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Globale Phosphoproteomanalyse Gram-positiver Bakterien unter
besonderer Berücksichtigung regulatorischer Mechanismen
I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n
zur
Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
vorgelegt von
Katrin Bäsell, geb. Gronau
geboren am 21.02.1977
in Kiel
Greifswald, 19.11.2012
Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser
1. Gutachter: Prof. Dr. Michael Hecker
2. Gutachter: Prof. Dr. Dirk Bumann
Tag der Promotion: 27.03.2013
Inhalt
Zusammenfassung ........................................................................................................ 7
Summary ....................................................................................................................... 9
1 Einleitung ................................................................................................................ 11
1.1 Proteomic/Phosphoproteomic ....................................................................... 11
1.2 Das bakterielle Phosphoproteom ................................................................... 15
1.2.1 Bakterielle Proteinkinasen ........................................................................ 17
1.2.2 Bakterielle Proteinphosphatasen ............................................................. 19
1.2.3 Bacillus subtilis .......................................................................................... 20
1.2.4 Mycoplasma pneumoniae ......................................................................... 24
1.2.5 Staphylococcus aureus .............................................................................. 26
1.3 Methoden zur Analyse des bakteriellen Phosphoproteoms .......................... 28
1.3.1 Gelbasierte Techniken zur Analyse des Phosphoproteoms ..................... 29
1.3.2 Gelfreie Techniken zur Analyse des Phosphoproteoms ........................... 32
1.3.3 Die Rolle der Massenspektrometrie bei der Analyse des
Phosphoproteoms ................................................................................................... 36
1.3.4 Daten-Analyse ........................................................................................... 38
1.4 Quantifizierung des Phosphoproteoms .......................................................... 39
1.5 Zielstellung der Arbeit ..................................................................................... 40
2 Ergebnisse und Diskussion ...................................................................................... 42
2.1 Das Phosphoproteom von Bacillus subtilis ..................................................... 42
2.1.1 Optimierung der 2D-gelbasierten phosphosensitiven Pro-Q® Diamond
Färbemethode ........................................................................................................ 42
2.1.2 Verwendung der Gesamtproteinfärbung zur verbesserten Identifizierung
putativ phosphorylierter Proteine .......................................................................... 46
4
2.1.3 Verifizierung der Pro-Q-Färbung via alkalischer Phosphatase von E. coli
und radioaktiver Markierung mit 33P ...................................................................... 51
2.1.4 Identifizierung von Pro-Q-gefärbten Proteinen aus dem 2D-Gel ............. 55
2.1.5 Dynamik des Phosphoproteoms unter veränderten physiologischen
Bedingungen ............................................................................................................ 62
2.1.6 Untersuchung des Phosphoproteoms einer B. subtilis sigB-Mutante ...... 67
2.1.7 Phosphotyrosin-Detektion via 2D-Westernblot ........................................ 73
2.1.8 Anreicherung von Proteinkinasen mittels Kinaseinhibitoren ................... 75
2.2 Das Phosphoproteom von Staphylococcus aureus ......................................... 82
2.2.1 Identifizierung der P-Stelle von RsbV aus S. aureus via "negative-mode"
an der Q-Trap4000 .................................................................................................. 82
2.2.2 Globale Analysen zum Phosphoproteom von S. aureus ........................... 85
2.2.2.1 2D-gelbasierte Analyse des Phosphoproteoms von S. aureus .......... 85
2.2.2.2 Analyse des Phosphoproteoms von S. aureus via gelfreier
Phosphopeptidanreicherungstechnik ................................................................. 91
2.2.2.3 Vergleich der Resultate aus den gelbasierten und gelfreien
Phosphoproteom-Analysemethoden .................................................................. 98
2.2.2.4 Funktionelle Einordnung der identifizierten phosphorylierten
Proteine .......................................................................................................... 102
2.2.2.5 Infektionsrelevante Phosphorylierungsereignisse ........................... 106
2.2.2.5.1 Enzyme des Metabolismus .......................................................... 106
2.2.2.5.2 Enzyme der Proteolyse ................................................................ 113
2.2.2.5.3 Virulenzregulatoren ..................................................................... 114
2.2.2.6 Zielproteine der Serin/Threoninkinase PknB ................................... 116
2.2.2.7 Dynamic des Phosphoproteoms unter veränderten physiologischen
Bedingungen ...................................................................................................... 119
2.2.2.7.1 Glukosehunger ............................................................................ 121
Inhalt 5
2.2.2.7.2 Stressinduktion durch Stickstoffmonoxid ................................... 130
2.2.2.7.3 Stressinduktion durch Diamid ..................................................... 135
2.2.2.7.4 Stressinduktion durch Natriumchlorid (osmotischer Stress) ...... 136
2.3 gelbasierte Quantifizierung des Phosphoproteoms von B. subtilis via
metabolischer 14N/15N-Markierung .......................................................................... 137
2.4 Analyse von Argininphosphorylierungen in Bacillus subtilis ........................ 145
2.5 Zusammenfassung und Ausblick ................................................................... 153
3 Material und Methoden ....................................................................................... 159
3.1 Materialien .................................................................................................... 159
3.1.1 Bakterienstämme .................................................................................... 159
3.1.2 Medien und Medienzusätze ................................................................... 159
3.1.3 Antikörper, Beads, Säulenmaterialien .................................................... 163
3.1.4 Antibiotika und Enzyme .......................................................................... 163
3.1.5 Chemikalien und Lösungsmittel .............................................................. 164
3.2 Methoden ..................................................................................................... 166
3.2.1 Stammhaltung ......................................................................................... 166
3.2.2 Proteinextraktgewinnung ....................................................................... 167
3.2.2.1 Zellkultivierung ................................................................................ 167
3.2.2.2 Zellaufschluss ................................................................................... 171
3.2.3 Methoden zur Proteinanalyse ................................................................ 172
3.2.3.1 Proteinbestimmung nach Bradford ................................................. 172
3.2.3.2 Verdau des Proteinextraktes mit alkalischer Phosphatase ............. 173
3.2.3.3 Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) ... 173
3.2.3.4 Färbemethoden für Proteine im 2D-Gel ......................................... 176
3.2.3.4.1 Phosphoproteinfärbung im 2D-Gel mit Pro-Q® Diamond ........... 176
3.2.3.4.2 Gesamtproteinfärbung im 2D-Gel mit Flamingo™ ..................... 177
6
3.2.3.4.3 Gesamtproteinfärbung im 2D-Gel mit Deep Purple™ ................. 177
3.2.3.4.4 Colloidal Coomassie/ Coomassie "blue silver" ............................ 178
3.2.3.4.5 Gesamtproteinfärbung im 2D-Gel mit Silbernitrat ..................... 179
3.2.3.5 2D-Gel Westernblot mit Phospo-Tyrosin-Antikörper (P-Tyr-100) ... 180
3.2.3.6 Bildananalyse der gefärbten 2D-Gele .............................................. 182
3.2.4 Anreicherung von Proteinkinasen mittels eukaryotischen
Kinaseinhibitoren .................................................................................................. 182
3.2.5 Phosphopeptidanreicherung ................................................................... 183
3.2.5.1 Kationenaustauschchromatographie (SCX-Chromatographie) ....... 184
3.2.5.2 TiO2-Phosphopeptidanreicherung ................................................... 185
3.2.5.3 TiO2-Anreicherung: Peptide mit Argininphosphorylierungen ......... 186
3.2.6 Massenspektrometrische Analyse der Phosphoproteine ....................... 187
3.2.6.1 nanoHPLC-ESI-LTQ-FT-ICR-MS ......................................................... 187
3.2.6.2 nanoHPLC-ESI-Qtrap-MS .................................................................. 188
3.2.6.3 nanoHPLC-ESI-LTQ-OrbitrapXL-MS .................................................. 191
3.2.6.4 nanoHPLC-ESI-LTQ-Orbitrap-Velos-MS ............................................ 194
3.2.7 Quantifizierung der MS-Daten (metabolischer Markierungsansatz) mittels
Census ................................................................................................................. 197
4 Literaturverzeichnis ............................................................................................... 200
5 Anhangsübersicht .................................................................................................. 237
6 Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................... 238
7 Publikationsverzeichnis ......................................................................................... 240
8 Erklärung ............................................................................................................... 242
9 Lebenslauf ............................................................................................................. 243
10 Danksagung ........................................................................................................... 245
Zusammenfassung 7
Zusammenfassung
Die Analyse bakterieller Phosphoproteome rückt durch die Einflussnahme von
Phosphorylierungsereignissen im Virulenzgeschehen pathogener Mikroorganismen
immer weiter in den Vordergrund.
Der Fokus dieser Arbeit lag auf der globalen Analyse bakterieller Phosphoproteome
unter Anwendung verschiedener Techniken der Proteomforschung. Ziel war es, einen
möglichst umfassenden Überblick über das cytosolische Phosphoproteom zu
gewinnen, die Dynamik der Protein-Phosphorylierungen unter verschiedenen
physiologischen Bedingungen zu analysieren und daraus folgend Hinweise auf
regulatorische Mechanismen zu erhalten. Im Zuge der Untersuchungen zum
Phosphoproteom von Bacillus subtilis wurde das auf den phosphosensitiven Pro-Q®
Diamond-Farbstoff basierende 2D-Gel-Färbeprotokoll optimiert und validiert. Ferner
wurde dieses Protokoll erfolgreich für die Untersuchungen des Phosphoproteoms von
Mycoplasma pneumoniae und Staphylococcus aureus eingesetzt. Durch die Etablierung
einer Methode zur Phosphopeptidanreicherung konnte der Blick auf das
Gesamtphosphoproteom von S. aureus komplementiert werden. Insgesamt war es
dadurch möglich, 103 phosphorylierte Proteine und 68 verschiedene
Phosphorylierungsstellen von S. aureus zu identifizieren, darunter z. B. den
Virulenzregulator SarA, dessen Phosphorylierung einen Hinweis auf seine mögliche
Regulation aufzeigt. Zusätzlich konnten die Phosphorylierungsergebnisse der Fruktose-
1,6-Bisphosphataldolase erste Hinweise auf eine Regulation der Substratbindung
liefern und einen Erklärungsansatz enstehen lassen, der die Wirkungslosigkeit einiger
in der Literatur beschriebenen Enzyminhibitoren (potentielle antimikrobielle
Wirkstoffe) in in vivo Studien darlegt.
In einem auf der Pro-Q® Diamond-Färbung beruhenden Quantifizierungsansatz
konnten 10 signifikante Veränderungen in der Signalintensität der phosphorylierten
Proteine unter Glukosehunger, nitrosativem, oxidativem und osmotischem Stress
festgestellt werden. Diese liefern erste Indizien auf durch Phosphorylierungsereignisse
gesteuerte Regulationsmechanismen. Besonders die unter nitrosativen Stress neu
auftretenden putativ phosphorylierten Proteinspots der Proteine FdaB (Fruktose-
Bisphosphataldolase) und HchA (molekulares Chaperon Hsp31/Glyoxalase 3) lassen
8
Spekulationen über neue Stoffwechselwege, wie z. B. einen Methylglyoxal
detoxifizierenden Mechanismus, zu. Darüber hinaus konnten durch die
Glukosehungerexperimente und die Spezifizierung der Phosphorylierungsstelle T537
der Pyruvatkinase von S. aureus ein Regulationsmechanismus vorgeschlagen werden,
der das "Finetuning" des Energieladungszustandes der Zelle über einen
Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsmechanismus beschreibt.
Von weiterem Interesse war die Identifizierung von am Arginin phosphorylierten
Peptiden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde hierfür das Phosphopeptid-
anreicherungsprotokoll optimiert, so dass in Zusammenarbeit mit A. Elsholz (Inst. f.
Mikrobiologie, EMAU Greifswald) die Identifizierung von phosphorylierten
Argininresten der Argininkinase McsB und der ATPase ClpC in B. subtilis möglich
wurde. Darüber hinaus wurde die Methode in globalen Untersuchungen einer
Phosphatasemutante (∆ywlE, B. subtilis) angewandt. Mittels der im Rahmen dieser
Arbeit durchgeführten massenspektrometrischen Analyse der angereicherten Peptide
konnten 111 Arginin-Phosphorylierungsstellen identifiziert werden.
Zur Verbesserung der Quantifizierung von phosphorylierten Proteinen in B. subtilis
wurde ein Protokoll entwickelt, indem das Auftrennungspotential des 2D-Gels, die
Identifizierung phosphorylierter Proteine anhand des Pro-Q® Diamond-Farbstoffs und
die auf die metabolische Markierung beruhende Quantifizierung miteinander
kombiniert wurde. Im Ergebnis konnte anhand dieser Methode eine bessere
Reproduzierbarkeit und eine höhere Sensitivität bei geringeren Veränderungen im
Vergleich zu dem Pro-Q® Diamond basierten Quantifizierungsansatz erzielt werden.
Zusammenfassung 9
Summary
Analysis of bacterial phosphoproteomes becomes an increasing importance due to the
influence of phosphorylation events during virulence of pathogenic microorganisms.
The thesis presented here focuses on the global analysis of bacterial
phosphoproteomes using different proteomic technologies. It was conducted in order
to characterize phosphorylated proteins comprehensively, to investigate their
dynamics under different physiological conditions and to obtain first insights in
regulatory mechanisms.
Therefore a 2D-gel protocol, based on the phosphosensitive stain Pro-Q Diamond, was
optimized, validated and first applied for the analysis of the phosphoproteome of
Bacillus subtilis. In the following work the resulting protocol was also applied for the
investigation of the phosphoproteomes of the human pathogens Mycoplasma
pneumoniae and Staphylococcus aureus.
The establishment of the phosphopeptide enrichment protocol according to Olsen and
Macek completed the analysis of the phosphoproteome of S. aureus. 103
phosphorylated proteins and 68 different phosphorylation sites from S. aureus were
identified including two phosphosites in the virulence regulator SarA. The
phosphorylation events of SarA provide a first hint of its putative control mechanism
similar to that of the transcriptional regulator MgrA. Additionally, the identification of
multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein
(fructose-1,6-bisphosphate aldolase) indicate an active regulation of the substrate
binding. These findings provide first possible explanations for the inefficacy of
substrate-analog FbaA-inhibitors in in vivo analysis experiments.
By quantitation of signal intensities of phosphorylated proteins on 2D-gels, we
observed 10 significant changes during glucose starvation, nitrosative, oxidative and
osmotic stress conditions. Especially, the appearance of two newly phosphorylated
isoforms of FdaB (fructose-bisphosphate aldolase) and HchA (molecular chaperone
Hsp31/glyoxalase 3) may lead to a suggestion of new metabolic pathways such as a
methylglyoxal detoxifying mechanism. Furthermore, due to the identification of the
10
phosphorylation site T537 of Pyk (pyruvate kinase) it was possible to propose a fine
tuning mechanism in dependency of the energy charge state of the cell.
Of special interest was the identification of arginine phosphorylated peptides in
B. subtilis. Consequently, the phosphopeptide enrichment protocol was optimized. In
cooperation with A. Elsholz (Inst. f. Microbiology, EMAU Greifswald) it was possible to
identify arginine phosphorylation sites in McsB (arginine kinase) and ClpC (ATPase). On
the base of a global phosphatase mutante analysis (ΔywlE) 111 arginine
phosphorylated peptides were identified via mass spectrometry using the optimized
enrichment protocol. To enhance the quality of quantitation of phosphorylated
proteins a protocol was developed in which the potential of the 2D-gel
(protein/-isoform separation), the identification of phosphorylated proteins via Pro-Q
Diamond, and the quantitation via metabolic labeling were combined. In the result an
improved reproducibility and a higher sensitivity compared to the gel-based approach
were reached.
1 Einleitung
1.1 Proteomic/Phosphoproteomic
Ähnlich dem Bauplan einer Fabrik liefert die Genomsequenz den Bauplan des Lebens
mit all seinen in der Theorie verhafteten Möglichkeiten. Der Drang, Leben zu
verstehen, entfachte in den 90er Jahren ein Wettrennen um die vollständigen
Sequenzierungen der Genome von Organismen, einschließlich dem des Menschen
(Venter u. a., 2001). 1995 wurde die erste komplette Sequenzierung des bakteriellen
Genoms von Haemophilus influenzae publiziert (Fleischmann u. a., 1995). Die Euphorie
der ersten Stunde verflog, als klar wurde, dass die Genomsequenzierung nur einen
statischen Bauplan liefern kann, jedoch keine Hinweise auf das reale Geschehen im
Organismus liefert. Die Suche nach den wirklichen Abläufen führte zur Entwicklung der
funktionellen Genomforschung, die beispielsweise mithilfe von Transkriptomanalysen,
die aktuell exprimierten Gene entschlüsselt (Harrington u. a., 2000; Ito & Sakaki, 1996).
Erst mit der Analyse der „aktiven Genprodukte“, nämlich der Proteine, wurde der
Genomsequenz "Leben eingehaucht" (Hecker, 2003), da die Proteine, die
Hauptdarsteller im Zellgeschehen, für alle zellulären Prozesse und insbesondere für
Regulationsmechanismen in Bezug auf sich wechselnde Umweltbedingungen, die dem
Organismus unter verschiedensten Bedingungen das Überleben sichern,
verantwortlich sind.
Die Proteomic beschäftigt sich mit der Analyse des exprimierten Proteinkomplementes
des Genoms einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus, dem Proteom. Der
Begriff des Proteoms und des dahinterstehenden Konzepts wurde erstmals von Marc
Wilkins (Macquarie Universität in Sydney, Australien) definiert (Cordwell u. a., 1995;
Wasinger u. a., 1995; Wilkins u. a., 1996a, 1996b). Die erste Generation der
Proteomforscher befasste sich mit dem Auffinden von Proteinen, deren An- und
Abwesenheit sowie deren Identifikation. Hierbei wurden die Veränderungen im
Proteom mittels der 2D-Gelelektrophorese (Klose, 1975; O’Farrell, 1975), mit der seit
den 70er Jahren eine große Anzahl von Proteinen getrennt und katalogisiert wurden,
12
visuell dargestellt. Damals erfolgte die Identifizierung der Proteine größtenteils mit
Hilfe der sehr zeitintensiven Edmann-Sequenzierung (Aebersold u. a., 1987; Edman,
1949). In einem automatisierten Ansatz konnte dann Ende der 80er Jahre die
Sequenzierungszeit für eine Aminosäure auf ca. eine Stunde reduziert werden
(Matsudaira, 1987). Durch die immer größer werdende Zahl an kompletten
Genomsequenzen und dem erhöhten Bedarf an Proteinsequenzierungen stieß die
Edmann-Sequenzierung mit ihrem beträchtlichen Zeitbedarf und ihrer relativ geringen
Sensitivität an ihre Grenzen.
Der große Durchbruch gelang Ende der 80er/Anfang der 90er Jahre mit der
Realisierung der analytischen Massenspektrometrie für biologische Moleküle, die die
Edmann- Sequenzierung ablöste. Die Entwicklung der weichen Ionisierungstechniken
ESI und MALDI (electrospray ionisation/matrix assisted laser desorption/ionization)
ermöglichte es, Peptidmassen sensitiv und im Hochdurchsatz zu bestimmen (Fenn u.
a., 1989; Karas & Hillenkamp, 1988). Diese Peptidmassen, in Verbindung mit den aus
der Nukleotidsequenzierung hervorgegangenen Datenbanken, wurden zur
Proteinidentifizierung herangezogen. 1993 fand mehrmals unabhängig voneinander
die Entwicklung des Algorithmus des "peptide-mass fingerprinting" statt (Henzel u. a.,
1993; James u. a., 1993; Mann u. a., 1993; Pappin u. a., 1993; Yates u. a., 1993). Mit
diesem wird eine Korrelation zwischen den Daten der massenspektrometrischen
Analyse (Peptidmasse, Fragmentionenmuster) und denen aus der Proteindatenbank
theoretisch errechneten hergestellt, die Peptidsequenz ermittelt und somit das
Peptid/Protein identifiziert.
Die Identifizierung der Proteine anhand der massenspektrometrischen Analyse und die
Detektion von dynamischen Veränderungen des Proteinmusters im 2D-Gel unter
verschiedenen Bedingungen liefern Erkenntnisse über die Funktionalität der Proteine,
die zur Aufklärung biologischer Prozesse führen. Die Anpassungsreaktionen eines
Organismus spiegeln sich in der Dynamik der verhältnismäßigen und inhaltlichen
Zusammensetzung des Proteoms wider.
Die große Herausforderung in der Proteomforschung liegt in der enormen chemischen
Diversität und der divergenten Synthese der Proteine in der Zelle. Eine weitere
Schwierigkeit besteht in der dynamischen Bandbreite der Proteinmengenverteilung,
1 Einleitung 13
die einen Faktor von 105-106 aufweist und somit weit außerhalb des Bereiches eines
2D-Gels avanciert (Rabilloud, 2002). Mit der Entwicklung Massenspektrometrie-
basierter, gelfreier Techniken, wie z. B. der GeLC-MS/MS, konnte der analytische
Bereich enorm vergrößert werden, so dass für S. aureus nahezu Dreiviertel und für
B. subtilis mehr als die Hälfte des vorhergesagten Proteoms detektiert und quantifiziert
werden konnten (Becher u. a., 2009, 2011).
Im Zuge des technologischen Fortschrittes hat sich auch die Proteomic
weiterentwickelt. Durch immer sensitivere und akkuratere Techniken konnten neue
Gebiete erschlossen werden, wie z. B. die der posttranslationalen Modifikationen, der
Protein-Protein-Interaktionen, der Proteinstabilitäten und der Strukturaufklärung
(Patterson & Aebersold, 2003).
Besonders die posttranslationalen Modifikationen (PTM) üben einen
bemerkenswerten Einfluss auf die Aktivität, Stabilität und Lokalisierung der Proteine
aus und beeinflussen somit regulatorische Prozesse (Pandey & Mann, 2000). Die
bedeutendsten PTMs stellen Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsereignisse
dar, denen eine Schlüsselrolle in regulatorischen Netzwerken und in der
Signaltransduktion zukommt (Casino u. a., 2010; Deutscher u. a., 2006; Hancock &
Perego, 2002; Hecker u. a., 2007). Durch den Einfluss der zusätzlich eingeführten
negativen Ladung oder Ladungen wird die Proteinstruktur in der Weise verändert, dass
dies eine Aktivierung, Inaktivierung oder Degradation des Enzyms zur Folge haben
kann (Johnson & Barford, 1993).
Zusätzlich beeinflusst sie die Möglichkeit von Protein-Protein-Interaktionen, als auch
die Proteinlokalisation selbst und stellt somit ein entscheidendes regulatorisches
Schaltwerkzeug der Zelle dar (Jers u. a., 2010; Mann & Jensen, 2003). Durch diese
Vielgestaltigkeit ist die Phosphorylierung ein wichtiges Werkzeug in verschiedenen
physiologischen Prozessen wie z. B. der Stressantwort, dem Glukosemetabolismus,
dem Zellwachstum, der Sporulation und der Biofilmbildung (Eymann u. a., 2007;
Hecker u. a., 2007; Iber u. a., 2006; Kiley & Stanley-Wall, 2010; Macek u. a., 2007;
Madec u. a., 2002). Außerdem konnte gezeigt werden, dass
Phosphorylierungsereignisse im Infektionsverlauf pathogener Mikroorganismen eine
wichtige Rolle spielen, wie z. B. bei der Adhäsion an die Wirtszelle, der Regulation von
14
Pathogenitätsfaktoren oder der Beeinflussung der Wirtsabwehr (Chao u. a., 2010;
Schmidl u. a., 2010a,b; Sun u. a., 2012).
Bis heute sind Phosphorylierungen an neun verschiedenen Aminosäuren bekannt und
lassen sich in vier verschiedene Gruppen einteilen.
A) Die O-Phosphate (Phosphatester) entstehen durch die Phosphorylierung der
Hydroxylgruppe am Serin, Threonin und Tyrosin.
B) Die N-Phosphate (Phosphoamidate) werden durch die Phosphorylierung der
Aminogruppe von Arginin, Lysin und Histidin gebildet.
C) Die S-Phosphorylierungen bzw. Phosphatthioester werden durch die
Phosphorylierung der SH-Gruppe des Cysteins hervorgerufen und
D) die Acylphosphorylierung (Acylphosphat/gemischtes Anhydrid) entsteht durch die
Phosphorylierung der Carboxylgruppe der Asparaginsäure oder der Glutaminsäure
(Martensen, 1984; Matthews, 1995; Sickmann & Meyer, 2001).
Die unterschiedlichen Phosphorylierungen differieren nicht nur in dem jeweiligen
modifizierten Atom, sondern auch in der daraus resultierenden chemischen Stabilität.
Die Phosphatester verhalten sich unter sauren Bedingungen, die bei den üblichen
Probenaufbereitungsverfahren und Proteomanalysemethoden gebräuchlich sind,
stabil (Martensen, 1984). Im Gegensatz dazu stehen die Phosphoamidate, wie z. B. die
Argininphosphorylierungen, die unter neutralen Bedingungen stabil vorliegen, jedoch
unter zunehmendem sauren pH-Wert einer sauren Hydrolyse unterliegen. Sie
entziehen sich somit weitestgehend den normalen Standardanalysen (Sickmann &
Meyer, 2001).
Die erste Identifizierung eines Phosphats in einem Protein fand vor 106 Jahren statt
(Levene & Alsberg, 1906). 27 Jahre später, 1933, wurde die dazugehörige
phosphorylierte Aminosäure identifiziert (Lipmann & Levene, 1932). Es dauerte jedoch
weitere 21 Jahre, bis die erste enzymatische Proteinphosphorylierung gezeigt werden
konnte. Hierbei wurde in vitro eine Serinphosphorylierung am Casein durch Zugabe
von radioaktivem ATP und Zugabe einer aus dem Lebermitochondrium isolierten
Kinase ausgelöst und nachgewiesen (Burnett & Kennedy, 1954). 1955 konnte die erste
am Serin phosphorylierte Phosphorylase identifiziert werden, die unter Zugabe von
Muskelextrakt und ATP in eine aktive Form übergeht und Glycogen zu
1 Einleitung 15
Glukose-1-Phosphat degradiert (Fischer & Krebs, 1955). Der umgekehrte
Mechanismus, die Inaktivierung durch Dephosphorylierung konnte ebenfalls gezeigt
werden (Sutherland & Wosilait, 1955). Hiermit wurde erstmals die Regulierung der
Enzymaktivität über einen Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsmechanismus
beschrieben. Edwin G. Fischer und Edmund H. Krebs erhielten: "for their discoveries
concerning reversible protein phosphorylation as a biological regulatory mechanism"
1992 den Nobelpreis für Physiologie bzw. Medizin.
Lange Zeit wurde angenommen, dass die Phosphatester sich auf das eukaryotische
Reich beschränken, da bis dato in Bakterien keine Serin-, Threonin- und Tyrosin-
Phosphorylierungen nachgewiesen werden konnten und in Eukaryoten 30 % aller
zellulären Proteine als phosphoryliert detektiert wurden (Pawson & Scott, 2005;
Ubersax & Ferrell, 2007). Es bestand die weitläufige Meinung, dass anstelle der
Phosphatester in der bakteriellen Signaltransduktion ausschließlich Phosphoamidate
bzw. Acylphosphate zur Anwendung kommen (Hoch, 2000; Mitrophanov & Groisman,
2008; Stock u. a., 1990). In den zur bakteriellen Signaltransduktion gehörenden
Zweikomponentensystemen findet eine Autophosphorylierung im Zuge der
Signalerkennung der Sensorkinase statt. Durch die Phosphatübertragung auf den
Responseregulator wird die zelluläre Antwort ausgelöst, indem z. B. durch DNA-
Bindung die Transkription bestimmter Gene reguliert wird (Stock u. a., 1990).
Diese Unterteilung der verschiedenen Phosphorylierungsarten auf die Eukaryoten und
Prokaryoten wurde im Laufe der Zeit mit der Entwicklung immer besserer Techniken
und optimierten Methoden grundlegend widerlegt.
1.2 Das bakterielle Phosphoproteom
Im Jahre 1979, 24 Jahre nach dem Auffinden der ersten enzymatischen
Phosphorylierungsreaktion, wurde das erste O-phosphorylierte bakterielle Enzym, die
Isocitratdehydrogenase von Escherichia coli, als Substrat einer Proteinkinase detektiert
(Garnak & Reeves, 1979). Garnak und Mitarbeiter beschrieben die in vivo
Phosphorylierung der Isocitratdehydrogenase während der Anpassung des Bakteriums
an die Nutzung von Acetat mittels radioaktivem Puls-Chase Experiment. Die für diese
16
Reaktionen verantwortliche Kinase und Phosphatase wurde im Jahre 1985 von LaPorte
und Chung näher beschrieben (LaPorte & Chung, 1985). Diese Ergebnisse resultierten
in einem Umdenken in der bakteriellen Phosphoproteomforschung und in einer
vermehrten Analyse von Serin-, Threonin- und Tyrosin-Phosphorylierungsreaktionen.
1983 wurde ein weiteres wichtiges, am Serin phosphoryliertes bakterielles Protein
identifiziert, das Phosphattransportprotein Hpr des Phosphotransferasesystems von
Streptococcus pyogenes (Deutscher & Saier, 1983).
Die ersten globalen Untersuchungen zum bakteriellen Phosphoproteom entstanden
1986. Cortay und Mitarbeiter analysierten mittels radioaktiver 32P-Markierung in
Verbindung mit einem 2D-gel basierten Ansatz das Phosphoproteom von E. coli unter
verschiedenen Wachstumsbedingungen und Stressfaktoren (Cortay u. a., 1986). Sie
untersuchten die jeweils phosphorylierte Aminosäure und entdeckten die erste
bakterielle Phosphorylierung an einem Tyrosinrest. Die Ergebnisse beinhalteten jedoch
keine Identifizierung der phosphorylierten Proteine sowie keine Spezifizierung der
Phosphorylierungsstelle, so dass die phosphorylierten Proteine nur aufgrund ihrer
molekularen Masse und ihres isoelektrischen Punktes katalogisiert werden konnten
(Cortay u. a., 1986).
Durch den rasanten technologischen Fortschritt, besonders bei der
massenspektrometrischen Analyse von Proteinen und der Entwicklung eines phospho-
sensitiven Farbstoffes, konnten in 2D-gelbasierten Phosphoproteomuntersuchungen
die phosphorylierten Proteine identifiziert und die spezifische phosphorylierte
Aminosäure detektiert werden (Eymann u. a., 2007; Lévine u. a., 2006; Lomas-Lopez u.
a., 2007; Schmidl u. a., 2010a). 2004 wurde damit begonnen, gelfreie
Phosphoproteomanalysen durchzuführen, in denen Phosphopeptide aus einem
komplexen Peptidgemisch mit Hilfe von Kationenaustauschchromatographie und
Titandioxid angereichert und massenspektrometrisch analysiert wurden (Pinkse u. a.,
2004). Bis heute wurden mit dieser Methode zahlreiche bakterielle Phosphoproteome
katalogisiert, so z. B. für B. subtilis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Lactococcus lactis,
Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas spec.,
Streptococcus pneumoniae und Streptomyces (Lin u. a., 2009; Macek u. a., 2007, 2008;
1 Einleitung 17
Manteca u. a., 2011; Misra u. a., 2011; Parker u. a., 2010; Prisic u. a., 2010;
Ravichandran u. a., 2009; Soufi u. a., 2008; Sun u. a., 2010).
1.2.1 Bakterielle Proteinkinasen
Eine wichtige Entdeckung gelang mit der Aufreinigung der ersten bakteriellen,
autophosphorylierenden Protein-Tyrosinkinase von Acinetobacter johnsonii durch
Antiphosphotyrosin-Immunochromatographie (Duclos u. a., 1996).
Im Laufe der Zeit konnten weitere bakterielle Kinasen, ihre Antagonisten die
Phosphatasen und ihre Substrate identifiziert und charakterisiert werden.
Aufgrund ihrer Ähnlichkeiten zu den eukaryotischen Kinasen und ihren
Substratspezifitäten werden die bakteriellen Kinasen in verschiedene Gruppen
eingeteilt. Eine Gruppe umfasst die Serin- und Threoninkinasen, die den
eukaryotischen Hanks-Kinasen ähneln. Die Hanks-Kinasen wurden durch Hanks und
Mitarbeiter nach ihren katalytischen Domänen, in denen 12 konservierte Subdomänen
auftreten, klassifiziert (Hanks u. a., 1988). Diese Subdomänen formen gemeinsam
durch spezielle Faltung den katalytischen Kern der Kinase (Hanks & Hunter, 1995). Die
erste bakterielle Hanks-ähnliche Kinase wurde in Myxococcus xanthus identifiziert
(Pkn1) (Muñoz-Dorado u. a., 1991). Später konnte gezeigt werden, dass das Bakterium
eine Kaskade von Hanks-ähnlichen Kinasen in Verbindung mit einem Prokaryoten
typischen His-Asp-Phosphorelay-System zur Regulation der Fruchtkörperbildung
einsetzt (Lux & Shi, 2005; Nariya & Inouye, 2005). Des Weiteren konnten für bakterielle
Hanks-ähnliche Kinasen auch "house-keeping"-Funktionen detektiert werden, darunter
z. B. Funktionen im Zellwandaufbau und im Zellzyklus (Kang u. a., 2005; Pietack u. a.,
2010; Shah u. a., 2008).
Hanks-ähnliche Kinasen wurden ebenfalls in humanpathogenen Bakterien identifiziert
und spielen dort oftmals eine wichtige Rolle in der bakteriellen Pathogenität/Virulenz
(Echenique u. a., 2004; Faucher u. a., 2008; Miller u. a., 2010). Ein bekanntes Beispiel
ist die sekretierte Kinase YpkA von Yersinia pestis. Diese beschädigt das Cytoskelett der
Wirtszelle und unterstützt durch einen bislang unbekannten Mechanismus die
18
Replikation und das Überleben des Bakteriums (Galyov u. a., 1993; Juris u. a., 2000;
Wiley u. a., 2009; Yang u. a., 2011).
Ein Überblick über die bisher sequenzierten bakteriellen Genome zeigt, dass die Hanks-
ähnlichen Kinasen eine weite Verbreitung aufweisen, da nur sieben Genome keine
Hanks-ähnliche Kinase codieren (Mijakovic & Macek, 2012). In Bakterien zeigen sie
eine relative Unspezifität und phosphorylieren eine große Gruppe unterschiedlichster
Enzyme (Absalon u. a., 2009; Lomas-Lopez u. a., 2007; Pietack u. a., 2010).
Eine weitere wichtige Gruppe von bakteriellen Serin- und Threoninkinasen befasst sich
mit den Hanks-unähnlichen Kinasen, die keine Ähnlichkeit zu den eukaryotischen
Proteinkinasen aufweisen. Unter diesen befinden sich z. B. die Hpr-Kinase und
verschiedene Anti-Sigmafaktoren; letztere sind in der Regulation Stress bedingter
Antworten, wie z. B. der generellen Stressantwort oder Sporulation beteiligt (Carniol
u. a., 2004; Deutscher & Saier, 1983; Hecker u. a., 2007; Price u. a., 2001).
Bakterielle Proteintyrosinkinasen (PTKs/BY-Kinasen) unterscheiden sich von den
eukaryotischen durch ein ATP/GTP-Walkerbindemotif im aktiven Zentrum (Mijakovic u.
a., 2003). In Bezug auf die Zelllokalisation und Struktur wird zwischen PTKs von
Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien unterschieden. In Gram-negativen
Bakterien liegt die Kinase als Membran-spannendes Multidomänenprotein vor. In
Gram-positiven Bakterien besteht die Kinaseeinheit aus zwei getrennt vorliegenden
Proteinen. Das eine Protein ist in die Membran integriert und interagiert mit dem
zweiten cytosolisch vorliegenden Protein, das die Autophosphorylierungsdomäne
aufweist (Grangeasse u. a., 2007; Jadeau u. a., 2008; Mijakovic u. a., 2003; Niemeyer &
Becker, 2001). PTKs besitzen die Fähigkeit zur Autophosphorylierung und sind in
Verbindung mit den korrespondierenden Proteintyrosinphosphatasen an der
Regulation verschiedener Prozesse wie der kapsulären Polysaccharidsynthese,
Zellzykluskontrolle oder an der zellulären Lokalisation ihrer Proteintargets beteiligt
(Grangeasse u. a., 2007; Jers u. a., 2010; Petranovic u. a., 2007; Vincent u. a., 2000).
