz)

< 1 pg (Martin u. a., 2003a)

(Proteinmikroarray)

3 Zehnerpotenzen (Steinberg u. a., 2003)

Page 48: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

48

In Tabelle 5 sind die in der Literatur beschriebenen Sensitivitäten und linearen

Bereiche der unterschiedlichen Färbungen aufgeführt.

Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass die Fluoreszenzfarbstoffe Deep Purple™ und

Flamingo™ einen deutlich größeren linearen Bereich aufweisen als die herkömmlichen

Absorptionsfärbungen und ein niedrigeres Detektionslimit gegenüber Colloidal

Coomassie zeigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Fluoreszenzfarbstoffe Deep

Purple und Flamingo im Hinblick auf ihre Sensitivität gegenüber Colloidal Coomassie

(Neuhoff u. a., 1988) und der Silberfärbung (Blum u. a., 1987) für das verwendete 2D-

Gelsystem und in der Anwendung mit der Pro-Q-Färbung getestet. Hierbei wurden die

im 2D-Gel aufgetrennten Proteine vorerst mit Pro-Q und nachfolgend mit jeweils einer

der aufgeführten Gesamtproteinfärbungen gefärbt. Die einzelnen Bilder wurden

mithilfe der Auswertesoftware Delta2D von Decodon (Greifswald) verglichen. Die

Ergebnisse sind in Abbildung 5 dargestellt. Keine der vier getesteten Färbemethoden

wies eine Inkompatibilität mit der vorangegangenen Pro-Q-Färbung auf, jedoch ist ein

Entfärbeschritt vor der Fluoreszenzfärbung mit Flamingo oder Deep Purple notwendig,

um die Vermischung von Pro-Q-Signalen und den Gesamtproteinsignalen

auszuschließen.

In Abbildung 5 sind die Zweikanalbilder der Farbstoffe Colloidal Coomassie, Deep

Purple, Flamingo und der Silberfärbung jeweils mit ihrem korrespondierenden Pro-Q-

Bild vergleichend dargestellt. Die Gesamtproteinfärbung wurde falschfarben grün und

die Pro-Q-Färbung falschfarben rot abgebildet. Die gelb erscheinenden Spots stellen

Proteine dar, die von beiden Farbstoffen angefärbt worden sind. Bereits visuell kann

die unterschiedliche Sensitivität der verschiedenen Gesamtproteinfärbungen an der

Anzahl und Dichte der grünen bzw. gelben Proteinspots wahrgenommen werden. Die

Anzahl der jeweils detektierten Spots ist in der dem Bild zugefügten Tabelle

zusammengefasst. Mit Hilfe der Silberfärbung wurde die größte Anzahl an Proteinspots

detektiert. Die Fluoreszenzfarbstoffe wiesen eine 6 - 22 % geringere Spotanzahl auf.

Mit Colloidal Coomassie konnten im Vergleich zur Silberfärbung nur 41 % der

Proteinspots identifiziert werden.

Page 49: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 49

Farbstoff Detektierte Proteinspots

MS- Kompatibilität

Colloidal Coomassie

426 +

Deep Purple 810/756 (s.u.) + Silberfärbung 1035 - Flamingo 979/889 (s.u.) +

Abbildung 5: Zweikanalfarbenbilder der unterschiedlichen Gesamtproteinfärbungen (grün) jeweils zusammen mit deren korrespondierenden Pro-Q-Färbung (rot). Visuell können die unterschiedlichen Intensitäten der Färbungen anhand der Anzahl der Proteinspots erkannt werden. Die Tabelle fasst die mit Decodon Delta2D ermittelten Spotquantitäten und die massenspektrometrische Kompabilität der Farbstoffe zusammen.

Page 50: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

50

Die Abbildung 6 gibt einen detaillierten Vergleich der beiden Fluoreszenzfarbstoffe

Deep Purple und Flamingo wieder.

Deep Purple: 756 Spots Flamingo: 889 Spots

Abbildung 6: Vergleich der Fluoreszenzfarbstoffe: oben: Zweikanalbild aus Flamingo-Bild (rot) und Deep Purple-Bild (grün); unten: Einzelbilder der beiden Fluoreszenzfarbstoffe (die Spotumrandungen wurden mithilfe der Decodon Delta2D-Software erstellt und ihre Anzahl ausgewertet).

Page 51: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 51

Hierbei wurden jeweils die einzelnen Proteinspots für jedes Gelbild unter

Zuhilfenahme der Decodonsoftware detektiert (siehe Spotumrandungen) und gezählt.

Des Weiteren wurde auch hier ein Zweikanalbild der beiden unterschiedlichen

Färbungen zur besseren Visualisierung erstellt (grün = Deep Purple; rot = Flamingo;

gelb = Spot wurde durch beide Farbstoffe angefärbt). Die Abbildung macht deutlich,

dass die Flamingofärbung in dem mittleren bis unteren Massenbereich eine größere

Anzahl von Proteinspots anfärbt und eine 9-23 % größere Anzahl an Proteinspots im

Vergleich zu Deep Purple detektiert werden kann.

Obwohl die größte Anzahl an Proteinspots mit der Silberfärbung detektiert werden

konnte, wurde sie aufgrund des zu geringen linearen Bereiches, der zu geringen

Reproduzierbarkeit infolge der verschiedenen zur Färbung nötigen Schritte und der

massenspektrometrischen Inkompatibilität, von der weiteren Anwendung

ausgeschlossen. In Bezug auf die Sensitivität (höchste Anzahl an detektierten

Proteinspots) stellte sich der Flamingo-Farbstoff als optimal dar. Des Weiteren konnte

die einfache Handhabung des Farbstoffes, die sich in einer besseren

Reproduzierbarkeit ausdrückt, überzeugen. Dieser wurde nun für die folgenden

Untersuchungen eingesetzt.

2.1.3 Verifizierung der Pro-Q-Färbung via alkalischer Phosphatase von E. coli und radioaktiver Markierung mit 33P

Zur Validierung des 2D-gelbasierten Ansatzes, besonders zur Verifizierung der

Detektion der phosphorylierten Proteinspots, wurden im Rahmen dieser Arbeit

Kontrollversuche mit alkalischer Phosphatase von E. coli und Versuche mit

radioaktivem 33P (aus 33P-Phosphorsäure) durchgeführt. Beim ersten Versuch wurde

ein Proteinkontrollextrakt mit alkalischer Phosphatase gemäß den Herstellerangaben

inkubiert und nachfolgend mit dem Proteinextrakt die 2D-gelbasierte

Phosphoproteommethode durchgeführt (2D-Gel, Pro-Q-Färbung, Flamingo-Färbung).

Ein unbehandelter Proteinextrakt diente als Kontrolle. Die entstandenen Gelbilder des

behandelten und unbehandelten Proteinextraktes wurden unter Verwendung der

Delta2D-Software (Decodon Greifswald) miteinander verglichen (siehe Abbildung 7).

Aufgrund der Spezifität der alkalischen Phosphatase, die auf der Hydrolyse von

Page 52: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

52

Phosphomonoestern basiert (Garen und Levinthal, 1960; Heppel u. a., 1962), sollte

durch die Zugabe eine Dephosphorylierung der O-Phosphatester an Serin, Threonin

und Tyrosin erreicht werden, so dass im Gelbild des behandelten Extrates geringere bis

gar keine Phosphorylierungssignale erwartet wurden.

In der Abbildung 7 sind die Unterschiede in der Anzahl und der Intensität der

phosphorylierten Proteinspots deutlich zu erkennen.

Im Bild des behandelten Extraktes sind alle putativ phosphorylierten Proteinspots, bis

auf Pyk-2, Pyk-3, RsbRA und RsbRB-1, deutlich in ihrer Signalintensität reduziert oder

treten nicht mehr in Erscheinung (siehe Abbildung 7A, rechts). Der Vergleich von den

Pro-Q-Bildern des behandelten und unbehandelten Extraktes zeigt, dass das Muster

der rotgefärbten und somit putativ phosphorylierten Proteine dem des

Zweikanalfarbenbildes Flamingo versus Pro-Q entspricht. Warum nur eine schwache

Reduzierung der Signalintensität der vier oben genannten Spots zu beobachten ist,

obwohl für jedes Protein eine Phosphorylierungsstelle massenspektrometrisch

bestimmt werden konnte (Phosphorylierungsstellen siehe Eymann u. a. 2007), bleibt

fraglich.

Eine mögliche Erklärung wäre, dass aufgrund der Proteinstruktur oder aufgrund von

Proteinkomplexbildung (z. B. Stressosomkomplex mit RsbRA und RsbRB) die

phosphorylierte Aminosäure der alkalischen Phosphatase nicht ausreichend zugänglich

war, so dass keine Dephosphorylierungsreaktion stattfinden konnte. Der Großteil der

putativ phosphorylierten Proteine wies eine deutliche Reduzierung der Signalintensität

unter Einfluss von alkalischer Phosphatase auf und zeigte damit, dass der gewählte

methodische Ansatz zur Identifizierung der phosphorylierten Proteine unter Einsatz

der Pro-Q- und Flamingofärbung vertrauenswürdige Ergebnisse liefert.

Es wurde ein weiterer Versuch zur Validierung der entwickelten 2D-Gel- und Pro-Q-

basierten Phosphoproteommethode durchgeführt. Hierbei wurde in vivo eine 33P-Markierung mit radioaktiver Phosphorsäure durchgeführt. Der Vorteil der

radioaktiven Markierung mit Phosphat gegenüber der Markierung mittels

radioaktivem ATP liegt in der direkten Aufnahme des Phosphats in die Zelle, in der das

Phosphat dann für den zellulären Metabolismus genutzt wird (Bendt u. a., 2003).

Page 53: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 53

A)

B)

Abbildung 7: A) Vergleich der Zweikanalbilder des unbehandelten (links) und des behandelten Proteinextrakts (alkalische Phosphatase, rechts). Das Resultat der Flamingo-Färbung wurde falschfarben grün und das der Pro-Q-Färbung falschfarben rot eingefärbt. B) Vergleich der Pro-Q-Bilder des behandelten und unbehandelten Extraktes. In der Abbildung wurden die Proteinspots der alkalischen Phosphatase sowie die in ihrer Signalintensität unbeeinflussten phosphorylierten Proteine markiert.

Page 54: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

54

Durch einen Verdau des gewonnen radioaktiven Proteinextraktes mit DNase und

RNase wird eine Hintergrundfärbung aufgrund von radioaktiv markierten DNA und

RNA vermieden. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass ausschließlich die das 33P-Isotop enthaltenden Proteine detektiert werden. Um einen direkten Vergleich zu

bekommen, wurden die im Gel aufgetrennten phosphorylierten Proteine mit dem

Pro-Q-Farbstoff und die Gesamtproteinmenge mit dem Flamingo-Farbstoff angefärbt,

bevor das Gel in getrockneter Form dem Phosphoscreening unterzogen wurde. So

konnte ein Vergleich der verschiedenen Phosphoprotein-Detektionen durchgeführt

werden. In Abbildung 8 sind die Gelbilder der unterschiedlichen Phosphoprotein-

Detektionen nebeneinander aufgeführt.

Abbildung 8: Vergleich der Bilder der Pro-Q-Färbung (links, rot) und der 33P-Markierung (rechts, rot) jeweils als Zweikanalfarbenbild mit der Gesamtproteinfärbung Flamingo (grün). Die Kreise markieren die jeweiligen Unterschiede (putativ phosphorylierte Proteine = rote erscheinende Spots).

Auffallend ist das sehr ähnliche Phosphorylierungsmuster des Gels der „ausgewerteten

Pro-Q-Färbung“ (d. h. das Muster der im Pro-Q/Flamingo-Vergleich als putativ

phosphoryliert ermittelten Spots) und des Gels der 33P-Markierung. Einzig die putativ

phosphorylierten Proteinspots von GlyA (Serin-Hydroxymethyltransferase) und TufA

(Elongationsfaktor Tu) konnten nur auf dem Pro-Q-Bild identifiziert werden. SdhA

Page 55: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 55

(Succinat-Dehydrogenase) und ein unbekanntes niedrigmolekulares Protein wurden

ausschließlich auf dem radioaktiven Bild detektiert.

Mit diesen Kontrollversuchen konnte deutlich gezeigt werden, dass die Identifizierung

phosphorylierter Proteinspots mit Hilfe eines Vergleichs zwischen Signalen einer

Gesamtproteinfärbung und den Signalen einer Phosphoproteinfärbung (Pro-Q

Diamond) aussagekräftige und validierte Ergebnisse liefert.

Es ist jedoch fraglich, ob Pro-Q-Signale auch durch das Vorhandensein von Cofaktoren,

wie z. B. Pyridoxal-5-Phosphat und ATP oder phosphorylierten Substraten zustande

kommen. Der Kontrollversuch mit der alkalischen Phosphatase dient dabei nicht als

Gegenargument, da in der Literatur beschrieben wurde, dass das Enzym ebenfalls in

der Lage ist, Phosphat von Ribonukleotiden (z. B. ATP), Desoxyribonukleotiden und

inorganischen Pyrophosphaten abzuspalten (Heppel u. a., 1962).

Da bei der hier angewandten 2D-Gelelektrophorese denaturierte Proteine aufgetrennt

werden, können alle phosphorylierten Substrate und Cofaktoren, die nicht kovalent

gebunden werden, als Signalauslöser ausgeschlossen werden. In der Literatur sind nur

wenige phosphathaltige Cofaktoren und Substrate beschrieben, die kovalent

gebunden werden, darunter beispielsweise das Pyridoxal-5-Phosphat als prosthetische

Gruppe bei Aminotransferasen und das 2-Phosphoglycerat als Substrat der Enolase

(Boël u. a., 2004; Cerqueira u. a., 2011; Sivaraman u. a., 2001).

Durch die hier vorgenommenen Versuche kann nicht ausgeschlossen werden, dass die

Phosphorylierungssignale der Pro-Q-Färbung bzw. 33P-Markierung nicht auch durch

kovalent gebundene Cofaktoren oder phosphorylierte Substrate hervorgerufen

werden. Daher gelten die durch die Pro-Q-Färbung ermittelten phosphorylierten

Proteine im Folgenden so lange als putativ phosphoryliert, bis die spezifische

Phosphorylierungsstelle massenspektrometrisch bestimmt werden konnte.

2.1.4 Identifizierung von Pro-Q-gefärbten Proteinen aus dem 2D-Gel

Die Identifizierung phosphorylierter Proteine wurde für einen Proteinextrakt, der aus

Ethanol-gestressten Zellen (20 min 10 % Ethanol) von B. subtilis extrahiert wurde,

durchgeführt. Zur Charakterisierung der Pro-Q-gefärbten und somit putativ

Page 56: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

56

phosphorylierten Proteinspots von B. subtilis fand eine massenspektrometrische

Analyse statt. Hierbei wurden die Proteinspots manuell aus dem Gel ausgeschnitten,

mit korrespondierenden Gelspots aus den Replikaten gepoolt und trypsiniert. Das

Peptidgemisch wurde mittels LC-ESI-MS/MS Analyse (LTQ-FTICR Massenspektrometer

(Thermo Electron, San Jose, USA)) in Kombination mit dem Ettan MDLC System

(GE Healthcare)) analysiert. Die Auswertung der Rohdaten erfolgte mit dem Sequest-

Algorithmus V.27.12 (siehe Abschnitt 3.2.6.1).

Die Abbildung 9 zeigt die Phosphoproteomkarte für die in dieser Arbeit entstandenen

Identifizierungen putativ phosphorylierter Proteinspots von B. subtilis.

Die rot markierten Proteinspots wurden in die Publikation (Eymann et al. 2007) mit

aufgenommen, die gelb markierten validierten bereits identifizierte Proteinspots und

die grün markierten Proteinspots wurden nachträglich im Rahmen dieser Arbeit

korrigiert.

In der Tabelle 6 sind die identifizierten Proteine, die Funktion und der jeweilige

Sequestscore aufgeführt (siehe auch Anhang I). Des Weiteren wurden die in anderen

Publikationen beschriebenen phosphorylierten Proteine mit einem Kreuz in der der

Publikation zugewiesenen Spalte markiert.

Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit 35 Pro-Q-gefärbte Proteinspots detektiert

werden. 32 wurden eindeutig identifiziert und konnten damit 21 verschiedenen

Proteinen zugeordnet werden. Für drei Proteinspots war nur eine

Mehrfachidentifizierung möglich. Es gelang, die genaue Phosphorylierungsstelle des

RsbR-Paralogs RsbRB1 (T186) zu spezifizieren (siehe Anhang Ib).

Page 57: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 57

Abbildung 9: Zweikanalfarbenbild der Bilder der Pro-Q-Färbung (rot) und der Gesamtproteinfärbung Flamingo (grün). Die in dieser Arbeit mittels massenspektrometrischer Analyse identifizierten putativ phosphorylierten Proteinspots wurden markiert (rote Beschriftung: die Identifizierungen flossen direkt in die Publikation mit ein; gelb: Validierung von bereits identifizierten Spots; grün: nachträgliche Korrektur der Identifizierung).

Page 58: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

58

Tabelle 6: Identifizierung der putativ phosphorylierten Proteine von B. subtilis. Die massenspektrometrischen Identifizierungen für die Pro-Q-gefärbten Proteinspots mit den dazugehörigen Proteinfunktionen und dem Sequestscore sind aufgelistet. Für RsbRB1 wurde die Sequenz des phosphorylierten Peptides mit aufgeführt, wobei die Raute das phosphorylierte Threonin markiert.

Unter den in dieser Arbeit identifizierten putativ phosphorylierten Proteinen befanden

sich überwiegend Proteine des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels, der Regulation der

SigB-Aktivität und der Cys.-, Met.- und Sulfat-Assimilierung (Einordnung gemäß

Subtiwiki http://subtiwiki.uni-goettingen.de/wiki/index.php/Main_Page). In der

Abbildung 10 sind die prozentualen Verhältnisse bezüglich der Verteilung der

identifizierten putativ phosphorylierten Proteine über die verschiedenen

physiologischen Gruppen wiedergegeben.

Proteinspot Proteinfunktion Sequest-Score phosphoryliertes Peptid

Levine u.a. 2006

Macek u.a. 2007/Soufi u.a.

2010CitZ/SerC CitZ: citrate synthase II (major) 80,39 x

SerC: phosphoserine aminotransferase 40,26DnaK DnaK: class I heat-shock protein (molecular chaperone) 160,28Eno1 Eno: enolase 110,38 x xEno2 Eno: enolase 100,38GapA GapA: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 140,36 xGapA/YxjG/YjcI GapA: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 100,31

YxjG: unknown; similar to unknown proteins from B. subtilis 90,30YjcI: unknown; similar to cystathionine gamma-synthase 60,30

GlyA GlyA: serine hydroxymethyltransferase 90,33 xGroEL GroEL: class I heat-shock protein (chaperonin) 250,36 xIcd1 Icd: isocitrate dehydrogenase 190,26 xIcd2 Icd: isocitrate dehydrogenase 180,26MetE MetE: cobalamin-independent methionine synthase 60,18 xPdxS1 (YaaD1) YaaD: unknown; similar to superoxide-inducible protein 110,32PdxS2 (YaaD2) YaaD: unknown; similar to superoxide-inducible protein 220,32PdxS3 (YaaD3) YaaD: unknown; similar to superoxide-inducible protein 120,33Pgm1 Pgm: phosphoglycerate mutase 90,29 xPyk2 Pyk: pyruvate kinase 130,35 xPyk3 Pyk: pyruvate kinase 70,28 xRsbRB1 YkoB: unknown; similar to positive regulator of sigma-B activity 170,31 K.STALLPLVGDIDT#ERAK.FSpoIIA SpoIIAA: anti-anti-sigma factor 60,29 x xThiG1 ThiG: hydroxyethylthiazole phosphate biosynthesis 140,34 xThiG2 ThiG: hydroxyethylthiazole phosphate biosynthesis 70,28TufA TufA: elongation factor Tu 100,27YhxB1 YhxB: unknown; similar to phosphomannomutase 210,33 xYhxB2 YhxB: unknown; similar to phosphomannomutase 220,34YhxB3 YhxB: unknown; similar to phosphomannomutase 150,32YwjH2 YwjH: unknown; similar to transaldolase (pentose phosphate) 30,18 x x

Validierungsproteine:Crh Crh: catabolite repression HPr-like protein 30,17GuaB2 GuaB: inosine-monophosphate dehydrogenase 60,23PurH/AsnS AsnS: asparaginyl-tRNA synthetase 120,23

PurH: phosphoribosylaminoimidazole carboxy formyl formyltransfera 80,26RsbV RsbV: positive regulator of sigma-B activity (anti-anti-sigma factor) 40,22 x xRsbRA1a RsbR: positive regulator of sigma-B activity 90,28 xRsbRA1b RsbR: positive regulator of sigma-B activity 90,28Tig Tig: trigger factor (prolyl isomerase) 140,32 x

sich später bestätigend:RsbRA2a RsbRA2a: positive regulator of sigma-B activity 60,28RsbRA2b RsbRA2b: positive regulator of sigma-B activity 70,27

Page 59: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 59

Abbildung 10: Physiologische Einordnung der in dieser Arbeit identifizierten putativ phosphorylierten Proteine. (Die Einordnung erfolgte gemäß Subtiwiki).

Anhand der Identifizierungsergebnisse konnte ein Teil des Phosphoproteoms Ethanol

gestresster Zellen von B. subtilis analysiert werden. Ein vollständiger Überblick, der die

Ergebnisse von Anja Klutzny und die aus dieser Arbeit stammenden zusammenfasst, ist

in Eymann u. a. 2007 dargestellt.

Im Vergleich zu der Studie von Lévine und Mitarbeitern konnte eine Gemeinsamkeit

von 12 phosphorylierten Proteinen festgestellt werden (Lévine u. a., 2006). Neun

phosphorylierte Proteine wurden ebenfalls in den gelfreien Ansätzen von Macek u. a.

2007 und Soufi u. a. 2010 detektiert, diese wurden in der Tabelle 6 mit einem Kreuz

gekennzeichnet.

Die gemeinsam identifizierten phosphorylierten Proteine der verschiedenen Studien

verifizieren den hier gewählten Ansatz zur globalen Untersuchung des

Phosphoproteoms. Jedoch ist auffällig, dass die Überlappungen des gelbasierten (diese

Arbeit) und des gelfreien Ansatz (Macek u. a. 2007) nur sehr gering sind. Dafür sind

andere

Purin-Synthese

Ala-, Gly-, Ser- Synthese

Cys-, Met- und Sulfat-Assimilierung

Kontrolle der SigB-Aktivität

zentraler C-Metabolismus

0%10%

20%30%

40%

18%

9%

9%

14%

14%

36%

Physiologische Einordnung der identifizierten putativ phosphorylierten Proteine

Page 60: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

60

nicht nur die unterschiedlich gewählten Wachstumsmedien verantwortlich, sondern

die Hauptursache ist anhand der unterschiedlichen physikalisch-chemischen

Bedingungen der jeweiligen Versuchsmethode erklärbar. Das 2D-Gel liefert in einem

definierten Massen- und pH-Bereich eine sehr gute Proteinauftrennung. Sehr kleine

(MW < 10 kDa), sehr saure (pH < 3) und sehr basische Proteine (pH > 11) sind jedoch

von der Analyse ausgeschlossen. Des Weiteren findet nur eine ungleichförmige

Absorption der Proteine an das Gel statt. Eine gute Trennung von hydrophoben

Membranproteinen ist mit dieser Methode nicht möglich, da sich die

Membranproteine oftmals nicht in nicht-ionischen bzw. zwitterionischen Detergenzien

lösen lassen oder bei pH-Werten in der Nähe ihres isoelektrischen Punktes

präzipitieren (Bunai & Yamane, 2005).

Aufgrund des Anspruchs, die Proteine voneinander zu separieren, ist die

Proteinladekapazität des Gels beschränkt. Hierin besteht ein großer Nachteil

gegenüber dem Anreicherungsverfahren, da mit steigender Anzahl an zur Messung zur

Verfügung stehenden phosphorylierten Peptiden, die Wahrscheinlichkeit der

Identifizierung der spezifischen Phosphorylierungsstelle zunimmt.

Der gelfreie Ansatz besticht dadurch, dass eine große Menge an Proteinextrakt

(10-50 mg) und somit eine größere Menge an phosphorylierten Peptiden für die

massenspektrometrische Analyse eingesetzt werden kann. Da während der

Zellaufschlussprozedur gemäß Macek u. a. 2007 das Detergenz Octylglucosid

eingesetzt wird, ist es möglich, dass sich im Proteinextrakt integrale Membranproteine

befinden und im Folgenden identifiziert werden. Diese können im gelbasierten Ansatz

nicht detektiert werden. Jedoch besteht die Begrenzung des gelfreien Ansatzes in der

Anreicherung von phosphorylierten Peptiden mit einem isoelektrischen Punkt (pI)

kleiner oder gleich dem pH der mobilen Phase der Kationenaustauschchromatographie

und in der Bindefähigkeit des Peptides an das Titaniumdioxid. Ist der pI des

phosphorylierten Peptides kleiner als der pH der mobilen Phase, liegt es nicht

vollständig protoniert vor und trägt dann keine, eine oder mehrere negative Ladungen.

In diesem Zustand kann das Peptid nicht an das Säulenmaterial binden und befindet

sich im Beladungsdurchfluss (Beausoleil u. a., 2004). Dessen Messung gestaltet sich

durch Harnstoffverunreinigungen (aus der Probenvorbereitung) und durch die erhöhte

Page 61: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 61

Peptidkomplexizität als problematisch, so dass nur hochabundante Phosphopeptide

identifiziert werden können.

Der detaillierte Vergleich der Ergebnisse zum Phosphoproteom von B. subtilis aus dem

gelbasierten Ansatz von Eymann und Mitarbeitern und dem gelfreien Ansatz von

Macek und Mitarbeitern (Eymann u. a., 2007; Macek u. a., 2007) zeigt, dass alle

phosphorylierten Peptide, die im gelbasierten Ansatz einen pI von 2,7 und niedriger

aufwiesen, im gelfreien Ansatz nur mit einer ausgelassenen Enzymschnittstelle

detektiert wurden. Diese Peptidverlängerung beeinflusste den pI des Peptides (siehe

Tabelle 7).

Tabelle 7: Gegenüberstellung von phosphorylierten Peptidsequenzen, die mit beiden Methoden identifiziert werden konnten. Zu jedem Peptid wurde der jeweilige pI aufgeführt (pI-Rechner: http://www.fmi.ch/members/reto.portmann/pepeval.html). Die aufgrund einer ausgelassenen Enzymschnittstelle hinzukommenden Aminosäuren wurden unterstrichen.

Protein- name

Peptidsequenz 2D-Gel-Ansatz

pI Peptidsequenz SCX-Ansatz

pI

AroA SNTELELLR 1,77 SNTELELLR 3,17 QK

RsbRA IALQELSAPLIPVFENITVMPLVGTIDTER 1,68 IALQELSAPLIPVFENITVMPLVGTIDTER 3,02 AK

YbbT AMDAEAGVMISASHNPVQDNGIK 3,01 AMDAEAGVMISASHNPVQDNGIK 3,01

YqhA EMINELSAPIMPITDGIGILPLVGEIDTHR 2,72 EMINELSAPIMPITDGIGILPLVGEIDTHR 3,69 AR

Zusätzlich beeinflusst die spezifische Aminosäurezusammensetzung des jeweiligen

Peptids die Bindungsaffinität an das Titandioxid. Je nachdem wie viele basische oder

saure Aminosäuren das Peptid enthält, vermindert oder erhöht sich die Affinität. Des

Weiteren weisen phosphorylierte Peptide unterschiedliche Elutionseffizienzen im

basischen Milieu auf (Klemm u. a., 2006). Ein weiterer wichtiger Faktor, der die

Bindungseffizienz von phosphorylierten Peptiden an das Titandioxid beeinflusst, ist das

Verhältnis von Peptidmenge zu Titandioxidpartikelmenge. Liegt eine im Verhältnis

gesehen zu geringe Menge an TiO2-Beads vor, werden bevorzugt

mehrfachphosphorylierte Peptide angereichert (Li u. a., 2009). Aufgrund der

unterschiedlichen Peptidkonzentrationen in den verschiedenen SCX-Fraktionen, ist

eine Optimierung der Partikelmenge nur bedingt möglich und Phosphopeptidverluste

können nicht ausgeschlossen werden. Das oben Benannte, die unterschiedlichen

Page 62: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

62

Wachstumsmedien und die Analyse unterschiedlicher Wachstumsphasen erklären die

geringen Überlappungen zwischen den Identifizierungsergebnissen.

2.1.5 Dynamik des Phosphoproteoms unter veränderten physiologischen Bedingungen

Die große Stärke der 2D-gelbasierten Methode in Verbindung mit der

phosphosensitiven Pro-Q Diamond-Färbung liegt in der Visualisierungsmöglichkeit der

Dynamik des Phosphoproteoms unter verschiedenen umweltrelevanten Bedingungen.

Hierbei können die Veränderungen via Bildanalyseprogramm (z. B. Decodon Delta2D)

über einen Zeitverlauf detektiert und relativ quantifiziert werden. Vorteilhaft ist auch,

dass nicht nur einzelne Proteine und ihre Isoformen verfolgt werden können, sondern

dass globale Einblicke in die wichtigsten metabolischen Enzyme entstehen und so

ganze Regulationseinheiten in ihrer Gesamtheit analysiert werden können (Hecker

u. a., 2008). Die Untersuchungen zur Dynamik des Phosphoproteoms von B. subtilis

wurden anhand der oben beschriebenen 2D-gelbasierten Phosphoproteommethode

durchgeführt. Um Einblicke in die Regulation von Stressantwort und

Anpassungsmechanismen zu erhalten, wurden die Phosphorylierungs- und

Dephosphorylierungsgeschehnisse anhand der unterschiedlichen Signalintensitäten

phosphorylierter Proteine vor, während und nach Einwirkung des physiologischen

Stimulus untersucht. Die Vorarbeit zu den physiologischen Untersuchungen lieferte

Anja Klutzny (Greifswald) im Rahmen ihrer Diplomarbeit. Im Zuge der hier

vorliegenden Arbeit sollte das Phosphoproteom unter den physiologischen

Bedingungen Hitzestress und Ethanolstress erneut im Vergleich zum exponentiellen

Wachstum untersucht werden, um die vorliegenden Ergebnisse durch die Anwendung

des optimierten Protokolls zu verifizieren und statistisch zu untermauern. Die

Auswertung erfolgte via Decodon Delta2D. Die Ergebnisse flossen in die Arbeit Eymann

u. a. (2007) mit ein und werden im Folgenden dargestellt.

Ein wichtiger Parameter in der Betrachtung von veränderten Signalintensitäten

phosphorylierter Proteine ist die Signifikanzschwelle, über der eine Veränderung als

aussagekräftig angenommen werden kann. Um diese zu ermitteln, wurden die

Abweichungen der Signalintensitäten zwischen drei biologischen Replikaten derselben

Page 63: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 63

physiologischen Bedingung analysiert, in dem die zur Basis 2 logarimierten

Verhältnisse (die log2-Ratios) zwischen den Replikaten gebildet wurden. Hierbei

wurden die Signalintensitäten der korrespondierenden phosphorylierten Proteinspots

aus der exponentiellen Phase miteinander verglichen. Es wurde erwartet, dass bei

einer vollständigen Übereinstimmung der Signalintensitäten der Proteinspots der

biologischen Replikate die log2-Ratio den Wert Null aufweist. In der Abbildung 11

wurden die mittleren log2-Ratios der miteinander ins Verhältnis gesetzten

Signalintensitäten in einer Häufigkeitsverteilung wiedergegeben und die mittlere

Standardabweichung eingezeichnet.

Abbildung 11: Ermittlung der Signifikanzgrenzen (lila-farbene Markierung) anhand der Häufigkeitsverteilung der mittleren log2-Ratios.

Aufgrund der Häufigkeitsverteilung wurde eine Signifikanzgrenze von 1 und -1 gewählt,

die in etwa der doppelten mittleren Standardabweichung entspricht.

Zur Überprüfung der empirisch ermittelten Signifikanzgrenzen wurden in der

Abbildung 12 die gemittelten Ratios für jeden putativ phosphorylierten Spot und deren

jeweiligen Standardabweichungen aufgeführt.

Page 64: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

64

Abbildung 12: Darstellung der mittleren log2-Ratios aus drei biol. Replikaten für jeden einzelnen putativ phosphorylierten Proteinspot. Die Standardabweichungen innerhalb der biol. Replikate wurden als Fehlerbalken aufgeführt und die Signifikanzgrenzen eingezeichnet.

Aus der Abbildung 12 geht hervor, dass schlechtestenfalls eine Falschpositivenrate

(FDR) von 16 % und bestenfalls von 0 % zu erwarten ist. Aufgrund der niedrigen Anzahl

an Datenpunkten, begründet in der niedrigen Anzahl von putativ phosphorylierten

Proteinspots für B. subtilis, ergibt die Betrachtung, dass mit einer gewählten

Signifikanzgrenze von 1 und -1 im logarithmischen Zahlenraum eine optimale Balance

zwischen Sensitivität und Validität geschaffen ist. Diese Grenze wurde für die

nachfolgenden physiologischen Betrachtungen angewendet.

Page 65: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 65

Unter Einfluss von 10 %igem Ethanol-Stress konnten sieben signifikante

Veränderungen in der Signalintensität putativ phosphorylierter Proteine im Vergleich

zu den Intensitäten unter Kontrollbedingungen (mittlere exponentielle Phase) relativ

quantifiziert werden (siehe Abbildung 13). Darunter wiesen RsbRA2a/b (Aktivator der

RsbT Kinase), RsbRB2 (RsbR-Paralog) und Pgm (Phosphoglycerat-Mutase) eine

verstärkte Signalintensität auf. Für die Proteinspots Pyk1, Pyk2 (Pyruvatkinase) und

RsbV (Anti-Anti-Sigmafaktor) wurde eine verminderte Signalintensität detektiert.

Abbildung 13: Log2-Ratios der Signalintensitäten (EtOH-Stresszeitpunkt vs. Kontrollzeitpunkt) der jeweiligen phosphorylierten Proteinspots für die verschiedenen Zeitpunkte. Die Signifikanzgrenzen wurden eingezeichnet.

RsbRA, RsbRB und RsbV sind Teil des SigB-Regulons der generellen Stressantwort. Die

beobachteten Phosphorylierungsereignisse spiegeln Ausschnitte des

Regulationsmechanismus der generellen Stressantwort unter Ethanolstress wider.

Unter Umweltstress, hier durch 10 % EtOH simuliert, findet eine zusätzliche

Phosphorylierung von RsbRA, RsbRB und RsbS des Stressosoms durch die Kinase RsbT

Page 66: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

66

statt, die dadurch aus diesem entlassen wird und die Phosphatase RsbU stimuliert, die

wiederum für die Dephosphorylierung des Anti-Anti-Sigmafaktors RsbV verantwortlich

ist. Durch diese Dephosphorylierungsreaktion (im 2D-Gel-Versuch als Abnahme der

Signalintensität des phosphorylierten RsbV-Spots erkennbar), wird ein

Partnerswitchmechanismus initiiert, der Sigmafaktor SigB daraufhin entlassen und

somit die generelle Stressantwort ausgelöst (Eymann u. a., 2011) (im Detail siehe

Abschnitt 2.1.6).

Abbildung 14: Log2-Ratios der Signalintensitäten (Hitze-Stresszeitpunkt vs. Kontrollzeitpunkt) der jeweiligen phosphorylierten Proteinspots für die verschiedenen Zeitpunkte. Die Signifikanzgrenzen wurden eingezeichnet.

Unter Hitzestressbedingungen (54°C) konnten ebenfalls sieben signifikante

Veränderungen beobachtet werden, darunter eine erhöhte Pro-Q-Signalintensität der

Proteine RsbRA2 (a und b) der SigB-Regulationseinheit, GlyA (Serin-

Hydroxymethyltransferase; allein und in der Mehrfachidentifizierung), PdxS (Pyridoxal-

Page 67: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 67

5'-Phosphat-Synthase; Spot 1 und 3) und GuaB1 (Inosin-Monophosphat-

Dehydrogenase (siehe Abbildung 14).

Das auftretende Signal des zweiten phosphorylierten RsbRA2-Proteins ist ebenfalls

durch den Mechanismus der generellen Stressantwort erklärbar (siehe oben).

Die vorliegenden signifikanten Veränderungen konnten durch einen Vergleich mit den

von Anja Klutzny durchgeführten Untersuchungen validiert werden. Ferner wurden

diese Analysen in die Auswertung für Eymann et al. 2007 mit aufgenommen und

vervollständigten somit die Untersuchungen zum Phosphoproteom von B. subtilis.

2.1.6 Untersuchung des Phosphoproteoms einer B. subtilis sigB-Mutante

Durch die Präsenz von mehreren alternativen Sigmafaktoren ist B. subtilis in der Lage,

bei sich ändernden Umweltbedingungen das Transkriptionsprogramm global

umzustrukturieren und sich somit an die jeweilige physiologische Situation anzupassen

(Gruber & Gross, 2003). Einer der bedeutendsten und am längsten bekannten ist der

alternative Sigmafaktor B. Über ihn wird die Expression der Proteine der generellen

Stressantwort, mit der sich die Zelle eine vielseitige, unspezifische und vorbeugende

Stressresistenz aufbaut, reguliert (Hecker & Völker, 2001; Hecker u. a., 2007; Price u.

a., 2001). Wichtige Ereignisse in dem Regulierungsprozess sind Phosphorylierungs- und

Dephosphorylierungsreaktionen bei der Weiterleitung von Umweltsignalen. Eine

kürzlich veröffentlichte Mikroarray-basierte Studie einer sigB-Mutante zeigt, dass

insgesamt 196 Gene unter die Regulation des SigB-Regulons fallen und verdeutlicht

somit die große Reichweite des SigB Regulons (Nannapaneni u. a., 2012).

In einem Vergleich zwischen den für B. subtilis im 2D-Gel identifizierten

phosphorylierten Proteinen (diese Arbeit und Eymann u. a. 2007) und den von

Petersohn u. a. sowie Nanapanenni und Mitarbeitern erstellten Array-Daten über die

SigB-abhängigen Gene zeigte sich, dass nur zwei im Gel identifizierte phosphorylierte

Proteine als SigB-abhängig detektiert werden konnten. Hierbei handelt es sich um den

Anti-Anti-Sigmafaktor RsbV und das RsbRA-Homolog RsbRD (YqhA) (Nannapaneni u. a.,

2012; Petersohn u. a., 2001). Folglich wurden in der Gegenüberstellung von Wildtyp

Page 68: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

68

und Mutante unter exponentiellen Wachstumsbedingungen Veränderungen in der

Signalintensität bezüglich dieser beiden phosphorylierten Proteine erwartet.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Phosphoproteom einer isogenen sigB-Mutante

(ML6 = trpC2 ∆sigB CmR (Igo u. a., 1987)) im Hinblick auf SigB-abhängige oder SigB-

unabhängige Phosphorylierungsgeschehnisse untersucht. Dabei wurde das

Phosphoproteom des Wildtyps mit dem der sigB-Mutante während des exponentiellen

Wachstums und nach Einwirkung verschiedener Stressbedingungen verglichen.

Abbildung 15: Zweikanalfarbenbild der Pro-Q-Bilder des WT (gün) und der sigB-Mutante (rot). Die beiden Proteine, bei denen eine signifikant und reproduzierbare Veränderung der Pro-Q Signalintensität zu detektieren war, wurden mit einer grünen Beschriftung versehen.

Page 69: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 69

Die Studien beruhten auf der oben beschriebenen 2D-Gel- und Pro-Q-basierten

Phosphoproteommethode. In Abbildung 15 ist das Zweikanalfarbenbild der Pro-Q-

Färbungen Wildtyp exponentielle Phase (grün) versus sigB-Mutante exponentielle

Phase (rot) dargestellt.

Die identifizierten putativ phosphorylierten Proteinspots wurden markiert und die

Signalintensitäten der korrespondierenden Phosphoproteine quantifiziert. Aus den

Quantifizierungsergebnissen geht hervor, dass der Anti-Anti-Sigmafaktor RsbV und das

RsbR-Homologen YqhA (heute RsbRD) in der sigB-Mutante ein signifikant vermindertes

Signal gegenüber den Signalen der WT-Proteine aufweisen (siehe Abbildung 16 und

Abbildung 17).

Weitere Proteine der SigB-Regulationseinheit, wie z. B. RsbRA, wiesen keine

Veränderungen auf.

Abbildung 16: Gegenüberstellung von Bildausschnitten aus den Gelbildern der Flamingo- und Pro-Q-Färbungen. Die jeweils veränderten Proteine YqhA und RsbV wurden eingekreist.

SigB wird in der Abwesenheit von Stress durch die Komplexbildung mit seinem Anti-

Sigmafaktor RsbW inhibiert. Gleichzeitig wirkt RsbW als Kinase und phosphoryliert den

Anti-Anti-Sigmafaktor RsbV am Serin 56 (Lévine u. a., 2006; Macek u. a., 2007). Der

Phosphorylierungsstatus von RsbV ist entscheidend für das Auslösen der generellen

Stressantwort. Bei beginnendem Stress oder Hunger wird jeweils eine spezifische

Phosphatase aktiviert (RsbP bei Energielimitation und Hunger; RsbU innerhalb des

Stressosoms bei plötzlichen Umweltstimuli wie z. B. Hitze), die RsbV dephosphoryliert.

Page 70: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

70

Abbildung 17: Graphik der log2-Ratios der Signalintensitäten ML6 versus WT (Pro-Q-Färbung). Die Ratios für beide Proteine liegen über der Signifikanzschwelle von -1. Die Standardabweichung aus drei biologischen Replikaten wurde als Fehlerbalken dargestellt.

Diese Dephosphorylierungsreaktion löst den entscheidenden Partnerwechsel aus, bei

dem RsbV und RsbW einen Komplex eingehen, und dabei SigB von RsbW entlassen

wird. Der dann freie Sigmafaktor bildet einen Komplex mit dem Core-Enzym und die

Gene der generellen Stressproteine werden transkribiert (Eymann u. a., 2011; Hecker

& Völker, 2001; Hecker u. a., 2007; Price u. a., 2001). Bei Eintritt eines Umweltstimulus

wie beispielsweise Hitze oder Ethanol findet im Stressosom ebenfalls ein

Partnerswitchmechanismus statt. Die beteiligten Akteure sind die RsbR-Homologen,

die das Stresssignal wahrnehmen und die Kinase RsbT, die in einem Komlpex mit ihrem

Antagonisten RsbS und den RsbR-Homologen vorliegt. Tritt nun eine Stresssituation

ein, phosphoryliert RsbT seinen Antagonisten RsbS und wird somit aus dem Komplex

entlassen und kann die Phosphatase RsbU aktivieren (Eymann u. a., 2011).

In der Abbildung 18 sind der Mechanismus mit den verantwortlichen Enzymen und

deren Phosphorylierungs- bzw. Dephosphorylierungsreaktionen sowie die

Operonstruktur skizziert (modifizierte Abbildung nach Hecker et al 2007, Eymann et al.

2011). Die Phosphoproteine, die in der sigB-Mutante ein signifikant verringertes Pro-Q

Signal aufwiesen, wurden farbig markiert, damit deren Rolle in dem

Regulationsmechanismus deutlich wird.

-6

-4

-2

0

log2

-Rat

io

log2-Ratios der Signalintensitäten sigB-Mutante vs. WT

YqhA RsbV1

Page 71: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 71

A)

B)

Abbildung 18: Skizzierte Darstellung A) der Operonstruktur des SigB-Regulons und B) der Regulation der generellen Stressantwort (modifiziert nach (Eymann u. a., 2011; Hecker u. a., 2007). Die Kinasen (rosa), die Phosphatasen (gelb), die Phosphorylierungen (rot) und das Stressosom (blauer Stern) wurden besonders hervorgehoben. Die Charakteristika der sigB-Mutante wurden einerseits durch Kreuze verbildlicht, andererseits wurden die in ihrem Phosphorylierungsstatus betroffenen Proteine grau markiert. Aufgrund der Übersichtlichkeit beschreibt der dargestellte Mechanismus nicht die Feedbackreaktionen.

Die verminderten bzw. fehlenden Signale (Pro-Q-Färbung) von RsbV und RsbRD (YqhA)

sind im Hinblick auf die Operonstruktur erklärbar (siehe Abbildung 18). Aufgrund des

fehlenden SigB-Proteins werden die Gene von RsbV und RsbW nur auf einem SigA-

Page 72: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

72

abhängigen Basislevel transkribiert, das deutlich unter dem normalen Basisniveau liegt,

wenn beide Promotoren aktiv sind (siehe Operonstruktur). Das heißt, dass das

verminderte Signal des phosphorylierten RsbVs auf die verminderte Gesamtmenge von

RsbV zurückzuführen ist

Das fehlende Phosphorylierungssignal von RsbRD in der sigB-Mutante lässt sich

ebenfalls auf das Fehlen des Sigmafaktors SigB zurückführen. RsbRD wird als

SigB-abhängig und als Paralog von RsbRA beschrieben (Petersohn u. a., 1999); das Gen

ist jedoch nicht im selben Operon wie rsbRA lokalisiert. Gemäß Reeves und

Mitarbeitern, wird das rsbRD-Gen unter normalem Wachstum nur gering exprimiert

(aufgrund des fehlenden SigA-Promotors), wohingegen es eine starke SigB-abhängige

Expression unter EtOH-Stress zeigt (Reeves u. a., 2010). Daher ist das fehlende

Phosphorylierungssignal mit der fehlenden Menge an RsbRD-Protein begründenbar.

Das Gleichbleiben des Phosphorylierungssignals von RsbRA ist damit zu erklären, dass

das RsbRA- und das RsbT-Gen unter der Kontrolle des allgemeinen Sigmafaktor A

stehen und somit die Menge von exprimierten RsbRA und RsbT im WT und in der sigB-

Mutante gleich ist. RsbT ist als Kinase für die RsbRA und RsbRB/C/D

Phosphorylierungen verantwortlich (Akbar u. a., 2001; Eymann u. a., 2011) und folglich

bleibt das Phosphorylierungssignal von RsbRA in der Mutante bestehen.

Um einen Überblick über den Einfluss von SigB auf Phosphorylierungs- und

Dephosphorylierungsreaktionen bei Veränderungen von physiologischen Bedingungen

zu bekommen, wurde im Rahmen dieser Arbeit das Phosphoproteommuster der

sigB-Mutante unter drei verschiedenen physiologischen Bedingungen analysiert. Es

wurden die beiden Stressstimuli Ethanol (EK: 10 %) und Hitze (54°C), die über das

Stressosom wahrgenommen werden, als auch Glukosehunger, die über die

Phosphatase RsbP die generelle Stressantwort auslöst, untersucht. Bei keinem der drei

Stimuli konnten signifikante und reproduzierbare Veränderungen in den

Phosphorylierungssignalen im Vergleich zum WT beobachtet werden. Daraus kann

geschlussfolgert werden, dass die Mutation im sigB-Gen nur auf das

Phosphorylierungsgeschehen innerhalb des Regulons Auswirkungen hat, aber keinen

Einfluss auf den Phosphorylierungsstatus der im 2D-Gel visualisierbaren

phosphorylierten Proteine.

Page 73: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 73

2.1.7 Phosphotyrosin-Detektion via 2D-Westernblot

Aufgrund des sehr geringen Anteils an phosphorylierten Tyrosinen wurde ein Weg

gesucht, die am Tyrosin phoshorylierten Proteine im Speziellen zu visualisieren. Des

Weiteren wurde ein Vergleich des Wildtyps mit einer Tyrosinphosphatasemutante

angestrebt, um die spezifischen Zielproteine der Tyrosinphosphatase identifizieren zu

können.

Die Untersuchungen erfolgten mit dem Phospho-Tyrosin Antikörper P-Tyr-100 der

Firma Cell Signaling. Laut Hersteller soll P-Tyr-100 eine hohe Affinität zu

phosphorylierten Tyrosinresten aufweisen. Diese Bindungsaffinität wäre unabhängig

von den umliegenden Aminosäuren und eine Kreuzreaktion mit phosphorylierten Serin

und Threoninresten soll nicht auftreten. Des Weiteren erwartet der Hersteller eine

Bindungsaffinät zu Tyrosin-phosphorylierten Peptiden aller Spezies.

Als Versuchsstämme wurde B. subtilis in seiner Wildtypform sowie eine yfkJ-

Tyrosinphosphatase-Deletionsmutante (PB645) und eine yfkJ-Tyrosinphosphatase-

Überexpressionsmutante (PB 1024) gewählt (Musumeci u. a., 2005). Alle drei Stämme

wurden freundlicherweise von Chester Price (University of California Davis) zur

Verfügung gestellt. Für den WT wurden 2D-Gel Westernblots angefertigt, um einen

Überblick über die bestehenden Tyrosin-Phosphorylierungen zu erhalten. In Abbildung

19 wurde das Bild des 2D-Gel Westernblots vom WT und ein Zweikanalfarbenbild des

WT, bei dem die Pro-Q-Färbung (rot) und die Gesamtproteinfärbung Flamingo (grün)

verdeutlicht wurden, gegenübergestellt.

Auf dem Westernblot konnten 169 Antikörper markierte Proteinspots identifiziert

werden (mit Decodon Delta2D). Im Gegensatz dazu konnten im Zweikanalfarbenbild 49

am Serin/Threonin oder Tyrosin putativ phosphorylierte Proteine ermittelt werden.

Folglich lässt der Vergleich zwischen Westernblot (in der Abbildung oben) und dem

Zweikanalfarbenbild der Gesamtproteinfärbung versus Pro-Q (unten) auf eine geringe

Spezifität des Antikörpers schließen.

Bei Macek und Mitarbeitern konnte 2007 in einem globalen Phosphoproteomansatz

gezeigt werden, dass nur 10 Prozent der gefundenen Phosphorylierungsstellen eine

Tyrosinphosphorylierung aufweisen (Macek u. a., 2007) und demonstrieren somit die

geringe Häufigkeit von Phosphorylierungsereignissen am Tyrosin.

Page 74: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

74

Abbildung 19: Vergleich des 2D-Gel Phosphotyrosin-Antikörper Westernblots (oben) mit dem Zweikanalfarbenbild Flamingo vs. Pro-Q (unten.) Auffallend ist die deutliche Überzahl der Antikörper markierten Proteinspots gegenüber den identifizierten putativ phosphorylierten Proteinen der Pro-Q Färbung.