Kürzlich wurde die erste prokaryotische Argininkinase in B. subtilis identifiziert
(Fuhrmann u. a., 2009). Es wurde gezeigt, dass neben
Autophosphorylierungsreaktionen unter Hitzestress, der Repressor der
Hitzeschockantwort CtsR als Zielprotein der Kinase fungiert (Elsholz u. a., 2010;
1 Einleitung 19
Fuhrmann u. a., 2009) und dass Argininphosphorylierungsreaktionen in Verbindung mit
der Dephosphorylierung durch eine Argininphosphatase einen sensitiven
Regulationsmechanismus in B. subtilis darstellen und somit eine bedeutende
physiologische Relevanz besitzen können (Elsholz u. a., 2012).
1.2.2 Bakterielle Proteinphosphatasen
Die Proteinphosphatasen stellen die Antagonisten der Proteinkinasen dar. Sie werden
in vier verschiedene Hauptklassen eingeteilt, in die konventionellen
Proteinphosphatasen PTPs ("protein tyrosine phosphatases"), die PPP
("phosphoprotein phosphatases"), die PPM ("metal-dependent phosphatases") und
die LMWPTP ("low molecular weight protein-tyrosine phosphatases") und zeigen eine
starke Ähnlichkeit zu den aus Eukaryoten bekannten Phosphatasen (Kennelly & Potts,
1999; Kennelly, 2002). Innerhalb der PPM-Phosphatasen bilden die PP2C-
Phosphatasen ("protein phosphatase 2C-family") die größte Gruppe. Ihr
charakteristisches Merkmal sind 11 konservierte Motive und eine Mg2+- oder Mn2+-
abhängige Phosphataseaktivität an Phosphoserin- und Phosphothreoninresten (Bork u.
a., 1996; Das u. a., 1996). Vertreter dieser Phosphatasen finden sich z. B. in dem
Regulationsmechanismus der generellen Stressantwort von B. subtilis (Yang u. a.,
1996) sowie in der Kontrolle des Phosphorylierungsstatus des Enzyms HPr
("phosphocarrier protein") in Mycoplasma pneumoniae (Halbedel u. a., 2006) und in
der Regulation des Sporulationsgeschehens (Arigoni u. a., 1996).
Die Vertreter der PPP-Familie zeichnen sich durch drei konservierte Aminosäuremotive
aus (Barton u. a., 1994). In E. coli wurde für zwei PPP-Phophatasen Funktionen in der
Weiterleitung von durch fehlgefaltete Proteine hervorgerufenen Stresssignalen
beschrieben (Missiakas & Raina, 1997).
Die bakteriellen Proteintyrosinphosphatasen werden in zwei verschiedene Klassen
eingeordnet. In der ersten Klasse sind die konventionellen PTP und die "dual-specific
protein phosphatases" (DSPs) zusammengefasst, letztere verfügen über eine
Serin/Threonin- und Tyrosinspezifität (Shi u. a., 1998). Die konventionellen PTPs
20
spielen bei der Wirtsinfektion durch pathogene Bakterien eine entscheidende Rolle
(Black & Bliska, 1997; Kaniga u. a., 1996).
In die zweite Klasse werden die "Low-molecular-weight protein tyrosine phosphatases"
(LMPTPs) eingeordnet (Musumeci u. a., 2005). Die LMPTPs Gram-negativen Bakterien
sind z. B. an der Kontrolle der kapsulären Exopolysaccharidsynthese beteiligt (Preneta
u. a., 2002; Vincent u. a., 1999, 2000).
Eine weitere Gruppe der Phosphatasen wurde vor kurzem beschrieben, von der erst
ein Vertreter im Reich der Bakterien identifiziert werden konnte. Hierbei handelt es
sich um die Phosphatase YwlE von B. subtilis, bei der es sich nicht, wie vormals
dargestellt, ausschließlich um eine Tyrosinphosphatase handelt (Kirstein u. a., 2005),
sondern um eine Argininphosphatase (Elsholz u. a., 2012).
Im Laufe der Jahre erfolgte lawinenartig die Erforschung des bakteriellen Serin-,
Threonin- und Tyrosin-Phosphoproteoms sowie der Hauptakteure, der Kinasen und
Phosphatasen. Es wurde deutlich, dass die physiologische Bedeutung von
Proteinphosphorylierungen in Bakterien sehr vielgestaltig ist.
1.2.3 Bacillus subtilis
Das im Boden lebende, sporenbildende und stäbchenförmige Bakterium B. subtilis
stellt einen apathogenen Modellorganismus für Gram-positive Bakterien dar. Es wurde
erstmals 1835 von Christian Gottfried Ehrenberg als Vibrio subtilis beschrieben und
1875 von Ferdinand Cohn in Bacillus subtilis umbenannt (Cohn, 1872; Ehrenberg,
1835).
1997 wurde die vollständige Genomsequenz von Kunst und Mitarbeitern veröffentlicht
(Kunst u. a., 1997) und 2009 von Barbe u. a. resequenziert und überarbeitet (Barbe u.
a., 2009).
Die Lebensbedingungen von B. subtilis sind dem ständigen Wandel von
Nährstoffbedingungen, Osmolarität, Sauerstoffgehalt und dem Klima des Lebensraums
unterworfen. Um unter diesen sich dauernd wechselnden Habitats-Bedingungen ihr
Überleben sichern zu können, besitzen die Bakterien ein komplexes Netzwerk von
Adaptionsmechanismen (Hecker & Babel, 1988). B. subtilis ist befähigt, in resistenten
1 Einleitung 21
Dauerformen, den Sporen, selbst den unwirtlichsten Situationen trotzen zu können
(Yudkin, 1993). Da die Sporenbildung jedoch ein sehr aufwändiger Prozess ist,
"versucht" das Bakterium diese durch andere Mechanismen, wie z. B.: Produktion von
Exoenzymen zur Erschließung alternativer C-Quellen, C-Katabolitenrepression,
"stringent response" und durch die generelle Stressantwort, zu umgehen (Hecker &
Völker, 2004). Besonders die Fähigkeit zur Exoenzymsynthese und Enzymsekretion
lässt dem Bakterium als Produzent in der biotechnologischen Anwendung eine große
Bedeutung zukommen. Diese Mechanismen werden biotechnologisch genutzt, um
verschiedenste Enzyme zu produzieren, darunter z. B. alkalische Proteasen für die
Waschmittelherstellung oder Amylasen für die Stärkeindustrie (Westers u. a., 2004).
Die Phosphorylierung als regulatorisches Element wurde in B. subtilis erstmals bei
Hpr/PtsH im PTS-System und der Regulation der Aktivität der Sigmafaktoren B und F in
den Vordergrund gerückt (Alper u. a., 1994; Eisermann u. a., 1988; Garsin u. a., 1998;
Price u. a., 2001; Reizer u. a., 1989; Stülke & Hillen, 2000). Später konnten
Tyrosinphosphorylierungen bei der UDP-Glukose-Dehydrogenase und bei
Einzelstrangebindeproteinen detektiert werden, die auf eine wichtige Rolle dieser
Modifikation in der Exopolysaccharidsynthese und in der Transkription schließen
lassen (Mijakovic u. a., 2003, 2006; Vujaklija & Macek, 2012).
Bisher konnten in B. subtilis zwei Hanks-ähnliche Kinasen charakterisiert werden (PrkC
und PrkD). PrkC, die mit der PP2C-ähnlichen Phosphatase PrpC cotranskribiert wird,
weist 10 der 12 katalytischen Subdomänen auf (Madec u. a., 2002; Obuchowski u. a.,
2000). Anhand der evolutionsähnlichen Entwicklung der Charakterisierung dieser
Kinase lässt sich die technische Revolution, die in der letzten Dekade stattgefunden
hat, erkennen (siehe Tabelle 1).
Aus der Tabelle wird ersichtlich, dass die Funktion der PrkC Kinase sehr vielgestaltig ist,
ebenso wie die angewandten Untersuchungsmethoden. Der Kinase werden Aufgaben
in der stationären Phase, in der Sporen- und Biofilmausbildung, in der
Phosphorylierung von Substraten des Metabolismus sowie dem "sensing" von
Muropeptiden zugesprochen (Referenzen siehe Tabelle 1).
22
Tabelle 1: Aufstellung der bisher publizierten Ergebnisse für die Kinase PrkC und den zur Untersuchung verwendeten Methoden.
Erkenntnisse über PrkC Methode Referenz
2000: - Substrat der Phosphatase PrpC
Autophosphorylierung der aufgereinigten Kinase mit radioaktivem 32P-ATP --> Dephosphorylierungsreaktion mit PrpC
(Obuchowski u. a., 2000)
2002: - wichtige Rolle in der stationären Phase - ElongationsfaktorG als Substrat
Deletionsmutanten Analyse, Betagalaktosidase-Assay, Western Blot , Immunopräzipitation, Kinase-Assay, Massenspektrometrie
(Gaidenko u. a., 2002)
2002: - Dimerbildung - Autophosphorylierung - Phosphorylierung von MBP an Threonin - Funktion in der Sporen-ausbildung u. Biofilmproduktion
Mutantenanalyse, Dimerisationstests, RNA-Analysen und RT-PCR, Western-Immuno-Blot-Analyse, Kinase-Assay, Phosphoaminosäure-Analyse mit radioaktivem 32P, Sporulation und Biofilm Assays
(Madec u. a., 2002)
2003: - 7 phosphorylierte Threoninreste und ein phosphorylierter Serinrest durch Autophosphorylierung - erstes Strukturmodell
Mutagenesis, in vitro Protein Kinase Assay, LC-MS/MS, 3D-Modelierung
(Madec u. a., 2003)
2005: - Operon- und Promoterstruktur
Genetische Analysen (Iwanicki u. a., 2005)
2009: - Substrate: CpgA, EF-Tu, YezB
Mutantenanalyse, Kinase-Assay, Phosphoaminosäure-Analyse, 32P-Markierung, 2D-Gel, MS-Analyse
(Absalon u. a., 2009)
2010: - Substrate im Metabolismus
MS-Analyse (Pietack u. a., 2010)
2010: - Konformationsstudien Strukturmodelierung (Gruszczyński u. a., 2010)
2011: - Röntgenstruktur Röntgenstrukturanalyse (Ruggiero u. a., 2011)
2011: - "Sensing" von Muropeptiden
NMR-Analyse, Proteinmutagenese (Squeglia u. a., 2011)
2012: - Subtrat: CpgA in vitro Phosphorylierungs-Assay mit radioaktivem Phosphat
(Pompeo u. a., 2012)
In B. subtilis wurden ebenfalls Hanks-unähnliche Ser/Thr-Kinasen beschrieben. Eine
große Gruppe bilden die Kinasen und Phosphatasen der Regulationsysteme
verschiedener Sigmafaktoren. Hierbei lösen Phosphorylierungs- und
Dephosphorylierungsgeschehnisse Partner-Switching-Reaktionen aus, die wiederum
zur Aktivität oder Inaktivierung des Sigmafaktors führen (Carniol u. a., 2004; Hecker
u. a., 2007; Price u. a., 2001). Die Hpr-Kinase des Phosphotransferasesystems stellt
1 Einleitung 23
ebenfalls eine Hanks-untypische Kinase dar. Die Phosphorylierung des Hpr-Proteins am
Ser-46 ist die Voraussetzung für die Interaktion mit CcpA dem globalen Regulator der
C-Katabolitenrepression und somit der DNA-Bindungsaffinität des Proteins an die
"catabolite-responsive-elements" cre (Fujita, 2009; Fujita u. a., 1995).
Die Proteintyrosinkinase PtkA von B. subtilis phosphoryliert zwei unterschiedliche
Klassen von Enzymen, die UDP-Glukose-Dehydrogenasen und die DNA-
Einzelstrangbindeproteine und besitzt somit eine wichtige Funktion in der
Zellzykluskontrolle und in der DNA-Replikation (Mijakovic u. a., 2003, 2006; Petranovic
u. a., 2007). Des Weiteren konnte der PtkA und der entsprechenden Phosphatase PtpZ
eine Rolle in Biofilmbildung nachgewiesen werden (Kiley & Stanley-Wall, 2010).
Zusätzlich wurde gezeigt, dass PtkA für die zelluläre Lokalisation ihrer Zielproteine
bedeutend ist (Jers u. a., 2010).
Erst vor kurzem wurde die erste prokaryotische Argininkinase in B. subtilis identifiziert.
In einem in vitro-Assay konnten Phosphorylierungsstellen am Arginin synthetischer
Peptide nachgewiesen werden (Fuhrmann u. a., 2009).
Die erste globale Phosphoproteomanalyse von B. subtilis publizierten Levine und
Mitarbeiter im Jahre 2006 (Lévine u. a., 2006). In dieser Studie wurde das
Phosphoproteom von B. subtilis 2D-gelbasiert mit Hilfe der radioaktiven 32P-Markierung analysiert. Sie detektierten 65 32P-markierte Spots aus dem
Proteinextrakt von Bakterien, die sich in der frühen stationären Phase befanden. 29
konnten mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert werden. Sechs zusätzliche
Spots konnten mithilfe der Pro-Q-Färbung detektiert werden. Eine Spezifizierung der
Phosphorylierungsstellen wurde nicht unternommen. Des Weiteren wurde der Einfluss
verschiedener Stressfaktoren auf das Phosphoproteom von sich in der stationären
Phase befindlichen Zellen untersucht und eine Dynamik des Phosphoproteoms
festgestellt. Ein Vergleich mit dem Phosphoproteom von Zellen aus der exponentiellen
Wachstumsphase blieb jedoch aus.
Im Jahre 2007 wurde der erste globale gelfreie Phosphoproteomansatz von Macek und
Mitarbeiter durchgeführt. Unter Verwendung der Kationenaustauschchromatographie
und einer auf Titandioxid basierenden Anreicherung konnten 78
Phosphorylierungsstellen identifiziert werden (Macek u. a., 2007). 2010 wurden in
24
einem gelfreien Quantifizierungsansatz 27 Phosphopeptide unter verschiedenen
Wachstumsbedingungen quantifiziert (Soufi u. a., 2010).
1.2.4 Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae ist ein humanpathogenes Bakterium, das als
Hauptverursacher der atypischen Pneumonie sowie chronischen Erkrankungen wie
z. B. Asthma und Arthritis bekannt ist (Atkinson u. a., 2008). Es wird aufgrund seiner
Zellwandlosigkeit in die Klasse der Mollicutes eingeordnet. 1944 wurde es von Eaton
erstmals isoliert und im Folgenden "eaton agent" genannt (Eaton u. a., 1944). 1962
gelang es Chanock und Mitarbeitern das Bakterium in Zellkultur zu züchten und es als
Mycoplasma zu identifizieren (Chanock u. a., 1962). Weitere bedeutende
Charakteristika des Bakteriums sind die kleine Genomgröße und die geringe Anzahl
von vorhergesagten Proteinen (< 700) (Catrein & Herrmann, 2011). Die Mollicuten sind
zudem die kleinsten, sich selbst replizierenden lebenden Organismen und stellen somit
optimale Modelle für pathogene Minimalorganismen dar, da die Größe des Genoms
das Vorhandensein komplexer Regulationssysteme minimiert. Es fehlen z. B. die
Enzyme des Tricarbonsäurezyklus und mehrere Enzyme des Pentosephosphatwegs
(Halbedel u. a., 2007). Stresseinwirkungen und sich dauernd ändernde
Umweltbedingungen stellen das Bakterium vor große Herausforderungen, die, um
überleben zu können, vom Organismus gemeistert werden müssen.
In Organismen, die nur ein minimales Repertoire an Regulationssystemen aufweisen,
könnte der Mechanismus der Phosphorylierung/Dephosphorylierung ein
entscheidendes regulatorisches Werkzeug darstellen. Als erstes wurde die
Phosphorylierung des HPr-Proteins beschrieben (Halbedel & Stülke, 2005). Des
Weiteren konnten mehrere Adhäsionsproteine als phosphoryliert identifiziert werden
(Dirksen u. a., 1994; Krebes u. a., 1995).
Su und Mitarbeiter veröffentlichten 2007 erste Studien zum Phosphoproteom von
M. pneumoniae und M. genitalium, mit dem Ergebnis, dass 18 Phosphoproteine
mithilfe des 2D-gelbasierten Ansatzes, der Pro-Q-Färbung und der radioaktiven 33P-Markierung für M. pneumoniae identifiziert werden konnten. Es wurde die
1 Einleitung 25
Hypothese aufgestellt, dass Phosphorylierungsgeschehnisse einen Einfluss auf die
Zytoskelett-ähnliche Struktur ausüben und an der Regulation der Adhäsion an die
Wirtszelle beteiligt sind (Su u. a., 2007).
Diese Hypothese und das Interesse an regulatorischen Ereignissen führten Sebastian
Schmidl (Universität Göttingen) zu weitergehenden Untersuchungen bezüglich des
Phosphoproteoms, des kompletten Kinoms und der Proteine des Adhäsionsapparates
von M. pneumoniae. Hierbei entstand in Kooperation mit dem Institut für
Mikrobiologie der EMAU Greifswald die Arbeiten "The phosphoproteome of the
minimal bacterium Mycoplasma pneumoniae " (Schmidl u. a., 2010a) und "The stability
of cytadherence proteins in Mycoplasma pneumoniae requires activity of the protein
kinase PrkC" (Schmidl u. a., 2010b).
In diesen Studien, in denen die gelbasierten Untersuchungen und
massenspektrometrischen Analysen im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden,
konnten 63 phosphorylierte Proteine und 16 Phosphorylierungsstellen von
M. pneumoniae identifiziert werden. Außerdem konnte in einer 2D-Gel basierten
Mutantenanalyse der zwei bekannten Kinasen (HprK/PrkC) und der
Phosphatasemutante (PrpC) festgestellt werden, dass das Protein HPr das Zielprotein
der HprK (Kinase) darstellt und die Kinase PrkC für die Phosphorylierung von vier
Proteinen (den Zelladhäsionsproteinen HMW3 und P41, dem Zelloberflächenprotein
MPN474, dem uncharakterisierten MPN 256 Protein) verantwortlich ist. Fortführend
wurde gezeigt, dass PrkC zusätzlich die Zelladhäsionsproteine P1 und HMW1
phosphoryliert. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde geschlussfolgert, dass PrkC für die
Zelladhäsion essentiell ist, um den Adhäsionskomplex zu stabilisieren und somit einen
wichtigen Virulenzfaktor darstellt. Mit diesen beiden Studien, die auf der optimierten
2D-Gel- und Pro-Q-basierten Phosphoproteommethode und auf akkuraten und
sensitiven massenspektrometrischen Analysen (die beide im Rahmen dieser Arbeit
durchgeführt wurden) basierten, konnte gezeigt werden, dass eine Verbindung
zwischen Phosphorylierungsereignissen und Virulenz besteht und dass das Werkzeug
der Phosphorylierung komplexe Regulationssysteme in Minimalorganismen
kompensieren kann.
26
In einer kürzlich erschienenen Studie von Van Noort und Mitarbeitern, in der die
Wechselwirkungen von Phosphorylierungs- und Acetylierungsereignissen analysiert
wurden, konnten in einem SCX-basierten gelfreien Ansatz 93 Phosphorylierungsstellen
in 72 Proteinen von M. pneumoniae identifiziert werden (van Noort u. a., 2012). Von
den phosphorylierten Proteinen wurden 30 schon vormals gelbasiert durch die
Detektion mit dem Pro-Q Diamond Farbstoff von Schmidl und Mitarbeitern
identifiziert, wobei 4 gemeinsame Phosphorylierungsstellen gefunden wurden
(Schmidl u. a., 2010a). Die gelfreien Identifizierungen phosphorylierter Proteine durch
van Noort u. a. validieren somit die durch den Pro-Q-Farbstoff detektierten
phosphorylierten Proteine. Darüber hinaus konnte der Einfluss der pknB-Deletions-
Mutante (PknB = PrkC = MPN248) auf die Zytoadhärenzproteine bestätigt werden. Es
wurden 12 Proteine beschrieben, auf die die pknB-Mutation einen negativen Einfluss
zeigte, darunter 8 Proteine, die von Schmidl u. a. schon vormals in diesem
Zusammenhang beschrieben wurden. Ferner wurden quantitative Analysen von zwei
Kinase- und einer Phosphatasemutante durchgeführt, mit dem Ergebnis, dass 76,1 %
der quantifizierbaren Phosphorylierungsstellen durch eine der beiden Kinasen
beeinflusst werden. Für die restlichen Nichtbetroffenen 23,9 % werden drei mögliche
Gründe für das Phosphorylierungsereignis vorgeschlagen:
a) es findet eine Kompensation durch die jeweils andere Kinase statt,
b) es finden Kinase-unabhängige Autophosphorylierungsreaktionen statt oder
c) sie stellen metabolische Intermediate dar (van Noort u. a., 2012).
Dieses steht im Gegensatz zu den Kinase-Untersuchungen von Schmidl u. a., in denen
nur fünf phosphorylierte Proteine (von 63 untersuchten) als Substrat detektiert
werden konnten (Schmidl u. a., 2010a).
1.2.5 Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus wurde 1881 von Alexander Ogston entdeckt und aufgrund der
Traubenform Staphylokokken genannt. Anton J.F. Rosenbach konnte es 1884 erstmals
isolieren. Es handelt sich hierbei um ein unbewegliches, kugelförmiges,
koagulasepositives, Gram-positives und fakultativ anaerobes Bakterium (Le Loir u. a.,
1 Einleitung 27
2003), welches aufgrund seiner goldgelben Farbe den Namen aureus verliehen
bekommen hat. S. aureus kommt als humanpathogener, opportunistischer
Krankheitserreger auf der Haut und in Schleimhäuten vor (Harris u. a., 2002; Kloos &
Lambe, 1991). Er ist zu einem bedeutenden und gefürchteten Krankenhauskeim
avanciert und ist der Auslöser vieler unterschiedlicher invasiver, systemischer
Erkrankungen wie Osteomyelitis, Pneumonie, Endokarditis oder Sepsis
(zusammengefasst in Musher & McKenzie, 1977). Des Weiteren ruft er
toxinvermittelte Erkrankungen (Toxinosen), wie das "Staphylococcal-Scaled-Skin-
Syndrom" (SSSS), das Toxische Schocksyndrom (TSS) sowie Nahrungs-
mittelvergiftungen hervor und ist Verursacher von Wundinfektionen und Abszessen
(Le Loir u. a., 2003; Musser u. a., 1990).
In der heutigen Zeit der vermehrt auftretenden Multiresistenzen zählt Staphylococcus
aureus als humanpathogener Keim zu den gefürchtesten bakteriellen nosokomialen
Erregern. Hochrechnungen des Robert-Koch-Instituts ergaben für das Jahr 2008 eine
MRSA-Last (Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus) von 132000 Fällen in
Deutschland (http://www.rki.de/cln_117/nn_504504/DE/Content/Infekt/EpidBull/
Archiv/2010/36__10,templateId=raw,property=publicationFile.pdf/36_10.pdf).
Zur Eindämmung dieser beträchtlich angestiegenen Gefahr besteht ein erhöhter
Bedarf an Aufklärung, insbesondere im Hinblick auf den Infektionsprozess, dessen
Regulation und der beteiligten Enzyme.
Bisher ist relativ wenig über das Phosphoproteom und die regulatorischen Einflüsse
der Phosphorylierungsreaktionen von S. aureus bekannt.
S. aureus besitzt eine Hanks-ähnliche MAP-Kinase (PknB, bzw. Stk1), deren Gen mit
dem Gen der Phosphatase Stp cotranskribiert wird (Beltramini u. a., 2009;
Débarbouillé u. a., 2009; Miller u. a., 2010). Verschiedene Aufgaben werden für die
Kinase beschrieben, darunter eine Rolle in der Zellwandarchitektur und damit in der
Regulierung der antimikrobiotischen Resistenz (Beltramini u. a., 2009; Tamber u. a.,
2010) sowie eine Aufgabe in der Regulation der Hämolysin Expression (Burnside u. a.,
2010). Des Weiteren wird durch die Kontrolle des Phosphorylierungslevels ein Einfluss
auf die Pathogenität und somit auf das Überleben im Wirt ausübt (Débarbouillé u. a.,
2009). Neun glykolytische Enzyme konnten als Substrate identifiziert werden (Lomas-
28
Lopez u. a., 2007). Als weiteres Substrat, das über den Phosphorylierungsstatus
reguliert wird, wurde PurA identifiziert und PknB somit eine Rolle in der
Purinbiosynthese zugewiesen. Zusätzlich konnten Funktionen in der Autolyse und in
zentral metabolischen Prozessen festgestellt werden (Donat u. a., 2009). Ferner übt
PknB einen Einfluss auf die Antibiotikaresistenz durch die Regulation der Expression
der von dem globalen Regulator MgrA kontrollierten "multidrug-efflux pumps" NorA
und NorB aus (Truong-Bolduc & Hooper, 2010). Die Pathogenität des Organismus wird
aufgrund der Phosphorylierung des Virulenzregulators SarA ebenfalls beeinflusst
(Didier u. a., 2010). Kürzlich wurde von Rakette und Mitarbeitern die Struktur der
Kinase aufgeklärt und eine erste Basisidee für den funktionellen Mechanismus
beschrieben (Rakette u. a., 2012). Neuerdings konnte in in vitro Ansätzen eine durch
die Kinase PknB (Stk1) vermittelte Cysteinphosphorylierung nachgewiesen werden, die
einen positiven Einfluss auf die Antibiotikaresistenz gegenüber Vancomycin und auf die
Produktion von Virulenz bestimmenden Faktoren ausüben soll (Sun u. a., 2012).
2007 wurde eine globale 2D-gelbasierte Phosphoproteomstudie von Lomas-Lopez und
Mitarbeitern durchgeführt (Lomas-Lopez u. a., 2007). Die Detektion der
phosphorylierten Proteine erfolgte über eine radioaktive 32P-Markierung. Insgesamt
konnten 11 verschiedene Phosphoproteine, der Hauptteil davon glykolytische,
identifiziert werden. Eine Spezifizierung der genauen Phosphorylierungsstellen fand
nicht statt, jedoch konnte für den Großteil der identifizierten phosphorylierten
Proteine in vitro eine Phosphorylierung durch PknB gezeigt werden.
1.3 Methoden zur Analyse des bakteriellen Phosphoproteoms
Die besonderen Eigenschaften der Proteinphosphorylierung beruhen auf der geringen
Abundanz der phosphorylierten Proteine, auf den verschiedenen chemischen
Eigenschaften und auf dem großen dynamischen Bereich, in dem sie anzutreffen sind.
Diese Charakteristika bedeuten bei der Analyse eine große technische
Herausforderung und bedingen ein weitgefächertes Methodenarsenal, da jede
einzelne Methode nur einen begrenzten dynamischen Bereich aufweist (Mann u. a.,
2002).
1 Einleitung 29
Das grundlegende Prinzip der Analyse von phosphorylierten Proteinen/Peptiden
beruht auf deren Trennung von den in hoher Anzahl vorliegenden Nicht-
phosphorylierten Proteinen/Peptiden. Verschiedenste Methoden sind bis heute
entwickelt worden. Die gebräuchlichsten Techniken dieser Zeit zur Untersuchung von
Phosphoproteomen wurden in der Tabelle 2 zusammengestellt.
Hierbei wird zwischen den Methoden zur Untersuchung von phosphorylierten
Proteinen oder Phosphopeptiden und den gelbasierten oder gelfreien Methoden
unterschieden. Die intelligente Kopplung von Vorfraktionierungs-, Anreicherungs- und
Detektionsmethoden garantiert den Erfolg bei der Analyse des Phosphoproteoms.
Tabelle 2: Zusammenfassung der gebräuchlichsten Methoden zur Untersuchung bakterieller Phosphoproteome.
Proteine Peptide
Methode: gelbasiert gelfrei gelfrei
Vorfraktionierung: 1D-Gel/2D-Gel SCX-/HILIC-Chromatogr.
Anreicherung:
Immunopräzipi-tation
Calciumphosphat-präzipitation Phosphoamidat-Chemie (PAC) chem. Modifizierung
TiO2-/ZrO2- Phosphopeptid-anreicherung
Detektion:
Pro-Q Diamond 32/33P-Detektion Phospho-Antikörper
Identifizierung: Massenspektrometrische Analyse: MALDI-TOF-MS, LC-ESI-MS/MS
Massenspektrometrische Analyse: LC-ESI-MS/MS
Quantifizierung: Relative Quantifizierung über Signalintensitäten
über SILAC-, iTRAQ-, Dimethyl-, 14N/15N-metabolische Markierung
1.3.1 Gelbasierte Techniken zur Analyse des Phosphoproteoms
Die gelbasierten Methoden beruhen auf dem Prinzip der ein- oder zweidimensionalen
Gelelektrophorese. Mit der 2D-Gel-Methode werden ca. 40 % der vorhergesagten
30
Proteine eines bakteriellen Organismus visualisiert, darunter viele Proteine der
metabolischen Stoffwechselwege und vieler anderer zellulärer Komponenten (Hecker
u. a., 2008). Die große Stärke dieser Methode liegt in der Auftrennung verschiedener
Proteinisoformen, die durch nachträgliche Prozessierung oder durch posttranslationale
Modifikationen, wie z. B. Phosphorylierungen entstehen. Diese Trennung von
Proteinisoformen lässt sich fast ausschließlich mit der 2D-Gelelektrophorese erreichen.
Der 2D-gelbasierte Ansatz bietet mehrere Möglichkeiten zur Analyse des
Phosphoproteoms. Zum einen wird eine Auftrennung der phosphorylierten Proteine
und der unphosphorylierten Spezies voneinander gewährleistet, so dass es möglich
wird, diese aus dem Gel zu separieren und massenspektrometrisch zu identifizieren.
Zum anderen eignet sich dieser Ansatz um herauszufinden, welche regulatorische
Bedeutung und Aufgabe den identifizierten Phosphoproteinen zukommt. Ein Vergleich
des Phosphoproteoms ist unter verschiedenen Wachstumsbedingungen möglich, so
dass Veränderungen im Proteommuster sehr schnell aufgespürt und die
verantwortlichen Enzyme und Regulatoren der anpassenden Zellantwort identifiziert
werden können (Eymann u. a., 2007).
Die 2D-Gelelektrophorese, die von Klose und O´Farrell 1975 unabhängig voneinander
entwickelt wurde, beruht auf der Auftrennung der Proteine nach dem isoelektrischen
Punkt in der horizontalen Ebene (1. Dimension: Isoelektrische Fokussierung) und dem
Molekulargewicht in der vertikalen Ebene (2. Dimension) (Klose, 1975; O’Farrell, 1975).
Die isoelektrische Fokussierung erfolgt in IPG-Gelstreifen (Bjellqvist u. a., 1982), die aus
einem immobilisierten in Polyacrylamid eingebetteten pH-Gradienten bestehen, an
denen ein elektrisches Feld angelegt wird. Die Proteine wandern dann aufgrund ihrer
Eigenladung an die Stelle im IPG-Streifen, an der ihre Nettoladung gleich 0 ist. Dies
entspricht dem isoelektrischen Punkt des Proteins. In der 2. Dimension werden die
durch die Äquilibrierung entfalteten und mit dem negativen Detergenz (SDS)
beladenen Proteine gemäß ihrer Masse im Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Beladung
der Proteine mit negativen Ladungsträgern maskiert deren Eigenladung, so dass die
Trennung nur hinsichtlich der molekularen Größe erfolgt. Hierbei wandern die
Proteine aufgrund der negativen Ladungen im elektrischen Feld zur Anode. Die
kleineren Proteine wandern schneller als die durch die Gelmatrix behinderten
größeren Proteine. Durch einen anschließenden Fixierungsschritt werden die Proteine
1 Einleitung 31
im Gel denaturiert/präzipitiert und somit deren weitere Diffusion verhindert
(zusammengefasst in Rabilloud & Lelong, 2011; Rabilloud u. a., 2010).
Durch verschiedene Markierungs- und Färbemethoden werden die Proteine im Gel
visualisiert und können durch einen Scanvorgang digitalisiert werden. Die
digitalisierten Bilder können mithilfe von computergestützter Auswertetechnik (z. B.
Decodon Delta2D, Greifswald) analysiert und quantifiziert werden.
Die Detektion der phosphorylierten Proteine erfolgt größtenteils anhand drei
verschiedener Techniken. Zum einen ist es durch eine in der Zellkultur vorangegangene
radioaktive 32/33P-Markierung oder durch eine in vitro Kinase-Reaktion unter Gebrauch
von 32P markiertem gamma-ATP möglich, die radioaktiv markierten Phosphoproteine
in einem Autoradiogramm sichtbar zu machen (Bendt u. a., 2003; Eymann u. a., 2007;
Grangeasse u. a., 2003; Lévine u. a., 2006).
Zum anderen kommen gegen die phosphorylierte Aminosäure gerichtete Antikörper
bei 1D- oder 2D-Westernblotanalysen zum Einsatz (Bendt u. a., 2003; Mijakovic u. a.,
2003; Soung u. a., 2009).
Des Weiteren kann zur Detektion von phosphorylierten Proteinen ein
phosphosensitiver Farbstoff (Pro-Q® Diamond, life technologies™) verwendet werden
(Steinberg u. a., 2003). Mit der Entwicklung dieses phosphosensitiven
Fluoreszenzfarbstoffes (im Folgenden Pro-Q genannt) und dessen
massenspektrometrische Kompatibilität wurde dem Experimentator nicht nur die
Möglichkeit der Detektion von phosphorylierten Proteinen, sondern auch die
Möglichkeit der massenspektrometrischen Identifizierung der spezifischen
Phosphorylierungsstelle gegeben (Martin u. a., 2003a, 2003b; Steinberg u. a., 2003).
Zusätzlich kann ein quantitativer Vergleich zwischen Phosphoproteomen
unterschiedlicher physiologischer Bedingungen und somit eine funktionelle
Einordnung der Phosphoproteine vorgenommen werden (Schulenberg u. a., 2004).
Die Identifikation der Phosphoproteine erfolgt häufig über ESI-LC-MS/MS-Analysen.
Hierfür wird der zu analysierende phosphorylierte Proteinspot aus dem Gel
ausgeschnitten und mit Trypsin oder einer anderen Protease verdaut. Nach der Elution
der Peptide aus dem Gelstück werden die Peptide mithilfe der
Umkehrphasenchromatographie vorfraktioniert und online massenspektrometrisch
32
analysiert (Eymann u. a., 2007). Trotz der geringen Proteinausgangsmenge ist eine
Identifizierung des Phosphoproteins und oft auch der spezifischen phosphorylierten
Aminosäure möglich.
1.3.2 Gelfreie Techniken zur Analyse des Phosphoproteoms
Die gelfreie Analyse des Phosphoproteoms erfolgt größtenteils auf Peptidebene. Das
vorherrschende Ziel ist die Identifizierung der phosphorylierten Peptide, einschließlich
der phosphorylierten Aminosäuren. Um diese zu verbessern, ist eine Anreicherung der
phosphorylierten Peptide aus den in einem großen Überschuss vorliegenden nicht-
phosphorylierten Peptiden notwendig. Zahlreiche Anreicherungstechniken basieren
auf der koordinativen Bindung der Phosphatgruppen an dreiwertige Metallionen
(IMAC = "Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography"). Hierbei finden
Metallionen wie Ga3+, Fe3+, Ti4+ und Zr4+ eine vermehrte Anwendung (Andersson &
Porath, 1986; Steen u. a., 2007; Feng u. a., 2007; Zhou u. a., 2008). Der IMAC-Ansatz
eignet sich im Besonderen bei mehrfach-phosphorylierten Peptiden (zusammengefasst
in Dunn u. a., 2010).
Des Weiteren kann eine Anreicherung über phosphospezifische Antikörper im Zuge der
Immunopräzipitation oder über eine chemische Derivatisierung durchgeführt werden
(Blagoev u. a., 2004; Oda u. a., 2001). Die chemische Modifikation kann z. B. in einer
ß-Eliminierung der Phosphatgruppe bestehen (Jaffe u. a., 1998). Die Eliminierung
dieser vom Serin oder Threonin resultiert in der Umwandlung in eine im
Massenspektrometer detektierbaren Dehydroaminobuttersäure oder eines
Dehydroalanins. An diese kann durch "Michael-Addition" ein Aufreinigungstag wie z. B.
Biotin gekoppelt werden (McLachlin & Chait, 2003; Oda u. a., 2001). Somit können
aufgrund dieses Taggings die am Serin oder Threonin phosphorylierten Proteine
aufgereinigt und massenspektrometrisch analysiert werden. Eine ähnliche Strategie
verfolgt der Ansatz der Phosphoamidatchemie (PAC). Hierbei werden über mehrere
Schritte die Phosphatgruppe z. B. mit Cystamin und einer reduzierenden Reagenz
derivatisiert. Die SH-Gruppe des Cystamins wird mit Maleimid-aktivierten Glasbeads
1 Einleitung 33
verbunden und somit das Phosphopeptid an der Matrix immobilisiert und aufgereinigt.
Die Elution erfolgt durch saure Hydrolyse (Bodenmiller u. a., 2007).
Den Durchbruch in der bakteriellen Phosphoproteomanalyse brachte die Anwendung
von Titandioxid als Anreicherungsmaterial (Pinkse u. a., 2004; Macek u. a., 2007), da es
sich besonders zur Anreicherung von den in Bakterien vorherrschend vorkommenden
einfach-phosphorylierten Peptiden eignet.
Olsen und Mitarbeiter entwickelten einen Workflow zur Anreicherung von
Phosphopeptiden unter Verwendung einer Kationenaustauschchromatographie und
einer Titandioxidanreicherung (Macek u. a., 2007; Olsen & Macek, 2009). Diese
Methode wird bisher sehr erfolgreich in der gelfreien Analyse bakterieller
Phosphoproteome eingesetzt.
Die Vorfraktionierung erfolgt hier mithilfe der SCX-Chromatographie ("strong-cation-
exchange chromatography"). Das Prinzip basiert auf der Trennung von den in
verschiedenen Ladungszuständen gelöst vorliegenden Peptiden und wurde 2004 von
Beausoleil und Mitarbeitern zur Vorfraktionierung von phosphorylierten Peptiden
eingeführt (Beausoleil u. a., 2004). Bei einem pH-Wert von 2,7 der mobilen Phase
liegen die tryptisch verdauten Peptide doppelt protoniert vor und weisen somit einen
Ladungszustand von zwei auf. Befindet sich jedoch eine negative Phosphatgruppe an
dem Peptid, so verringert sich die Gesamtladungszahl des Peptides um eins. Diese
geringere Gesamtladungszahl begründet die schwächere Affinität zum Säulenmaterial
und führt zu einer frühen Elution im linearen Salzgradienten. Gleiches gilt jedoch auch
für andere, durch Modifikationen in ihrer Gesamtladungszahl reduzierten Peptide, so
dass keine spezifische Abtrennung von nicht-phosphorylierten Peptiden erfolgt,
sondern nur eine Reduzierung der Komplexität und eine Erhöhung des
Phosphopeptidvorkommens innerhalb der ersten entstehenden Fraktionen. Peptide
mit einer Gesamtladungszahl von 0 oder kleiner werden nicht von dem Säulenmaterial
retardiert (Beausoleil u. a., 2004).
Nachfolgend werden die einzelnen Fraktionen mit Titandioxid im sauren Milieu
inkubiert. Titandioxid wurde erstmals von Pinkse und Mitarbeitern in einer globalen
Phosphoproteomstudie eingesetzt (Pinkse u. a., 2004). Die Adsorption der anionischen
Phosphatgruppe an die Oberfläche des Titandioxids erfolgt über einen zweizähnigen
34
(bidentalen) Bindungskomplex (Larsen u. a., 2005). Aber nicht nur phosphorylierte
Peptide adsorbieren an die Titaniumdioxidoberfläche, sondern ebenfalls anionische,
aber nicht-phosphorylierte Peptide. Zur Vermeidung dieser ungewollten koordinativen
Bindungen der Carbonsäuren wird eine Maskierungsreagenz hinzugegeben. Hierbei
handelt es sich häufig um DHB (2,5-Dihydroxybenzoesäure), die die Adsorptionsstellen
am Titandioxid für Carbonsäuren, aber nicht für Phosphatgruppen belegt. Aber auch
Milchsäure oder Glutaminsäure werden als kompetitive Reagenzien eingesetzt (Larsen
u. a., 2005; Pinkse u. a., 2004). Dies erhöht die Selektivität des Titandioxids für
phosphorylierte Peptide.
Nach mehreren Waschritten erfolgt die Elution der phosphorylierten Peptide im
basischen Milieu durch die Zugabe einer Ammoniumhydroxid-Lösung. Die eluierten
Peptide werden der massenspektrometrischen Analyse zugeführt und können
beispielsweise mit der MaxQuant-Software (Cox & Mann, 2008) ausgewertet werden.
In Abbildung 1 ist der von Olsen und Macek propagierte Workflow vereinfacht
dargestellt.
Es liegen weitere Anreicherungs-Protokolle vor, die sich in den einzelnen Bausteinen
sowie in den verwendeten Substanzen unterscheiden und somit auf das zu
untersuchende System speziell aufeinander abgestimmt werden können. Dabei
kommen z. B. andere Vorfraktionierungtechniken wie beispielsweise HILIC
(Hydrophilen-Interaktions-Chromatographie) oder ERLIC (Electrostatische Repulsions-
hydrophile Interaktionschromatographie) zum Einsatz.
Das Prinzip der HILIC beruht auf der Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen
zwischen dem Peptid, das sich in einer organischen mobilen Phase befindet und einer
neutralen und hydrophilen stationären Phase. Die Elution erfolgt durch eine
Reduzierung des organischen Lösungsmittelanteils in der mobilen Phase und die
Peptide eluieren somit entsprechend ihrer Polarität (McNulty & Annan, 2008;
Thingholm u. a., 2009).
1 Einleitung 35
Abbildung 1: Workflow zur globalen Analyse von Phosphopeptiden gemäß Olsen und Macek, 2009.
Eine weitere Vorfraktionierungsmethode ist ERLIC. Sie beruht auf dem Prinzip der
HILIC-Chromatographie, jedoch wird als stationäre Phase anstatt einer
neutralen/hydrophilen Phase eine schwache Ionenaustauschsäule verwendet (Alpert,
2008). Durch die negativ geladene Phosphatgruppe bestehen elektrostatische
Interaktionen zwischen den Phosphopeptiden und dem Säulenmaterial. Des Weiteren
führt die Verwendung eines organischen Lösungsmittels dazu, dass hydrophile
Interaktionen zwischen Phosphopeptid und Säulenmaterial auftreten. Das resultiert in
einer vermehrten Retention der phosphorylierten Peptide im Gegensatz zu den nicht-
phosphorylierten (Alpert, 2008).
36
1.3.3 Die Rolle der Massenspektrometrie bei der Analyse des Phosphoproteoms
Die massenspektrometrische Analyse von Phosphopeptiden stellt eine große
Herausforderung an das technische Equipment und an den Experimentator. Mehrere
charakteristische Faktoren behindern eine erfolgreiche Untersuchung und müssen
durch verbesserte Analysemethoden umgangen werden. Durch die geringe
Stöchiometrie, die schlechteren Fragmentierungseigenschaften und die Suppression
durch andere höher abundant vorliegende Peptide ist eine massenspektrometrische
Detektion der phosphorylierten Peptide erschwert (Mann u. a., 2002). Das
Grundprinzip der massenspektrometrischen LC-ESI-MS/MS-Analyse phosphorylierter
Peptide ist in Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 2: Grundlegendes Schema einer massenspektrometrischen LC-ESI-MS/MS-Analyse (modifiziert nach Gafken, 2009).
Das aus der Umkehrphasenchromatographie kommende vorfraktionierte
Peptidgemisch, bestehend aus phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Peptiden,
1 Einleitung 37
wird über Elektrosprayionisation als positiv geladene Ionen dem Massenspektrometer
zugeführt. Es erfolgt ein Übersichtsscan, in dem das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis und
die Intensität bestimmt werden (MS-Spektrum). Gleichzeitig werden die Peptide
isoliert und fragmentiert. Die Fragmente werden dann im Massenanalysator detektiert
(MS2 (MS/MS)-Spektrum) (Macek u. a., 2009). Verschiedenste Fragmentierungs- und
Analysetechniken wurden im Laufe der Zeit entwickelt. Die klassische
kollisionsinduzierte Fragmentierung (CID) besteht in einer langsamen Erhöhung der
internen Energie der Ionen und einer induzierten Fragmentierung durch die Kollision
mit Edelgasatomen (z. B. Helium) (Jennings, 1968; Jones & Cooper, 2011; McLafferty &
Bryce, 1967). Die labilsten Bindungen dissoziieren mit dieser Methode zuerst und
verhindern eine weitere Fragmentierung des Peptidrückgrats des Ions. So entsteht bei
phosphorylierten Serinen und Threoninen der klassische Neutralverlust von
ungeladener (neutraler) Phosphosäure (H3PO4) im positiven Ionenmodus. Dies
resultiert in fragmentarmen Spektren, die oftmals nicht genug Informationen
enthalten, um das Phosphopeptid zu identifizieren, beziehungsweise die genaue
phosphorylierte Aminosäure zu detektieren (Boersema u. a., 2009a). Williamson und
Mitarbeiter entwickelten 2006 einen automatisierten Workflow zur Identifizierung von
Phosphorylierungsstellen für ein Hybrid-Gerät aus drei Quadrupolen, das eine
Einsatzmöglichkeit als lineare Ionenfalle beinhaltete. Innerhalb dieser Methode wird
zuerst ein Vorläuferscan auf m/z -79 (≙ -HPO3) im negativen Ionenmodus
durchgeführt, der bei Auftreten dieses Massenverlustes einen hochauflösenden Scan
(MS), eine Fragmentierung und einen Produktionenscan (MS/MS) im positiven
Ionenmodus auslöst (Williamson u. a., 2006).
Eine weitere Lösung der Neutralverlustproblematik bietet der MS3-Ansatz. Hierbei
triggert der Neutralverlust von Phosphorsäure (m/z -98) eine zusätzliche
Fragmentierung des Neutralverlust-Vorläuferions, und es entsteht somit ein qualitativ
hochwertigeres Spektrum (Wolschin & Weckwerth, 2005). Die restlichen Fragmente
der ersten Aktivierung gehen jedoch verloren und stehen der Analyse nicht mehr zur
Verfügung.
Durch die Einführung der Multistage-Aktivierung (bzw. pseudo-MS3) von Schroeder
und Mitarbeitern 2004 konnte durch die Anwendung einer weiteren Aktivierung des
38
putativ entstehenden Neutralverlustions die Anzahl der Fragmente erhöht und die
Identifizierung verbessert werden. Hierbei findet im Gegensatz zum klassischen
MS3-Ansatz zwischen den beiden Aktivierungen keine Leerung der Ionenfalle statt, so
dass alle entstehenden Fragmente dem Analysator zugeführt werden (Schroeder u. a.,
2004).
Weitere Fragmentierungstechniken wie "electron capture dissociation" (ECD),
"electron transfer dissociation" (ETD) und "higher energy collision activated
dissociation" (HCD) werden zur Analyse von phosphorylierten Peptiden angewandt. Bei
diesen Methoden tritt der Neutralverlust nicht oder nur kaum auf. Die HCD-
Fragmentierungstechnik basiert auf der hochenergetischen Kollision mit
Stickstoffatomen und liefert eine höhere Dissoziationsenergie als die
CID-Fragmentierung, so dass eine Fragmentierung des Peptidrückgrats stattfindet und
b- und y-Ionen generiert werden. Die labilen Phosphatbindungen bleiben
weitestgehend erhalten. Die daraus resultierende höhere Anzahl intensiverer
Fragmentionen produziert qualitativ hochwertige Spektren (Jedrychowski u. a., 2011;
Olsen u. a., 2007; Zhang u. a., 2009).
ECD, basierend auf der Fragmentierung mit niedrig energetischen thermischen
Elektronen und ETD, basierend auf der Fragmentierung mit Radikalionen, resultieren in
einer Dissoziation des Peptidrückgrats zwischen dem Stickstoff und dem C-alpha Atom
und somit in der Bildung von c- und z-Ionen (Molina u. a., 2007; Stensballe u. a., 2000).
Diese beiden Fragmentierungstechniken eignen sich jedoch vorwiegend für höher
geladene Ionen (z>3). 2007 wurde ein Ansatz vorgestellt, indem die CID-Methode für
zweifach geladene Ionen und die ETD-Methode für mehrfach geladene Ionen
miteinander kombiniert wurde (Good u. a., 2007; Molina u. a., 2007).
1.3.4 Daten-Analyse
Eine klassische Datenbankanalyse zur Interpretierung der gewonnen Spektren und
Daten bedingt oft eine manuelle Durchsicht der Spektren potentiell phosphorylierter
Peptide, da aufgrund der mäßigen Qualität der Spektren nur ein geringer Score
erreicht wird. Dies ist in komplexen Phosphoproteomansätzen nicht mehr möglich,
1 Einleitung 39
und daher wurden im Laufe der Zeit mehrere Programme/Algorithmen entwickelt, die
im Speziellen die gefundene Phosphorylierungsstelle beurteilen.
In Tabelle 3 sind die am häufigsten verwendeten Programme zur Validierung der
Phosphorylierungsstelle aufgelistet.
Tabelle 3: Auflistung der gebräuchlichsten Algorithmen/Programme zur Validierung von Phosphorylierungsstellen.
Programm Referenz
Ascore Basiert auf der Intensität und dem Vorkommen der der Phophorylierungsstelle benachbarten Ionen im MS/MS Spektrum
(Beausoleil u. a., 2006)
MSQuant Wahrscheinlichkeits-Score + "Localizations-Score" = PTM-Score
(Mortensen u. a., 2010)
MaxQuant Lokalisationswahrscheinlichkeits-Score (Prinzip wie MSQuant)
(Cox & Mann, 2008)
ProPhosSI Automatische Validierung mittels aufgestellten Kriterien
(Martin u. a., 2010)
PhosphoRS/ Proteome Discoverer
Determinierung der dynamischen Peaktiefe, individuelle Phosphorylierungsstellen-Wahrscheinlichkeiten, Anwendbarkeit für alle Fragmentierungstechniken
(Taus u. a., 2011)
1.4 Quantifizierung des Phosphoproteoms
Ein tieferes Verständnis der durch Phosphorylierungsgeschehnisse gesteuerten
Regulationsprozesse kann nur entstehen, wenn ein quantifizierender Vergleich von
verschiedenen Zuständen und Bedingungen möglich ist. In einem gelbasierten Ansatz
können die Signalintensitäten der phosphorylierten Proteine, die durch den phospho-
spezifischen Farbstoff Pro-Q angefärbt wurden, relativ zueinander quantifiziert werden
(siehe Abschnitt 2.1.5).
Mehrere verschiedene Quantifizierungsmethoden wurden im Laufe der Zeit für die
gelfreien Ansätze entwickelt und basieren auf stabilen Isotopen-Markierungen (z. B.
40
SILAC (stable isotope labeling of amino acids in cell culture) und 14N/15N-metabolischer
Markierung (Conrads u. a., 2001; Wu u. a., 2004; Ong u. a., 2002)), die in der Zellkultur
eingeführt werden können, oder auf Tags, die nachträglich auf Peptidebene (iTRAQ
(isobaric tags for relative and absolute quantitation), 18O-Markierung,
Dimethylmarkierung) eingebaut werden (Ross u. a., 2004; Muñoz & Heck, 2011;
Mirgorodskaya u. a., 2000; Yao u. a., 2001; Andersen u. a., 2009; Mertins u. a., 2012;
Boersema u. a., 2009b).
Die häufigsten Anwendungen zum Quantifizieren von phosphorylierten Peptiden
besteht in der SILAC-, in der iTRAQ-Methode und in der 14N/15N-metabolischen
Markierung (Gruhler u. a., 2005; Jones & Nühse, 2011; Liao u. a., 2012). Das Prinzip der
SILAC-Markierung beruht auf dem Vergleich der Proteine aus zwei unterschiedlichen
Zellkulturen, bei der in dem Medium einer Zellkultur eine Aminosäure gegen eine
durch stabile Isotope veränderte Aminosäure ausgetauscht wurde. Werden die zwei
Zellkulturen gemischt und die Peptide massenspektrometrisch analysiert, so können
die Peptide der Zellkulturen aufgrund des Massenshifts voneinander unterschieden
und quantifiziert werden (Ong & Mann, 2007). Die auf dem SILAC-Ansatz beruhende
Quantifizierung wurde von Soufi und Mitarbeitern für die Analyse des bakteriellen
Phosphoproteoms von B. subtilis angewendet (Soufi u. a., 2010). Eine weitere
Möglichkeit für die Quantifizierung von phosphorylierten Peptiden aus bakteriellen
Phosphoproteomen zeigten van Noort und Mitarbeitern, indem sie für M. pneumoniae
die Dimethyl-Markierung einsetzten (van Noort u. a., 2012).
1.5 Zielstellung der Arbeit
Im Rahmen dieser Dissertation sollte die Analyse verschiedener bakterieller
Phosphoproteome durchgeführt und innerhalb dieser Untersuchungen die aktuellsten
analytischen Methoden etabliert, angewendet und auf die jeweilige Fragestellung
angepasst werden.
Am Anfang stand die Optimierung der 2D-gelbasierten Phosphoproteomanalyse am
Modellorganismus B. subtilis im Vordergrund, die sich auf die Detektion der
phosphorylierten Proteine im 2D-Gel durch den phosphosensitiven Farbstoff Pro-Q
1 Einleitung 41
Diamond stützen sollte. Die Anwendung sollte sich dann auf die Erstellung einer
Phosphoproteommasterkarte sowie auf die Untersuchung der Veränderungen des
Phosphoproteoms bei unterschiedlichen physiologischen Bedingungen erstrecken.
Eine weitere Aufgabe bestand in der vergleichenden gelbasierten
Phosphoproteomanalyse einer sigB-Mutante von B. subtilis. Ziel dieser
Untersuchungen war es, Phosphorylierungsereignisse innerhalb der generellen
Stressantwort aufzudecken. Mutanten von bisher unbekannten Kinasen und
Phosphatasen des Bodenbakteriums sollten ebenfalls 2D-gelbasiert untersucht
werden, um potentielle Zielproteine der Kinasen und Phosphatasen zu identifizieren.
Darüber hinaus bestand die Aufgabe in der Anreicherung von weiteren unbekannten
Kinasen mittels eukaryotischer Kinaseinhibitoren.
Die Anwendung der 2D-gelbasierten Methode war dann für die
Phosphoproteomanalysen des humanpathogenen S. aureus vorgesehen. Um
verschiedene durch Phosphorylierungsereignisse gesteuerte Anpassungsmechanismen
und Regulationsprozesse aufzudecken und zu analysieren, sollten die Veränderungen
im Phosphoproteom im Hinblick auf verschiedene physiologische Bedingungen oder
Stresssituationen aufgezeigt werden.
Aufgrund des limitierten dynamischen Bereiches des 2D-Gels sollte der gelfreie
Phosphopeptidanreicherungsansatz für S. aureus etabliert und genutzt werden, um die
gelbasierten Untersuchungen zu komplettieren. Ferner wurde nach für die Virulenz
oder Regulation metabolischer Prozesse wichtigen Phosphorylierungsereignissen
gesucht.
Da die relative Quantifizierung über die Signalintensitäten der phosphorylierten
Proteine einen hohen technischen Aufwand erfordert und abhängig von der Qualität
der Pro-Q Diamond-Färbung ist, wurde nach einem alternativen Ansatz zur
gelbasierten Quantifizierung von phosphorylierten Proteinen gesucht.
Für diese Arbeit durfte und sollte der technologische Fortschritt genutzt werden, um
die aktuellsten auf Massenspektrometrie basierende Analysemethoden zu etablieren
und anzuwenden.
42
2 Ergebnisse und Diskussion
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden zur Untersuchung
bakterieller Phosphoproteome angewandt. Darunter die auf der Pro-Q® Diamond-
Färbung basierende 2D-Gel-Methode und die gelfreie Phosphopeptid-
anreicherungsmethode gemäß Olsen und Macek (Olsen & Macek, 2009). Mit Hilfe
dieser Methoden war es möglich, die Phosphoproteome von B. subtilis und S. aureus
global zu charakterisieren, die Dynamik zu verfolgen und spezifische Fragestellungen
zu beantworten. Diese Untersuchungen werden nachfolgend dargestellt.
2.1 Das Phosphoproteom von Bacillus subtilis
Aufgrund der wachsenden Erkenntnis der Bedeutung von
Phosphorylierungsereignissen im physiologischen Zellgeschehen von Bakterien geriet
die globale Analyse von Phosphoproteomen bakterieller Organismen in den Fokus des
Interesses. Als Gemeinschaftsarbeit entstand „Dynamics of protein phosphorylation on
Ser/Thr/Tyr in B. subtilis“ (Eymann u. a., 2007), in der das Phosphoproteom von
B. subtilis umfassend gelbasiert charakterisiert wurde. Insgesamt konnten 32 potentiell
phosphorylierte Proteine mittels phosphospezifischer Fluoreszenzfärbung
nachgewiesen und neun Phosphorylierungsstellen massenspektrometrisch identifiziert
werden. Zusätzlich wurde die Dynamik des Phosphoproteoms unter verschiedenen
physiologischen Bedingungen untersucht, wobei die größten Veränderungen unter
Glukosehunger beobachtet werden konnten. Im Folgenden sind die in dieser Arbeit
entstandenen Beiträge zu diesem Werk aufgeführt.
2.1.1 Optimierung der 2D-gelbasierten phosphosensitiven Pro-Q® Diamond Färbemethode
Als Basis für die Untersuchungen des Phosphoproteoms wurde die zweidimensionale
(2D)-Gelelektrophorese in Verbindung mit dem phosphosensitiven Farbstoff Pro-Q®
Diamond gewählt. Aufgrund der sehr niedrigen Abundanz der phosphorylierten
2 Ergebnisse und Diskussion 43
Proteine werden sehr hohe Anforderungen an die Färbemethode gestellt. Zum einen
müssen eine hohe Sensitivität und ein großes Maß an Spezifität gewährleistet sein,
zum anderen stellt die Quantifizierung von unterschiedlichen Signalintensitäten eine
große Herausforderung an die Reproduzierbarkeit der Methode. Die Handhabung des
Pro-Q-Farbstoffes war anfänglich problematisch, da vermehrt unregelmäßige
Hintergrundfärbungen, Schlieren- und Schmutzpartikelbildung auftraten (siehe
Abbildung 3). Diese Verunreinigungen erschwerten die Identifikation der
phosphorylierten Proteinspots sowie die relative Quantifizierung verschiedener
Signalintensitäten der phosphorylierten Proteine und erforderten eine Optimierung
der Methode.
Abbildung 3: Darstellung von Pro-Q-gefärbten Proteinspots in 2D-Gelen. Einige Schmutzpartikel wurden exemplarisch durch Pfeile hervorgehoben. Deutlich sind das verminderte Kontrastverhältnis zwischen dem Hintergrund und den einzelnen Proteinspots und die Schlierenbildung zu erkennen.
Zahlreiche unterschiedliche Pro-Q-Färbeprotokolle sind in der Literatur beschrieben
worden, die in der nachfolgend dargestellten Tabelle aufgeführt sind (siehe Tabelle 4).
Basierend auf diesen von Steinberg, Schulenberg und Agrawal und Thelen (Agrawal &
Thelen, 2005; Schulenberg u. a., 2004; Steinberg u. a., 2003) beschriebenen Methoden
wurde im Rahmen dieser Arbeit das neue Protokoll entwickelt.
44
Tabelle 4: Darstellung der verschiedenen in der Literatur beschriebenen Pro-Q-Färbemethoden. Diese wurden als Grundlage für die Optimierung der Pro-Q-Färbung herangezogen. Die optimierte Methode ist am Tabellenende aufgeführt. (AA = Essigsäure; MeOH = Methanol; EtOH = Ethanol; ACN = Acetonitril).
Hersteller: Invitrogen (2D-Gel):
Fixieren 1 x 30 min und 1 x ÜN in 50 % MeOH/10 % AA Waschen 3 x 15 min in Wasser Färben 1 x 1,5-2 h in 500 ml Pro-Q Entfärben 3 x 30 min in 20 % ACN, 50 mM Natriumacetat pH 4 Waschen 2 x 5 min in Wasser Schulenberg, 2003 (2D-Gel): Fixieren 1 x ÜN in 45 % MeOH/5 % AA Waschen 3 x 10-20 min in Wasser Färben 1 x 180 min in Pro-Q Entfärben 3 x hintereinander in 50 mM Natriumacetat, pH 4/15 % 1,2-Propandiol Steinberg, 2003 (1D-Gel): Fixieren 45 % MeOH / 5 % AA , 1 x 90 min bis ÜN Waschen 2 x 10-20 min in Wasser Färben 25-50 ml Pro-Q, 1 x 75-120 min Entfärben 3 x hintereinander in 50 mM Natriumacetat, pH 4, 3 x; oder 3 x hintereinander in 50 mM Natriumacetat, pH 4/4 % ACN; oder 3 x hintereinander in 50 mM Natriumacetat, pH 4/15 % 1,2-Propandiol Agrawal und Thelen, 2005 (2D-Gel): Fixieren 2 x 30 min in 50 % MeOH/10 % AA Waschen 2 x 15 min in Wasser Färben 1 x 120 min in 3 x verdünntem Pro-Q Entfärben 4 x 30 min in 20 % ACN/50 mM Natriumacetat pH 4 Waschen 2 x 5 min in Wasser Optimiertes Protokoll (diese Arbeit) (2D-Gel): Fixieren 2 x 30 min in 50 % EtOH/12 % AA Waschen 4 x 15 min in Wasser oder 2 x 15 min, 1 x ÜN und 1 x 15 min in Wasser Färben 1 x 150 min in 3x verdünntem Pro-Q Entfärben 3 x 30 min, 1 x 45 min in 20 % 1,2-Propandiol/50 mM Natriumacetat pH 4 Waschen 2 x 10 min in Wasser
Im Zuge der Optimierung wurden die jeweiligen Inkubationszeiten und die
Konzentration der Färbelösung angepasst, so dass ein sehr gutes Ergebnis in Bezug auf
Bildreinheit (Schmutzpartikel- und Schlierenfreiheit), Spotklarheit und
2 Ergebnisse und Diskussion 45
Reproduzierbarkeit erzielt wurde (siehe Abbildung 4). Des Weiteren wurden die zu
vergleichenden Gele parallel aus denselben Gellösungen hergestellt, die 2. Dimension
in derselben Laufkammer durchgeführt und dieselbe Färbemittel-Charge benutzt.
Als besonders wichtig in der Färbeprozedur stellten sich dabei die Länge der
Waschschritte und deren Wiederholungen nach dem Fixieren und dem Entfärben
ebenso wie das optimale Verhältnis von Färbezeit und der Länge der
Entfärbungsschritte dar. Eine vermehrte Schmutzpartikelreduzierung konnte durch
intensiveres Waschen nach dem Fixierschritt erreicht werden und die Schlierenfreiheit
durch mehrmaliges und verlängertes Waschen nach den Entfärbeschritten. Ferner
wurde darauf geachtet, dass die Verwendung gesundheits- und umweltschädlicher
Chemikalien vermieden wurde, so dass Methanol durch Ethanol und Acetonitril durch
1,2-Propandiol ersetzt wurde.
Abbildung 4: Das linke Gelbild zeigt das Ergebnis der optimierten Pro-Q-Färbemethode. Deutlich ist eine verminderte Hintergrundfärbung sowie Schlierenfreiheit und eine Schmutzpartikelreduzierung gegenüber den in Abbildung 3 dargestellten Bildern zu erkennen. Vergleichend wurde ein Gelbild (rechts) aus der Abbildung 3 dem Bild der optimierten Methode (links) gegenübergestellt.
46
2.1.2 Verwendung der Gesamtproteinfärbung zur verbesserten Identifizierung putativ phosphorylierter Proteine
Martin und Mitarbeiter beschrieben, dass der Pro-Q-Farbstoff nicht nur spezifisch
Serin-, Threonin- und Tyrosinphosphorylierungen anfärbt, sondern auch saure,
nicht-phosphorylierte Proteine. Es konnte jedoch bei Auswertung eines Pro-Q-Arrays
durch Martin u. a. festgestellt werden, dass diese unspezifischen Signale 64- bis
128-mal schwächer sind, als die Signale der eigentlichen phosphorylierten Proteine
(Martin u. a., 2003a, 2003b). 2009 zeigten Hempel und Mitarbeiter, dass ultrasaure
Proteine ebenfalls durch den Farbstoff angefärbt werden (Hempel u. a., 2009).
Zusätzlich ruft die unterschiedliche Selektivität aufgrund verschiedener Bindungsarten
des Farbstoffes an das phosphorylierte Protein divergente Färbeintensitäten hervor
(Steinberg u. a., 2003). Diese Eigenschaften erschweren die bildliche Identifikation der
phosphorylierten Proteine.
Die unspezifische Färbung des Pro-Q-Farbstoffes bringt jedoch einen großen Vorteil
mit sich, der sich insbesondere im Vergleich zu der früher üblichen radioaktiven 33/32P-Markierung zeigt. Aufgrund der Tatsache, dass bei der 33/32P-Markierung nur die
radioaktiv phosphorylierten Proteine dargestellt werden können, fehlt der Bezug zu
den unphosphorylierten Proteinen, die durch die Gesamtproteinfärbung angezeigt
werden. Dies erschwerte nicht nur die Identifizierung, sondern verhinderte ebenfalls
die Gegenüberstellung verschiedener Proteinisoformen (z. B. phosphoryliert und
unphosphoryliert). Durch das Vorhandensein der unspezifischen Proteinfärbung
(bedingt durch den Pro-Q-Farbstoff) ist es möglich, ein Zweikanalfarbenbild von der
Pro-Q-Färbung und der Gesamtproteinfärbung zu erstellen, indem die
korrespondierenden Proteinspots aufeinandergelegt werden.
Der Vorteil der Vergleichsmöglichkeit von Gesamtproteinfärbung und
Phosphoproteinfärbung wurde nun des Weiteren genutzt, um die genaue
Identifizierung der phosphorylierten Proteinspots zu ermöglichen. Die
Signalintensitäten der Pro-Q-Färbung (Bild der Pro-Q-Färbung im Zweikanalfarbenbild:
falschfarben rot) und der Gesamtproteinfärbung (Bild der Flamingo-Färbung im
Zweikanalfarbenbild: falschfarben grün) wurden zueineinander ins Verhältnis gesetzt.
Gemäß Jörg Bernhardt (Inst. f. Mikrobiologie, Universität Greifswald) wurden
2 Ergebnisse und Diskussion 47
diejenigen Ratios als signifikant für phosphorylierte Proteine angesehen, die außerhalb
einer Normalverteilung liegen, die aus den Verhältnissen von
Proteinmengensignalintensität und unspezifischer Signaltintensität des Pro-Q-
Farbstoffes resultiert (Eymann u. a., 2007). Im Zweikanalfarbenbild können diejenigen
Proteinspots, die eine Ratio außerhalb der Normalverteilung aufweisen und deren
Pro-Q-Signalintensität deutlich höher ist als die der Flamingo-Färbung, visuell als rote
Spots erkannt werden. Proteinspots deren Signalverhältnis innerhalb der
Normalverteilung liegt erscheinen gelb (nicht phosphoryliert) und Proteinspots ohne
Pro-Q Signal grün (nicht phosphoryliert). Die visuellen Eindrücke müssen jedoch immer
über die Berechnung der Ratios bestätigt werden. Als Gesamtproteinfärbung wurde
anfänglich die Colloidal Coomassie Färbung ausgewählt, da es sich um eine leicht zu
handhabende Färbemethode handelt, die sowohl preiswert als auch
massenspektrometrisch kompatibel ist (Harris u. a., 2007; Neuhoff u. a., 1988; Zhu u.
a., 2005). Nachteilig waren jedoch die geringere Sensitivität und der geringe lineare
Bereich dieser Färbemethode gegenüber den sich auf dem Markt befindlichen
Fluoreszenzfarbstoffen und letztendlich der Pro-Q-Färbung.
Tabelle 5: Darstellung von unterschiedlichen Gesamtproteinfarbstoffen und ihrer spezifischen Charakteristika.
Farbstoff Detektionslimit Linearer Bereich
Colloidal Coomassie 30 ng (Neuhoff u. a., 1988) eine Zehnerpotenz (Patton, 2002)
Silberfärbung ~0,5 ng (Blum u. a., 1987) eine Zehnerpotenz oder weniger (Patton, 2000)
Deep Purple™ Total Protein Stain (Fluoreszenz)
0,5 ng (Herstellerangaben) 4 Zehnerpotenzen (Bell & Karuso, 2003)
Flamingo™ Fluorescent Gel Stain (Fluoreszenz)
0,25 ng (Herstellerangaben) 3 Zehnerpotenzen (Herstellerangaben)
Pro-Q® Diamond (Fluoreszenz)
< 1 pg (Martin u. a., 2003a)
(Proteinmikroarray)
3 Zehnerpotenzen (Steinberg u. a., 2003)
48
In Tabelle 5 sind die in der Literatur beschriebenen Sensitivitäten und linearen
Bereiche der unterschiedlichen Färbungen aufgeführt.
Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass die Fluoreszenzfarbstoffe Deep Purple™ und
Flamingo™ einen deutlich größeren linearen Bereich aufweisen als die herkömmlichen
Absorptionsfärbungen und ein niedrigeres Detektionslimit gegenüber Colloidal
Coomassie zeigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Fluoreszenzfarbstoffe Deep
Purple und Flamingo im Hinblick auf ihre Sensitivität gegenüber Colloidal Coomassie
(Neuhoff u. a., 1988) und der Silberfärbung (Blum u. a., 1987) für das verwendete 2D-
Gelsystem und in der Anwendung mit der Pro-Q-Färbung getestet. Hierbei wurden die
im 2D-Gel aufgetrennten Proteine vorerst mit Pro-Q und nachfolgend mit jeweils einer
der aufgeführten Gesamtproteinfärbungen gefärbt. Die einzelnen Bilder wurden
mithilfe der Auswertesoftware Delta2D von Decodon (Greifswald) verglichen. Die
Ergebnisse sind in Abbildung 5 dargestellt. Keine der vier getesteten Färbemethoden
wies eine Inkompatibilität mit der vorangegangenen Pro-Q-Färbung auf, jedoch ist ein
Entfärbeschritt vor der Fluoreszenzfärbung mit Flamingo oder Deep Purple notwendig,
um die Vermischung von Pro-Q-Signalen und den Gesamtproteinsignalen
auszuschließen.
In Abbildung 5 sind die Zweikanalbilder der Farbstoffe Colloidal Coomassie, Deep
Purple, Flamingo und der Silberfärbung jeweils mit ihrem korrespondierenden Pro-Q-
Bild vergleichend dargestellt. Die Gesamtproteinfärbung wurde falschfarben grün und
die Pro-Q-Färbung falschfarben rot abgebildet. Die gelb erscheinenden Spots stellen
Proteine dar, die von beiden Farbstoffen angefärbt worden sind. Bereits visuell kann
die unterschiedliche Sensitivität der verschiedenen Gesamtproteinfärbungen an der
Anzahl und Dichte der grünen bzw. gelben Proteinspots wahrgenommen werden. Die
Anzahl der jeweils detektierten Spots ist in der dem Bild zugefügten Tabelle
zusammengefasst. Mit Hilfe der Silberfärbung wurde die größte Anzahl an Proteinspots
detektiert. Die Fluoreszenzfarbstoffe wiesen eine 6 - 22 % geringere Spotanzahl auf.
Mit Colloidal Coomassie konnten im Vergleich zur Silberfärbung nur 41 % der
Proteinspots identifiziert werden.
2 Ergebnisse und Diskussion 49
Farbstoff Detektierte Proteinspots
MS- Kompatibilität
Colloidal Coomassie
426 +
Deep Purple 810/756 (s.u.) + Silberfärbung 1035 - Flamingo 979/889 (s.u.) +
Abbildung 5: Zweikanalfarbenbilder der unterschiedlichen Gesamtproteinfärbungen (grün) jeweils zusammen mit deren korrespondierenden Pro-Q-Färbung (rot). Visuell können die unterschiedlichen Intensitäten der Färbungen anhand der Anzahl der Proteinspots erkannt werden. Die Tabelle fasst die mit Decodon Delta2D ermittelten Spotquantitäten und die massenspektrometrische Kompabilität der Farbstoffe zusammen.
50
Die Abbildung 6 gibt einen detaillierten Vergleich der beiden Fluoreszenzfarbstoffe
Deep Purple und Flamingo wieder.
Deep Purple: 756 Spots Flamingo: 889 Spots
Abbildung 6: Vergleich der Fluoreszenzfarbstoffe: oben: Zweikanalbild aus Flamingo-Bild (rot) und Deep Purple-Bild (grün); unten: Einzelbilder der beiden Fluoreszenzfarbstoffe (die Spotumrandungen wurden mithilfe der Decodon Delta2D-Software erstellt und ihre Anzahl ausgewertet).