Die Ergebnisse des Westernblots zeigen jedoch die Detektion einer großen Anzahl von

Proteinen mit einer vermeintlichen Tyrosinphosphorylierung. Die Spezifität des

Antikörpers reicht demnach nicht aus, um Proteine mit Phosphorylierungen am

Tyrosin zu identifizieren.

Page 75: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 75

Somit wurde diese Methode für einen Vergleich der Tyrosinphosphatasemutante und

der Überexpressionsmutante als nicht geeignet angesehen. Anzustreben ist eine

Verbesserung des Westernblots durch spezifischere Phospho-Tyrosin-Antikörper.

2.1.8 Anreicherung von Proteinkinasen mittels Kinaseinhibitoren

Eine Vielzahl der identifizierten phosphorylierten Proteine konnte bisher noch keiner

spezifischen Kinase als Zielprotein zugeordnet werden. Ein im Rahmen dieser Arbeit

durchgeführtes 2D-gelbasiertes Kinase- und Phosphatasemutantenscreening brachte

keine neuen Zielproteine hervor (vier Kinase- und drei Phosphatasemutanten wurden

in der exponentiellen Phase, sowie unter verschiedenen physiologischen Bedingungen

untersucht, Daten nicht gezeigt). Daher stand das Auffinden neuer, unbekannter

Kinasen im Vordergrund. Hierbei sollten nun die unbekannten Kinasen unter Einsatz

von Kinaseinhibitoren angereichert und massenspektrometrisch analysiert werden.

Diese Arbeit entstand in Kooperation mit der Gruppe von Prof. Dr. Lothar Jänsch (HZI

Braunschweig) unter der Anleitung von Dr. Josef Wissing.

Die Kinaseinhibitoren stellen eine Gruppe von niedrigmolekularen Liganden dar, die

eine ATP-kompetitive Eigenschaft aufweisen (Cohen, 2002; Godl u. a., 2003; Hidaka u.

a., 1984; Wissing u. a., 2004). 1978 stellte Erikson fest, dass der Transformationsfaktor

Src des Avian sarcoma Virus die Funktion einer Proteinkinase aufweist, die in

Säugetierzellen als Onkogen fungiert (Collett & Erikson, 1978). Mit dieser Erkenntnis

startete die Suche und Entwicklung von Kinaseinhibitoren. In der heutigen Zeit werden

Kinaseinhibitoren als Therapeutika bei humanen Krankheiten eingesetzt (insbesondere

bei Krebs), um gezielt regulatorische Mechanismen zu inhibieren, die durch abnormale

Phosphorylierungsreaktionen entstehen (Cohen, 2002). Sie werden jedoch ebenso als

Hilfsmittel zur physiko-chemischen Charakterisierung und zur Anreicherung von

Proteinkinasen eingesetzt (Brehmer u. a., 2005; Wissing u. a., 2004, 2007).

Lothar Jänsch und Josef Wissing entwickelten eine Fraktionierungstechnik, die auf

einer Auftrennung an vier verschiedenen immobilisierten Kinaseinhibitoren beruht, die

jeweils unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Wissing u. a., 2007). Gemäß ihrem

Protokoll fand im Rahmen dieser Arbeit eine Anreicherung von Kinasen aus einem

Page 76: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

76

zytosolischen Proteinextrakt von B. subtilis unter Einsatz von vier an Sepharosebeads

gekoppelten eukaryotischen Kinaseinhibitoren (PP58, Purvalanol B (PurB),

BisindolylmaleimideX (BisX) und AX14596) statt. Abweichend von dem oben

aufgeführten Protokoll wurden zwei unterschiedliche Anreicherungsschritte

vorgenommen. Beim ersten Schritt wurde der Proteinextrakt in einem "Batchansatz"

mit dem an Sepharose gekoppelten Inhibitor PP58 inkubiert. Nachfolgend wurde der

Überstand chromatographisch mithilfe eines Äkta Explorers über drei

hintereinandergeschaltete Säulen, die jeweils einen Inhibitor enthielten, aufgetrennt.

Die Reihenfolge entsprach den Inhibitoren Bis --> AX14596 --> Pur. Elutionen mit

Eluent B (20 mM MgCl2, 5 mM AMP-PNP, 5 mM ADP, 1 mM vom korrespondierenden

freien Inhibitor und allen Additiven (50 mm HEPES, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.5 % Triton X-

100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mM NaF, and 0.1 mM Natriumorthovanadat))

erfolgten für die beiden Anreicherungsansätze getrennt. Die Eluate wurden

massenspektrometrisch analysiert.

Mit dieser Methode konnten zwei bekannte Proteinkinasen angereichert und

massenspektrometrisch identifiziert werden. Hierbei handelt es sich um die

Zweikomponentensystem-Sensorkinase DegS und die Kinase PrkC, welche in beiden

Aufreinigungsansätzen detektiert werden konnten. Bei PrkC handelt es sich um eine

bakterielle Proteinkinase, die Ähnlichkeiten zu eukaryotischen Hanks-Kinasen besitzt

und die in der N-terminalen katalytischen Region 10 der 12 konservierten Motive

aufweist. Aufgrund der eukaryotischen Charakteristika wurde eine Anreicherung dieser

Kinase in diesem Versuch erwartet. PrkD, ebenfalls eine Hanks-ähnliche Kinase von

B. subtilis, konnte nicht identifiziert werden.

Des Weiteren wurden sechs nicht-proteinogene Kinasen (FruK, GlpK, ThiD, ProB, Dck

und MtnK) und vier Proteine mit putativer Kinase bzw. Phosphotransferaseaktivität

(PtsG, SacP, TreP und ManP) in der Anreicherung identifiziert (siehe Tabelle 8).

Page 77: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 77

Tabelle 8: Identifizierungsergebnisse der Kinaseanreicherung via Kinaseinhibitoren.

Proteinkinasen:

DegS

2K-Sensor-Histidinkinase

PrkC putativ Membran verlinkte Proteinkinase

Kinasen/Phosphotranferasen: FruK Fruktose-1-phosphat-Kinase GlpK Glycerolkinase ThiD putative Phosphomethylpyrimidinkinase ProB Glutamat-5-kinase Dck Desoxyadenosin-/Desoxycytidinkinase MtnK Methylribosekinase PtsG Kinase-/Phosphotransferaseaktivität SacP Kinase-/Phosphotransferaseaktivität TreP Kinase-/Phosphotransferaseaktivität ManP Kinase-/Phosphotransferaseaktivität

Abbildung 20: Identifizierungsergebnisse der bakteriellen Kinaseanreicherung via Kinaseinhibitoren.

Page 78: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

78

In der Abbildung 20 sind die identifizierten Proteine gemäß ihrem Bekanntheitsgrad

und potentieller Kinaseaktivität eingeordnet.

Hierbei wird deutlich, dass der Großteil, nämlich 69 % (102 Proteine) der identifizierten

Proteine, bekannte Proteine ohne Kinasefunktion darstellen. Außerdem konnten 24

unbekannte Proteine detektiert werden, denen jedoch aufgrund von Ähnlichkeiten

Funktionen zugeordnet wurden.

Fraglich war, ob sich unter den Proteinen unbekannter Funktion unbekannte

Proteinkinasen befinden. Insgesamt konnten 20 von insgesamt 148 Proteinen mit

gänzlich unbekannter Funktion detektiert werden, davon 12 im PP58- und acht im

PurB/AX14596/BisX-Ansatz. Das entspricht einem Anteil von ca. 15 % (siehe Abbildung

20).

Die unbekannten Proteine wurden einer Motivsuche mit Interproscan (Hunter u. a.,

2009) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan) und einer Charakterisierung anhand

der UniprotKB (© 2002–2011 UniProt Consortium) unterzogen. Die Ergebnisse sind in

Tabelle 9 zusammengefasst.

Zwei aus der Gruppe der Proteine mit unbekannter Funktion (YtmP und YerI) weisen

eine putative Phosphotransferaseaktivität auf. Mit Interproscan konnte in diesen

jeweils eine Proteinkinase-ähnliche Domäne identifiziert werden. Jedoch handelt es

sich vermutlich nicht um potentielle Proteinkinasen, sondern um Aminoglycosid-

Phosphotransferasen.

Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass es möglich ist, bakterielle Kinasen

bzw. Phosphotransferasen mithilfe eukaryotischer Kinaseinhibitoren anzureichern und

zu identifizieren. Der größte Teil der angereicherten, identifizierten Proteine stellt

jedoch keine Kinasen dar, sondern Proteine mit bekannter Funktion. Die Verteilung

über die einzelnen funktionellen Gruppen ist in dem Balkendiagramm in der Abbildung

21 dargestellt.

Der Hauptanteil der identifizierten angereicherten bekannten Proteine lässt sich in die

Gruppen der Transport-, Bindungs- und Lipoproteine sowie Proteine der

Membranelektronentransportkette und ATP-Synthasen einordnen. Außerdem wurden

ebenfalls Proteine des Aminosäuremetabolismus und ribosomale Proteine in erhöhter

Weise identifiziert.

Page 79: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 79

Tabelle 9: Ergebnisse der Motivsuche mit Interproscan 4.8 und der Datenbankrecherche mit Uniprot KB.

UniprotKB / Interproscan 4.8

unbekannte Proteine: YabN YdcE NTP-Pyrophosphohydrolase MazG-verwandt, Bacilli YdfG YerH YerI Proteinkinase-ähnliche Domäne (Superfamilie) / Aminoglycosid-Phosphotransferase

YheA Phosphoprotein YheB YhfP NADP-Bindung YjlC YjlG YjoA Phosphoprotein YneP YozB YpmS YqfA YtmP Proteinkinase-ähnliche Domäne (Superfamilie) / Aminoglycosid-Phosphotransferase YubA YuiF YvbJ YxkC

unbekannte Proteine mit Ähnlichkeiten: YdaF YdeQ YdgI NADP YfiR YfiY Phosphoprotein

YfmT YhjG: YodC NADP YokG YonS YpfD Phosphoprotein YurT YwjH Phosphoprotein YxeB

Page 80: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

80

Abbildung 21: Quantitative Einordnung der identifizierten bekannten Proteine in physiologische Gruppen. Etwaige vorhandene ATP-Bindungsstellen und/oder Phosphorylierungen wurden farblich dargestellt.

In der Abbildung 21 wurden ebenfalls die Anzahl der identifizierten Proteine mit ATP-

Bindestellen sowie Phosphorylierungsstellen abgebildet. Erkennbar ist hieraus, dass

nur ein geringer Anteil der identifizierten bekannten Proteine eine ATP-Bindungsstelle

besitzt und dies somit verdeutlicht, dass ein Großteil der bekannten Proteine

unspezifisch an die Kinaseinhibitoren bindet.

Der Anteil an Proteinkinasen beträgt in diesen Analysen 1,3 %. Im Vergleich zu den

Ergebnissen der Anreicherung von eukaryotischen Kinasen von Josef Wissing zeigt sich

dort eine Anreicherungseffizienz von 24-63 %, wobei sich PurB als der effektivste

Inhibitor zeigte (Wissing u. a., 2007).

Page 81: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 81

Das vorherrschende Ziel der Untersuchungen war die Anreicherung und Identifizierung

von unbekannten Proteinkinasen. Durch die große Anzahl an identifizierten Proteinen

mit bekannter Funktion konnte nicht durch die alleinige Identifizierung eines Proteins

darauf geschlossen werden, dass es sich bei allen unbekannten Proteinen um

Proteinkinasen handelt. Die geringe Deckungsgleichheit zwischen den beiden

Anreicherungsansätzen (PP58 gegenüber PurB/AX14596/BisX) könnte die

unterschiedliche Spezifität ebenso wie die generelle Unspezifität der Kinaseinhibitoren

in Bezug auf bakterielle Systeme aufzeigen.

Erst durch eine Motivsuche in Verbindung mit einer Datenbankrecherche konnten von

den 15 % angereicherten unbekannten Proteinen zwei als putative Proteinkinasen

bzw. Phosphotransferasen identifiziert werden.

Folglich ist die auf eukaryotische Kinaseinhibitoren beruhende Anreicherungsmethode

für bakterielle Systeme zu unspezifisch, um eine alleinige Kinaseselektion aufgrund der

Identifizierungsergebnisse vornehmen und unbekannte Proteinkinasen sicher

detektieren zu können.

Page 82: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

82

2.2 Das Phosphoproteom von Staphylococcus aureus

Begonnen wurden die Analysen zum Phosphoproteom von S. aureus mit einer

Detailanalyse des Anti-Anti-Sigmafaktors RsbV der generellen Stressantwort. In einer

Kooperation mit Jan Pané-Farré (Inst. f. Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität,

Greifswald) wurde die spezifische Phosphorylierungsstelle des Anti-Anti-Sigmafaktors

RsbV massenspektrometrisch analysiert. Anschließend folgten globale Untersuchungen

des Phosphoproteoms von S. aureus zum einen gelbasiert mit der zuvor für B. subtilis

optimierten Pro-Q basierten 2D-Gel Methode (siehe Abschnitt 2.1.1) und zum anderen

gelfrei mit dem Phosphopeptidanreicherungsansatz gemäß Olsen und Macek (Olsen

und Macek, 2009).

2.2.1 Identifizierung der P-Stelle von RsbV aus S. aureus via "negative-mode" an der Q-Trap4000

Eine erste Abwehrbarriere des mikrobiellen Organismus gegenüber äußerlichen

Umweltbedingungen oder Wirtseinflüssen stellt die generelle Stressantwort (siehe

2.1.6) dar. In dem ebenfalls Gram-positiven Bakterium B. subtilis findet eine

Dephosphorylierung des Anti-Anti-Sigmafaktors RsbV durch RsbU unter

umweltbedingter Stresseinwirkung statt. Diese Reaktion löst die Aktivierung des

Sigmafaktors B und somit die generelle Stressantwort aus. Die hierbei entscheidende

Phosphorylierungsstelle des RsbV Proteins wurde am Serin 56 beschrieben (Hecker u.

a., 2007; Macek u. a., 2007; Price u. a., 2001). Für detailliertere Einblicke in den

Mechanismus bei S. aureus wurde die Rolle der Proteinphosphatase RsbU bei

auftretendem alkalischem Stress näher untersucht (Jan Pané-Farré, Inst. f.

Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald). Unter anderem sollte

hierbei die spezifische Phosphorylierungsstelle im RsbV Protein von S. aureus in einer

massenspektrometrisch basierten Analyse detektiert und eventuelle Homologien zu

B. subtilis aufgedeckt werden.

Jan Pané-Farré stellte den in E. coli überexprimierten, aufgereinigten, in vitro

phosphorylierten und im 1D-Gel aufgetrennten Anti-Anti-Sigmafaktor RsbV zur

Verfügung (Pané-Farré u. a., 2009). Die dem phosphorylierten RsbV-Protein

Page 83: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 83

entsprechende Gelbande wurde trypsiniert und die entstandenen RsbV-Peptide

wurden der massenspektrometrischen Analyse (MS-Analyse) zugeführt, die im Rahmen

der hier vorliegenden Arbeit durchgeführt wurde.

Die MS-Analyse erfolgte an der Q-Trap4000 (Applied Biosystems MDS Sciex), die mit

einem Dionex-HPLC-System (Dionex, LC Packings) kombiniert wurde. Es wurde hiermit

eine Technologie gewählt, die die selektive auf einem Triple-Quadrupol basierende

Tandem-Massenspektrometrie mit den sensitiven Produktionenscans der Ionenfalle

kombiniert und somit eine schnelle Identifizierung von Peptiden, die in sehr geringen

Konzentrationen vorliegen, wie z. B. Phosphopeptide, ermöglicht (Le Blanc u. a., 2003;

Hager, 2002; Williamson u. a., 2006).

Das hier angewandte Messverfahren bestand in einer informationsabhängigen

Akquisitionsmethode, bei der ein Vorläuferionenscan im negativen Ionenmodus den

für Serin und Threonin spezifischen Neutralverlust von m/z -79 Da detektiert und bei

Auftreten des Neutralverlust-Fragmentions ein MS/MS-Event für das Vorläuferion im

positiven Ionenmodus auslöst. Mit dieser Methode können somit speziell die

phosphorylierten Peptide detektiert, fragmentiert und mit Massenanalysatoren

analysiert werden.

Die Schwierigkeit bestand in der Erlangung eines stabilen Sprays während der

negativen Ionisierung der Peptide. Zur Erzeugung des Elektrosprays wurde eine

NanoSpray II-Quelle benutzt, in der ein MicroIonSpray II-Kopf mit einem T-Stück

implementiert war. Durch dieses T-Stück war es möglich, nicht nur das Eluat aus der

HPLC, sondern auch ein zusätzliches Lösungsmittel zur Erhöhung der

Ionisierungseffizienz und zur Verbesserung des Sprays dem Sprayprozess zuzuführen.

Als additives Lösungsmittel wurden 80 % (v/v) Isopropanol, 10 % (v/v) Acetonitril,

0,1 % (v/v) Essigsäure verwendet (Christoph Lenz, Applied Biosystems MDS Sciex).

Insgesamt wurden 200 nl/min Eluat aus der HPLC mit 100 nl/min zusätzlichem

Lösungsmittel (aus einer externen Spritzenpumpe) dem Sprayprozess zugeführt. Es

fand vor den Probenläufen eine Optimierung der an der Nadel anliegenden Spannung

anhand eines Gemischs aus 90 % Eluent A und 10 % Eluent B (aus der HPLC) und dem

oben beschriebenen Lösungsmittel statt. Die der massenspektrometrischen Analyse

Page 84: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

84

anschließenden Datenanalyse erfolgte manuell mit dem Analyst- bzw. Bioanalyst-

Programm der Q-Trap4000.

Mit dieser massenspektrometrischen Analysemethode gelang es, die spezifische

Phosphorylierungsstelle von RsbV am Serin 57 zu identifizieren (siehe Abbildung 22)

und somit einen Homologiezusammenhang zu B. subtilis herzustellen; diese Ergebnisse

flossen in die Arbeit von Jan Pané-Farré mit ein (Pané-Farré u. a., 2009).

Abbildung 22: MS/MS-Spektrum des phosphorylierten RsbV Peptides. Die dem Peptid zugeordneten Fragmentionen der y-Ionenserie wurden markiert und die spezifische phosphorylierte Aminosäure im Spektrum als auch in der Aminosäuresequenz kenntlich gemacht. Dieses Spektrum wurde etwas modifiziert in die Arbeit von Jan Pané-Farré mit aufgenommen (Pané-Farré u. a., 2009).

Diese Phosphorylierungsstelle konnte in den unten dargestellten globalen Analysen

zum Phosphoproteom von S. aureus bestätigt werden (siehe Tabelle 10).

Page 85: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 85

2.2.2 Globale Analysen zum Phosphoproteom von S. aureus

Um Einblicke in die durch Phosphorylierungsereignisse gesteuerten

Regulationsmechanismen zu erhalten, sollte im Rahmen dieser Arbeit global das

cytoplasmatische Phosphoproteom von S. aureus untersucht werden.

In einer früheren Studie von Lomas-Lopez und Mitarbeitern konnten diesbezüglich

unter Verwendung von 2D-PAGE und in vivo 32P-Markierung insgesamt 11

phosphorylierte Proteine identifiziert werden (Lomas-Lopez u. a., 2007). Die Studie

beinhaltete jedoch keine weitere Spezifizierung der jeweiligen

Phosphorylierungsstelle, konnte aber durch in vitro Analysen neun dieser

phosphorylierten Proteine als Substrate einer Serin-Threonin-Kinase (homolog zu PknB

Donat u. a., 2009) detektieren.

Aufgrund der im Vergleich zu anderen bakteriellen Phosphoproteomen geringen

Anzahl an bisher identifizierten phosphorylierten Proteinen und dem Fehlen der

Spezifizierung der genauen Phosphorylierungsstellen, sollten gelbasierte und gelfreie

Untersuchungen durchgeführt werden, um umfassendere Einblicke in das

Phosphoproteom von S. aureus zu gewinnen.

2.2.2.1 2D-gelbasierte Analyse des Phosphoproteoms von S. aureus

Die gelbasierten Analysen wurden mit dem für B. subtilis optimierten Protokoll

durchgeführt (siehe Abschnitt 2.1.1 und 2.1.2). Die Detektion der phosphorylierten

Proteine erfolgte mithilfe des phosphosensitiven Farbstoffes Pro-Q Diamond und dem

Vergleich zur Gesamtproteinfärbung (Flamingo). Der Fokus lag vorerst auf der

Erstellung einer 2D-Gel-Phosphoproteomreferenzkarte. In Vorversuchen zeigte sich,

dass der größte Anteil an putativ phosphorylierten Proteinspots im pH-Bereich 4,5 bis

5,5 lokalisiert ist. Daher konnten Zoomgele im pH-Bereich 4,5-5,5 verwendet werden,

die zu einer verstärkten Protein-Auftrennung im Vergleich zum pH 4-7 Standardgel

führten (siehe Abbildung 23).

Page 86: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

86

Abbildung 23: Vergleich der Auflösungsunterschiede zwischen Gelen im pH-Bereich 4-7 und 4,5-5,5 . Drei Beispielproteine wurden aufgezeigt. Die phosphorylierten Proteine wurden falschfarben rot dargestellt und mit einer Umrandung versehen. Die unphosphorylierten Proteine wurden falschfarben grün-gelb angefärbt. Augenfällig ist die bessere Trennung der Proteine im Zoomgel pH 4,5-5,5. Besonders eindrucksvoll ist die deutliche Separierung der phosphorylierten Proteine SACOL0564 und AhpF, die erst durch die Verwendung des Zoomgels als zwei unterschiedliche Proteinspots wahrgenommen werden konnten.

Die Abbildung 23 verdeutlicht die verbesserte Trennung der Proteinspots in

horizontaler Ebene im Zoomgel. Für die drei putativen phosphorylierten Spots des

Proteins DeoB konnte eine Separierung von einem hoch abundanten,

unphosphorylierten Protein erzielt werden. Die beiden Proteine SACOL0564 und AhpF,

die jeweils in drei putativ phosphorylierten Isoformen im Gel vorliegen, konnten erst

durch die Auftrennung im Zoomgel voneinander unterschieden werden. Dies

ermöglichte im weiteren Versuchsgeschehen eine eindeutigere Identifizierung und

eine verbesserte relative Quantifizierung der Signalintensitäten der phosphorylierten

Proteine. Durch die erhöhte Proteinladungskapazität von 400 µg des pH 4,5-5,5 IPG-

Streifens gegenüber 200 µg des pH 4-7 IPG-Streifens stand die doppelte Menge an

phosphoryliertem Protein für die massenspektrometrische Analyse zur Verfügung und

Page 87: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 87

dies steigerte somit die Identifizierungswahrscheinlichkeit für die spezifische

Phosphorylierungsstelle.

Es konnten jeweils für beide pH-Bereiche Phosphoproteommasterkarten erstellt

werden. Hierfür wurden die phosphorylierten Proteine im 2D-Gel mit dem Pro-Q-

Farbstoff angefärbt. Unter Zuhilfenahme der Gesamtproteinfärbung (Flamingo) konnte

unter Bildung der Ratio zwischen Pro-Q- und Flamingosignalintensitäten der zu

quantifizierenden Proteinspots die putativ phosphorylierten Proteine ermittelt werden

(siehe Abschnitt 2.1.2). Die detektierten Phosphoproteine wurden aus dem Gel

ausgeschnitten, trypsiniert und massenspektrometrisch analysiert.

In der Abbildung 24 und der Abbildung 25 sind die Phosphoproteommasterkarten der

zwei pH-Bereiche in Form von Zweikanalfalschfarbenbildern dargestellt. Alle putativ

phosphorylierten und massenspektrometrisch identifizierten Proteinspots wurden mit

der entsprechenden Protein-Abkürzung markiert.

Insgesamt konnten unter Verwendung des gelbasierten Ansatzes 121 putativ

phosphorylierte Pro-Q-gefärbte Proteinspots detektiert und diese 80 verschiedenen

Proteinen zugeordnet werden (siehe Abbildung 24 und Abbildung 25). Von diesen 80

phosphorylierten Proteinen lagen 36 in zwei oder mehr Isoformen vor.

Interessant ist das Auftreten von phosphorylierten Isoformen, da sie einen direkten

Hinweis auf durch Phosphorylierung regulierte Prozesse liefern können. In B. subtilis

beispielsweise konnten, im Rahmen dieser Arbeit (Daten gezeigt in Eymann u. a. 2011),

für das RsbRA Protein, einem Regulator der SigB-Aktivität, zwei phosphorylierte

Isoformen detektiert und ebenfalls zwei unterschiedliche Phosphorylierungsstellen

identifiziert werden. Daraus schlossen Eymann und Mitarbeiter auf eine zweite

Feedback-Schleife, die die Aktivität von SigB limitiert und auf den unterschiedlich

phosphorylierten Isoformen des RsbRA Proteins beruht (Eymann u. a., 2011).

Hierdurch wird deutlich, welche Bedeutung die Detektion verschiedener

phosphorylierter Isoformen bei der Aufklärung regulatorischer Mechanismen haben

kann.

Page 88: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

88

Abbildung 24: Phosphoproteommasterkarte pH 4-7. Hierbei handelt es sich um ein Zweikanalfalschfarbenbild bei dem die phosphorylierten Proteinspots rot zu erkennen sind und die unphosphorylierten Proteine grün-gelb gefärbt wurden. Die Pro-Q gefärbten putativ phosphorylierten und identifizierten Proteinspots wurden mit ihrer Proteinabkürzung kenntlich gemacht.

Durch die Verwendung des Zoomgels pH 4,5-5,5 und die hiermit verbundene

verbesserte Auflösung, konnten 48 Pro-Q gefärbte Proteinspots zusätzlich identifiziert

werden, wohingegen sieben Proteinspots nur ausschließlich auf dem Standardgel pH

4-7 detektiert wurden.

Page 89: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 89

Abbildung 25: Phosphoproteommasterkarte pH 4,5-5,5. (Legende s.o.). Zusätzlich wurden die neu unter Stressbedingungen erscheinenden phosphorylierten Proteinsspots rot eingezeichnet.

Grundsätzlich ist die Identifizierung der putativ phosphorylierten Proteine und deren

spezifischen Phosphorylierungsstellen abhängig von einer akkuraten und sensitiven

massenspektrometrischen Analyse. Im Vergleich zu den Analysen von B. subtilis

konnten durch die stetige Weiterentwicklung der Massenspektrometer im Rahmen

dieser Arbeit neue innovative Methoden zum Einsatz kommen, darunter die Methode

der "Multistage-Aktivierung" (MSA = Pseudo MSn), die für das häufig auftretende

Phänomen des spezifischen Neutralverlustes bei der massenspektrometrischen

Analyse von Serin- und Threonin-phosphorylierten Peptiden entwickelt wurde

(Schroeder u. a., 2004).

Page 90: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

90

Dieser Neutralverlust tritt während der kollisions-induzierten Fragmentierung (CID) des

phosphorylierten Vorläuferions auf (zusammengefasst in (Boersema u. a., 2009a)).

Hierbei unterliegt der Vorläufer keiner vollständigen Fragmentierung, sondern es wird

ein kleines Molekül, in diesem Falle Phosphorsäure (H3PO4 --> neutral), abgespalten.

Das Charakteristische an dem von dieser Fragmentierung aufgenommenen

MS/MS-Spektrum ist die Fragmentarmut. Anhand dieses Fragmentionenspektrums ist

es oft nicht möglich, die genaue Phosphorylierungsstelle zu bestimmen. Das Prinzip der

MSA-Methode beruht auf der Annahme, dass der Neutralverlust immer auftritt. Daher

wird nach der ersten Aktivierung (MS2) eine zweite Vorläuferionaktivierung (MS3)

durchgeführt, die die Vorläuferionenmasse abzüglich des Neutralverlusts fragmentiert.

Dabei findet zwischen den beiden Aktivierungen MS2 und MS3 keine Leerung der

linearen Ionenfalle statt, so dass alle Fragmente der ersten und zweiten Aktivierung

gesammelt werden und somit ein komplexes, fragmentreiches Spektrum

aufgenommen wird (Boersema u. a., 2009a; Schroeder u. a., 2004).

Bezüglich der identifizierten, putativ phosphorylierten Proteine, bei denen bisher keine

Phosphorylierungsstelle identifiziert werden konnte, wurde in dieser Arbeit die MS-

Methode mit der Implementierung einer "Parentmasslist" erweitert. In diese Liste

wurden alle Massen der theoretisch möglichen Phosphopeptide des zu

untersuchenden Proteins aufgenommen. Hiermit wurde es möglich, bei auftretender

Detektion einer auf der Liste sich befindlichen Massen, eine bevorzugte

Fragmentierung des Vorläuferions dieser Masse durchzuführen. Das Ziel dieser

Methode bestand in der Fokussierung auf das niedrig abundante phosphorylierte

Peptid und nicht in der Erreichung einer guten Sequenzabdeckung zur Identifizierung

des zu untersuchenden Proteins. Mit dieser Methode ist es möglich, phosphorylierte

Peptide zu analysieren, die nicht zu den fünf hoch abundantesten (Orbitrap XL) im

Übersichtsscan gehören. Eine gesicherte Aussage über eine Verbesserung der

Ergebnisse bei Anwendung der Parentmasslist kann aufgrund des Versuchsaufbaus

nicht getroffen werden, da der zu analysierende Proteinspot aus mehreren

korrespondierenden Gelen gepoolt und trypsiniert wurde. Daher variierte die zur

Analyse vorliegende Proteinmenge. Die Menge des verdauten Proteinspots war

darüber hinaus für eine Zweifach-Messung nicht ausreichend, so dass für die

Wiederholung neue Proteinsspots aus anderen Gelen hinzugezogen werden mussten.

Page 91: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 91

Jedoch konnten unter Verwendung der Parentmasslist spezifische

Phosphorylierungsstellen identifiziert werden.

Mit der Anwendung der neuen Orbitraptechnologie, die eine schnelle, hoch sensitive

und akkurate Analyse der zu untersuchenden Peptide ermöglichte, war es mit der

speziell für modifizierte Peptide ausgelegten Anwendung der Multistage-Aktivierung

(MSA) und der Implementierung einer „Parentmasslist“ in die MS-Methode gelungen,

trotz der sehr geringen Menge des jeweiligen phosphorylierten Proteins im 2D-Gel, 22

Phosphorylierungsstellen zu identifizieren. Diese Phosphorylierungsstellen verteilen

sich über 28 Pro-Q gefärbte Proteinspots und verifizieren 19 verschiedene

phosphorylierte Proteine (siehe Tabelle 10).

2.2.2.2 Analyse des Phosphoproteoms von S. aureus via gelfreier Phosphopeptidanreicherungstechnik

Die globale Analyse des Phosphoproteoms mit Hilfe einer speziellen

Phosphopeptidanreicherungstechnik wird schon seit vielen Jahren bei der Analyse von

phosphorylierten Proteinen in Eukaryoten eingesetzt (Neville u. a., 1997; Scanff u. a.,

1991). Erst mit der Nutzung von Titandioxid (Pinkse u. a., 2004) konnte die

Anreicherungstechnik auch erfolgreich auf bakterielle Organismen übertragen werden

(Larsen u. a., 2005; Macek u. a., 2007, 2008; Soufi u. a., 2008). In der von Olsen und

Macek weiterentwickelten Methode (Olsen & Macek, 2009), findet die Anreicherung

der phosphorylierten Peptide aus einem Peptidgemisch in zwei Schritten statt. Nach

dem Verdau eines kompletten Proteinextraktes wird das Peptidgemisch mittels

Kationenaustauschchromatographie SCX ("strong cation exchange chromatography")

vorfraktioniert und darauffolgend die Fraktionen mit Titandioxid inkubiert.

Anschließend wird eine massenspektrometrische Analyse der Phosphopeptid-

angereicherten Eluate durchgeführt.

Dieser gelfreie Ansatz gemäß Olsen und Macek wurde im Rahmen dieser Arbeit im

Haus etabliert und zur Untersuchung des Phosphoproteoms von S. aureus eingesetzt.

Für die Analysen wurden S. aureus Zellen aus der späten exponentiellen bzw.

transienten Wachstumsphase ausgewählt, um ein möglichst breites Spektrum an

phosphorylierten Proteinen abdecken und putativ phosphorylierte infektionsrelevante

Page 92: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

92

Proteine detektieren zu können. Die massenspektrometrischen Analysen erfolgten,

wie unter Abschnitt 2.2.2.1 beschrieben, mit Anwendung der Multistage-Technologie.

Der methodische Versuchsablauf ist in der Abbildung 1 (siehe Abschnitt 1.3.2)

graphisch aufgeführt.

Insgesamt konnten mittels der Anreicherungstechnik 49 verschiedene

Phosphorylierungsstellen in 33 unterschiedlichen Proteinen detektiert werden.

Hierunter befanden sich 29 phosphorylierte Serin-, 10 phosphorylierte Threonin- und

10 phosphorylierte Tyrosinreste. Zwei phosphorylierte Peptide konnten nicht eindeutig

einem Protein zugeordnet werden (SodA1/SodA2; SACOL0912/SACOL1680). Die große

Anzahl an identifizierten Phosphorylierungsstellen (49) im Vergleich zu den mit der

gelbasierten Methode detektierten (22), verdeutlicht die große Stärke der

Anreicherungstechnik.

Mit beiden Analysemethoden konnten insgesamt 103 phosphorylierte Proteine und 68

verschiedene Phosphorylierungsstellen aus S. aureus identifiziert werden. Diese sind in

Tabelle 10 zusammenfassend aufgeführt.

Tabelle 10: Auflistung der phosphorylierten Proteine und ihrer spezifischen Phosphorylierungsstellen (wenn identifiziert). Unterschieden wurde zwischen dem gelbasierten bzw. gelfreien Ansatz und der Lokalisation auf den Gelen der zwei verschiedenen pH-Bereiche. X markiert die entsprechende Methode mit der das phosphorylierte Protein oder Peptid detektiert werden konnte. Grün hinterlegt wurden diejenigen Proteine, die nur gelfrei identifiziert werden konnten, wohingegen die in beiden Ansätzen identifizierten rot hinterlegt wurden. Dementsprechend sind die einzig im Gel identifizierten Proteine nicht farbig markiert.

Protein Proteinfunktion (original aus dem Suchergebnis übernommen)

P- stelle

Proteinspot

im 2D-Gel

Gel pH

4-7*

Gel pH 4.5- 5.5*

TiO2

AcnA aconitate hydratase Y310 AcnA

x

AhpC alkyl hydroperoxide reductase subunit C

AhpC

x

AhpF hypothetical protein SACOL1985

AhpF-1

x

AhpF hypothetical protein SACOL1985

AhpF-2

x

AhpF hypothetical protein SACOL1985 AhpF-3 x

Page 93: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 93

Protein Proteinfunktion (original aus dem Suchergebnis übernommen)

P- stelle

Proteinspot im 2D-Gel

Gel pH

4-7*

Gel pH 4.5- 5.5*

TiO2

AhpF hypothetical protein SACOL1985

SACOL0564-1/ AhpF-1 (x)

AhpF hypothetical protein SACOL1985

SACOL0564-2/ AhpF-2 (x)

AhpF hypothetical protein SACOL1985

SACOL0564-3/ AhpF-3 (x)

ClpB ATP-dependent Clp protease, ATP-binding subunit ClpB

S426 x

ClpX ATP-dependent protease ATP-binding subunit

Eno-2/ClpX-1 x x

ClpX ATP-dependent protease ATP-binding subunit

Eno-3/ClpX-2 x x

CysK cysteine synthase

RpsB/CysK

(x)

DapA dihydrodipicolinate synthase

DapA x x

Dat D-alanine aminotransferase

Dat

x

DeoB phosphopentomutase T87 DeoB-1 x x

DeoB phosphopentomutase T87 DeoB-2

x

DeoB phosphopentomutase T87 DeoB-3 x x

DnaN DNA polymarease III subunit beta

Tuf-1b/DnaN-1 x x

DnaN DNA polymarease III subunit beta

Tuf-2b/DnaN-2

x

Efp elongation factor P

Efp x x

Eno enolase

Eno-1 x x

Eno enolase

Eno-2/ClpX-1 (x) (x)

Eno enolase

Eno-3/ClpX-2 (x) (x)

FbaA fructose-bisphosphate aldolase S50/ T212/T234

FbaA-1 x x

FbaA fructose-bisphosphate aldolase T234 FbaA-2 x x

FdaB fructose-1,6-bisphosphate aldolase

FdaB-1 x x

FdaB fructose-1,6-bisphosphate aldolase

FdaB-2

x

FemC glutamine synthetase S392 FemC-1/GatB-1 x x

FemC glutamine synthetase

FemC-2/GatB-2 x x

FolD methylenetetrahydrofolate dehydrogenase /methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase S190

x

FtsY cell division protein FtsY, putative

FtsY

x

FtsZ cell division protein

FtsZ

x

FusA elongation factor G T388 FusA-1 x x

FusA elongation factor G

FusA-2 x x

GapA1 glycerinealdehyde 3-phosphate dehydrogenase S210 GapA1-1 x x

GapA1 glycerinealdehyde 3-phosphate dehydrogenase

GapA1-2 x x

GapA1 glycerinealdehyde 3-phosphate dehydrogenase

GapA1-3 x x

Page 94: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

94

Protein Proteinfunktion (original aus dem Suchergebnis übernommen)

P- stelle

Proteinspot

im 2D-Gel

Gel pH

4-7*

Gel pH 4.5- 5.5*

TiO2

GatB aspartyl/glutamyl-tRNA amidotransferase subunit B S196 FemC-2/GatB-2 (x) (x)

GatB aspartyl/glutamyl-tRNA amidotransferase subunit B

FemC-1/GatB-1 (x) (x)

GatB aspartyl/glutamyl-tRNA amidotransferase subunit B

GatB/GlyS

(x)

GlmM phosphoglucoseamine mutase S102 GlmM-1 x x

GlmM phosphoglucoseamine mutase S102 GlmM-2 x x

GlmM phosphoglucosamine mutase GlmM S102

x

GlpD Aerobic glycerol-3-phosphate-dhg.

GlpD/Zwf-1 x x

GluD NAD-specific glutamate dehydrogenase S264 GluD-2 x x

GluD NAD-specific glutamate dehydrogenase T267/S264 GluD-1 x x

GluD glutamate dehydrogenase, NAD-specific S264

x

GluD glutamate dehydrogenase, NAD-specific T267

x

GlyA serine hydroxymethyltransferase Y51

x

GlyS glycyl-tRNA synthetase

GatB/GlyS

x

Gnd 6-phosphogluconate dehydrogenase S167 Gnd/SucC

x

Gpm phosphoglycerate mutase

SACOL0534/Gpm

x

GuaB inosine-5'-monophosphate dehydrogenase

GuaB-1/LeuA-1 x x

GuaB inosine-5'-monophosphate dehydrogenase

GuaB-2/LeuA-2 x x

HchA chaperone protein HchA

HchA

x

HemC porphobilinogen deaminase S136/Y138

x

HemE uroporphyrinogen decarboxylase S92

x

HemL1 glutamate-1-semialdehyde aminotransferase

HemL1

x

HemL2 glutamate-1-semialdehyde aminotransferase

Pgk-1/HemL2 (x) (x)

HisC histidinol-phosphate aminotransferase

HisC

x

Hom homoserine dehydrogenase

Hom x x

IlvC ketol-acid reductoisomerase

IlvC-2

x

IlvC ketol-acid reductoisomerase

SACOL1958/IlvC-1 (x) (x)

IlvE branched-chain amino acid aminotransferase

IlvE-1

x

IlvE branched-chain amino acid aminotransferase

IlvE-2/MtlD-1

x

IlvE branched-chain amino acid aminotransferase

IlvE-3/MtlD-2

x

IsdB LPXTG cell wall surface anchor protein Y440/Y444

x

KatA katalse

KatA-1/SerA x x

KatA katalse

KatA-2 x x

Page 95: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 95

Protein Proteinfunktion (original aus dem Suchergebnis übernommen)

P- stelle

Proteinspot

im 2D-Gel

Gel pH

4-7*

Gel pH 4.5- 5.5*

TiO2

LeuA 2-Isopropyl synthase

GuaB-1/LeuA-1 (x) (x)

LeuA 2-Isopropyl synthase

GuaB-2/LeuA-2 (x) (x)

MetE 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase

MetE-1 x x

MetE 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase

MetE-2 x x

MetE 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase

MetE-3 x x

MetE 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase S363

x

MetE 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase S394

x

MetE 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase T393

x

MetK S-adenosylmethionine synthetase

MetK-1

x

MetK S-adenosylmethionine synthetase

MetK-2 x x

Mqo2 malate:quinone oxidoreductase

Mqo2-1 x

Mqo2 malate:quinone oxidoreductase

Mqo2-2 x

MtlD mannitol-1-phosphate 5-dehydrogenase

IlvE-2/MtlD-1

(x)

MtlD mannitol-1-phosphate 5-dehydrogenase

IlvE-3/MtlD-2

(x)

PdhC branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase subunit E2

PdhC-1 x x

PdhC branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase subunit E2

PdhC-2/Pnp x x

PdhC branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase subunit E2

PdhC-3 x x

PdhD dihydrolipoamide dehydrogenase

PdhD-1 x x

PdhD dihydrolipoamide dehydrogenase

PdhD-2 x x

PepF oligoendopeptidase

PepF

x

PepV dipeptidase PepV

PepV x x

Pgi glucose-6-phosphate isomerase T143 Pgi x x

Pgk phosphoglycerate kinase

Pgk-1/HemL2 x x

Pgk phosphoglycerate kinase

Pgk-2 x x

Pgm phosphoglyceromutase

Pgm-1 x x

Pgm phosphoglyceromutase

Pgm-2

x

Pgm phosphoglyceromutase

Pgm-3

x

Pgm phosphoglycerate mutase, 2,3-bisphosphoglycerate-independent S62

x

Pnp polynucleotide phosphorylase/polyadenylase

PdhC-2/Pnp (x) (x)

PtsH phosphocarrier protein HPr S46 RsbV/PtsH (x) (x)

PtsI phosphoenolpyruvate-protein phosphotransferase

PtsI

x

Pyk pyruvate kinase T537 Pyk-1 x x

Page 96: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

96

Protein Proteinfunktion (original aus dem Suchergebnis übernommen)

P- stelle

Proteinspot

im 2D-Gel

Gel pH

4-7*

Gel pH 4.5- 5.5*

TiO2

Pyk pyruvate kinase T537 Pyk-2 x x

Pyk pyruvate kinase T537 Pyk-3 x x

Pyk pyruvate kinase T537 Pyk-4 x x

Pyk pyruvate kinase T537 Pyk-5

x

Pyk pyruvate kinase S198

x

RpsA 30S ribosomal protein S1

RpsA

x

RpsB 30S ribosomal protein S2

RpsB/CysK

x

RpsB 30S ribosomal protein S2

RpsB-1 x x

RpsB 30S ribosomal protein S2

RpsB-2 x x

RsbV anti-anti-sigma factor RsbV S57 RsbV/(RsbV) x x

SACOL0178 PTS system, IIBC components Y187

x

SACOL0413 ribosomal-protein-serine acetyltransferase, putative

Y169/Y171

x

SACOL0427 hypothetical protein SACOL0427

SACOL0427-1

x

SACOL0427 hypothetical protein SACOL0427

SACOL0427-2

x

SACOL0427 conserved hypothetical protein Y52

x

SACOL0431 trans-sulfuration enzyme family protein

SACOL0431

x

SACOL0534 TatD family deoxyribonuclease

SACOL0534/ Gpm

(x)

SACOL0552 general stress protein 13 S105

x

SACOL0564 pyridoxin biosynthesis protein T155 SACOL0564-1/AhpF-1 x

SACOL0564 pyridoxin biosynthesis protein

SACOL0564-1

x

SACOL0564 pyridoxin biosynthesis protein

SACOL0564-2

x

SACOL0564 pyridoxin biosynthesis protein

SACOL0564-2/AhpF-2 x

SACOL0564 pyridoxin biosynthesis protein

SACOL0564-3

x

SACOL0564 pyridoxin biosynthesis protein

SACOL0564-3/AhpF-3 x

SACOL0597 chaperone protein HchA

SACOL0597 (HchA)

x

SACOL0617 hexulose-6-phosphate synthase, putative S52

x

SACOL0812 degV family protein

SACOL0812 x x

SACOL0875 thioredoxin, putative T7 SACOL0875

x

SACOL0875 thioredoxin, putative S88

x

SACOL0884 ABC transporter, substrate-binding protein

SACOL0884-1 x

SACOL0884 ABC transporter, substrate-binding protein

SACOL0884-2 x

SACOL0884 ABC transporter, substrate-binding protein

SACOL0884-3 x

SACOL0884 ABC transporter, substrate-binding protein

SACOL0884-4 x

SACOL0912 conserved hypothetical protein S37

x

SACOL0912 conserved hypothetical protein S5

x

SACOL0912 conserved hypothetical protein T52 x

Page 97: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 97

Protein Proteinfunktion (original aus dem Suchergebnis übernommen)

P- stelle

Proteinspot

im 2D-Gel

Gel pH

4-7*

Gel pH 4.5- 5.5*

TiO2

SACOL0912/ SACOL1680 conserved hypothetical protein T17

x

SACOL0912/ SACOL1680 conserved hypothetical protein T22

x

SACOL0914 FeS assembly ATPase SufC

SACOL0914

x

SACOL1445 CbbQ/NirQ/NorQ/GpvN family protein

SACOL1445

x

SACOL1483 hypothetical protein SACOL1483

SACOL1483

x

SACOL1522 elastin binding protein, putative S128

x

SACOL1522 elastin binding protein, putative S2

x

SACOL1522 elastin binding protein, putative T64

x

SACOL1561 2-oxoisovalerate dehydrogenase, E1 component, beta subunit

SACOL1561 x x

SACOL1561 2-oxoisovalerate dehydrogenase, E1 component, beta subunit

SACOL1561

x

SACOL1588 proline dipeptidase T313 SACOL1588

x

SACOL1672 conserved hypothetical protein Y12

x

SACOL1679 conserved hypothetical protein S17

x

SACOL1679 conserved hypothetical protein S35

x

SACOL1680 conserved hypothetical protein T52

x

SACOL1749 NADP-dependent malic enzyme, putative

SACOL1749

x

SACOL1759 universal stress protein

SACOL1759

x

SACOL1788 conserved hypothetical protein S371

x

SACOL1789 conserved hypothetical protein S103

x

SACOL1789 conserved hypothetical protein T105

x

SACOL1895 conserved hypothetical protein S43

x

SACOL1895 conserved hypothetical protein T34

x

SACOL1958 putative lipid kinase

SACOL1958/IlvC-1 x x

SACOL2173 alkaline shock protein 23

SACOL2173-1 x x

SACOL2173 alkaline shock protein 23

SACOL2173-2 x x

SACOL2173 alkaline shock protein 23

SACOL2173-3 x x

SACOL2173 alkaline shock protein 23

SACOL2173-4

x

SACOL2173 alkaline shock protein 23

SACOL2173-5

x

SACOL2173 alkaline shock protein 23

SACOL2173-6

x

SACOL2173 alkaline shock protein 23

SACOL2173-7

x

SACOL2173 alkaline shock protein 23 S45

x

SACOL2255 conserved hypothetical protein Y11

x

SACOL2450 amino acid ABC transporter, permease protein S228

x

SACOL2501 phosphoglucomutase/phosphomannomutase family protein

SACOL2501 x

SACOL2501 phosphoglucomutase/phosphomannomutase family protein S193

x

SarA staphylococcal accessory regulator A S106

x

Page 98: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

98

Protein Proteinfunktion (original aus dem Suchergebnis übernommen)

P- stelle

Proteinspot

im 2D-Gel

Gel pH

4-7*

Gel pH 4.5- 5.5*

TiO2

SarA staphylococcal accessory regulator A S109

x

SdhA succinate dehydrogenase flavoprotein subunit

SdhA/Zwf-2 x x

SerA D-3-phosphoglycerate dehydrogenase

KatA-1/SerA (x) (x)

SodA2 superoxide dismutase

SodA2-1 x x

SodA2 superoxide dismutase

SodA2-2 x x

SodA2/ SodA1

superoxide dismutase T34

x

SucC succinyl-CoA synthetase subunit beta S364 Gnd/SucC

(x)

SufD FeS assembly protein SufD S24

x

Tal putative transaldolase

Tal-1 x x

Tal putative transaldolase

Tal-2 x x

Tal putative transaldolase

Tal-3

x

Tig trigger factor

Tig

x

Tkt transketolase

Tkt-1 x x

Tkt transketolase

Tkt-2 x x

TpiA triosephosphate isomerase S215

x

Tuf elongation factor Tu S220 Tuf-1a x x

Tuf elongation factor Tu

Tuf-1b/DnaN-1 (x) (x)

Tuf elongation factor Tu

Tuf-2a

x

Tuf elongation factor Tu

Tuf-2b/DnaN-2

(x)

Zwf glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase

GlpD/Zwf-1 (x) (x)

Zwf glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase

SdhA/Zwf-2 (x) (x)

*Die Kreuze in den 2D-Gel-Spalten markieren die Detektion der einzelnen Proteinspots im jeweiligen Versuchsansatz. In einigen Proteinspots konnte jedoch keine eindeutige Identifizierung vorgenommen werden. Diese Mehrfachidentifizierungen pro Spot wurden in der Tabelle nur einmal mit einem Kreuz berücksichtigt, die zusätzlich identifizierten Proteine im Spot wurden durch ein Kreuz in Klammern markiert. Somit wurden Doppeltzählungen vermieden.

2.2.2.3 Vergleich der Resultate aus den gelbasierten und gelfreien Phosphoproteom-Analysemethoden

Zur Verdeutlichung der Notwendigkeit der Verwendung beider Methoden zur Analyse

des Phosphoproteoms wurden die Identifizierungsergebnisse miteinander verglichen.

In diesem Vergleich zeigte sich, wie auch schon in früheren Studien beschrieben

(Eymann u. a., 2007; Macek u. a., 2007), dass keine großen Gemeinsamkeiten zwischen

den Ergebnissen des gelbasierten und des gelfreien Ansatzes bestehen (siehe

Page 99: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 99

Abschnitt 2.1.4). Insgesamt konnten in dieser Arbeit drei Phosphorylierungsstellen von

S. aureus mit beiden Methoden identifiziert werden (Glm (pS102), GluD (pT267/S264)).

10 gelfrei identifizierte Phosphorylierungsstellen verifizieren acht Pro-Q-gefärbte

putativ phosphorylierte Proteine der gelbasierten Methode (MetE (3 P-Stellen), Pgm,

Pyk, SACOL0427, SACOL0875, SACOL2173, SACOL2501, SodA2) in denen keine

Phosphorylierungsstelle gefunden werden konnte. 93 phosphorylierte Proteine

wurden mit jeweils nur einer Methode detektiert, davon 23 nur gelfrei und 70 Proteine

nur gelbasiert (siehe Abbildung 26 und Tabelle 10).