2 Ergebnisse und Diskussion 51
Hierbei wurden jeweils die einzelnen Proteinspots für jedes Gelbild unter
Zuhilfenahme der Decodonsoftware detektiert (siehe Spotumrandungen) und gezählt.
Des Weiteren wurde auch hier ein Zweikanalbild der beiden unterschiedlichen
Färbungen zur besseren Visualisierung erstellt (grün = Deep Purple; rot = Flamingo;
gelb = Spot wurde durch beide Farbstoffe angefärbt). Die Abbildung macht deutlich,
dass die Flamingofärbung in dem mittleren bis unteren Massenbereich eine größere
Anzahl von Proteinspots anfärbt und eine 9-23 % größere Anzahl an Proteinspots im
Vergleich zu Deep Purple detektiert werden kann.
Obwohl die größte Anzahl an Proteinspots mit der Silberfärbung detektiert werden
konnte, wurde sie aufgrund des zu geringen linearen Bereiches, der zu geringen
Reproduzierbarkeit infolge der verschiedenen zur Färbung nötigen Schritte und der
massenspektrometrischen Inkompatibilität, von der weiteren Anwendung
ausgeschlossen. In Bezug auf die Sensitivität (höchste Anzahl an detektierten
Proteinspots) stellte sich der Flamingo-Farbstoff als optimal dar. Des Weiteren konnte
die einfache Handhabung des Farbstoffes, die sich in einer besseren
Reproduzierbarkeit ausdrückt, überzeugen. Dieser wurde nun für die folgenden
Untersuchungen eingesetzt.
2.1.3 Verifizierung der Pro-Q-Färbung via alkalischer Phosphatase von E. coli und radioaktiver Markierung mit 33P
Zur Validierung des 2D-gelbasierten Ansatzes, besonders zur Verifizierung der
Detektion der phosphorylierten Proteinspots, wurden im Rahmen dieser Arbeit
Kontrollversuche mit alkalischer Phosphatase von E. coli und Versuche mit
radioaktivem 33P (aus 33P-Phosphorsäure) durchgeführt. Beim ersten Versuch wurde
ein Proteinkontrollextrakt mit alkalischer Phosphatase gemäß den Herstellerangaben
inkubiert und nachfolgend mit dem Proteinextrakt die 2D-gelbasierte
Phosphoproteommethode durchgeführt (2D-Gel, Pro-Q-Färbung, Flamingo-Färbung).
Ein unbehandelter Proteinextrakt diente als Kontrolle. Die entstandenen Gelbilder des
behandelten und unbehandelten Proteinextraktes wurden unter Verwendung der
Delta2D-Software (Decodon Greifswald) miteinander verglichen (siehe Abbildung 7).
Aufgrund der Spezifität der alkalischen Phosphatase, die auf der Hydrolyse von
52
Phosphomonoestern basiert (Garen und Levinthal, 1960; Heppel u. a., 1962), sollte
durch die Zugabe eine Dephosphorylierung der O-Phosphatester an Serin, Threonin
und Tyrosin erreicht werden, so dass im Gelbild des behandelten Extrates geringere bis
gar keine Phosphorylierungssignale erwartet wurden.
In der Abbildung 7 sind die Unterschiede in der Anzahl und der Intensität der
phosphorylierten Proteinspots deutlich zu erkennen.
Im Bild des behandelten Extraktes sind alle putativ phosphorylierten Proteinspots, bis
auf Pyk-2, Pyk-3, RsbRA und RsbRB-1, deutlich in ihrer Signalintensität reduziert oder
treten nicht mehr in Erscheinung (siehe Abbildung 7A, rechts). Der Vergleich von den
Pro-Q-Bildern des behandelten und unbehandelten Extraktes zeigt, dass das Muster
der rotgefärbten und somit putativ phosphorylierten Proteine dem des
Zweikanalfarbenbildes Flamingo versus Pro-Q entspricht. Warum nur eine schwache
Reduzierung der Signalintensität der vier oben genannten Spots zu beobachten ist,
obwohl für jedes Protein eine Phosphorylierungsstelle massenspektrometrisch
bestimmt werden konnte (Phosphorylierungsstellen siehe Eymann u. a. 2007), bleibt
fraglich.
Eine mögliche Erklärung wäre, dass aufgrund der Proteinstruktur oder aufgrund von
Proteinkomplexbildung (z. B. Stressosomkomplex mit RsbRA und RsbRB) die
phosphorylierte Aminosäure der alkalischen Phosphatase nicht ausreichend zugänglich
war, so dass keine Dephosphorylierungsreaktion stattfinden konnte. Der Großteil der
putativ phosphorylierten Proteine wies eine deutliche Reduzierung der Signalintensität
unter Einfluss von alkalischer Phosphatase auf und zeigte damit, dass der gewählte
methodische Ansatz zur Identifizierung der phosphorylierten Proteine unter Einsatz
der Pro-Q- und Flamingofärbung vertrauenswürdige Ergebnisse liefert.
Es wurde ein weiterer Versuch zur Validierung der entwickelten 2D-Gel- und Pro-Q-
basierten Phosphoproteommethode durchgeführt. Hierbei wurde in vivo eine 33P-Markierung mit radioaktiver Phosphorsäure durchgeführt. Der Vorteil der
radioaktiven Markierung mit Phosphat gegenüber der Markierung mittels
radioaktivem ATP liegt in der direkten Aufnahme des Phosphats in die Zelle, in der das
Phosphat dann für den zellulären Metabolismus genutzt wird (Bendt u. a., 2003).
2 Ergebnisse und Diskussion 53
A)
B)
Abbildung 7: A) Vergleich der Zweikanalbilder des unbehandelten (links) und des behandelten Proteinextrakts (alkalische Phosphatase, rechts). Das Resultat der Flamingo-Färbung wurde falschfarben grün und das der Pro-Q-Färbung falschfarben rot eingefärbt. B) Vergleich der Pro-Q-Bilder des behandelten und unbehandelten Extraktes. In der Abbildung wurden die Proteinspots der alkalischen Phosphatase sowie die in ihrer Signalintensität unbeeinflussten phosphorylierten Proteine markiert.
54
Durch einen Verdau des gewonnen radioaktiven Proteinextraktes mit DNase und
RNase wird eine Hintergrundfärbung aufgrund von radioaktiv markierten DNA und
RNA vermieden. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass ausschließlich die das 33P-Isotop enthaltenden Proteine detektiert werden. Um einen direkten Vergleich zu
bekommen, wurden die im Gel aufgetrennten phosphorylierten Proteine mit dem
Pro-Q-Farbstoff und die Gesamtproteinmenge mit dem Flamingo-Farbstoff angefärbt,
bevor das Gel in getrockneter Form dem Phosphoscreening unterzogen wurde. So
konnte ein Vergleich der verschiedenen Phosphoprotein-Detektionen durchgeführt
werden. In Abbildung 8 sind die Gelbilder der unterschiedlichen Phosphoprotein-
Detektionen nebeneinander aufgeführt.
Abbildung 8: Vergleich der Bilder der Pro-Q-Färbung (links, rot) und der 33P-Markierung (rechts, rot) jeweils als Zweikanalfarbenbild mit der Gesamtproteinfärbung Flamingo (grün). Die Kreise markieren die jeweiligen Unterschiede (putativ phosphorylierte Proteine = rote erscheinende Spots).
Auffallend ist das sehr ähnliche Phosphorylierungsmuster des Gels der „ausgewerteten
Pro-Q-Färbung“ (d. h. das Muster der im Pro-Q/Flamingo-Vergleich als putativ
phosphoryliert ermittelten Spots) und des Gels der 33P-Markierung. Einzig die putativ
phosphorylierten Proteinspots von GlyA (Serin-Hydroxymethyltransferase) und TufA
(Elongationsfaktor Tu) konnten nur auf dem Pro-Q-Bild identifiziert werden. SdhA
2 Ergebnisse und Diskussion 55
(Succinat-Dehydrogenase) und ein unbekanntes niedrigmolekulares Protein wurden
ausschließlich auf dem radioaktiven Bild detektiert.
Mit diesen Kontrollversuchen konnte deutlich gezeigt werden, dass die Identifizierung
phosphorylierter Proteinspots mit Hilfe eines Vergleichs zwischen Signalen einer
Gesamtproteinfärbung und den Signalen einer Phosphoproteinfärbung (Pro-Q
Diamond) aussagekräftige und validierte Ergebnisse liefert.
Es ist jedoch fraglich, ob Pro-Q-Signale auch durch das Vorhandensein von Cofaktoren,
wie z. B. Pyridoxal-5-Phosphat und ATP oder phosphorylierten Substraten zustande
kommen. Der Kontrollversuch mit der alkalischen Phosphatase dient dabei nicht als
Gegenargument, da in der Literatur beschrieben wurde, dass das Enzym ebenfalls in
der Lage ist, Phosphat von Ribonukleotiden (z. B. ATP), Desoxyribonukleotiden und
inorganischen Pyrophosphaten abzuspalten (Heppel u. a., 1962).
Da bei der hier angewandten 2D-Gelelektrophorese denaturierte Proteine aufgetrennt
werden, können alle phosphorylierten Substrate und Cofaktoren, die nicht kovalent
gebunden werden, als Signalauslöser ausgeschlossen werden. In der Literatur sind nur
wenige phosphathaltige Cofaktoren und Substrate beschrieben, die kovalent
gebunden werden, darunter beispielsweise das Pyridoxal-5-Phosphat als prosthetische
Gruppe bei Aminotransferasen und das 2-Phosphoglycerat als Substrat der Enolase
(Boël u. a., 2004; Cerqueira u. a., 2011; Sivaraman u. a., 2001).
Durch die hier vorgenommenen Versuche kann nicht ausgeschlossen werden, dass die
Phosphorylierungssignale der Pro-Q-Färbung bzw. 33P-Markierung nicht auch durch
kovalent gebundene Cofaktoren oder phosphorylierte Substrate hervorgerufen
werden. Daher gelten die durch die Pro-Q-Färbung ermittelten phosphorylierten
Proteine im Folgenden so lange als putativ phosphoryliert, bis die spezifische
Phosphorylierungsstelle massenspektrometrisch bestimmt werden konnte.
2.1.4 Identifizierung von Pro-Q-gefärbten Proteinen aus dem 2D-Gel
Die Identifizierung phosphorylierter Proteine wurde für einen Proteinextrakt, der aus
Ethanol-gestressten Zellen (20 min 10 % Ethanol) von B. subtilis extrahiert wurde,
durchgeführt. Zur Charakterisierung der Pro-Q-gefärbten und somit putativ
56
phosphorylierten Proteinspots von B. subtilis fand eine massenspektrometrische
Analyse statt. Hierbei wurden die Proteinspots manuell aus dem Gel ausgeschnitten,
mit korrespondierenden Gelspots aus den Replikaten gepoolt und trypsiniert. Das
Peptidgemisch wurde mittels LC-ESI-MS/MS Analyse (LTQ-FTICR Massenspektrometer
(Thermo Electron, San Jose, USA)) in Kombination mit dem Ettan MDLC System
(GE Healthcare)) analysiert. Die Auswertung der Rohdaten erfolgte mit dem Sequest-
Algorithmus V.27.12 (siehe Abschnitt 3.2.6.1).
Die Abbildung 9 zeigt die Phosphoproteomkarte für die in dieser Arbeit entstandenen
Identifizierungen putativ phosphorylierter Proteinspots von B. subtilis.
Die rot markierten Proteinspots wurden in die Publikation (Eymann et al. 2007) mit
aufgenommen, die gelb markierten validierten bereits identifizierte Proteinspots und
die grün markierten Proteinspots wurden nachträglich im Rahmen dieser Arbeit
korrigiert.
In der Tabelle 6 sind die identifizierten Proteine, die Funktion und der jeweilige
Sequestscore aufgeführt (siehe auch Anhang I). Des Weiteren wurden die in anderen
Publikationen beschriebenen phosphorylierten Proteine mit einem Kreuz in der der
Publikation zugewiesenen Spalte markiert.
Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit 35 Pro-Q-gefärbte Proteinspots detektiert
werden. 32 wurden eindeutig identifiziert und konnten damit 21 verschiedenen
Proteinen zugeordnet werden. Für drei Proteinspots war nur eine
Mehrfachidentifizierung möglich. Es gelang, die genaue Phosphorylierungsstelle des
RsbR-Paralogs RsbRB1 (T186) zu spezifizieren (siehe Anhang Ib).
2 Ergebnisse und Diskussion 57
Abbildung 9: Zweikanalfarbenbild der Bilder der Pro-Q-Färbung (rot) und der Gesamtproteinfärbung Flamingo (grün). Die in dieser Arbeit mittels massenspektrometrischer Analyse identifizierten putativ phosphorylierten Proteinspots wurden markiert (rote Beschriftung: die Identifizierungen flossen direkt in die Publikation mit ein; gelb: Validierung von bereits identifizierten Spots; grün: nachträgliche Korrektur der Identifizierung).
58
Tabelle 6: Identifizierung der putativ phosphorylierten Proteine von B. subtilis. Die massenspektrometrischen Identifizierungen für die Pro-Q-gefärbten Proteinspots mit den dazugehörigen Proteinfunktionen und dem Sequestscore sind aufgelistet. Für RsbRB1 wurde die Sequenz des phosphorylierten Peptides mit aufgeführt, wobei die Raute das phosphorylierte Threonin markiert.
Unter den in dieser Arbeit identifizierten putativ phosphorylierten Proteinen befanden
sich überwiegend Proteine des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels, der Regulation der
SigB-Aktivität und der Cys.-, Met.- und Sulfat-Assimilierung (Einordnung gemäß
Subtiwiki http://subtiwiki.uni-goettingen.de/wiki/index.php/Main_Page). In der
Abbildung 10 sind die prozentualen Verhältnisse bezüglich der Verteilung der
identifizierten putativ phosphorylierten Proteine über die verschiedenen
physiologischen Gruppen wiedergegeben.
Proteinspot Proteinfunktion Sequest-Score phosphoryliertes Peptid
Levine u.a. 2006
Macek u.a. 2007/Soufi u.a.
2010CitZ/SerC CitZ: citrate synthase II (major) 80,39 x
SerC: phosphoserine aminotransferase 40,26DnaK DnaK: class I heat-shock protein (molecular chaperone) 160,28Eno1 Eno: enolase 110,38 x xEno2 Eno: enolase 100,38GapA GapA: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 140,36 xGapA/YxjG/YjcI GapA: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 100,31
YxjG: unknown; similar to unknown proteins from B. subtilis 90,30YjcI: unknown; similar to cystathionine gamma-synthase 60,30
GlyA GlyA: serine hydroxymethyltransferase 90,33 xGroEL GroEL: class I heat-shock protein (chaperonin) 250,36 xIcd1 Icd: isocitrate dehydrogenase 190,26 xIcd2 Icd: isocitrate dehydrogenase 180,26MetE MetE: cobalamin-independent methionine synthase 60,18 xPdxS1 (YaaD1) YaaD: unknown; similar to superoxide-inducible protein 110,32PdxS2 (YaaD2) YaaD: unknown; similar to superoxide-inducible protein 220,32PdxS3 (YaaD3) YaaD: unknown; similar to superoxide-inducible protein 120,33Pgm1 Pgm: phosphoglycerate mutase 90,29 xPyk2 Pyk: pyruvate kinase 130,35 xPyk3 Pyk: pyruvate kinase 70,28 xRsbRB1 YkoB: unknown; similar to positive regulator of sigma-B activity 170,31 K.STALLPLVGDIDT#ERAK.FSpoIIA SpoIIAA: anti-anti-sigma factor 60,29 x xThiG1 ThiG: hydroxyethylthiazole phosphate biosynthesis 140,34 xThiG2 ThiG: hydroxyethylthiazole phosphate biosynthesis 70,28TufA TufA: elongation factor Tu 100,27YhxB1 YhxB: unknown; similar to phosphomannomutase 210,33 xYhxB2 YhxB: unknown; similar to phosphomannomutase 220,34YhxB3 YhxB: unknown; similar to phosphomannomutase 150,32YwjH2 YwjH: unknown; similar to transaldolase (pentose phosphate) 30,18 x x
Validierungsproteine:Crh Crh: catabolite repression HPr-like protein 30,17GuaB2 GuaB: inosine-monophosphate dehydrogenase 60,23PurH/AsnS AsnS: asparaginyl-tRNA synthetase 120,23
PurH: phosphoribosylaminoimidazole carboxy formyl formyltransfera 80,26RsbV RsbV: positive regulator of sigma-B activity (anti-anti-sigma factor) 40,22 x xRsbRA1a RsbR: positive regulator of sigma-B activity 90,28 xRsbRA1b RsbR: positive regulator of sigma-B activity 90,28Tig Tig: trigger factor (prolyl isomerase) 140,32 x
sich später bestätigend:RsbRA2a RsbRA2a: positive regulator of sigma-B activity 60,28RsbRA2b RsbRA2b: positive regulator of sigma-B activity 70,27
2 Ergebnisse und Diskussion 59
Abbildung 10: Physiologische Einordnung der in dieser Arbeit identifizierten putativ phosphorylierten Proteine. (Die Einordnung erfolgte gemäß Subtiwiki).
Anhand der Identifizierungsergebnisse konnte ein Teil des Phosphoproteoms Ethanol
gestresster Zellen von B. subtilis analysiert werden. Ein vollständiger Überblick, der die
Ergebnisse von Anja Klutzny und die aus dieser Arbeit stammenden zusammenfasst, ist
in Eymann u. a. 2007 dargestellt.
Im Vergleich zu der Studie von Lévine und Mitarbeitern konnte eine Gemeinsamkeit
von 12 phosphorylierten Proteinen festgestellt werden (Lévine u. a., 2006). Neun
phosphorylierte Proteine wurden ebenfalls in den gelfreien Ansätzen von Macek u. a.
2007 und Soufi u. a. 2010 detektiert, diese wurden in der Tabelle 6 mit einem Kreuz
gekennzeichnet.
Die gemeinsam identifizierten phosphorylierten Proteine der verschiedenen Studien
verifizieren den hier gewählten Ansatz zur globalen Untersuchung des
Phosphoproteoms. Jedoch ist auffällig, dass die Überlappungen des gelbasierten (diese
Arbeit) und des gelfreien Ansatz (Macek u. a. 2007) nur sehr gering sind. Dafür sind
andere
Purin-Synthese
Ala-, Gly-, Ser- Synthese
Cys-, Met- und Sulfat-Assimilierung
Kontrolle der SigB-Aktivität
zentraler C-Metabolismus
0%10%
20%30%
40%
18%
9%
9%
14%
14%
36%
Physiologische Einordnung der identifizierten putativ phosphorylierten Proteine
60
nicht nur die unterschiedlich gewählten Wachstumsmedien verantwortlich, sondern
die Hauptursache ist anhand der unterschiedlichen physikalisch-chemischen
Bedingungen der jeweiligen Versuchsmethode erklärbar. Das 2D-Gel liefert in einem
definierten Massen- und pH-Bereich eine sehr gute Proteinauftrennung. Sehr kleine
(MW < 10 kDa), sehr saure (pH < 3) und sehr basische Proteine (pH > 11) sind jedoch
von der Analyse ausgeschlossen. Des Weiteren findet nur eine ungleichförmige
Absorption der Proteine an das Gel statt. Eine gute Trennung von hydrophoben
Membranproteinen ist mit dieser Methode nicht möglich, da sich die
Membranproteine oftmals nicht in nicht-ionischen bzw. zwitterionischen Detergenzien
lösen lassen oder bei pH-Werten in der Nähe ihres isoelektrischen Punktes
präzipitieren (Bunai & Yamane, 2005).
Aufgrund des Anspruchs, die Proteine voneinander zu separieren, ist die
Proteinladekapazität des Gels beschränkt. Hierin besteht ein großer Nachteil
gegenüber dem Anreicherungsverfahren, da mit steigender Anzahl an zur Messung zur
Verfügung stehenden phosphorylierten Peptiden, die Wahrscheinlichkeit der
Identifizierung der spezifischen Phosphorylierungsstelle zunimmt.
Der gelfreie Ansatz besticht dadurch, dass eine große Menge an Proteinextrakt
(10-50 mg) und somit eine größere Menge an phosphorylierten Peptiden für die
massenspektrometrische Analyse eingesetzt werden kann. Da während der
Zellaufschlussprozedur gemäß Macek u. a. 2007 das Detergenz Octylglucosid
eingesetzt wird, ist es möglich, dass sich im Proteinextrakt integrale Membranproteine
befinden und im Folgenden identifiziert werden. Diese können im gelbasierten Ansatz
nicht detektiert werden. Jedoch besteht die Begrenzung des gelfreien Ansatzes in der
Anreicherung von phosphorylierten Peptiden mit einem isoelektrischen Punkt (pI)
kleiner oder gleich dem pH der mobilen Phase der Kationenaustauschchromatographie
und in der Bindefähigkeit des Peptides an das Titaniumdioxid. Ist der pI des
phosphorylierten Peptides kleiner als der pH der mobilen Phase, liegt es nicht
vollständig protoniert vor und trägt dann keine, eine oder mehrere negative Ladungen.
In diesem Zustand kann das Peptid nicht an das Säulenmaterial binden und befindet
sich im Beladungsdurchfluss (Beausoleil u. a., 2004). Dessen Messung gestaltet sich
durch Harnstoffverunreinigungen (aus der Probenvorbereitung) und durch die erhöhte
2 Ergebnisse und Diskussion 61
Peptidkomplexizität als problematisch, so dass nur hochabundante Phosphopeptide
identifiziert werden können.
Der detaillierte Vergleich der Ergebnisse zum Phosphoproteom von B. subtilis aus dem
gelbasierten Ansatz von Eymann und Mitarbeitern und dem gelfreien Ansatz von
Macek und Mitarbeitern (Eymann u. a., 2007; Macek u. a., 2007) zeigt, dass alle
phosphorylierten Peptide, die im gelbasierten Ansatz einen pI von 2,7 und niedriger
aufwiesen, im gelfreien Ansatz nur mit einer ausgelassenen Enzymschnittstelle
detektiert wurden. Diese Peptidverlängerung beeinflusste den pI des Peptides (siehe
Tabelle 7).
Tabelle 7: Gegenüberstellung von phosphorylierten Peptidsequenzen, die mit beiden Methoden identifiziert werden konnten. Zu jedem Peptid wurde der jeweilige pI aufgeführt (pI-Rechner: http://www.fmi.ch/members/reto.portmann/pepeval.html). Die aufgrund einer ausgelassenen Enzymschnittstelle hinzukommenden Aminosäuren wurden unterstrichen.
Protein- name
Peptidsequenz 2D-Gel-Ansatz
pI Peptidsequenz SCX-Ansatz
pI
AroA SNTELELLR 1,77 SNTELELLR 3,17 QK
RsbRA IALQELSAPLIPVFENITVMPLVGTIDTER 1,68 IALQELSAPLIPVFENITVMPLVGTIDTER 3,02 AK
YbbT AMDAEAGVMISASHNPVQDNGIK 3,01 AMDAEAGVMISASHNPVQDNGIK 3,01
YqhA EMINELSAPIMPITDGIGILPLVGEIDTHR 2,72 EMINELSAPIMPITDGIGILPLVGEIDTHR 3,69 AR
Zusätzlich beeinflusst die spezifische Aminosäurezusammensetzung des jeweiligen
Peptids die Bindungsaffinität an das Titandioxid. Je nachdem wie viele basische oder
saure Aminosäuren das Peptid enthält, vermindert oder erhöht sich die Affinität. Des
Weiteren weisen phosphorylierte Peptide unterschiedliche Elutionseffizienzen im
basischen Milieu auf (Klemm u. a., 2006). Ein weiterer wichtiger Faktor, der die
Bindungseffizienz von phosphorylierten Peptiden an das Titandioxid beeinflusst, ist das
Verhältnis von Peptidmenge zu Titandioxidpartikelmenge. Liegt eine im Verhältnis
gesehen zu geringe Menge an TiO2-Beads vor, werden bevorzugt
mehrfachphosphorylierte Peptide angereichert (Li u. a., 2009). Aufgrund der
unterschiedlichen Peptidkonzentrationen in den verschiedenen SCX-Fraktionen, ist
eine Optimierung der Partikelmenge nur bedingt möglich und Phosphopeptidverluste
können nicht ausgeschlossen werden. Das oben Benannte, die unterschiedlichen
62
Wachstumsmedien und die Analyse unterschiedlicher Wachstumsphasen erklären die
geringen Überlappungen zwischen den Identifizierungsergebnissen.
2.1.5 Dynamik des Phosphoproteoms unter veränderten physiologischen Bedingungen
Die große Stärke der 2D-gelbasierten Methode in Verbindung mit der
phosphosensitiven Pro-Q Diamond-Färbung liegt in der Visualisierungsmöglichkeit der
Dynamik des Phosphoproteoms unter verschiedenen umweltrelevanten Bedingungen.
Hierbei können die Veränderungen via Bildanalyseprogramm (z. B. Decodon Delta2D)
über einen Zeitverlauf detektiert und relativ quantifiziert werden. Vorteilhaft ist auch,
dass nicht nur einzelne Proteine und ihre Isoformen verfolgt werden können, sondern
dass globale Einblicke in die wichtigsten metabolischen Enzyme entstehen und so
ganze Regulationseinheiten in ihrer Gesamtheit analysiert werden können (Hecker
u. a., 2008). Die Untersuchungen zur Dynamik des Phosphoproteoms von B. subtilis
wurden anhand der oben beschriebenen 2D-gelbasierten Phosphoproteommethode
durchgeführt. Um Einblicke in die Regulation von Stressantwort und
Anpassungsmechanismen zu erhalten, wurden die Phosphorylierungs- und
Dephosphorylierungsgeschehnisse anhand der unterschiedlichen Signalintensitäten
phosphorylierter Proteine vor, während und nach Einwirkung des physiologischen
Stimulus untersucht. Die Vorarbeit zu den physiologischen Untersuchungen lieferte
Anja Klutzny (Greifswald) im Rahmen ihrer Diplomarbeit. Im Zuge der hier
vorliegenden Arbeit sollte das Phosphoproteom unter den physiologischen
Bedingungen Hitzestress und Ethanolstress erneut im Vergleich zum exponentiellen
Wachstum untersucht werden, um die vorliegenden Ergebnisse durch die Anwendung
des optimierten Protokolls zu verifizieren und statistisch zu untermauern. Die
Auswertung erfolgte via Decodon Delta2D. Die Ergebnisse flossen in die Arbeit Eymann
u. a. (2007) mit ein und werden im Folgenden dargestellt.
Ein wichtiger Parameter in der Betrachtung von veränderten Signalintensitäten
phosphorylierter Proteine ist die Signifikanzschwelle, über der eine Veränderung als
aussagekräftig angenommen werden kann. Um diese zu ermitteln, wurden die
Abweichungen der Signalintensitäten zwischen drei biologischen Replikaten derselben
2 Ergebnisse und Diskussion 63
physiologischen Bedingung analysiert, in dem die zur Basis 2 logarimierten
Verhältnisse (die log2-Ratios) zwischen den Replikaten gebildet wurden. Hierbei
wurden die Signalintensitäten der korrespondierenden phosphorylierten Proteinspots
aus der exponentiellen Phase miteinander verglichen. Es wurde erwartet, dass bei
einer vollständigen Übereinstimmung der Signalintensitäten der Proteinspots der
biologischen Replikate die log2-Ratio den Wert Null aufweist. In der Abbildung 11
wurden die mittleren log2-Ratios der miteinander ins Verhältnis gesetzten
Signalintensitäten in einer Häufigkeitsverteilung wiedergegeben und die mittlere
Standardabweichung eingezeichnet.
Abbildung 11: Ermittlung der Signifikanzgrenzen (lila-farbene Markierung) anhand der Häufigkeitsverteilung der mittleren log2-Ratios.
Aufgrund der Häufigkeitsverteilung wurde eine Signifikanzgrenze von 1 und -1 gewählt,
die in etwa der doppelten mittleren Standardabweichung entspricht.
Zur Überprüfung der empirisch ermittelten Signifikanzgrenzen wurden in der
Abbildung 12 die gemittelten Ratios für jeden putativ phosphorylierten Spot und deren
jeweiligen Standardabweichungen aufgeführt.
64
Abbildung 12: Darstellung der mittleren log2-Ratios aus drei biol. Replikaten für jeden einzelnen putativ phosphorylierten Proteinspot. Die Standardabweichungen innerhalb der biol. Replikate wurden als Fehlerbalken aufgeführt und die Signifikanzgrenzen eingezeichnet.
Aus der Abbildung 12 geht hervor, dass schlechtestenfalls eine Falschpositivenrate
(FDR) von 16 % und bestenfalls von 0 % zu erwarten ist. Aufgrund der niedrigen Anzahl
an Datenpunkten, begründet in der niedrigen Anzahl von putativ phosphorylierten
Proteinspots für B. subtilis, ergibt die Betrachtung, dass mit einer gewählten
Signifikanzgrenze von 1 und -1 im logarithmischen Zahlenraum eine optimale Balance
zwischen Sensitivität und Validität geschaffen ist. Diese Grenze wurde für die
nachfolgenden physiologischen Betrachtungen angewendet.
2 Ergebnisse und Diskussion 65
Unter Einfluss von 10 %igem Ethanol-Stress konnten sieben signifikante
Veränderungen in der Signalintensität putativ phosphorylierter Proteine im Vergleich
zu den Intensitäten unter Kontrollbedingungen (mittlere exponentielle Phase) relativ
quantifiziert werden (siehe Abbildung 13). Darunter wiesen RsbRA2a/b (Aktivator der
RsbT Kinase), RsbRB2 (RsbR-Paralog) und Pgm (Phosphoglycerat-Mutase) eine
verstärkte Signalintensität auf. Für die Proteinspots Pyk1, Pyk2 (Pyruvatkinase) und
RsbV (Anti-Anti-Sigmafaktor) wurde eine verminderte Signalintensität detektiert.
Abbildung 13: Log2-Ratios der Signalintensitäten (EtOH-Stresszeitpunkt vs. Kontrollzeitpunkt) der jeweiligen phosphorylierten Proteinspots für die verschiedenen Zeitpunkte. Die Signifikanzgrenzen wurden eingezeichnet.
RsbRA, RsbRB und RsbV sind Teil des SigB-Regulons der generellen Stressantwort. Die
beobachteten Phosphorylierungsereignisse spiegeln Ausschnitte des
Regulationsmechanismus der generellen Stressantwort unter Ethanolstress wider.
Unter Umweltstress, hier durch 10 % EtOH simuliert, findet eine zusätzliche
Phosphorylierung von RsbRA, RsbRB und RsbS des Stressosoms durch die Kinase RsbT
66
statt, die dadurch aus diesem entlassen wird und die Phosphatase RsbU stimuliert, die
wiederum für die Dephosphorylierung des Anti-Anti-Sigmafaktors RsbV verantwortlich
ist. Durch diese Dephosphorylierungsreaktion (im 2D-Gel-Versuch als Abnahme der
Signalintensität des phosphorylierten RsbV-Spots erkennbar), wird ein
Partnerswitchmechanismus initiiert, der Sigmafaktor SigB daraufhin entlassen und
somit die generelle Stressantwort ausgelöst (Eymann u. a., 2011) (im Detail siehe
Abschnitt 2.1.6).
Abbildung 14: Log2-Ratios der Signalintensitäten (Hitze-Stresszeitpunkt vs. Kontrollzeitpunkt) der jeweiligen phosphorylierten Proteinspots für die verschiedenen Zeitpunkte. Die Signifikanzgrenzen wurden eingezeichnet.
Unter Hitzestressbedingungen (54°C) konnten ebenfalls sieben signifikante
Veränderungen beobachtet werden, darunter eine erhöhte Pro-Q-Signalintensität der
Proteine RsbRA2 (a und b) der SigB-Regulationseinheit, GlyA (Serin-
Hydroxymethyltransferase; allein und in der Mehrfachidentifizierung), PdxS (Pyridoxal-
2 Ergebnisse und Diskussion 67
5'-Phosphat-Synthase; Spot 1 und 3) und GuaB1 (Inosin-Monophosphat-
Dehydrogenase (siehe Abbildung 14).
Das auftretende Signal des zweiten phosphorylierten RsbRA2-Proteins ist ebenfalls
durch den Mechanismus der generellen Stressantwort erklärbar (siehe oben).
Die vorliegenden signifikanten Veränderungen konnten durch einen Vergleich mit den
von Anja Klutzny durchgeführten Untersuchungen validiert werden. Ferner wurden
diese Analysen in die Auswertung für Eymann et al. 2007 mit aufgenommen und
vervollständigten somit die Untersuchungen zum Phosphoproteom von B. subtilis.
2.1.6 Untersuchung des Phosphoproteoms einer B. subtilis sigB-Mutante
Durch die Präsenz von mehreren alternativen Sigmafaktoren ist B. subtilis in der Lage,
bei sich ändernden Umweltbedingungen das Transkriptionsprogramm global
umzustrukturieren und sich somit an die jeweilige physiologische Situation anzupassen
(Gruber & Gross, 2003). Einer der bedeutendsten und am längsten bekannten ist der
alternative Sigmafaktor B. Über ihn wird die Expression der Proteine der generellen
Stressantwort, mit der sich die Zelle eine vielseitige, unspezifische und vorbeugende
Stressresistenz aufbaut, reguliert (Hecker & Völker, 2001; Hecker u. a., 2007; Price u.
a., 2001). Wichtige Ereignisse in dem Regulierungsprozess sind Phosphorylierungs- und
Dephosphorylierungsreaktionen bei der Weiterleitung von Umweltsignalen. Eine
kürzlich veröffentlichte Mikroarray-basierte Studie einer sigB-Mutante zeigt, dass
insgesamt 196 Gene unter die Regulation des SigB-Regulons fallen und verdeutlicht
somit die große Reichweite des SigB Regulons (Nannapaneni u. a., 2012).
In einem Vergleich zwischen den für B. subtilis im 2D-Gel identifizierten
phosphorylierten Proteinen (diese Arbeit und Eymann u. a. 2007) und den von
Petersohn u. a. sowie Nanapanenni und Mitarbeitern erstellten Array-Daten über die
SigB-abhängigen Gene zeigte sich, dass nur zwei im Gel identifizierte phosphorylierte
Proteine als SigB-abhängig detektiert werden konnten. Hierbei handelt es sich um den
Anti-Anti-Sigmafaktor RsbV und das RsbRA-Homolog RsbRD (YqhA) (Nannapaneni u. a.,
2012; Petersohn u. a., 2001). Folglich wurden in der Gegenüberstellung von Wildtyp
68
und Mutante unter exponentiellen Wachstumsbedingungen Veränderungen in der
Signalintensität bezüglich dieser beiden phosphorylierten Proteine erwartet.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Phosphoproteom einer isogenen sigB-Mutante
(ML6 = trpC2 ∆sigB CmR (Igo u. a., 1987)) im Hinblick auf SigB-abhängige oder SigB-
unabhängige Phosphorylierungsgeschehnisse untersucht. Dabei wurde das
Phosphoproteom des Wildtyps mit dem der sigB-Mutante während des exponentiellen
Wachstums und nach Einwirkung verschiedener Stressbedingungen verglichen.
Abbildung 15: Zweikanalfarbenbild der Pro-Q-Bilder des WT (gün) und der sigB-Mutante (rot). Die beiden Proteine, bei denen eine signifikant und reproduzierbare Veränderung der Pro-Q Signalintensität zu detektieren war, wurden mit einer grünen Beschriftung versehen.
2 Ergebnisse und Diskussion 69
Die Studien beruhten auf der oben beschriebenen 2D-Gel- und Pro-Q-basierten
Phosphoproteommethode. In Abbildung 15 ist das Zweikanalfarbenbild der Pro-Q-
Färbungen Wildtyp exponentielle Phase (grün) versus sigB-Mutante exponentielle
Phase (rot) dargestellt.
Die identifizierten putativ phosphorylierten Proteinspots wurden markiert und die
Signalintensitäten der korrespondierenden Phosphoproteine quantifiziert. Aus den
Quantifizierungsergebnissen geht hervor, dass der Anti-Anti-Sigmafaktor RsbV und das
RsbR-Homologen YqhA (heute RsbRD) in der sigB-Mutante ein signifikant vermindertes
Signal gegenüber den Signalen der WT-Proteine aufweisen (siehe Abbildung 16 und
Abbildung 17).
Weitere Proteine der SigB-Regulationseinheit, wie z. B. RsbRA, wiesen keine
Veränderungen auf.
Abbildung 16: Gegenüberstellung von Bildausschnitten aus den Gelbildern der Flamingo- und Pro-Q-Färbungen. Die jeweils veränderten Proteine YqhA und RsbV wurden eingekreist.
SigB wird in der Abwesenheit von Stress durch die Komplexbildung mit seinem Anti-
Sigmafaktor RsbW inhibiert. Gleichzeitig wirkt RsbW als Kinase und phosphoryliert den
Anti-Anti-Sigmafaktor RsbV am Serin 56 (Lévine u. a., 2006; Macek u. a., 2007). Der
Phosphorylierungsstatus von RsbV ist entscheidend für das Auslösen der generellen
Stressantwort. Bei beginnendem Stress oder Hunger wird jeweils eine spezifische
Phosphatase aktiviert (RsbP bei Energielimitation und Hunger; RsbU innerhalb des
Stressosoms bei plötzlichen Umweltstimuli wie z. B. Hitze), die RsbV dephosphoryliert.
70
Abbildung 17: Graphik der log2-Ratios der Signalintensitäten ML6 versus WT (Pro-Q-Färbung). Die Ratios für beide Proteine liegen über der Signifikanzschwelle von -1. Die Standardabweichung aus drei biologischen Replikaten wurde als Fehlerbalken dargestellt.
Diese Dephosphorylierungsreaktion löst den entscheidenden Partnerwechsel aus, bei
dem RsbV und RsbW einen Komplex eingehen, und dabei SigB von RsbW entlassen
wird. Der dann freie Sigmafaktor bildet einen Komplex mit dem Core-Enzym und die
Gene der generellen Stressproteine werden transkribiert (Eymann u. a., 2011; Hecker
& Völker, 2001; Hecker u. a., 2007; Price u. a., 2001). Bei Eintritt eines Umweltstimulus
wie beispielsweise Hitze oder Ethanol findet im Stressosom ebenfalls ein
Partnerswitchmechanismus statt. Die beteiligten Akteure sind die RsbR-Homologen,
die das Stresssignal wahrnehmen und die Kinase RsbT, die in einem Komlpex mit ihrem
Antagonisten RsbS und den RsbR-Homologen vorliegt. Tritt nun eine Stresssituation
ein, phosphoryliert RsbT seinen Antagonisten RsbS und wird somit aus dem Komplex
entlassen und kann die Phosphatase RsbU aktivieren (Eymann u. a., 2011).
In der Abbildung 18 sind der Mechanismus mit den verantwortlichen Enzymen und
deren Phosphorylierungs- bzw. Dephosphorylierungsreaktionen sowie die
Operonstruktur skizziert (modifizierte Abbildung nach Hecker et al 2007, Eymann et al.
2011). Die Phosphoproteine, die in der sigB-Mutante ein signifikant verringertes Pro-Q
Signal aufwiesen, wurden farbig markiert, damit deren Rolle in dem
Regulationsmechanismus deutlich wird.
-6
-4
-2
0
log2
-Rat
io
log2-Ratios der Signalintensitäten sigB-Mutante vs. WT
YqhA RsbV1
2 Ergebnisse und Diskussion 71
A)
B)
Abbildung 18: Skizzierte Darstellung A) der Operonstruktur des SigB-Regulons und B) der Regulation der generellen Stressantwort (modifiziert nach (Eymann u. a., 2011; Hecker u. a., 2007). Die Kinasen (rosa), die Phosphatasen (gelb), die Phosphorylierungen (rot) und das Stressosom (blauer Stern) wurden besonders hervorgehoben. Die Charakteristika der sigB-Mutante wurden einerseits durch Kreuze verbildlicht, andererseits wurden die in ihrem Phosphorylierungsstatus betroffenen Proteine grau markiert. Aufgrund der Übersichtlichkeit beschreibt der dargestellte Mechanismus nicht die Feedbackreaktionen.
Die verminderten bzw. fehlenden Signale (Pro-Q-Färbung) von RsbV und RsbRD (YqhA)
sind im Hinblick auf die Operonstruktur erklärbar (siehe Abbildung 18). Aufgrund des
fehlenden SigB-Proteins werden die Gene von RsbV und RsbW nur auf einem SigA-
72
abhängigen Basislevel transkribiert, das deutlich unter dem normalen Basisniveau liegt,
wenn beide Promotoren aktiv sind (siehe Operonstruktur). Das heißt, dass das
verminderte Signal des phosphorylierten RsbVs auf die verminderte Gesamtmenge von
RsbV zurückzuführen ist
Das fehlende Phosphorylierungssignal von RsbRD in der sigB-Mutante lässt sich
ebenfalls auf das Fehlen des Sigmafaktors SigB zurückführen. RsbRD wird als
SigB-abhängig und als Paralog von RsbRA beschrieben (Petersohn u. a., 1999); das Gen
ist jedoch nicht im selben Operon wie rsbRA lokalisiert. Gemäß Reeves und
Mitarbeitern, wird das rsbRD-Gen unter normalem Wachstum nur gering exprimiert
(aufgrund des fehlenden SigA-Promotors), wohingegen es eine starke SigB-abhängige
Expression unter EtOH-Stress zeigt (Reeves u. a., 2010). Daher ist das fehlende
Phosphorylierungssignal mit der fehlenden Menge an RsbRD-Protein begründenbar.
Das Gleichbleiben des Phosphorylierungssignals von RsbRA ist damit zu erklären, dass
das RsbRA- und das RsbT-Gen unter der Kontrolle des allgemeinen Sigmafaktor A
stehen und somit die Menge von exprimierten RsbRA und RsbT im WT und in der sigB-
Mutante gleich ist. RsbT ist als Kinase für die RsbRA und RsbRB/C/D
Phosphorylierungen verantwortlich (Akbar u. a., 2001; Eymann u. a., 2011) und folglich
bleibt das Phosphorylierungssignal von RsbRA in der Mutante bestehen.
Um einen Überblick über den Einfluss von SigB auf Phosphorylierungs- und
Dephosphorylierungsreaktionen bei Veränderungen von physiologischen Bedingungen
zu bekommen, wurde im Rahmen dieser Arbeit das Phosphoproteommuster der
sigB-Mutante unter drei verschiedenen physiologischen Bedingungen analysiert. Es
wurden die beiden Stressstimuli Ethanol (EK: 10 %) und Hitze (54°C), die über das
Stressosom wahrgenommen werden, als auch Glukosehunger, die über die
Phosphatase RsbP die generelle Stressantwort auslöst, untersucht. Bei keinem der drei
Stimuli konnten signifikante und reproduzierbare Veränderungen in den
Phosphorylierungssignalen im Vergleich zum WT beobachtet werden. Daraus kann
geschlussfolgert werden, dass die Mutation im sigB-Gen nur auf das
Phosphorylierungsgeschehen innerhalb des Regulons Auswirkungen hat, aber keinen
Einfluss auf den Phosphorylierungsstatus der im 2D-Gel visualisierbaren
phosphorylierten Proteine.
2 Ergebnisse und Diskussion 73
2.1.7 Phosphotyrosin-Detektion via 2D-Westernblot
Aufgrund des sehr geringen Anteils an phosphorylierten Tyrosinen wurde ein Weg
gesucht, die am Tyrosin phoshorylierten Proteine im Speziellen zu visualisieren. Des
Weiteren wurde ein Vergleich des Wildtyps mit einer Tyrosinphosphatasemutante
angestrebt, um die spezifischen Zielproteine der Tyrosinphosphatase identifizieren zu
können.
Die Untersuchungen erfolgten mit dem Phospho-Tyrosin Antikörper P-Tyr-100 der
Firma Cell Signaling. Laut Hersteller soll P-Tyr-100 eine hohe Affinität zu
phosphorylierten Tyrosinresten aufweisen. Diese Bindungsaffinität wäre unabhängig
von den umliegenden Aminosäuren und eine Kreuzreaktion mit phosphorylierten Serin
und Threoninresten soll nicht auftreten. Des Weiteren erwartet der Hersteller eine
Bindungsaffinät zu Tyrosin-phosphorylierten Peptiden aller Spezies.
Als Versuchsstämme wurde B. subtilis in seiner Wildtypform sowie eine yfkJ-
Tyrosinphosphatase-Deletionsmutante (PB645) und eine yfkJ-Tyrosinphosphatase-
Überexpressionsmutante (PB 1024) gewählt (Musumeci u. a., 2005). Alle drei Stämme
wurden freundlicherweise von Chester Price (University of California Davis) zur
Verfügung gestellt. Für den WT wurden 2D-Gel Westernblots angefertigt, um einen
Überblick über die bestehenden Tyrosin-Phosphorylierungen zu erhalten. In Abbildung
19 wurde das Bild des 2D-Gel Westernblots vom WT und ein Zweikanalfarbenbild des
WT, bei dem die Pro-Q-Färbung (rot) und die Gesamtproteinfärbung Flamingo (grün)
verdeutlicht wurden, gegenübergestellt.
Auf dem Westernblot konnten 169 Antikörper markierte Proteinspots identifiziert
werden (mit Decodon Delta2D). Im Gegensatz dazu konnten im Zweikanalfarbenbild 49
am Serin/Threonin oder Tyrosin putativ phosphorylierte Proteine ermittelt werden.
Folglich lässt der Vergleich zwischen Westernblot (in der Abbildung oben) und dem
Zweikanalfarbenbild der Gesamtproteinfärbung versus Pro-Q (unten) auf eine geringe
Spezifität des Antikörpers schließen.
Bei Macek und Mitarbeitern konnte 2007 in einem globalen Phosphoproteomansatz
gezeigt werden, dass nur 10 Prozent der gefundenen Phosphorylierungsstellen eine
Tyrosinphosphorylierung aufweisen (Macek u. a., 2007) und demonstrieren somit die
geringe Häufigkeit von Phosphorylierungsereignissen am Tyrosin.
74
Abbildung 19: Vergleich des 2D-Gel Phosphotyrosin-Antikörper Westernblots (oben) mit dem Zweikanalfarbenbild Flamingo vs. Pro-Q (unten.) Auffallend ist die deutliche Überzahl der Antikörper markierten Proteinspots gegenüber den identifizierten putativ phosphorylierten Proteinen der Pro-Q Färbung.
Die Ergebnisse des Westernblots zeigen jedoch die Detektion einer großen Anzahl von
Proteinen mit einer vermeintlichen Tyrosinphosphorylierung. Die Spezifität des
Antikörpers reicht demnach nicht aus, um Proteine mit Phosphorylierungen am
Tyrosin zu identifizieren.
2 Ergebnisse und Diskussion 75
Somit wurde diese Methode für einen Vergleich der Tyrosinphosphatasemutante und
der Überexpressionsmutante als nicht geeignet angesehen. Anzustreben ist eine
Verbesserung des Westernblots durch spezifischere Phospho-Tyrosin-Antikörper.
2.1.8 Anreicherung von Proteinkinasen mittels Kinaseinhibitoren
Eine Vielzahl der identifizierten phosphorylierten Proteine konnte bisher noch keiner
spezifischen Kinase als Zielprotein zugeordnet werden. Ein im Rahmen dieser Arbeit
durchgeführtes 2D-gelbasiertes Kinase- und Phosphatasemutantenscreening brachte
keine neuen Zielproteine hervor (vier Kinase- und drei Phosphatasemutanten wurden
in der exponentiellen Phase, sowie unter verschiedenen physiologischen Bedingungen
untersucht, Daten nicht gezeigt). Daher stand das Auffinden neuer, unbekannter
Kinasen im Vordergrund. Hierbei sollten nun die unbekannten Kinasen unter Einsatz
von Kinaseinhibitoren angereichert und massenspektrometrisch analysiert werden.
Diese Arbeit entstand in Kooperation mit der Gruppe von Prof. Dr. Lothar Jänsch (HZI
Braunschweig) unter der Anleitung von Dr. Josef Wissing.
Die Kinaseinhibitoren stellen eine Gruppe von niedrigmolekularen Liganden dar, die
eine ATP-kompetitive Eigenschaft aufweisen (Cohen, 2002; Godl u. a., 2003; Hidaka u.
a., 1984; Wissing u. a., 2004). 1978 stellte Erikson fest, dass der Transformationsfaktor
Src des Avian sarcoma Virus die Funktion einer Proteinkinase aufweist, die in
Säugetierzellen als Onkogen fungiert (Collett & Erikson, 1978). Mit dieser Erkenntnis
startete die Suche und Entwicklung von Kinaseinhibitoren. In der heutigen Zeit werden
Kinaseinhibitoren als Therapeutika bei humanen Krankheiten eingesetzt (insbesondere
bei Krebs), um gezielt regulatorische Mechanismen zu inhibieren, die durch abnormale
Phosphorylierungsreaktionen entstehen (Cohen, 2002). Sie werden jedoch ebenso als
Hilfsmittel zur physiko-chemischen Charakterisierung und zur Anreicherung von
Proteinkinasen eingesetzt (Brehmer u. a., 2005; Wissing u. a., 2004, 2007).
Lothar Jänsch und Josef Wissing entwickelten eine Fraktionierungstechnik, die auf
einer Auftrennung an vier verschiedenen immobilisierten Kinaseinhibitoren beruht, die
jeweils unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Wissing u. a., 2007). Gemäß ihrem
Protokoll fand im Rahmen dieser Arbeit eine Anreicherung von Kinasen aus einem
76
zytosolischen Proteinextrakt von B. subtilis unter Einsatz von vier an Sepharosebeads
gekoppelten eukaryotischen Kinaseinhibitoren (PP58, Purvalanol B (PurB),
BisindolylmaleimideX (BisX) und AX14596) statt. Abweichend von dem oben
aufgeführten Protokoll wurden zwei unterschiedliche Anreicherungsschritte
vorgenommen. Beim ersten Schritt wurde der Proteinextrakt in einem "Batchansatz"
mit dem an Sepharose gekoppelten Inhibitor PP58 inkubiert. Nachfolgend wurde der
Überstand chromatographisch mithilfe eines Äkta Explorers über drei
hintereinandergeschaltete Säulen, die jeweils einen Inhibitor enthielten, aufgetrennt.
Die Reihenfolge entsprach den Inhibitoren Bis --> AX14596 --> Pur. Elutionen mit
Eluent B (20 mM MgCl2, 5 mM AMP-PNP, 5 mM ADP, 1 mM vom korrespondierenden
freien Inhibitor und allen Additiven (50 mm HEPES, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.5 % Triton X-
100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mM NaF, and 0.1 mM Natriumorthovanadat))
erfolgten für die beiden Anreicherungsansätze getrennt. Die Eluate wurden
massenspektrometrisch analysiert.
Mit dieser Methode konnten zwei bekannte Proteinkinasen angereichert und
massenspektrometrisch identifiziert werden. Hierbei handelt es sich um die
Zweikomponentensystem-Sensorkinase DegS und die Kinase PrkC, welche in beiden
Aufreinigungsansätzen detektiert werden konnten. Bei PrkC handelt es sich um eine
bakterielle Proteinkinase, die Ähnlichkeiten zu eukaryotischen Hanks-Kinasen besitzt
und die in der N-terminalen katalytischen Region 10 der 12 konservierten Motive
aufweist. Aufgrund der eukaryotischen Charakteristika wurde eine Anreicherung dieser
Kinase in diesem Versuch erwartet. PrkD, ebenfalls eine Hanks-ähnliche Kinase von
B. subtilis, konnte nicht identifiziert werden.
Des Weiteren wurden sechs nicht-proteinogene Kinasen (FruK, GlpK, ThiD, ProB, Dck
und MtnK) und vier Proteine mit putativer Kinase bzw. Phosphotransferaseaktivität
(PtsG, SacP, TreP und ManP) in der Anreicherung identifiziert (siehe Tabelle 8).
2 Ergebnisse und Diskussion 77
Tabelle 8: Identifizierungsergebnisse der Kinaseanreicherung via Kinaseinhibitoren.
Proteinkinasen:
DegS
2K-Sensor-Histidinkinase
PrkC putativ Membran verlinkte Proteinkinase
Kinasen/Phosphotranferasen: FruK Fruktose-1-phosphat-Kinase GlpK Glycerolkinase ThiD putative Phosphomethylpyrimidinkinase ProB Glutamat-5-kinase Dck Desoxyadenosin-/Desoxycytidinkinase MtnK Methylribosekinase PtsG Kinase-/Phosphotransferaseaktivität SacP Kinase-/Phosphotransferaseaktivität TreP Kinase-/Phosphotransferaseaktivität ManP Kinase-/Phosphotransferaseaktivität
Abbildung 20: Identifizierungsergebnisse der bakteriellen Kinaseanreicherung via Kinaseinhibitoren.
78
In der Abbildung 20 sind die identifizierten Proteine gemäß ihrem Bekanntheitsgrad
und potentieller Kinaseaktivität eingeordnet.
Hierbei wird deutlich, dass der Großteil, nämlich 69 % (102 Proteine) der identifizierten
Proteine, bekannte Proteine ohne Kinasefunktion darstellen. Außerdem konnten 24
unbekannte Proteine detektiert werden, denen jedoch aufgrund von Ähnlichkeiten
Funktionen zugeordnet wurden.
Fraglich war, ob sich unter den Proteinen unbekannter Funktion unbekannte
Proteinkinasen befinden. Insgesamt konnten 20 von insgesamt 148 Proteinen mit
gänzlich unbekannter Funktion detektiert werden, davon 12 im PP58- und acht im
PurB/AX14596/BisX-Ansatz. Das entspricht einem Anteil von ca. 15 % (siehe Abbildung
20).
Die unbekannten Proteine wurden einer Motivsuche mit Interproscan (Hunter u. a.,
2009) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan) und einer Charakterisierung anhand
der UniprotKB (© 2002–2011 UniProt Consortium) unterzogen. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 9 zusammengefasst.
Zwei aus der Gruppe der Proteine mit unbekannter Funktion (YtmP und YerI) weisen
eine putative Phosphotransferaseaktivität auf. Mit Interproscan konnte in diesen
jeweils eine Proteinkinase-ähnliche Domäne identifiziert werden. Jedoch handelt es
sich vermutlich nicht um potentielle Proteinkinasen, sondern um Aminoglycosid-
Phosphotransferasen.
Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass es möglich ist, bakterielle Kinasen
bzw. Phosphotransferasen mithilfe eukaryotischer Kinaseinhibitoren anzureichern und
zu identifizieren. Der größte Teil der angereicherten, identifizierten Proteine stellt
jedoch keine Kinasen dar, sondern Proteine mit bekannter Funktion. Die Verteilung
über die einzelnen funktionellen Gruppen ist in dem Balkendiagramm in der Abbildung
21 dargestellt.
Der Hauptanteil der identifizierten angereicherten bekannten Proteine lässt sich in die
Gruppen der Transport-, Bindungs- und Lipoproteine sowie Proteine der
Membranelektronentransportkette und ATP-Synthasen einordnen. Außerdem wurden
ebenfalls Proteine des Aminosäuremetabolismus und ribosomale Proteine in erhöhter
Weise identifiziert.
2 Ergebnisse und Diskussion 79
Tabelle 9: Ergebnisse der Motivsuche mit Interproscan 4.8 und der Datenbankrecherche mit Uniprot KB.
UniprotKB / Interproscan 4.8
unbekannte Proteine: YabN YdcE NTP-Pyrophosphohydrolase MazG-verwandt, Bacilli YdfG YerH YerI Proteinkinase-ähnliche Domäne (Superfamilie) / Aminoglycosid-Phosphotransferase
YheA Phosphoprotein YheB YhfP NADP-Bindung YjlC YjlG YjoA Phosphoprotein YneP YozB YpmS YqfA YtmP Proteinkinase-ähnliche Domäne (Superfamilie) / Aminoglycosid-Phosphotransferase YubA YuiF YvbJ YxkC
unbekannte Proteine mit Ähnlichkeiten: YdaF YdeQ YdgI NADP YfiR YfiY Phosphoprotein
YfmT YhjG: YodC NADP YokG YonS YpfD Phosphoprotein YurT YwjH Phosphoprotein YxeB
80
Abbildung 21: Quantitative Einordnung der identifizierten bekannten Proteine in physiologische Gruppen. Etwaige vorhandene ATP-Bindungsstellen und/oder Phosphorylierungen wurden farblich dargestellt.
In der Abbildung 21 wurden ebenfalls die Anzahl der identifizierten Proteine mit ATP-
Bindestellen sowie Phosphorylierungsstellen abgebildet. Erkennbar ist hieraus, dass
nur ein geringer Anteil der identifizierten bekannten Proteine eine ATP-Bindungsstelle
besitzt und dies somit verdeutlicht, dass ein Großteil der bekannten Proteine
unspezifisch an die Kinaseinhibitoren bindet.
Der Anteil an Proteinkinasen beträgt in diesen Analysen 1,3 %. Im Vergleich zu den
Ergebnissen der Anreicherung von eukaryotischen Kinasen von Josef Wissing zeigt sich
dort eine Anreicherungseffizienz von 24-63 %, wobei sich PurB als der effektivste
Inhibitor zeigte (Wissing u. a., 2007).
2 Ergebnisse und Diskussion 81
Das vorherrschende Ziel der Untersuchungen war die Anreicherung und Identifizierung
von unbekannten Proteinkinasen. Durch die große Anzahl an identifizierten Proteinen
mit bekannter Funktion konnte nicht durch die alleinige Identifizierung eines Proteins
darauf geschlossen werden, dass es sich bei allen unbekannten Proteinen um
Proteinkinasen handelt. Die geringe Deckungsgleichheit zwischen den beiden
Anreicherungsansätzen (PP58 gegenüber PurB/AX14596/BisX) könnte die
unterschiedliche Spezifität ebenso wie die generelle Unspezifität der Kinaseinhibitoren
in Bezug auf bakterielle Systeme aufzeigen.
Erst durch eine Motivsuche in Verbindung mit einer Datenbankrecherche konnten von
den 15 % angereicherten unbekannten Proteinen zwei als putative Proteinkinasen
bzw. Phosphotransferasen identifiziert werden.
Folglich ist die auf eukaryotische Kinaseinhibitoren beruhende Anreicherungsmethode
für bakterielle Systeme zu unspezifisch, um eine alleinige Kinaseselektion aufgrund der
Identifizierungsergebnisse vornehmen und unbekannte Proteinkinasen sicher
detektieren zu können.
82
2.2 Das Phosphoproteom von Staphylococcus aureus
Begonnen wurden die Analysen zum Phosphoproteom von S. aureus mit einer
Detailanalyse des Anti-Anti-Sigmafaktors RsbV der generellen Stressantwort. In einer
Kooperation mit Jan Pané-Farré (Inst. f. Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität,
Greifswald) wurde die spezifische Phosphorylierungsstelle des Anti-Anti-Sigmafaktors
RsbV massenspektrometrisch analysiert. Anschließend folgten globale Untersuchungen
des Phosphoproteoms von S. aureus zum einen gelbasiert mit der zuvor für B. subtilis
optimierten Pro-Q basierten 2D-Gel Methode (siehe Abschnitt 2.1.1) und zum anderen
gelfrei mit dem Phosphopeptidanreicherungsansatz gemäß Olsen und Macek (Olsen
und Macek, 2009).
2.2.1 Identifizierung der P-Stelle von RsbV aus S. aureus via "negative-mode" an der Q-Trap4000
Eine erste Abwehrbarriere des mikrobiellen Organismus gegenüber äußerlichen
Umweltbedingungen oder Wirtseinflüssen stellt die generelle Stressantwort (siehe
2.1.6) dar. In dem ebenfalls Gram-positiven Bakterium B. subtilis findet eine
Dephosphorylierung des Anti-Anti-Sigmafaktors RsbV durch RsbU unter
umweltbedingter Stresseinwirkung statt. Diese Reaktion löst die Aktivierung des
Sigmafaktors B und somit die generelle Stressantwort aus. Die hierbei entscheidende
Phosphorylierungsstelle des RsbV Proteins wurde am Serin 56 beschrieben (Hecker u.
a., 2007; Macek u. a., 2007; Price u. a., 2001). Für detailliertere Einblicke in den
Mechanismus bei S. aureus wurde die Rolle der Proteinphosphatase RsbU bei
auftretendem alkalischem Stress näher untersucht (Jan Pané-Farré, Inst. f.
Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald). Unter anderem sollte
hierbei die spezifische Phosphorylierungsstelle im RsbV Protein von S. aureus in einer
massenspektrometrisch basierten Analyse detektiert und eventuelle Homologien zu
B. subtilis aufgedeckt werden.
Jan Pané-Farré stellte den in E. coli überexprimierten, aufgereinigten, in vitro
phosphorylierten und im 1D-Gel aufgetrennten Anti-Anti-Sigmafaktor RsbV zur
Verfügung (Pané-Farré u. a., 2009). Die dem phosphorylierten RsbV-Protein
2 Ergebnisse und Diskussion 83
entsprechende Gelbande wurde trypsiniert und die entstandenen RsbV-Peptide
wurden der massenspektrometrischen Analyse (MS-Analyse) zugeführt, die im Rahmen
der hier vorliegenden Arbeit durchgeführt wurde.
Die MS-Analyse erfolgte an der Q-Trap4000 (Applied Biosystems MDS Sciex), die mit
einem Dionex-HPLC-System (Dionex, LC Packings) kombiniert wurde. Es wurde hiermit
eine Technologie gewählt, die die selektive auf einem Triple-Quadrupol basierende
Tandem-Massenspektrometrie mit den sensitiven Produktionenscans der Ionenfalle
kombiniert und somit eine schnelle Identifizierung von Peptiden, die in sehr geringen
Konzentrationen vorliegen, wie z. B. Phosphopeptide, ermöglicht (Le Blanc u. a., 2003;
Hager, 2002; Williamson u. a., 2006).
Das hier angewandte Messverfahren bestand in einer informationsabhängigen
Akquisitionsmethode, bei der ein Vorläuferionenscan im negativen Ionenmodus den
für Serin und Threonin spezifischen Neutralverlust von m/z -79 Da detektiert und bei
Auftreten des Neutralverlust-Fragmentions ein MS/MS-Event für das Vorläuferion im
positiven Ionenmodus auslöst. Mit dieser Methode können somit speziell die
phosphorylierten Peptide detektiert, fragmentiert und mit Massenanalysatoren
analysiert werden.
Die Schwierigkeit bestand in der Erlangung eines stabilen Sprays während der
negativen Ionisierung der Peptide. Zur Erzeugung des Elektrosprays wurde eine
NanoSpray II-Quelle benutzt, in der ein MicroIonSpray II-Kopf mit einem T-Stück
implementiert war. Durch dieses T-Stück war es möglich, nicht nur das Eluat aus der
HPLC, sondern auch ein zusätzliches Lösungsmittel zur Erhöhung der
Ionisierungseffizienz und zur Verbesserung des Sprays dem Sprayprozess zuzuführen.
Als additives Lösungsmittel wurden 80 % (v/v) Isopropanol, 10 % (v/v) Acetonitril,
0,1 % (v/v) Essigsäure verwendet (Christoph Lenz, Applied Biosystems MDS Sciex).
Insgesamt wurden 200 nl/min Eluat aus der HPLC mit 100 nl/min zusätzlichem
Lösungsmittel (aus einer externen Spritzenpumpe) dem Sprayprozess zugeführt. Es
fand vor den Probenläufen eine Optimierung der an der Nadel anliegenden Spannung
anhand eines Gemischs aus 90 % Eluent A und 10 % Eluent B (aus der HPLC) und dem
oben beschriebenen Lösungsmittel statt. Die der massenspektrometrischen Analyse
84
anschließenden Datenanalyse erfolgte manuell mit dem Analyst- bzw. Bioanalyst-
Programm der Q-Trap4000.
Mit dieser massenspektrometrischen Analysemethode gelang es, die spezifische
Phosphorylierungsstelle von RsbV am Serin 57 zu identifizieren (siehe Abbildung 22)
und somit einen Homologiezusammenhang zu B. subtilis herzustellen; diese Ergebnisse
flossen in die Arbeit von Jan Pané-Farré mit ein (Pané-Farré u. a., 2009).
Abbildung 22: MS/MS-Spektrum des phosphorylierten RsbV Peptides. Die dem Peptid zugeordneten Fragmentionen der y-Ionenserie wurden markiert und die spezifische phosphorylierte Aminosäure im Spektrum als auch in der Aminosäuresequenz kenntlich gemacht. Dieses Spektrum wurde etwas modifiziert in die Arbeit von Jan Pané-Farré mit aufgenommen (Pané-Farré u. a., 2009).
Diese Phosphorylierungsstelle konnte in den unten dargestellten globalen Analysen
zum Phosphoproteom von S. aureus bestätigt werden (siehe Tabelle 10).
2 Ergebnisse und Diskussion 85
2.2.2 Globale Analysen zum Phosphoproteom von S. aureus
Um Einblicke in die durch Phosphorylierungsereignisse gesteuerten
Regulationsmechanismen zu erhalten, sollte im Rahmen dieser Arbeit global das
cytoplasmatische Phosphoproteom von S. aureus untersucht werden.
In einer früheren Studie von Lomas-Lopez und Mitarbeitern konnten diesbezüglich
unter Verwendung von 2D-PAGE und in vivo 32P-Markierung insgesamt 11
phosphorylierte Proteine identifiziert werden (Lomas-Lopez u. a., 2007). Die Studie
beinhaltete jedoch keine weitere Spezifizierung der jeweiligen
Phosphorylierungsstelle, konnte aber durch in vitro Analysen neun dieser
phosphorylierten Proteine als Substrate einer Serin-Threonin-Kinase (homolog zu PknB
Donat u. a., 2009) detektieren.
Aufgrund der im Vergleich zu anderen bakteriellen Phosphoproteomen geringen
Anzahl an bisher identifizierten phosphorylierten Proteinen und dem Fehlen der
Spezifizierung der genauen Phosphorylierungsstellen, sollten gelbasierte und gelfreie
Untersuchungen durchgeführt werden, um umfassendere Einblicke in das
Phosphoproteom von S. aureus zu gewinnen.
2.2.2.1 2D-gelbasierte Analyse des Phosphoproteoms von S. aureus
Die gelbasierten Analysen wurden mit dem für B. subtilis optimierten Protokoll
durchgeführt (siehe Abschnitt 2.1.1 und 2.1.2). Die Detektion der phosphorylierten
Proteine erfolgte mithilfe des phosphosensitiven Farbstoffes Pro-Q Diamond und dem
Vergleich zur Gesamtproteinfärbung (Flamingo). Der Fokus lag vorerst auf der
Erstellung einer 2D-Gel-Phosphoproteomreferenzkarte. In Vorversuchen zeigte sich,
dass der größte Anteil an putativ phosphorylierten Proteinspots im pH-Bereich 4,5 bis
5,5 lokalisiert ist. Daher konnten Zoomgele im pH-Bereich 4,5-5,5 verwendet werden,
die zu einer verstärkten Protein-Auftrennung im Vergleich zum pH 4-7 Standardgel
führten (siehe Abbildung 23).
86
Abbildung 23: Vergleich der Auflösungsunterschiede zwischen Gelen im pH-Bereich 4-7 und 4,5-5,5 . Drei Beispielproteine wurden aufgezeigt. Die phosphorylierten Proteine wurden falschfarben rot dargestellt und mit einer Umrandung versehen. Die unphosphorylierten Proteine wurden falschfarben grün-gelb angefärbt. Augenfällig ist die bessere Trennung der Proteine im Zoomgel pH 4,5-5,5. Besonders eindrucksvoll ist die deutliche Separierung der phosphorylierten Proteine SACOL0564 und AhpF, die erst durch die Verwendung des Zoomgels als zwei unterschiedliche Proteinspots wahrgenommen werden konnten.
Die Abbildung 23 verdeutlicht die verbesserte Trennung der Proteinspots in
horizontaler Ebene im Zoomgel. Für die drei putativen phosphorylierten Spots des
Proteins DeoB konnte eine Separierung von einem hoch abundanten,
unphosphorylierten Protein erzielt werden. Die beiden Proteine SACOL0564 und AhpF,
die jeweils in drei putativ phosphorylierten Isoformen im Gel vorliegen, konnten erst
durch die Auftrennung im Zoomgel voneinander unterschieden werden. Dies
ermöglichte im weiteren Versuchsgeschehen eine eindeutigere Identifizierung und
eine verbesserte relative Quantifizierung der Signalintensitäten der phosphorylierten
Proteine. Durch die erhöhte Proteinladungskapazität von 400 µg des pH 4,5-5,5 IPG-
Streifens gegenüber 200 µg des pH 4-7 IPG-Streifens stand die doppelte Menge an
phosphoryliertem Protein für die massenspektrometrische Analyse zur Verfügung und
2 Ergebnisse und Diskussion 87
dies steigerte somit die Identifizierungswahrscheinlichkeit für die spezifische
Phosphorylierungsstelle.
Es konnten jeweils für beide pH-Bereiche Phosphoproteommasterkarten erstellt
werden. Hierfür wurden die phosphorylierten Proteine im 2D-Gel mit dem Pro-Q-
Farbstoff angefärbt. Unter Zuhilfenahme der Gesamtproteinfärbung (Flamingo) konnte
unter Bildung der Ratio zwischen Pro-Q- und Flamingosignalintensitäten der zu
quantifizierenden Proteinspots die putativ phosphorylierten Proteine ermittelt werden
(siehe Abschnitt 2.1.2). Die detektierten Phosphoproteine wurden aus dem Gel
ausgeschnitten, trypsiniert und massenspektrometrisch analysiert.
In der Abbildung 24 und der Abbildung 25 sind die Phosphoproteommasterkarten der
zwei pH-Bereiche in Form von Zweikanalfalschfarbenbildern dargestellt. Alle putativ
phosphorylierten und massenspektrometrisch identifizierten Proteinspots wurden mit
der entsprechenden Protein-Abkürzung markiert.
Insgesamt konnten unter Verwendung des gelbasierten Ansatzes 121 putativ
phosphorylierte Pro-Q-gefärbte Proteinspots detektiert und diese 80 verschiedenen
Proteinen zugeordnet werden (siehe Abbildung 24 und Abbildung 25). Von diesen 80
phosphorylierten Proteinen lagen 36 in zwei oder mehr Isoformen vor.
Interessant ist das Auftreten von phosphorylierten Isoformen, da sie einen direkten
Hinweis auf durch Phosphorylierung regulierte Prozesse liefern können. In B. subtilis
beispielsweise konnten, im Rahmen dieser Arbeit (Daten gezeigt in Eymann u. a. 2011),
für das RsbRA Protein, einem Regulator der SigB-Aktivität, zwei phosphorylierte
Isoformen detektiert und ebenfalls zwei unterschiedliche Phosphorylierungsstellen
identifiziert werden. Daraus schlossen Eymann und Mitarbeiter auf eine zweite
Feedback-Schleife, die die Aktivität von SigB limitiert und auf den unterschiedlich
phosphorylierten Isoformen des RsbRA Proteins beruht (Eymann u. a., 2011).
Hierdurch wird deutlich, welche Bedeutung die Detektion verschiedener
phosphorylierter Isoformen bei der Aufklärung regulatorischer Mechanismen haben
kann.
88
Abbildung 24: Phosphoproteommasterkarte pH 4-7. Hierbei handelt es sich um ein Zweikanalfalschfarbenbild bei dem die phosphorylierten Proteinspots rot zu erkennen sind und die unphosphorylierten Proteine grün-gelb gefärbt wurden. Die Pro-Q gefärbten putativ phosphorylierten und identifizierten Proteinspots wurden mit ihrer Proteinabkürzung kenntlich gemacht.
Durch die Verwendung des Zoomgels pH 4,5-5,5 und die hiermit verbundene
verbesserte Auflösung, konnten 48 Pro-Q gefärbte Proteinspots zusätzlich identifiziert
werden, wohingegen sieben Proteinspots nur ausschließlich auf dem Standardgel pH
4-7 detektiert wurden.
2 Ergebnisse und Diskussion 89
Abbildung 25: Phosphoproteommasterkarte pH 4,5-5,5. (Legende s.o.). Zusätzlich wurden die neu unter Stressbedingungen erscheinenden phosphorylierten Proteinsspots rot eingezeichnet.
Grundsätzlich ist die Identifizierung der putativ phosphorylierten Proteine und deren
spezifischen Phosphorylierungsstellen abhängig von einer akkuraten und sensitiven
massenspektrometrischen Analyse. Im Vergleich zu den Analysen von B. subtilis
konnten durch die stetige Weiterentwicklung der Massenspektrometer im Rahmen
dieser Arbeit neue innovative Methoden zum Einsatz kommen, darunter die Methode
der "Multistage-Aktivierung" (MSA = Pseudo MSn), die für das häufig auftretende
Phänomen des spezifischen Neutralverlustes bei der massenspektrometrischen
Analyse von Serin- und Threonin-phosphorylierten Peptiden entwickelt wurde
(Schroeder u. a., 2004).