Abbildung 26: Venndiagramm über die Verteilung der identifizierten phosphorylierten Proteine zwischen der gelfreien und gelbasierten Methode.

Ein Vergleich der detektierten phosphorylierten Aminosäuren bei S. aureus zeigt eine

Gesamtaufteilung von 56 % p-Serin, 28 % p-Threonin und 16 % p-Tyrosin (Abbildung

27), die den allgemeinen Verhältnissen in bakteriellen Organismen entspricht (Macek

u. a., 2007, 2008). Auffällig ist, dass zwischen den angewandten Methoden eine

Diskrepanz zwischen den Verhältnissen auftritt. Der Schwerpunkt im gelbasierten

Ansatz liegt zu gleichen Teilen in den Serin- und Threonin-Phosphorylierungen, wobei

die Tyrosinphosphorylierung nur eine untergeordnete Rolle spielt. Im gelfreien Ansatz

wurde bei 60 % aller identifizierten Phosphopeptide ein phosphorylierter Serinrest

Page 100: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

100

identifiziert, und es bestand eine Verteilung der Threonin- oder

Tyrosinphosphorylierung zu gleichen Teilen von jeweils 20 %.

Abbildung 27: Auftreten der verschiedenen phosphorylierten Aminosäuren in den unterschiedlichen Versuchsansätzen.

Fraglich ist, ob der Anreicherungsansatz eine bevorzugte Bindungsaffinität zu

Serinphosphorylierungen aufweist und dies die Diskrepanz zwischen den beiden

Methoden erklärt. In Tabelle 11 ist die Anzahl der aus der Literatur bekannten und die

aus dieser Arbeit hervorgegangenen Phosphorylierungsstellen, die mit dem gelfreien

Anreicherungsansatz identifiziert wurden, aufgelistet. Des Weiteren ist das

prozentuale Vorkommen von Serin-, Threonin- oder Tyrosinphosphorylierungen

aufgeführt.

Der Tabelle ist zu entnehmen, dass die Häufigkeit von Serinphosphorylierungen

zwischen 46 % und 69 % liegt. Nur bei Lactococcus lactis wurden mehr Threonin- als

Serinphosphorylierungen detektiert. Für B. subtilis, E. coli, H. salinarium, K.

pneumoniae, L. monocytogenes, H. pylori, M. pneumoniae und S. aureus hingegen

überwiegt die Anzahl der Serinphosphorylierungen, so dass eine bevorzugte

Bindungsaffinität zu Serinphosphorylierungen angenommen werden könnte.

gelbasiert

gelfreigesamt

010203040506070

P-Stellen pSerpThr

pTyr

22

1110

1

49

29

10 10

68

38

1911

Anza

hl #

Page 101: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 101

Tabelle 11: Auflistung und Charakterisierung der verschiedenen in der Literatur und in dieser Arbeit mithilfe von SCX/TiO2 identifizierten Phosphorylierungsstellen.

Organismus P-Stellen % p-Serin

% p-Threonin

% p-Tyrosin

Referenz

Bacillus subtilis 103 69,2 20,5 10,3 (Macek u. a., 2007) Lactococcus lactis 73 46,6 50,7 2,7 (Soufi u. a., 2008) Escherichia coli 81 68 23 9 (Macek u. a., 2008) Halobacterium salinarum

56 46,4 44,6 9 (Aivaliotis u. a., 2009)

Klebsiella pneumoniae 93 31,2 15,1 25,8 (Lin u. a., 2009)(pTyr-Anreicherung)

Staphylococcus aureus 49 60 20 20 diese Arbeit Listeria monocytogenes 143 65 30 5 (Misra u. a., 2011) Helicobacter pylori 79 42,8 38,7 18,5 (Ge u. a., 2011)(nur

TiO2) Mycoplasma pneumoniae

93 58 37 5 (van Noort u. a., 2012) (nur SCX)

Eine Studie von Klemm und Mitarbeitern im Jahr 2006 konnte unter anderem an

synthetisch hergestellten Phosphopeptiden zeigen, dass keine bevorzugte Affinität von

S-, T- oder Y-Phosphopeptiden an TiO2 besteht (Klemm u. a., 2006). Sie konnten jedoch

feststellen, dass die Aminosäureszusammensetzung des phosphorylierten Peptids

Einfluss auf die Bindungsaffinität ausübt, so dass z. B. Phosphopeptide mit mehreren

basischen Aminosäuren eine geringere Affinität aufweisen als Peptide mit mehreren

sauren Aminosäuren. Die Identifizierung der phosphorylierten Peptide mittels ESI-

MS/MS hängt demnach von ihrer Bindungsaffinität an TiO2 ab und zusätzlich von der

Elutionseffizienz unter basischen Bedingungen, sowie dem generellen Peptidverlust bei

der sich anschließenden "reversed phase chromatography" (Klemm u. a., 2006).

Zusätzlich könnte vermutet werden, dass die Peptide mit Serinphosphorylierungen

eine bessere Ionisation in der massenspektrometrischen Analyse erfahren und somit

bevorzugt detektiert werden. Aus den oben erwähnten Versuchen von Klemm und

Mitarbeitern kann im Umkehrschluss dieses ebenfalls ausgeschlossen werden.

Generell konnten Steen und Mitarbeiter zeigen, dass keine verminderte Ionisierungs-

bzw. Detektionseffizienz von phosphorylierten Peptiden gegenüber ihren

unphosphorylierten Isoformen vorliegt, dass jedoch eine generelle unspezifische

Supression von Peptiden mit geringer Stöchiometrie unter gesättigten

Page 102: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

102

Ionisierungsbedingungen, bei denen die Komplexität der Probe sehr hoch ist, auftritt

(Steen u. a., 2006). Folglich kann eine bevorzugte Detektion von

Serinphosphorylierungen im gelfreien Ansatz ausgeschlossen werden. Die Detektion

des phosphorylierten Peptides im gelbasierten Ansatz hängt von der Stöchiometrie

und der Aminosäurezusammensetzung desselben ab, so dass dies die pS/pT/pY-

Verteilung begründet.

Generell ist zu berücksichtigen, dass eine Verteilung zugunsten der

Serinphosphorylierung im Organismus vorliegen kann und die Methode dies

wiederspiegelt. Aufgrund der für S. aureus in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse und

dem Vergleich der Identifizierungen für B. subtilis wird deutlich, dass es durch die

unterschiedlichen physiko-chemischen Eigenschaften der gelbasierten und der

gelfreien Methode sinnvoll ist, beide zur Analyse des Phosphoproteoms eines

Organismus anzuwenden.

2.2.2.4 Funktionelle Einordnung der identifizierten phosphorylierten Proteine

Zur Spezifizierung regulationsabhängiger Prozesse, in denen

Phosphorylierungsgeschehnisse für die Steuerung verantwortlich sein könnten,

wurden die identifizierten, phosphorylierten Proteine anhand von funktionellen

Kategorien eingeordnet (JCVI Cellular Role Category; http://cmr.jcvi.org/cgi-

bin/CMR/CmrHomePage.cgi) (siehe Abbildung 28). 15 verschiedene Klassen konnten

unterschieden werden, womit die weitreichende Verteilung und die große

physiologische Bedeutung von Phosphorylierungsereignissen deutlich wird.

Diese facettenreiche Streuung ließ sich schon in vorangegangenen Untersuchungen

zum Phosphoproteom bakterieller Organismen beobachten (Eymann u. a., 2007;

Macek u. a., 2007, 2008; Schmidl u. a., 2010a; Soufi u. a., 2008).

Besonders auffällig ist, dass der größte Anteil an phosphorylierten Proteinen - bei

S. aureus entspricht das einem Anteil von 27 % - in den meisten untersuchten

bakteriellen Phosphoproteomen dem Energiemetabolismus zugeordnet werden kann.

Page 103: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 103

Abbildung 28: Einordnung der identifizierten phosphorylierten Proteine in funktionelle Kategorien gemäß JCVI. Zusätzlich wird in zwei kleineren Tortendiagrammen die Verteilung innerhalb einer Methode mit den korrespondierenden Farben dargestellt.

In den Untersuchungen zum Phosphoproteom von S. aureus konnten 21 der 33

Enzyme des zentralen Kohlenstoffwechsels detektiert werden, und bei 10 von ihnen

konnte die direkte Phosphorylierungsstelle identifiziert werden. Der Vergleich zu der

früheren Studie von Lomas-Lopez (Lomas-Lopez u. a., 2007) zeigt drei

übereinstimmende phosphorylierte Enzyme (Eno, FbaA, TpiA). Aufgrund von PknB

Kinasemutante-Analysen wurde in der oben genannten Studie für das Protein FbaA

eine Phosphorylierungsstelle an einem Serin oder Threonin vorhergesagt. Diese

Vorhersage konnte bestätigt werden, da in den gelbasierten Untersuchungen zum

Page 104: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

104

Phosphoproteom von S. aureus das Protein mit drei Phosphorylierungsstellen (S50,

T212 und T234) identifiziert werden konnte.

In einem Vergleich der Proteine des Energiestoffwechsels verschiedener bakterieller

Organismen wird deutlich, dass jeder einzelne Organismus sein eigenes und spezielles

Muster an phosphorylierten Proteinen aufweist. In der Tabelle 12 sind die aus der

Literatur bekannten Phosphorylierungsdaten der Glykolyse- und TCA-Enzyme aus

globalen Phosphoproteomstudien einander gegenübergestellt, so dass die spezifischen

Phosphorylierungsmuster ersichtlich sind. Hierbei werden nicht alle Ergebnisse der

bisher untersuchten bakteriellen Phosphoproteome wiedergegeben, sondern nur

diejenigen, die einen informativen Zugewinn in Bezug auf die Enzyme des

Energiemetabolismus liefern.

Einige wenige Phosphorylierungsstellen scheinen konserviert zu sein, darunter FbaA,

GapA und Pgm.

Bei vielen phosphorylierten Enzymen des Kohlenstoffwechsels ist der

Phosphorylierungsmechanismus noch unbekannt. Mehrere Möglichkeiten werden

diskutiert und beschrieben, darunter die Kinase-vermittelte Phosphorylierung, die

Autophosphorylierungsreaktionen oder die Bildung von kovalenten Intermediaten im

aktiven Zentrum des Enzyms (Boël u. a., 2004; Jolly u. a., 2000). Bei letzteren ist es

nicht ausgeschlossen, dass diese durch den Pro-Q-Farbstoff angefärbt werden können

und somit ein Phosphorylierungssignal liefern, dass nicht auf einer Ser-, Thr- oder

Tyrosinphosphorylierung beruht.

In S. aureus wird für die Serin-/Threoninkinase PknB eine wichtige Rolle in der

Regulation glykolytischer Enzyme vorhergesagt (Lomas-Lopez u. a., 2007; Ohlsen &

Donat, 2010). Jedoch lässt sich diese Rolle nicht auf andere Organismen übertragen, da

für die homologen Kinasen unterschiedlichste Funktionen vorhergesagt werden, wie

z. B. Aufgaben in der Stabilität von Zytoadhärenzproteinen, in der Virulenz und in der

Germination (Kristich u. a., 2007; Schmidl u. a., 2010b; Shah u. a., 2008).

In B. subtilis wurde durch Pietack und Mitarbeiter gezeigt, dass Icd ein Substrat der

Kinase PrkC (homolog zu PknB) darstellt, die Pyruvatkinase, die Enolase und die

Transketolase jedoch PrkC unabhängig phosphoryliert werden (Pietack u. a., 2010).

Page 105: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 105

Tabelle 12: Gegenüberstellung verschiedener aus der Literatur bekannten Phosphorylierungsdaten der Glykolyse- und TCA-Enzyme. In die Tabelle wurden die spezifischen Phosphorylierungsstellen sowie die Detektion als Phosphoprotein mit aufgenommen. SA: S. aureus (Lomas-Lopez u. a., 2007; diese Arbeit); BS: B. subtilis (Eymann u. a., 2007; Lévine u. a., 2006; Macek u. a., 2007; Soufi u. a., 2010); LL: L. lactis (Soufi u. a., 2008); LR: Lactobacillus rhamnosus (Koponen u. a., 2012); LM: L. monocytogenes (Misra u. a., 2011); SP: S. pneumoniae (Sun u. a., 2010); MT: M. tuberculosis (Prisic u. a., 2010); CG: Corynebacterium glutamaticum (Bendt u. a., 2003); MP: M. pneumoniae (van Noort u. a., 2012; Schmidl u. a., 2010a); EC: E. coli (Macek u. a., 2008); NM: Neisseria meningitidis (Bernardini u. a., 2011); PA: Pseudomonas aeruginosa (Ravichandran u. a., 2009); HS: Halobacterium salinarium (Aivaliotis u. a., 2009).

Page 106: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

106

Ein bekanntes Beispiel für eine regulative Phosphorylierung an einem Enzym des

Energiestoffwechsels ist die Phosphorylierung der Isocitratdehydrogenase von E. coli.

Hierbei spielt der Serinrest 113 im aktiven Zentrum des Enzyms eine Hauptrolle. Durch

Phosphorylierung des Serins wird die Bindung des Substrats (Isocitrat) an das aktive

Zentrum (einschließlich der Formierung einer Wasserstoffbrückenbindung zum Ser113)

durch Einführung einer negativen Ladung und der daraus resultierenden

Konformationsänderungen verhindert und eine Inhibierung des Enzyms hervorgerufen.

Diese Regulation findet unter Wachstumsbedingungen statt, bei denen Acetat als

alleinige C-Quelle genutzt wird und Enzyme des Glyoxylat-Bypass benötigt werden

(Cozzone & El-Mansi, 2005; Garnak & Reeves, 1979; Gonçalves u. a., 2012; Hurley u. a.,

1990).

Weitere Beispiele für die Regulation von Enzymen durch Phosphorylierung wurden für

die Isocitratlyase und die Enolase von E. coli beschrieben, wobei z. B. für die Enolase

eine Inhibierung durch Dephosphorylierung festgestellt werden konnte, der genaue

Regulationsmechanismus jedoch noch unbekannt ist (Dannelly u. a., 1989; Robertson

& Reeves, 1989).

2.2.2.5 Infektionsrelevante Phosphorylierungsereignisse

Aufgrund der Pathogenität von S. aureus und der Rolle als bedeutender nosokomialer

Keim ist die Suche nach infektionsrelevanten Phosphorylierungsereignissen von großer

Wichtigkeit. Im Folgenden werden die in dieser Arbeit identifizierten, phosphorylierten

Proteine näher betrachtet, für die in der Literatur eine Verbindung zu Virulenz,

Pathogenität und Resistenz zu recherchieren war.

2.2.2.5.1 Enzyme des Metabolismus

In den letzten zwei Dekaden wurde immer häufiger von glykolytischen Enzymen

berichtet, denen neben ihrer Aufgabe in der Glykolyse auch eine Rolle auf der

Zelloberfläche oder extrazellulär zuzuordnen ist. Sie wirken dort als Adhäsions-

vermittelnde Proteine, die die Gewebsinvasion fördern sowie das Immunsystem des

Wirtes manipulieren können und somit potentielle Virulenzfaktoren darstellen

(zusammengefasst in (Copley, 2012; Henderson & Martin, 2011; Pancholi & Chhatwal,

Page 107: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 107

2003; Tunio u. a., 2010)). Diese "moonlighting"-Proteine stellen cytosolische Proteine

dar, die unerwarteterweise auf der Zelloberfläche oder extrazellulär detektiert werden

und an diesem Standort, abweichend von deren ursprünglichen Aufgabe, divergente

Funktionen erfüllen können. Diese neuen Funktionalitäten können auch aufgrund von

Konformationsänderungen, die z. B. durch posttranslationale Modifikationen

hervorgerufen werden, vom Protein ausgeführt werden (Copley, 2012). Der

Kontrollmechanismus für diese Proteine ist noch weitestgehend unverstanden.

Diskussionswürdig ist die Frage, wie diese "moonlighting"-Proteine ohne Signalpeptid

auf die Zelloberfläche gelangen. Zwei Möglichkeiten werden hierbei kontrovers

diskutiert. Die Vertreter der einen sind der Ansicht, dass die glykolytischen Proteine

durch Zelllyse in den extrazellulären Raum gelangen. Andere sind hingegen der

Auffassung, dass es noch unbekannte Sekretionsmechanismen geben muss

(Henderson & Martin, 2011). Einigkeit besteht jedoch darüber, dass die

"moonlighting"-Proteine eine wichtige Gruppe von Virulenzfaktoren darstellen, die in

der weiteren Forschungsarbeit berücksichtigt werden müssen. Einen ersten Hinweis

auf eine gesteuerte Sekretion liefern die Ergebnisse von Boël und Mitarbeitern. Sie

konnten zeigen, dass an die Enolase kovalent gebundenes 2-Phosphoglycerat die

Exkretion des Enzyms ermöglicht (Boël u. a., 2004).

Bisher wurden für viele bakterielle glykolytische Enzym eine "moonlighting"-Funktion

beschrieben (zusammengefasst in (Henderson & Martin, 2011)). Für S. aureus wurden

die Enolase, die Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH/GapA1) und die

Triosephosphatisomerase (TpiA) als "moonlighting"-Proteine dargestellt. Furuya und

Mitarbeiter wiesen TpiA eine zusätzliche Rolle als Plasminogen Bindungsfaktor zu

(Furuya & Ikeda, 2011). Eine Funktion als Transferrinrezeptor konnte für GapA1 gezeigt

werden (Modun u. a., 2000).

Für die Zelloberflächen lokalisierte Enolase wird eine Laminin-Bindungsfunktion

beschrieben (Carneiro u. a., 2004).

Im Rahmen dieser Arbeit konnten für TpiA (S215) und GapA1 (S210) jeweils eine

spezifische Phosphorylierungsstelle detektiert werden (siehe Tabelle 10). Des Weiteren

wurde die Enolase als putativ phosphoryliertes Protein über die Pro-Q-Färbung

nachgewiesen.

Page 108: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

108

In den Untersuchungen zum Phosphoproteom von Mycoplasma pneumoniae und

Campylobacter jejuni konnte TpiA als putativ phosphoryliert nachgewiesen werden,

ohne jedoch die spezifische Phosphorylierungsstelle zu detektieren (Schmidl u. a.,

2010a; Voisin u. a., 2007). In B. subtilis wurde homolog zu S. aureus das Serin 213 von

Macek und Mitarbeitern als phosphoryliert identifiziert (Macek u. a., 2007). Die

demnach konservierte Phosphorylierungsstelle, ist in einem durch strukturelle

Beweglichkeit die Enzymaktivität beeinflussenden "loop" lokalisiert (Casteleijn u. a.,

2006) und könnte somit einen regulierenden Einfluss auf die Aktivität des Enzyms

ausüben.

Inwieweit die Phosphorylierungsereignisse bei der generellen Regulation des Enzyms

oder der "moonlighting"-Funktion eine Rolle spielen und somit Einfluss auf die

Pathogenität von S. aureus haben könnten, muss untersucht werden.

Ein in der Literatur beschriebenes potentielles antimikrobielles Therapieziel stellt die

Fruktose-1,6-Bisphosphataldolase FbaA dar (Fonvielle u. a., 2004).

Die Funktion der Fruktose-1,6-Bisphosphat (FBP)-Aldolasen ist vielgestaltig. Auf der

einen Seite spielen sie eine wichtige Rolle in der Glykolyse und der Gluconeogenese,

aber auf der anderen Seite wurden FBP-Aldolasen als "moonlighting"-Proteine

ebenfalls auf der Zelloberfläche z. B. des Bakteriums Neisseria meningitidis detektiert.

Weitere Analysen zeigten, dass oberflächen-exponiertes FbaA notwendig ist, um eine

optimale Adhäsion an Wirtszellen zu gewährleisten (Tunio u. a., 2010). In

Streptococcus pneumoniae wurde über eine oberflächen-assoziierte Lokalisation des

Proteins berichtet und eine Verbindung dessen zur Adhärenz an den Wirt postuliert

(Blau u. a., 2007).

Das Enzym FbaA von S. aureus wird der Klasse II der FBP-Aldolasen (FBA) zugeordnet,

da das Enzym für die Spaltung von Fruktose-1,6-Bisphosphat in Glycerinaldehyd-3-

phosphat (G3P) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) ein divalentes Kation (hier Zn2+)

als Elektrophil für die Reaktion benötigt (Marsh & Lebherz, 1992). Diese Klasse der

Aldolasen wird fast ausschließlich in niederen Organismen gefunden (Daher u. a.,

2010) und stellt somit ein interessantes Ziel für antimikrobielle Therapeutika dar (Blom

u. a., 1996; Tunio u. a., 2010). Bisher sind verschiedene FBA-Inhibitoren entwickelt

Page 109: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 109

worden, die als Zinkchelator oder als "transition-state"-Analog fungieren und somit die

Funktion des Enzyms inhibieren (Daher u. a., 2010; Fonvielle u. a., 2004). Daher und

Mitarbeiter entwickelten FBA-Inhibitoren, die strukturverwandt zu dem Subtrat FBP

sind und Intermediatanaloge darstellen. In in vitro Analysen zeigten die vier neu

entwickelten Inhibitoren eine unterschiedliche, aber erfolgreiche Inhibierung der FBA.

In in vivo Wachstumsinhibierungsexperimenten konnte dieser inhibierender Effekt

nicht gezeigt werden. Die Autoren vermuten, dass es an dem Vorhandensein von

Phosphatgruppen liegen könnte, die eine Bindung des Inhibitors verhindern (Daher u.

a., 2010).

Im Rahmen dieser Arbeit konnte FbaA gelbasiert in zwei phosphorylierten Isoformen

detektiert werden. Eine Verifizierung des Phosphorylierungsstatus fand durch die

massenspektrometrische Spezifizierung der genauen Phosphorylierungsstelle am

Threonin 234 statt. Ein zusätzlicher Verdau des Proteins mit der Endoproteinase GluC

(V8 Proteinase von S. aureus) ermöglichte die Identifizierung von zwei weiteren

Phosphorylierungsstellen (T212 und S50). In mehreren früheren Studien wurde

gezeigt, dass es sich bei FbaA um ein Zielprotein bzw. Substrat der Serin-/Threonin

Kinase SA1063 (homolog zu PknB) handelt (Donat u. a., 2009; Lomas-Lopez u. a., 2007;

Truong-Bolduc u. a., 2008).

In einem Vergleich der aktiven Substratbindungstellen, die Daher und Mitarbeiter

aufgrund kristallographischer Analysen für H. pylori postuliert haben, zeigt sich, dass

zwei der identifizierten Phosphorylierungsstellen diejenigen Aminosäuren betreffen,

die als Substratbindungsstellen beschrieben wurden (S50 und S211 für S. aureus).

Somit bestätigt deren Identifizierung die Annahme von Daher, dass phosphorylierte

Aminosäuren in FbaA den Hemmeffekt des Inhibitors verhindern. Ein Alignment mit

der FBA von H. pylori und S. aureus verdeutlicht die Übereinstimmungen der

Substratbindungsstellen (siehe Abbildung 29).

Zusätzlich wurde das Alignment um Aldolasen anderer Mikroorganismen erweitert, um

die Konserviertheit dieser Phosphorylierungstellen zu überprüfen.

Page 110: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

110

Abbildung 29: Ausschnitte aus dem Alignment der FBA-Aminosäuresequenzen verschiedener Mikroorganismen. Das Alignment wurde mit EXPRESSO (T-COFFEE, Version_9.02.r1228 (Armougom u. a., 2006; Di Tommaso u. a., 2011)) durchgeführt. Die Zink-chelatierenden Histidinreste wurden mit einer Raute (#) hervorgehoben und die substratbindenden Aminosäuren mit einem "*" bzw. einem "P" markiert. Die "P"-Markierungen spiegeln zusätzlich die potentiellen Phosphorylierungsstellen wider. Bereits als phosphoryliert gezeigte Aminosäuren wurden mit einem Kästchen umrahmt (Macek u. a., 2007; Misra u. a., 2011; Soufi u. a., 2008).

Es zeigte sich, dass drei verschiedene, dem aktiven Zentrum naheliegende an Serin-

und Threoninresten befindliche Phosphorylierungsstellen konserviert vorliegen (S50,

Page 111: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 111

S211/T212 und T234) und in mehreren Organismen auch schon als phosphoryliert

identifiziert wurden (Macek u. a., 2007; Misra u. a., 2011; Soufi u. a., 2008).

Ebenso konnte für Streptococcus pneumoniae von Christian Hentschker zwei

Phosphorylierungsstellen im FbaA nachgewiesen werden, es handelt sich hierbei

ebenfalls um S50 und T211 (persönliche Mitteilung von Christian Hentschker

(Universität Greifswald), siehe Bäsell u. a. 2012 (eingereicht)). Interessant ist die

strukturelle Lage der Phosphorylierungsstellen im Protein.

Die Abbildung 30 zeigt die Struktur der FBP-Aldolase von M. tuberculosis, deren

Oberflächenfärbung auf einem Strukturalignment fünf verschiedener bakterieller

Klasse II Aldolasen beruht (M. tuberculosis, H. pylori, E. coli, Bacillus anthracis und

Campylobacter jejuni).

Abbildung 30: Struktur der FBP-Aldolase inklusive dem Substrat FBP von Mycobacterium tuberculosis. Die putativ phosphorylierten Aminosäuren wurden markiert. Gemäß dem Sequenz- und Strukturalignment wurden die verschiedenen Bereiche basierend auf ihrer Homologie eingefärbt. (gelb =schwach homolog; rot = stark homolog). Die Strukturen wurden aus der RscB-PDB-Protein-Datenbank übernommen und mit Chimera1.6.2 (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera) dargestellt.

Page 112: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

112

Deutlich ist die homologe Struktur der Substratbindetasche zu erkennen, die als rote

Kammer in der Abbildung ersichtlich wird. Innerhalb der Tasche sind die

phosphorylierten Serinreste zu erkennen (lila).

Die Abbildung 31 zeigt die Substratbindetasche im Detail.

Abbildung 31: Struktur der FBP-Aldolase inklusive dem Substrat FBP von Mycobacterium tuberculosis. Dargestellt ist der Cartoon der Aldolase im Ganzen und die Substratbindetasche als Ausschnitt. Die bindenden Aminosäuren wurden als Stäbchen- oder "Ball and Stick"- Modell dargestellt. Die in S. aureus als phosphoryliert identifizierten homologen Aminosäuren wurden lila angefärbt. Die Strukturen wurden aus der RscB-PDB-Protein-Datenbank übernommen und mit Chimera1.6.2 dargestellt.

Gemäß Pegan und Mitarbeitern dienen die zwei Serine und das Threonin in

M. tuberculosis dazu, mit dem Substrat (FBP) bzw. Substraten (DHAP, G3P)

Wasserstoffbrückenbindungen aufzubauen und so den Enzym-Substrat-Komplex zu

stabilisieren (Pegan u. a., 2009). Es kann daher spekuliert werden, dass aufgrund von

Phosphorylierungsereignissen, sei es durch Kinase vermittelte, selbständige oder

aufgrund von Intermediatbildung erfolgende Phosphorylierung, die Bindung des

Substrats reguliert wird, und dass diese Phosphorylierungen, die schon in zahlreichen

Organismen nachgewiesen worden sind, für die Aktivität des Enzyms sowie für die

Unwirksamkeit von auf Substratanaloga basierenden Inhibitoren verantwortlich sind.

Bei der Entwicklung von antimikrobiellen Therapeutika auf der Basis der Klasse II

Aldolasen muss für S. aureus berücksichtigt werden, dass der Organismus eine weitere

Page 113: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 113

Aldolase (FdaB) synthetisiert, die der Klasse I zugehörig ist. Inwieweit die eine Aldolase

die andere in ihrer Funktion ersetzen kann, ist bisher ungeklärt und bedarf weiterer

Untersuchungen. Im Hinblick auf eine potentielle "moonlighting"-Funktion von FbaA

und somit einer möglichen Rolle im Virulenzgeschehen, könnte der Entwicklung von

Inhibitoren jedoch eine besondere Bedeutung zukommen.

Aufgrund der Identifizierungen der Phosphorylierungstellen, der Ergebnisse des

multiplen Alignments und des Strukturvergleichs kann vermutet werden, dass es ein

hoch konserviertes Phosphorylierungsmuster in der Klasse II der FBP-Aldolasen gibt,

welches die Substratbindung reguliert und das bei der Neuentwicklung von

antimikrobiellen Inhibitoren berücksichtigt werden muss.

2.2.2.5.2 Enzyme der Proteolyse

Energieabhängige Proteolyse spielt eine wichtige Rolle in der Degradation von

Proteinen mit regulatorischen Funktionen und von durch Stresseinwirkung

geschädigten Proteinen. Durch die Degradation wird die Akkumulation von Proteinen

ohne aktuelle Funktion in der Zelle vermieden und die Proteinhomöostase

gewährleistet (Gerth u. a., 2008; Gottesman, 1999; Gottesman u. a., 1990; Reeves u.

a., 2007). In den globalen Untersuchungen des Phosphoproteoms von S. aureus

wurden zwei phosphorylierte Clp-ATPasen detektiert (ClpX und ClpB), die dem

Proteolysesystem der bakteriellen Zelle zugeordnet werden (Frees u. a., 2007;

Zolkiewski, 2006).

Zum einen konnte ClpX als putativ phosphorylierter Pro-Q gefärbter Spot im 2D-Gel

detektiert (hierbei ist jedoch zu berücksichtigen, dass das Phosphorylierungssignal

durch einen kovalent gebundenen phosphorylierten Cofaktor hervorgerufen werden

kann) und zum anderen das am Serin 426 phosphorylierte ClpB-Peptid im gelfreien

Ansatz identifiziert werden. Beiden ATPasen wird neben ihren Aufgaben innerhalb der

Stresstoleranz, der intrazellulären Replikation und der Biofilmbildung auch eine

wichtige Rolle in der Virulenz eingeräumt (Frees u. a., 2003, 2004, 2007; Jelsbak u. a.,

2010). Es wird beschrieben, dass ClpX für die Zellinteraktionen und für die Bildung von

Biofilm verantwortlich ist und durch die Stimulierung der Synthese des

oberflächengebundendenen Virulenzfaktors Protein A eine zentrale Rolle in der

Page 114: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

114

Steuerung der Regulation der Virulenz aufweist (Frees u. a., 2003; Jelsbak u. a., 2010).

Die ATPase ClpB wird als essentiell für die intrazelluläre Vermehrung in bovinen

Brustepithelzellen beschrieben (Frees u. a., 2004). In welcher Form das

Phosphorylierungsereignis im Virulenzgeschehen eine Rolle spielt, muss untersucht

werden.

2.2.2.5.3 Virulenzregulatoren

Vor kurzem wurde der pleiotrope Virulenz-Regulator SarA als Substrat der

Proteinkinase PknB (Serin-Threoninkinase) beschrieben. Die Phosphorylierung von

SarA wurde in vivo und in vitro nachgewiesen. Eine Spezifizierung der genauen

Phosphorylierungsstelle fand jedoch nicht statt (Didier u. a., 2010). Die Autoren

stellten die Hypothese auf, dass die Regulation von SarA über den

Phosphorylierungsstatus stattfindet. Als präferierte Phosphorylierungsstelle wurde von

ihnen das Serin 75 vorgeschlagen. Dies schlussfolgerten sie aus der Beobachtung, dass

die Phosphorylierung des Proteins zu einer verminderten DNA-Bindungskapazität führt

und das S75 neben dem für die DNA-Bindung verantwortlichen Lysin lokalisiert ist. Für

das Serin 75 konnte in dieser Arbeit keine Phosphorylierung nachgewiesen werden,

jedoch wurden die Serine 106 und 109 als phosphoryliert identifiziert. Diese multiplen

Serin-Phosphorylierungen, die in einem Abstand von zwei Aminosäuren lokalisiert sind,

wurden ebenfalls für den Regulator MgrA, der der Familie der SarA Regulatoren

zugeordnet wird, beschrieben (Truong-Bolduc & Hooper, 2010). Der

Phosphorylierungsstatus von MgrA soll für die Regulation der Expression der MDR

("multi-drug-resistance") Effluxpumpen NorA und NorB verantwortlich sein, die einem

Resistenzmechnismus gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen angehören (Truong-

Bolduc & Hooper, 2010; Truong-Bolduc u. a., 2005, 2006, 2008).

In einem Sequenzalignment zeigt sich, dass das S109 von SarA eine Homologie zum

S110 des Proteins MgrA aufweist (siehe Abbildung 32). Aufgrund dieser Homologie

und des Motives der doppelten Serinphosphorylierung kann auf eine ähnliche

Funktionsweise bzw. auf einen ähnlichen regulatorischen Mechanismus geschlossen

werden.

Page 115: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 115

Abbildung 32: Sequenzalignment von SarA (Sbjct) und MgrA (Query). Es wurde mit dem Algorithmus BLAST® (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) erstellt. Das Serin 109 von SarA zeigt eine Homologie zum Serin 110 von MgrA. Beide Serine sind durch eine Umrahmung (Kasten) hervorgehoben.

Eine neue Regulationsmöglichkeit von SarA beschrieben kürzlich Sun und Mitarbeiter.

Sie konnten in der SarA/MgrA-Familie (SarA, MgrA und SarZ) in in vitro Kinaseassays

eine Phosphorylierung des konservierten Cysteinrestes C9 identifizieren und bringen

dies mit der Regulation der Enzyme in Verbindung (Sun u. a., 2012).

Die Aufklärung der detaillierten Regulationsmechanismen steht noch aus und in

welcher Weise die identifizierten Phosphorylierungen einen regulatorischen Einfluss

auf die Enzymaktivität in vivo ausüben, muss überprüft werden.

Des Weiteren konnte in dem gelfreien Ansatz der phosphorylierte putative

Virulenzfaktor EbpS (SACOL1522) identifiziert werden, bei dem es sich um ein Elastin-

Bindeprotein handelt (Park u. a., 1999). Die Elastinbindung von EbpS wurde mit

löslichen Elastinpeptiden und der Elastinvorstufe Tropoelastin nachgewiesen (Downer

u. a., 2002; Park u. a., 1999). In späteren Studien wurde gezeigt, dass EbpS zwar

lösliches Elastin bindet, jedoch für die Adherenz an immobilisierten Elastin nicht

verantwortlich ist (Roche u. a., 2004), womit die genaue Funktion des EbpS fraglich

wird. Interessant ist der topologische Aufbau des Proteins. EbpS besitzt zwei

hydrophobe Membranspannungsdomänen und einen N- sowie C-terminalen Teil, die

beide außerhalb der cytoplasmatischen Membran lokalisiert sind, wobei nur der

N-terminale Teil auf der Zelloberfläche exponiert wird (Downer u. a., 2002). Eine

detaillierte Studie der N-terminalen Domäne von Nakakido und Mitarbeitern zeigte

dessen strukturelle Wandelbarkeit in verschiedenen physiologischen Umgebungen

(Nakakido u. a., 2007). Einen interessanten Beitrag liefern die im Rahmen dieser Arbeit

identifizierten Phosphorylierungsstellen (S2, T64, S218) des EbsP Proteins. Alle drei

sind in der extrazellulären N-terminalen Domäne lokalisiert und geben somit einen

Page 116: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

116

Hinweis auf regulatorische Prozesse im Pathogenitätsgeschehen sowie auf aktive

Zentren der N-terminalen Domäne.

Anhand dieser Literaturvergleiche konnte gezeigt werden, dass die globale Analyse des

Phosphoproteoms nicht nur die Auflistung von phosphorylierten Proteinen wiedergibt,

sondern dass sie erste wichtige Hinweise auf regulatorische Mechanismen, strukturelle

Charakteristika und auf eine mögliche Rolle der Phosphorylierung im

Pathogenitätsgeschehen liefern kann. Somit dienen diese Analysen als Basis für

detaillierte Studien und fördern Ideen für erste Therapieansätze zur Bekämpfung

pathogener Bakterien.

2.2.2.6 Zielproteine der Serin/Threoninkinase PknB

Aufgrund der zahlreich identifizierten phosphorylierten Proteine stellt sich die Frage

nach den dafür verantwortlichen Kinasen. In S. aureus COL ist bisher die Serin-/

Threoninkinase PknB beschrieben worden (Lomas-Lopez u. a., 2007; Rakette u. a.,

2012; Soulat u. a., 2006). Die ersten Untersuchungen zur Rolle von PknB von S. aureus

resultierten in der Erkenntnis, dass die Kinase Enzyme des zentralen

Kohlenstoffwechsels phosphoryliert (Lomas-Lopez u. a., 2007), Funktionen im

Zellwandaufbau, der Autolyse und der Purin/Pyrimidin-Synthese ausübt (Beltramini u.

a., 2009; Donat u. a., 2009) sowie in der Antibiotikaresistenz involviert ist (Tamber u.

a., 2010). Die Kinase besteht aus einer N-terminalen cytosolischen Kinasedomäne,

einer Transmembranspannungsdomäne und drei extrazellulären PASTA-Domänen

(Rakette u. a., 2012).

Es wurden bisher neun potentielle bakterielle Zielproteine (Glyoxylase, Triggerfaktor,

Trioseisomerase, Fruktose-Bisphosphataldolase, Pyruvatdehydrogenase, L7/L12

ribosomales Protein, Elongationsfaktor, Enolase und Phosphatacetyltransferase) der

Kinase PknB detektiert (Lomas-Lopez u. a., 2007).

Des Weiteren wurde vor kurzem festgestellt, dass es sich bei PknB um eine auf Prolin-

gerichtete Kinase handelt, die Ähnlichkeiten zu den eukaryotischen MAP-Kinasen

(Mitogen-aktivierte Protein Kinasen) aufweist (Miller u. a., 2010). Das Charakteristikum

Page 117: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 117

der Prolin-gerichteten Kinasen drückt sich in der spezifischen Konsensussequenz aus,

in der carboxyterminal zum phosphorylierten Serin oder Threonin die Aminosäure

Prolin lokalisiert ist. Es konnte gezeigt werden, dass PknB in das extrazelluläre Medium

sekretiert wird und mit Hilfe von Peptid-Arrays wurden 68 mögliche humane

Zielproteine der Kinase identifiziert (Miller u. a., 2010). Im Spezielleren konnte mit

Hilfe der massenspektrometrischen Analyse, die im Rahmen dieser Arbeit

durchgeführt wurde, für den ATF-2 (Activating Transcription Factor-2) gezeigt werden,

dass eine Phosphorylierung dessen durch PknB stattfinden kann. Hieraus wurde

geschlussfolgert, dass PknB nicht nur Funktionen innerhalb der bakteriellen Zelle

ausübt, sondern dass die Sekretion von PknB Regulationsmechanismen im Wirt

beeinflusst und somit dem Bakterium das intrazelluläre Wachstum ermöglicht (Miller

u. a., 2010).

Aufgrund der spezifischen Konsensussequenz der Prolin-gerichteten Kinasen

(XS*PX/XT*PX (Vulliet u. a., 1989)), wurde eine Analyse der in dieser Arbeit

identifizierten 68 Phosphorylierungsstellen vorgenommen, um potentielle bakterielle

Zielproteine der Kinase PknB zu identifizieren. Das Ergebnis der Konsensusmotivsuche

war für alle identifizierten Phosphorlierungsstellen negativ. Auch die von Lomas-Lopez

und Mitarbeitern detektierten Zielproteine TpiA und FbaA wiesen in den in dieser

Arbeit identifizierten Phosphorylierungsstellen das Prolinmotiv nicht auf, und ein

direkter Sequenzvergleich zwischen den beiden Phosphorylierungsstellen zeigt keine

Motivähnlichkeiten.

Fraglich war, ob sich unter den identifizierten phosphorylierten Peptiden ein

gemeinsames Kinasemotiv (eine Konsensussequenz) erkennen lässt. Da in den meisten

Fällen das aktive Zentrum der Kinase mit vier Aminosäuren ober- und unterhalb der

Phosphorylierungsstelle interagiert (Ubersax & Ferrell, 2007), wurden für die Analyse

jeweils die speziell phosphorylierte Aminosäure, sechs Aminosäuren in N-terminale

Richtung und sechs in C-terminaler Richtung als Sequenz zur Konsensusuche

abgeschickt. Die Konsensussequenzsuche wurde mit dem Programm WebLogo (Crooks

u. a., 2004) (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi) durchgeführt. Jedes Logo besteht

dabei aus Buchstabenblöcken, die jeweils eine Position in der Sequenz besetzen. Die

Konservierung der Sequenz spiegelt sich in der Gesamthöhe der Buchstabenblöcke

Page 118: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

118

wider. Die Höhe der einzelnen Buchstaben innerhalb eines Blockes gibt die relative

Häufigkeit der korrespondierenden Aminosäure an (Crooks u. a., 2004).

Abbildung 33: Sequenzlogos für die in S. aureus identifizierten Phosphorylierungsstellen. Es wurde differenziert zwischen Serin-, Threonin-, S+T- und Tyrosin-Phosphorylierungen. Die Logos wurden mit dem Programm WebLogo kreiert.

Page 119: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 119

Die resultierenden Sequenzlogos für die in S. aureus identifizierten

Phosphorylierungstellen sind in Abbildung 33 dargestellt. Aus den Sequenzlogos geht

hervor, dass keine einheitliche Konsensussequenz für die Phosphorylierungsstellen der

identifizierten Peptide gefunden worden ist. Jedoch zeigt das Sequenzlogo für die

Threoninphosphorylierungen ein Asparagin an Position -3. Dieses Asparagin tritt in 5

von den 18 untersuchten Threoninphosphorylierungsstellen auf. Die

korrespondierenden Proteine dazu sind FbaA (Fruktose-Bisphosphataldolase) und Pyk

(Pyruvatkinase) aus dem Kohlenhydratmetabolismus, die Prolin-Dipeptidease

SACOL1588 und zwei konservierte hypothetische Enzyme (SACOL1680 und

SACOL1789). Interessanterweise stehen drei Enzyme davon in physiologischem

Zusammenhang. FbaA und Pyk sind beide an der Glykolyse bzw. Gluconeogenese

beteiligt, und SACOL1588 zeigt ein verstärktes Phosphorylierungssignal unter

Glukosehunger (siehe Abschnitt 2.2.2.7.1). Durch das gemeinsame Sequenzmotiv kann

angenommen werden, dass diese fünf Enzyme unter dem Einfluss derselben Kinase

stehen.

Betrachtet man das in den am Tyrosin phosphorylierten Peptiden auftretende Leucin

carboxyterminal an Position 3, dann sind drei von 11 Sequenzen mit dieser

Aminosäure ausgestattet. Dies könnte ebenfalls ein Hinweis auf eine gemeinsame

Kinase sein.

Folglich konnte festgestellt werden, dass in den von S. aureus identifizierten

phosphorylierten Peptiden kein einheitliches Kinasemotiv vorliegt und somit entweder

mehrere unterschiedliche Kinasen für die Phosphorylierungsereignisse verantwortlich

sind, eine Kinase sehr unspezifisch agiert oder Autophosphorylierungsreaktionen an

den Enzymen selbst vorkommen. Zur Klärung müssen weitere Untersuchungen, wie

z. B. Kinasemutantenanalysen, folgen.

2.2.2.7 Dynamic des Phosphoproteoms unter veränderten physiologischen Bedingungen

Ein bakterieller Erreger wird während seines Lebenszyklus sich ständig wechselnden

Umweltbedingungen, wie z. B. Veränderungen des pH-Wertes der Umgebung, ein

variierendes Nährstoffangebot und Wassermangel (Dehydrierung), ausgesetzt.

Page 120: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

120

Zusätzlich stellen von humaner Hand eingesetzte Desinfektionsmittel und die

Immunabwehr des besiedelten Wirtes eine stetige Bedrohung für das pathogene

Bakterium dar, die es durch verschiedenste Wege der Anpassung, z. B. durch

Enzymregulationen über Phosphorylierungsereignisse, "versucht" zu umgehen. Um

erste Hinweise auf auf Phosphorylierungsgeschehnissen basierende

Regulationsmechanismen unter sich ändernden Umweltbedingungen zu erhalten,

wurde das Phosphoproteom von S. aureus im Rahmen dieser Arbeit gelbasiert unter

vier verschiedenen physiologischen Stress-Bedingungen (Glukosehunger, nitrosativer

Stress, Diamidstress (oxidativer Stress) und osmotischer Stress) untersucht. Gesucht

wurden phosphorylierte Proteine mit signifikant veränderten oder neu auftretenden

Signalintensitäten in Antwort auf Stress oder Hunger, die in insgesamt drei

biologischen Replikaten auftraten. Eine signifikante Veränderung des Pro-Q-Signals des

phosphorylierten Proteins wurde dann angenommen, wenn das Verhältnis der

Signalintensitäten (% V) Stresszeitpunkt versus Kontrolle ≥ 2 (Zunahme der

Signalintensität) oder ≤ 0,5 (Abnahme der Signalintensität) auftrat (im log2-Raum

entsprechend bei ≥ 1 und ≤ -1) (Signifikanzgrenzen siehe Abschnitt 2.1.5). Die

Signifikanz musste sich in einem der zu untersuchenden Zeitpunkte widerspiegeln und

in mindestens zwei biologischen Replikaten vorliegen. Bei einem der drei Replikate

wurde eine 10 %ige Unterschreitung der Toleranzwerte geduldet.

Die Veränderungen in der Signalintensität phosphorylierter Proteine können wichtige

Hinweise auf regulatorische Effekte liefern, jedoch ist zu berücksichtigen, dass

veränderte Phosphorylierungssignale im 2D-Gel sich in mehreren Ursachen begründen

können:

A) vormals nicht phosphoryliert vorliegendes oder neuexprimiertes Protein wird durch

eine Kinase oder durch Autophosphorylierungsreaktionen phosphoryliert

B) ein Phosphorylierungssignal erscheint durch ein kovalent gebundendes

phosphoryliertes Substrat oder Cofakor

C) das Phosphoprotein wird durch eine Phosphatase aktiv dephosphoryliert

D) das Phosphoprotein wird degradiert

Page 121: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 121

Um detailliertere Einblicke zu erhalten, müßte die Puls-Chase-Markierung mit einem

radioaktiven Phosphatisotop mit der Puls-Chase-Markierung mit radioaktivem

Methionin 2D-gelbasiert verglichen werden.

Ziel dieser Arbeit war es mit der 2D-gelbasierten Methode und der Pro-Q Färbung in

der globalen Ansicht erste wichtige Hinweise auf mögliche Regulationsmechanismen

zu liefern, die dann motivieren diese im Detail zu analysieren.

2.2.2.7.1 Glukosehunger

Durch die physiologische Einordnung der identifizierten phosphorylierten Proteine von

S. aureus konnte bereits ermittelt werden, dass insgesamt 27 % dem

Energiestoffwechsel zugeordnet werden können (siehe Abschnitt 2.2.2.4). Im

gelbasierten Ansatz liegt der Anteil sogar bei 32 %. Aufgrund dieser Dominanz von

phosphorylierten glykolytischen Enzymen, Enzymen des TCC und des

Pentosephosphat-Wegs wurden im 2D-Gel die zahlreichsten Veränderungen im

Phosphoproteom unter Glukosehungerbedingungen erwartet. Das Ziel der 2D-Gel

basierten Untersuchungen lag in der Visualisierung und Quantifizierung dieser

Veränderungen, um mögliche Anpassungs-/Regulationsmechanismen bei

Glukosehunger, an denen Phosphorylierungsereignisse beteiligt sind, aufzuspüren. Die

in diesem Experiment zu erzielende Glukoselimitation wurde durch eine Anzucht der

Zellen in synthetischem Medium unter Zugabe von 0.05 % (w/v) Glukose bei einer

optischen Dichte von 0,9 - 1 erreicht. Die Zellernte erfolgte in der exponentiellen

Wachstumsphase bei der OD500nm = 0,5 in der Transientphase und drei Stunden nach

Eintritt in die stationäre Phase (siehe Abbildung 34).

Es konnten insgesamt sechs Veränderungen in der Signalintensität phosphorylierter

Proteine quantifiziert werden. Die betroffenen Proteinspots wurden im

Zweikanalfarbenbild Flamingo versus Pro-Q markiert (Abbildung 35).

Die Proteinspots konnten als SACOL1483, Pyk-4, DeoB-1, DeoB-3, Pgm und SACOL1588

identifiziert werden. Für vier der fünf Proteine konnte im Vorwege mindestens eine

spezifische Phosphorylierungsstelle identifiziert werden. Eine Phosphorylierung für das

Protein SACOL1483 wird bisher nur aufgrund der Pro-Q-Färbung angenommen, einen

Beweis durch die Identifizierung einer Phosphorylierungsstelle steht noch aus.

Page 122: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

122

Abbildung 34: Das logarithmische Wachstum von S. aureus exemplarisch gezeigt anhand der optischen Dichte während des Glukosehungerversuchs. Die Zeitpunkte in denen die Zellernte erfolgte, wurden markiert.

Abbildung 35: Zweikanalfarbenbild des Zeitpunktes drei Stunden nach Eintritt in die stationäre Phase. Gegenübergestellt ist die Gesamtproteinfärbung (grün) und die Pro-Q-Färbung (rot). Die in der Signalintensität veränderten phosphorylierten Proteinspots wurden markiert.

Page 123: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 123

In der Abbildung 36 wurden die Signalintensitäten, die korrespondierenden Ratios und

drei Replikate in jeweils zwei Graphiken pro Spot aufgeführt. Zusätzlich wurden

exemplarisch die Veränderungen mithilfe von Ausschnitten aus dem

Zweikanalfarbenbild dokumentiert. Die übereinstimmenden Signalintensitäten des

Kontrollgels von Replikat 2 und 3 gehen aus der Nutzung desselben Gels für beide

Replikate hervor.

Page 124: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

124

Abbildung 36: Darstellung der Signalintensitäten (Pro-Q-Färbung) in % Volumen für den jeweiligen Proteinspot zu den unterschiedlichen Zeitpunkten im Versuchsverlauf (linke Graphik). Dem Säulendiagramm wurden Auschnitte aus dem Zweikanalfarbenbild (Flamingo vs. Pro-Q) eines Replikates hinzugefügt, in dem der quantifizierte Spot umrandet wurde. Die jeweils rechte Graphik beschreibt die log2-Ratios der verschiedenen Zeitpunkte die jeweils mit der Kontrolle in das Verhältnis gesetzt wurden. Die rote Linie markiert die Signifikanzgrenze. Der Mittelwert der log2-Ratios der drei Replikate wurde mit aufgeführt.

Die Analysen zeigen, dass für die phosphorylierten Proteinspots DeoB-1, DeoB-2,

Pgm-3 und SACOL1588 eine signifikante Zunahme und für Pyk-4 und SACOL1483 eine

signifikante Abnahme der Signalintensität (Pro-Q-Färbung) quantifiziert werden

Page 125: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 125

konnte. Auffällig ist des Weiteren, dass das Gel aus der transienten Phase des ersten

Replikates für alle Spots geringere Signalintensitäten aufweist. Durch die Verwendung

derselben Pro-Q-Färbelösung besteht der Fehler nicht in dem Färbeablauf, sondern im

Auftrag einer zu geringen Proteinmenge. Dieser Fehler beeinträchtigt die

Mittelwertergebnisse, aber nicht das Gesamtergebnis.

Für den Umweltfaktor Glukosehunger wurden kürzlich tiefgreifende Veränderungen im

Proteom vom exponentiellen Wachstum bis hin zur stationären Phase beschrieben

(Becher u. a., 2009; Kohler u. a., 2005; Liebeke u. a., 2011). Es wurde festgestellt, dass

S. aureus in der stationären Phase Acetat, Pyruvat und Aminosäuren als alternative

Kohlenstoffquellen verwertet und diese über den Tricarbonsäurezyklus oxidiert.

Enzyme dieser Stoffwechselwege, ebenfalls die der Gluconeogenese, zeigten ein stark

erhöhtes Induktionsprofil. Ferner lagen Enzyme, die für die Degradation von

Aminosäuren benötigt werden, in erhöhter Anzahl vor. Glykolytische Enzyme wurden

nicht weiter synthetisiert, nahmen in der Menge nur wenig ab und zeigten sich

weitestgehend stabil (Becher u. a., 2009; Kohler u. a., 2005; Liebeke u. a., 2011;

Michalik u. a., 2009). Des Weiteren zeigte sich eine Degradation von "arbeitslos"

gewordenden Proteinen wie z. B. Enzymen der Nukleid- und Aminosäuresynthese, des

Energiemetabolismus und der Cofaktorsynthese. Michalik und Mitarbeiter postulieren

dies als eine wichtige Eigenschaft von S. aureus um in Zeiten des Hungers Zugang zu

Nährstoffen zu erhalten und sich so das Überleben zu sichern (Michalik u. a., 2009).

In der nachfolgenden Tabelle 13 sind die in der Literatur bekannten Veränderungen

der fünf sich in dieser Arbeit verändernden phosphorylierten Proteine aufgeführt, um

in Verbindung mit den hier ermittelten Daten auf mögliche Regulationen schließen zu

können.

Aus der Tabelle geht hervor, dass nur für die Phosphopentomutase ein verringertes

Signal und eine Abnahme der Proteinmenge bei auftretendem Glukosehunger

beschrieben wurden. Die Proteine Pyk, DeoB, SACOL1588 und SACOL1483 weisen

hingegen überwiegend keine Veränderungen auf.

Page 126: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

126

Tabelle 13: Literaturdaten in Bezug auf das Mengensignal ausgewählter Proteine im Vergleich exponentielles Wachstum und stationärer Phase.

Protein Kohler u. a. 2005

Michalik u. a. 2009

Becher u. a. 2009

Liebeke u. a. 2011

Pgm Abnahme anfänglich stabil, nach 20 h Degradation

verminderte Expression/

degradiert

Abnahme

Pyk leichte Abnahme gleichbleibend gleichbleibend

DeoB gleichbleibend

SACOL1588 gleichbleibend

SACOL1483 gleichbleibend

Aufgrund der Literaturdaten ist davon auszugehen, dass die in dieser Arbeit

detektierten Abnahmen der Signale der Phosphoproteine Pyk und SACOL1483 nicht

durch eine Degradation des Proteins, sondern durch eine Dephosphorylierung

hervorgerufen wurden.

2010 veröffentlichten Zoraghi und Mitarbeiter eine detaillierte Charakterisierung der

Pyruvatkinase von S. aureus. Unter anderem lieferten sie aufgrund ihrer Ergebnisse

ein erstes Modell der Pyruvatkinaseregulation. In diesem beschreiben sie die

Steigerung der Enzymaktivität der Pyruvatkinase (Pyk) durch die Aktivatoren AMP und

Ribulose-5-Phosphat (R5P) in der exponentiellen Wachstumsphase. Zusätzlich konnten

sie feststellen, dass durch die geringe Menge an verwertbaren Zuckern in der

stationären Wachstumsphase der Pentosephosphatweg zurückgefahren wird und dies

in einer niedrigeren Konzentration des Pyk-Aktivators R5P resultiert, und somit in einer

geringeren Aktivierung der Kinase endet (Zoraghi u. a., 2010).

Zoraghi und Mitarbeiter erwähnen kein Phosphorylierungsevent als regulatorisches

Ereignis, sie stellten jedoch fest, dass der starke Abfall der Enzymaktivität in der

sationären Phase nicht mit der Enzymmenge korreliert und dies auf eine

posttranskriptionale Regulation hinweist.

Gelbasiert konnte in dieser Arbeit eine Phosphorylierungsstelle am Threonin 537, das

sich in der extra C-terminalen Domäne (CT-Domäne) des Proteins befindet,

nachgewiesen werden. Diese Domäne ist eine Besonderheit und kommt in einigen

bakteriellen Organismen, wie z. B. Geobacillus stearothermophilus, B. lichiniformes,

Page 127: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 127

Lactobacillus delbrueckii, Synechocystis sp. PCC6803 und S. aureus vor und trennt diese

Puruvatkinasen somit strikt von den eukaryotischen (Muñoz & Ponce, 2003).

Mehrere Charakteristika lassen sich für die CT-Domäne aufführen. Zum einen wurde

für G. stearothermophilus beschrieben, dass die CT-Domäne zur Stabilität der als

Tetramer vorliegenden Pytuvatkinase beiträgt, da die Reste T539 (homolog zu T537

von S. aureus) und L538 der CT-Domäne mit den Resten E206 und E209 der A-Domäne

mittels Wasserstoffbrückenbindungen schwach interagieren (Sakai, 2004; Suzuki u. a.,

2008). Zoraghi und Mitarbeiter konnten für S. aureus zeigen, dass die CT-Domäne eine

hohe Affinität zu PEP und ADP aufweist. Sie stellten aber keine Beteiligung der CT-

Domäne an der Tetramerisierung des Enzyms, der Substratbindung und in der

allosterischen Regulation des Holoenzyms fest. Wiesen aber der Domäne eine

bedeutende Rolle in der Enzymaktivität und ebenfalls in der Stabilität des Enzyms zu

(Zoraghi u. a., 2010). Die zweifache Antwort des Enzyms auf ATP, in der die Kinase bei

physiologischer ATP-Konzentration stimuliert und bei hoher ATP-Konzentration

inaktiviert wird, schreiben sie aufgrund von Mutantenanalysen ebenfalls der CT-

Domäne zu (Zoraghi u. a., 2010).

Des Weiteren enthält die CT-Domäne eine PEP-bindende Sequenz (PEP =

Phosphoenolpyruvat), die weitestgehend homolog zu dem PEP-Bindemotiv der PEP-

nutzenden Enzyme ist, wie z. B. der Pyruvat-orthophosphat-Dikinase des Zea mays, der

PEP-Synthetase oder der Phosphotransferase des PTS-Systems von E. coli. und

Salmonella typhimurium (Burnell, 2010; Sakai & Ohta, 1993; Suzuki u. a., 2008).

Fraglich ist, welche Aufgabe die PEP-bindenden Sequenz in der Pyruvatkinase besitzt.

PEP-Synthetasen kommen in vielen bakteriellen Organismen vor und katalysieren den

gluconeogenetischen Reaktionsschritt von Pyruvat zu PEP.

Jim Burnell postulierte 2010 den Regulationsmechanismus der PEP-Synthetase von

E. coli. In diesem beschreibt er die Regulation des Enzyms über die ADP-Konzentration

mithilfe des PEP-Synthetase regulierenden Enzyms (PEPSRE). Bei vorherrschenden

hohen ADP-Konzentrationen, wie es in der exponentiellen Wachstumsphase der Fall ist

(s. u.), liegt das Enzym am Threonin phosphoryliert vor. Bei Eintritt in die stationäre

Wachstumsphase verringert sich die ADP Konzentration. Das Enzym wird durch

Dephosphorylierung aktiviert und Pyruvat wird zu PEP phosphoryliert (Burnell, 2010).

Page 128: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

128

Interessant ist die Übertragung dieses Modells auf die Pyruvatkinase von S. aureus.

Laut Gendatenbank (aus UniprotKB, Uniprot Consortium) besitzt S. aureus ein

putatives Pyruvat-Phosphat-Dikinase-regulatorisches-Protein (PPDRP) aber keine PEP-

Synthetase oder eine Pyruvat-ortho-Phosphat-Dikinase. Es kann jedoch spekuliert

werden, dass die in der Pyruvatkinase beschriebene PEP-bindende Domäne der PEP-

nutzenden Enzyme durch das PPDRP reguliert wird. Einen Hinweis darauf liefert die in

dieser Arbeit identifizierte Phosphorylierungsstelle am Threonin 537. Diese ist

homolog zu dem regulatorisch phosphorylierten Threonin der PEP-Synthetase von

E. coli und der Pyruvat-Phosphat-Dikinase von Zea mays (siehe Abbildung 37). Die

Ergebnisse der 2D-Gel-basierten Analysen dieser Arbeit, in denen ein

Phosphorylierungssignal der Pyruvatkinase in der exponentiellen Wachstumsphase

und ein stark vermindertes in der stationären Phase detektiert werden konnte,

unterstreichen den oben beschriebenen Regulationsmechanismus, in dem das

Threonin in der exponentiellen Phase, nicht aber in der stationären Phase

phosphoryliert vorliegt.

Abbildung 37: Ausschnitt aus dem Sequenzalignment der Pyruvat-Phosphat-Dikinase des Mais, der PEP-Synthetase von E. coli und der Pyruvatkinase von S. aureus. Die phosphorylierten Threonine und die Histidine der Histidin-vermittelten Phosphorylgruppen-Übertragungsreaktion wurden in Fettdruck dargestellt.

Ein bedeutender Unterschied besteht jedoch zwischen den PEP-Motiven von

G. stearothermphilus, E. coli, Zea mays und S. aureus. Anstelle des

Phosphorylgruppenübertragenden Histidins liegt bei S. aureus ein Prolin vor. Folglich

kann die Reaktion vom Pyruvat zum PEP nicht stattfinden.

Page 129: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 129

Fraglich ist nun, welche Aufgabe dem über die Phosphorylierung kontrollierten PEP-

bindenden Motiv in S. aureus zukommt, da eine gluconeogenetische Reaktion

aufgrund des fehlenden Histidins auszuschließen ist.

Diskussionswürdig ist hierbei, ob sich das PEP-Bindemotiv aus einem vormals

bifunktionellen Enzym erklärt und die PEP-Bindedomäne als funktionsloses Rudiment

zurückgeblieben ist oder ob sich, durch das Aneignen einer neuen Domäne, die

Möglichkeit eines "Finetuning" des Enzyms evolutionär entwickelt hat und dieser

Domäne somit einer Funktion zukommt.

Für das letztere spricht, dass Zoraghi und Mitarbeitern der CT-Domäne eine Funktion

in der Regulierung des Enzyms aufgrund unterschiedlicher ATP-Konzentrationen

zugesprochen haben (Zoraghi u. a., 2010).

Anhand der im Rahmen dieser Arbeiten erzielten Ergebnisse für die Pyruvatkinase von

S. aureus und der oben beschrieben Literaturdaten kann folgender

Regulationsmechanismus vorgeschlagen werden, der eine erste Idee liefert und zu

detaillierten Studien motiviert:

Durch die erhöhte ADP/ATP-Konzentration in der exponentiellen Wachstumsphase

(Liebeke u. a., 2011) könnte das Threonin 537 in der CT-Domäne von dem PPDRP

phosphoryliert werden und die Stabilität der als Tetramer vorliegenden Pyruvatkinase

verändern, indem durch sie z. B. die Interaktion zwischen der CT-Domäne und der A-

Domäne des Nachbarenzyms beeinflusst wird. Dies könnte die Aktivität des Enzyms

erniedrigen und so den Energieladungszustand der Zelle konstant halten, indem kein

nicht nutzbarer ATP-Überschuss produziert wird. Bei einsetzendem Glukosehunger und

dem daraus folgendem Abfall der ADP/ATP-Konzentration (Liebeke u. a., 2011), könnte

eine Dephosphorylierung des Threonins durch das PPDRP die Enzymstruktur insoweit

verändern, dass die Aktivitätshemmung wieder aufgehoben wird und das Enzym durch

die Effektorbindung allosterisch kontrolliert werden kann.

Aufgrund dieser Regulation wäre eine zusätzliche Kontrolle der Pyruvatkinase (neben

der allosterischen Effektor-Kontrolle) möglich, die den Energieladungszustand der Zelle

über die ADP/ATP-Konzentration reguliert.

Page 130: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

130

Zur Validierung dieses Regulationsmodels müssen Strukturanalysen der

phosphorylierten und unphosphorylierten Pyruvatkinase, sowie Mutantenanalysen

durchgeführt werden.

Das erhöhte Signal der phosphorylierten Phosphoglyceratmutase (Pgm) liefert einen

Hinweis auf eine regulatorische Rolle im Wechsel von der Glykolyse zur

Gluconeogense. Interessant ist hierbei, dass in der Literatur eine Abnahme des Enzyms

zu recherchieren war, die phosphorylierte Isoform in diesen Untersuchungen jedoch

eine Zunahme des Signals zeigt.

Fraglich bleibt die Zunahme der Signalintensität der phosphorylierten

Phosphopentomutase (DeoB), die zudem in drei größenunterschiedlichen Isoformen

im Gel auftritt.

Das verstärkte Phosphorylierungssignal der Prolin-Dipeptidase (SACOL1588), die zur

Nutzung von Aminosäuren als alternative C-Quellen dient, deutet auf eine Aktivierung

des Enzyms hin.

In einem Vergleich der Ergebnisse aus dieser Arbeit und den Ergebnissen von B. subtilis

in Bezug auf Veränderungen von Phosphorylierungssignalen unter Glukosehunger

konnten keine Gemeinsamkeiten festgestellt werden, obwohl die hier beinflussten

Enzyme DeoB, Pyk und Pgm homologe Phosphorylierungsstellen aufweisen.

2.2.2.7.2 Stressinduktion durch Stickstoffmonoxid

Um in seinem natürlichen Habitat überleben zu können, muss sich S. aureus gegen

Stickstoffmonoxid, welches von der Immunantwort des Wirtes generiert wird,

schützen können (Lewis u. a., 1995; Nalwaya & Deen, 2005). Stickstoffmonoxid und

seine reaktiven Stickstoffspezies reagieren mit einer Vielzahl von Substraten, wie

Metallkernen, Tyrosinresten, Nukleotidbasen, Lipiden und Thiolen und rufen indirekte

Effekte wie z. B. die Inhibierung der bakteriellen Respiration oder der

Aminosäuresynthese hervor (Borisov u. a., 2004; Hyduke u. a., 2007; Nathan & Shiloh,

2000). In einer kürzlich erschienenen Studie konnte gezeigt werden, dass NO-Stress die

Page 131: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 131

Atmung inhibiert, was zu einem umfassenden Shift zum anaeroben Metabolismus

führt und die glykolytische Aktivität erhöht (Borisov u. a., 2004; Hochgräfe u. a., 2008).

Überdies schützt sich der Organismus vor reaktiven Stickstoffmonoxidspezies durch

eine koordinative Stressantwort, die die Exprimierung des NO-detoxifizierenden

Flavohämoglobins Hmp sowie Enzyme des hypoxic sowie des anaeroben Metabolismus

beinhaltet. Die Expression einer Vielzahl dieser Enzyme wird durch das

Zweikomponentensystem SrrAB reguliert (Richardson u. a., 2006). Weiterhin wurde

gezeigt, dass unter nitrosativen Stressbedingungen das Gen der Lactatdehydrogenase

1 (ldh1) exprimiert wird und dies einen Anpassungsmechanismus darstellt, da es die

Erhaltung der Redox-Homöostase durch Milchsäuregärung während des anhaltenden

Stresses ermöglicht (Richardson u. a., 2008).

Aufgrund des Umbruchs im Metabolismus und des weitreichenden Einflusses von

Stickstoffmonoxid in die bakterielle Physiologie wurden Veränderungen im

Phosphoproteom erwartet. Das NO-Stress Experiment wurde gemäß Hochgräfe und

Mitarbeitern durchgeführt, indem MAHMA NONOat [6-(2-hydroxy-1-methyl- 2-

nitrosohydrazino)-N-methyl-1-hexanamin], das als NO-Donor fungiert, in einer

Konzentration von 500 µM hinzugegeben wurde (Hochgräfe u. a., 2008).

Es konnten im Rahmen dieser Arbeit zwei neu erscheinende Phosphorylierungssignale

(Pro-Q-Färbung) detektiert werden. Es handelt sich hierbei um das hitzeinduzierbare

Chaperon HchA und das glykolytische Enzym FdaB (Fruktose-Bisphosphat-

Aldolase)(siehe Abbildung 38).

Die Graphiken der Abbildung 38 verdeutlichen die signifikante Zunahme bzw. das

Erscheinen der phosphorylierten Isoformen der Proteine FdaB und HchA.

Beide Proteine weisen unter exponentiellen Bedingungen einen phosphorylierten

Proteinspot auf. HchA wurde kürzlich im Zusammenhang mit antioxidativen Strategien

unter Diamid-Stress beschrieben (Wolf u. a., 2008). Durch das Auftreten einer

weiteren phosphorylierten Isoform kann eine Funktion des Enzyms unter NO-Stress,

die durch Phosphorylierung reguliert wird, angenommen werden.

Page 132: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

132

Abbildung 38: Darstellung der Signalintensitäten (Pro-Q-Färbung) in % Volumen für den jeweiligen Proteinspot zu den unterschiedlichen Zeitpunkten im Versuchsverlauf (linke Graphik). Dem Säulendiagramm wurden Auschnitte aus dem Zweikanalfarbenbild (Flamingo vs. Pro-Q) eines Replikates hinzugefügt in dem der quantifizierte Spot umrandet wurde. Die jeweils rechte Graphik beschreibt die log2-Ratios der verschiedenen Zeitpunkte, die jeweils mit der Kontrolle in das Verhältnis gesetzt wurden. Die rote Linie markiert die Signifikanzgrenze. Trotz des nicht erkennbaren Spots in dem Zweikanalfarbenbild ist ein %V-Wert für den Kontrollspot vorhanden. Dies ist in dem Algorithmus der Delta 2D-Software begründet, der auch die unterhalb der Detektionsgrenze liegenden Grauschattierungen als Wert mit einbezieht, um nicht durch Null zu dividieren.

FdaB wurde kürzlich als Markerprotein für anaeroben Metabolismus, wie auch für

NO-Stress beschrieben (Hochgräfe u. a., 2008). Auch hier tritt aufgrund der

Stresseinwirkung eine weitere phosphorylierte Isoform auf. Im Rahmen dieser Arbeit

konnte in ersten Experimenten unter anaeroben Bedingungen diese zweite

phosphorylierte FdaB-Isoform nicht detektiert werden (siehe Abbildung 39). Dies wird

als erster Hinweis betrachtet, dass diese zweite Phosphorylierung spezifisch für

NO-Stress ist.

Page 133: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 133

Abbildung 39: Vergleich der Signalintensitäten (Pro-Q-Färbung) der Proteine HchA und FdaB-2 unter Anaerobiose (links) und NO-Stress (rechts). Es sind jeweils Ausschnitte aus den Zweikanalbildern in denen die Gesamtproteinfärbung (grün) und die Pro-Q-Färbung(rot) dargestellt wurde. In der obersten Reihe befinden sich die korrespondierenden Ausschnitte aus den jeweiligen Mastergelen, darunter die jeweiligen Ausschnitte aus den Kontrollen und nach 15 minütiger Stressinduktion. Die Proteinspots FdaB-2 und HchA wurden umkreist. Aus diesen Bildern geht hervor, dass im Gegensatz zum NO-Stress, die Proteinspots unter Anaerobiose nicht auftreten.

Fraglich ist, welche Bedeutung der zusätzlichen phosphorylierten FdaB-Isoform

zukommt. S. aureus besitzt zwei verschiedene Fruktose-Bisphosphataldolasen, die

aufgrund ihres Spaltungsmechanismus in unterschiedliche Klassen eingeordnet

werden. Hierbei handelt es sich bei FbaA um ein Enzym der Klasse II Fruktose-

Aldolasen, dass für die Spaltung von Fruktose-1,6-Bisphosphat in Glycerinaldehyd-3-

phosphat und Dihydroxyacetonphosphat ein divalentes Kation (hier Zn2+) als

Elektrophil für die Reaktion benötigt (Marsh & Lebherz, 1992). FdaB hingegen wird in

die Klasse I eingeordnet, da das Enzym in der Spaltungsreaktion ein kovalentes

"Schiffsche-Base"-Intermediat bildet. Aus Studien für Borrelia burgdorferi geht hervor,

dass die Zinkmetallo-Fruktose Bisphosphat Aldolase der Klasse II sensitiv gegenüber

nitrosativem Stress ist und inhibiert wird (Bourret u. a., 2011). Bourret und Mitarbeiter

stellen dabei die These auf, dass die funktionslose Fruktose-1,6-Bisphosphataldolase

Page 134: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

134

der Klasse II durch das Enzym der Klasse I (falls vorhanden, wie bei Salmonella

typhimurium und S. aureus) ersetzt werden kann.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine zweite phosphorylierte Isoform des FdaB Enzyms

unter nitrosativem Stress detektiert werden. Diese liefert einen ersten Hinweis auf die

Aktivierung des Enzyms. FdaB könnte somit die Aufgaben des Enzyms FbaA, das

vorraussichtlich unter nitrosativen Bedingungen inaktiviert vorliegt, übernehmen und

den glykolytischen Stoffwechselweg an diesem Punkt erhalten.

Eine weitere interessante Beobachtung ist der zusätzlich erscheinende Pro-Q-gefärbte

Spot des Proteins HchA. Für dieses Protein wird nicht nur eine Chaperonfunktion

beschrieben, sondern es wird auch eine Glyoxalase-III-Funktion vorhergesagt

(http://www.uniprot.org/uniprot/Q5HIC4). Folglich kann HchA Methylglyoxal in

D-Lactat umwandeln und somit die Zelle vor einer lethalen Dosis des zytotoxischen

Methylglyoxals bewahren.

Für einige Organismen wurde ein Methylglyoxal-Bypass beschrieben, der eine

Akkumulation von C3-Zuckerphosphaten unter "Overflow-Metabolismus"-

Bedingungen verhindern soll, indem durch eine Methylglyoxalsynthetase das

Dihydroxyacetonphosphat in Methylglyoxal umgewandelt wird, das dann entweder

exkretiert oder in D-Lactat umgewandelt wird (zusammengefasst in (Landmann u. a.,

2011).

Diese Möglichkeit besteht bei S. aureus nicht, da der Organismus keine

Methylglyoxalsynthetase aufweist.

Methlglyoxal kann jedoch auch durch eine nicht-enzymatische Umwandlung aus

Glycerinaldehyd-3-phosphat und DHAP gebildet werden (Cooper, 1984). Hierbei sollen

polyvalente Anionen, wie z. B. Phosphate, Bicarbonate und phosphorylierte

Kohlenhydrate die Formierung des Methylglyoxals aus Glycerinaldehyd-3-phosphat

und Dihydroxyacetonphosphat bewirken (Riddle & Lorenz, 1968).

Eine solche Umwandlung könnte auch in S. aureus unter nitrosativen Bedingungen bei

der Akkumulation von C3-Zuckerphosphaten stattfinden, so dass der Organismus zur

Entgiftung des Methylglyoxals dessen Umwandlung durch HchA in D-Lactat benötigt.

Die zweite phosphorylierte Isoform von HchA, die unter nitrosativen Bedingungen

auftritt, könnte die Aktivierung dieses Enzyms markieren und somit einen Hinweis auf

Page 135: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 135

einen Methylglyoxal detoxifizierenden Mechanismus, der unter nitrosativen

Stressbedingungen zum Tragen kommt, geben.

2.2.2.7.3 Stressinduktion durch Diamid

Aerobe Organismen sind dem dauernden Einfluss von reaktiven Sauerstoffspezies, wie

Superoxidanionen, Hydrogenperoxid oder Hydroxylradikalen ausgesetzt. Diese rufen

z. B. die Formierung von nicht nativen inter- und intrazellulären Disulfidbrücken

hervor, durch die das Protein in seiner Funktion, aufgrund von Fehlfaltungen,

eingeschränkt und somit geschädigt wird (Pöther u. a., 2009). Des Weiteren wurde

beschrieben, dass S. aureus Thiolierungen (Disulfidbrücken zwischen Proteinen und

niedermolekularen Thiolen) einführt, um die S-Thiole zu modifizieren und sie somit vor

irreversiblen Oxidationen zu schützen (Hochgräfe u. a., 2007; Pöther u. a., 2009).

In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass die Formierung dieser

Disulfidbrücken durch die Zugabe von Diamid induziert werden kann (Kosower &

Kosower, 1995). Diamid wirkt als elektrophile Spezies und sollte in den hier

durchgeführten Versuchen oxidativen Stress in der Zelle auslösen.

Folglich wird die Beinflussung und Veränderung der Regulation der Reparatur- und

Degradations-Enzyme durch die oxidative Stresseinwirkung, wie auch schon in einer

früheren Proteomstudie beschrieben (Wolf u. a., 2008), erwartet. Ob dies auch

Phosphorylierungsgeschehnisse beinflusst, sollte hier untersucht werden.

Überraschenderweise konnte keine Veränderungen des Phosphoproteommusters im

Hinblick auf degradative Enzyme beobachtet werden. An Stelle dessen konnte eine

Veränderung in dem Phosphorylierungsmuster eines glykolytischen Enzyms (Pyk)

ermittelt werden. Das phosphorylierte Protein Pyk-4 zeigte eine Erhöhung der

Signalintensität (siehe Abbildung 40).

Interessanterweise wurde beschrieben, dass die Pyruvatkinase von S. aureus MRSA252

unter Diamid-Einwirkung eine S-Cysteinylierung am C8 aufweist (Pöther u. a., 2009). In

welcher Verbindung dazu jedoch das erhöhte Pro-Q Signal steht, bleibt fraglich und

bedarf weiterer Untersuchungen.

Page 136: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

136

Abbildung 40: Darstellung der Signalintensitäten (Pro-Q-Färbung) in % Volumen für den jeweiligen Proteinspot zu den unterschiedlichen Zeitpunkten im Versuchsverlauf (linke Graphik). Dem Säulendiagramm wurden Auschnitte aus dem Zweikanalfarbenbild (Flamingo vs. Pro-Q) eines Replikates hinzugefügt, in dem der quantifizierte Spot umrandet wurde. Die jeweils rechte Graphik beschreibt die log2-Ratios der verschiedenen Zeitpunkte, die jeweils mit der Kontrolle ins Verhältnis gesetzt wurden. Die rote Linie markiert die Signifikanzgrenze.

2.2.2.7.4 Stressinduktion durch Natriumchlorid (osmotischer Stress)

Die Auswirkung von osmotischem Stress, induziert durch Natriumchlorid, auf das

Phosphoproteommuster der bakteriellen Zelle wurde im Rahmen dieser Arbeit

untersucht. In früheren Studien wurde dieser Stress als Auslöser der generellen

Stressantwort eingesetzt. Hierbei zeigte sich, dass keine signifikanten Unterschiede im

Akkumulationsmuster der beteiligten Enzyme des SigB-Regulons festgestellt werden

konnten (Pané-Farré u. a., 2009).

Um herauszufinden, ob andere Regulationsmechanismen zur Anpassung an

osmotischen Stress beteiligt sind, wurde das Phosphoproteom auf Stress bedingte

Veränderung untersucht.

In dem 2D-gelbasiertem Ansatz konnten keine signifikanten Unterschiede in den

Signalintensitäten des phosphorylierten Anti-Anti-Sigmafaktors RsbV des generellen

Stressregulons festgestellt werden und dies bestätigt somit die von Jan Pané-Farré

beschriebenen Beobachtungen. Ein signifikant verändertes Signal konnte für den Spot

1 der Phosphopentomutase DeoB quantifiziert werden (siehe Abbildung 41).

Page 137: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 137

Abbildung 41: Darstellung der Signalintensitäten (Pro-Q-Färbung) in % Volumen für den jeweiligen Proteinspot zu den unterschiedlichen Zeitpunkten im Versuchsverlauf (linke Graphik). Dem Säulendiagramm wurden Auschnitte aus dem Zweikanalfarbenbild (Flamingo vs. Pro-Q) eines Replikates hinzugefügt, in dem der quantifizierte Spot umrandet wurde. Die jeweils rechte Graphik beschreibt die log2-Ratios der verschiedenen Zeitpunkte, die jeweils mit der Kontrolle ins Verhältnis gesetzt wurden. Die rote Linie markiert die Signifikanzgrenze.

Inwieweit dieses Phosphorylierungsereignis unter osmotischem Stress eine Rolle spielt,

ist fraglich. Kürzlich wurde beschrieben, dass DeoB nicht nur die Reaktion von

Ribose-5-P and Ribose-1-P katalysiert, sondern auch als immunogenes ankerloses

Zellwandprotein in S. aureus fungiert (Glowalla u. a., 2009). Inwieweit hier ein

Phosphorylierungsereignis eine Rolle spielen könnte, muss untersucht werden.

2.3 gelbasierte Quantifizierung des Phosphoproteoms von B. subtilis via metabolischer 14N/15N-Markierung

Die Quantifizierung der Phosphorylierungssignale bzw. der phosphorylierten Proteine

innerhalb physiologischer Prozesse ist ein wichtiger Teil der Phosphoproteomic, um

eventuell bestehende Regulationsmechanismen erkennen und erklären zu können.

Dafür bedarf es spezieller Methoden, um akkurate und reproduzierbare Daten für die

phosphorylierten Proteine und ihre quantitativen Veränderungen zu erzeugen.

Wie schon in Abschnitt 2.1.5 und 2.2.2.7 für B. subtilis und S. aureus gezeigt werden

konnte, stellt die traditionelle 2D-Gel-Methode eine sichere Methode zur relativen

Quantifizierung des Phosphoproteoms (unter Verwendung des phosphosensitiven

Page 138: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

138

Pro-Q diamond Farbstoffes) bzw. des Proteoms dar (Bernhardt u. a., 2003; Eymann u.

a., 2007; Kohler u. a., 2005). Die Ergebnisse für das Phosphoproteom sind jedoch stark

abhängig von der Qualität der Pro-Q-Färbung und der Auflösung der einzelnen

Proteinspots. Da die Signalintensitäten von Pro-Q-gefärbten Spots aus verschiedenen

Gelen miteinander verglichen werden, werden somit auch zwei verschiedene

Gelfärbeprozesse und getrennte Proteinseparierungsprozesse gegenübergestellt.

Durch die zuvor beschriebene optimierte Pro-Q-basierte Methode zur Detektion

phosphorylierter Proteine (siehe Abschnitt 2.1.1), bei der der Farbstoff (ein 1:3

Gemisch mit Wasser) aus einer Charge kommt, die Gele parallel gefärbt werden und

die Herstellung der zu vergleichenden Gele gemeinsam aus derselben Gellösung

erfolgte, konnten die Quantifizierungsergebnisse und deren Reproduzierbarkeit

erheblich verbessert werden. Wie z. B. in Abbildung 36 des Abschnittes Glukosehunger

bei S. aureus deutlich geworden ist, unterliegen die biologischen Replikate jedoch

größeren Schwankungen. Daher bedarf es immer noch einer Vielzahl von

Wiederholungen und somit eines großen materiellen und zeitlichen Aufwands, um

eine validierte Aussage treffen zu können. Das Ziel war im Rahmen dieser Arbeit eine

Methode zu etablieren, die diesen großen technischen Aufwand minimiert und die in

kürzerer Zeit zu einem aussagekräftigen Ergebnis kommt.

2011 wurde durch Carsten Holland und Mitarbeitern ein 2D-Gel-basierter

Phosphoproteomquantifizierungsansatz vorgestellt. In diesem wurde die Kombination

der SILAC-Markierung (Stable Isotope Labeling by Amino acids in cell Culture), mit der

Phosphoprotein-Affinitätsanreicherung und der 2D-Gel-Analyse gewählt, um die

Unterschiede im Phosphoroteom von gesunden und H. pylori infizierten

Magenepithelzellen zu quantifizieren (Holland u. a., 2011). Die mit Coomassie

gefärbten Proteinspots wurden aus dem 2D-Gel ausgeschnitten und

massenspektrometrisch über MALDI-MS/MS analysiert. Die identifizierten Proteine

wurden mit der Uniprotdatenbank abgeglichen und als phosphoryliert deklariert, wenn

sie in der Datenbank als phosphoryliert angegeben wurden. Insgesamt wurde für 20

Proteine (51 Proteinisoformen) eine Veränderung quantifiziert (Holland u. a., 2011).

Dieser Ansatz liefert erste Hinweise auf mögliche Veränderungen im

Phosphorylierungsmuster. Da jedoch für den Großteil der identifizierten Proteinspots

keine Phosphorylierungsstelle identifiziert werden konnte, beruht die Einordnung als

Page 139: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 139

Phosphoprotein nur auf einem Datenbankvergleich, so dass eine direkte Zuordnung

der Phosphorylierung zu einer bestimmten Proteinisoform nur grob über den pI

getroffen werden konnte.

Um diesem Problem zu entgehen, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein 2D-Gel-basierter

Ansatz gewählt, der eine metabolische Markierung sowie eine Identifizierung der

phosphorylierten Proteine durch eine Pro-Q-Färbung kombiniert.

Der gewählte metabolische Markierungsansatz basiert auf dem Einbau von schweren 15N-Isotopen in alle Aminosäuren der Zelle. Dieser Einbau ruft einen definierten

Massenverschub in den massenspektrometrisch bestimmbaren Peptiden der Proteine

hervor, und dies ermöglicht die Unterscheidung und relative Quantifizierung von

Proteinen aus 14N Zellkulturen und Proteinen aus 15N Zellkulturen (Conrads u. a., 2001;

Wu u. a., 2004). Die hohe Zuverlässigkeit dieses Ansatzes wurde schon in früheren

Arbeiten gezeigt (Dreisbach u. a., 2008; Hempel u. a., 2011). Im Jahre 2005 wurde ein

Versuchsansatz beschrieben, in dem ein Vergleich zwischen einer DIGE ("Di

In dem in dieser Arbeit erstellten Ansatz wurde die Pro-Q-Färbung lediglich als

Instrument für die zuverlässige Detektion der phosphorylierten Proteinspots

verwendet, wohingegen die metabolische Markierung zur Quantifizierung genutzt

wurde. Die Versuchsdurchführung ist in der

fferential

Gel Electrophoresis")-Markierung und einem metabolischen Labeling vorgenommen

wurde. Das Resultat ergab eine gute Übereinstimmung zwischen beiden

Quantifizierungsmethoden (Kolkman u. a., 2005). Ein solcher Vergleich ist mit dem

Pro-Q-Farbstoff jedoch nicht möglich.

Abbildung 42 schematisch dargestellt.

Von Jan Muntel (Inst. f. Mikrobiologie, Universität Greifswald) wurde ein 15N-markierter Standardproteinextrakt von B. subtilis zur Verfügung gestellt, der

Proteine aus verschiedenen Wachstumsphasen enthielt. Dieser wurde aus Zellen

gewonnen, die in einem Medium kultiviert wurden, in dem alle Stickstoffquellen das

Isotop 15N enthielten.

Dieser 15N-Standardproteinextrakt wurde mit dem zu untersuchenden Proteinextrakt

(14N) (WT exponentielles Wachstum oder WT 30 Minuten nach Ethanol-Zugabe) 1:1

gemischt und 2D-gelbasiert aufgetrennt.

Page 140: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

140

Abbildung 42: Versuchsaufbau und -durchführung der auf metabolischer Markierung basierender Quantifizierung phosphorylierter Proteine. Die Pro-Q Färbung wurde ausschließlich zur Detektion der phosphorylierten Proteinisoformen verwendet.

Page 141: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 141

Die anschließende Pro-Q-Färbung (in Verbindung mit der Gesamtproteinfärbung

Flamingo s.o.) diente ausschließlich der Identifizierung der phosphorylierten

Proteinspots und hatte somit ihre Relevanz bei der Quantifizierung verloren. Die

phosphorylierten Proteinspots wurden manuell ausgestochen und

massenspektrometrisch analysiert. Die Daten wurden mit der

Quantifizierungssoftware CenSus (Park u. a., 2008) ausgewertet.

Im Zuge der Etablierung dieser neuen Methode wurde eine repräsentative Auswahl an

phosphorylierten Proteinen, die eine Änderung in der Signalstärke unter 30 Minuten

Ethanolstress aufwiesen und welche, die keine Änderungen aufzeigten, ausgewählt.

Dieses Set an Proteinen differierte im Molekulargewicht, im pH und im Auftreten von

unterschiedlichen Proteinisoformen und deckte somit unterschiedliche physikalisch-

chemischen Proteineigenschaften ab. Diese phosphorylierten Proteine konnten

mithilfe der 14N/15N-Markierung quantifiziert werden. Zur Verifizierung der erhaltenen

Ergebnisse wurden drei biologische Replikate angefertigt. Für die Proteine PtsH,

RsbRA2, und PdxS1 konnten nur aus zwei Replikaten Quantifizierungsdaten erhoben

werden.

In Abbildung 43 sind die Ergebnisse der Quantifizierung der metabolischen Markierung

für die jeweiligen phosphorylierten Proteine von B. subtilis aufgeführt. Als Vergleich

wurden die 2D-gelbasierten Pro-Q-Quantifizierungsergebnisse aus dieser Arbeit

gegenübergestellt (Replikat 1). Das zweite 2D-gelbasierte Replikat wurde aus den

Daten von Anja Klutzny übernommen (Anja Klutzny, Diplomarbeit, Universität

Greifswald). In den Graphiken links sind die Ergebnisse eines Replikates und in den

Graphiken rechts die aus zwei bzw. 3 biologischen Replikaten wiedergegeben. In der

oberen Reihe sind die Pro-Q-Quantifizierungsresultate dargestellt, darunter die des

metabolischen Markierungsansatzes. In jede Graphik wurden die Signifikanzgrenzen

eingezeichnet. Aufgrund der großen Standardabweichung liegen die Grenzen für den

Pro-Q-basierten Quantifizierungsansatz bei log2 ≥ 1 und log2 ≤ -1 (siehe auch Abschnitt

2.1.5). Werden die Ergebnisse von einem Replikat mit denen aus zwei Replikaten

verglichen, so zeigt sich, dass Pro-Q-basiert nur ein Protein (RsbRB2) aus dem 1.

Replikat validiert werden konnte.

Page 142: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

142

In dem Ansatz der metabolischen Markierung wurden die Ergebnisse des ersten

Ansatzes validiert und zusätzlich konnte für das Protein PdxS1, das in zwei Replikaten

quantifiziert werden konnte, die Zunahme durch das 2. Replikat bestätigt werden.

Aufgrund der für diesen Ansatz berechneten geringen Standardabweichung wurde für

den metabolischen Markierungsansatz die Signifikanzgrenzen auf log2 ≥ 0,555 und

log2 ≤ -0,555 heruntergesetzt. Diese Grenzen sind mit denen von Holland und

Mitarbeitern (im SILAC-Ansatz ermittelt, s. o.) vergleichbar (Holland u. a., 2011).

Abbildung 43: Ergebnisse der verschiedenen Quantifizierungsansätze. Die Säulendiagramme zeigen die normalisierten Ratios (Signalintensitäten der putativ phosphorylierten Proteine (Pro-Q-Färbung) aus 30 min EtOH-Stress versus den korrespondierenden aus der Kontrolle) der analysierten Phosphoprotein-Spots des metabolischen Markierungsansatzes (unten) und der Pro-Q-basierten Quantifizierungsergebnisse (oben). Auf der linken Seite wurden die Ergebnisse eines Versuches dargestellt, auf der rechten die zusammengefassten Ergebnisse aus zwei bzw. drei biologischen Replikaten. Die Standardabweichungen zwischen den biologischen Replikaten sind als Fehlerbalken in dem Säulendiagramm abgebildet. Des Weiteren wurden die jeweiligen Signifikanzgrenzen eingezeichnet.

Die Vorteile der Quantifizierung mithilfe des metabolischen Markierungsansatzes

bestehen in den durch eine geringere Standardabweichung erzielten niedrigeren

Signifikanzgrenzen und in der somit deutlicheren Ausprägung der Veränderung in der

Page 143: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 143

Proteinintensität. Des Weiteren wird direkt die Quantifizierung der Peptide des

Proteins vorgenommen und nicht nur die Quantifizierung der Signalintensitäten eines

Proteinspots, der möglicherweise aus mehreren Proteinen zusammengesetzt ist.

Interessant ist das Ergebnis des Proteins RsbRA1. In der Pro-Q-basierten

Quantifizierung ist die Abnahme der Signalintensität zwar zu detektieren, aber

aufgrund der großen Standardabweichung als nicht signifikant zu werten. Im 14N/15N-

Ansatz hingegen konnte diese Abnahme als signifikant festgestellt werden.

Durch die geringe Standarabweichung und der somit niedrigeren Signifikanzgrenzen

werden schon schwächere Veränderungen als signifikant detektiert. Dies spielt für die

physiologische Betrachtung eine große Rolle. Dadurch dass im 14N/15N-Quantifizierungsansatz eine Abnahme des RsbRA1-Proteins und eine Zunahme

seiner Isoform RsbRA2 festgestellt werden konnte, kann ein Zusammenhang zwischen

diesen beiden Ereignissen angenommen werden. Im 2D-Gel befindet sich die Isoform

RsbRA2 in einem saureren pH-Bereich als RsbRA1. Dies lässt darauf schließen, dass

RsbRA2 eine zusätzliche Phosphorylierung aufweist. Werden nun die oben genannten

Ergebnisse aus Quantifizierung und Pro-Q-Bild zusammengefasst, kann eine Abnahme

des phosphorylierten RsbRA1 durch die Einführung einer zusätzlichen

Phosphorylierung erklärt werden, so dass das Protein seine Lokalisation im Gel

wechselt und somit die Zunahme des RsbRA2 Proteins begründet. Diese Annahme

konnte nur aus dem Markierungsansatz in Kombination mit 2D-Gel, Pro-Q-Färbung

und Quantifizierung geschlussfolgert werden. Kürzlich wurde beschrieben, dass RsbRA

bei starkem Stress (wie z. B. 10 % EtOH) zusätzlich phosphoryliert wird ((Eymann u. a.,

2011), die massenspektrometrischen Analysen wurden im Rahmen dieser Arbeit

durchgeführt) und dies bestätigt die aus dieser Arbeit gewonnene Erkenntnis und die

Richtigkeit der entwickelten Methode.

Die vorgestellte Methode der metabolischen Markierung in Verbindung mit der

Identifizierung der phosphorylierten Proteine unter Einsatz des Pro-Q-Farbstoffes,

zeigt die Möglichkeit für eine zuverlässige Quantifizierung der Dynamik des

Phosphoproteoms, ohne dass eine Quantifizierung über Signalintensitäten, die aus der

Pro-Q-Färbung resultieren, nötig ist. In Zukunft soll sich diese Methode in größer

angelegten Phosphoproteomstudien bewähren.

Page 144: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

144

Berücksichtigt werden muss, dass in etwa nur die Hälfte der vorhandenen Proteine im

2D-Gel aufgetrennt werden können (Wolff u. a., 2006) und es daher der Kombination

der 2D-Gel-Methode mit gelfreien Quantifizierungsansätzen bedarf, um einen

möglichst vollständigen quantitativen Überblick über die Physiologie des

Phosphoproteoms zu erhalten (Soufi u. a., 2010).

Der Anspruch, zwei verschiedene Phosphoproteome gelfrei miteinander vergleichen zu

können, ist eine große Herausforderung an den Experimentator und an die

Analysetechnik, da gerade auch bei bakteriellen Phosphoproteomen eine Reduzierung

der Komplexität des zu untersuchenden Proteingemisches und eine Anreicherung der

phosphorylierten Peptide notwendig ist. In der Literatur wurden erste

Quantifizierungsergebnisse von phosphorylierten Peptiden des Phosphoproteomes

von B. subtilis beschrieben (Soufi u. a., 2010). Als Quantifizierungsmethode wurde

SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture) verwendet. Mithilfe der

TiO2-basierten Phosphopeptidanreicherungstechnik wurden dort insgesamt 35

phosphorylierte Peptide identifiziert. Zur Quantifizierung konnten sieben

phosphorylierte Peptide im Phosphathungerexperiment und 20 im

Succinatwachstumsexperiment herangezogen werden.

Kürzlich wurde das Phosphoproteom des Wildtyps von M. pneumoniae mit dem von

Kinase- und Phosphatasemutanten gelfrei mithilfe der Dimethylmarkierung

quantifiziert (van Noort u. a., 2012). Die Autoren konnten 67 verschiedene

phosphorylierte Peptide quantifizieren und fanden nur 16 als unverändert.

Der Nachteil der gelfreien Quantifizierungsmethoden liegt darin, dass nur das

markierte phosphorylierte Peptid quantifiziert wird, und eine Unterscheidung

zwischen verschiedenen Proteinisoformen nicht möglich ist. Daher wird erst die

Kombination der gelbasierten phosphosensitiven Färbemethode mit einem

metabolischen Markierungsansatzes, mit der gelfreien Phopshopeptid-

Anreicherungstechnik und der akuraten und sensitiven Massenspektrometrie bei der

Quantifizierung von phosphorylierten Proteinen vollständigere Einblicke in die

Physiologie des Phosphoproteoms liefern.

Page 145: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 145

2.4 Analyse von Argininphosphorylierungen in Bacillus subtilis

Der grundlegende Fokus in der Analyse von bakteriellen

Phosphorylierungsgeschehnissen lag lange Zeit auf den Histidin- und

Aspartatphosphorylierungen der Zweikomponentensysteme (Stock u. a., 1990 und

Übersichtsartikel Casino u. a., 2010) und später zunehmend auf der Analyse der an

Serin, Threonin und Tyrosin gebildeten Phosphatester. Letztere wurden durch ihre

Stabilität in sauren pH-Bereichen mit den Hochdurchsatzmethoden der analytischen

Proteomforschung am intensivsten untersucht. Hierbei standen die 2D-gelbasierte

Phosphoproteommethodik und die gelfreie Phosphopeptidanreicherungsmethode,

welche beide mit der hoch akkuraten und sensitiven Massenspektrometrie gekoppelt

waren, im Vordergrund (Eymann u. a., 2007; Lévine u. a., 2006; Lomas-Lopez u. a.,

2007; Macek u. a., 2007, 2008; Schmidl u. a., 2010a; Soufi u. a., 2008).

Nur wenig wurde bisher über Argininphosphorylierungen in Proteinen, deren Labilität

mit zunehmendem sauren pH-Wert ansteigt, berichtet. Eine eukaryotische

Argininkinase, die für die Phosphorylierung des Histon3 verantwortlich ist, konnte

beispielsweise im Chromatin des Kalbthymus identifiziert werden (Wakim & Aswad,

1994; Wakim u. a., 1990).

Erst vor kurzem wurde in B. subtilis die Kinase McsB als Argininkinase identifiziert und

die Phosphorylierungsereignisse an ihrem Target (CtsR), einem Repressor der

Hitzeschockantwort, in vitro untersucht und beschrieben (Fuhrmann u. a., 2009). McsB

gilt als Adaptorprotein für die kontrollierte Degradationsaktivität der ClpCP-Protease

unter Hitzestress (Elsholz u. a., 2010; Kirstein u. a., 2005, 2007).

Eine weiterführende Analyse wurde von Elsholz und Mitarbeitern unternommen. In

diesen Untersuchungen wurde die Autophosphorylierungsreaktion der Kinase in vitro

mit isoliertem McsB und dessen Aktivatorprotein McsA in Anwesenheit von ATP

durchgeführt. Ziel war es, spezifische Autophosphorylierungen an Argininresten zu

identifizieren. Durch die spezielle Aufreinigung des McsB-Proteins standen für die

Analyse ausreichend große Mengen an Material zur Verfügung. Im Rahmen dieser

Arbeit wurden die Methodenoptimierung zur Anreicherung der am Arginin

phosphorylierten Peptide sowie die massenspektrometrischen Analysen durchgeführt.

Page 146: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

146

Durch den Verzicht der Anwendung der SCX-Chromatographie bei der Durchführung

des Titandioxid-Anreicherungsprotokolls zur Anreicherung der phosphorylierten

Peptide wurde die Ausgangsmethode gemäß Olsen und Macek (siehe oben) erheblich

verkürzt. Aufgrund der methodisch bedingten sauren Verhältnisse wurde mit saurer

Hydrolyse gerechnet, es wurde jedoch hinsichtlich der Protokollverkürzung keine

vollständige Hydrolyse der Phosphoamidate erwartet. Mit diesem Protokoll und der

massenspektrometrischen Analyse an der LTQ Orbitrap XL konnten fünf spezifische

Phosphorylierungsstellen im McsB Protein identifiziert werden (Abbildung 44).

Page 147: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 147

Abbildung 44: MS/MS-Fragmentionenspektren der identifizierten Phosphopeptide von McsB. Die b- und y-Fragmentionenserien wurden unterschiedlich farbig dargestellt. Die jeweilige Aminosäuresequenz des Peptides ist mit dem phosphorylierten Argininrest aufgeführt. Deutlich zu erkennen ist das jeweilige Neutralverlustfragment des Vorläuferions (mit NL markiert).