90
Dieser Neutralverlust tritt während der kollisions-induzierten Fragmentierung (CID) des
phosphorylierten Vorläuferions auf (zusammengefasst in (Boersema u. a., 2009a)).
Hierbei unterliegt der Vorläufer keiner vollständigen Fragmentierung, sondern es wird
ein kleines Molekül, in diesem Falle Phosphorsäure (H3PO4 --> neutral), abgespalten.
Das Charakteristische an dem von dieser Fragmentierung aufgenommenen
MS/MS-Spektrum ist die Fragmentarmut. Anhand dieses Fragmentionenspektrums ist
es oft nicht möglich, die genaue Phosphorylierungsstelle zu bestimmen. Das Prinzip der
MSA-Methode beruht auf der Annahme, dass der Neutralverlust immer auftritt. Daher
wird nach der ersten Aktivierung (MS2) eine zweite Vorläuferionaktivierung (MS3)
durchgeführt, die die Vorläuferionenmasse abzüglich des Neutralverlusts fragmentiert.
Dabei findet zwischen den beiden Aktivierungen MS2 und MS3 keine Leerung der
linearen Ionenfalle statt, so dass alle Fragmente der ersten und zweiten Aktivierung
gesammelt werden und somit ein komplexes, fragmentreiches Spektrum
aufgenommen wird (Boersema u. a., 2009a; Schroeder u. a., 2004).
Bezüglich der identifizierten, putativ phosphorylierten Proteine, bei denen bisher keine
Phosphorylierungsstelle identifiziert werden konnte, wurde in dieser Arbeit die MS-
Methode mit der Implementierung einer "Parentmasslist" erweitert. In diese Liste
wurden alle Massen der theoretisch möglichen Phosphopeptide des zu
untersuchenden Proteins aufgenommen. Hiermit wurde es möglich, bei auftretender
Detektion einer auf der Liste sich befindlichen Massen, eine bevorzugte
Fragmentierung des Vorläuferions dieser Masse durchzuführen. Das Ziel dieser
Methode bestand in der Fokussierung auf das niedrig abundante phosphorylierte
Peptid und nicht in der Erreichung einer guten Sequenzabdeckung zur Identifizierung
des zu untersuchenden Proteins. Mit dieser Methode ist es möglich, phosphorylierte
Peptide zu analysieren, die nicht zu den fünf hoch abundantesten (Orbitrap XL) im
Übersichtsscan gehören. Eine gesicherte Aussage über eine Verbesserung der
Ergebnisse bei Anwendung der Parentmasslist kann aufgrund des Versuchsaufbaus
nicht getroffen werden, da der zu analysierende Proteinspot aus mehreren
korrespondierenden Gelen gepoolt und trypsiniert wurde. Daher variierte die zur
Analyse vorliegende Proteinmenge. Die Menge des verdauten Proteinspots war
darüber hinaus für eine Zweifach-Messung nicht ausreichend, so dass für die
Wiederholung neue Proteinsspots aus anderen Gelen hinzugezogen werden mussten.
2 Ergebnisse und Diskussion 91
Jedoch konnten unter Verwendung der Parentmasslist spezifische
Phosphorylierungsstellen identifiziert werden.
Mit der Anwendung der neuen Orbitraptechnologie, die eine schnelle, hoch sensitive
und akkurate Analyse der zu untersuchenden Peptide ermöglichte, war es mit der
speziell für modifizierte Peptide ausgelegten Anwendung der Multistage-Aktivierung
(MSA) und der Implementierung einer „Parentmasslist“ in die MS-Methode gelungen,
trotz der sehr geringen Menge des jeweiligen phosphorylierten Proteins im 2D-Gel, 22
Phosphorylierungsstellen zu identifizieren. Diese Phosphorylierungsstellen verteilen
sich über 28 Pro-Q gefärbte Proteinspots und verifizieren 19 verschiedene
phosphorylierte Proteine (siehe Tabelle 10).
2.2.2.2 Analyse des Phosphoproteoms von S. aureus via gelfreier Phosphopeptidanreicherungstechnik
Die globale Analyse des Phosphoproteoms mit Hilfe einer speziellen
Phosphopeptidanreicherungstechnik wird schon seit vielen Jahren bei der Analyse von
phosphorylierten Proteinen in Eukaryoten eingesetzt (Neville u. a., 1997; Scanff u. a.,
1991). Erst mit der Nutzung von Titandioxid (Pinkse u. a., 2004) konnte die
Anreicherungstechnik auch erfolgreich auf bakterielle Organismen übertragen werden
(Larsen u. a., 2005; Macek u. a., 2007, 2008; Soufi u. a., 2008). In der von Olsen und
Macek weiterentwickelten Methode (Olsen & Macek, 2009), findet die Anreicherung
der phosphorylierten Peptide aus einem Peptidgemisch in zwei Schritten statt. Nach
dem Verdau eines kompletten Proteinextraktes wird das Peptidgemisch mittels
Kationenaustauschchromatographie SCX ("strong cation exchange chromatography")
vorfraktioniert und darauffolgend die Fraktionen mit Titandioxid inkubiert.
Anschließend wird eine massenspektrometrische Analyse der Phosphopeptid-
angereicherten Eluate durchgeführt.
Dieser gelfreie Ansatz gemäß Olsen und Macek wurde im Rahmen dieser Arbeit im
Haus etabliert und zur Untersuchung des Phosphoproteoms von S. aureus eingesetzt.
Für die Analysen wurden S. aureus Zellen aus der späten exponentiellen bzw.
transienten Wachstumsphase ausgewählt, um ein möglichst breites Spektrum an
phosphorylierten Proteinen abdecken und putativ phosphorylierte infektionsrelevante
92
Proteine detektieren zu können. Die massenspektrometrischen Analysen erfolgten,
wie unter Abschnitt 2.2.2.1 beschrieben, mit Anwendung der Multistage-Technologie.
Der methodische Versuchsablauf ist in der Abbildung 1 (siehe Abschnitt 1.3.2)
graphisch aufgeführt.
Insgesamt konnten mittels der Anreicherungstechnik 49 verschiedene
Phosphorylierungsstellen in 33 unterschiedlichen Proteinen detektiert werden.
Hierunter befanden sich 29 phosphorylierte Serin-, 10 phosphorylierte Threonin- und
10 phosphorylierte Tyrosinreste. Zwei phosphorylierte Peptide konnten nicht eindeutig
einem Protein zugeordnet werden (SodA1/SodA2; SACOL0912/SACOL1680). Die große
Anzahl an identifizierten Phosphorylierungsstellen (49) im Vergleich zu den mit der
gelbasierten Methode detektierten (22), verdeutlicht die große Stärke der
Anreicherungstechnik.
Mit beiden Analysemethoden konnten insgesamt 103 phosphorylierte Proteine und 68
verschiedene Phosphorylierungsstellen aus S. aureus identifiziert werden. Diese sind in
Tabelle 10 zusammenfassend aufgeführt.
Tabelle 10: Auflistung der phosphorylierten Proteine und ihrer spezifischen Phosphorylierungsstellen (wenn identifiziert). Unterschieden wurde zwischen dem gelbasierten bzw. gelfreien Ansatz und der Lokalisation auf den Gelen der zwei verschiedenen pH-Bereiche. X markiert die entsprechende Methode mit der das phosphorylierte Protein oder Peptid detektiert werden konnte. Grün hinterlegt wurden diejenigen Proteine, die nur gelfrei identifiziert werden konnten, wohingegen die in beiden Ansätzen identifizierten rot hinterlegt wurden. Dementsprechend sind die einzig im Gel identifizierten Proteine nicht farbig markiert.
Protein Proteinfunktion (original aus dem Suchergebnis übernommen)
P- stelle
Proteinspot
im 2D-Gel
Gel pH
4-7*
Gel pH 4.5- 5.5*
TiO2
AcnA aconitate hydratase Y310 AcnA
x
AhpC alkyl hydroperoxide reductase subunit C
AhpC
x
AhpF hypothetical protein SACOL1985
AhpF-1
x
AhpF hypothetical protein SACOL1985
AhpF-2
x
AhpF hypothetical protein SACOL1985 AhpF-3 x
2 Ergebnisse und Diskussion 93
Protein Proteinfunktion (original aus dem Suchergebnis übernommen)
P- stelle
Proteinspot im 2D-Gel
Gel pH
4-7*
Gel pH 4.5- 5.5*
TiO2
AhpF hypothetical protein SACOL1985
SACOL0564-1/ AhpF-1 (x)
AhpF hypothetical protein SACOL1985
SACOL0564-2/ AhpF-2 (x)
AhpF hypothetical protein SACOL1985
SACOL0564-3/ AhpF-3 (x)
ClpB ATP-dependent Clp protease, ATP-binding subunit ClpB
S426 x
ClpX ATP-dependent protease ATP-binding subunit
Eno-2/ClpX-1 x x
ClpX ATP-dependent protease ATP-binding subunit
Eno-3/ClpX-2 x x
CysK cysteine synthase
RpsB/CysK
(x)
DapA dihydrodipicolinate synthase
DapA x x
Dat D-alanine aminotransferase
Dat
x
DeoB phosphopentomutase T87 DeoB-1 x x
DeoB phosphopentomutase T87 DeoB-2
x
DeoB phosphopentomutase T87 DeoB-3 x x
DnaN DNA polymarease III subunit beta
Tuf-1b/DnaN-1 x x
DnaN DNA polymarease III subunit beta
Tuf-2b/DnaN-2
x
Efp elongation factor P
Efp x x
Eno enolase
Eno-1 x x
Eno enolase
Eno-2/ClpX-1 (x) (x)
Eno enolase
Eno-3/ClpX-2 (x) (x)
FbaA fructose-bisphosphate aldolase S50/ T212/T234
FbaA-1 x x
FbaA fructose-bisphosphate aldolase T234 FbaA-2 x x
FdaB fructose-1,6-bisphosphate aldolase
FdaB-1 x x
FdaB fructose-1,6-bisphosphate aldolase
FdaB-2
x
FemC glutamine synthetase S392 FemC-1/GatB-1 x x
FemC glutamine synthetase
FemC-2/GatB-2 x x
FolD methylenetetrahydrofolate dehydrogenase /methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase S190
x
FtsY cell division protein FtsY, putative
FtsY
x
FtsZ cell division protein
FtsZ
x
FusA elongation factor G T388 FusA-1 x x
FusA elongation factor G
FusA-2 x x
GapA1 glycerinealdehyde 3-phosphate dehydrogenase S210 GapA1-1 x x
GapA1 glycerinealdehyde 3-phosphate dehydrogenase
GapA1-2 x x
GapA1 glycerinealdehyde 3-phosphate dehydrogenase
GapA1-3 x x
94
Protein Proteinfunktion (original aus dem Suchergebnis übernommen)
P- stelle
Proteinspot
im 2D-Gel
Gel pH
4-7*
Gel pH 4.5- 5.5*
TiO2
GatB aspartyl/glutamyl-tRNA amidotransferase subunit B S196 FemC-2/GatB-2 (x) (x)
GatB aspartyl/glutamyl-tRNA amidotransferase subunit B
FemC-1/GatB-1 (x) (x)
GatB aspartyl/glutamyl-tRNA amidotransferase subunit B
GatB/GlyS
(x)
GlmM phosphoglucoseamine mutase S102 GlmM-1 x x
GlmM phosphoglucoseamine mutase S102 GlmM-2 x x
GlmM phosphoglucosamine mutase GlmM S102
x
GlpD Aerobic glycerol-3-phosphate-dhg.
GlpD/Zwf-1 x x
GluD NAD-specific glutamate dehydrogenase S264 GluD-2 x x
GluD NAD-specific glutamate dehydrogenase T267/S264 GluD-1 x x
GluD glutamate dehydrogenase, NAD-specific S264
x
GluD glutamate dehydrogenase, NAD-specific T267
x
GlyA serine hydroxymethyltransferase Y51
x
GlyS glycyl-tRNA synthetase
GatB/GlyS
x
Gnd 6-phosphogluconate dehydrogenase S167 Gnd/SucC
x
Gpm phosphoglycerate mutase
SACOL0534/Gpm
x
GuaB inosine-5'-monophosphate dehydrogenase
GuaB-1/LeuA-1 x x
GuaB inosine-5'-monophosphate dehydrogenase
GuaB-2/LeuA-2 x x
HchA chaperone protein HchA
HchA
x
HemC porphobilinogen deaminase S136/Y138
x
HemE uroporphyrinogen decarboxylase S92
x
HemL1 glutamate-1-semialdehyde aminotransferase
HemL1
x
HemL2 glutamate-1-semialdehyde aminotransferase
Pgk-1/HemL2 (x) (x)
HisC histidinol-phosphate aminotransferase
HisC
x
Hom homoserine dehydrogenase
Hom x x
IlvC ketol-acid reductoisomerase
IlvC-2
x
IlvC ketol-acid reductoisomerase
SACOL1958/IlvC-1 (x) (x)
IlvE branched-chain amino acid aminotransferase
IlvE-1
x
IlvE branched-chain amino acid aminotransferase
IlvE-2/MtlD-1
x
IlvE branched-chain amino acid aminotransferase
IlvE-3/MtlD-2
x
IsdB LPXTG cell wall surface anchor protein Y440/Y444
x
KatA katalse
KatA-1/SerA x x
KatA katalse
KatA-2 x x
2 Ergebnisse und Diskussion 95
Protein Proteinfunktion (original aus dem Suchergebnis übernommen)
P- stelle
Proteinspot
im 2D-Gel
Gel pH
4-7*
Gel pH 4.5- 5.5*
TiO2
LeuA 2-Isopropyl synthase
GuaB-1/LeuA-1 (x) (x)
LeuA 2-Isopropyl synthase
GuaB-2/LeuA-2 (x) (x)
MetE 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase
MetE-1 x x
MetE 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase
MetE-2 x x
MetE 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase
MetE-3 x x
MetE 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase S363
x
MetE 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase S394
x
MetE 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase T393
x
MetK S-adenosylmethionine synthetase
MetK-1
x
MetK S-adenosylmethionine synthetase
MetK-2 x x
Mqo2 malate:quinone oxidoreductase
Mqo2-1 x
Mqo2 malate:quinone oxidoreductase
Mqo2-2 x
MtlD mannitol-1-phosphate 5-dehydrogenase
IlvE-2/MtlD-1
(x)
MtlD mannitol-1-phosphate 5-dehydrogenase
IlvE-3/MtlD-2
(x)
PdhC branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase subunit E2
PdhC-1 x x
PdhC branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase subunit E2
PdhC-2/Pnp x x
PdhC branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase subunit E2
PdhC-3 x x
PdhD dihydrolipoamide dehydrogenase
PdhD-1 x x
PdhD dihydrolipoamide dehydrogenase
PdhD-2 x x
PepF oligoendopeptidase
PepF
x
PepV dipeptidase PepV
PepV x x
Pgi glucose-6-phosphate isomerase T143 Pgi x x
Pgk phosphoglycerate kinase
Pgk-1/HemL2 x x
Pgk phosphoglycerate kinase
Pgk-2 x x
Pgm phosphoglyceromutase
Pgm-1 x x
Pgm phosphoglyceromutase
Pgm-2
x
Pgm phosphoglyceromutase
Pgm-3
x
Pgm phosphoglycerate mutase, 2,3-bisphosphoglycerate-independent S62
x
Pnp polynucleotide phosphorylase/polyadenylase
PdhC-2/Pnp (x) (x)
PtsH phosphocarrier protein HPr S46 RsbV/PtsH (x) (x)
PtsI phosphoenolpyruvate-protein phosphotransferase
PtsI
x
Pyk pyruvate kinase T537 Pyk-1 x x
96
Protein Proteinfunktion (original aus dem Suchergebnis übernommen)
P- stelle
Proteinspot
im 2D-Gel
Gel pH
4-7*
Gel pH 4.5- 5.5*
TiO2
Pyk pyruvate kinase T537 Pyk-2 x x
Pyk pyruvate kinase T537 Pyk-3 x x
Pyk pyruvate kinase T537 Pyk-4 x x
Pyk pyruvate kinase T537 Pyk-5
x
Pyk pyruvate kinase S198
x
RpsA 30S ribosomal protein S1
RpsA
x
RpsB 30S ribosomal protein S2
RpsB/CysK
x
RpsB 30S ribosomal protein S2
RpsB-1 x x
RpsB 30S ribosomal protein S2
RpsB-2 x x
RsbV anti-anti-sigma factor RsbV S57 RsbV/(RsbV) x x
SACOL0178 PTS system, IIBC components Y187
x
SACOL0413 ribosomal-protein-serine acetyltransferase, putative
Y169/Y171
x
SACOL0427 hypothetical protein SACOL0427
SACOL0427-1
x
SACOL0427 hypothetical protein SACOL0427
SACOL0427-2
x
SACOL0427 conserved hypothetical protein Y52
x
SACOL0431 trans-sulfuration enzyme family protein
SACOL0431
x
SACOL0534 TatD family deoxyribonuclease
SACOL0534/ Gpm
(x)
SACOL0552 general stress protein 13 S105
x
SACOL0564 pyridoxin biosynthesis protein T155 SACOL0564-1/AhpF-1 x
SACOL0564 pyridoxin biosynthesis protein
SACOL0564-1
x
SACOL0564 pyridoxin biosynthesis protein
SACOL0564-2
x
SACOL0564 pyridoxin biosynthesis protein
SACOL0564-2/AhpF-2 x
SACOL0564 pyridoxin biosynthesis protein
SACOL0564-3
x
SACOL0564 pyridoxin biosynthesis protein
SACOL0564-3/AhpF-3 x
SACOL0597 chaperone protein HchA
SACOL0597 (HchA)
x
SACOL0617 hexulose-6-phosphate synthase, putative S52
x
SACOL0812 degV family protein
SACOL0812 x x
SACOL0875 thioredoxin, putative T7 SACOL0875
x
SACOL0875 thioredoxin, putative S88
x
SACOL0884 ABC transporter, substrate-binding protein
SACOL0884-1 x
SACOL0884 ABC transporter, substrate-binding protein
SACOL0884-2 x
SACOL0884 ABC transporter, substrate-binding protein
SACOL0884-3 x
SACOL0884 ABC transporter, substrate-binding protein
SACOL0884-4 x
SACOL0912 conserved hypothetical protein S37
x
SACOL0912 conserved hypothetical protein S5
x
SACOL0912 conserved hypothetical protein T52 x
2 Ergebnisse und Diskussion 97
Protein Proteinfunktion (original aus dem Suchergebnis übernommen)
P- stelle
Proteinspot
im 2D-Gel
Gel pH
4-7*
Gel pH 4.5- 5.5*
TiO2
SACOL0912/ SACOL1680 conserved hypothetical protein T17
x
SACOL0912/ SACOL1680 conserved hypothetical protein T22
x
SACOL0914 FeS assembly ATPase SufC
SACOL0914
x
SACOL1445 CbbQ/NirQ/NorQ/GpvN family protein
SACOL1445
x
SACOL1483 hypothetical protein SACOL1483
SACOL1483
x
SACOL1522 elastin binding protein, putative S128
x
SACOL1522 elastin binding protein, putative S2
x
SACOL1522 elastin binding protein, putative T64
x
SACOL1561 2-oxoisovalerate dehydrogenase, E1 component, beta subunit
SACOL1561 x x
SACOL1561 2-oxoisovalerate dehydrogenase, E1 component, beta subunit
SACOL1561
x
SACOL1588 proline dipeptidase T313 SACOL1588
x
SACOL1672 conserved hypothetical protein Y12
x
SACOL1679 conserved hypothetical protein S17
x
SACOL1679 conserved hypothetical protein S35
x
SACOL1680 conserved hypothetical protein T52
x
SACOL1749 NADP-dependent malic enzyme, putative
SACOL1749
x
SACOL1759 universal stress protein
SACOL1759
x
SACOL1788 conserved hypothetical protein S371
x
SACOL1789 conserved hypothetical protein S103
x
SACOL1789 conserved hypothetical protein T105
x
SACOL1895 conserved hypothetical protein S43
x
SACOL1895 conserved hypothetical protein T34
x
SACOL1958 putative lipid kinase
SACOL1958/IlvC-1 x x
SACOL2173 alkaline shock protein 23
SACOL2173-1 x x
SACOL2173 alkaline shock protein 23
SACOL2173-2 x x
SACOL2173 alkaline shock protein 23
SACOL2173-3 x x
SACOL2173 alkaline shock protein 23
SACOL2173-4
x
SACOL2173 alkaline shock protein 23
SACOL2173-5
x
SACOL2173 alkaline shock protein 23
SACOL2173-6
x
SACOL2173 alkaline shock protein 23
SACOL2173-7
x
SACOL2173 alkaline shock protein 23 S45
x
SACOL2255 conserved hypothetical protein Y11
x
SACOL2450 amino acid ABC transporter, permease protein S228
x
SACOL2501 phosphoglucomutase/phosphomannomutase family protein
SACOL2501 x
SACOL2501 phosphoglucomutase/phosphomannomutase family protein S193
x
SarA staphylococcal accessory regulator A S106
x
98
Protein Proteinfunktion (original aus dem Suchergebnis übernommen)
P- stelle
Proteinspot
im 2D-Gel
Gel pH
4-7*
Gel pH 4.5- 5.5*
TiO2
SarA staphylococcal accessory regulator A S109
x
SdhA succinate dehydrogenase flavoprotein subunit
SdhA/Zwf-2 x x
SerA D-3-phosphoglycerate dehydrogenase
KatA-1/SerA (x) (x)
SodA2 superoxide dismutase
SodA2-1 x x
SodA2 superoxide dismutase
SodA2-2 x x
SodA2/ SodA1
superoxide dismutase T34
x
SucC succinyl-CoA synthetase subunit beta S364 Gnd/SucC
(x)
SufD FeS assembly protein SufD S24
x
Tal putative transaldolase
Tal-1 x x
Tal putative transaldolase
Tal-2 x x
Tal putative transaldolase
Tal-3
x
Tig trigger factor
Tig
x
Tkt transketolase
Tkt-1 x x
Tkt transketolase
Tkt-2 x x
TpiA triosephosphate isomerase S215
x
Tuf elongation factor Tu S220 Tuf-1a x x
Tuf elongation factor Tu
Tuf-1b/DnaN-1 (x) (x)
Tuf elongation factor Tu
Tuf-2a
x
Tuf elongation factor Tu
Tuf-2b/DnaN-2
(x)
Zwf glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase
GlpD/Zwf-1 (x) (x)
Zwf glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase
SdhA/Zwf-2 (x) (x)
*Die Kreuze in den 2D-Gel-Spalten markieren die Detektion der einzelnen Proteinspots im jeweiligen Versuchsansatz. In einigen Proteinspots konnte jedoch keine eindeutige Identifizierung vorgenommen werden. Diese Mehrfachidentifizierungen pro Spot wurden in der Tabelle nur einmal mit einem Kreuz berücksichtigt, die zusätzlich identifizierten Proteine im Spot wurden durch ein Kreuz in Klammern markiert. Somit wurden Doppeltzählungen vermieden.
2.2.2.3 Vergleich der Resultate aus den gelbasierten und gelfreien Phosphoproteom-Analysemethoden
Zur Verdeutlichung der Notwendigkeit der Verwendung beider Methoden zur Analyse
des Phosphoproteoms wurden die Identifizierungsergebnisse miteinander verglichen.
In diesem Vergleich zeigte sich, wie auch schon in früheren Studien beschrieben
(Eymann u. a., 2007; Macek u. a., 2007), dass keine großen Gemeinsamkeiten zwischen
den Ergebnissen des gelbasierten und des gelfreien Ansatzes bestehen (siehe
2 Ergebnisse und Diskussion 99
Abschnitt 2.1.4). Insgesamt konnten in dieser Arbeit drei Phosphorylierungsstellen von
S. aureus mit beiden Methoden identifiziert werden (Glm (pS102), GluD (pT267/S264)).
10 gelfrei identifizierte Phosphorylierungsstellen verifizieren acht Pro-Q-gefärbte
putativ phosphorylierte Proteine der gelbasierten Methode (MetE (3 P-Stellen), Pgm,
Pyk, SACOL0427, SACOL0875, SACOL2173, SACOL2501, SodA2) in denen keine
Phosphorylierungsstelle gefunden werden konnte. 93 phosphorylierte Proteine
wurden mit jeweils nur einer Methode detektiert, davon 23 nur gelfrei und 70 Proteine
nur gelbasiert (siehe Abbildung 26 und Tabelle 10).
Abbildung 26: Venndiagramm über die Verteilung der identifizierten phosphorylierten Proteine zwischen der gelfreien und gelbasierten Methode.
Ein Vergleich der detektierten phosphorylierten Aminosäuren bei S. aureus zeigt eine
Gesamtaufteilung von 56 % p-Serin, 28 % p-Threonin und 16 % p-Tyrosin (Abbildung
27), die den allgemeinen Verhältnissen in bakteriellen Organismen entspricht (Macek
u. a., 2007, 2008). Auffällig ist, dass zwischen den angewandten Methoden eine
Diskrepanz zwischen den Verhältnissen auftritt. Der Schwerpunkt im gelbasierten
Ansatz liegt zu gleichen Teilen in den Serin- und Threonin-Phosphorylierungen, wobei
die Tyrosinphosphorylierung nur eine untergeordnete Rolle spielt. Im gelfreien Ansatz
wurde bei 60 % aller identifizierten Phosphopeptide ein phosphorylierter Serinrest
100
identifiziert, und es bestand eine Verteilung der Threonin- oder
Tyrosinphosphorylierung zu gleichen Teilen von jeweils 20 %.
Abbildung 27: Auftreten der verschiedenen phosphorylierten Aminosäuren in den unterschiedlichen Versuchsansätzen.
Fraglich ist, ob der Anreicherungsansatz eine bevorzugte Bindungsaffinität zu
Serinphosphorylierungen aufweist und dies die Diskrepanz zwischen den beiden
Methoden erklärt. In Tabelle 11 ist die Anzahl der aus der Literatur bekannten und die
aus dieser Arbeit hervorgegangenen Phosphorylierungsstellen, die mit dem gelfreien
Anreicherungsansatz identifiziert wurden, aufgelistet. Des Weiteren ist das
prozentuale Vorkommen von Serin-, Threonin- oder Tyrosinphosphorylierungen
aufgeführt.
Der Tabelle ist zu entnehmen, dass die Häufigkeit von Serinphosphorylierungen
zwischen 46 % und 69 % liegt. Nur bei Lactococcus lactis wurden mehr Threonin- als
Serinphosphorylierungen detektiert. Für B. subtilis, E. coli, H. salinarium, K.
pneumoniae, L. monocytogenes, H. pylori, M. pneumoniae und S. aureus hingegen
überwiegt die Anzahl der Serinphosphorylierungen, so dass eine bevorzugte
Bindungsaffinität zu Serinphosphorylierungen angenommen werden könnte.
gelbasiert
gelfreigesamt
010203040506070
P-Stellen pSerpThr
pTyr
22
1110
1
49
29
10 10
68
38
1911
Anza
hl #
2 Ergebnisse und Diskussion 101
Tabelle 11: Auflistung und Charakterisierung der verschiedenen in der Literatur und in dieser Arbeit mithilfe von SCX/TiO2 identifizierten Phosphorylierungsstellen.
Organismus P-Stellen % p-Serin
% p-Threonin
% p-Tyrosin
Referenz
Bacillus subtilis 103 69,2 20,5 10,3 (Macek u. a., 2007) Lactococcus lactis 73 46,6 50,7 2,7 (Soufi u. a., 2008) Escherichia coli 81 68 23 9 (Macek u. a., 2008) Halobacterium salinarum
56 46,4 44,6 9 (Aivaliotis u. a., 2009)
Klebsiella pneumoniae 93 31,2 15,1 25,8 (Lin u. a., 2009)(pTyr-Anreicherung)
Staphylococcus aureus 49 60 20 20 diese Arbeit Listeria monocytogenes 143 65 30 5 (Misra u. a., 2011) Helicobacter pylori 79 42,8 38,7 18,5 (Ge u. a., 2011)(nur
TiO2) Mycoplasma pneumoniae
93 58 37 5 (van Noort u. a., 2012) (nur SCX)
Eine Studie von Klemm und Mitarbeitern im Jahr 2006 konnte unter anderem an
synthetisch hergestellten Phosphopeptiden zeigen, dass keine bevorzugte Affinität von
S-, T- oder Y-Phosphopeptiden an TiO2 besteht (Klemm u. a., 2006). Sie konnten jedoch
feststellen, dass die Aminosäureszusammensetzung des phosphorylierten Peptids
Einfluss auf die Bindungsaffinität ausübt, so dass z. B. Phosphopeptide mit mehreren
basischen Aminosäuren eine geringere Affinität aufweisen als Peptide mit mehreren
sauren Aminosäuren. Die Identifizierung der phosphorylierten Peptide mittels ESI-
MS/MS hängt demnach von ihrer Bindungsaffinität an TiO2 ab und zusätzlich von der
Elutionseffizienz unter basischen Bedingungen, sowie dem generellen Peptidverlust bei
der sich anschließenden "reversed phase chromatography" (Klemm u. a., 2006).
Zusätzlich könnte vermutet werden, dass die Peptide mit Serinphosphorylierungen
eine bessere Ionisation in der massenspektrometrischen Analyse erfahren und somit
bevorzugt detektiert werden. Aus den oben erwähnten Versuchen von Klemm und
Mitarbeitern kann im Umkehrschluss dieses ebenfalls ausgeschlossen werden.
Generell konnten Steen und Mitarbeiter zeigen, dass keine verminderte Ionisierungs-
bzw. Detektionseffizienz von phosphorylierten Peptiden gegenüber ihren
unphosphorylierten Isoformen vorliegt, dass jedoch eine generelle unspezifische
Supression von Peptiden mit geringer Stöchiometrie unter gesättigten
102
Ionisierungsbedingungen, bei denen die Komplexität der Probe sehr hoch ist, auftritt
(Steen u. a., 2006). Folglich kann eine bevorzugte Detektion von
Serinphosphorylierungen im gelfreien Ansatz ausgeschlossen werden. Die Detektion
des phosphorylierten Peptides im gelbasierten Ansatz hängt von der Stöchiometrie
und der Aminosäurezusammensetzung desselben ab, so dass dies die pS/pT/pY-
Verteilung begründet.
Generell ist zu berücksichtigen, dass eine Verteilung zugunsten der
Serinphosphorylierung im Organismus vorliegen kann und die Methode dies
wiederspiegelt. Aufgrund der für S. aureus in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse und
dem Vergleich der Identifizierungen für B. subtilis wird deutlich, dass es durch die
unterschiedlichen physiko-chemischen Eigenschaften der gelbasierten und der
gelfreien Methode sinnvoll ist, beide zur Analyse des Phosphoproteoms eines
Organismus anzuwenden.
2.2.2.4 Funktionelle Einordnung der identifizierten phosphorylierten Proteine
Zur Spezifizierung regulationsabhängiger Prozesse, in denen
Phosphorylierungsgeschehnisse für die Steuerung verantwortlich sein könnten,
wurden die identifizierten, phosphorylierten Proteine anhand von funktionellen
Kategorien eingeordnet (JCVI Cellular Role Category; http://cmr.jcvi.org/cgi-
bin/CMR/CmrHomePage.cgi) (siehe Abbildung 28). 15 verschiedene Klassen konnten
unterschieden werden, womit die weitreichende Verteilung und die große
physiologische Bedeutung von Phosphorylierungsereignissen deutlich wird.
Diese facettenreiche Streuung ließ sich schon in vorangegangenen Untersuchungen
zum Phosphoproteom bakterieller Organismen beobachten (Eymann u. a., 2007;
Macek u. a., 2007, 2008; Schmidl u. a., 2010a; Soufi u. a., 2008).
Besonders auffällig ist, dass der größte Anteil an phosphorylierten Proteinen - bei
S. aureus entspricht das einem Anteil von 27 % - in den meisten untersuchten
bakteriellen Phosphoproteomen dem Energiemetabolismus zugeordnet werden kann.
2 Ergebnisse und Diskussion 103
Abbildung 28: Einordnung der identifizierten phosphorylierten Proteine in funktionelle Kategorien gemäß JCVI. Zusätzlich wird in zwei kleineren Tortendiagrammen die Verteilung innerhalb einer Methode mit den korrespondierenden Farben dargestellt.
In den Untersuchungen zum Phosphoproteom von S. aureus konnten 21 der 33
Enzyme des zentralen Kohlenstoffwechsels detektiert werden, und bei 10 von ihnen
konnte die direkte Phosphorylierungsstelle identifiziert werden. Der Vergleich zu der
früheren Studie von Lomas-Lopez (Lomas-Lopez u. a., 2007) zeigt drei
übereinstimmende phosphorylierte Enzyme (Eno, FbaA, TpiA). Aufgrund von PknB
Kinasemutante-Analysen wurde in der oben genannten Studie für das Protein FbaA
eine Phosphorylierungsstelle an einem Serin oder Threonin vorhergesagt. Diese
Vorhersage konnte bestätigt werden, da in den gelbasierten Untersuchungen zum
104
Phosphoproteom von S. aureus das Protein mit drei Phosphorylierungsstellen (S50,
T212 und T234) identifiziert werden konnte.
In einem Vergleich der Proteine des Energiestoffwechsels verschiedener bakterieller
Organismen wird deutlich, dass jeder einzelne Organismus sein eigenes und spezielles
Muster an phosphorylierten Proteinen aufweist. In der Tabelle 12 sind die aus der
Literatur bekannten Phosphorylierungsdaten der Glykolyse- und TCA-Enzyme aus
globalen Phosphoproteomstudien einander gegenübergestellt, so dass die spezifischen
Phosphorylierungsmuster ersichtlich sind. Hierbei werden nicht alle Ergebnisse der
bisher untersuchten bakteriellen Phosphoproteome wiedergegeben, sondern nur
diejenigen, die einen informativen Zugewinn in Bezug auf die Enzyme des
Energiemetabolismus liefern.
Einige wenige Phosphorylierungsstellen scheinen konserviert zu sein, darunter FbaA,
GapA und Pgm.
Bei vielen phosphorylierten Enzymen des Kohlenstoffwechsels ist der
Phosphorylierungsmechanismus noch unbekannt. Mehrere Möglichkeiten werden
diskutiert und beschrieben, darunter die Kinase-vermittelte Phosphorylierung, die
Autophosphorylierungsreaktionen oder die Bildung von kovalenten Intermediaten im
aktiven Zentrum des Enzyms (Boël u. a., 2004; Jolly u. a., 2000). Bei letzteren ist es
nicht ausgeschlossen, dass diese durch den Pro-Q-Farbstoff angefärbt werden können
und somit ein Phosphorylierungssignal liefern, dass nicht auf einer Ser-, Thr- oder
Tyrosinphosphorylierung beruht.
In S. aureus wird für die Serin-/Threoninkinase PknB eine wichtige Rolle in der
Regulation glykolytischer Enzyme vorhergesagt (Lomas-Lopez u. a., 2007; Ohlsen &
Donat, 2010). Jedoch lässt sich diese Rolle nicht auf andere Organismen übertragen, da
für die homologen Kinasen unterschiedlichste Funktionen vorhergesagt werden, wie
z. B. Aufgaben in der Stabilität von Zytoadhärenzproteinen, in der Virulenz und in der
Germination (Kristich u. a., 2007; Schmidl u. a., 2010b; Shah u. a., 2008).
In B. subtilis wurde durch Pietack und Mitarbeiter gezeigt, dass Icd ein Substrat der
Kinase PrkC (homolog zu PknB) darstellt, die Pyruvatkinase, die Enolase und die
Transketolase jedoch PrkC unabhängig phosphoryliert werden (Pietack u. a., 2010).