Die Spektren der phosphorylierten Peptide zeigen eine überwiegend vollständige

Abdeckung der b- und y-Ionen Serien, wobei der spezifisch phosphorylierte Argininrest

identifiziert werden konnte. Im Gegensatz zu Fuhrmann und Mitarbeitern, in dessen

Versuchen die spezifische Phosphorylierungsstelle ausschließlich mit „electron-capture

dissociation“ (ECD) direkt identifiziert wurde, konnte in diesem Ansatz die eindeutige

Phosphorylierungsstelle mit der kollissions-induzierten Fragmentierungsmethode (CID)

spezifisch detektiert werden. In allen aufgenommenen Spektren der am Arginin

phosphorylierten Peptide konnte ein Neutralverlustfragment (Vorläuferion abzüglich

m/z 97,98 Da) detektiert werden (trotz Anwendung der "Multistage Activation" (MSA,

s.o.)). Dieses überraschende Phänomen konnte gleichermaßen von Fuhrmann und

Mitarbeitern beobachtet werden (Fuhrmann u. a., 2009) Dieser Neutralverlust

Page 148: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

148

entspricht normalerweise dem Verlust von H3PO4, der bei der CID-Fragmentierung an

phosphorylierten Serinen und Threoninen auftreten kann. Aus der Struktur des

Phosphoamidats ist dieser Neutralverlust nicht erklärbar. Kürzlich wurde dieses

Ereignis bei Peptiden, die einen phosphorylierten Histidinrest aufweisen, ebenfalls

beobachtet, und es wird angenommen, dass dieser Verlust von einer Abspaltung von

HPO3 und H2O herrührt (Kleinnijenhuis u. a., 2007; Medzihradszky u. a., 1997). Ein

ähnliches Phänomen könnte auch bei Phosphoamidaten auftreten.

Als Antagonist der McsB Kinase wurde schon vormals die Phosphatase YwlE

beschrieben (Elsholz u. a., 2010; Kirstein u. a., 2005).

In einem in dieser Arbeit durchgeführten 2D-gelbasiertem Phosphoproteomansatz

konnten phosphorylierte Proteinisoformen des ClpC-Proteins in dem Extrakt einer

∆ywlE-Deletionsmutante beobachtet werden, die sich kettenartig aneinanderreihten

(siehe Abbildung 45).

Abbildung 45: Zweikanalfalschfarbenbild der Auftrennung des cytosolischen Extraktes einer ∆ywlE-Mutante im 2D-Gel. Die Phosphoproteine wurden mit dem phosphosensitiven Farbstoff Pro-Q (rot) und die Proteine mit der Gesamtproteinmengenfärbung Flamingo (grün) angefärbt. Das Bild wurde mit der Decodon Delta2D Software erstellt. Speziell wurde das ClpC-Protein hervorgehoben, welches durch eine Kette von phosphorylierten Proteinisoformen (rot) auffällt.

Page 149: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 149

Gelbasiert war es damals nicht möglich, die spezifischen phosphorylierten

Aminosäuren in den Peptiden des ClpC-Proteins massenspektrometrisch zu

identifizieren.Mit der vor kurzem erlangten Erkenntnis der Existenz bakterieller

Argininphosphorylierungen entstand in Zusammenarbeit mit Alexander Elsholz

(Institut f. Mikrobiologie, Universität Greifswald) die Charakterisierung der ClpC-

Argininphosphorylierungsstellen.

Hierbei fand eine Aufreinigung des ClpC-Proteins aus der ∆ywlE-Mutante statt. Die

phosphorylierten Peptide wurden unter Zuhilfenahme der Titandioxid-basierenden

Phosphopeptid-Methode angereichert und im Rahmen dieser Arbeit

massenspektrometrisch analysiert (es wurde die für McsB in dieser Arbeit etablierte

Methode angewendet s.o.). Mit diesem Ansatz konnten fünf spezifische

Argininphosphorylierungsstellen identifiziert werden (Abbildung 46).

Page 150: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

150

Abbildung 46: MS/MS Fragmentionenspektren der identifizierten phosphorylierten Peptide von ClpC. Die b- und y-Fragmentionenserien sind unterschiedlich farbig dargestellt und die jeweilige Aminosäuresequenz des Peptides ist mit dem phosphorylierten Argininrest aufgeführt.

Ob die in dem 2D-Gel-Ansatz detektierten phosphorylierten ClpC-Isoformen wirklich

Argininphosphorylierungen aufweisen und somit der Pro-Q-Farbstoff auch

Phosphoamidate anfärbt, bleibt fraglich, denn aufgrund der Instabilität der

Phosphoamidate ist es nicht geklärt, ob Phosphoamidate die Methode der

2D-Gelelektrophorese und der Pro-Q-Färbung überdauern.

An die detaillierten Einzelproteinstudien schloss sich ein globaler Ansatz an. Das

cytosolische Phosphoproteom der ∆ywlE-Phosphatase-Mutante wurde mittels

Titandioxidanreicherung und massenspektrometrischer Analyse untersucht. Hierbei

stand der Überblick über die Argininphosphorylierungen im Vordergrund und nicht der

Anspruch nach einer vollständigen Charakterisierung des Arginin-Phosphoproteoms.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Phosphopeptidanreicherungsmethode für diese

Aufgabenstellung optimiert. In dem Optimierungsprozess wurde eine Abwägung

zwischen Funktionalität der Anreicherungsmethode und der Vermeidung verstärkter

Hydrolyse getroffen. Aufgrund der Ergebnisse dieser Abwägung wurde die Methode

gemäß Macek und Olsen (Olsen & Macek, 2009) modifiziert. Im Hinblick auf die

Instabilität der Argininphosphorylierungen in stark sauren Bedingungen konnte die

saure Hydrolyse nicht ausgeschlossen werden. Durch die zeitliche Einschränkung des

Page 151: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 151

Protokolls (s. o.) und der genauen Einhaltung des pH-Wertes (pH 2,7-3) sollte diese

insoweit eingeschränkt werden, dass die Menge der N-phosphorylierten Peptide

(Phosphoamidate) für eine Identifizierung ausreichend ist, um sie mit den etablierten

massenspektrometrischen Methoden analysieren zu können. Die chromatographische

Auftrennung vor der massenspektrometrischen Analyse fand bei Raumtemperatur und

nicht, wie sonst üblich, in einem erwärmten Säulenofen statt, um die Hydrolyse der N-

Phosphorylierung nicht zu beschleunigen. Auf eine

Kationenaustauschchromatographie wurde im Hinblick auf das Vorhergesagte

verzichtet. Da diesem Vorfraktionierungsschritt jedoch eine wichtige Aufgabe bei der

Reduzierung der Proteinkomplexität zukommt, wurde ein komplementäres Verfahren

in die Titandioxidanreicherung mit eingebunden, indem die Überstände aus der

Beladung des Titaniumdioxides erneut einer Titaniumdioxidanreicherung zugeführt

wurden. Diese Prozedur wurde mehrfach wiederholt, und am Ende des

Anreicherungsprotokolls schloss sich die Vereinigung der Eluate an. Diese Methode

resultierte in einer Schritt-für-Schritt-Reduzierung der Komplexität des für die

Anreicherung vorgesehenen Peptidgemisches. Aufgrund der Instabilität der

Phosphoamidate wurde die massenspektrometrische Analyse der vereinigten Eluate

sofort nach Beendigung der Anreicherungsmethode angeschlossen.

In dieser fand eine Separierung der Peptide über eine selbstgepackte „reversed

phase“-(Umkehrphasen-) C18-Säule statt, die gleichzeitig als Emittertip genutzt wurde,

um den Weg zwischen Auftrennung und der Analyse im Massenspektrometer so kurz

wie möglich zu halten. In der massenspektrometrischen Untersuchung der separierten

Peptide wurden zwei verschiedene Methoden basierend auf zwei unterschiedlichen

Fragmentierungstechniken angewandt, da die MS-Analyse von den strukturellen

Informationen aus den Fragmentierungssreaktionen der Peptide abhängig ist. Durch

die Anwendung zweier unterschiedlicher Fragmentierungstechniken wurde eine

vermehrte Identifizierung von phosphorylierten Peptiden und deren spezifischer

Phosphorylierungstellen erwartet. Bei der einen Fragmentierungstechnik handelte es

sich um die Kollisions-induzierte Fragmentierung CID (collision induced fragmentation)

der 20 höchst abundantesten Peptidionen, die in eine Daten abhängige Messmethode,

bei der der Übersichtsscan in der Orbitrap (Auflösung R= 60000) durchgeführt wird,

mit einbezogen wurde. Die CID-Fragmentierungstechnik (hier mit der LTQ-Orbitrap-

Page 152: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

152

Velos durchgeführt) wird bevorzugt für die Hochdurchsatzanalyse von

Peptidgemischen eingesetzt, da sie in Verbindung mit dem Multiplierdetektionssystem

der linearen Ionenfalle eine sehr schnelle und sensitive Methode darstellt, Peptide zu

detektieren (Becher u. a., 2009; Olsen u. a., 2009; Wolff u. a., 2006). Ein Nachteil dieser

Fragmentierungstechnik besteht darin, dass die "weiche"-Fragmentierung

charakteristische Neutralverluste durch die vorzeitige Dissoziation funktioneller

Gruppen hervorruft. Dies spiegelt sich in einem fragmentärmeren Spektrum wider, in

dem das Vorläuferion abzüglich des Neutralverlusts dominiert (Boersema u. a., 2009a).

Dieser Nachteil kann durch die Anwendung der Multistage-Aktivierung (siehe

Abschnitt 2.2.2.1) kompensiert werden. Wie in den vorangegangenen Messungen bei

der Identifizierung von Argininphosphorylierungen von McsB und ClpC festgestellt

werden konnte, wurde trotz der MSA-Technik ein sehr intensiver Neutralverlust-

Vorläuferionenpeak detektiert, der vermutlich aus einer Zweifachabspaltung herrührt.

Um qualitativ hochwertigere Spektren zu erzielen, wurde daher zusätzlich eine weitere

Fragmentierungsmethode eingesetzt.

Die zweite Fragmentierungsmethode stellt die HCD-Fragmentierung (HCD = higher

energy collisional dissociation) der 10 höchst abundanten Peptide des Übersichtsscan

(siehe Abschnitt 3.2.6.4) dar. Die HCD-Fragmentierungstechnik beruht auf der

hochenergetischen Kollision mit Stickstoffatomen und liefert eine höhere

Dissoziationsenergie als die vorher beschriebene CID-Fragmentierung. Die daraus

resultierende höhere Anzahl intensiverer Fragmentionen produziert qualitativ

hochwertigere Spektren. Die Analyse der Fragmentionen erfolgt in der

hochauflösenden Orbitrap. Aufgrund des spezifischen Fourier-Transform-Analysators

benötigt die HCD-Messung jedoch ungefähr die doppelte Zeit im Vergleich zur CID-

Anwendung (Jedrychowski u. a., 2011; Olsen u. a., 2007).

Die Proben wurden jeweils mit einer CID- und einer HCD-Methode analysiert, wobei

die chromatographische Auftrennung (Gradientenlänge, Eluentenbedingungen) für

beide Methoden gleich gewählt wurden (siehe Abschnitt 3.2.6.4). Des Weiteren

wurden die optimalen Parameter für die einzelnen Fragmentierungsmethoden

ausgewählt, um für jede Methode die bestmöglichsten Ergebnisse zu erzielen. Für die

CID-Methode (Fullscan FT R=60000) wurde ein TOP20- und für die HCD-Methode ein

Page 153: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 153

Top10-Ansatz (Fullscan FT R=30000, MS/MS FT R=7500) verwendet. Bei den Resultaten

muss berücksichtigt werden, dass mit der HCD- im Vergleich zur CID-Analyse

methodisch bedingt nur die Hälfte der MS/MS-Spektren aufgenommen werden

konnten. Die Daten wurden mit der MaxQuant-Software ausgewertet.

Mit dem gewählten Ansatz und der Anwendung zweier unterschiedlicher

Fragmentierungstechniken war es möglich 111 Arginin Phosphorylierungsstellen in 84

Proteinen von B. subtilis zu identifizieren (Fragmentspektren und Tabelle siehe Anhang

III und III_S). Durch die Anwendung der HCD-Fragmentierungstechnik konnten 14

phosphorylierte Peptide dem Ergebnis hinzugefügt werden, die entweder ein qualitativ

hochwertigeres Spektrum aufwiesen oder eine Neuidentifizierung darstellten.

Damit konnte dargelegt werden, dass mit der oben beschriebenen Methode eine

erfolgreiche Identifizierung von Argininphosphorylierungen aus komplexen

bakteriellen Proteingemischen möglich ist, und die hier erzielten Ergebnisse einen

ersten größeren Einblick in das Arginin-Phosphoproteom von B. subtilis liefern.

Aufgrund der Untersuchungen von Andreas Schmidt (Universität Wien) zu der

Stabilität der Argininphosphorylierung eines synthetischen Peptides unter

verschiedenen pH- und Temperatur- Bedingungen, die er in seiner Dissertation 2010

aufzeigte, kann geschlussfolgert werden, dass maximal die Hälfte der ursprünglich

vorhandenen, am Arginin phosphorylierten Peptide, zur massenspektrometrischen

Analyse zur Verfügung standen. Die nächste Aufgabe besteht somit in einer weiteren

Optimierung der Methode, so dass eine vollständige Analyse der

Argininphosphoproteome bakterieller Systeme möglich wird.

2.5 Zusammenfassung und Ausblick

Im Gegensatz zu den eukaryotischen Zellen, in denen ca. 30 % der synthetisierten

Proteine phosphoryliert vorliegen (Mann u. a., 2002), findet sich im bakteriellen

Organismus nur eine geringe Menge an phosphorylierten Proteinen. Der Anteil an

phosphorylierten Proteinen in Bakterien beträgt durchschnittlich 0,5-4 % (Macek &

Mijakovic, 2011).

Page 154: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

154

Diese geringe Stöchiometrie erfordert eine Differenzierung innerhalb des Proteoms

durch Vorfraktionierung der Proteine gemäß ihren physiko-chemischen Eigenschaften,

um die Komplexität des Proteingemisches herabzusetzen. Das Ziel dieser Arbeit war es

Methoden zur Analyse von Phosphoproteomen zu etablieren, zu optimieren und die

bakteriellen Phosphoproteome von B. subtilis und S. aureus zu charakterisieren.

Zur Reduzierung der Komplexität des Proteingemisches und zur Visualisierung der

phosphorylierten Proteinisoformen wurde eine 2D-gelbasierte Methode eingesetzt,

die auf der phosphosensitiven Pro-Q Diamond-Färbung beruht. Diese Methode wurde

im Zuge der Untersuchungen zum Phosphoproteom von B. subtilis in der Art optimiert,

dass ein sauberes, reproduzierbares und quantifizierbares Färbeergebnis erzielt wurde

und somit die Visualisierung eines Großteils des cytosolischen Phosphoproteoms von

B. subtilis gelungen ist. Des Weiteren wurden Gesamtproteinfärbungen getestet, die

zur Identifizierung putativ phosphorylierter Proteine in Verbindung mit der Pro-Q-

Färbung Anwendung finden sollten. Hierbei stellte sich der Fluoreszenzfarbstoff

Flamingo der Firma Biorad als optimal dar. Es konnte mit zwei unterschiedlichen

Versuchsansätzen gezeigt werden, dass die Identifizierung phosphorylierter Proteine

durch den Vergleich mit einer fluoreszierenden Gesamtproteinfärbung validierbare

Ergebnisse liefert.

Des Weiteren konnte mit Hilfe dieser Methode die Dynamik des Phosphoproteoms von

B. subtilis zwischen verschiedenen physiologischen Umweltbedingungen global

visualisiert und relativ quantifiziert werden. Die Phosphoproteom-Untersuchungen

einer sigB-Mutante von B. subtilis lieferten das Ergebnis, dass die Mutation im Gen des

Sigmafaktors B einen negativen Einfluss auf die Pro-Q-Signalintensität des

phosphorylierten Anti-Anti-Sigmafaktors RsbV und des phosphorylierten RsbRD

Proteins des Stressosoms ausübt.

Diese Ergebnisse wurden in der gemeinsamen Arbeit "Dynamics of protein

phosphorylation on Ser/Thr/Tyr in Bacillus subtilis." mit Christine Eymann und

Kollegen veröffentlicht (Eymann u. a., 2007).

In enger Zusammenarbeit mit Sebastian Schmidl (Universität Göttingen) wurde die

optimierte 2D-Gel- und Pro-Q-basierte Phosphoproteommethode zur Analyse des

pathogenen, zellwandlosen Mollicuten Mycoplasma pneumoniae erfolgreich

Page 155: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 155

eingesetzt. Die im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit durchgeführten 2D-Gele und

massenspektrometrischen Analysen der putativ phosphorylierten Proteinspots

lieferten die Basis für die entstandenen Gemeinschaftsarbeiten:

"The phosphoproteome of the minimal bacterium Mycoplasma pneumoniae:

analysis of the complete known Ser/Thr kinome suggests the existence of novel

kinases." (Schmidl u. a., 2010a) und "The stability of cytadherence proteins in

Mycoplasma pneumoniae requires activity of the protein kinase PrkC" (Schmidl u. a.,

2010b).

Darüber hinaus wurde die optimierte 2D-Gel- und Pro-Q-basierte

Phosphoproteommethode bei der Untersuchung des Phosphoproteoms von S. aureus

angewendet. Es konnten Phosphoproteommasterkarten für zwei unterschiedliche

pH-Bereiche erstellt werden. Hierbei zeigte sich, dass der Einsatz von Gelen mit einem

engen pH-Bereich für die Analyse von phosphorylierten Proteinen von Vorteil ist.

Insgesamt konnten mittels des 2D-Gel-basierten Ansatzes 121 verschiedenen putativ

phosphorylierte Proteinspots, die 80 verschiedenen Proteinen zugeordnet werden

konnten, detektiert werden. Durch eine auf die Messungen von phosphorylierten

Peptiden angepasste massenspektrometrische Analyse ist es gelungen, trotz der sehr

geringen Menge an vorliegenden phosphorylierten Peptiden, 22 verschiedene

Phosphorylierungsstellen zu identifizieren.

Durch die Untersuchungen zur Dynamik des cytosolischen Phosphoproteoms von

S. aureus unter verschiedenen physiologischen Bedingungen sollten Einblicke in

Regulationsmechanismen und ihrer möglichen Hauptakteure erhalten werden.

Insgesamt konnten 10 signifikante Veränderungen der Signalintensitäten

phosphorylierter Proteine, bedingt durch Stresseinwirkung oder Glukosehunger, im

Phosphoproteom relativ quantifiziert werden: sechs unter Glukose-

hungerbedingungen, zwei unter nitrosativem Stress, eine unter oxidativer Stress und

eine Veränderung unter osmotischem Stress. Für das phosphorylierte Protein DeoB

konnte eine Veränderung in der Signalintensität unter mehreren Stressbedingungen

beobachtet werden. Die Veränderungen des Signals des phosphorylierten Spots der

Pyruvatkinase unter Glukosehungerbedingungen in Verbindung mit der für dieses

Enzym identifizierten Phosphorylierungsstelle und den neuesten Literaturdaten

Page 156: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

156

ergaben Hinweise auf eine durch Phosphorylierung regulierte Teilsteuerung des

Enzyms. Ebenso konnte durch das Auftreten eines zusätzlichen phosphorylierten Spots

des Enzyms HchA auf einen putativen Methylglyoxal detoxifizierenden Mechanismus

unter nitrosativen Bedingungen geschlossen werden.

Ziel war es, einen möglichst umfassenden Überblick über das gesamte

Phosphoproteom von S. aureus zu gewinnen. Eine weitere leistungsstarke Technik, die

Phosphopeptidanreicherungsmethode gemäß Olsen und Macek (2009), konnte

etabliert und für die Untersuchungen des Phosphoproteoms von S. aureus eingesetzt

werden. Mit dieser war es möglich 49 verschiedene Phosphorylierungsstellen aus 33

unterschiedlichen Proteinen zu detektieren.

Insgesamt konnten mit Hilfe der gelbasierten und der gelfreien Methode 103

phosphorylierte Proteine und 68 verschiedene Phosphorylierungsstellen von S. aureus

identifiziert werden. Welche weitreichende Bedeutung die

Phosphorylierungsgeschehnisse besitzen, wurde aufgrund der funktionellen

Einordnung der identifizierten phosphorylierten Proteine in 15 verschiedene Klassen

deutlich. Für mehrere phosphorylierte Proteine konnten Verbindungen zum

Virulenzgeschehen hergestellt werden. Besonders interessant für das

Pathogenitätsgeschehen ist der phosphoryliert vorliegende Virulenz-Regulator SarA,

der vermutlich, wie ein Sequenzvergleich zeigte, einen ähnlichen durch

Phosphorylierung geregelten Regulationsmechanismus aufweist, wie der "multi-drug-

resistenz"-Regulator MgrA. Schließlich konnten für das glykolytische Enzym FbaA, das

als antimikrobielles Ziel in der Literatur beschrieben wurde, drei

Phosphorylierungsstellen im aktiven Zentrum identifiziert werden. Es wird

angenommen, dass sie für die Regulation der Substratbindung und somit für die

Aktivität des Enzyms verantwortlich sind. Ferner wird vermutet, dass die

Phosphorylierungsereignisse möglicherweise die Wirkung von auf Substratanaloga

basierenden Inhibitoren unter in vivo Bedingungen negativ beeinflussen.

Die Ergebnisse der Untersuchungen zum Phosphoproteom sind in der Arbeit "The

cytoplasmic phosphoproteome and its physiological dynamics in Staphylococcus

aureus" (Katrin Bäsell u.a., eingereicht bei dem "Journal of Proteome Research")

zusammenfassend aufgeführt.

Page 157: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

2 Ergebnisse und Diskussion 157

Es war im Rahmen dieser Arbeit ebenfalls möglich die für S. aureus angewendete

Phosphopeptidanreicherungsmethode in der Form zu modifizieren, dass sie in der

Analyse der Argininphosphorylierungen von B. subtilis Anwendung finden konnte. Mit

Hilfe der angepassten Methode und der massenspektrometrischen Analyse war es

möglich, fünf Argininphosphorylierungsstellen der Argininkinase McsB und fünf der

ATPase ClpC zu identifizieren. In einem globalen Phosphoproteomansatz, in dem

zusätzlich zu der optimierten Methode zwei verschiedenen Fragmentierungstechniken

bei der massenspektrometrischen Analyse verwendet wurden, konnten in der

Phosphatasemutante ∆ywlE 111 Argininphosphorylierungsstellen in 84 Proteinen von

B. subtilis identifiziert werden. Diese Ergebnisse flossen in die Arbeiten von A. Elsholz:

"Activity control of the ClpC adaptor McsB in Bacillus subtilis" (Elsholz u. a., 2011)

und "Global impact of protein arginine phosphorylation on the physiology of Bacillus

subtilis" (Elsholz u. a., 2012) mit ein.

Die Quantifizierung der Veränderungen im Phosphoproteom, die aufgrund der

Anpassung an unterschiedliche physiologische Bedingungen auftreten, ist ein wichtiger

Bestandteil der Phosphoproteomic. Sie ist nötig, um eventuell bestehende

Regulationsmechanismen erkennen und erklären zu können. In dieser Arbeit wurde die

Dynamik des Phosphoproteoms für B. subtilis und S. aureus mithilfe des Pro-Q-

basierten Phosphoproteomansatzes analysiert. Die Untersuchungen zeigten jedoch,

dass die biologischen Replikate größeren Schwankungen unterliegen, und es einer

Vielzahl von Wiederholungen und somit eines großen materiellen und zeitlichen

Aufwands bedarf, um eine signifikante Aussage treffen zu können. Bezug nehmend auf

diese Problematik wurde eine Methode entwickelt, die die Vorteile des 2D-Gels, die

Identifizierung des phosphorylierten Proteins über den Pro-Q-Farbstoff und die

metabolische Markierung als Quantifizierungsansatz miteinander kombiniert. Mit

dieser Methode konnten am Beispiel des Ethanolstress für B. subtilis signifikante

Aussagen zu Veränderungen phosphorylierter Proteine getroffen und somit die

Funktionalität der Methode gezeigt werden. Der Vorteil dieser Methode, im

Unterschied zu dem Pro-Q-Quantifizierungsansatz, zeichnet sich durch eine bessere

Reproduzierbarkeit und eine höhere Empfindlichkeit gegenüber geringeren

Veränderungen aus. In Zukunft soll sich die Qualität der Methode in größer angelegten

Phosphoproteom-Quantifizierungsanalysen bewähren.

Page 158: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

158

Des Weiteren werden die Etablierung und Optimierung eines gelfreien

Quantifzierungsansatzes angestrebt, um für einen möglichst großen Teil des

bakteriellen Phosphoproteoms quantifizierbare Daten ermitteln zu können.

Dieser Ansatz soll es dann in der Untersuchung von Kinase- und Phosphatasemutanten

ermöglichen, die Unterschiede zum Wildtyp aufzuzeigen und somit potentielle

Zielproteine der Kinasen bzw. Phosphatasen zu identifizieren.

Ein in Zukunft intensiv zu untersuchendes Feld wird neben den einzelnen

Phosphorylierungsereignissen, das Wechselspiel verschiedenster Modifikationen im

Regulationsgeschehen sein. Erste Untersuchungen von van Noort und Mitarbeitern

zeigen das gemeinsame Auftreten von Acetylierungen am Lysin und

Phosphorylierungen am Serin, Threonin oder Tyrosin an demselben Protein und es

wurde gemutmaßt, dass ein regulatorischer Zusammenhang zwischen den

verschiedenen Modifikationen bestehen könnte (van Noort u. a., 2012; Soufi u. a.,

2012). In einem von Soufi und Mitarbeitern durchgeführten Vergleich der in der

Literatur beschriebenen Modifikationen der Isocitratdehydrogenase von E. coli zeigte

sich, dass die Phosphorylierung bzw. Acetylierung des Proteins jeweils einen Effekt auf

die Aktivität zeigen und somit beide einen Einfluss auf das Regulationsgeschehen

ausüben (Soufi u. a., 2012).

Aufgrund dessen wird die Analyse des "cross-talk" zwischen Modifikationsereignissen

in der Zukunft eine wichtige Rolle bei der Aufklärung von Regulationsmechanismen

spielen.

Page 159: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 159

3 Material und Methoden

3.1 Materialien

3.1.1 Bakterienstämme

Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme sind in der

nachfolgenden Tabelle zusammen mit dem für die Selektion eingesetzten Antibiotikum

und den dazugehörigen Referenzen aufgeführt.

Tabelle 14: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus Stämme.

Bakterien-stamm

Relevanter Genotyp Antibiotika Resistenzen

Referenz

B. subtilis 168

trpC2 / (Anagnostopoulos & Spizizen, 1961)

B. subtilis ML6

trpC2 ΔsigB CmR Chloramphenicol (Igo u. a., 1987)

S. aureus COL Klinisches Isolat, mec, hoch Methicillin resistent, TcR

/ (Shafer & Iandolo, 1979)

3.1.2 Medien und Medienzusätze

Im Folgenden sind die verschiedenen Medien und Medienzusätze, die für die Anzucht

von B. subtilis oder S. aureus COL verwandt worden sind, aufgeführt. Das LB-Medium

wurde für beide Stämme zur Anzucht von Glycerinkulturen im Zuge der Stammhaltung

genutzt. Die Kultivierung von B. subtilis erfolgte in den verschiedenen Belitzky-Medien,

die von S. aureus wurde im chemisch-definierten Medium durchgeführt. Die

Herstellung der jeweiligen Medien und Komponenten erfolgte, soweit nicht anders

beschrieben, mit A. bidest.

LB-Medium:

LB Broth Base von Invitrogen (20 g/l, pH 7,5)

Page 160: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

160

Belitzky-Minimalmedium (Bacillus subtilis Stämme): BMM

Das BMM besteht aus dem Grundmedium (1-fach konzentriert) und den

verschiedenen Supplementen, die gemäß dem Supplementierungsschema (siehe

unten) kurz vor der Bakterienanzucht hinzugefügt wurden.

Grundmedium, 2-fach Konzentrat:

30 mM (NH4)2SO4 16 mM MgSO4 * 7H2O 54 mM KCl 14 mM Na3Citrat * H2O 100 mM Tris Base

Der pH-Wert wurde mit HCl auf 7,5 eingestellt und das Medium nachfolgend

autoklaviert.

Belitzky Minimalmedium ohne Citrat (B. subtilis-Stämme): BOC

Für die Glukosehungerversuche wurde das Belitzky-Medium ohne Citrat eingesetzt, um

eine Nutzung des Citrats als alternative C-Quelle bei Glukosehunger auszuschließen.

Grundmedium nach Stülke und Mitarbeitern modifiziert (Stülke u. a., 1993), 2-fach

Konzentrat:

15 mM (NH4)2SO4 8 mM MgSO4 * 7 H2O 27 mM KCl 50 mM Tris-HCl

Der pH-Wert wurde mit HCl auf 7,5 eingestellt und das Medium nachfolgend

autoklaviert.

Supplementierungsschema für Belitzky- und BOC-Medien:

Das Schema (Tabelle 15) beschreibt die Medienzusätze, die Konzentration ihrer

Stammlösung und die Endkonzentration im jeweiligen Medium. Zusätzlich wurde die

verwendete Sterilisationsmethode aufgeführt.

Page 161: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 161

Tabelle 15: Supplementierungsschema für Belitzky- und BOC-Medien.

Sterilisation Konz. Stammlsg. ÜN-Medium Glukoselimitation

KH2PO4 autoklavieren 0,2 M 0,6 mM 0,4 mM

L-Tryptophan filtrieren 39 mM 0,78 mM 0,78 mM

CaCl2 x 2 H2O autoklavieren 1 M 2 mM 2 mM

FeSO4 x 7 H2O filtrieren 0,5 mM 1 µM 1 µM

MnSO4 x 4 H2O filtrieren 25 mM 10 µM 10 µM

Glukose punktautoklavieren 20 % (w/v) 0,2 % 0,05 %

Glutaminsäure punktautoklavieren 0,5 M 4,5 mM 4,5 mM

Chemisch-definiertes-Medium (S. aureus COL): CDM

Grundmedium, 2-fach Konzentrat: 9,88 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 3,3 mM MgSO4 * 7 H2O 18,67 mM NH4Cl 17,11 mM NaCl

Das Medium wurde punktautoklaviert.

Supplemente für CDM:

Es wurden die folgenden Supplemente, gemäß dem Suplementierungsschema der

Tabelle 16, dem Grundmedium (1-fach konzentriert) kurz vor der Bakterienanzucht

hinzugefügt.

• je 1 mM der folgenden Aminosäuren: Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Valin

Die Aminosäuren wurden in 50 mM-Stammlösungen angesetzt und

sterilfiltriert.

• Vitamine:

Endkonzentration im Medium: 0,04 mM Biotin 0,21 mM Ca-D-Panthothensäure

Page 162: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

162

0,036 mM Cyanocobalamin 0,81 mM Nicotinsäure 0,29 mM p-Aminobenzoat 0,62 mM Pyridoxaminhydrochlorid 0,26 mM Riboflavin 0,29 mM Thiaminiumchlorid

Die Vitamine wurden in 1000-fach konzentrierten Stammlösungen angesetzt

und sterilfiltriert.

• Spurenelemente:

Endkonzentration im Medium: 1,46 mM CoCl2 * 6 H2O 0,015 mM CuCl2 * 2 H2O 0,5 mM FeCl3 * 6 H2O in 2 N HCl 0,097 mM H3BO3 0,5 mM MnCl2 * 4 H2O 0,148 mM Na2MoO4 * 2 H2O 0,1 mM NiCl2 * 6 H2O 0,51 mM ZnCl2

Die Spurenelemente wurden in 1000-fach konzentrierten Stammlösungen

angesetzt und sterilfiltriert.

• Glukose: Es wurde eine 20 %ige Stammlösung (w/v) angesetzt und

punktautoklaviert.

• Citrat: Es wurde eine 1 M Citrat-Stammlösung hergestellt und

punktautoklaviert.

Tabelle 16: Pipettierschema für 100 ml chemisch definiertes Medium

Übernacht-/Hauptkultur Glukose limitiert

je Aminosäuren 2 ml (Stammlsg.) 2 ml (Stammlsg.)

je Vitamine 100 μl (Stammlsg.) 100 μl (Stammlsg.)

je Spurenelemente

(außer FeCl3) 100 μl (Stammlsg.) 100 μl (Stammlsg.)

1 M Citrat 14 μl (EK: 0,142 mM) 14 μl

FeCl3 150 μl (Stammlsg.) 150 μl (Stammlsg.)

2 N NaOH (steril) 150 μl 150 μl

20 % (w/v) Glukose 740 μl (EK: 7,5 mM/0,15 %) 246 μl (EK: 2,5 mM/ 0,05%)

Page 163: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 163

3.1.3 Antikörper, Beads, Säulenmaterialien

Die folgende Aufzählung beinhaltet die in dieser Arbeit verwendeten Antikörper, Beads

und Säulenmaterialien.

primärer Antikörper: Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) (Cell Signaling Technology®) sekundärer Antikörper: "Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate" (Bio-Rad) Titansphäre 10 µm: GL Sciences Inc. Japan (MZ-Analysentechnick, Mainz) Säulenmaterial, C8 3M: Infochroma AG, Zug, CH Säulenmaterial, C18(2) Luna 3n: Phenomenex Ltd., Torrance, USA

3.1.4 Antibiotika und Enzyme

Das zur Stammselektion bzw. als Translationshemmer genutzte Antibiotikum wird in

der Tabelle 17 aufgeführt.

Tabelle 17: verwendetes Antibiotikum.

Antibiotikum Firma Firmenstandort Lösungs-mittel Endkonzentration

Chloramphenicol Serva Electrophoresis GmbH

Heidelberg 100 % Ethanol 5 µg/ml

Nachfolgend sind alle in dieser Arbeit verwendeten Enzyme aufgeführt.

Tabelle 18: verwendete Enzyme.

Enzym Firma Firmenstandort Reinheitsgrad

Nucleasemix GE Healthcare Chalfont St. Giles, GB -

Lysozym Fluka AG Buchs, CH -

Lysylendopeptidase (LysC)

Wako Pure Chemical Industries Neuss "Mass Spectrometry

Grade"

Trypsin Promega USA "Sequencing Grade"

Alkalische Phosphatase Sigma-Aldrich® St. Louis, USA -

Glutamylendopeptidase (GluC)

Roche Diagnostics GmbH Mannheim "Sequencing Grade"

Page 164: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

164

3.1.5 Chemikalien und Lösungsmittel

Die Tabelle 19 umfasst alle im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Chemikalien und

Lösungsmittel.

Tabelle 19: verwendete Chemikalien und Lösungsmittel.

Chemikalien/Lösungsmittel Hersteller Firmensitz 15N-Ammoniumsulfat Cambridge Isotope Laboratories Inc. USA 15N-L-Tryptophan Cambridge Isotope Laboratories Inc. USA 2-Gycerolphosphat Sigma-Aldrich® St. Louis, USA 33P-Phosphosäure Hartmann GmbH Braunschweig Aceton (≥ 99,8%) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Acetonitril (ultrapure) AppliChem GmbH Darmstadt Acrylamid 40 % AppliChem GmbH Darmstadt Alanin Fluka AG Buchs, CH Ammoniak 25 % Fluka AG Buchs, CH Ammoniumbicarbonat Fluka AG Buchs, CH Ammoniumchlorid (NH4Cl) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Ammoniumhydrogencarbonat (NH4HCO3)

Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe

Ammoniumpersulfat (APS) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Arginin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Aspartat Sigma-Aldrich® St. Louis, USA BCIP Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Biotin Fluka AG Buchs, CH Bisacrylamid 2 % AppliChem GmbH Darmstadt Borsäure (H3BO3) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Bromphenolblau Sigma-Aldrich® St. Louis, USA BSA (Rinderserumalbumin) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Butanol (≥ 99,5 %) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Calciumchlorid (CaCl2 * 2 H2O) Serva Electrophoresis GmbH Heidelberg Calcium-D-Panthothensäure Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe CHAPS Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Citrat-Monohydrat Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Cobaldchlorid (CoCl2 * 6 H2O) Fluka AG Buchs, CH Coomassie-Brillant Blue G-250 Sigma-Aldrich® St. Louis, USA CuCl2 * 2 H2O Fluka AG Buchs, CH Cyanocobalamin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Cystein Sigma-Aldrich® St. Louis, USA DHB Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Diamid Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Dimethylformamid (≥99,8) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe DTT (Dithiothreitol) GE Healthcare Chalfont St. Giles,

GB Eisenchlorid (FeCl3) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Eisensulfat- Heptahydrat (FeSO4 * 7H2O)

Serva Electrophoresis GmbH Heidelberg

Essigsäure (100 %) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Essigsäure (100 %, Ultraqualität) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe

Page 165: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 165

Chemikalien/Lösungsmittel Hersteller Firmensitz Ethanol Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Flamingo Bio-Rad Laboratories GmbH Hercules, USA Formaldehyd (≥ 37 %) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Glukose Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Glycerin Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Glycin Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Harnstoff Merck KGaA Darmstadt Histidin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Iodacetamid Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Isoleucin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Isopropanol (≥ 99,95 %) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Kaliumcarbonat (KCO3) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Kaliumchlorid (KCl) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck KGaA Darmstadt Leucin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA L-Glutaminsäure Sigma-Aldrich® St. Louis, USA L-Tryptophan- HCl Fluka AG Buchs, CH Lysin Fluka AG Buchs, CH Lysozym Fluka AG Buchs, CH Magnesiumchlorid (MgCl2) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4 * 7H2O)

Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe

MAHMA NONOate Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Manganchlorid-Tetrahydrat (MnCl2 * 4H2O)

Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe

Mangansulfat-Tetrahydrat (MnSO4 * 4H2O)

Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe

Methanol Rotipuran (99,9 %) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Methanol Lichrosolv (HPLC grade) Merck KGaA Darmstadt Milchpulver Fluka AG Buchs, CH Natrium fluorid (NaF) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Natriumacetat-Trihydrat Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Natriumcarbonat (Na2CO3) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Natriumchlorid (NaCl) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Natriumcitrat-Dihydrat (Na3Citrat * 2H2O)

Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe

Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Merck KGaA Darmstadt Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Natriumhydroxid (NaOH) (≥ 99 %) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Natriummolybdat-Dihydrat (Na2MoO4 * 2H2O)

Merck KGaA Darmstadt

Natrium-Pyrophosphat Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Natriumthiosulfat-Pentahydrat (Na2S2O3 * 5H2O)

Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe

Natriumvanadat (Na3VO4) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA NBT Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe NiCl2 * 6 H2O Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Nicotinsäure Fluka AG Buchs, CH N-Octylglucosid Roche Diagnostics GmbH Mannheim Nuklease-Mix GE Healthcare Chalfont St. Giles,

GB O-Phosphorsäure (reinst) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe p-Aminobenzoat AppliChem GmbH Darmstadt

Page 166: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

166

Chemikalien/Lösungsmittel Hersteller Firmensitz Pharmalyte 3-10 GE Healthcare Chalfont St. Giles,

GB Phenylalanin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA PMSF Fluka AG Buchs, CH Prolin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Propylenglykol Fagron GmbH & Co. KG Barsbüttel Pro-Q Diamond Life Technologies GmbH Carlsbad, USA Pyridoxaminhydrochlorid Fluka AG Buchs, CH Riboflavin Fluka AG Buchs, CH Roti®-Nanoquant Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Salzsäure (HCl) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe SDS ultrapure (reinst) AppliChem GmbH Darmstadt Serin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Silbernitrat (AgNO3) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe TEMED Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Thiaminiumchlorid Fluka AG Buchs, CH Thioharnstoff (≥ 99 %) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Threonin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Trifluoressigsäure (TFA) (spectroscopy grade)

AppliChem GmbH Darmstadt

Tris Base (≥ 99.5 %) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Tryptophan Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Tween 20 Serva Electrophoresis GmbH Heidelberg Valin Fluka AG Buchs, CH Zinkchlorid (ZnCl2) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe

Folgende Wasserqualitäten wurden verwendet:

- Reinstwasser aus Aufbereitungsanlage der Fa. Grünbeck: hier A. dest genannt

- destilliertes A. dest aus dem Wasserdestilliergerät der Fa. Marienfeld: hier A. bidest

oder MS-Wasser genannt

3.2 Methoden

3.2.1 Stammhaltung

Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme wurden in Glycerinkulturen bei

-70°C gelagert. Die Herstellung dieser erfolgte nach der Stammanzucht in einer 20 ml

LB-Schüttelkultur (180 rpm) bei 37°C im Wasserbad, die je nach Stamm mit den

entsprechenden Antibiotika zur Selektion versetzt war. Die Zugabe von 5 ml sterilem

Page 167: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 167

Glycerols fand bei einer optischen Dichte von OD540nm = 0,5 statt. Die Kultur wurde

nachfolgend in Aliquots eingefroren.

3.2.2 Proteinextraktgewinnung

3.2.2.1 Zellkultivierung

Die Vorkultivierung erfolgte nach der Inokulation aus einer Glycerinkultur im

Wasserbad schüttelnd (180 rpm B. subtilis, 120 rpm S. aureus) bei 37°C in dem für den

Organismus entsprechenden Medium. Am darauffolgenden Tag wurde das

vorgewärmte Hauptkulturmedium (100 ml, 37°C) mit den Zellen aus der Vorkultur auf

eine optische Dichte (gemessen mit: Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences,

Uppsala, Schweden) von OD500nm = 0,1 beimpft. Während des Versuches wurde das

Wachstum der Zellen durch das Messen der optischen Dichte verfolgt.

Die auf Eis geernteten Zellen wurden sofort bei 8000 rpm und 4°C für 5-10 min

zentrifugiert (Heraeus Biofuge PrimoR Centrifuge, Thermo Scientific). Nach Verwerfen

des Überstandes, schlossen sich zwei Waschschritte an, bei denen die Zellen in 50 ml

kaltem T-NaF-Puffer gewaschen und anschließend durch Zentrifugation (8000 rpm,

4°C, 5-10 min) pelletiert und vom Überstand befreit wurden. Die Zellen wurden dann

bei -70°C bis zur Weiterverarbeitung kurzfristig gelagert.

T-NaF-Puffer: 0,1 M Tris (pH 7,5 mit HCl) 10 mM NaF (Phosphatase-Inhibitor)

Die Kultivierung erfolgte schüttelnd (180 rpm) im BMM bei 37°C im Wasserbad. Nach

der Entnahme der Kontrollprobe in der logarithmischen Wachstumsphase bei der

OD500nm = 0,5 wurde Ethanol der Kultur hinzugefügt, so dass eine Endkonzentration

Bacillus subtilis

Stressexperimente für WT und sigB-Mutante (ML6):

Ethanolstress (EK: 10 %) (WT und ML6):

Page 168: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

168

von 10 % (v/v) EtOH im Medium vorlag. Weitere Probenentnahmen folgten zu den

Zeitpunkten 10, 20, 30 und 60 min nach Stressauslösung. Das Probenvolumen

umfasste jeweils 20 ml der Kultur.

Hitzestress (54°C) (WT und ML6):

Die Kultivierung erfolgte schüttelnd (180 rpm) im BMM bei 37°C im Wasserbad. Bei der

OD500nm = 0,5 wurde in der exponentiellen Wachstumsphase die Kontrollprobe

entnommen und nachfolgend die Kultur in ein Wasserbad mit der Temperatur von

54°C umgesetzt. Die Probenentnahme von jeweils 20 ml erfolgte 10, 20, 30 und 60 min

nach Temperaturwechsel.

Glukosehunger (ML6):

Die Kultivierung erfolgte schüttelnd (180 rpm) bei 37°C in BOC mit einer

Glukosesupplementierung von 0,05 % (w/v). Bei der OD500nm = 0,5 wurde in der

exponentiellen Wachstumsphase der Kultur eine Kontrollprobe entnommen. Weitere

Probenentnahmen erfolgten in der transienten Phase sowie 30 und 60 min nach

Eintritt in die stationäre Phase. Das Probenentnahmevolumen umfasste jeweils 20 ml

der Kultur.

33P-Phosphorsäuremarkierung:

Zur Detektion phosphorylierter Proteine von B. subtilis unter Kontroll- und

Ethanolstressbedingungen wurde eine radioaktive Markierung mit Phosphorsäure, die

das 33P-Isotop enthielt, durchgeführt. Dazu wurde B. subtilis bis zu einer OD500nm = 0,4

in BMM angezogen, das mit 0,15 mM KH2PO4 statt mit 0,6 mM supplementiert war.

Bei Erreichen dieser optischen Dichte wurden 60 µCi/ml 33P-Phosphorsäure (entspricht

22,2 MBq) der Kultur hinzugegeben. 10 min später wurde die Kontrollprobe (10 ml)

entnommen, sowie Ethanol (EK in der Kultur 10 % (v/v)) hinzugefügt. Nach 20 min

erfolgte eine weitere Probenentnahme (10 ml). Beide Proben wurden mit 1 ml Stopp-

Puffer versetzt. Die Zellen wurden in Falkonröhrchen bei 8000 rpm und 4°C pelletiert

und zweimal mit T-NaF-Puffer gewaschen. Die Lagerung der Zellpellets erfolgte bei

-20°C. Zellaufschluss, 2D-Gel-Herstellung und Pro-Q-Färbung wurde wie unten

beschrieben vorgenommen.

Page 169: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 169

Nach erfolgreicher Pro-Q-Färbung wurden die Gele getrocknet (Geltrockner/

Thermostat, UNIQUIP) und auf einen Phosphoscreen (Molecular Dynamics) gelegt. Die

Expositionslänge erfolgte gemäß Einbaurate (diese wurde über eine

Szintillationsmessung bestimmt) und die Digitalisierung wurde nachfolgend mit dem

Storm 840 (Molecular Dynamics) vorgenommen.

Stopp-Puffer: 0,1 M Tris 0,1 % (w/v) Chloramphenicol 5 mM KH2PO4

Metabolische Markierung /15N-Standard als interne Referenz:

Der interne 15N-Proteinextrakt-Standard wurde von Jan Muntel (Inst. f. Mikrobiologie,

Universität Greifswald) zur Verfügung gestellt. Er wurde aus einer B. subtilis-Kultur

gewonnen, in der die Zellen in Minimalmedium, das mit 15N-Ammoniumsulfat und 15N-

L-Tryptophan (Cambridge Isotope Laboratories Inc., USA) supplementiert war,

kultiviert wurden. Die Zellernte erfolgte zu unterschiedlichen Zeitpunkten (in der

logarithmischen, transienten und stationären Phase), so dass möglichst ein Großteil

des Proteinkomplements der Zelle in der internen Referenz enthalten war

(Zellaufschluss siehe Abschnitt 3.2.2.2)

Der Standardproteinextrakt wurde dann vor der Auftrennung im 2D-Gel in gleichen

Teilen zu dem eigentlichen 14N-Proteinextrakt aus dem Ethanolstress-Experiment

(Kontrollzeitpunkt und Zeitpunkt 30 min nach Ethanolzugabe) hinzugegeben.

Weiter wurde wie unter Abschnitt 3.2.3.3 beschrieben verfahren.

Für die Anzucht eines biologischen Replikates (insgesamt wurden drei biologische

Replikate angefertigt) wurden jeweils 3 Kolben à 100 ml vortemperiertem Medium

(37°C) aus einer Vorkultur inokuliert. Dies garantierte, dass für die spätere Analyse

ausreichend Zellmaterial zur Verfügung stand. Die Probenentnahme erfolgte jeweils

Staphylococcus aureus

Kultivierung von S. aureus COL für die gelbasierten Phosphoproteomanalysen:

Page 170: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

170

durch die Ernte des Inhalts eines Kolbens mittels Zentrifugation (8000 rpm, 4°C für 5-

10 min; Heraeus Biofuge PrimoR Centrifuge, Thermo Scientific).

Glukosehunger:

Die Anzucht erfolgte schüttelnd (120 rpm) im Wasserbad bei 37°C im chemisch

definierten Medium (CDM) mit einer Glukosesupplementierung von 0,05 %. Die Ernte

der Zellen wurde in der exponentiellen Wachstumsphase (OD500nm = 0,5), in der

transienten Phase und 180 min nach Eintritt in die stationäre Phase durchgeführt. Die

Zellen traten bei einer OD500nm von 0,9 in die stationäre Phase ein.

osmotischer Stress (durch Salzzugabe):

Bei einer OD500nm = 0,5 wurde NaCl zur Hauptkultur hinzugegeben, so dass im Medium

eine Endkonzentration von 8 % (w/v) vorlag. Die Probenentnahmen erfolgten vor der

Salzzugabe bei einer OD500nm = 0,5 sowie 15 und 45 min nach Stressinduzierung.

oxidativer Stress (durch Diamidzugabe):

Um oxidativen Stress auszulösen, wurde das Thiol-spezifische Oxidant Diamid bei einer

OD500nm = 0,5 in einer Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben. Die

Probenentnahme erfolgte wie unter dem Abschnitt Salzstress beschrieben.

nitrosativer Stress:

MAHMA NONOate [6-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-

1-hexanamine; Sigma-Aldrich®] wurde als NO-Donor in einer Endkonzentration von

500 µM verwendet, um den nitrosativen Stress auszulösen. Die Experimente erfolgten

gemäß Falko Hochgräfe und Mitarbeitern (Hochgräfe u. a., 2008). Die

Probenentnahme erfolgte wie unter dem Punkt Salzstress beschrieben.

Kultivierung von S. aureus COL für die gelfreien Phosphoproteomanalysen:

Für den gelfreien Ansatz wurden die S. aureus COL Zellen bis zu einer optischen Dichte

OD500nm = 1,5-2 in CDM bei 37°C schüttelnd (120 rpm) im Wasserbad kultiviert und

Page 171: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 171

nachfolgend auf Eis geerntet (siehe oben). Die Zellen befanden sich bei der Ernte in der

späten logarithmischen, bzw. der transienten Wachstumsphase.

3.2.2.2 Zellaufschluss

Ultraschall (B. subtilis):

Der Aufschluss wurde in 400 µl T-P-VF Aufschlusspuffer mittels Ultraschall (B. Braun

Biotech International) durchgeführt. Eine Beschallung fand 3 x 1 min bei 50 W

(Impulsfrequenz: 0,6 s) statt. Während des Ultraschalls wurden die Proben auf Eis

gelagert und zwischen den Zyklen ebenso eine Minute auf Eis gekühlt. Die Zelltrümmer

wurden durch zwei Zentrifugationsschritte (2 x 30 min, 15000 rpm, 4°C; Heraeus

Biofuge PrimoR Centrifuge, Thermo Scientific) entfernt.