2 Ergebnisse und Diskussion 105
Tabelle 12: Gegenüberstellung verschiedener aus der Literatur bekannten Phosphorylierungsdaten der Glykolyse- und TCA-Enzyme. In die Tabelle wurden die spezifischen Phosphorylierungsstellen sowie die Detektion als Phosphoprotein mit aufgenommen. SA: S. aureus (Lomas-Lopez u. a., 2007; diese Arbeit); BS: B. subtilis (Eymann u. a., 2007; Lévine u. a., 2006; Macek u. a., 2007; Soufi u. a., 2010); LL: L. lactis (Soufi u. a., 2008); LR: Lactobacillus rhamnosus (Koponen u. a., 2012); LM: L. monocytogenes (Misra u. a., 2011); SP: S. pneumoniae (Sun u. a., 2010); MT: M. tuberculosis (Prisic u. a., 2010); CG: Corynebacterium glutamaticum (Bendt u. a., 2003); MP: M. pneumoniae (van Noort u. a., 2012; Schmidl u. a., 2010a); EC: E. coli (Macek u. a., 2008); NM: Neisseria meningitidis (Bernardini u. a., 2011); PA: Pseudomonas aeruginosa (Ravichandran u. a., 2009); HS: Halobacterium salinarium (Aivaliotis u. a., 2009).
106
Ein bekanntes Beispiel für eine regulative Phosphorylierung an einem Enzym des
Energiestoffwechsels ist die Phosphorylierung der Isocitratdehydrogenase von E. coli.
Hierbei spielt der Serinrest 113 im aktiven Zentrum des Enzyms eine Hauptrolle. Durch
Phosphorylierung des Serins wird die Bindung des Substrats (Isocitrat) an das aktive
Zentrum (einschließlich der Formierung einer Wasserstoffbrückenbindung zum Ser113)
durch Einführung einer negativen Ladung und der daraus resultierenden
Konformationsänderungen verhindert und eine Inhibierung des Enzyms hervorgerufen.
Diese Regulation findet unter Wachstumsbedingungen statt, bei denen Acetat als
alleinige C-Quelle genutzt wird und Enzyme des Glyoxylat-Bypass benötigt werden
(Cozzone & El-Mansi, 2005; Garnak & Reeves, 1979; Gonçalves u. a., 2012; Hurley u. a.,
1990).
Weitere Beispiele für die Regulation von Enzymen durch Phosphorylierung wurden für
die Isocitratlyase und die Enolase von E. coli beschrieben, wobei z. B. für die Enolase
eine Inhibierung durch Dephosphorylierung festgestellt werden konnte, der genaue
Regulationsmechanismus jedoch noch unbekannt ist (Dannelly u. a., 1989; Robertson
& Reeves, 1989).
2.2.2.5 Infektionsrelevante Phosphorylierungsereignisse
Aufgrund der Pathogenität von S. aureus und der Rolle als bedeutender nosokomialer
Keim ist die Suche nach infektionsrelevanten Phosphorylierungsereignissen von großer
Wichtigkeit. Im Folgenden werden die in dieser Arbeit identifizierten, phosphorylierten
Proteine näher betrachtet, für die in der Literatur eine Verbindung zu Virulenz,
Pathogenität und Resistenz zu recherchieren war.
2.2.2.5.1 Enzyme des Metabolismus
In den letzten zwei Dekaden wurde immer häufiger von glykolytischen Enzymen
berichtet, denen neben ihrer Aufgabe in der Glykolyse auch eine Rolle auf der
Zelloberfläche oder extrazellulär zuzuordnen ist. Sie wirken dort als Adhäsions-
vermittelnde Proteine, die die Gewebsinvasion fördern sowie das Immunsystem des
Wirtes manipulieren können und somit potentielle Virulenzfaktoren darstellen
(zusammengefasst in (Copley, 2012; Henderson & Martin, 2011; Pancholi & Chhatwal,
2 Ergebnisse und Diskussion 107
2003; Tunio u. a., 2010)). Diese "moonlighting"-Proteine stellen cytosolische Proteine
dar, die unerwarteterweise auf der Zelloberfläche oder extrazellulär detektiert werden
und an diesem Standort, abweichend von deren ursprünglichen Aufgabe, divergente
Funktionen erfüllen können. Diese neuen Funktionalitäten können auch aufgrund von
Konformationsänderungen, die z. B. durch posttranslationale Modifikationen
hervorgerufen werden, vom Protein ausgeführt werden (Copley, 2012). Der
Kontrollmechanismus für diese Proteine ist noch weitestgehend unverstanden.
Diskussionswürdig ist die Frage, wie diese "moonlighting"-Proteine ohne Signalpeptid
auf die Zelloberfläche gelangen. Zwei Möglichkeiten werden hierbei kontrovers
diskutiert. Die Vertreter der einen sind der Ansicht, dass die glykolytischen Proteine
durch Zelllyse in den extrazellulären Raum gelangen. Andere sind hingegen der
Auffassung, dass es noch unbekannte Sekretionsmechanismen geben muss
(Henderson & Martin, 2011). Einigkeit besteht jedoch darüber, dass die
"moonlighting"-Proteine eine wichtige Gruppe von Virulenzfaktoren darstellen, die in
der weiteren Forschungsarbeit berücksichtigt werden müssen. Einen ersten Hinweis
auf eine gesteuerte Sekretion liefern die Ergebnisse von Boël und Mitarbeitern. Sie
konnten zeigen, dass an die Enolase kovalent gebundenes 2-Phosphoglycerat die
Exkretion des Enzyms ermöglicht (Boël u. a., 2004).
Bisher wurden für viele bakterielle glykolytische Enzym eine "moonlighting"-Funktion
beschrieben (zusammengefasst in (Henderson & Martin, 2011)). Für S. aureus wurden
die Enolase, die Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH/GapA1) und die
Triosephosphatisomerase (TpiA) als "moonlighting"-Proteine dargestellt. Furuya und
Mitarbeiter wiesen TpiA eine zusätzliche Rolle als Plasminogen Bindungsfaktor zu
(Furuya & Ikeda, 2011). Eine Funktion als Transferrinrezeptor konnte für GapA1 gezeigt
werden (Modun u. a., 2000).
Für die Zelloberflächen lokalisierte Enolase wird eine Laminin-Bindungsfunktion
beschrieben (Carneiro u. a., 2004).
Im Rahmen dieser Arbeit konnten für TpiA (S215) und GapA1 (S210) jeweils eine
spezifische Phosphorylierungsstelle detektiert werden (siehe Tabelle 10). Des Weiteren
wurde die Enolase als putativ phosphoryliertes Protein über die Pro-Q-Färbung
nachgewiesen.
108
In den Untersuchungen zum Phosphoproteom von Mycoplasma pneumoniae und
Campylobacter jejuni konnte TpiA als putativ phosphoryliert nachgewiesen werden,
ohne jedoch die spezifische Phosphorylierungsstelle zu detektieren (Schmidl u. a.,
2010a; Voisin u. a., 2007). In B. subtilis wurde homolog zu S. aureus das Serin 213 von
Macek und Mitarbeitern als phosphoryliert identifiziert (Macek u. a., 2007). Die
demnach konservierte Phosphorylierungsstelle, ist in einem durch strukturelle
Beweglichkeit die Enzymaktivität beeinflussenden "loop" lokalisiert (Casteleijn u. a.,
2006) und könnte somit einen regulierenden Einfluss auf die Aktivität des Enzyms
ausüben.
Inwieweit die Phosphorylierungsereignisse bei der generellen Regulation des Enzyms
oder der "moonlighting"-Funktion eine Rolle spielen und somit Einfluss auf die
Pathogenität von S. aureus haben könnten, muss untersucht werden.
Ein in der Literatur beschriebenes potentielles antimikrobielles Therapieziel stellt die
Fruktose-1,6-Bisphosphataldolase FbaA dar (Fonvielle u. a., 2004).
Die Funktion der Fruktose-1,6-Bisphosphat (FBP)-Aldolasen ist vielgestaltig. Auf der
einen Seite spielen sie eine wichtige Rolle in der Glykolyse und der Gluconeogenese,
aber auf der anderen Seite wurden FBP-Aldolasen als "moonlighting"-Proteine
ebenfalls auf der Zelloberfläche z. B. des Bakteriums Neisseria meningitidis detektiert.
Weitere Analysen zeigten, dass oberflächen-exponiertes FbaA notwendig ist, um eine
optimale Adhäsion an Wirtszellen zu gewährleisten (Tunio u. a., 2010). In
Streptococcus pneumoniae wurde über eine oberflächen-assoziierte Lokalisation des
Proteins berichtet und eine Verbindung dessen zur Adhärenz an den Wirt postuliert
(Blau u. a., 2007).
Das Enzym FbaA von S. aureus wird der Klasse II der FBP-Aldolasen (FBA) zugeordnet,
da das Enzym für die Spaltung von Fruktose-1,6-Bisphosphat in Glycerinaldehyd-3-
phosphat (G3P) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) ein divalentes Kation (hier Zn2+)
als Elektrophil für die Reaktion benötigt (Marsh & Lebherz, 1992). Diese Klasse der
Aldolasen wird fast ausschließlich in niederen Organismen gefunden (Daher u. a.,
2010) und stellt somit ein interessantes Ziel für antimikrobielle Therapeutika dar (Blom
u. a., 1996; Tunio u. a., 2010). Bisher sind verschiedene FBA-Inhibitoren entwickelt
2 Ergebnisse und Diskussion 109
worden, die als Zinkchelator oder als "transition-state"-Analog fungieren und somit die
Funktion des Enzyms inhibieren (Daher u. a., 2010; Fonvielle u. a., 2004). Daher und
Mitarbeiter entwickelten FBA-Inhibitoren, die strukturverwandt zu dem Subtrat FBP
sind und Intermediatanaloge darstellen. In in vitro Analysen zeigten die vier neu
entwickelten Inhibitoren eine unterschiedliche, aber erfolgreiche Inhibierung der FBA.
In in vivo Wachstumsinhibierungsexperimenten konnte dieser inhibierender Effekt
nicht gezeigt werden. Die Autoren vermuten, dass es an dem Vorhandensein von
Phosphatgruppen liegen könnte, die eine Bindung des Inhibitors verhindern (Daher u.
a., 2010).
Im Rahmen dieser Arbeit konnte FbaA gelbasiert in zwei phosphorylierten Isoformen
detektiert werden. Eine Verifizierung des Phosphorylierungsstatus fand durch die
massenspektrometrische Spezifizierung der genauen Phosphorylierungsstelle am
Threonin 234 statt. Ein zusätzlicher Verdau des Proteins mit der Endoproteinase GluC
(V8 Proteinase von S. aureus) ermöglichte die Identifizierung von zwei weiteren
Phosphorylierungsstellen (T212 und S50). In mehreren früheren Studien wurde
gezeigt, dass es sich bei FbaA um ein Zielprotein bzw. Substrat der Serin-/Threonin
Kinase SA1063 (homolog zu PknB) handelt (Donat u. a., 2009; Lomas-Lopez u. a., 2007;
Truong-Bolduc u. a., 2008).
In einem Vergleich der aktiven Substratbindungstellen, die Daher und Mitarbeiter
aufgrund kristallographischer Analysen für H. pylori postuliert haben, zeigt sich, dass
zwei der identifizierten Phosphorylierungsstellen diejenigen Aminosäuren betreffen,
die als Substratbindungsstellen beschrieben wurden (S50 und S211 für S. aureus).
Somit bestätigt deren Identifizierung die Annahme von Daher, dass phosphorylierte
Aminosäuren in FbaA den Hemmeffekt des Inhibitors verhindern. Ein Alignment mit
der FBA von H. pylori und S. aureus verdeutlicht die Übereinstimmungen der
Substratbindungsstellen (siehe Abbildung 29).
Zusätzlich wurde das Alignment um Aldolasen anderer Mikroorganismen erweitert, um
die Konserviertheit dieser Phosphorylierungstellen zu überprüfen.
110
Abbildung 29: Ausschnitte aus dem Alignment der FBA-Aminosäuresequenzen verschiedener Mikroorganismen. Das Alignment wurde mit EXPRESSO (T-COFFEE, Version_9.02.r1228 (Armougom u. a., 2006; Di Tommaso u. a., 2011)) durchgeführt. Die Zink-chelatierenden Histidinreste wurden mit einer Raute (#) hervorgehoben und die substratbindenden Aminosäuren mit einem "*" bzw. einem "P" markiert. Die "P"-Markierungen spiegeln zusätzlich die potentiellen Phosphorylierungsstellen wider. Bereits als phosphoryliert gezeigte Aminosäuren wurden mit einem Kästchen umrahmt (Macek u. a., 2007; Misra u. a., 2011; Soufi u. a., 2008).
Es zeigte sich, dass drei verschiedene, dem aktiven Zentrum naheliegende an Serin-
und Threoninresten befindliche Phosphorylierungsstellen konserviert vorliegen (S50,
2 Ergebnisse und Diskussion 111
S211/T212 und T234) und in mehreren Organismen auch schon als phosphoryliert
identifiziert wurden (Macek u. a., 2007; Misra u. a., 2011; Soufi u. a., 2008).
Ebenso konnte für Streptococcus pneumoniae von Christian Hentschker zwei
Phosphorylierungsstellen im FbaA nachgewiesen werden, es handelt sich hierbei
ebenfalls um S50 und T211 (persönliche Mitteilung von Christian Hentschker
(Universität Greifswald), siehe Bäsell u. a. 2012 (eingereicht)). Interessant ist die
strukturelle Lage der Phosphorylierungsstellen im Protein.
Die Abbildung 30 zeigt die Struktur der FBP-Aldolase von M. tuberculosis, deren
Oberflächenfärbung auf einem Strukturalignment fünf verschiedener bakterieller
Klasse II Aldolasen beruht (M. tuberculosis, H. pylori, E. coli, Bacillus anthracis und
Campylobacter jejuni).
Abbildung 30: Struktur der FBP-Aldolase inklusive dem Substrat FBP von Mycobacterium tuberculosis. Die putativ phosphorylierten Aminosäuren wurden markiert. Gemäß dem Sequenz- und Strukturalignment wurden die verschiedenen Bereiche basierend auf ihrer Homologie eingefärbt. (gelb =schwach homolog; rot = stark homolog). Die Strukturen wurden aus der RscB-PDB-Protein-Datenbank übernommen und mit Chimera1.6.2 (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera) dargestellt.
112
Deutlich ist die homologe Struktur der Substratbindetasche zu erkennen, die als rote
Kammer in der Abbildung ersichtlich wird. Innerhalb der Tasche sind die
phosphorylierten Serinreste zu erkennen (lila).
Die Abbildung 31 zeigt die Substratbindetasche im Detail.
Abbildung 31: Struktur der FBP-Aldolase inklusive dem Substrat FBP von Mycobacterium tuberculosis. Dargestellt ist der Cartoon der Aldolase im Ganzen und die Substratbindetasche als Ausschnitt. Die bindenden Aminosäuren wurden als Stäbchen- oder "Ball and Stick"- Modell dargestellt. Die in S. aureus als phosphoryliert identifizierten homologen Aminosäuren wurden lila angefärbt. Die Strukturen wurden aus der RscB-PDB-Protein-Datenbank übernommen und mit Chimera1.6.2 dargestellt.
Gemäß Pegan und Mitarbeitern dienen die zwei Serine und das Threonin in
M. tuberculosis dazu, mit dem Substrat (FBP) bzw. Substraten (DHAP, G3P)
Wasserstoffbrückenbindungen aufzubauen und so den Enzym-Substrat-Komplex zu
stabilisieren (Pegan u. a., 2009). Es kann daher spekuliert werden, dass aufgrund von
Phosphorylierungsereignissen, sei es durch Kinase vermittelte, selbständige oder
aufgrund von Intermediatbildung erfolgende Phosphorylierung, die Bindung des
Substrats reguliert wird, und dass diese Phosphorylierungen, die schon in zahlreichen
Organismen nachgewiesen worden sind, für die Aktivität des Enzyms sowie für die
Unwirksamkeit von auf Substratanaloga basierenden Inhibitoren verantwortlich sind.
Bei der Entwicklung von antimikrobiellen Therapeutika auf der Basis der Klasse II
Aldolasen muss für S. aureus berücksichtigt werden, dass der Organismus eine weitere
2 Ergebnisse und Diskussion 113
Aldolase (FdaB) synthetisiert, die der Klasse I zugehörig ist. Inwieweit die eine Aldolase
die andere in ihrer Funktion ersetzen kann, ist bisher ungeklärt und bedarf weiterer
Untersuchungen. Im Hinblick auf eine potentielle "moonlighting"-Funktion von FbaA
und somit einer möglichen Rolle im Virulenzgeschehen, könnte der Entwicklung von
Inhibitoren jedoch eine besondere Bedeutung zukommen.
Aufgrund der Identifizierungen der Phosphorylierungstellen, der Ergebnisse des
multiplen Alignments und des Strukturvergleichs kann vermutet werden, dass es ein
hoch konserviertes Phosphorylierungsmuster in der Klasse II der FBP-Aldolasen gibt,
welches die Substratbindung reguliert und das bei der Neuentwicklung von
antimikrobiellen Inhibitoren berücksichtigt werden muss.
2.2.2.5.2 Enzyme der Proteolyse
Energieabhängige Proteolyse spielt eine wichtige Rolle in der Degradation von
Proteinen mit regulatorischen Funktionen und von durch Stresseinwirkung
geschädigten Proteinen. Durch die Degradation wird die Akkumulation von Proteinen
ohne aktuelle Funktion in der Zelle vermieden und die Proteinhomöostase
gewährleistet (Gerth u. a., 2008; Gottesman, 1999; Gottesman u. a., 1990; Reeves u.
a., 2007). In den globalen Untersuchungen des Phosphoproteoms von S. aureus
wurden zwei phosphorylierte Clp-ATPasen detektiert (ClpX und ClpB), die dem
Proteolysesystem der bakteriellen Zelle zugeordnet werden (Frees u. a., 2007;
Zolkiewski, 2006).
Zum einen konnte ClpX als putativ phosphorylierter Pro-Q gefärbter Spot im 2D-Gel
detektiert (hierbei ist jedoch zu berücksichtigen, dass das Phosphorylierungssignal
durch einen kovalent gebundenen phosphorylierten Cofaktor hervorgerufen werden
kann) und zum anderen das am Serin 426 phosphorylierte ClpB-Peptid im gelfreien
Ansatz identifiziert werden. Beiden ATPasen wird neben ihren Aufgaben innerhalb der
Stresstoleranz, der intrazellulären Replikation und der Biofilmbildung auch eine
wichtige Rolle in der Virulenz eingeräumt (Frees u. a., 2003, 2004, 2007; Jelsbak u. a.,
2010). Es wird beschrieben, dass ClpX für die Zellinteraktionen und für die Bildung von
Biofilm verantwortlich ist und durch die Stimulierung der Synthese des
oberflächengebundendenen Virulenzfaktors Protein A eine zentrale Rolle in der
114
Steuerung der Regulation der Virulenz aufweist (Frees u. a., 2003; Jelsbak u. a., 2010).
Die ATPase ClpB wird als essentiell für die intrazelluläre Vermehrung in bovinen
Brustepithelzellen beschrieben (Frees u. a., 2004). In welcher Form das
Phosphorylierungsereignis im Virulenzgeschehen eine Rolle spielt, muss untersucht
werden.
2.2.2.5.3 Virulenzregulatoren
Vor kurzem wurde der pleiotrope Virulenz-Regulator SarA als Substrat der
Proteinkinase PknB (Serin-Threoninkinase) beschrieben. Die Phosphorylierung von
SarA wurde in vivo und in vitro nachgewiesen. Eine Spezifizierung der genauen
Phosphorylierungsstelle fand jedoch nicht statt (Didier u. a., 2010). Die Autoren
stellten die Hypothese auf, dass die Regulation von SarA über den
Phosphorylierungsstatus stattfindet. Als präferierte Phosphorylierungsstelle wurde von
ihnen das Serin 75 vorgeschlagen. Dies schlussfolgerten sie aus der Beobachtung, dass
die Phosphorylierung des Proteins zu einer verminderten DNA-Bindungskapazität führt
und das S75 neben dem für die DNA-Bindung verantwortlichen Lysin lokalisiert ist. Für
das Serin 75 konnte in dieser Arbeit keine Phosphorylierung nachgewiesen werden,
jedoch wurden die Serine 106 und 109 als phosphoryliert identifiziert. Diese multiplen
Serin-Phosphorylierungen, die in einem Abstand von zwei Aminosäuren lokalisiert sind,
wurden ebenfalls für den Regulator MgrA, der der Familie der SarA Regulatoren
zugeordnet wird, beschrieben (Truong-Bolduc & Hooper, 2010). Der
Phosphorylierungsstatus von MgrA soll für die Regulation der Expression der MDR
("multi-drug-resistance") Effluxpumpen NorA und NorB verantwortlich sein, die einem
Resistenzmechnismus gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen angehören (Truong-
Bolduc & Hooper, 2010; Truong-Bolduc u. a., 2005, 2006, 2008).
In einem Sequenzalignment zeigt sich, dass das S109 von SarA eine Homologie zum
S110 des Proteins MgrA aufweist (siehe Abbildung 32). Aufgrund dieser Homologie
und des Motives der doppelten Serinphosphorylierung kann auf eine ähnliche
Funktionsweise bzw. auf einen ähnlichen regulatorischen Mechanismus geschlossen
werden.
2 Ergebnisse und Diskussion 115
Abbildung 32: Sequenzalignment von SarA (Sbjct) und MgrA (Query). Es wurde mit dem Algorithmus BLAST® (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) erstellt. Das Serin 109 von SarA zeigt eine Homologie zum Serin 110 von MgrA. Beide Serine sind durch eine Umrahmung (Kasten) hervorgehoben.
Eine neue Regulationsmöglichkeit von SarA beschrieben kürzlich Sun und Mitarbeiter.
Sie konnten in der SarA/MgrA-Familie (SarA, MgrA und SarZ) in in vitro Kinaseassays
eine Phosphorylierung des konservierten Cysteinrestes C9 identifizieren und bringen
dies mit der Regulation der Enzyme in Verbindung (Sun u. a., 2012).
Die Aufklärung der detaillierten Regulationsmechanismen steht noch aus und in
welcher Weise die identifizierten Phosphorylierungen einen regulatorischen Einfluss
auf die Enzymaktivität in vivo ausüben, muss überprüft werden.
Des Weiteren konnte in dem gelfreien Ansatz der phosphorylierte putative
Virulenzfaktor EbpS (SACOL1522) identifiziert werden, bei dem es sich um ein Elastin-
Bindeprotein handelt (Park u. a., 1999). Die Elastinbindung von EbpS wurde mit
löslichen Elastinpeptiden und der Elastinvorstufe Tropoelastin nachgewiesen (Downer
u. a., 2002; Park u. a., 1999). In späteren Studien wurde gezeigt, dass EbpS zwar
lösliches Elastin bindet, jedoch für die Adherenz an immobilisierten Elastin nicht
verantwortlich ist (Roche u. a., 2004), womit die genaue Funktion des EbpS fraglich
wird. Interessant ist der topologische Aufbau des Proteins. EbpS besitzt zwei
hydrophobe Membranspannungsdomänen und einen N- sowie C-terminalen Teil, die
beide außerhalb der cytoplasmatischen Membran lokalisiert sind, wobei nur der
N-terminale Teil auf der Zelloberfläche exponiert wird (Downer u. a., 2002). Eine
detaillierte Studie der N-terminalen Domäne von Nakakido und Mitarbeitern zeigte
dessen strukturelle Wandelbarkeit in verschiedenen physiologischen Umgebungen
(Nakakido u. a., 2007). Einen interessanten Beitrag liefern die im Rahmen dieser Arbeit
identifizierten Phosphorylierungsstellen (S2, T64, S218) des EbsP Proteins. Alle drei
sind in der extrazellulären N-terminalen Domäne lokalisiert und geben somit einen
116
Hinweis auf regulatorische Prozesse im Pathogenitätsgeschehen sowie auf aktive
Zentren der N-terminalen Domäne.
Anhand dieser Literaturvergleiche konnte gezeigt werden, dass die globale Analyse des
Phosphoproteoms nicht nur die Auflistung von phosphorylierten Proteinen wiedergibt,
sondern dass sie erste wichtige Hinweise auf regulatorische Mechanismen, strukturelle
Charakteristika und auf eine mögliche Rolle der Phosphorylierung im
Pathogenitätsgeschehen liefern kann. Somit dienen diese Analysen als Basis für
detaillierte Studien und fördern Ideen für erste Therapieansätze zur Bekämpfung
pathogener Bakterien.
2.2.2.6 Zielproteine der Serin/Threoninkinase PknB
Aufgrund der zahlreich identifizierten phosphorylierten Proteine stellt sich die Frage
nach den dafür verantwortlichen Kinasen. In S. aureus COL ist bisher die Serin-/
Threoninkinase PknB beschrieben worden (Lomas-Lopez u. a., 2007; Rakette u. a.,
2012; Soulat u. a., 2006). Die ersten Untersuchungen zur Rolle von PknB von S. aureus
resultierten in der Erkenntnis, dass die Kinase Enzyme des zentralen
Kohlenstoffwechsels phosphoryliert (Lomas-Lopez u. a., 2007), Funktionen im
Zellwandaufbau, der Autolyse und der Purin/Pyrimidin-Synthese ausübt (Beltramini u.
a., 2009; Donat u. a., 2009) sowie in der Antibiotikaresistenz involviert ist (Tamber u.
a., 2010). Die Kinase besteht aus einer N-terminalen cytosolischen Kinasedomäne,
einer Transmembranspannungsdomäne und drei extrazellulären PASTA-Domänen
(Rakette u. a., 2012).
Es wurden bisher neun potentielle bakterielle Zielproteine (Glyoxylase, Triggerfaktor,
Trioseisomerase, Fruktose-Bisphosphataldolase, Pyruvatdehydrogenase, L7/L12
ribosomales Protein, Elongationsfaktor, Enolase und Phosphatacetyltransferase) der
Kinase PknB detektiert (Lomas-Lopez u. a., 2007).
Des Weiteren wurde vor kurzem festgestellt, dass es sich bei PknB um eine auf Prolin-
gerichtete Kinase handelt, die Ähnlichkeiten zu den eukaryotischen MAP-Kinasen
(Mitogen-aktivierte Protein Kinasen) aufweist (Miller u. a., 2010). Das Charakteristikum
2 Ergebnisse und Diskussion 117
der Prolin-gerichteten Kinasen drückt sich in der spezifischen Konsensussequenz aus,
in der carboxyterminal zum phosphorylierten Serin oder Threonin die Aminosäure
Prolin lokalisiert ist. Es konnte gezeigt werden, dass PknB in das extrazelluläre Medium
sekretiert wird und mit Hilfe von Peptid-Arrays wurden 68 mögliche humane
Zielproteine der Kinase identifiziert (Miller u. a., 2010). Im Spezielleren konnte mit
Hilfe der massenspektrometrischen Analyse, die im Rahmen dieser Arbeit
durchgeführt wurde, für den ATF-2 (Activating Transcription Factor-2) gezeigt werden,
dass eine Phosphorylierung dessen durch PknB stattfinden kann. Hieraus wurde
geschlussfolgert, dass PknB nicht nur Funktionen innerhalb der bakteriellen Zelle
ausübt, sondern dass die Sekretion von PknB Regulationsmechanismen im Wirt
beeinflusst und somit dem Bakterium das intrazelluläre Wachstum ermöglicht (Miller
u. a., 2010).
Aufgrund der spezifischen Konsensussequenz der Prolin-gerichteten Kinasen
(XS*PX/XT*PX (Vulliet u. a., 1989)), wurde eine Analyse der in dieser Arbeit
identifizierten 68 Phosphorylierungsstellen vorgenommen, um potentielle bakterielle
Zielproteine der Kinase PknB zu identifizieren. Das Ergebnis der Konsensusmotivsuche
war für alle identifizierten Phosphorlierungsstellen negativ. Auch die von Lomas-Lopez
und Mitarbeitern detektierten Zielproteine TpiA und FbaA wiesen in den in dieser
Arbeit identifizierten Phosphorylierungsstellen das Prolinmotiv nicht auf, und ein
direkter Sequenzvergleich zwischen den beiden Phosphorylierungsstellen zeigt keine
Motivähnlichkeiten.
Fraglich war, ob sich unter den identifizierten phosphorylierten Peptiden ein
gemeinsames Kinasemotiv (eine Konsensussequenz) erkennen lässt. Da in den meisten
Fällen das aktive Zentrum der Kinase mit vier Aminosäuren ober- und unterhalb der
Phosphorylierungsstelle interagiert (Ubersax & Ferrell, 2007), wurden für die Analyse
jeweils die speziell phosphorylierte Aminosäure, sechs Aminosäuren in N-terminale
Richtung und sechs in C-terminaler Richtung als Sequenz zur Konsensusuche
abgeschickt. Die Konsensussequenzsuche wurde mit dem Programm WebLogo (Crooks
u. a., 2004) (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi) durchgeführt. Jedes Logo besteht
dabei aus Buchstabenblöcken, die jeweils eine Position in der Sequenz besetzen. Die
Konservierung der Sequenz spiegelt sich in der Gesamthöhe der Buchstabenblöcke
118
wider. Die Höhe der einzelnen Buchstaben innerhalb eines Blockes gibt die relative
Häufigkeit der korrespondierenden Aminosäure an (Crooks u. a., 2004).
Abbildung 33: Sequenzlogos für die in S. aureus identifizierten Phosphorylierungsstellen. Es wurde differenziert zwischen Serin-, Threonin-, S+T- und Tyrosin-Phosphorylierungen. Die Logos wurden mit dem Programm WebLogo kreiert.
2 Ergebnisse und Diskussion 119
Die resultierenden Sequenzlogos für die in S. aureus identifizierten
Phosphorylierungstellen sind in Abbildung 33 dargestellt. Aus den Sequenzlogos geht
hervor, dass keine einheitliche Konsensussequenz für die Phosphorylierungsstellen der
identifizierten Peptide gefunden worden ist. Jedoch zeigt das Sequenzlogo für die
Threoninphosphorylierungen ein Asparagin an Position -3. Dieses Asparagin tritt in 5
von den 18 untersuchten Threoninphosphorylierungsstellen auf. Die
korrespondierenden Proteine dazu sind FbaA (Fruktose-Bisphosphataldolase) und Pyk
(Pyruvatkinase) aus dem Kohlenhydratmetabolismus, die Prolin-Dipeptidease
SACOL1588 und zwei konservierte hypothetische Enzyme (SACOL1680 und
SACOL1789). Interessanterweise stehen drei Enzyme davon in physiologischem
Zusammenhang. FbaA und Pyk sind beide an der Glykolyse bzw. Gluconeogenese
beteiligt, und SACOL1588 zeigt ein verstärktes Phosphorylierungssignal unter
Glukosehunger (siehe Abschnitt 2.2.2.7.1). Durch das gemeinsame Sequenzmotiv kann
angenommen werden, dass diese fünf Enzyme unter dem Einfluss derselben Kinase
stehen.
Betrachtet man das in den am Tyrosin phosphorylierten Peptiden auftretende Leucin
carboxyterminal an Position 3, dann sind drei von 11 Sequenzen mit dieser
Aminosäure ausgestattet. Dies könnte ebenfalls ein Hinweis auf eine gemeinsame
Kinase sein.
Folglich konnte festgestellt werden, dass in den von S. aureus identifizierten
phosphorylierten Peptiden kein einheitliches Kinasemotiv vorliegt und somit entweder
mehrere unterschiedliche Kinasen für die Phosphorylierungsereignisse verantwortlich
sind, eine Kinase sehr unspezifisch agiert oder Autophosphorylierungsreaktionen an
den Enzymen selbst vorkommen. Zur Klärung müssen weitere Untersuchungen, wie
z. B. Kinasemutantenanalysen, folgen.
2.2.2.7 Dynamic des Phosphoproteoms unter veränderten physiologischen Bedingungen
Ein bakterieller Erreger wird während seines Lebenszyklus sich ständig wechselnden
Umweltbedingungen, wie z. B. Veränderungen des pH-Wertes der Umgebung, ein
variierendes Nährstoffangebot und Wassermangel (Dehydrierung), ausgesetzt.
120
Zusätzlich stellen von humaner Hand eingesetzte Desinfektionsmittel und die
Immunabwehr des besiedelten Wirtes eine stetige Bedrohung für das pathogene
Bakterium dar, die es durch verschiedenste Wege der Anpassung, z. B. durch
Enzymregulationen über Phosphorylierungsereignisse, "versucht" zu umgehen. Um
erste Hinweise auf auf Phosphorylierungsgeschehnissen basierende
Regulationsmechanismen unter sich ändernden Umweltbedingungen zu erhalten,
wurde das Phosphoproteom von S. aureus im Rahmen dieser Arbeit gelbasiert unter
vier verschiedenen physiologischen Stress-Bedingungen (Glukosehunger, nitrosativer
Stress, Diamidstress (oxidativer Stress) und osmotischer Stress) untersucht. Gesucht
wurden phosphorylierte Proteine mit signifikant veränderten oder neu auftretenden
Signalintensitäten in Antwort auf Stress oder Hunger, die in insgesamt drei
biologischen Replikaten auftraten. Eine signifikante Veränderung des Pro-Q-Signals des
phosphorylierten Proteins wurde dann angenommen, wenn das Verhältnis der
Signalintensitäten (% V) Stresszeitpunkt versus Kontrolle ≥ 2 (Zunahme der
Signalintensität) oder ≤ 0,5 (Abnahme der Signalintensität) auftrat (im log2-Raum
entsprechend bei ≥ 1 und ≤ -1) (Signifikanzgrenzen siehe Abschnitt 2.1.5). Die
Signifikanz musste sich in einem der zu untersuchenden Zeitpunkte widerspiegeln und
in mindestens zwei biologischen Replikaten vorliegen. Bei einem der drei Replikate
wurde eine 10 %ige Unterschreitung der Toleranzwerte geduldet.
Die Veränderungen in der Signalintensität phosphorylierter Proteine können wichtige
Hinweise auf regulatorische Effekte liefern, jedoch ist zu berücksichtigen, dass
veränderte Phosphorylierungssignale im 2D-Gel sich in mehreren Ursachen begründen
können:
A) vormals nicht phosphoryliert vorliegendes oder neuexprimiertes Protein wird durch
eine Kinase oder durch Autophosphorylierungsreaktionen phosphoryliert
B) ein Phosphorylierungssignal erscheint durch ein kovalent gebundendes
phosphoryliertes Substrat oder Cofakor
C) das Phosphoprotein wird durch eine Phosphatase aktiv dephosphoryliert
D) das Phosphoprotein wird degradiert
2 Ergebnisse und Diskussion 121
Um detailliertere Einblicke zu erhalten, müßte die Puls-Chase-Markierung mit einem
radioaktiven Phosphatisotop mit der Puls-Chase-Markierung mit radioaktivem
Methionin 2D-gelbasiert verglichen werden.
Ziel dieser Arbeit war es mit der 2D-gelbasierten Methode und der Pro-Q Färbung in
der globalen Ansicht erste wichtige Hinweise auf mögliche Regulationsmechanismen
zu liefern, die dann motivieren diese im Detail zu analysieren.
2.2.2.7.1 Glukosehunger
Durch die physiologische Einordnung der identifizierten phosphorylierten Proteine von
S. aureus konnte bereits ermittelt werden, dass insgesamt 27 % dem
Energiestoffwechsel zugeordnet werden können (siehe Abschnitt 2.2.2.4). Im
gelbasierten Ansatz liegt der Anteil sogar bei 32 %. Aufgrund dieser Dominanz von
phosphorylierten glykolytischen Enzymen, Enzymen des TCC und des
Pentosephosphat-Wegs wurden im 2D-Gel die zahlreichsten Veränderungen im
Phosphoproteom unter Glukosehungerbedingungen erwartet. Das Ziel der 2D-Gel
basierten Untersuchungen lag in der Visualisierung und Quantifizierung dieser
Veränderungen, um mögliche Anpassungs-/Regulationsmechanismen bei
Glukosehunger, an denen Phosphorylierungsereignisse beteiligt sind, aufzuspüren. Die
in diesem Experiment zu erzielende Glukoselimitation wurde durch eine Anzucht der
Zellen in synthetischem Medium unter Zugabe von 0.05 % (w/v) Glukose bei einer
optischen Dichte von 0,9 - 1 erreicht. Die Zellernte erfolgte in der exponentiellen
Wachstumsphase bei der OD500nm = 0,5 in der Transientphase und drei Stunden nach
Eintritt in die stationäre Phase (siehe Abbildung 34).
Es konnten insgesamt sechs Veränderungen in der Signalintensität phosphorylierter
Proteine quantifiziert werden. Die betroffenen Proteinspots wurden im
Zweikanalfarbenbild Flamingo versus Pro-Q markiert (Abbildung 35).