T-P-VF Aufschlusspuffer: 0,01 M Tris/Hcl pH 7,5 1 mM PMSF in EtOH 1 mM Na3VO4, pH 10 (Phosphatase- Inhibitor) 10 mM NaF (Phosphatase-Inhibitor) Ribolyser (S. aureus):

Gelbasierter Ansatz:

Das Zellpellet wurde in dem Aufschlusspuffer resuspendiert und in mit

Glasperlen gefüllte Stammhaltungsröhrchen überführt. Der Aufschluss erfolgte

mit dem Precellys 24 Homogenisator (PeqLab) (bei 6500 rpm für 6 x 10

Sekunden). Die Glasperlen (0,1 mm Durchmesser) wurden durch Zentrifugation

(15000 rpm, 15°C, 5 min) pelletiert und der Überstand durch zwei weitere

Zentrifugationsschritte (15000 rpm, 15°C, 30 min) von den Zelltrümmern

befreit.

Aufschlusspuffer: 8 M Harnstoff 2 M Thioharnstoff 10 mM NaF

Page 172: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

172

Gelfreier Phosphopeptidanreicherungsansatz

3.2.3 Methoden zur Proteinanalyse

(angelehnt an Olsen & Macek, 2009):

Die Zellen wurden in 1 ml Lysis-Puffer aufgenommen und für 15 min bei 37°C

inkubiert.

Lysis-Puffer: 50 mM Tris/HCl 5 mg/ml Lysozym 5 mM der folgenden Phosphatase-Inhibitoren: NaF, 2-Gycerolphosphat, Natriumvanadat, Natrium-Pyrophosphat

Es folgte der Zellaufschluss mit dem Ribolyser (siehe oben). Bevor die

Glasperlen und Zelltrümmer abzentrifugiert wurden, fand zur Hydrolyse von

Nucleinsäurenketten ein Verdau der Suspension mit einem DNase und RNase

enthaltendem Nucleasemix (GE Healthcare) statt. Hierbei wurde nach den

Herstellerangaben verfahren. Des Weiteren wurde das Gemisch mit dem

Detergenz N-Octylglucosid versetzt (Endkonzentration: 1 % (w/v)). Die Zugabe

hatte das Herauslösen von integralen Membranproteinen zum Ziel. Es folgten

ein 5- und zwei 30-minütige Zentrifugationsschritte bei 15000 rpm (4°C).

Die erhaltenen Proteinextrakte wurden bei -70°C bis zur Weiterverarbeitung gelagert.

3.2.3.1 Proteinbestimmung nach Bradford

Die quantitative Bestimmung des Gesamtproteingehalts erfolgte gemäß der Bradford-

Methode. Diese wurde von der Amerikanerin Marion M. Bradford 1976 beschrieben

und beruht auf der Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffes

Coomassie Brilliant blue G-250, die durch die Komplexbindung mit Proteinen

hervorgerufen wird (Bradford, 1976).

Als Bradfordreagenz wurde Roti®-Nanoquant (Roth) eingesetzt und die Bestimmung

laut Herstellerangaben durchgeführt.

Page 173: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 173

Für die Bestimmung des Proteingehalts in S. aureus-Extrakten, die 8 M Harnstoff/2 M

Thioharnstoff enthielten, wurde eine entsprechende BSA-Eichreihe zur Ermittlung des

Proteingehaltes eingesetzt.

3.2.3.2 Verdau des Proteinextraktes mit alkalischer Phosphatase

Für den Verdau mit alkalischer Phosphatase wurden 400 µg Proteinextrakt mit einer

Unit alkalischer Phosphatase von E. coli (Sigma-Aldrich®) für eine Stunde bei 37°C

inkubiert.

3.2.3.3 Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE)

Zur Auftrennung der Proteine mittels 2D-PAGE wurden für die erste Dimension

Proteinextrakt-Aliquots mit der für den Organismus entsprechenden

Rehydratisierungslösung versetzt. Je nach pH-Bereich des IPG-Streifens (Immobiline

Dry Strips, GE Healthcare) wurden 200 µg (für den pH-Bereich 4-7) oder 400 µg (für

den pH-Bereich 4,5-5,5) Proteinextrakt eingesetzt. Das Gemisch wurde mehrfach

geschwenkt, 2 x 30 min bei 12000 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert und in eine

Rehydratisierungsschale überführt. Der IPG-Streifen wurde mit der Gelseite nach

unten auf den in der Schale befindlichen Flüssigkeitsfilm luftblasenfrei gelegt, mit

DryStripFluid (GE Healthcare) überschichtet und die Schale mit Parafilm abgedichtet.

Die Rehydratisierung erfolgte abgedunkelt für 22 h bei konstanter Raumtemperatur.

Aufgrund der unterschiedlichen Aufschlusspuffer für B. subtilis (Basis=Trispuffer) und

S. aureus (Basis=Harnstoff/Thioharnstoff) mußten verschiedene Rehydratisierungs-

protokolle verwendet werden.

Rehydratisierung - B. subtilis: 8 M Harnstoff 2 M Thioharnstoff 1 % (w/v) CHAPS 0,5 % (v/v) Pharmalyte™ pH 3-10 für IEF 0,3 % (w/v) DTT lösen in A. bidest

Page 174: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

174

Das eingesetzte Volumen des Proteinextraktes durfte 40 µl nicht überschreiten und

wurde gegebenenfalls durch Vakuumzentrifugation verkleinert. Der Proteinextrakt

wurde auf 400 µl mit Rehydratisierungslösung aufgefüllt.

Rehydratisierung - S. aureus:

Zu jeder einzelnen Proteinprobe (200 µg oder 400 µg Proteinextrakt) wurden 40 µl

10-fach-Konzentrat hinzugegeben und mit der Stammlösung auf ein

Rehydratisierungsvolumen von 400 µl aufgefüllt.

Stammlösung: 8 M Harnstoff 2 M Thioharnstoff 10-fach Konzentrat: 10 % (w/v) CHAPS 1 % (v/v) Pharmalyte™ pH 3-10 für IEF 3 % (w/v) DTT Die isoelektrische Fokussierung fand in einer MultiphorII-Kammer (Pharmacia Biotech,

Uppsala) bei 20°C statt. Folgendes Programm wurde gewählt:

Phase 1: Gradient 500 V 500 Vh 1 mA 5 W 2h Phase 2: Stufe 500 V 2500 Vh 1 mA 5 W 5h Phase 3: Gradient 3500V 10 kVh 1 mA 5 W 5h Phase 4: Stufe 3500 V 35 kVh 1 mA 5 W 10h

Nach erfolgter isoelektrischer Fokussierung wurden die Streifen, um Diffusionen zu

vermeiden, möglichst umgehend in die Prozedur der zweiten Dimension überführt

oder bei -20°C in Folie gelagert.

Für die Auftrennung in der zweiten Dimension wurden die nach ihrem isoelektrischen

Punkt separierten Proteine im IPG-Streifen mit DTT reduziert und mit Iodacetamid

alkyliert. Dazu wurde der Streifen jeweils 15 min in Äquilibrierungslösung A und B bei

Raumtemperatur geschwenkt.

Page 175: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 175

Äquilibrierungslösung : 50 mM 0,5 M Tris-HCl pH 6,8

6 M Harnstoff 30 % (v/v) Glycerol 4 % (w/v) SDS A: + 0,35 % (w/v) DTT B: + 4,5 % (w/v) Iodacetamid + Spatelspitze Bromphenolblau

Anschließend wurde der Streifen auf das Sammelgel überführt und mit SDS-Laufpuffer

(1-fach konzentriert) überschichtet. Die Elektrophorese erfolgte in einer Apparatur von

Genomic Solutions in der 5-Gele (Gelgröße: ca. 20 x 20 cm Trenngel und ca. 5 x 20 cm

Sammelgel, mit einer Dicke von 0,8 mm) gleichzeitig vertikal in Laufpuffer stehen

konnten. Die elektrophoretische Trennung wurde über 18-20 h bei 12°C mit 1-2 W pro

Gel, 300 mA und 500 V durchgeführt, wobei der Fortgang der Elektrophorese durch die

mit Bromphenolblau angefärbte Lauffront erkennbar war. Bei Erreichen der unteren

Gelseite wurde der Lauf gestoppt. Die Gele wurden der Apparatur entnommen und für

die weitere Behandlung vorsichtig in saubere Färbeschalen überführt.

Trenngel (10 Gele) 12,5 %: 303,6 ml A. bidest 334,4 ml 40 % Acrylamid 187 ml 2 % Bisacrylamid 275 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 2,75 ml 10 % (w/v) APS 0,55 ml TEMED Sammelgel (10 Gele) 4 %: 61 ml A. bidest 9 ml 40 % Acrylamid 4,5 ml 2 % Bisacrylamid 25 ml 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 380 µl 10 % (w/v) APS 62,5 µl TEMED 10 x SDS-Laufpuffer: 250 mM Tris Base 1,92 M Glycin 1 % (w/v) SDS

Page 176: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

176

3.2.3.4 Färbemethoden für Proteine im 2D-Gel

3.2.3.4.1 Phosphoproteinfärbung im 2D-Gel mit Pro-Q® Diamond

Die Färbung der phosphorylierten Proteine im 2D-Gel erfolgte mit dem Pro-Q®

Diamond Phosphoprotein Gel Stain (Molecular Probes®, life technologies™). Es wurde

darauf geachtet, dass die Färbeschalen nicht durch einen anderen Farbstoff, wie z. B.

Flamingo oder Colloidal Coomassie kontaminiert waren. Bei Bedarf wurde das Gel

immer nur an der gleichen Ecke, an der keine phosphorylierten Spots zu erwarten

waren, berührt.

Die Färbung erfolgte wie nachfolgend beschrieben:

Fixieren: 2 x 30 min in 500 ml Fixierlösung, schwenkend

Fixierlösung: 50 % (v/v) EtOH 12 % (v/v) Essigsäure ad A. dest

Waschen: 4 x 15 min mit 500 ml A. dest waschen (der 3. Waschschritt wurde

häufig auch über Nacht durchgeführt)

Färben: Die Färbung fand in 450 ml Färbelösung leicht schwenkend für 2,5 h

statt. Die Färbelösung wurde gemäß Agrawal und Thelen angesetzt,

indem eine dreifache Verdünnung des Farbstoffes vorgenommen wurde

(Agrawal & Thelen, 2005).

Färbelösung pro Gel: 300 ml A. dest 150 ml Pro-Q Diamond

Entfärben: Nach der Färbung wurde das Gel entfärbt, um die Hintergrundfärbung

zu minimieren. Dies fand in 500 ml Entfärbelösung für 3 x 30 min und 1 x

45 min statt. Zwischen den Schritten wurde der Entfärber getauscht.

Entfärbelösung: 20 % (v/v) Propylenglykol 5 % (w/v) Natriumacetat pH 4,0 ad A. dest

Page 177: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 177

Waschen: 2 x 10 min in 500 ml A. dest Scannen: Molecular Imager FX (Bio-Rad Laboratories, Inc.) Excitations Quelle: 532 nm Laser Emissions Filter: 555 nm longpass

3.2.3.4.2 Gesamtproteinfärbung im 2D-Gel mit Flamingo™

Die Gesamtproteinfärbung mit dem fluoreszierenden Farbstoff Flamingo™ Fluorescent

Gel Stain (Bio-Rad) wurde wie nachfolgend beschrieben durchgeführt.

Fixieren: 40 % (v/v) EtOH 10 % (v/v) Essigsäure 500 ml pro Gel mindestens 1h Färben: Flamingo 1:10 mit A. dest verdünnt 200 ml pro Gel mindestens 3 h, besser über Nacht Scannen: Typhoon Scanner 9400 (GE Healthcare) 532 nm (Excitation) 610 nm BP 30 oder 560 nm LP (Emission)

Die Gele wurden in der Färbelösung gelagert, erneut gefärbt oder eingeschweißt bei

4°C gelagert.

3.2.3.4.3 Gesamtproteinfärbung im 2D-Gel mit Deep Purple™

Die Gesamtproteinfärbung mit dem fluoreszierenden Farbstoff Deep Purple™ total

protein stain (GE Healthcare) wurde wie nachfolgend beschrieben durchgeführt:

Fixieren: 7,5 % (v/v) Essigsäure 10 % (v/v) Ethanol 1 l pro Gel, mindestens 1 h, besser über Nacht

Page 178: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

178

Waschen: 300 mM Na2CO3 35 mM NaHCO3 pH 10-11, 1 l pro Gel 30 min Färben: Deep purple 1:200 mit A. dest verdünnt für 1h Stabilisieren: 7,5 % (v/v) Essigsäure 1 l pro Gel 2 x 15 min Scannen: Typhoon 9400 Scanner 532 nm (Excitation) 610 nm BP 30 oder 560 nm LP (Emission)

3.2.3.4.4 Colloidal Coomassie/ Coomassie "blue silver"

Eine Colloidal Coomassie Färbung (Neuhoff u. a., 1988) oder die Coomassie "blue

silver" Färbung (Candiano u. a., 2004) wurde durchgeführt, wenn Proteine aus dem

2D-Gel ausgeschnitten und massenspektrometrisch identifiziert werden sollten. Die

blaue Färbung der Proteinspots diente hierbei als Orientierungshilfe, um im Vergleich

zu einem Zweikanalfarbenbild (Coomassie vs. Pro-Q), die Lokalisierung der

phosphorylierten Spots auszumachen. Häufig wurde die Färbung im Anschluss an die

Flamingo-Färbung ohne einen zusätzlichen Fixierungsschritt durchgeführt. Die Färbung

erfolgte für mindestens 2 h (Coomassie "blue silver") oder über Nacht (Colloidal

Coomassie). Die Entfärbung des Hintergrundes wurde durch mehrmaliges Waschen mit

A. dest realisiert.

Colloidal Coomassie-Färbung:

Die Colloidal Coomassie Färbelösung wurde kurz vor der Färbung aus dem CCD-stock

und Methanol angesetzt. Pro Gel wurden 250 ml Färbelösung eingesetzt.

Coomassie Brillant Blue stock (CBB-stock):

5 % (w/v) Coomassie-Brillant Blue G-250

Page 179: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 179

Colloidal Coomassie dye stock (CCD-stock):

50 g Ammoniumsulfat + 6 ml 85 % Phosphorsäure

ad 490 ml A. dest + 10 ml CBB stock

Colloidal Coomassie Lösung:

200 ml CCD stock + 50 ml Methanol

Coomassie "blue silver"-Färbung:

1l Färbelösung: 100 ml A. dest 100 ml O-Phosphorsäure 100 g Ammoniumsulfat ad 800 ml mit A. dest + 1,2 g Coomassie G-250 ÜN rühren kurz vor Anwendung: + 200 ml MetOH

Nach der Entfärbung des Hintergrundes mit A. dest wurde die Digitalisierung mit dem

Lichtscanner "x-finity ultra 1600" der Firma Quatographic (Braunschweig)

vorgenommen.

3.2.3.4.5 Gesamtproteinfärbung im 2D-Gel mit Silbernitrat

Vorgegangen wurde nach der von Blum et al. (1987) beschriebenen Methode. Alle

nachfolgend beschriebenen Schritte wurden bei RT in Färbeschalen mit 200 ml

Lösungsvolumen auf einem Gelschüttler durchgeführt.

Fixieren: 50 % (v/v) Ethanol 12 % (v/v) Essigsäure 0,05 % (v/v) Formaldehyd mindestens 1 h

Waschen: 2 x 20 min mit 50 % (v/v) Ethanol

Page 180: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

180

Sensitivieren: 1 min in 0,2 g/l Na2S2O3* 5 H2O Waschen: 3 x 20 s mit A. dest

Färben: 2 g/l AgNO3 750 µl/l 37 % Formaldehyd 20 min

Waschen: 2 x 20 s in A. dest Entwickeln: 30 g/l KCO3 4 mg/l Na2S2O3 * 5 H2O 0,5 ml/l 37 % Formaldehyd 4-5 min, je nach Bedarf Stoppen: 30 s mit 1 % (w/v) Glycin Waschen: 30 s mit A. dest Stoppen: 10-30 min mit 1 % (w/v) Glycin Waschen: 30 s mit A. dest

Nach dieser Prozedur konnte das Gel eingescannt (digitalisiert), in Folie aufbewahrt

oder im Fall von radioaktiven Gelen getrocknet werden.

3.2.3.5 2D-Gel Westernblot mit Phospo-Tyrosin-Antikörper (P-Tyr-100)

Die 2D-Gelelektrophorese wurde wie unter Abschnitt 3.2.3.3 beschrieben

durchgeführt. Der Transfer der Proteine vom 2D-Gel auf eine Membran wurde mit

einer Semi-Dry Apparatur (Amersham Biosciences) durchgeführt, in der Gele von der

Größe 23 x 26 cm eingelegt werden konnten. Zu Beginn wurde die PVDF-Membran

(Roth) für 1 min in 60 % (v/v) Methanol aktiviert und in die Blotapparatur auf das 2D-

Gel überführt. Das Blotten fand in Transferpuffer für 3 h bei 250 mA statt.

Transferpuffer: 25 mM Tris Base 0,2 M Glycin 20 % (v/v) Methanol pH 8,5

Page 181: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 181

Zur Detektion der am Tyrosin phosphorylierten Proteine auf der Membran wurde

folgendes Antikörper-basiertes Protokoll durchgeführt:

Waschen der Membran: 1 x 5 min mit 100 ml 1x TBS bei RT 10 x TBS: 60 g Tris 90 g NaCl ad 1 l A. dest., pH 7,6 Blocking: 1 x 1 h mit 100 ml Blocking-Puffer Blocking-Puffer: 0,1 % (v/v) Tween 20 5 % (w/v) Magermilchpulver in 1 x TBS Waschen der Membran: 3 x 5 min mit 100 ml TBS/T bei RT TBS/T: 0,1 % (v/v) Tween 20 in 1x TBS primärer Antikörper: 120 ml Verdünnungspuffer + 60 µl P-Tyr100 Antikörper ÜN, schüttelnd bei 4°C Verdünnungspuffer: 0,1 % (v/v) Tween 20 5 % (w/v) BSA in 1 x TBS Waschen: 2 x 7,5 min mit 100 ml TBS/T Blocking: 1 x 30 min mit 100 ml Blocking-Puffer sekundärer Antikörper: 2 h Inkubation mit sekundärem Antikörper (Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate, Bio-Rad) (60 µl Antikörper in 120 ml Blocking-Puffer) Waschen: 3 x min A. dest die Membran spülen Äquilibrieren: 1 x mit AP-Puffer äquilibrieren AP-Puffer: 100 mM Tris-HCl, pH 9,5 100 mM NaCl 5 mM MgCl2

Page 182: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

182

Detektieren: 800 µl NBT + 400µl BCIP in 120 ml AP-Puffer

Nach Ausbildung des Farbkomplexes wurde die Reaktion

durch waschen in A. dest gestoppt.

NBT-Stammlösung: 5 % (w/v) in 70 % (v/v)

Dimethylformamid

BCIP-Stammlösung: 5 % (w/v) in 100 % Dimethylformamid Die Digitalisierung erfolgte mithilfe des Lichtscanners "x-finity ultra 1600" der Firma

Quatographic (Braunschweig).

3.2.3.6 Bildananalyse der gefärbten 2D-Gele

Die digitalisierte Bildanalyse wurde jeweils mit der aktuellen Version der Delta2D

Software von Decodon GmbH (Greifswald) durchgeführt.

3.2.4 Anreicherung von Proteinkinasen mittels eukaryotischen Kinaseinhibitoren

Die Anreicherung bakterieller Proteinkinasen mittels eukaryotischer Kinaseinhibitoren

wurde in Kooperation mit Prof. Dr. Lothar Jänsch und Dr. Josef Wissing (Mikrobielle

Krankheitserreger/Zelluläre Proteomforschung, HZI Braunschweig) am HZI in

Braunschweig durchgeführt. Sie wurde gemäß Wissing und Kollegen an einem

Proteinextrakt von B. subtilis vorgenommen (Wissing u. a., 2007). Das Protokoll wurde

dahingehend geändert, dass zwei getrennte Anreicherungsschritte durchgeführt

wurden. Der erste Anreicherungsschritt erfolgte in einem "Batchansatz", in dem der

Proteinextrakt mit dem an Sepharose gekoppelten Inhibitor PP58 im Falkongefäß

inkubiert wurde. Der Überstand aus diesem Ansatz wurde in dem zweiten

Anreicherungsschritt zugeführt. Dieser bestand aus einer chromatographischen

Auftrennung mithilfe des Äkta-Explorers 900 (Pharmacia Biotech/GE Healthcare,

Uppsala, Schweden) unter Verwendung von drei hintereinandergeschalteten Säulen,

die jeweils einen an Sepharose gekoppelten Inhibitor enthielten. Die Reihenfolge

entsprach den Inhibitoren BisX (BisindolylmaleimideX) --> AX14596 --> PurB

Page 183: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 183

(Purvalanol B). Die Elutionen der putativen Proteinkinasen erfolgten für beide

Anreicherungsansätze getrennt. Die Eluate wurden massenspektrometrisch am FT-ICR-

MS/MS (Thermo Scientific) am Inst. für Mikrobiologie der Universität Greifswald

analysiert (siehe unter Absatz 3.2.6.1).

3.2.5 Phosphopeptidanreicherung

Zur Analyse des Phosphoproteoms von S. aureus wurde die gelfreie

Phosphopeptidanreicherung gemäß Olsen und Macek 2009 durchgeführt, die im

Rahmen eines Besuches bei Prof. Boris Macek am Proteome Center der Universität

Tübingen erlernt und geringfügig modifiziert wurde.

Für jeweils einen Versuch wurden 50 mg Proteinrohextrakt (siehe Abschnitt 3.2.2.2

gelfreier Aufschluss) eingesetzt. Um einen Pufferwechsel zu ermöglichen wurde eine

Acetonfällung durchgeführt. Hierbei erfolgte die Fällung bei -70°C in einem fünffachen

Acetonüberschuss über Nacht. Am nächsten Tag wurden die präzipitierten Proteine

per Zentrifugation pelletiert und zweimal mit Aceton gewaschen (30 min, 8000 rpm,

4°C). Das restliche Aceton wurde durch Lufttrocknung entfernt.

Für den Verdau wurde das Proteinpellet in 100-200 µl Denaturierungspuffer

resuspendiert und eine Reduzierung der Disulfidbrücken mit DTT und die Alkylierung

der entstandenen Sulfhydrylgruppen mit Iodacetamid vorgenommen.

Denaturierungspuffer: 6 M Harnstoff 2 M Thioharnstoff in 10 mM Tris/ HCl pH 8,0 Reduktionspuffer: 1 M DTT in 50 mM Ammoniumbicarbonat (Stammlösung) Endkonzentration in der Verdaulösung 1mM 1 h bei RT schütteln Alkylierungspuffer: 550 mM Iodacetamid in 50 mM Ammoniumbicarbonat (Stammlösung)

Page 184: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

184

Endkonzentration in der Verdaulösung 5,5 mM 1 h bei RT abgedeckt schütteln Nach dem Überprüfen des pH-Wertes, der sich bei pH 8,0 befinden sollte und

gegebenenfalls nötiger Adjustierung, wurde dem Proteinextrakt die

Lysylendopeptidase LysC (Wako) in einer Endkonzentration von 1 µg Enzym zu 500 µg

Protein zugesetzt. Es folgte ein Inkubationsschritt von 6-8 h bei Raumtemperatur. Nach

diesem Vorverdau wurde das Protein/Peptidgemisch mit der vierfachen Menge an

A. bidest verdünnt und der pH-Wert auf pH 8,0 eingestellt. Ein weiterer Verdauschritt

folgte, in dem über Nacht das Gemisch mit der Proteinase Trypsin (Promega) in einem

1:100 Verhältnis bei 37°C inkubiert wurde.

3.2.5.1 Kationenaustauschchromatographie (SCX-Chromatographie)

Zur Vorfraktionierung des aus dem Verdau hervorgegangenen Peptidgemisches wurde

eine Kationenaustauschchromatographie mit dem Äkta-Explorer 900 (Pharmacia

Biotech/GE Healthcare, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Die chromatographische

Trennung fand mittels einer 1 ml Resource S Säule (GE Healthcare) statt. Vor der

chromatographischen Auftrennung wurde das Peptidgemisch auf ein Volumen von

45 ml mit A. bidest (MS-Wasser) verdünnt und der pH auf 2,7 mit TFA adjustiert.

Eventuell entstehende Präzipitate wurden mittels Zentrifugation (8500 rpm, 20 min,

22°C) entfernt.

Die Probe wurde mithilfe eines Probengefäßes und einem Fluss von 1 ml/min auf die

Säule geladen. Eine Trennung der Peptide erfolgte aufgrund eines binären Gradienten

aus Eluent A und B (0 % - 30 % Eluent B) über einen Zeitraum von 30 min mit einem

Fluss von 1 ml/min. Die Chromatographie wurde durch UV-Detektion bei 214 nm

dokumentiert. Es wurden während des Ladevorgangs, des Gradienten und des

darauffolgenden Waschschritts bei 100 % Eluent B Fraktionen (jeweils 1,5 ml)

gesammelt und bis zur weiteren Verarbeitung bei - 70°C gelagert.

Eluent A: 5 mM Kaliumdihydrogenphosphat 30 % (v/v) ACN pH 2,7 (mit TFA adjustieren)

Page 185: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 185

Eluent B: 5 mM Kaliumdihydrogenphosphat 30 % (v/v) ACN 350 mM Kaliumchlorid pH 2,7 (mit TFA adjustieren)

3.2.5.2 TiO2-Phosphopeptidanreicherung

Aufgrund des UV-Spektrums aus der durchgeführten Kationen-

austauschchromatographie wurde der Peptidgehalt jeder Fraktion bewertet und

danach diejenigen Fraktionen mit einem niedrigen Peptidgehalt vereinigt ("gepoolt").

Die Anreicherung über die Titandioxidbeads (5 mg; Titansphere, GL-Sciences) erfolgte

für jede Fraktion oder gepoolte Fraktion separat. Bevor die Beads eingesetzt werden

konnten, musste deren Äquilibrierung mit DHB (EK: 30 mg/ml in 80 % (v/v) ACN,

50 µl/5 mg Beads) über einen Zeitraum von 10 min schüttelnd bei RT unter

Lichtausschluss erfolgen. Die Beadsuspension wurde anschließend zu den Fraktionen

hinzugegeben und das Gemisch für 1 h bei RT auf einem Überkopfschüttler unter

Lichtausschluss inkubiert.

Anschließend wurde der Überstand nach einem zweiminütigem Zentrifugationsschritt

(10000 rpm, RT; Heraeus Biofuge Pico, Thermo Scientific) entfernt. Die Beads wurden

zweimal mit Waschlösung I und einmal mit Waschlösung II für jeweils zehn Minuten

gewaschen (Rotation auf Überkopfschüttler) und der Überstand nach dem

Zentrifugieren (2 min, 10000 rpm) entfernt. Die Beads wurden in 50 µl Waschlösung 2

aufgenommen und in vorbereitete C8-Stage-Tips (Rappsilber u. a., 2007) überführt. Die

Elution erfolgte 3 x mit 100 µl Elutionslösung aus 40 % (v/v) NH4OH (aq 25 % NH3 Fluka;

EK NH3 = 10 %) und 60 % (v/v) ACN (pH >10) durch Zentrifugation für 3 min bei 5000

rpm. Die Eluate wurden vereinigt und das Flüssigkeitsvolumen durch

Vakuumzentrifugation auf 5 µl reduziert. Das Eluat wurde mit A*-Lösung angesäuert

und sofort massenspektrometrisch analysiert.

Äquilibrierungslösung: 30 mg/ml DHB 80 % (v/v) ACN in MS-Wasser

Page 186: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

186

Waschlösung 1: 30 % (v/v) ACN 3 % (v/v) TFA in MS-Wasser Waschlösung 2: 80 % (v/v) ACN 0,1 % (v/v) TFA in MS-Wasser Elutionslösung: 40 % (v/v) NH4OH (aq 25 % NH3) 60 % (v/v) ACN pH > 10,5 A*-Lösung: 3 % (v/v) ACN 0,5 % (v/v) TFA in MS-Wasser

3.2.5.3 TiO2-Anreicherung: Peptide mit Argininphosphorylierungen

Die Anreicherung von den am Arginin phosphorylierten Peptiden wurde gemäß der

oben beschriebenen Phosphopeptidanreicherungsprozedur durchgeführt. Folgende

Modifikationen wurden im Hinblick auf die Instabilität der Phosphoamidate eingeführt:

Die SCX-Chromatographie wurde nicht durchgeführt. Anstelle dessen wurden die

Titandioxidanreicherung mehrfach wiederholt und die Eluate vereinigt. Dabei wurde

jeweils der Beladungsüberstand erneut mit Titandioxid inkubiert.

Es wurde darauf geachtet, dass die Schritte im Protokoll, die eine saure Hydrolyse der

Phosphoamidate begünstigen, möglichst kurz und bei Raumtemperatur durchgeführt

wurden. Ebenso wurde nach der Elution und Volumenreduzierung die

massenspektrometrische Analyse sofort angeschlossen, wobei auf eine Vorsäule und

die Temperierung der Trennsäule verzichtet wurde (siehe auch Abschnitt 2.4).

Page 187: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 187

3.2.6 Massenspektrometrische Analyse der Phosphoproteine

Die phosphorylierten Peptide aus den gelfreien Anreicherungsansätzen wurden sofort

der massenspektrometrischen Analyse zugeführt werden. Bei den phosphorylierten

Proteinen aus dem 1D- oder 2D-Gel bedurfte es nachfolgender Prozedur:

Die gewünschten Proteinspots/-banden wurden aus dem 2D-Gel/1D-Gel manuell

mithilfe einer abgeschnittenen Pipettenspitze oder einem Skalpell ausgeschnitten und

in ein speziell beschichtetes Reaktionsgefäß ("low binding polymer", Safe Seal

Microcentrifuge Tube; Sorenson BioScience Inc. USA) überführt. In diesen wurden die

Gelstückchen mit 200 µl Gelwaschlösung für 2 x 30 min schüttelnd gewaschen.

Gelwaschlösung: 0,2 M NH4HCO3 30 % (v/v) Acetonitril in A. bidest Der Überstand wurde abgenommen und die Gelstückchen in der Vakuumzentrifuge

(Concentrator 5301, Eppendorf) getrocknet. Es folgte die Inkubation der Gelstückchen

in Trypsinlösung (2 ng/µl) (alternativ GluC-Lösung, 2 ng/µl) bis deren Quellvorgang

abgeschlossen war. Der Überstand wurde abgenommen und die Gelstückchen bei 37°C

über Nacht inkubiert. Die Peptide wurden in einem entsprechenden Volumen A. dest

mittels Ultraschall (15 min) aus dem Gelstückchen extrahiert und der

massenspektrometrischen Analyse zugeführt.

3.2.6.1 nanoHPLC-ESI-LTQ-FT-ICR-MS

Die LC-MS/MS Analyse wurde mit einem LTQ-FT-ICR Massenspektometers (Thermo

Scientific) in Verbindung mit einem Ettan MDLC System (GE Healthcare) durchgeführt.

Die Peptide wurde auf eine C18-Vorsäule (nano-Precolumn™, PepMap™, C18, 300 μm

Innendurchmesser × 5 mm, Dionex LC Packings) geladen und für 15 min mit Eluent A

(0,05 % (v/v) Essigsäure) gewaschen. Die Separierung und Elution erfolgte auf bzw. von

einer analytischen Säule (PepMap, C18, 75-μm Innendurchmesser × 15 cm, Dionex LC

Packings) mithilfe eines binären Gradienten aus Eluent A und B (90 % (v/v) Acetonitril,

Page 188: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

188

0,05 % (v/v) Essigsäure) bei einem Fluss von 250 nl/min über eine Zeitspanne von 60

min (2D-Gelspot) oder 80 min (Kinaseanreicherung).

Das LTQ-FT-ICR Massenspektrometer arbeitete im Daten-abhängigen Modus, indem

der FT-Übersichtsscan über einen Massenbereich von m/z 300-2000 aufgenommen

wurde und die drei abundantesten Vorläuferionen einer Fragmentierung im LTQ-

Instrument unterzogen wurden. In der Zwischenzeit wurde die Masse der

Vorläuferionen in der ICR-Zelle mit hoher Massengenauigkeit bestimmt (Wolff u. a.,

2006).

Für die Auswertung der massenspektrometrischen Daten wurde mithilfe des Sequest

Algorithmus (Version 27.12, Thermo Scientific) eine Datenbanksuche gegen eine aus

SubtiList (genolist.pasteur.fr/SubtiList/) extrahierte B. subtilis 168-Datenbank

durchgeführt. Als Suchparameter wurde eine Massenabweichung für Vorläufer- und

Fragmentionen bis einschließlich 0,01 Da toleriert. Eine ausgelassene

Enzymschnittstelle wurde erlaubt. Als variable Modifikationen wurden

Methioninoxidation (15,99 Da), Carbamidomethylierung des Cysteins (57,02 Da) und

STY-Phosphorylierungen (79,97 Da) berücksichtigt. Die Suchergebnisse wurden mithilfe

der BioWorks 3.2 Software (Thermo Scientific) gefiltert. Folgende Filterparameter

wurden genutzt (angelehnt an (Wolff u. a., 2006)):

• "peptide sequence length: 7-30 amino acids"

• "RSp ≤ 4"

• "Xcorr versus charge state: 1,9 for z=1; 2,2 for z=2; 3,75 for z=3"

Das Spektrum des phosphorylierten Peptids von RsbRB (YkoB) wurde manuell validiert

(b- und y-Ionen mußten die Phosphorylierungsstelle bestätigen) und ist im Anhang

aufgeführt.

3.2.6.2 nanoHPLC-ESI-Qtrap-MS

Die Identifikation der Phosphorylierungsstelle des Anti-Anti-Sigmafaktors RsbV erfolgte

an der Q-Trap4000 (Applied Biosystems MDS Sciex) einem "Linear Ion Trap Quadrupole

MS/MS Massenspektrometer" in Verbindung mit einem Dionex HPLC-Systems (Dionex

LC Packings). Jan Pané-Farré (Inst. f. Mikrobiologie, Universität Greifswald) lieferte das

Page 189: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 189

überexprimierte und phosphorylierte RsbV Protein im 1D-Gel aufgetrennt. Aus diesem

wurde die entsprechende Bande ausgeschnitten und wie unter Abschnitt 3.2.6

beschrieben trypsiniert. Das Eluat wurde der massenspektrometrischen Analyse

zugeführt.

Die RsbV-Peptide wurden auf einer Vorsäule (nano Precolumn, PepMap, C18, 300 μm

Innendurchmesser, 5 mm Länge; Dionex LC Packings) geladen und mit Eluent A

gewaschen. Die Separierung erfolgte über eine analytische Trennsäule (PepMap, C18,

75 μm Innendurchmesser, 15 cm Länge; Dionex LC Packings) bei einem Fluss von

200 nl/min mit einem binären Gradienten über 80 min aus Eluent A und B.

Eluent A: 0,1 % (v/v) Essigsäure 99,9 % (v/v) A. bidest Eluent B: 90 % (v/v) Acetonitril 0,1 % (v/v) Essigsäure 9,9 % (v/v) A. bidest Über ein T-Stück im MicroonSprayHead II der NanoSpray II Quelle der Q-Trap4000

wurde ein Zusatzlösungsmittel zugeführt, um die Ionisierung und die Sprayqualität zu

verbessern.

Zusatzlösungsmittel: 80 % (v/v) Isopropanol 10 % (v/v) Acetonitril 0,1 % (v/v) Essigsäure 9,1 % (v/v) A. bidest Der zusätzliche Lösungsmittelfluss von 100 nl/min wurde mit einer 11Plus Harvard

Apparatus Spritzenpumpe hergestellt.

Es wurde eine datenabhängige Messmethode durchgeführt, bei der ein

Vorläuferionenscan für m/z 79 (PO3−) im negativem Ionenmodus bei Detektion des

Vorläuferions einen Scan mit erhöhter Auflösung (enhanced resolution scan) sowie im

Positivionenmodus durchgeführte MS/MS auslöste.

Page 190: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

190

wichtige Parameter/"IDA Properties": First Criteria: Intense peaks from 1 to 2 Ions greater than: 300.000 m/z Ions smaller than: 1500.000 m/z Charge state from 1 to 4 Unknowns included. Rolling collision energy: Yes Exclude former target ions: for 90.000 seconds Mass Tolerance: 1000.000 mDa Exclude isotopes within 4.0 Da window Use Enhanced Resolution scan to confirm Charge State and\or Isotope Pattern selection: Yes Exclude 1+ precursors from Enhanced Resolution Scan confirmation and MS/MS: No Dynamic Background Subtraction: No

Scan Type: Precursor Ion (Prec) Polarity: Negative Scan Mode: Peak Hopping Precursor Of: 79.00 Da Resolution Q1: Low Resolution Q3: Unit Intensity Thres.: 0.00 cps Step Size: 1.00 Da Start (Da) Stop (Da) Time (sec) Param Start Stop 400.00 1500.00 3.00 CE -60.00 -120.00

Scan Type: Enhanced Resolution (ER) Scan Mode: Profile # Scans to Sum: 2 Resolution Q1: Open Scan Rate: 250 Da/s Intensity Thres.: 0.00 cps Center/Width: Yes LIT fill time: 20.00 msec Dynamic Fill Time: On

Page 191: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 191

TIC Target EMS Scan: 2.00 x1e7 cps. TIC Target ER Scan: 0.30 x1e7 cps. TIC Target EPI Scan: 10.00 x1e7 cps. Max Fill EMS Scan: 75 msec Max Fill ER Scan: 150 msec Max Fill EPI Scan: 300 msec Min Fill EMS Scan: 2 msec Min Fill ER Scan: 2 msec Min Fill EPI Scan: 2 msec

Scan Type: Enhanced Product Ion (EPI) Polarity: Positive Scan Mode: Profile Ion Source: Nanospray # Scans to Sum: 2 Resolution Q1: Low Scan Rate: 4000 Da/s Intensity Thres.: 0.00 cps

Die Daten wurden manuell mithilfe der Analyst® 1.4.1 und BioAnalyst™ Software (AB

Sciex) für die Q-Trap 4000 ausgewertet.

3.2.6.3 nanoHPLC-ESI-LTQ-OrbitrapXL-MS

Die LC-MS/MS-Analyse putativ phosphorylierter 2D-Gelspots sowie der gelfreien

Phosphopeptidanreicherungsfraktionen von S. aureus wurden mit dem LTQ Orbitrap

XL™ Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) in Verbindung

mit einem nanoACQUITY UPLC System (Waters, Milford, MA) durchgeführt. Die

Konzentrierung und Entsalzung der Peptide (nur für die gelbasierten Peptide

angewendet, nicht aber für die Peptide aus dem gelfreien Ansatz) wurde über eine

Vorsäule (Symmetry® C18, 5 µm, 180µm Innendurchmesser x 20mm, Waters, Milford,

MA) vorgenommen und die Elution erfolgte über eine analytische C18-Trennsäule

(BEH130 C18, 1,7 µm, 100 µm Innendurchmesser x 100mm, Waters) mit einem binären

45 min-Gradienten (80 oder 90 min-Gradient für die gelfreien Proben) aus Eluent A

und B mit einer Flussrate von 400 nl/min.

Page 192: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

192

Eluent A: 99,9 % A . bidest 0,1 % (v/v) Essigsäure Eluent B: 99,9 % (v/v) Acetonitril 0,1 % (v/v) Essigsäure

Die massenspektrometrische Analyse erfolgte mit einer datenabhängigen MS/MS-

Methode. Der Übersichtsscan wurde im Orbitrap Analysator bei einer Auflösung von

R=60000 aufgezeichnet. Für die fünf intensivsten Vorläuferionen wurde eine

kollissionsinduzierte Fragmentierung (CID) in der LTQ vorgenommen und mit dem LTQ-

Analysator aufgezeichnet. Zur "realtime"-Kalibrierung wurde die "lockmass"-Option für

die Masse 445.120025 ausgewählt (Graumann u. a., 2008). Nur Ionen mit einem

Ladungszustand von 2 und höher wurden berücksichtigt.

Es wurde die Möglichkeit der "Multistage"-Aktivierung für den putativen

Neutralverlust von -97,98, -48,99, -36,66 und -24,49 Thompson aktiviert. In der

Analyse der Peptide aus einem 2D-Gelspot wurde bei Bedarf in die Methode eine

"parent mass list" implementiert, die alle Massen der theoretisch vorkommenden

Phosphopeptide des betreffenden Proteins enthielt.

wichtige Parameter:

ITMS: Activation Type: CID Min. Signal Required: 1000 Isolation width: 2 Normalized Coll. Energy: 35 Activation Q: 0,250 Activation time: 30 ms

Datenanalyse:

Gelbasiert:

Die massenspektrometrischen Daten wurden anhand einer Datenbanksuche

ausgewertet. Dabei wurden alle MS/MS-Spektren im .dta Format in einer Target-Decoy

Page 193: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 193

Datenbank von S. aureus COL (5236 Einträge) mithilfe des Sorcerer™-SEQUEST®

(ThermoFinnigan, San Jose, CA; version v.27, rev. 11) in Verbindung mit Scaffold2

(Version Scaffold_2_02_03, Proteome Software Inc., Portland, OR) gesucht. Die

Datenbank wurde aus der öffentlichen "NCBI bacteria genomes" (National Center for

Biotechnology Information) extrahiert und mit allgemeinen Kontaminationen

versehen. Die mit dem BioworksBrowser 3.2 EF2 (Elias & Gygi, 2007) erstellten

"reversen" Sequenzen der Datenbankeinträge wurden der Datenbank hinzugefügt.

Folgende Parameter wurden in die Suche miteinbezogen: Die Massentoleranz

bezüglich der Vorläuferionen betrug 10 ppm und die der Fragmentionen 1 Da. Zwei

übersprungene Enzymschnittstellen wurden erlaubt. Methioninoxidation (+15.99 Da)

und Cystein-Carbamidomethylierung (+57.02 Da) sowie Phosphorylierungen (+79.97

Da) am Serin, Threonin oder Tyrosin wurde als variable Modifikationen eingesetzt. Für

die Proteinidentifikation wurden mindestens zwei Peptide vorausgesetzt sowie ein

"Probability Score" von mindestens 99,9 %, der durch den "Protein Prophet

Algorithmus" zugewiesen wurde (Nesvizhskii u. a., 2003). Für die phosphorylierten

Peptide wurde ein "Peptide Probability Score" gemäß dem "Peptide Prophet

Algorithmus" von größer als 95 % vorausgesetzt (Keller u. a., 2002). Des Weiteren

wurden folgende Kriterien eingehalten:

• Mindestanzahl von Aminosäuren im Peptid = 6

• b- und y-Ionen bestätigen die Phosphorylierungsstelle

Die Spektren der phosphorylierten Peptide wurden manuell validiert und sind im

Anhang aufgeführt.

Gelfrei:

Die massenspektrometrischen Daten aus den gelfreien Experimenten wurden mit der

MaxQuant Software (Version 1.1.1.14, Max Plank Institute of Biochemistry,

Martinsried) prozessiert. Die Peaklisten wurden mit der in MaxQuant implementierten

Suchmaschine Andromeda gegen eine aus der NCBI-Datenbank (National Center for

Biotechnology Information) extrahierten S. aureus COL-Datenbank (2618 Einträge)

gesucht. Die Möglichkeit der Randomisierung sowie das Hinzufügen von

Kontaminanten wurden ausgewählt.

Page 194: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

194

Folgende Parameter wurden angesetzt:

• zwei ausgelassene Enzymschnittstellen wurden erlaubt

• Carbamidomethylierung am Cystein wurde als fixierte Modifikation ausgewählt

• Oxidierung von Methionin und Phosphorylierungen an Serin, Threonin und Tyrosin wurden als variable Modifikationen angegeben

• die Massenabweichung der Vorläuferionen durfte höchstens 6 ppm betragen, für die Fragmentionen 0,5 Da

Für die Phosphopeptidvalidierung wurde ebenfalls die MaxQuant-Software benutzt.

Die Peptide mussten mindestens aus 6 Aminosäuren bestehen. Die Falschpositivenrate

wurde auf Protein- und Peptidlevel auf 1 % beschränkt. Nur diejenigen

Phosphopeptide, die einen "site probability score"/"localization score" (Olsen u. a.,

2006) von größer als 0,75 aufwiesen, wurden für die Bestimmung der spezifischen

Phosphorylierungsstelle akzeptiert. Die Spektren der phosphorylierten Peptide, die

den Kriterien entsprachen, wurden manuell validiert und sind im Anhang aufgeführt.

3.2.6.4 nanoHPLC-ESI-LTQ-Orbitrap-Velos-MS

Die massenspekrometrischen Analysen zum Argininphosphoproteom von B. subtilis

wurden mit der LTQ Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) in

Verbindung mit einem nano-HPLC EASY-nLC II System (Thermo Fisher Scientific Inc.,

Waltham, MA) durchgeführt. Die Trennung der Peptide erfolgte über eine selbst

hergestellte analytische Säule (C18-Material (Luna 3u C18(2)100A, Phenomenex®), 100

µm i.D. x 200 mm Säule), die ebenfalls als Emmittertip genutzt wurde. Die Elution der

Peptide wurde durch einen binären Gradienten aus Eluent A und B über einen

Zeitraum von 80 min und einem Fluss von 300 nl/min hervorgerufen.

Eluent A: 99,9 % A. bidest 0,1 % (v/v) Essigsäure

Page 195: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 195

Eluent B: 99,9 % (v/v) Acetonitril 0,1 % (v/v) Essigsäure

Für die massenspektrometrische Analyse wurden zwei unterschiedliche Methoden

angewendet, die sich aufgrund der gewählten Fragmentierungstechnik unterschieden.

Zum einen wurde die Methode der kollisionsinduzierten Fragmentierung (CID) und

zum anderen die Methode der hochenergetischen Kollisionsdissoziierung (HCD)

gewählt.

CID-Fragmentierungsmethode:

Es kam eine Daten-abhängige MS/MS-Methode zum Einsatz, bei der der

Übersichtsscan mit dem Orbitrap-Analysator mit einer Auflösung von R=60000

aufgenommen wurde. Für die Echtzeitkalibrierung wurde die "Lockmass"-Option für

das Ion m/z 445,120025 gewählt. Ebenfalls wurde die "Wideband-activation"

ermöglicht. Für die zwanzig intensivsten Vorläuferionen wurde ein

Fragmentierungsevent (CID) ausgelöst und die Fragmente mit dem LTQ-Analysator

detektiert. Für den erwarteten Verlust von -97,98 Th (H3PO4-Verlust am p-Serin oder p-

Threonin) und -79,97 Th (für HPO3 -Verlust am p-Tyrosin) wurde die "Multistage-

Activation"-Option für alle MS/MS-Ereignisse aktiviert. Die Option "the use of m/z

values as masses" wurde genutzt.

wichtige Parameter der "Instrument"-Methode:

normalized collision energy: 35 isolation width: 2 activation Q: 0,25 activation time: 10 dynamic exclusion: repeat count: 1

exclusion list size: 500 exclusion duration: 20

wichtige Parameter in der "Tune"-Methode:

FTMS Full Max Ion Time: 500 ms ITMS MSn Max Ion Time: 200 ms

Page 196: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

196

FTMS Full AGC Target: 1E6 ITMSn AGC Target: 5E3

HCD- Fragmentierungsmethode

Es kam eine datenabhängige MS/MS-Methode zum Einsatz, bei der der Übersichtsscan

mit dem Orbitrap-Analysator mit einer Auflösung von R=30000 aufgenommen wurde.

Für die Echtzeitkalibrierung wurde die "Lockmass"-Option für das Ion m/z 445,120025

gewählt. Ebenfalls wurde die "Wideband-activation" ermöglicht. Für die zehn

intensivsten Vorläuferionen wurde ein Fragmentierungsevent (HCD) in der C-Trap

ausgelöst und die Fragmente mit dem Orbitrap Analysator mit einer Auflösung von

7500 detektiert.

wichtige Parameter der "Instrument"-Methode:

normalized collision energy: 40 isolation width: 2 activation time: 0,1 dynamic exclusion: repeat count: 2

repeat duration: 30 exclusion list size: 500 exclusion duration: 60

wichtige Parameter in der "Tune"-Methode:

FTMS Full Max Ion Time: 250 ms FTMS MSn Max Ion Time: 150 ms FTMS Full AGC Target: 1E6 FTMSn AGC Target: 4E4

Die gewählten Einstellungen für die HCD-Methode wurden an die Publikation von

Nagaraj und Mitarbeitern angelehnt (Nagaraj u. a., 2010).

MS-Datenanalyse

Die massenspektrometrischen Daten der Untersuchungen des

Argininphosphoproteoms wurden mit der MaxQuant-Software (Version 1.1.1.36, Max

Plank Institute of Biochemistry, Martinsried) prozessiert. Die Peaklisten wurden mit

Page 197: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 197

der in MaxQuant implementierten Suchmaschine Andromeda gegen eine aus der

UniprotKB release 12.7 (Uniprot Consortium) extrahierten B. subtilis 168-Datenbank

(4105 Einträge) gesucht. Die Möglichkeit der Randomisierung sowie das Hinzufügen

von Kontaminanten wurden ausgewählt.

Folgende Parameter wurden angesetzt:

• Trypsin-Spezifität

• zwei ausgelassene Enzymschnittstellen wurden erlaubt

• Carbamidomethylierung am Cystein wurde als fixierte Modifikation ausgewählt

• Oxidierung von Methionin und Phosphorylierungen an Arginin, Serin, Threonin und Tyrosin wurden als variable Modifikationen angegeben

• die Massenabweichung der Vorläuferionen durfte höchstens 6 ppm betragen, für die Fragmentionen der CID-Fragmentierung 0,5 Da (CID)oder 20 ppm für die HCD-Fragmente

Die Phosphopeptidvalidierung wurde ebenfalls mit der MaxQuant-Software

durchgeführt. Die Falschpositivenrate wurde auf Protein- und Peptidlevel auf 1 %

beschränkt. Nur diejenigen Phosphopeptide, die einen "site probability/localization

score" (Olsen u. a., 2006) von größer als 0,75 aufwiesen, wurden für die Bestimmung

der spezifischen Phosphorylierungsstelle akzeptiert. Die Peptide mussten mindestens

aus 6 Aminosäuren bestehenund die Phosphorylierungsstelle musste durch b- oder y-

Ionen bestätigt sein. Die Spektren der phosphorylierten Peptide, die den Kriterien

entsprachen, wurden manuell validiert und sind im Anhang aufgeführt.

3.2.7 Quantifizierung der MS-Daten (metabolischer Markierungsansatz) mittels Census

Die putativ phosphorylierten 2D-Gelspots (aus Zoomgelen des pH-Bereiches 4,5-5,5)

aus dem EtOH-Stress-Experiment mit metabolischer Markierung wurden, wie oben

beschrieben, trypsiniert und die extrahierten Peptide der massenspektrometrischen

Analyse zugeführt.

Die MS/MS-Spektren wurden mithilfe von Sequest v.27 (implementiert im Sorcerer-

SequestTM v4.0.3 (rev. 11) (SageN research, USA)) durch eine B. subtilis-

Page 198: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

198

Datenbanksuche (extrahiert aus UniProt (UniProtKB release 12.7;

UniProtConsortium)(„The Universal Protein Resource (UniProt)“, 2007) analysiert.

Folgende Parameter wurden eingesetzt:

• Trypsin-Spezifität

• zwei ausgelassene Enzymschnittstellen waren möglich

• die Massenabweichung der Vorläuferionen durfte höchstens 10 ppm und für die Fragmentionen 1 Da betragen

• variable Modifikationen: Oxidation am Methionin (+15.99 Da), Carbamidomethylierung am Cystein(+57.02 Da) und Phosphorylierungen am Serin, Threonin und Tyrosin (+79.97 Da)

Die Datenbanksuche wurde mit 15N als statische Modifikation wiederholt. Die

entstandenen *.dta and *.out files wurden mit dtaselect 2.0.25 zusammengefasst und

gefiltert (Tabb u. a., 2002). Folgende Filterkriterien wurden angewendet:

• erlaubte Ladungszustände: 2-4

• nur komplett tryptische Peptide

• minimal mussten mindestens zwei Peptide pro Lokus vorliegen

• zwei ausgelassene Enzymschnittstellen waren möglich

• Xcorr-Filter: z2 = 2,2; z3 = 3,3; z4 = 3,75

Die Konvertierung der *.raw Dateien in *.ms1 Datein erfolgte mit dem RawExtractor

des CenSus-Pakets (Park u. a., 2008). Die Quantifizierung wurde dann mit CenSus 1.31

unter der Benutzung der nachfolgend beschriebenen config-Datei durchgeführt.

config-Datei:

• "mass accuracy": 10 ppm

• "enrichment factor": 0.98

• "masses for 14N and 15N amino acids"

Der Export der Ergebnisse aus CenSus erfolgte unter folgenden Kriterien:

• "determination factor": 0.7

Page 199: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

3 Material und Methoden 199

• "unique peptides"

• "area lower threshold": 0.001

• "area upper threshold": 1000

• "composite score threshold": 0.95

• "minimum peptide per protein": 2

Für die Normalisierung der Daten wurde derselbe N14/N15-Extrakt auf ein 1D-Gel oder

2D-Gel aufgetragen und aufgetrennt. Die Spuren/Spots wurden ausgeschnitten und

wie oben beschrieben tryptisch verdaut, extrahiert, massenspektrometrisch analysiert

und quantifiziert.

Das 14N/15N-Verhältnis wurde mit einer Medianbildung auf 0 über alle Peptidratios

normalisiert. Die 14N/15N-Verhältnisse der Quantifizierung der 2D-Gelspots wurden mit

diesem Medianfaktor normalisiert. Die biologischen Replikate wurden gemittelt und

die Standardabweichung berechnet. Die korrigierten Ratios der Kontrolle und des

Stresszeitpunktes wurde zueinander ins Verhältnis gesetzt und in den Log2-

Zahlenraum überführt.

Page 200: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

200

4 Literaturverzeichnis

Absalon, C., Obuchowski, M., Madec, E., Delattre, D., Holland, I. B. & Séror, S. J.

(2009). CpgA, EF-Tu and the stressosome protein YezB are substrates of the Ser/Thr

kinase/phosphatase couple, PrkC/PrpC, in Bacillus subtilis. Microbiology 155, 932–943.

Aebersold, R. H., Leavitt, J., Saavedra, R. A., Hood, L. E. & Kent, S. B. (1987). Internal

amino acid sequence analysis of proteins separated by one- or two-dimensional gel

electrophoresis after in situ protease digestion on nitrocellulose. Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 84, 6970–6974.

Agrawal, G. K. & Thelen, J. J. (2005). Development of a simplified, economical

polyacrylamide gel staining protocol for phosphoproteins. Proteomics 5, 4684–4688.

Aivaliotis, M., Macek, B., Gnad, F., Reichelt, P., Mann, M. & Oesterhelt, D. (2009).

Ser/Thr/Tyr protein phosphorylation in the archaeon Halobacterium salinarum--a

representative of the third domain of life. PLoS ONE 4, e4777.

Akbar, S., Gaidenko, T. A., Kang, C. M., O’Reilly, M., Devine, K. M. & Price, C. W.

(2001). New family of regulators in the environmental signaling pathway which

activates the general stress transcription factor sigma(B) of Bacillus subtilis. J.

Bacteriol. 183, 1329–1338.

Alper, S., Duncan, L. & Losick, R. (1994). An adenosine nucleotide switch controlling

the activity of a cell type-specific transcription factor in B. subtilis. Cell 77, 195–205.

Alpert, A. J. (2008). Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for

isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides.

Anal. Chem. 80, 62–76.

Anagnostopoulos, C. & Spizizen, J. (1961). Requirements for transformation in Bacillus

subtilis. J. Bacteriol. 81, 741–746.

Andersen, C. A., Gotta, S., Magnoni, L., Raggiaschi, R., Kremer, A. & Terstappen, G. C.

(2009). Robust MS quantification method for phospho-peptides using 18O/16O labeling.

BMC Bioinformatics 10, 141.

Andersson, L. & Porath, J. (1986). Isolation of phosphoproteins by immobilized metal

(Fe3+) affinity chromatography. Anal. Biochem. 154, 250–254.

Page 201: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 201

Arigoni, F., Duncan, L., Alper, S., Losick, R. & Stragier, P. (1996). SpoIIE governs the

phosphorylation state of a protein regulating transcription factor sigma F during

sporulation in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 3238–3242.

Armougom, F., Moretti, S., Poirot, O., Audic, S., Dumas, P., Schaeli, B., Keduas, V. &

Notredame, C. (2006). Expresso: automatic incorporation of structural information in

multiple sequence alignments using 3D-Coffee. Nucleic Acids Res. 34, W604–608.

Atkinson, T. P., Balish, M. F. & Waites, K. B. (2008). Epidemiology, clinical

manifestations, pathogenesis and laboratory detection of Mycoplasma pneumoniae

infections. FEMS Microbiol. Rev. 32, 956–973.

Barbe, V., Cruveiller, S., Kunst, F., Lenoble, P., Meurice, G., Sekowska, A., Vallenet,

D., Wang, T., Moszer, I., u. a. (2009). From a consortium sequence to a unified

sequence: the Bacillus subtilis 168 reference genome a decade later. Microbiology 155,

1758–1775.

Barton, G. J., Cohen, P. T. & Barford, D. (1994). Conservation analysis and structure

prediction of the protein serine/threonine phosphatases. Sequence similarity with

diadenosine tetraphosphatase from Escherichia coli suggests homology to the protein

phosphatases. Eur. J. Biochem. 220, 225–237.

Beausoleil, S. A., Jedrychowski, M., Schwartz, D., Elias, J. E., Villén, J., Li, J., Cohn, M.

A., Cantley, L. C. & Gygi, S. P. (2004). Large-scale characterization of HeLa cell nuclear

phosphoproteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12130–12135.

Beausoleil, S. A., Villén, J., Gerber, S. A., Rush, J. & Gygi, S. P. (2006). A probability-

based approach for high-throughput protein phosphorylation analysis and site

localization. Nat. Biotechnol. 24, 1285–1292.

Becher, D., Büttner, K., Moche, M., Hessling, B. & Hecker, M. (2011). From the

genome sequence to the protein inventory of Bacillus subtilis. Proteomics 11, 2971–

2980.

Becher, D., Hempel, K., Sievers, S., Zühlke, D., Pané-Farré, J., Otto, A., Fuchs, S.,

Albrecht, D., Bernhardt, J., u. a. (2009). A proteomic view of an important human

pathogen--towards the quantification of the entire Staphylococcus aureus proteome.

PLoS ONE 4, e8176.

Page 202: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

202

Bell, P. J. L. & Karuso, P. (2003). Epicocconone, a novel fluorescent compound from

the fungus epicoccumnigrum. J. Am. Chem. Soc. 125, 9304–9305.

Beltramini, A. M., Mukhopadhyay, C. D. & Pancholi, V. (2009). Modulation of cell wall

structure and antimicrobial susceptibility by a Staphylococcus aureus eukaryote-like

serine/threonine kinase and phosphatase. Infect. Immun. 77, 1406–1416.

Bendt, A. K., Burkovski, A., Schaffer, S., Bott, M., Farwick, M. & Hermann, T. (2003).

Towards a phosphoproteome map of Corynebacterium glutamicum. Proteomics 3,

1637–1646.

Bernardini, G., Laschi, M., Serchi, T., Arena, S., D’Ambrosio, C., Braconi, D., Scaloni, A.

& Santucci, A. (2011). Mapping phosphoproteins in Neisseria meningitidis serogroup

A. Proteomics 11, 1351–1358.

Bernhardt, J., Weibezahn, J., Scharf, C. & Hecker, M. (2003). Bacillus subtilis during

feast and famine: visualization of the overall regulation of protein synthesis during

glucose starvation by proteome analysis. Genome Res. 13, 224–237.

Bjellqvist, B., Ek, K., Righetti, P. G., Gianazza, E., Görg, A., Westermeier, R. & Postel,

W. (1982). Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: principle, methodology

and some applications. J. Biochem. Biophys. Methods 6, 317–339.

Black, D. S. & Bliska, J. B. (1997). Identification of p130Cas as a substrate of Yersinia

YopH (Yop51), a bacterial protein tyrosine phosphatase that translocates into

mammalian cells and targets focal adhesions. EMBO J. 16, 2730–2744.

Blagoev, B., Ong, S.-E., Kratchmarova, I. & Mann, M. (2004). Temporal analysis of

phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. Nat.

Biotechnol. 22, 1139–1145.

Le Blanc, J. C. Y., Hager, J. W., Ilisiu, A. M. P., Hunter, C., Zhong, F. & Chu, I. (2003).

Unique scanning capabilities of a new hybrid linear ion trap mass spectrometer

(Q TRAP) used for high sensitivity proteomics applications. Proteomics 3, 859–869.

Blau, K., Portnoi, M., Shagan, M., Kaganovich, A., Rom, S., Kafka, D., Chalifa Caspi, V.,

Porgador, A., Givon-Lavi, N., u. a. (2007). Flamingo cadherin: a putative host receptor

for Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 195, 1828–1837.

Page 203: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 203

Blom, N. S., Tétreault, S., Coulombe, R. & Sygusch, J. (1996). Novel active site in

Escherichia coli fructose 1,6-bisphosphate aldolase. Nat. Struct. Biol. 3, 856–862.

Blum, H., Beier, H. & Gross, H. J. (1987). Improved silver staining of plant proteins,

RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis 8, 93–99.

Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Pedrioli, P. G. A., Pflieger, D., Jünger, M. A., Eng, J. K.,

Aebersold, R. & Tao, W. A. (2007). An integrated chemical, mass spectrometric and

computational strategy for (quantitative) phosphoproteomics: application to

Drosophila melanogaster Kc167 cells. Mol. Biosyst. 3, 275–286.

Boël, G., Pichereau, V., Mijakovic, I., Mazé, A., Poncet, S., Gillet, S., Giard, J.-C.,

Hartke, A., Auffray, Y. & Deutscher, J. (2004). Is 2-phosphoglycerate-dependent

automodification of bacterial enolases implicated in their export? J. Mol. Biol. 337,

485–496.

Boersema, P. J., Mohammed, S. & Heck, A. J. R. (2009a). Phosphopeptide

fragmentation and analysis by mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 44, 861–878.

Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S. & Heck, A. J. R. (2009b).

Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat.

Protoc. 4, 484–494.

Borisov, V. B., Forte, E., Konstantinov, A. A., Poole, R. K., Sarti, P. & Giuffrè, A. (2004).

Interaction of the bacterial terminal oxidase cytochrome bd with nitric oxide. FEBS

Lett. 576, 201–204.

Bork, P., Brown, N. P., Hegyi, H. & Schultz, J. (1996). The protein phosphatase 2C

(PP2C) superfamily: detection of bacterial homologues. Protein Sci. 5, 1421–1425.

Bourret, T. J., Boylan, J. A., Lawrence, K. A. & Gherardini, F. C. (2011). Nitrosative

damage to free and zinc-bound cysteine thiols underlies nitric oxide toxicity in wild-

type Borrelia burgdorferi. Mol. Microbiol. 81, 259–273.

Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.

Biochem. 72, 248–254.

Brehmer, D., Greff, Z., Godl, K., Blencke, S., Kurtenbach, A., Weber, M., Müller, S.,

Klebl, B., Cotten, M., u. a. (2005). Cellular targets of gefitinib. Cancer Res. 65, 379–382.

Page 204: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

204

Bunai, K. & Yamane, K. (2005). Effectiveness and limitation of two-dimensional gel

electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J.

Chromatogr. B 815, 227–236.

Burnell, J. N. (2010). Cloning and characterization of Escherichia coli DUF299: a

bifunctional ADP-dependent kinase--Pi-dependent pyrophosphorylase from bacteria.

BMC Biochem. 11, 1.

Burnett, G. & Kennedy, E. (1954). The enzymatic phosphorylation of proteins. J. Biol.

Chem. 211, 969–980.

Burnside, K., Lembo, A., de Los Reyes, M., Iliuk, A., Binhtran, N.-T., Connelly, J. E., Lin,

W.-J., Schmidt, B. Z., Richardson, A. R., u. a. (2010). Regulation of hemolysin

expression and virulence of Staphylococcus aureus by a serine/threonine kinase and

phosphatase. PLoS ONE 5, e11071.

Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B.,

Orecchia, P., Zardi, L. & Righetti, P. G. (2004). Blue silver: a very sensitive colloidal

Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis 25, 1327–1333.

Carneiro, C. R. W., Postol, E., Nomizo, R., Reis, L. F. L. & Brentani, R. R. (2004).

Identification of enolase as a laminin-binding protein on the surface of Staphylococcus

aureus. Microbes Infect. 6, 604–608.

Carniol, K., Kim, T.-J., Price, C. W. & Losick, R. (2004). Insulation of the σF regulatory

system in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 186, 4390–4394.

Casino, P., Rubio, V. & Marina, A. (2010). The mechanism of signal transduction by

two-component systems. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 763–771.

Casteleijn, M. G., Alahuhta, M., Groebel, K., El-Sayed, I., Augustyns, K., Lambeir, A.-

M., Neubauer, P. & Wierenga, R. K. (2006). Functional role of the conserved active site

proline of triosephosphate isomerase. Biochemistry 45, 15483–15494.

Catrein, I. & Herrmann, R. (2011). The proteome of Mycoplasma pneumoniae, a

supposedly „simple“ cell. Proteomics 11, 3614–3632.

Cerqueira, N. M. F. S. A., Fernandes, P. A. & Ramos, M. J. (2011). Computational

mechanistic studies addressed to the transimination reaction present in all pyridoxal

5′-phosphate-requiring enzymes. J. Chem. Theory Comput. 7, 1356–1368.

Page 205: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 205

Chanock, R. M., Hayflick, L. & Barile, M. F. (1962). Growth on artificial medium of an

agent associated with atypical pneumonia and its identification as a PPLO. Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. 48, 41–49.

Chao, J., Wong, D., Zheng, X., Poirier, V., Bach, H., Hmama, Z. & Av-Gay, Y. (2010).

Protein kinase and phosphatase signaling in Mycobacterium tuberculosis physiology

and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta 1804, 620–627.

Cohen, P. (2002). Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century?

Nat. Rev. Drug Discov. 1, 309–315.

Cohn, F. (1872). Untersuchungen über Bakterien. Beitr. Biol. Pflanzen 1, 127–224.

Collett, M. S. & Erikson, R. L. (1978). Protein kinase activity associated with the avian

sarcoma virus src gene product. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 2021–2024.

Conrads, T. P., Alving, K., Veenstra, T. D., Belov, M. E., Anderson, G. A., Anderson, D.

J., Lipton, M. S., Pasa-Tolić, L., Udseth, H. R., u. a. (2001). Quantitative analysis of

bacterial and mammalian proteomes using a combination of cysteine affinity tags and 15N-metabolic labeling. Anal. Chem. 73, 2132–2139.

Cooper, R. A. (1984). Metabolism of methylglyoxal in microorganisms. Annu. Rev.

Microbiol. 38, 49–68.

Copley, S. D. (2012). Moonlighting is mainstream: Paradigm adjustment required.

Bioessays 34, 578–588.

Cordwell, S. J., Wilkins, M. R., Cerpa-Poljak, A., Gooley, A. A., Duncan, M., Williams,

K. L. & Humphery-Smith, I. (1995). Cross-species identification of proteins separated

by two-dimensional gel electrophoresis using matrix-assisted laser desorption

ionisation/time-of-flight mass spectrometry and amino acid composition.

Electrophoresis 16, 438–443.

Cortay, J. C., Rieul, C., Duclos, B. & Cozzone, A. J. (1986). Characterization of the

phosphoproteins of Escherichia coli cells by electrophoretic analysis. Eur. J. Biochem.

159, 227–237.

Cox, J. & Mann, M. (2008). MaxQuant enables high peptide identification rates,

individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.

Nat. Biotechnol. 26, 1367–1372.

Page 206: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

206

Cozzone, A. J. & El-Mansi, M. (2005). Control of isocitrate dehydrogenase catalytic

activity by protein phosphorylation in Escherichia coli. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 9,

132–146.

Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J.-M. & Brenner, S. E. (2004). WebLogo: a sequence

logo generator. Genome Res. 14, 1188–1190.

Daher, R., Coinçon, M., Fonvielle, M., Gest, P. M., Guerin, M. E., Jackson, M., Sygusch,

J. & Therisod, M. (2010). Rational design, synthesis, and evaluation of new selective

inhibitors of microbial class II (zinc dependent) fructose bis-phosphate aldolases.

J. Med. Chem. 53, 7836–7842.

Dannelly, H. K., Duclos, B., Cozzone, A. J. & Reeves, H. C. (1989). Phosphorylation of

Escherichia coli enolase. Biochimie 71, 1095–1100.

Das, A. K., Helps, N. R., Cohen, P. T. & Barford, D. (1996). Crystal structure of the

protein serine/threonine phosphatase 2C at 2.0 A resolution. EMBO J. 15, 6798–6809.

Débarbouillé, M., Dramsi, S., Dussurget, O., Nahori, M.-A., Vaganay, E., Jouvion, G.,

Cozzone, A., Msadek, T. & Duclos, B. (2009). Characterization of a serine/threonine

kinase involved in virulence of Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 191, 4070–4081.

Deutscher, J., Francke, C. & Postma, P. W. (2006). How phosphotransferase system-

related protein phosphorylation regulates carbohydrate metabolism in bacteria.

Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70, 939–1031.

Deutscher, J. & Saier, M. H. (1983). ATP-dependent protein kinase-catalyzed

phosphorylation of a seryl residue in HPr, a phosphate carrier protein of the

phosphotransferase system in Streptococcus pyogenes. PNAS 80, 6790 –6794.

Didier, J.-P., Cozzone, A. J. & Duclos, B. (2010). Phosphorylation of the virulence

regulator SarA modulates its ability to bind DNA in Staphylococcus aureus. FEMS

Microbiol. Lett. 306, 30–36.

Dirksen, L. B., Krebes, K. A. & Krause, D. C. (1994). Phosphorylation of cytadherence-

accessory proteins in Mycoplasma pneumoniae. J. Bacteriol. 176, 7499–7505.

Donat, S., Streker, K., Schirmeister, T., Rakette, S., Stehle, T., Liebeke, M., Lalk, M. &

Ohlsen, K. (2009). Transcriptome and functional analysis of the eukaryotic-type

serine/threonine kinase PknB in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 191, 4056–4069.

Page 207: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 207

Downer, R., Roche, F., Park, P. W., Mecham, R. P. & Foster, T. J. (2002). The elastin-

binding protein of Staphylococcus aureus (EbpS) is expressed at the cell surface as an

integral membrane protein and not as a cell wall-associated protein. J. Biol. Chem. 277,

243–250.

Dreisbach, A., Otto, A., Becher, D., Hammer, E., Teumer, A., Gouw, J. W., Hecker, M.

& Völker, U. (2008). Monitoring of changes in the membrane proteome during

stationary phase adaptation of Bacillus subtilis using in vivo labeling techniques.

Proteomics 8, 2062–2076.

Duclos, B., Grangeasse, C., Vaganay, E., Riberty, M. & Cozzone, A. J. (1996).

Autophosphorylation of a bacterial protein at tyrosine. J. Mol. Biol. 259, 891–895.

Dunn, J. D., Reid, G. E. & Bruening, M. L. (2010). Techniques for phosphopeptide

enrichment prior to analysis by mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 29–54.

Eaton, M. D., Meiklejohn, G. & van Herick, W. (1944). Studies on the etiology of

primary atypical pneumonia: a filterable agent transmissible to cotton rats, hamsters,

and chick embryos. J. Exp. Med. 79, 649–668.

Echenique, J., Kadioglu, A., Romao, S., Andrew, P. W. & Trombe, M.-C. (2004). Protein

serine/threonine kinase StkP positively controls virulence and competence in

Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 72, 2434–2437.

Edman, P. (1949). A method for the determination of amino acid sequence in

peptides. Arch. Biochem. 22, 475.

Ehrenberg, C. (1835). Physikalische Abhandlungen der Koeniglichen Akademie der

Wissenschaften zu Berlin aus den Jahren 1833–1835., S. 145–336.

Eisermann, R., Deutscher, J., Gonzy-Treboul, G. & Hengstenberg, W. (1988). Site-

directed mutagenesis with the ptsH gene of Bacillus subtilis. Isolation and

characterization of heat-stable proteins altered at the ATP-dependent regulatory

phosphorylation site. J. Biol. Chem. 263, 17050–17054.

Elias, J. E. & Gygi, S. P. (2007). Target-decoy search strategy for increased confidence

in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat. Methods 4, 207–214.

Page 208: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

208

Elsholz, A. K. W., Hempel, K., Michalik, S., Gronau, K., Becher, D., Hecker, M. & Gerth,

U. (2011). Activity control of the ClpC adaptor McsB in Bacillus subtilis. J. Bacteriol.

193, 3887–3893.

Elsholz, A. K. W., Michalik, S., Zühlke, D., Hecker, M. & Gerth, U. (2010). CtsR, the

Gram-positive master regulator of protein quality control, feels the heat. EMBO J. 29,

3621–3629.

Elsholz, A. K. W., Turgay, K., Michalik, S., Hessling, B., Gronau, K., Oertel, D., Mäder,

U., Bernhardt, J., Becher, D., u. a. (2012). Global impact of protein arginine

phosphorylation on the physiology of Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109,

7451–7456.

Eymann, C., Becher, D., Bernhardt, J., Gronau, K., Klutzny, A. & Hecker, M. (2007).

Dynamics of protein phosphorylation on Ser/Thr/Tyr in Bacillus subtilis. Proteomics 7,

3509–3526.

Eymann, C., Schulz, S., Gronau, K., Becher, D., Hecker, M. & Price, C. W. (2011). In

vivo phosphorylation patterns of key stressosome proteins define a second feedback

loop that limits activation of Bacillus subtilis σB. Mol. Microbiol. 80, 798–810.

Faucher, S. P., Viau, C., Gros, P.-P., Daigle, F. & Le Moual, H. (2008). The prpZ gene

cluster encoding eukaryotic-type Ser/Thr protein kinases and phosphatases is

repressed by oxidative stress and involved in Salmonella enterica serovar Typhi survival

in human macrophages. FEMS Microbiol. Lett. 281, 160–166.

Feng, S., Ye, M., Zhou, H., Jiang, X., Jiang, X., Zou, H. & Gong, B. (2007). Immobilized

zirconium ion affinity chromatography for specific enrichment of phosphopeptides in

phosphoproteome analysis. Mol. Cell. Proteomics 6, 1656–1665.

Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F. & Whitehouse, C. M. (1989).

Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science 246, 64–

71.

Fischer, E. H. & Krebs, E. G. (1955). Conversion of phosphorylase b to phosphorylase a

in muscle extracts. J. Biol. Chem. 216, 121–132.

Fleischmann, R. D., Adams, M. D., White, O., Clayton, R. A., Kirkness, E. F., Kerlavage,

A. R., Bult, C. J., Tomb, J. F., Dougherty, B. A. & Merrick, J. M. (1995). Whole-genome

Page 209: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 209

random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 269, 496–

512.

Fonvielle, M., Weber, P., Dabkowska, K. & Therisod, M. (2004). New highly selective

inhibitors of class II fructose-1,6-bisphosphate aldolases. Bioorg. Med. Chem. Lett. 14,

2923–2926.

Frees, D., Chastanet, A., Qazi, S., Sørensen, K., Hill, P., Msadek, T. & Ingmer, H.

(2004). Clp ATPases are required for stress tolerance, intracellular replication and

biofilm formation in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 54, 1445–1462.

Frees, D., Qazi, S. N. A., Hill, P. J. & Ingmer, H. (2003). Alternative roles of ClpX and

ClpP in Staphylococcus aureus stress tolerance and virulence. Mol. Microbiol. 48,

1565–1578.

Frees, D., Savijoki, K., Varmanen, P. & Ingmer, H. (2007). Clp ATPases and ClpP

proteolytic complexes regulate vital biological processes in low GC, Gram-positive

bacteria. Mol. Microbiol. 63, 1285–1295.

Fuhrmann, J., Schmidt, A., Spiess, S., Lehner, A., Turgay, K., Mechtler, K., Charpentier,

E. & Clausen, T. (2009). McsB is a protein arginine kinase that phosphorylates and

inhibits the heat-shock regulator CtsR. Science 324, 1323–1327.

Fujita, Y. (2009). Carbon catabolite control of the metabolic network in Bacillus

subtilis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 245–259.

Fujita, Y., Miwa, Y., Galinier, A. & Deutscher, J. (1995). Specific recognition of the

Bacillus subtilis gnt cis-acting catabolite-responsive element by a protein complex

formed between CcpA and seryl-phosphorylated HPr. Mol. Microbiol. 17, 953–960.

Furuya, H. & Ikeda, R. (2011). Interaction of triosephosphate isomerase from

Staphylococcus aureus with plasminogen. Microbiol. Immunol. 55, 855–862.

Gafken, P. R. (2009). An overview of the qualitative analysis of phosphoproteins by

mass spectrometry. Methods Mol. Biol. 527, 159–172, ix.

Gaidenko, T. A., Kim, T.-J. & Price, C. W. (2002). The PrpC serine-threonine

phosphatase and PrkC kinase have opposing physiological roles in stationary-phase

Bacillus subtilis cells. J. Bacteriol. 184, 6109–6114.

Page 210: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

210

Galyov, E. E., Håkansson, S., Forsberg, A. & Wolf-Watz, H. (1993). A secreted protein

kinase of Yersinia pseudotuberculosis is an indispensable virulence determinant.

Nature 361, 730–732.

Garen, A. & Levinthal, C. (1960). A fine-structure genetic and chemical study of the

enzyme alkaline phosphatase of E. coli I. Purification and characterization of alkaline

phosphatase. Biochim. Biophys. Acta 38, 470–483.

Garnak, M. & Reeves, H. (1979). Phosphorylation of Isocitrate dehydrogenase of

Escherichia coli. Science 203, 1111 –1112.

Garsin, D. A., Paskowitz, D. M., Duncan, L. & Losick, R. (1998). Evidence for common

sites of contact between the antisigma factor SpoIIAB and its partners SpoIIAA and the

developmental transcription factor σF in Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. 284, 557–568.

Ge, R., Sun, X., Xiao, C., Yin, X., Shan, W., Chen, Z. & He, Q.-Y. (2011).

Phosphoproteome analysis of the pathogenic bacterium Helicobacter pylori reveals

over-representation of tyrosine phosphorylation and multiply phosphorylated

proteins. Proteomics 11, 1449–1461.

Gerth, U., Kock, H., Kusters, I., Michalik, S., Switzer, R. L. & Hecker, M. (2008). Clp-

dependent proteolysis down-regulates central metabolic pathways in glucose-starved

Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 321–331.

Glowalla, E., Tosetti, B., Krönke, M. & Krut, O. (2009). Proteomics-based identification

of anchorless cell wall proteins as vaccine candidates against Staphylococcus aureus.

Infect. Immun. 77, 2719–2729.

Godl, K., Wissing, J., Kurtenbach, A., Habenberger, P., Blencke, S., Gutbrod, H.,

Salassidis, K., Stein-Gerlach, M., Missio, A., u. a. (2003). An efficient proteomics

method to identify the cellular targets of protein kinase inhibitors. Proc. Natl. Acad.

Sci. U.S.A. 100, 15434 –15439.

Gonçalves, S., Miller, S. P., Carrondo, M. A., Dean, A. M. & Matias, P. M. (2012).

Induced fit and the catalytic mechanism of isocitrate dehydrogenase. Biochemistry 51,

7098–7115.

Page 211: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 211

Good, D. M., Wirtala, M., McAlister, G. C. & Coon, J. J. (2007). Performance

characteristics of electron transfer dissociation mass spectrometry. Mol. Cell.

Proteomics 6, 1942–1951.

Gottesman, S. (1999). Regulation by proteolysis: developmental switches. Curr. Opin.

Microbiol. 2, 142–147.

Gottesman, S., Squires, C., Pichersky, E., Carrington, M., Hobbs, M., Mattick, J. S.,

Dalrymple, B., Kuramitsu, H., Shiroza, T. & Foster, T. (1990). Conservation of the

regulatory subunit for the Clp ATP-dependent protease in prokaryotes and eukaryotes.

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 3513–3517.

Grangeasse, C., Cozzone, A. J., Deutscher, J. & Mijakovic, I. (2007). Tyrosine

phosphorylation: an emerging regulatory device of bacterial physiology. Trends

Biochem. Sci. 32, 86–94.

Grangeasse, C., Obadia, B., Mijakovic, I., Deutscher, J., Cozzone, A. J. & Doublet, P.

(2003). Autophosphorylation of the Escherichia coli protein kinase Wzc regulates

tyrosine phosphorylation of Ugd, a UDP-glucose dehydrogenase. J. Biol. Chem. 278,

39323–39329.

Graumann, J., Hubner, N. C., Kim, J. B., Ko, K., Moser, M., Kumar, C., Cox, J., Schöler,

H. & Mann, M. (2008). Stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC)

and proteome quantitation of mouse embryonic stem cells to a depth of 5,111

proteins. Mol. Cell. Proteomics 7, 672–683.

Gruber, T. M. & Gross, C. A. (2003). Multiple sigma subunits and the partitioning of

bacterial transcription space. Annu. Rev. Microbiol. 57, 441–466.

Gruhler, A., Olsen, J. V., Mohammed, S., Mortensen, P., Faergeman, N. J., Mann, M.

& Jensen, O. N. (2005). Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast

pheromone signaling pathway. Mol. Cell. Proteomics 4, 310–327.

Gruszczyński, P., Obuchowski, M. & Kaźmierkiewicz, R. (2010). Phosphorylation and

ATP-binding induced conformational changes in the PrkC, Ser/Thr kinase from

B. subtilis. J. Comput. Aided Mol. Des. 24, 733–747.

Hager, J. W. (2002). A new linear ion trap mass spectrometer. Rapid Commun. Mass

Spectrom. 16, 512–526.

Page 212: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

212

Halbedel, S., Busse, J., Schmidl, S. R. & Stülke, J. (2006). Regulatory protein

phosphorylation in Mycoplasma pneumoniae. A PP2C-type phosphatase serves to

dephosphorylate HPr(Ser-P). J. Biol. Chem. 281, 26253–26259.

Halbedel, S., Hames, C. & Stülke, J. (2007). Regulation of carbon metabolism in the

mollicutes and its relation to virulence. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 147–154.

Halbedel, S. & Stülke, J. (2005). Dual phosphorylation of Mycoplasma pneumoniae HPr

by Enzyme I and HPr kinase suggests an extended phosphoryl group susceptibility of

HPr. FEMS Microbiol. Lett. 247, 193–198.

Hancock, L. & Perego, M. (2002). Two-component signal transduction in Enterococcus

faecalis. J. Bacteriol. 184, 5819–5825.

Hanks, S. K. & Hunter, T. (1995). Protein kinases 6. The eukaryotic protein kinase

superfamily: kinase (catalytic) domain structure and classification. FASEB J. 9, 576–596.

Hanks, S. K., Quinn, A. M. & Hunter, T. (1988). The protein kinase family: conserved

features and deduced phylogeny of the catalytic domains. Science 241, 42–52.

Harrington, C. A., Rosenow, C. & Retief, J. (2000). Monitoring gene expression using

DNA microarrays. Curr. Opin. Microbiol. 3, 285–291.

Harris, L. G., Foster, S. J. & Richards, R. G. (2002). An introduction to Staphylococcus

aureus, and techniques for identifying and quantifying S. aureus adhesins in relation to

adhesion to biomaterials: review. Eur. Cell. Mater. 4, 39–60.

Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H. & Coorssen, J. R. (2007). Assessing

detection methods for gel-based proteomic analyses. J. Proteome Res. 6, 1418–1425.

Hecker, M. (2003). A proteomic view of cell physiology of Bacillus subtilis--bringing the

genome sequence to life. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 83, 57–92.

Hecker, M., Antelmann, H., Büttner, K. & Bernhardt, J. (2008). Gel-based proteomics

of Gram-positive bacteria: a powerful tool to address physiological questions.

Proteomics 8, 4958–4975.

Hecker, M. & Babel, W. (1988). Physiologie der Mikroorganismen: die Zelle, ihre

Umwelt und die Mechanismen der Adaptation. Gustav Fischer Verlag.

Page 213: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 213

Hecker, M., Pané-Farré, J. & Völker, U. (2007). SigB-dependent general stress

response in Bacillus subtilis and related gram-positive bacteria. Annu. Rev. Microbiol.

61, 215–236.

Hecker, M. & Völker, U. (2001). General stress response of Bacillus subtilis and other

bacteria. Adv. Microb. Physiol. 44, 35–91.

Hecker, M. & Völker, U. (2004). Towards a comprehensive understanding of Bacillus

subtilis cell physiology by physiological proteomics. Proteomics 4, 3727–3750.

Hempel, K., Herbst, F.-A., Moche, M., Hecker, M. & Becher, D. (2011). Quantitative

proteomic view on secreted, cell surface-associated, and cytoplasmic proteins of the

methicillin-resistant human pathogen Staphylococcus aureus under iron-limited

conditions. J. Proteome Res. 10, 1657–1666.

Hempel, K., Rosen, R., Becher, D., Büttner, K., Hecker, M. & Ron, E. Z. (2009). Analysis

of ultra acidic proteins by the use of anodic acidic gels. Anal. Biochem. 385, 208–214.

Henderson, B. & Martin, A. (2011). Bacterial virulence in the moonlight: multitasking

bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease.

Infect. Immun. 79, 3476–3491.

Henzel, W. J., Billeci, T. M., Stults, J. T., Wong, S. C., Grimley, C. & Watanabe, C.

(1993). Identifying proteins from two-dimensional gels by molecular mass searching of

peptide fragments in protein sequence databases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90,

5011–5015.

Heppel, L. A., Harkness, D. R. & Hilmoe, R. J. (1962). A study of the substrate

specificity and other properties of the alkaline phosphatase of Escherichia coli. J. Biol.

Chem. 237, 841–846.

Hidaka, H., Inagaki, M., Kawamoto, S. & Sasaki, Y. (1984). Isoquinolinesulfonamides,

novel and potent inhibitors of cyclic nucleotide dependent protein kinase and protein

kinase C. Biochemistry 23, 5036–5041.

Hoch, J. A. (2000). Two-component and phosphorelay signal transduction. Curr. Opin.

Microbiol. 3, 165–170.

Page 214: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

214

Hochgräfe, F., Mostertz, J., Pöther, D.-C., Becher, D., Helmann, J. D. & Hecker, M.

(2007). S-cysteinylation is a general mechanism for thiol protection of Bacillus subtilis

proteins after oxidative stress. J. Biol. Chem. 282, 25981–25985.

Hochgräfe, F., Wolf, C., Fuchs, S., Liebeke, M., Lalk, M., Engelmann, S. & Hecker, M.

(2008). Nitric oxide stress induces different responses but mediates comparable

protein thiol protection in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 190,

4997–5008.

Holland, C., Schmid, M., Zimny-Arndt, U., Rohloff, J., Stein, R., Jungblut, P. R. &

Meyer, T. F. (2011). Quantitative phosphoproteomics reveals link between

Helicobacter pylori infection and RNA splicing modulation in host cells. Proteomics 11,

2798–2811.

Hunter, S., Apweiler, R., Attwood, T. K., Bairoch, A., Bateman, A., Binns, D., Bork, P.,

Das, U., Daugherty, L., u. a. (2009). InterPro: the integrative protein signature

database. Nucleic Acids Res. 37, D211–215.

Hurley, J. H., Dean, A. M., Sohl, J. L., Koshland, D. E., Jr & Stroud, R. M. (1990).

Regulation of an enzyme by phosphorylation at the active site. Science 249, 1012–

1016.

Hyduke, D. R., Jarboe, L. R., Tran, L. M., Chou, K. J. Y. & Liao, J. C. (2007). Integrated

network analysis identifies nitric oxide response networks and dihydroxyacid

dehydratase as a crucial target in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104,

8484–8489.

Iber, D., Clarkson, J., Yudkin, M. D. & Campbell, I. D. (2006). The mechanism of cell

differentiation in Bacillus subtilis. Nature 441, 371–374.

Igo, M., Lampe, M., Ray, C., Schafer, W., Moran, C. P., Jr & Losick, R. (1987). Genetic

studies of a secondary RNA polymerase sigma factor in Bacillus subtilis. J. Bacteriol.

169, 3464–3469.

Ito, T. & Sakaki, Y. (1996). Toward genome-wide scanning of gene expression: a

functional aspect of the Genome Project. Essays Biochem. 31, 11–21.

Iwanicki, A., Hinc, K., Seror, S., Wegrzyn, G. & Obuchowski, M. (2005). Transcription

in the prpC-yloQ region in Bacillus subtilis. Arch. Microbiol. 183, 421–430.

Page 215: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 215

Jadeau, F., Bechet, E., Cozzone, A. J., Deléage, G., Grangeasse, C. & Combet, C.

(2008). Identification of the idiosyncratic bacterial protein tyrosine kinase (BY-kinase)

family signature. Bioinformatics 24, 2427–2430.

Jaffe, H., Veeranna & Pant, H. C. (1998). Characterization of serine and threonine

phosphorylation sites in beta-elimination/ethanethiol addition-modified proteins by

electrospray tandem mass spectrometry and database searching. Biochemistry 37,

16211–16224.

James, P., Quadroni, M., Carafoli, E. & Gonnet, G. (1993). Protein identification by

mass profile fingerprinting. Biochem. Biophys. Res. Commun. 195, 58–64.

Jedrychowski, M. P., Huttlin, E. L., Haas, W., Sowa, M. E., Rad, R. & Gygi, S. P. (2011).

Evaluation of HCD- and CID-type fragmentation within their respective detection

platforms for murine phosphoproteomics. Mol. Cell. Proteomics 10, M111.009910.

Jelsbak, L., Ingmer, H., Valihrach, L., Cohn, M. T., Christiansen, M. H. G., Kallipolitis, B.

H. & Frees, D. (2010). The chaperone ClpX stimulates expression of Staphylococcus

aureus protein A by Rot dependent and independent pathways. PLoS ONE 5, e12752.

Jennings, K. R. (1968). Collision-induced decompositions of aromatic molecular ions.

Int. J. Mass Spec. Ion Physics 1, 227–235.

Jers, C., Pedersen, M. M., Paspaliari, D. K., Schütz, W., Johnsson, C., Soufi, B., Macek,

B., Jensen, P. R. & Mijakovic, I. (2010). Bacillus subtilis BY-kinase PtkA controls enzyme

activity and localization of its protein substrates. Mol. Microbiol 77, 287–299.

Johnson, L. N. & Barford, D. (1993). The effects of phosphorylation on the structure

and function of proteins. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 22, 199–232.

Jolly, L., Pompeo, F., van Heijenoort, J., Fassy, F. & Mengin-Lecreulx, D. (2000).

Autophosphorylation of phosphoglucosamine mutase from Escherichia coli. J.

Bacteriol. 182, 1280–1285.

Jones, A. M. E. & Nühse, T. S. (2011). Phosphoproteomics using iTRAQ. Methods Mol.

Biol. 779, 287–302.

Jones, A. W. & Cooper, H. J. (2011). Dissociation techniques in mass spectrometry-

based proteomics. Analyst 136, 3419–3429.

Page 216: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

216

Juris, S. J., Rudolph, A. E., Huddler, D., Orth, K. & Dixon, J. E. (2000). A distinctive role

for the Yersinia protein kinase: actin binding, kinase activation, and cytoskeleton

disruption. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 9431–9436.

Kang, C.-M., Abbott, D. W., Park, S. T., Dascher, C. C., Cantley, L. C. & Husson, R. N.

(2005). The Mycobacterium tuberculosis serine/threonine kinases PknA and PknB:

substrate identification and regulation of cell shape. Genes Dev. 19, 1692–1704.

Kaniga, K., Uralil, J., Bliska, J. B. & Galán, J. E. (1996). A secreted protein tyrosine

phosphatase with modular effector domains in the bacterial pathogen Salmonella

typhimurium. Mol. Microbiol. 21, 633–641.

Karas, M. & Hillenkamp, F. (1988). Laser desorption ionization of proteins with

molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal. Chem. 60, 2299–2301.

Keller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E. & Aebersold, R. (2002). Empirical statistical

model to estimate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and

database search. Anal. Chem. 74, 5383–5392.

Kennelly, P. J. (2002). Protein kinases and protein phosphatases in prokaryotes: a

genomic perspective. FEMS Microbiol. Lett. 206, 1–8.

Kennelly, P. J. & Potts, M. (1999). Life among the primitives: protein O-phosphatases

in prokaryotes. Front. Biosci. 4, D372–385.

Kiley, T. B. & Stanley-Wall, N. R. (2010). Post-translational control of Bacillus subtilis

biofilm formation mediated by tyrosine phosphorylation. Mol. Microbiol. 78, 947– 963.

Kirstein, J., Dougan, D. A., Gerth, U., Hecker, M. & Turgay, K. (2007). The tyrosine

kinase McsB is a regulated adaptor protein for ClpCP. EMBO J. 26, 2061–2070.

Kirstein, J., Zühlke, D., Gerth, U., Turgay, K. & Hecker, M. (2005). A tyrosine kinase

and its activator control the activity of the CtsR heat shock repressor in B. subtilis.

EMBO J. 24, 3435–3445.

Kleinnijenhuis, A. J., Kjeldsen, F., Kallipolitis, B., Haselmann, K. F. & Jensen, O. N.

(2007). Analysis of histidine phosphorylation using tandem MS and ion-electron

reactions. Anal. Chem. 79, 7450–7456.

Page 217: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 217

Klemm, C., Otto, S., Wolf, C., Haseloff, R. F., Beyermann, M. & Krause, E. (2006).

Evaluation of the titanium dioxide approach for MS analysis of phosphopeptides. J.

Mass Spectrom. 41, 1623–1632.

Kloos, W. & Lambe, D., Jr. (1991). Staphylococcus. In Manual of Clinical Microbiology,

S. 222–237. Washington DC: ASM Press.

Klose, J. (1975). Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis

of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in

mammals. Humangenetik 26, 231–243.

Kohler, C., Wolff, S., Albrecht, D., Fuchs, S., Becher, D., Büttner, K., Engelmann, S. &

Hecker, M. (2005). Proteome analyses of Staphylococcus aureus in growing and non-

growing cells: a physiological approach. Int. J. Med. Microbiol. 295, 547–565.

Kolkman, A., Dirksen, E. H. C., Slijper, M. & Heck, A. J. R. (2005). Double standards in

quantitative proteomics: direct comparative assessment of difference in gel

electrophoresis and metabolic stable isotope labeling. Mol. Cell. Proteomics 4, 255–

266.

Koponen, J., Laakso, K., Koskenniemi, K., Kankainen, M., Savijoki, K., Nyman, T. A., de

Vos, W. M., Tynkkynen, S., Kalkkinen, N. & Varmanen, P. (2012). Effect of acid stress

on protein expression and phosphorylation in Lactobacillus rhamnosus GG.

J. Proteomics 75, 1357–1374.

Kosower, N. S. & Kosower, E. M. (1995). Diamide: an oxidant probe for thiols. Meth.

Enzymol. 251, 123–133.

Krebes, K. A., Dirksen, L. B. & Krause, D. C. (1995). Phosphorylation of Mycoplasma

pneumoniae cytadherence-accessory proteins in cell extracts. J. Bacteriol. 177, 4571–

4574.

Kristich, C. J., Wells, C. L. & Dunny, G. M. (2007). A eukaryotic-type Ser/Thr kinase in

Enterococcus faecalis mediates antimicrobial resistance and intestinal persistence.

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3508–3513.

Kunst, F., Ogasawara, N., Moszer, I., Albertini, A. M., Alloni, G., Azevedo, V., Bertero,

M. G., Bessières, P., Bolotin, A., u. a. (1997). The complete genome sequence of the

gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature 390, 249–256.

Page 218: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

218

Landmann, J. J., Busse, R. A., Latz, J.-H., Singh, K. D., Stülke, J. & Görke, B. (2011). Crh,

the paralogue of the phosphocarrier protein HPr, controls the methylglyoxal bypass of

glycolysis in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 82, 770–787.

LaPorte, D. C. & Chung, T. (1985). A single gene codes for the kinase and phosphatase

which regulate isocitrate dehydrogenase. J. Biol. Chem. 260, 15291–15297.

Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P. & Jørgensen, T. J. D.

(2005). Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures

using titanium dioxide microcolumns. Mol. Cell. Proteomics 4, 873–886.

Levene, P. & Alsberg, C. (1906). The cleavage products of vitellin. J. Biol. Chem. 2, 127–

133.

Lévine, A., Vannier, F., Absalon, C., Kuhn, L., Jackson, P., Scrivener, E., Labas, V., Vinh,

J., Courtney, P., u. a. (2006). Analysis of the dynamic Bacillus subtilis Ser/Thr/Tyr

phosphoproteome implicated in a wide variety of cellular processes. Proteomics 6,

2157–2173.

Lewis, R. S., Tamir, S., Tannenbaum, S. R. & Deen, W. M. (1995). Kinetic analysis of

the fate of nitric oxide synthesized by macrophages in vitro. J. Biol. Chem. 270, 29350–

29355.

Li, Q., Ning, Z., Tang, J., Nie, S. & Zeng, R. (2009). Effect of peptide-to-TiO2 beads ratio

on phosphopeptide enrichment selectivity. J. Proteome Res. 8, 5375–5381.

Liao, L., Sando, R. C., Farnum, J. B., Vanderklish, P. W., Maximov, A. & Yates, J. R.

(2012). 15N-labeled brain enables quantification of proteome and phosphoproteome in

cultured primary neurons. J. Proteome Res. 11, 1341–1353.

Liebeke, M., Dörries, K., Zühlke, D., Bernhardt, J., Fuchs, S., Pané-Farré, J.,

Engelmann, S., Völker, U., Bode, R., u. a. (2011). A metabolomics and proteomics

study of the adaptation of Staphylococcus aureus to glucose starvation. Mol. Biosyst. 7,

1241–1253.

Lin, M.-H., Hsu, T.-L., Lin, S.-Y., Pan, Y.-J., Jan, J.-T., Wang, J.-T., Khoo, K.-H. & Wu, S.-

H. (2009). Phosphoproteomics of Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044 reveals a tight

link between tyrosine phosphorylation and virulence. Mol. Cell. Proteomics 8, 2613–

2623.

Page 219: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 219

Lipmann, F. & Levene, P. (1932). Serinephosphoric acid obtained on hydrolysis of

vitellinic acid. J. Biol. Chem. 98, 109–114.

Le Loir, Y., Baron, F. & Gautier, M. (2003). Staphylococcus aureus and food poisoning.

Genet. Mol. Res. 2, 63–76.

Lomas-Lopez, R., Paracuellos, P., Riberty, M., Cozzone, A. J. & Duclos, B. (2007).

Several enzymes of the central metabolism are phosphorylated in Staphylococcus

aureus. FEMS Microbiol. Lett. 272, 35–42.

Lux, R. & Shi, W. (2005). A novel bacterial signalling system with a combination of a

Ser/Thr kinase cascade and a His/Asp two-component system. Mol. Microbiol. 58, 345–

348.

Macek, B., Gnad, F., Soufi, B., Kumar, C., Olsen, J. V., Mijakovic, I. & Mann, M. (2008).

Phosphoproteome analysis of E. coli reveals evolutionary conservation of bacterial

Ser/Thr/Tyr phosphorylation. Mol. Cell. Proteomics 7, 299–307.

Macek, B., Mann, M. & Olsen, J. V. (2009). Global and site-specific quantitative

phosphoproteomics: principles and applications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49,

199–221.

Macek, B. & Mijakovic, I. (2011). Site-specific analysis of bacterial phosphoproteomes.

Proteomics 11, 3002–3011.

Macek, B., Mijakovic, I., Olsen, J. V., Gnad, F., Kumar, C., Jensen, P. R. & Mann, M.

(2007). The serine/threonine/tyrosine phosphoproteome of the model bacterium

Bacillus subtilis. Mol. Cell. Proteomics 6, 697–707.

Madec, E., Laszkiewicz, A., Iwanicki, A., Obuchowski, M. & Séror, S. (2002).

Characterization of a membrane-linked Ser/Thr protein kinase in Bacillus subtilis,

implicated in developmental processes. Mol. Microbiol. 46, 571–586.

Madec, E., Stensballe, A., Kjellström, S., Cladière, L., Obuchowski, M., Jensen, O. N. &

Séror, S. J. (2003). Mass spectrometry and site-directed mutagenesis identify several

autophosphorylated residues required for the activity of PrkC, a Ser/Thr kinase from

Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. 330, 459–472.

Page 220: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

220

Mann, M., Højrup, P. & Roepstorff, P. (1993). Use of mass spectrometric molecular

weight information to identify proteins in sequence databases. Biol. Mass Spectrom.

22, 338–345.

Mann, M. & Jensen, O. N. (2003). Proteomic analysis of post-translational

modifications. Nat. Biotechnol. 21, 255–261.

Mann, M., Ong, S. E., Grønborg, M., Steen, H., Jensen, O. N. & Pandey, A. (2002).

Analysis of protein phosphorylation using mass spectrometry: deciphering the

phosphoproteome. Trends Biotechnol. 20, 261–268.

Manteca, A., Ye, J., Sánchez, J. & Jensen, O. N. (2011). Phosphoproteome analysis of

streptomyces development reveals extensive protein phosphorylation accompanying

bacterial differentiation. J. Proteome Res. 10, 5481–5492.

Marsh, J. J. & Lebherz, H. G. (1992). Fructose-bisphosphate aldolases: an evolutionary

history. Trends Biochem. Sci. 17, 110–113.

Martensen, T. M. (1984). Chemical properties, isolation, and analysis of O-phosphates

in proteins. Meth. Enzymol. 107, 3–23.

Martin, D. M. A., Nett, I. R. E., Vandermoere, F., Barber, J. D., Morrice, N. A. &

Ferguson, M. A. J. (2010). Prophossi: automating expert validation of phosphopeptide-

spectrum matches from tandem mass spectrometry. Bioinformatics 26, 2153–2159.

Martin, K., Steinberg, T. H., Cooley, L. A., Gee, K. R., Beechem, J. M. & Patton, W. F.

(2003a). Quantitative analysis of protein phosphorylation status and protein kinase

activity on microarrays using a novel fluorescent phosphorylation sensor dye.

Proteomics 3, 1244–1255.

Martin, K., Steinberg, T. H., Goodman, T., Schulenberg, B., Kilgore, J. A., Gee, K. R.,

Beechem, J. M. & Patton, W. F. (2003b). Strategies and solid-phase formats for the

analysis of protein and peptide phosphorylation employing a novel fluorescent

phosphorylation sensor dye. Comb. Chem. High Throughput Screen 6, 331–339.

Matsudaira, P. (1987). Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted

onto polyvinylidene difluoride membranes. J. Biol. Chem. 262, 10035–10038.

Page 221: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 221

Matthews, H. R. (1995). Protein kinases and phosphatases that act on histidine, lysine,

or arginine residues in eukaryotic proteins: a possible regulator of the mitogen-

activated protein kinase cascade. Pharmacol. Ther. 67, 323–350.

McLachlin, D. T. & Chait, B. T. (2003). Improved beta-elimination-based affinity

purification strategy for enrichment of phosphopeptides. Anal. Chem. 75, 6826–6836.

McLafferty, F. W. & Bryce, T. A. (1967). Metastable-ion characteristics:

characterization of isomeric molecules. Chem. Commun. (London) 1215–1217.

McNulty, D. E. & Annan, R. S. (2008). Hydrophilic interaction chromatography reduces

the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide

isolation and detection. Mol. Cell. Proteomics 7, 971–980.

Medzihradszky, K. F., Phillipps, N. J., Senderowicz, L., Wang, P. & Turck, C. W. (1997).

Synthesis and characterization of histidine-phosphorylated peptides. Protein Sci. 6,

1405–1411.

Mertins, P., Udeshi, N. D., Clauser, K. R., Mani, D. R., Patel, J., Ong, S.-E., Jaffe, J. D. &

Carr, S. A. (2012). iTRAQ labeling is superior to mTRAQ for quantitative global

proteomics and phosphoproteomics. Mol. Cell. Proteomics 11, 10.1074/

mcp.M111.014423.

Michalik, S., Liebeke, M., Zühlke, D., Lalk, M., Bernhardt, J., Gerth, U. & Hecker, M.

(2009). Proteolysis during long-term glucose starvation in Staphylococcus aureus COL.

Proteomics 9, 4468–4477.

Mijakovic, I. & Macek, B. (2012). Impact of phosphoproteomics on studies of bacterial

physiology. FEMS Microbiol. Rev. 36, 877–892.

Mijakovic, I., Petranovic, D., Macek, B., Cepo, T., Mann, M., Davies, J., Jensen, P. R. &

Vujaklija, D. (2006). Bacterial single-stranded DNA-binding proteins are

phosphorylated on tyrosine. Nucleic Acids Res. 34, 1588–1596.

Mijakovic, I., Poncet, S., Boël, G., Mazé, A., Gillet, S., Jamet, E., Decottignies, P.,

Grangeasse, C., Doublet, P., u. a. (2003). Transmembrane modulator-dependent

bacterial tyrosine kinase activates UDP-glucose dehydrogenases. EMBO J. 22, 4709–

4718.

Page 222: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

222

Miller, M., Donat, S., Rakette, S., Stehle, T., Kouwen, T. R. H. M., Diks, S. H.,

Dreisbach, A., Reilman, E., Gronau, K., u. a. (2010). Staphylococcal PknB as the first

prokaryotic representative of the proline-directed kinases. PLoS ONE 5, e9057.

Mirgorodskaya, O. A., Kozmin, Y. P., Titov, M. I., Körner, R., Sönksen, C. P. &

Roepstorff, P. (2000). Quantitation of peptides and proteins by matrix-assisted laser

desorption/ionization mass spectrometry using 18O-labeled internal standards. Rapid

Commun. Mass Spectrom. 14, 1226–1232.

Misra, S. K., Milohanic, E., Aké, F., Mijakovic, I., Deutscher, J., Monnet, V. & Henry, C.

(2011). Analysis of the serine/threonine/tyrosine phosphoproteome of the pathogenic

bacterium Listeria monocytogenes reveals phosphorylated proteins related to

virulence. Proteomics 11, 4155–4165.

Missiakas, D. & Raina, S. (1997). Signal transduction pathways in response to protein

misfolding in the extracytoplasmic compartments of E. coli: role of two new

phosphoprotein phosphatases PrpA and PrpB. EMBO J. 16, 1670–1685.

Mitrophanov, A. Y. & Groisman, E. A. (2008). Signal integration in bacterial two-

component regulatory systems. Genes Dev. 22, 2601–2611.

Modun, B., Morrissey, J. & Williams, P. (2000). The staphylococcal transferrin

receptor: a glycolytic enzyme with novel functions. Trends Microbiol. 8, 231–237.

Molina, H., Horn, D. M., Tang, N., Mathivanan, S. & Pandey, A. (2007). Global

proteomic profiling of phosphopeptides using electron transfer dissociation tandem

mass spectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2199–2204.

Mortensen, P., Gouw, J. W., Olsen, J. V., Ong, S.-E., Rigbolt, K. T. G., Bunkenborg, J.,

Cox, J., Foster, L. J., Heck, A. J. R., u. a. (2010). MSQuant, an open source platform for

mass spectrometry-based quantitative proteomics. J. Proteome Res. 9, 393–403.

Muñoz, J. & Heck, A. J. R. (2011). Quantitative proteome and phosphoproteome

analysis of human pluripotent stem cells. Methods Mol. Biol. 767, 297–312.

Muñoz, M. E. & Ponce, E. (2003). Pyruvate kinase: current status of regulatory and

functional properties. Comp. Biochem. Physiol. B, Biochem. Mol. Biol. 135, 197–218.

Page 223: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 223

Muñoz-Dorado, J., Inouye, S. & Inouye, M. (1991). A gene encoding a protein

serine/threonine kinase is required for normal development of M. xanthus, a gram-

negative bacterium. Cell 67, 995–1006.

Musher, D. M. & McKenzie, S. O. (1977). Infections due to Staphylococcus aureus.

Medicine (Baltimore) 56, 383–409.

Musser, J. M., Schlievert, P. M., Chow, A. W., Ewan, P., Kreiswirth, B. N., Rosdahl, V.

T., Naidu, A. S., Witte, W. & Selander, R. K. (1990). A single clone of Staphylococcus

aureus causes the majority of cases of toxic shock syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 87, 225–229.

Musumeci, L., Bongiorni, C., Tautz, L., Edwards, R. A., Osterman, A., Perego, M.,

Mustelin, T. & Bottini, N. (2005). Low-molecular-weight protein tyrosine phosphatases

of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 187, 4945–4956.

Nagaraj, N., D’Souza, R. C. J., Cox, J., Olsen, J. V. & Mann, M. (2010). Feasibility of

large-scale phosphoproteomics with higher energy collisional dissociation

fragmentation. J. Proteome Res. 9, 6786–6794.

Nakakido, M., Tanaka, Y. & Tsumoto, K. (2007). The N-terminal domain of elastin-

binding protein of Staphylococcus aureus changes its secondary structure in a

membrane-mimetic environment. J. Biochem. 142, 131–134.

Nalwaya, N. & Deen, W. M. (2005). Nitric oxide, oxygen, and superoxide formation

and consumption in macrophage cultures. Chem. Res. Toxicol 18, 486–493.

Nannapaneni, P., Hertwig, F., Depke, M., Hecker, M., Mäder, U., Völker, U., Steil, L. &

van Hijum, S. A. F. T. (2012). Defining the structure of the general stress regulon of

Bacillus subtilis using targeted microarray analysis and random forest classification.

Microbiology 158, 696–707.

Nariya, H. & Inouye, S. (2005). Identification of a protein Ser/Thr kinase cascade that

regulates essential transcriptional activators in Myxococcus xanthus development.

Mol. Microbiol. 58, 367–379.

Nathan, C. & Shiloh, M. U. (2000). Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the

relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 97, 8841–8848.

Page 224: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

224

Nesvizhskii, A. I., Keller, A., Kolker, E. & Aebersold, R. (2003). A statistical model for

identifying proteins by tandem mass spectrometry. Anal. Chem 75, 4646–4658.

Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D. & Ehrhardt, W. (1988). Improved staining of proteins

in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at

nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis

9, 255–262.

Neville, D. C. A., Townsend, R. R., Rozanas, C. R., Verkman, A. S., Price, E. M. & Gruis,

D. B. (1997). Evidence for phosphorylation of serine 753 in CFTR using a novel

metal-ion affinity resin and matrix-assisted laser desorption mass spectrometry.

Protein Sci. 6, 2436–2445.

Niemeyer, D. & Becker, A. (2001). The molecular weight distribution of succinoglycan

produced by Sinorhizobium meliloti is influenced by specific tyrosine phosphorylation

and ATPase activity of the cytoplasmic domain of the ExoP protein. J. Bacteriol. 183,

5163–5170.

van Noort, V., Seebacher, J., Bader, S., Mohammed, S., Vonkova, I., Betts, M. J.,

Kühner, S., Kumar, R., Maier, T., u. a. (2012). Cross-talk between phosphorylation and

lysine acetylation in a genome-reduced bacterium. Mol. Syst. Biol. 8, 571.

O’Farrell, P. H. (1975). High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.

J. Biol. Chem. 250, 4007–4021.

Obuchowski, M., Madec, E., Delattre, D., Boël, G., Iwanicki, A., Foulger, D. & Séror, S.

J. (2000). Characterization of PrpC from Bacillus subtilis, a member of the PPM

phosphatase family. J. Bacteriol. 182, 5634–5638.

Oda, Y., Nagasu, T. & Chait, B. T. (2001). Enrichment analysis of phosphorylated

proteins as a tool for probing the phosphoproteome. Nat. Biotechnol. 19, 379–382.

Ohlsen, K. & Donat, S. (2010). The impact of serine/threonine phosphorylation in

Staphylococcus aureus. Int. J. Med. Microbiol. 300, 137–141.

Olsen, J. V., Blagoev, B., Gnad, F., Macek, B., Kumar, C., Mortensen, P. & Mann, M.

(2006). Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling

networks. Cell 127, 635–648.

Page 225: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 225

Olsen, J. V. & Macek, B. (2009). High accuracy mass spectrometry in large-scale

analysis of protein phosphorylation. Methods Mol. Biol. 492, 131–142.

Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S. & Mann, M. (2007).

Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nat. Methods 4,

709–712.

Olsen, J. V., Schwartz, J. C., Griep-Raming, J., Nielsen, M. L., Damoc, E., Denisov, E.,

Lange, O., Remes, P., Taylor, D., u. a. (2009). A dual pressure linear ion trap orbitrap

instrument with very high sequencing speed. Mol. Cell. Proteomics 8, 2759 –2769.

Ong, S.-E., Blagoev, B., Kratchmarova, I., Kristensen, D. B., Steen, H., Pandey, A. &

Mann, M. (2002). Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a

simple and accurate approach to expression proteomics. Mol. Cell. Proteomics 1, 376–

386.

Ong, S.-E. & Mann, M. (2007). Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for

quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 359, 37–52.

Pancholi, V. & Chhatwal, G. S. (2003). Housekeeping enzymes as virulence factors for

pathogens. Int. J. Med. Microbiol. 293, 391–401.

Pandey, A. & Mann, M. (2000). Proteomics to study genes and genomes. Nature 405,

837–846.

Pané-Farré, J., Jonas, B., Hardwick, S. W., Gronau, K., Lewis, R. J., Hecker, M. &

Engelmann, S. (2009). Role of RsbU in controlling SigB activity in Staphylococcus

aureus following alkaline stress. J. Bacteriol. 191, 2561–2573.

Pappin, D. J., Hojrup, P. & Bleasby, A. J. (1993). Rapid identification of proteins by

peptide-mass fingerprinting. Curr. Biol. 3, 327–332.

Park, P. W., Broekelmann, T. J., Mecham, B. R. & Mecham, R. P. (1999).

Characterization of the elastin binding domain in the cell-surface 25-kDa elastin-

binding protein of Staphylococcus aureus (EbpS). J. Biol. Chem. 274, 2845–2850.

Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T. & Yates, J. R. (2008). A quantitative analysis software

tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods 5, 319–322.

Parker, J. L., Jones, A. M. E., Serazetdinova, L., Saalbach, G., Bibb, M. J. & Naldrett, M.

J. (2010). Analysis of the phosphoproteome of the multicellular bacterium

Page 226: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

226

Streptomyces coelicolor A3(2) by protein/peptide fractionation, phosphopeptide

enrichment and high accuracy mass spectrometry. Proteomics 10, 2486–2497.

Patterson, S. D. & Aebersold, R. H. (2003). Proteomics: the first decade and beyond.

Nat. Genet. 33, 311–323.

Patton, W. F. (2000). A thousand points of light: the application of fluorescence

detection technologies to two-dimensional gel electrophoresis and proteomics.

Electrophoresis 21, 1123–1144.

Patton, W. F. (2002). Detection technologies in proteome analysis. J. Chromatogr. B

Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 771, 3–31.

Pawson, T. & Scott, J. D. (2005). Protein phosphorylation in signaling--50 years and

counting. Trends Biochem. Sci. 30, 286–290.

Pegan, S. D., Rukseree, K., Franzblau, S. G. & Mesecar, A. D. (2009). Structural basis

for catalysis of a tetrameric class IIa fructose 1,6-bisphosphate aldolase from

Mycobacterium tuberculosis. J. Mol. Biol. 386, 1038–1053.

Petersohn, A., Antelmann, H., Gerth, U. & Hecker, M. (1999). Identification and

transcriptional analysis of new members of the σB regulon in Bacillus subtilis.

Microbiology 145, 869–880.

Petersohn, A., Brigulla, M., Haas, S., Hoheisel, J. D., Völker, U. & Hecker, M. (2001).

Global analysis of the general stress response of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 183,

5617–5631.

Petranovic, D., Michelsen, O., Zahradka, K., Silva, C., Petranovic, M., Jensen, P. R. &

Mijakovic, I. (2007). Bacillus subtilis strain deficient for the protein-tyrosine kinase

PtkA exhibits impaired DNA replication. Mol. Microbiol. 63, 1797–1805.

Pietack, N., Becher, D., Schmidl, S. R., Saier, M. H., Hecker, M., Commichau, F. M. &

Stülke, J. (2010). In vitro phosphorylation of key metabolic enzymes from Bacillus

subtilis: PrkC phosphorylates enzymes from different branches of basic metabolism. J.

Mol. Microbiol. Biotechnol. 18, 129–140.

Pinkse, M. W. H., Uitto, P. M., Hilhorst, M. J., Ooms, B. & Heck, A. J. R. (2004).

Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests

Page 227: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 227

using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal. Chem. 76, 3935–

3943.

Pompeo, F., Freton, C., Wicker-Planquart, C., Grangeasse, C., Jault, J.-M. & Galinier,

A. (2012). Phosphorylation of CpgA protein enhances both its GTPase activity and its

affinity for ribosome and is crucial for Bacillus subtilis growth and morphology. J. Biol.

Chem. 287, 20830–20838.

Pöther, D.-C., Liebeke, M., Hochgräfe, F., Antelmann, H., Becher, D., Lalk, M.,

Lindequist, U., Borovok, I., Cohen, G., u. a. (2009). Diamide triggers mainly

S-Thiolations in the cytoplasmic proteomes of Bacillus subtilis and Staphylococcus

aureus. J. Bacteriol. 191, 7520–7530.

Preneta, R., Jarraud, S., Vincent, C., Doublet, P., Duclos, B., Etienne, J. & Cozzone, A.

J. (2002). Isolation and characterization of a protein-tyrosine kinase and a

phosphotyrosine-protein phosphatase from Klebsiella pneumoniae. Comp. Biochem.

Physiol. B, Biochem. Mol. Biol. 131, 103–112.

Price, C. W., Fawcett, P., Cérémonie, H., Su, N., Murphy, C. K. & Youngman, P. (2001).

Genome-wide analysis of the general stress response in Bacillus subtilis. Mol.

Microbiol. 41, 757–774.

Prisic, S., Dankwa, S., Schwartz, D., Chou, M. F., Locasale, J. W., Kang, C.-M., Bemis,

G., Church, G. M., Steen, H. & Husson, R. N. (2010). Extensive phosphorylation with

overlapping specificity by Mycobacterium tuberculosis serine/threonine protein

kinases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7521–7526.

Rabilloud, T. (2002). Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old

fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics 2, 3–10.

Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S. & Lelong, C. (2010). Two-dimensional gel

electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics 73, 2064–2077.

Rabilloud, T. & Lelong, C. (2011). Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics:

a tutorial. J. Proteomics 74, 1829–1841.

Rakette, S., Donat, S., Ohlsen, K. & Stehle, T. (2012). Structural analysis of

Staphylococcus aureus serine/threonine kinase PknB. PLoS ONE 7, e39136.

Page 228: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

228

Rappsilber, J., Mann, M. & Ishihama, Y. (2007). Protocol for micro-purification,

enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.

Nat. Protoc. 2, 1896–1906.

Ravichandran, A., Sugiyama, N., Tomita, M., Swarup, S. & Ishihama, Y. (2009).

Ser/Thr/Tyr phosphoproteome analysis of pathogenic and non-pathogenic

Pseudomonas species. Proteomics 9, 2764–2775.

Reeves, A., Gerth, U., Völker, U. & Haldenwang, W. G. (2007). ClpP modulates the

activity of the Bacillus subtilis stress response transcription factor,σB. J. Bacteriol. 189,

6168–6175.

Reeves, A., Martinez, L. & Haldenwang, W. (2010). Expression of, and in vivo

stressosome formation by, single members of the RsbR protein family in Bacillus

subtilis. Microbiology 156, 990–998.

Reizer, J., Sutrina, S. L., Saier, M. H., Stewart, G. C., Peterkofsky, A. & Reddy, P.

(1989). Mechanistic and physiological consequences of HPr(ser) phosphorylation on

the activities of the phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system in gram-

positive bacteria: studies with site-specific mutants of HPr. EMBO J. 8, 2111–2120.

Richardson, A. R., Dunman, P. M. & Fang, F. C. (2006). The nitrosative stress response

of Staphylococcus aureus is required for resistance to innate immunity. Mol. Microbiol.

61, 927–939.

Richardson, A. R., Libby, S. J. & Fang, F. C. (2008). A nitric oxide–inducible lactate

dehydrogenase enables Staphylococcus aureus to resist innate immunity. Science 319,

1672–1676.

Riddle, V. & Lorenz, F. W. (1968). Nonenzymic, polyvalent anion-catalyzed formation

of methylglyoxal as an explanation of its presence in physiological systems. J. Biol.

Chem. 243, 2718–2724.

Robertson, E. F. & Reeves, H. C. (1989). Phosphorylation of isocitrate lyase in

Escherichia coli. Biochimie 71, 1065–1070.

Roche, F. M., Downer, R., Keane, F., Speziale, P., Park, P. W. & Foster, T. J. (2004). The

N-terminal A domain of fibronectin-binding proteins A and B promotes adhesion of

Staphylococcus aureus to elastin. J. Biol. Chem. 279, 38433–38440.

Page 229: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 229

Ross, P. L., Huang, Y. N., Marchese, J. N., Williamson, B., Parker, K., Hattan, S.,

Khainovski, N., Pillai, S., Dey, S., u. a. (2004). Multiplexed protein quantitation in

Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell.

Proteomics 3, 1154–1169.

Ruggiero, A., Squeglia, F., Marasco, D., Marchetti, R., Molinaro, A. & Berisio, R.

(2011). X-ray structural studies of the entire extracellular region of the

serine/threonine kinase PrkC from Staphylococcus aureus. Biochem. J. 435, 33–41.

Sakai, H. (2004). Possible structure and function of the extra C-terminal sequence of

pyruvate kinase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem. 136, 471–476.

Sakai, H. & Ohta, T. (1993). Molecular cloning and nucleotide sequence of the gene for

pyruvate kinase of Bacillus stearothermophilus and the production of the enzyme in

Escherichia coli. Evidence that the genes for phosphofructokinase and pyruvate kinase

constitute an operon. Eur. J. Biochem. 211, 851–859.

Scanff, P., Yvon, M. & Pelissier, J. P. (1991). Immobilized Fe3+ affinity chromatographic

isolation of phosphopeptides. J. Chromatogr. 539, 425–432.

Schmidl, S. R., Gronau, K., Hames, C., Busse, J., Becher, D., Hecker, M. & Stülke, J.

(2010b). The stability of cytadherence proteins in Mycoplasma pneumoniae requires

activity of the protein kinase PrkC. Infect. Immun. 78, 184–192.

Schmidl, S. R., Gronau, K., Pietack, N., Hecker, M., Becher, D. & Stülke, J. (2010a). The

phosphoproteome of the minimal bacterium Mycoplasma pneumoniae: analysis of the

complete known Ser/Thr kinome suggests the existence of novel kinases. Mol. Cell.

Proteomics 9, 1228–1242.

Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F. & Coon, J. J. (2004). A

neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by

quadrupole ion trap mass spectrometry. Anal. Chem. 76, 3590–3598.

Schulenberg, B., Goodman, T. N., Aggeler, R., Capaldi, R. A. & Patton, W. F. (2004).

Characterization of dynamic and steady-state protein phosphorylation using a

fluorescent phosphoprotein gel stain and mass spectrometry. Electrophoresis 25,

2526–2532.

Page 230: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

230

Shafer, W. M. & Iandolo, J. J. (1979). Genetics of staphylococcal enterotoxin B in

methicillin-resistant isolates of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 25, 902–911.

Shah, I. M., Laaberki, M.-H., Popham, D. L. & Dworkin, J. (2008). A eukaryotic-like

Ser/Thr kinase signals bacteria to exit dormancy in response to peptidoglycan

fragments. Cell 135, 486–496.

Shi, L., Potts, M. & Kennelly, P. J. (1998). The serine, threonine, and/or tyrosine-

specific protein kinases and protein phosphatases of prokaryotic organisms: a family

portrait. FEMS Microbiol. Rev. 22, 229–253.

Sickmann, A. & Meyer, H. E. (2001). Phosphoamino acid analysis. Proteomics 1, 200–

206.

Sivaraman, J., Li, Y., Larocque, R., Schrag, J. D., Cygler, M. & Matte, A. (2001). Crystal

structure of histidinol phosphate aminotransferase (HisC) from Escherichia coli, and its

covalent complex with pyridoxal-5′-phosphate and l-histidinol phosphate. J. Mol. Biol.

311, 761–776.

Soufi, B., Gnad, F., Jensen, P. R., Petranovic, D., Mann, M., Mijakovic, I. & Macek, B.

(2008). The Ser/Thr/Tyr phosphoproteome of Lactococcus lactis IL1403 reveals

multiply phosphorylated proteins. Proteomics 8, 3486–3493.

Soufi, B., Kumar, C., Gnad, F., Mann, M., Mijakovic, I. & Macek, B. (2010). Stable

isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) applied to quantitative

proteomics of Bacillus subtilis. J. Proteome Res. 9, 3638–3646.

Soufi, B., Soares, N. C., Ravikumar, V. & Macek, B. (2012). Proteomics reveals

evidence of cross-talk between protein modifications in bacteria: focus on acetylation

and phosphorylation. Curr. Opin. Microbiol. 15, 357–363.

Soulat, D., Jault, J.-M., Duclos, B., Geourjon, C., Cozzone, A. J. & Grangeasse, C.

(2006). Staphylococcus aureus operates protein-tyrosine phosphorylation through a

specific mechanism. J. Biol. Chem. 281, 14048–14056.

Soung, G. Y., Miller, J. L., Koc, H. & Koc, E. C. (2009). Comprehensive analysis of

phosphorylated proteins of Escherichia coli ribosomes. J. Proteome Res. 8, 3390–3402.

Squeglia, F., Marchetti, R., Ruggiero, A., Lanzetta, R., Marasco, D., Dworkin, J.,

Petoukhov, M., Molinaro, A., Berisio, R. & Silipo, A. (2011). Chemical basis of

Page 231: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 231

peptidoglycan discrimination by PrkC, a key kinase involved in bacterial resuscitation

from dormancy. J. Am. Chem. Soc. 133, 20676–20679.

Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N. & Kirschner, M. W. (2006).

Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences

for qualitative and quantitative measurements. Mol. Cell. Proteomics 5, 172–181.

Steen, H., Stensballe, A. & Jensen, O. N. (2007). Phosphopeptide purification by IMAC

with Fe(III) and Ga(III). CSH Protoc. 2007, pdb.prot4607.

Steinberg, T. H., Agnew, B. J., Gee, K. R., Leung, W.-Y., Goodman, T., Schulenberg, B.,

Hendrickson, J., Beechem, J. M., Haugland, R. P. & Patton, W. F. (2003). Global

quantitative phosphoprotein analysis using Multiplexed Proteomics technology.

Proteomics 3, 1128–1144.

Stensballe, A., Jensen, O. N., Olsen, J. V., Haselmann, K. F. & Zubarev, R. A. (2000).

Electron capture dissociation of singly and multiply phosphorylated peptides. Rapid

Commun. Mass Spectrom. 14, 1793–1800.

Stock, J. B., Stock, A. M. & Mottonen, J. M. (1990). Signal transduction in bacteria.

Nature 344, 395–400.

Stülke, J., Hanschke, R. & Hecker, M. (1993). Temporal activation of beta-glucanase

synthesis in Bacillus subtilis is mediated by the GTP pool. J. Gen. Microbiol. 139, 2041–

2045.

Stülke, J. & Hillen, W. (2000). Regulation of carbon catabolism in Bacillus species.

Annu. Rev. Microbiol. 54, 849–880.

Su, H.-C., Hutchison, C. A., 3rd & Giddings, M. C. (2007). Mapping phosphoproteins in

Mycoplasma genitalium and Mycoplasma pneumoniae. BMC Microbiol. 7, 63.

Sun, F., Ding, Y., Ji, Q., Liang, Z., Deng, X., Wong, C. C. L., Yi, C., Zhang, L., Xie, S., u. a.

(2012). Protein cysteine phosphorylation of SarA/MgrA family transcriptional

regulators mediates bacterial virulence and antibiotic resistance. Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 109, 15461–15466.

Sun, X., Ge, F., Xiao, C.-L., Yin, X.-F., Ge, R., Zhang, L.-H. & He, Q.-Y. (2010).

Phosphoproteomic analysis reveals the multiple roles of phosphorylation in pathogenic

bacterium Streptococcus pneumoniae. J. Proteome Res. 9, 275–82.

Page 232: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

232

Sutherland, E. & Wosilait, W. (1955). Inactivation and activation of liver

phosphorylase. Nature 175, 169–170.

Suzuki, K., Ito, S., Shimizu-Ibuka, A. & Sakai, H. (2008). Crystal structure of pyruvate

kinase from Geobacillus stearothermophilus. J. Biochem. 144, 305–312.

Tabb, D. L., McDonald, W. H. & Yates, J. R. (2002). DTASelect and Contrast: tools for

assembling and comparing protein identifications from shotgun proteomics.

J. Proteome Res. 1, 21–26.

Tamber, S., Schwartzman, J. & Cheung, A. L. (2010). Role of PknB kinase in antibiotic

resistance and virulence in community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus

aureus strain USA300. Infect. Immun. 78, 3637–3646.

Taus, T., Köcher, T., Pichler, P., Paschke, C., Schmidt, A., Henrich, C. & Mechtler, K.

(2011). Universal and confident phosphorylation site localization using phosphoRS.

J. Proteome Res. 10, 5354–5362.

The Universal Protein Resource (UniProt). (2007). Nucleic Acids Res 35, D193–197.

Thingholm, T. E., Jensen, O. N. & Larsen, M. R. (2009). Analytical strategies for

phosphoproteomics. Proteomics 9, 1451–1468.

Di Tommaso, P., Moretti, S., Xenarios, I., Orobitg, M., Montanyola, A., Chang, J.-M.,

Taly, J.-F. & Notredame, C. (2011). T-Coffee: a web server for the multiple sequence

alignment of protein and RNA sequences using structural information and homology

extension. Nucleic Acids Res. 39, W13–17.

Truong-Bolduc, Q. C., Ding, Y. & Hooper, D. C. (2008). Posttranslational modification

influences the effects of MgrA on norA expression in Staphylococcus aureus.

J. Bacteriol. 190, 7375–7381.

Truong-Bolduc, Q. C., Dunman, P. M., Strahilevitz, J., Projan, S. J. & Hooper, D. C.

(2005). MgrA is a multiple regulator of two new efflux pumps in Staphylococcus

aureus. J. Bacteriol. 187, 2395–2405.

Truong-Bolduc, Q. C. & Hooper, D. C. (2010). Phosphorylation of MgrA and its effect

on expression of the NorA and NorB efflux pumps of Staphylococcus aureus.

J. Bacteriol. 192, 2525–2534.

Page 233: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 233

Truong-Bolduc, Q. C., Strahilevitz, J. & Hooper, D. C. (2006). NorC, a new efflux pump

regulated by MgrA of Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 50,

1104–1107.

Tunio, S. A., Oldfield, N. J., Berry, A., Ala’Aldeen, D. A. A., Wooldridge, K. G. & Turner,

D. P. J. (2010). The moonlighting protein fructose-1,6-bisphosphate aldolase of

Neisseria meningitidis: surface localization and role in host cell adhesion. Mol.

Microbiol. 76, 605–615.

Ubersax, J. A. & Ferrell, J. E., Jr. (2007). Mechanisms of specificity in protein

phosphorylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 530–541.

Venter, J. C., Adams, M. D., Myers, E. W., Li, P. W., Mural, R. J., Sutton, G. G., Smith,

H. O., Yandell, M., Evans, C. A., u. a. (2001). The sequence of the human genome.

Science 291, 1304–1351.

Vincent, C., Doublet, P., Grangeasse, C., Vaganay, E., Cozzone, A. J. & Duclos, B.

(1999). Cells of Escherichia coli contain a protein-tyrosine kinase, Wzc, and a

phosphotyrosine-protein phosphatase, Wzb. J. Bacteriol. 181, 3472–3477.

Vincent, C., Duclos, B., Grangeasse, C., Vaganay, E., Riberty, M., Cozzone, A. J. &

Doublet, P. (2000). Relationship between exopolysaccharide production and protein-

tyrosine phosphorylation in gram-negative bacteria. J. Mol. Biol. 304, 311–321.

Voisin, S., Watson, D. C., Tessier, L., Ding, W., Foote, S., Bhatia, S., Kelly, J. F. &

Young, N. M. (2007). The cytoplasmic phosphoproteome of the Gram-negative

bacterium Campylobacter jejuni: evidence for modification by unidentified protein

kinases. Proteomics 7, 4338–4348.

Vujaklija, D. & Macek, B. (2012). Detecting posttranslational modifications of bacterial

SSB proteins. Methods Mol. Biol. 922, 205–218.

Vulliet, P. R., Hall, F. L., Mitchell, J. P. & Hardie, D. G. (1989). Identification of a novel

proline-directed serine/threonine protein kinase in rat pheochromocytoma. J. Biol.

Chem. 264, 16292–16298.

Wakim, B. T. & Aswad, G. D. (1994). Ca2+-calmodulin-dependent phosphorylation of

arginine in histone 3 by a nuclear kinase from mouse leukemia cells. J. Biol. Chem. 269,

2722–2727.

Page 234: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

234

Wakim, B. T., Picken, M. M. & DeLange, R. J. (1990). Identification and partial

purification of a chromatin bound calmodulin activated histone 3 kinase from calf

thymus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 171, 84–90.

Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M.

R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L. & Humphery-Smith, I. (1995). Progress

with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis

16, 1090–1094.

Westers, L., Westers, H. & Quax, W. J. (2004). Bacillus subtilis as cell factory for

pharmaceutical proteins: a biotechnological approach to optimize the host organism.

Biochim. Biophys. Acta 1694, 299–310.

Wiley, D. J., Shrestha, N., Yang, J., Atis, N., Dayton, K. & Schesser, K. (2009). The

activities of the Yersinia protein kinase A (YpkA) and outer protein J (YopJ) virulence

factors converge on an eIF2alpha kinase. J. Biol. Chem. 284, 24744–24753.

Wilkins, M. R., Pasquali, C., Appel, R. D., Ou, K., Golaz, O., Sanchez, J. C., Yan, J. X.,

Gooley, A. A., Hughes, G., u. a. (1996a). From proteins to proteomes: large scale

protein identification by two-dimensional electrophoresis and amino acid analysis.

Biotechnology (N.Y.) 14, 61–65.

Wilkins, M. R., Sanchez, J. C., Gooley, A. A., Appel, R. D., Humphery-Smith, I.,

Hochstrasser, D. F. & Williams, K. L. (1996b). Progress with proteome projects: why all

proteins expressed by a genome should be identified and how to do it. Biotechnol.

Genet. Eng. Rev. 13, 19–50.

Williamson, B. L., Marchese, J. & Morrice, N. A. (2006). Automated identification and

quantification of protein phosphorylation sites by LC/MS on a hybrid triple quadrupole

linear ion trap mass spectrometer. Mol. Cell. Proteomics 5, 337–346.

Wissing, J., Godl, K., Brehmer, D., Blencke, S., Weber, M., Habenberger, P., Stein-

Gerlach, M., Missio, A., Cotten, M., u. a. (2004). Chemical proteomic analysis reveals

alternative modes of action for pyrido[2,3-d]pyrimidine kinase inhibitors. Mol. Cell.

Proteomics 3, 1181–1193.

Wissing, J., Jänsch, L., Nimtz, M., Dieterich, G., Hornberger, R., Kéri, G., Wehland, J. &

Daub, H. (2007). Proteomics analysis of protein kinases by target class-selective

prefractionation and tandem mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics 6, 537–547.

Page 235: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

4 Literaturverzeichnis 235

Wolf, C., Hochgräfe, F., Kusch, H., Albrecht, D., Hecker, M. & Engelmann, S. (2008).

Proteomic analysis of antioxidant strategies of Staphylococcus aureus: diverse

responses to different oxidants. Proteomics 8, 3139–3153.

Wolff, S., Otto, A., Albrecht, D., Zeng, J. S., Büttner, K., Glückmann, M., Hecker, M. &

Becher, D. (2006). Gel-free and gel-based proteomics in Bacillus subtilis: a comparative

study. Mol. Cell. Proteomics 5, 1183–1192.

Wolschin, F. & Weckwerth, W. (2005). Combining metal oxide affinity

chromatography (MOAC) and selective mass spectrometry for robust identification of

in vivo protein phosphorylation sites. Plant Methods 1, 9.

Wu, C. C., MacCoss, M. J., Howell, K. E., Matthews, D. E. & Yates, J. R. (2004).

Metabolic labeling of mammalian organisms with stable isotopes for quantitative

proteomic analysis. Anal. Chem. 76, 4951–4959.

Yang, H., Ke, Y., Wang, J., Tan, Y., Myeni, S. K., Li, D., Shi, Q., Yan, Y., Chen, H., u. a.

(2011). Insight into bacterial virulence mechanisms against host immune response via

the Yersinia pestis-human protein-protein interaction network. Infect. Immun. 79,

4413–4424.

Yang, X., Kang, C. M., Brody, M. S. & Price, C. W. (1996). Opposing pairs of serine

protein kinases and phosphatases transmit signals of environmental stress to activate

a bacterial transcription factor. Genes Dev. 10, 2265–2275.

Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A. & Fenselau, C. (2001). Proteolytic 18O

labeling for comparative proteomics: model studies with two serotypes of adenovirus.

Anal. Chem. 73, 2836–2842.

Yates, J. R., 3rd, Speicher, S., Griffin, P. R. & Hunkapiller, T. (1993). Peptide mass

maps: a highly informative approach to protein identification. Anal. Biochem. 214,

397–408.

Yudkin, M. (1993). Spore formation in Bacillus subtilis. Sci. Progress 77, 113–130.

Zhang, Y., Ficarro, S. B., Li, S. & Marto, J. A. (2009). Optimized Orbitrap HCD for

quantitative analysis of phosphopeptides. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1425–1434.

Page 236: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

236

Zhou, H., Ye, M., Dong, J., Han, G., Jiang, X., Wu, R. & Zou, H. (2008). Specific

phosphopeptide enrichment with immobilized titanium ion affinity chromatography

adsorbent for phosphoproteome analysis. J. Proteome Res. 7, 3957–3967.

Zhu, W., Venable, J., Giometti, C. S., Khare, T., Tollaksen, S., Ahrendt, A. J. & Yates, J.

R., 3rd. (2005). Large-scale µLC-MS/MS for silver- and Coomassie blue-stained

polyacrylamide gels. Electrophoresis 26, 4495–4507.

Zolkiewski, M. (2006). A camel passes through the eye of a needle: protein unfolding

activity of Clp ATPases. Mol. Microbiol. 61, 1094–1100.

Zoraghi, R., See, R. H., Gong, H., Lian, T., Swayze, R., Finlay, B. B., Brunham, R. C.,

McMaster, W. R. & Reiner, N. E. (2010). Functional analysis, overexpression, and

kinetic characterization of pyruvate kinase from methicillin-resistant Staphylococcus

aureus. Biochemistry 49, 7733–7747.

Page 237: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

5 Anhangsübersicht 237

5 Anhangsübersicht

Alle Anhänge sind als Dateien auf der beigefügten CD bereitgestellt.

Anhang I: Identifizierte putativ phosphorylierte Proteine (Bacillus subtilis)

Anhang Ib: Identifizierung der Phosphorylierungsstelle T186 von RsbRB (B. subtilis)

Anhang II: Phosphorylierte Proteine und Peptide (Staphylococcus aureus)

Anhang II S1: Spektren phosphorylierter Peptide: gelbasierter Ansatz (S. aureus)

Anhang II S2: Spektren phosphorylierter Peptide: gelfreier Ansatz (S. aureus)

Anhang III: Peptide mit Argininphosphorylierungsstellen (B. subtilis)

Anhang III S: Spektren der Phospho-Arginin-Peptide (B. subtilis)

Page 238: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

238

6 Abkürzungsverzeichnis

Im Duden enthaltene Abkürzungen, Symbole chemischer Elemente, SI-Einheiten,

chemische und mathematische Formeln sowie Gen- und Proteinbezeichnungen

wurden nicht aufgeführt.

1D-Gel eindimensionale Gelelektrophorese

2D-Gel zweidimensionale Gelelektrophorese

AA Essigsäure

ACN Acetonitril

BMM Belitzky Minimalmedium

BOC Belitzky ohne Citrat

BY-Kinase bakterielle Tyrosinkinase

CDM chemisch definiertes Medium

CID "collision induced dissociation"

DHB Dihydroxybenzoesäure

DIGE "differential gel electrophoresis"

ECD "electron capture dissociation"

EK Endkonzentration

ERLIC Elektrostatische Repulsions - hydrophile Interaktionschromatographie

ESI "electrospray ionisation"

ETD "electron transfer dissociation"

GeLC-MS/MS "in-gel tryptic digestion followed by liquid chromatography-tandem mass

spectrometry"

FTICR "Fourier transform ion cyclotron resonance" Massenspektrometer

HCD "higher energy collision activated dissociation"

HILIC hydrophile Interaktionschromatographie

HPLC "high performance liquid chromatograph" (Hochleistungschromatographie)

IMAC "Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography"

IPG immobilisierter pH-Gradient

iTraQ "isobaric tags for relative and absolute quantitation"

LC "liquid chromatography" (Flüssigkeitschromatographie)

Page 239: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

6 Abkürzungsverzeichnis 239

LMWPTP "low molecular weight protein-tyrosine phosphatases"

LTQ "linear trap quadrupole" (lineare Ionenfalle)

MALDI "matrix assisted laser desorption/ionization" Massenspektrometer

MS Massenspektrometrie

MS/MS Tandem Massenspektrometrie

MSA "Multistage"-Aktivierung

MS-Analyse massenspektrometrische Analyse

NMR-Analyse "nuclear magnetic resonance"-Spektroskopie

OD optische Dichte

PAC Phosphoamidat-Chemie

PP2C "protein phosphatase 2C-family"

PPM "metal-dependent phosphatases"

PPP "phosphoprotein phosphatases"

p-Serin (pSer) phosphoryliertes Serin

P-Stelle Phosphorylierungsstelle

p-Threonin (pThr) phosphoryliertes Threonin

PTM posttranslationale Modifikationen

PTPs "protein tyrosine phosphatases"

PTS Phosphotransferasesystem

p-Tyrosin (pTyr) phosphoryliertes Tyrosin

RT Raumtemperatur

RT-PCR "Realtime"-Polymerasekettenreaktion

SCX "strong cation exchange chromatography"

SDS Natrium Dodecylsulfat

SDS-PAGE "sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis"

SILAC "stable isotope labeling of amino acids in cell culture"

TOF "time of flight" Massenspektrometer

ÜN über Nacht

UPLC "ultra performance liquid chromatography"

WT Wildtyp

Page 240: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

240

7 Publikationsverzeichnis

1) Dynamics of protein phosphorylation on Ser/Thr/Tyr in Bacillus subtilis. Eymann C, Becher D, Bernhardt J, Gronau K, Klutzny A, Hecker M. Proteomics. 2007 Oct; 7(19):3509-26. 2) Role of RsbU in controlling SigB activity in Staphylococcus aureus following alkaline stress. Pané-Farré J, Jonas B, Hardwick SW, Gronau K, Lewis RJ, Hecker M, Engelmann S. J. Bacteriol. 2009 Apr; 191(8):2561-73. 3) The stability of cytadherence proteins in Mycoplasma pneumoniae requires activity of the protein kinase PrkC. Schmidl SR, Gronau K, Hames C, Busse J, Becher D, Hecker M, Stülke J. Infect. Immun. 2010 Jan; 78(1):184-92. 4) The phosphoproteome of the minimal bacterium Mycoplasma pneumoniae: analysis of the complete known Ser/Thr kinome suggests the existence of novel kinases. Schmidl SR, Gronau K, Pietack N, Hecker M, Becher D, Stülke J. Mol. Cell. Proteomics. 2010 Jun; 9(6):1228-42. 5) Staphylococcal PknB as the first prokaryotic representative of the proline-directed kinases. Miller M, Donat S, Rakette S, Stehle T, Kouwen TR, Diks SH, Dreisbach A, Reilman E, Gronau K, Becher D, Peppelenbosch MP, van Dijl JM, Ohlsen K. PLoS One. 2010 Feb 4; 5(2):e9057. 6) The redox-sensing regulator YodB senses quinones and diamide via a thiol-disulfide switch in Bacillus subtilis. Chi BK, Albrecht D, Gronau K, Becher D, Hecker M, Antelmann H. Proteomics. 2010 Sep; 10(17):3155-64. 7) In vivo phosphorylation patterns of key stressosome proteins define a second feedback loop that limits activation of Bacillus subtilis σB. Eymann C, Schulz S, Gronau K, Becher D, Hecker M, Price CW. Mol. Microbiol. 2011 May; 80(3):798-810. 8) Activity control of the ClpC adaptor McsB in Bacillus subtilis. Elsholz AK, Hempel K, Michalik S, Gronau K, Becher D, Hecker M, Gerth U. J. Bacteriol. 2011 Aug; 193(15):3887-93.

Page 241: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

7 Publikationsverzeichnis 241

9) Surface shaving as a versatile tool to profile global interactions between human serum proteins and the Staphylococcus aureus cell surface. Dreisbach A, van der Kooi-Pol MM, Otto A, Gronau K, Bonarius HP, Westra H, Groen H, Becher D, Hecker M, van Dijl JM. Proteomics. 2011 Jul; 11(14):2921-30. 10) Involvement of protein acetylation in glucose-induced transcription of a stress-responsive promoter. Lima BP, Antelmann H, Gronau K, Chi BK, Becher D, Brinsmade SR, Wolfe AJ. Mol. Microbiol. 2011 Sep; 81(5):1190-204. 11) S-bacillithiolation protects against hypochlorite stress in Bacillus subtilis as revealed by transcriptomics and redox proteomics. Chi BK, Gronau K, Mäder U, Hessling B, Becher D, Antelmann H. Mol. Cell. Proteomics. 2011 Nov; 10(11):M111.009506. 12) Structural insights into the redox-switch mechanism of the MarR/DUF24-type regulator HypR. Palm GJ, Khanh Chi B, Waack P, Gronau K, Becher D, Albrecht D, Hinrichs W, Read RJ, Antelmann H. Nucleic Acids Res. 2012 May; 40(9):4178-92. 13) Global impact of protein arginine phosphorylation on the physiology of Bacillus subtilis. Elsholz AK, Turgay K, Michalik S, Hessling B, Gronau K, Oertel D, Mäder U, Bernhardt J, Becher D, Hecker M, Gerth U. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2012 May 8; 109(19):7451-6. 14) Inhibition of acetyl phosphate-dependent transcription by an acetylatable lysine on RNA polymerase. Lima BP, Huyen TT, Bäsell K, Becher D, Antelmann H, Wolfe AJ. J. Biol. Chem. 2012 Sep 14; 287(38):32147-60. 15) S-bacillithiolation protects conserved and essential proteins against hypochlorite stress in Firmicutes bacteria. Chi BK, Roberts AA, Huyen TT, Bäsell K, Becher D, Albrecht D, Hamilton CJ, Antelmann H. Antioxid. Redox Signal. 2012 Oct 18 (Epub ahead of print). 16) The phosphoproteome and its physiological dynamics in Staphylococcus aureus. Bäsell K, Otto A, Zühlke D, Rappen GM, Schmidt S, Hentschker C, Macek B, Ohlsen K, Hecker M, Becher D. J. Proteome. Res.: Status: eingereicht

Page 242: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

242

8 Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch-

Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch

einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht

wurde.

Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die

darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines

Dritten ohne Kennzeichnung übernommen habe.

Page 243: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

10 Danksagung 245

10 Danksagung

Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Michael Hecker, für

die Überlassung dieses interessanten und herausfordernden Themas, für die

Betreuung, für die Möglichkeit, ein weitreichendes Arsenal an unterschiedlichsten

Massenspektrometern nutzen zu können und für die Gelegenheiten an

verschiedensten Tagungen teilnehmen und die eigenen Daten präsentieren zu dürfen.

Frau PD Dr. Dörte Becher möchte ich ganz herzlich für die engagierte Betreuung und

Ihren Einsatz bei meiner Weiterbildung in die Funktionsweise verschiedenster

Massenspektrometer danken und für das mir entgegen gebrachte Vertrauen, mehrere

Diplomanden betreuen und in mehreren Kooperationen mitarbeiten zu dürfen.

Bei Dr. Andreas Otto möchte ich mich für seine tatkräftige Unterstützung bei der

Fertigstellung des S. aureus-Manuskriptes, für angeregte Diskussionen und für die

angenehme Zusammenarbeit bedanken.

Mein herzlicher Dank gilt Dr. Daniela Zühlke, die mich bei der Kultivierung von

S. aureus unterstützte, immer ein offenes Ohr für jegliche Art von Fragen gehabt hat

und dem Laboralltag eine freundliche Atmosphäre einhauchte. Ein zusätzliches

Dankeschön für jeden einzelnen "Bindestrich".

Gerd-Martin Rappen und Dr. Jan Muntel danke ich für die Unterstützung bei

MaxQuant und Census und für die kollegiale Arbeitsatmosphäre.

Ganz herzlich bedanke ich mich bei Sebastian Grund für seine technische

Unterstützung und für seine "sozialistische" Ader, dem "Gruppenkollektiv" eine

freundliche Atmosphäre zu verschaffen.

Den Diplomanden Sabrina Schmidt und Martin Zander danke für die Durchführung

praktischer Arbeiten.

Den Mitgliedern der MS-Gruppe, darunter Susann Meyer, danke ich für die lustige

Arbeitsatmosphäre und die stetige Diskussionsbereitschaft.

Page 244: Globale Phosphoproteomanalyse G ram-positiver Bakterien ... · multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase)

246

Ich danke allen Mitarbeitern des Instituts für Ihre Hilfsbereitschaft und das sehr

angenehme Arbeitsklima.

Prof. Dr. Lothar Jänsch und Dr. Josef Wissing aus Braunschweig möchte ich für die

Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Kinaseanreicherung bedanken.

Bei Prof. Boris Macek und seiner Gruppe in Tübingen bedanke ich mich dafür, dass ich

Einblick in ihre Arbeitsgruppe nehmen und von ihnen die Phosphopeptidanreicherung

lernen durfte.

Ich danke folgenden Kooperationspartnern:

- Dr. Christine Eymann und Dr. Jörg Bernhardt für die Zusammenarbeit

beim Phosphoproteom von B. subtilis

- Prof. Dr. Jörg Stülke und Dr. Sebastian Schmidl für die Zusammenarbeit

beim Phosphoproteom von M. pneumoniae

- Dr. Jan Pané-Farré für die Zusammenarbeit an dem RsbV-Protein von

S. aureus

- Dr. Alexander Elsholz und Dr. Ulf Gerth für die Zusammenarbeit bei den

Argininphosphorylierungen von B. subtilis

und allen weiteren Kooperationspartnern, darunter PD Dr. Haike Antelmann, für das

in mich gesetzte Vertrauen, ihre Proben massenspektrometrisch analysieren zu dürfen.

Ich danke meinem Lieblingsonkel Sönke, der nicht müde wurde, mich während dieser

Zeit zu unterstützen.

Ganz besonders innig und herzlich möchte ich meinem Vater, meiner Mutter und

meinem Bruder danken, die mir immer mit Rat und Tat zur Seite gestanden haben und

ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.

Zuletzt bedanke ich von ganzem Herzen bei meinem Mann Torsten für seine Liebe und

seine Unterstützung.