Die Proteinspots konnten als SACOL1483, Pyk-4, DeoB-1, DeoB-3, Pgm und SACOL1588
identifiziert werden. Für vier der fünf Proteine konnte im Vorwege mindestens eine
spezifische Phosphorylierungsstelle identifiziert werden. Eine Phosphorylierung für das
Protein SACOL1483 wird bisher nur aufgrund der Pro-Q-Färbung angenommen, einen
Beweis durch die Identifizierung einer Phosphorylierungsstelle steht noch aus.
122
Abbildung 34: Das logarithmische Wachstum von S. aureus exemplarisch gezeigt anhand der optischen Dichte während des Glukosehungerversuchs. Die Zeitpunkte in denen die Zellernte erfolgte, wurden markiert.
Abbildung 35: Zweikanalfarbenbild des Zeitpunktes drei Stunden nach Eintritt in die stationäre Phase. Gegenübergestellt ist die Gesamtproteinfärbung (grün) und die Pro-Q-Färbung (rot). Die in der Signalintensität veränderten phosphorylierten Proteinspots wurden markiert.
2 Ergebnisse und Diskussion 123
In der Abbildung 36 wurden die Signalintensitäten, die korrespondierenden Ratios und
drei Replikate in jeweils zwei Graphiken pro Spot aufgeführt. Zusätzlich wurden
exemplarisch die Veränderungen mithilfe von Ausschnitten aus dem
Zweikanalfarbenbild dokumentiert. Die übereinstimmenden Signalintensitäten des
Kontrollgels von Replikat 2 und 3 gehen aus der Nutzung desselben Gels für beide
Replikate hervor.
124
Abbildung 36: Darstellung der Signalintensitäten (Pro-Q-Färbung) in % Volumen für den jeweiligen Proteinspot zu den unterschiedlichen Zeitpunkten im Versuchsverlauf (linke Graphik). Dem Säulendiagramm wurden Auschnitte aus dem Zweikanalfarbenbild (Flamingo vs. Pro-Q) eines Replikates hinzugefügt, in dem der quantifizierte Spot umrandet wurde. Die jeweils rechte Graphik beschreibt die log2-Ratios der verschiedenen Zeitpunkte die jeweils mit der Kontrolle in das Verhältnis gesetzt wurden. Die rote Linie markiert die Signifikanzgrenze. Der Mittelwert der log2-Ratios der drei Replikate wurde mit aufgeführt.
Die Analysen zeigen, dass für die phosphorylierten Proteinspots DeoB-1, DeoB-2,
Pgm-3 und SACOL1588 eine signifikante Zunahme und für Pyk-4 und SACOL1483 eine
signifikante Abnahme der Signalintensität (Pro-Q-Färbung) quantifiziert werden
2 Ergebnisse und Diskussion 125
konnte. Auffällig ist des Weiteren, dass das Gel aus der transienten Phase des ersten
Replikates für alle Spots geringere Signalintensitäten aufweist. Durch die Verwendung
derselben Pro-Q-Färbelösung besteht der Fehler nicht in dem Färbeablauf, sondern im
Auftrag einer zu geringen Proteinmenge. Dieser Fehler beeinträchtigt die
Mittelwertergebnisse, aber nicht das Gesamtergebnis.
Für den Umweltfaktor Glukosehunger wurden kürzlich tiefgreifende Veränderungen im
Proteom vom exponentiellen Wachstum bis hin zur stationären Phase beschrieben
(Becher u. a., 2009; Kohler u. a., 2005; Liebeke u. a., 2011). Es wurde festgestellt, dass
S. aureus in der stationären Phase Acetat, Pyruvat und Aminosäuren als alternative
Kohlenstoffquellen verwertet und diese über den Tricarbonsäurezyklus oxidiert.
Enzyme dieser Stoffwechselwege, ebenfalls die der Gluconeogenese, zeigten ein stark
erhöhtes Induktionsprofil. Ferner lagen Enzyme, die für die Degradation von
Aminosäuren benötigt werden, in erhöhter Anzahl vor. Glykolytische Enzyme wurden
nicht weiter synthetisiert, nahmen in der Menge nur wenig ab und zeigten sich
weitestgehend stabil (Becher u. a., 2009; Kohler u. a., 2005; Liebeke u. a., 2011;
Michalik u. a., 2009). Des Weiteren zeigte sich eine Degradation von "arbeitslos"
gewordenden Proteinen wie z. B. Enzymen der Nukleid- und Aminosäuresynthese, des
Energiemetabolismus und der Cofaktorsynthese. Michalik und Mitarbeiter postulieren
dies als eine wichtige Eigenschaft von S. aureus um in Zeiten des Hungers Zugang zu
Nährstoffen zu erhalten und sich so das Überleben zu sichern (Michalik u. a., 2009).
In der nachfolgenden Tabelle 13 sind die in der Literatur bekannten Veränderungen
der fünf sich in dieser Arbeit verändernden phosphorylierten Proteine aufgeführt, um
in Verbindung mit den hier ermittelten Daten auf mögliche Regulationen schließen zu
können.
Aus der Tabelle geht hervor, dass nur für die Phosphopentomutase ein verringertes
Signal und eine Abnahme der Proteinmenge bei auftretendem Glukosehunger
beschrieben wurden. Die Proteine Pyk, DeoB, SACOL1588 und SACOL1483 weisen
hingegen überwiegend keine Veränderungen auf.
126
Tabelle 13: Literaturdaten in Bezug auf das Mengensignal ausgewählter Proteine im Vergleich exponentielles Wachstum und stationärer Phase.
Protein Kohler u. a. 2005
Michalik u. a. 2009
Becher u. a. 2009
Liebeke u. a. 2011
Pgm Abnahme anfänglich stabil, nach 20 h Degradation
verminderte Expression/
degradiert
Abnahme
Pyk leichte Abnahme gleichbleibend gleichbleibend
DeoB gleichbleibend
SACOL1588 gleichbleibend
SACOL1483 gleichbleibend
Aufgrund der Literaturdaten ist davon auszugehen, dass die in dieser Arbeit
detektierten Abnahmen der Signale der Phosphoproteine Pyk und SACOL1483 nicht
durch eine Degradation des Proteins, sondern durch eine Dephosphorylierung
hervorgerufen wurden.
2010 veröffentlichten Zoraghi und Mitarbeiter eine detaillierte Charakterisierung der
Pyruvatkinase von S. aureus. Unter anderem lieferten sie aufgrund ihrer Ergebnisse
ein erstes Modell der Pyruvatkinaseregulation. In diesem beschreiben sie die
Steigerung der Enzymaktivität der Pyruvatkinase (Pyk) durch die Aktivatoren AMP und
Ribulose-5-Phosphat (R5P) in der exponentiellen Wachstumsphase. Zusätzlich konnten
sie feststellen, dass durch die geringe Menge an verwertbaren Zuckern in der
stationären Wachstumsphase der Pentosephosphatweg zurückgefahren wird und dies
in einer niedrigeren Konzentration des Pyk-Aktivators R5P resultiert, und somit in einer
geringeren Aktivierung der Kinase endet (Zoraghi u. a., 2010).
Zoraghi und Mitarbeiter erwähnen kein Phosphorylierungsevent als regulatorisches
Ereignis, sie stellten jedoch fest, dass der starke Abfall der Enzymaktivität in der
sationären Phase nicht mit der Enzymmenge korreliert und dies auf eine
posttranskriptionale Regulation hinweist.
Gelbasiert konnte in dieser Arbeit eine Phosphorylierungsstelle am Threonin 537, das
sich in der extra C-terminalen Domäne (CT-Domäne) des Proteins befindet,
nachgewiesen werden. Diese Domäne ist eine Besonderheit und kommt in einigen
bakteriellen Organismen, wie z. B. Geobacillus stearothermophilus, B. lichiniformes,
2 Ergebnisse und Diskussion 127
Lactobacillus delbrueckii, Synechocystis sp. PCC6803 und S. aureus vor und trennt diese
Puruvatkinasen somit strikt von den eukaryotischen (Muñoz & Ponce, 2003).
Mehrere Charakteristika lassen sich für die CT-Domäne aufführen. Zum einen wurde
für G. stearothermophilus beschrieben, dass die CT-Domäne zur Stabilität der als
Tetramer vorliegenden Pytuvatkinase beiträgt, da die Reste T539 (homolog zu T537
von S. aureus) und L538 der CT-Domäne mit den Resten E206 und E209 der A-Domäne
mittels Wasserstoffbrückenbindungen schwach interagieren (Sakai, 2004; Suzuki u. a.,
2008). Zoraghi und Mitarbeiter konnten für S. aureus zeigen, dass die CT-Domäne eine
hohe Affinität zu PEP und ADP aufweist. Sie stellten aber keine Beteiligung der CT-
Domäne an der Tetramerisierung des Enzyms, der Substratbindung und in der
allosterischen Regulation des Holoenzyms fest. Wiesen aber der Domäne eine
bedeutende Rolle in der Enzymaktivität und ebenfalls in der Stabilität des Enzyms zu
(Zoraghi u. a., 2010). Die zweifache Antwort des Enzyms auf ATP, in der die Kinase bei
physiologischer ATP-Konzentration stimuliert und bei hoher ATP-Konzentration
inaktiviert wird, schreiben sie aufgrund von Mutantenanalysen ebenfalls der CT-
Domäne zu (Zoraghi u. a., 2010).
Des Weiteren enthält die CT-Domäne eine PEP-bindende Sequenz (PEP =
Phosphoenolpyruvat), die weitestgehend homolog zu dem PEP-Bindemotiv der PEP-
nutzenden Enzyme ist, wie z. B. der Pyruvat-orthophosphat-Dikinase des Zea mays, der
PEP-Synthetase oder der Phosphotransferase des PTS-Systems von E. coli. und
Salmonella typhimurium (Burnell, 2010; Sakai & Ohta, 1993; Suzuki u. a., 2008).
Fraglich ist, welche Aufgabe die PEP-bindenden Sequenz in der Pyruvatkinase besitzt.
PEP-Synthetasen kommen in vielen bakteriellen Organismen vor und katalysieren den
gluconeogenetischen Reaktionsschritt von Pyruvat zu PEP.
Jim Burnell postulierte 2010 den Regulationsmechanismus der PEP-Synthetase von
E. coli. In diesem beschreibt er die Regulation des Enzyms über die ADP-Konzentration
mithilfe des PEP-Synthetase regulierenden Enzyms (PEPSRE). Bei vorherrschenden
hohen ADP-Konzentrationen, wie es in der exponentiellen Wachstumsphase der Fall ist
(s. u.), liegt das Enzym am Threonin phosphoryliert vor. Bei Eintritt in die stationäre
Wachstumsphase verringert sich die ADP Konzentration. Das Enzym wird durch
Dephosphorylierung aktiviert und Pyruvat wird zu PEP phosphoryliert (Burnell, 2010).
128
Interessant ist die Übertragung dieses Modells auf die Pyruvatkinase von S. aureus.
Laut Gendatenbank (aus UniprotKB, Uniprot Consortium) besitzt S. aureus ein
putatives Pyruvat-Phosphat-Dikinase-regulatorisches-Protein (PPDRP) aber keine PEP-
Synthetase oder eine Pyruvat-ortho-Phosphat-Dikinase. Es kann jedoch spekuliert
werden, dass die in der Pyruvatkinase beschriebene PEP-bindende Domäne der PEP-
nutzenden Enzyme durch das PPDRP reguliert wird. Einen Hinweis darauf liefert die in
dieser Arbeit identifizierte Phosphorylierungsstelle am Threonin 537. Diese ist
homolog zu dem regulatorisch phosphorylierten Threonin der PEP-Synthetase von
E. coli und der Pyruvat-Phosphat-Dikinase von Zea mays (siehe Abbildung 37). Die
Ergebnisse der 2D-Gel-basierten Analysen dieser Arbeit, in denen ein
Phosphorylierungssignal der Pyruvatkinase in der exponentiellen Wachstumsphase
und ein stark vermindertes in der stationären Phase detektiert werden konnte,
unterstreichen den oben beschriebenen Regulationsmechanismus, in dem das
Threonin in der exponentiellen Phase, nicht aber in der stationären Phase
phosphoryliert vorliegt.
Abbildung 37: Ausschnitt aus dem Sequenzalignment der Pyruvat-Phosphat-Dikinase des Mais, der PEP-Synthetase von E. coli und der Pyruvatkinase von S. aureus. Die phosphorylierten Threonine und die Histidine der Histidin-vermittelten Phosphorylgruppen-Übertragungsreaktion wurden in Fettdruck dargestellt.
Ein bedeutender Unterschied besteht jedoch zwischen den PEP-Motiven von
G. stearothermphilus, E. coli, Zea mays und S. aureus. Anstelle des
Phosphorylgruppenübertragenden Histidins liegt bei S. aureus ein Prolin vor. Folglich
kann die Reaktion vom Pyruvat zum PEP nicht stattfinden.
2 Ergebnisse und Diskussion 129
Fraglich ist nun, welche Aufgabe dem über die Phosphorylierung kontrollierten PEP-
bindenden Motiv in S. aureus zukommt, da eine gluconeogenetische Reaktion
aufgrund des fehlenden Histidins auszuschließen ist.
Diskussionswürdig ist hierbei, ob sich das PEP-Bindemotiv aus einem vormals
bifunktionellen Enzym erklärt und die PEP-Bindedomäne als funktionsloses Rudiment
zurückgeblieben ist oder ob sich, durch das Aneignen einer neuen Domäne, die
Möglichkeit eines "Finetuning" des Enzyms evolutionär entwickelt hat und dieser
Domäne somit einer Funktion zukommt.
Für das letztere spricht, dass Zoraghi und Mitarbeitern der CT-Domäne eine Funktion
in der Regulierung des Enzyms aufgrund unterschiedlicher ATP-Konzentrationen
zugesprochen haben (Zoraghi u. a., 2010).
Anhand der im Rahmen dieser Arbeiten erzielten Ergebnisse für die Pyruvatkinase von
S. aureus und der oben beschrieben Literaturdaten kann folgender
Regulationsmechanismus vorgeschlagen werden, der eine erste Idee liefert und zu
detaillierten Studien motiviert:
Durch die erhöhte ADP/ATP-Konzentration in der exponentiellen Wachstumsphase
(Liebeke u. a., 2011) könnte das Threonin 537 in der CT-Domäne von dem PPDRP
phosphoryliert werden und die Stabilität der als Tetramer vorliegenden Pyruvatkinase
verändern, indem durch sie z. B. die Interaktion zwischen der CT-Domäne und der A-
Domäne des Nachbarenzyms beeinflusst wird. Dies könnte die Aktivität des Enzyms
erniedrigen und so den Energieladungszustand der Zelle konstant halten, indem kein
nicht nutzbarer ATP-Überschuss produziert wird. Bei einsetzendem Glukosehunger und
dem daraus folgendem Abfall der ADP/ATP-Konzentration (Liebeke u. a., 2011), könnte
eine Dephosphorylierung des Threonins durch das PPDRP die Enzymstruktur insoweit
verändern, dass die Aktivitätshemmung wieder aufgehoben wird und das Enzym durch
die Effektorbindung allosterisch kontrolliert werden kann.
Aufgrund dieser Regulation wäre eine zusätzliche Kontrolle der Pyruvatkinase (neben
der allosterischen Effektor-Kontrolle) möglich, die den Energieladungszustand der Zelle
über die ADP/ATP-Konzentration reguliert.
130
Zur Validierung dieses Regulationsmodels müssen Strukturanalysen der
phosphorylierten und unphosphorylierten Pyruvatkinase, sowie Mutantenanalysen
durchgeführt werden.
Das erhöhte Signal der phosphorylierten Phosphoglyceratmutase (Pgm) liefert einen
Hinweis auf eine regulatorische Rolle im Wechsel von der Glykolyse zur
Gluconeogense. Interessant ist hierbei, dass in der Literatur eine Abnahme des Enzyms
zu recherchieren war, die phosphorylierte Isoform in diesen Untersuchungen jedoch
eine Zunahme des Signals zeigt.
Fraglich bleibt die Zunahme der Signalintensität der phosphorylierten
Phosphopentomutase (DeoB), die zudem in drei größenunterschiedlichen Isoformen
im Gel auftritt.
Das verstärkte Phosphorylierungssignal der Prolin-Dipeptidase (SACOL1588), die zur
Nutzung von Aminosäuren als alternative C-Quellen dient, deutet auf eine Aktivierung
des Enzyms hin.
In einem Vergleich der Ergebnisse aus dieser Arbeit und den Ergebnissen von B. subtilis
in Bezug auf Veränderungen von Phosphorylierungssignalen unter Glukosehunger
konnten keine Gemeinsamkeiten festgestellt werden, obwohl die hier beinflussten
Enzyme DeoB, Pyk und Pgm homologe Phosphorylierungsstellen aufweisen.
2.2.2.7.2 Stressinduktion durch Stickstoffmonoxid
Um in seinem natürlichen Habitat überleben zu können, muss sich S. aureus gegen
Stickstoffmonoxid, welches von der Immunantwort des Wirtes generiert wird,
schützen können (Lewis u. a., 1995; Nalwaya & Deen, 2005). Stickstoffmonoxid und
seine reaktiven Stickstoffspezies reagieren mit einer Vielzahl von Substraten, wie
Metallkernen, Tyrosinresten, Nukleotidbasen, Lipiden und Thiolen und rufen indirekte
Effekte wie z. B. die Inhibierung der bakteriellen Respiration oder der
Aminosäuresynthese hervor (Borisov u. a., 2004; Hyduke u. a., 2007; Nathan & Shiloh,
2000). In einer kürzlich erschienenen Studie konnte gezeigt werden, dass NO-Stress die
2 Ergebnisse und Diskussion 131
Atmung inhibiert, was zu einem umfassenden Shift zum anaeroben Metabolismus
führt und die glykolytische Aktivität erhöht (Borisov u. a., 2004; Hochgräfe u. a., 2008).
Überdies schützt sich der Organismus vor reaktiven Stickstoffmonoxidspezies durch
eine koordinative Stressantwort, die die Exprimierung des NO-detoxifizierenden
Flavohämoglobins Hmp sowie Enzyme des hypoxic sowie des anaeroben Metabolismus
beinhaltet. Die Expression einer Vielzahl dieser Enzyme wird durch das
Zweikomponentensystem SrrAB reguliert (Richardson u. a., 2006). Weiterhin wurde
gezeigt, dass unter nitrosativen Stressbedingungen das Gen der Lactatdehydrogenase
1 (ldh1) exprimiert wird und dies einen Anpassungsmechanismus darstellt, da es die
Erhaltung der Redox-Homöostase durch Milchsäuregärung während des anhaltenden
Stresses ermöglicht (Richardson u. a., 2008).
Aufgrund des Umbruchs im Metabolismus und des weitreichenden Einflusses von
Stickstoffmonoxid in die bakterielle Physiologie wurden Veränderungen im
Phosphoproteom erwartet. Das NO-Stress Experiment wurde gemäß Hochgräfe und
Mitarbeitern durchgeführt, indem MAHMA NONOat [6-(2-hydroxy-1-methyl- 2-
nitrosohydrazino)-N-methyl-1-hexanamin], das als NO-Donor fungiert, in einer
Konzentration von 500 µM hinzugegeben wurde (Hochgräfe u. a., 2008).
Es konnten im Rahmen dieser Arbeit zwei neu erscheinende Phosphorylierungssignale
(Pro-Q-Färbung) detektiert werden. Es handelt sich hierbei um das hitzeinduzierbare
Chaperon HchA und das glykolytische Enzym FdaB (Fruktose-Bisphosphat-
Aldolase)(siehe Abbildung 38).
Die Graphiken der Abbildung 38 verdeutlichen die signifikante Zunahme bzw. das
Erscheinen der phosphorylierten Isoformen der Proteine FdaB und HchA.
Beide Proteine weisen unter exponentiellen Bedingungen einen phosphorylierten
Proteinspot auf. HchA wurde kürzlich im Zusammenhang mit antioxidativen Strategien
unter Diamid-Stress beschrieben (Wolf u. a., 2008). Durch das Auftreten einer
weiteren phosphorylierten Isoform kann eine Funktion des Enzyms unter NO-Stress,
die durch Phosphorylierung reguliert wird, angenommen werden.
132
Abbildung 38: Darstellung der Signalintensitäten (Pro-Q-Färbung) in % Volumen für den jeweiligen Proteinspot zu den unterschiedlichen Zeitpunkten im Versuchsverlauf (linke Graphik). Dem Säulendiagramm wurden Auschnitte aus dem Zweikanalfarbenbild (Flamingo vs. Pro-Q) eines Replikates hinzugefügt in dem der quantifizierte Spot umrandet wurde. Die jeweils rechte Graphik beschreibt die log2-Ratios der verschiedenen Zeitpunkte, die jeweils mit der Kontrolle in das Verhältnis gesetzt wurden. Die rote Linie markiert die Signifikanzgrenze. Trotz des nicht erkennbaren Spots in dem Zweikanalfarbenbild ist ein %V-Wert für den Kontrollspot vorhanden. Dies ist in dem Algorithmus der Delta 2D-Software begründet, der auch die unterhalb der Detektionsgrenze liegenden Grauschattierungen als Wert mit einbezieht, um nicht durch Null zu dividieren.
FdaB wurde kürzlich als Markerprotein für anaeroben Metabolismus, wie auch für
NO-Stress beschrieben (Hochgräfe u. a., 2008). Auch hier tritt aufgrund der
Stresseinwirkung eine weitere phosphorylierte Isoform auf. Im Rahmen dieser Arbeit
konnte in ersten Experimenten unter anaeroben Bedingungen diese zweite
phosphorylierte FdaB-Isoform nicht detektiert werden (siehe Abbildung 39). Dies wird
als erster Hinweis betrachtet, dass diese zweite Phosphorylierung spezifisch für
NO-Stress ist.
2 Ergebnisse und Diskussion 133
Abbildung 39: Vergleich der Signalintensitäten (Pro-Q-Färbung) der Proteine HchA und FdaB-2 unter Anaerobiose (links) und NO-Stress (rechts). Es sind jeweils Ausschnitte aus den Zweikanalbildern in denen die Gesamtproteinfärbung (grün) und die Pro-Q-Färbung(rot) dargestellt wurde. In der obersten Reihe befinden sich die korrespondierenden Ausschnitte aus den jeweiligen Mastergelen, darunter die jeweiligen Ausschnitte aus den Kontrollen und nach 15 minütiger Stressinduktion. Die Proteinspots FdaB-2 und HchA wurden umkreist. Aus diesen Bildern geht hervor, dass im Gegensatz zum NO-Stress, die Proteinspots unter Anaerobiose nicht auftreten.
Fraglich ist, welche Bedeutung der zusätzlichen phosphorylierten FdaB-Isoform
zukommt. S. aureus besitzt zwei verschiedene Fruktose-Bisphosphataldolasen, die
aufgrund ihres Spaltungsmechanismus in unterschiedliche Klassen eingeordnet
werden. Hierbei handelt es sich bei FbaA um ein Enzym der Klasse II Fruktose-
Aldolasen, dass für die Spaltung von Fruktose-1,6-Bisphosphat in Glycerinaldehyd-3-
phosphat und Dihydroxyacetonphosphat ein divalentes Kation (hier Zn2+) als
Elektrophil für die Reaktion benötigt (Marsh & Lebherz, 1992). FdaB hingegen wird in
die Klasse I eingeordnet, da das Enzym in der Spaltungsreaktion ein kovalentes
"Schiffsche-Base"-Intermediat bildet. Aus Studien für Borrelia burgdorferi geht hervor,
dass die Zinkmetallo-Fruktose Bisphosphat Aldolase der Klasse II sensitiv gegenüber
nitrosativem Stress ist und inhibiert wird (Bourret u. a., 2011). Bourret und Mitarbeiter
stellen dabei die These auf, dass die funktionslose Fruktose-1,6-Bisphosphataldolase
134
der Klasse II durch das Enzym der Klasse I (falls vorhanden, wie bei Salmonella
typhimurium und S. aureus) ersetzt werden kann.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine zweite phosphorylierte Isoform des FdaB Enzyms
unter nitrosativem Stress detektiert werden. Diese liefert einen ersten Hinweis auf die
Aktivierung des Enzyms. FdaB könnte somit die Aufgaben des Enzyms FbaA, das
vorraussichtlich unter nitrosativen Bedingungen inaktiviert vorliegt, übernehmen und
den glykolytischen Stoffwechselweg an diesem Punkt erhalten.
Eine weitere interessante Beobachtung ist der zusätzlich erscheinende Pro-Q-gefärbte
Spot des Proteins HchA. Für dieses Protein wird nicht nur eine Chaperonfunktion
beschrieben, sondern es wird auch eine Glyoxalase-III-Funktion vorhergesagt
(http://www.uniprot.org/uniprot/Q5HIC4). Folglich kann HchA Methylglyoxal in
D-Lactat umwandeln und somit die Zelle vor einer lethalen Dosis des zytotoxischen
Methylglyoxals bewahren.
Für einige Organismen wurde ein Methylglyoxal-Bypass beschrieben, der eine
Akkumulation von C3-Zuckerphosphaten unter "Overflow-Metabolismus"-
Bedingungen verhindern soll, indem durch eine Methylglyoxalsynthetase das
Dihydroxyacetonphosphat in Methylglyoxal umgewandelt wird, das dann entweder
exkretiert oder in D-Lactat umgewandelt wird (zusammengefasst in (Landmann u. a.,
2011).
Diese Möglichkeit besteht bei S. aureus nicht, da der Organismus keine
Methylglyoxalsynthetase aufweist.
Methlglyoxal kann jedoch auch durch eine nicht-enzymatische Umwandlung aus
Glycerinaldehyd-3-phosphat und DHAP gebildet werden (Cooper, 1984). Hierbei sollen
polyvalente Anionen, wie z. B. Phosphate, Bicarbonate und phosphorylierte
Kohlenhydrate die Formierung des Methylglyoxals aus Glycerinaldehyd-3-phosphat
und Dihydroxyacetonphosphat bewirken (Riddle & Lorenz, 1968).
Eine solche Umwandlung könnte auch in S. aureus unter nitrosativen Bedingungen bei
der Akkumulation von C3-Zuckerphosphaten stattfinden, so dass der Organismus zur
Entgiftung des Methylglyoxals dessen Umwandlung durch HchA in D-Lactat benötigt.
Die zweite phosphorylierte Isoform von HchA, die unter nitrosativen Bedingungen
auftritt, könnte die Aktivierung dieses Enzyms markieren und somit einen Hinweis auf
2 Ergebnisse und Diskussion 135
einen Methylglyoxal detoxifizierenden Mechanismus, der unter nitrosativen
Stressbedingungen zum Tragen kommt, geben.
2.2.2.7.3 Stressinduktion durch Diamid
Aerobe Organismen sind dem dauernden Einfluss von reaktiven Sauerstoffspezies, wie
Superoxidanionen, Hydrogenperoxid oder Hydroxylradikalen ausgesetzt. Diese rufen
z. B. die Formierung von nicht nativen inter- und intrazellulären Disulfidbrücken
hervor, durch die das Protein in seiner Funktion, aufgrund von Fehlfaltungen,
eingeschränkt und somit geschädigt wird (Pöther u. a., 2009). Des Weiteren wurde
beschrieben, dass S. aureus Thiolierungen (Disulfidbrücken zwischen Proteinen und
niedermolekularen Thiolen) einführt, um die S-Thiole zu modifizieren und sie somit vor
irreversiblen Oxidationen zu schützen (Hochgräfe u. a., 2007; Pöther u. a., 2009).
In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass die Formierung dieser
Disulfidbrücken durch die Zugabe von Diamid induziert werden kann (Kosower &
Kosower, 1995). Diamid wirkt als elektrophile Spezies und sollte in den hier
durchgeführten Versuchen oxidativen Stress in der Zelle auslösen.
Folglich wird die Beinflussung und Veränderung der Regulation der Reparatur- und
Degradations-Enzyme durch die oxidative Stresseinwirkung, wie auch schon in einer
früheren Proteomstudie beschrieben (Wolf u. a., 2008), erwartet. Ob dies auch
Phosphorylierungsgeschehnisse beinflusst, sollte hier untersucht werden.
Überraschenderweise konnte keine Veränderungen des Phosphoproteommusters im
Hinblick auf degradative Enzyme beobachtet werden. An Stelle dessen konnte eine
Veränderung in dem Phosphorylierungsmuster eines glykolytischen Enzyms (Pyk)
ermittelt werden. Das phosphorylierte Protein Pyk-4 zeigte eine Erhöhung der
Signalintensität (siehe Abbildung 40).
Interessanterweise wurde beschrieben, dass die Pyruvatkinase von S. aureus MRSA252
unter Diamid-Einwirkung eine S-Cysteinylierung am C8 aufweist (Pöther u. a., 2009). In
welcher Verbindung dazu jedoch das erhöhte Pro-Q Signal steht, bleibt fraglich und
bedarf weiterer Untersuchungen.
136
Abbildung 40: Darstellung der Signalintensitäten (Pro-Q-Färbung) in % Volumen für den jeweiligen Proteinspot zu den unterschiedlichen Zeitpunkten im Versuchsverlauf (linke Graphik). Dem Säulendiagramm wurden Auschnitte aus dem Zweikanalfarbenbild (Flamingo vs. Pro-Q) eines Replikates hinzugefügt, in dem der quantifizierte Spot umrandet wurde. Die jeweils rechte Graphik beschreibt die log2-Ratios der verschiedenen Zeitpunkte, die jeweils mit der Kontrolle ins Verhältnis gesetzt wurden. Die rote Linie markiert die Signifikanzgrenze.
2.2.2.7.4 Stressinduktion durch Natriumchlorid (osmotischer Stress)
Die Auswirkung von osmotischem Stress, induziert durch Natriumchlorid, auf das
Phosphoproteommuster der bakteriellen Zelle wurde im Rahmen dieser Arbeit
untersucht. In früheren Studien wurde dieser Stress als Auslöser der generellen
Stressantwort eingesetzt. Hierbei zeigte sich, dass keine signifikanten Unterschiede im
Akkumulationsmuster der beteiligten Enzyme des SigB-Regulons festgestellt werden
konnten (Pané-Farré u. a., 2009).
Um herauszufinden, ob andere Regulationsmechanismen zur Anpassung an
osmotischen Stress beteiligt sind, wurde das Phosphoproteom auf Stress bedingte
Veränderung untersucht.
In dem 2D-gelbasiertem Ansatz konnten keine signifikanten Unterschiede in den
Signalintensitäten des phosphorylierten Anti-Anti-Sigmafaktors RsbV des generellen
Stressregulons festgestellt werden und dies bestätigt somit die von Jan Pané-Farré
beschriebenen Beobachtungen. Ein signifikant verändertes Signal konnte für den Spot
1 der Phosphopentomutase DeoB quantifiziert werden (siehe Abbildung 41).
2 Ergebnisse und Diskussion 137
Abbildung 41: Darstellung der Signalintensitäten (Pro-Q-Färbung) in % Volumen für den jeweiligen Proteinspot zu den unterschiedlichen Zeitpunkten im Versuchsverlauf (linke Graphik). Dem Säulendiagramm wurden Auschnitte aus dem Zweikanalfarbenbild (Flamingo vs. Pro-Q) eines Replikates hinzugefügt, in dem der quantifizierte Spot umrandet wurde. Die jeweils rechte Graphik beschreibt die log2-Ratios der verschiedenen Zeitpunkte, die jeweils mit der Kontrolle ins Verhältnis gesetzt wurden. Die rote Linie markiert die Signifikanzgrenze.
Inwieweit dieses Phosphorylierungsereignis unter osmotischem Stress eine Rolle spielt,
ist fraglich. Kürzlich wurde beschrieben, dass DeoB nicht nur die Reaktion von
Ribose-5-P and Ribose-1-P katalysiert, sondern auch als immunogenes ankerloses
Zellwandprotein in S. aureus fungiert (Glowalla u. a., 2009). Inwieweit hier ein
Phosphorylierungsereignis eine Rolle spielen könnte, muss untersucht werden.
2.3 gelbasierte Quantifizierung des Phosphoproteoms von B. subtilis via metabolischer 14N/15N-Markierung
Die Quantifizierung der Phosphorylierungssignale bzw. der phosphorylierten Proteine
innerhalb physiologischer Prozesse ist ein wichtiger Teil der Phosphoproteomic, um
eventuell bestehende Regulationsmechanismen erkennen und erklären zu können.
Dafür bedarf es spezieller Methoden, um akkurate und reproduzierbare Daten für die
phosphorylierten Proteine und ihre quantitativen Veränderungen zu erzeugen.
Wie schon in Abschnitt 2.1.5 und 2.2.2.7 für B. subtilis und S. aureus gezeigt werden
konnte, stellt die traditionelle 2D-Gel-Methode eine sichere Methode zur relativen
Quantifizierung des Phosphoproteoms (unter Verwendung des phosphosensitiven
138
Pro-Q diamond Farbstoffes) bzw. des Proteoms dar (Bernhardt u. a., 2003; Eymann u.
a., 2007; Kohler u. a., 2005). Die Ergebnisse für das Phosphoproteom sind jedoch stark
abhängig von der Qualität der Pro-Q-Färbung und der Auflösung der einzelnen
Proteinspots. Da die Signalintensitäten von Pro-Q-gefärbten Spots aus verschiedenen
Gelen miteinander verglichen werden, werden somit auch zwei verschiedene
Gelfärbeprozesse und getrennte Proteinseparierungsprozesse gegenübergestellt.
Durch die zuvor beschriebene optimierte Pro-Q-basierte Methode zur Detektion
phosphorylierter Proteine (siehe Abschnitt 2.1.1), bei der der Farbstoff (ein 1:3
Gemisch mit Wasser) aus einer Charge kommt, die Gele parallel gefärbt werden und
die Herstellung der zu vergleichenden Gele gemeinsam aus derselben Gellösung
erfolgte, konnten die Quantifizierungsergebnisse und deren Reproduzierbarkeit
erheblich verbessert werden. Wie z. B. in Abbildung 36 des Abschnittes Glukosehunger
bei S. aureus deutlich geworden ist, unterliegen die biologischen Replikate jedoch
größeren Schwankungen. Daher bedarf es immer noch einer Vielzahl von
Wiederholungen und somit eines großen materiellen und zeitlichen Aufwands, um
eine validierte Aussage treffen zu können. Das Ziel war im Rahmen dieser Arbeit eine
Methode zu etablieren, die diesen großen technischen Aufwand minimiert und die in
kürzerer Zeit zu einem aussagekräftigen Ergebnis kommt.
2011 wurde durch Carsten Holland und Mitarbeitern ein 2D-Gel-basierter
Phosphoproteomquantifizierungsansatz vorgestellt. In diesem wurde die Kombination
der SILAC-Markierung (Stable Isotope Labeling by Amino acids in cell Culture), mit der
Phosphoprotein-Affinitätsanreicherung und der 2D-Gel-Analyse gewählt, um die
Unterschiede im Phosphoroteom von gesunden und H. pylori infizierten
Magenepithelzellen zu quantifizieren (Holland u. a., 2011). Die mit Coomassie
gefärbten Proteinspots wurden aus dem 2D-Gel ausgeschnitten und
massenspektrometrisch über MALDI-MS/MS analysiert. Die identifizierten Proteine
wurden mit der Uniprotdatenbank abgeglichen und als phosphoryliert deklariert, wenn
sie in der Datenbank als phosphoryliert angegeben wurden. Insgesamt wurde für 20
Proteine (51 Proteinisoformen) eine Veränderung quantifiziert (Holland u. a., 2011).
Dieser Ansatz liefert erste Hinweise auf mögliche Veränderungen im
Phosphorylierungsmuster. Da jedoch für den Großteil der identifizierten Proteinspots
keine Phosphorylierungsstelle identifiziert werden konnte, beruht die Einordnung als
2 Ergebnisse und Diskussion 139
Phosphoprotein nur auf einem Datenbankvergleich, so dass eine direkte Zuordnung
der Phosphorylierung zu einer bestimmten Proteinisoform nur grob über den pI
getroffen werden konnte.
Um diesem Problem zu entgehen, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein 2D-Gel-basierter
Ansatz gewählt, der eine metabolische Markierung sowie eine Identifizierung der
phosphorylierten Proteine durch eine Pro-Q-Färbung kombiniert.
Der gewählte metabolische Markierungsansatz basiert auf dem Einbau von schweren 15N-Isotopen in alle Aminosäuren der Zelle. Dieser Einbau ruft einen definierten
Massenverschub in den massenspektrometrisch bestimmbaren Peptiden der Proteine
hervor, und dies ermöglicht die Unterscheidung und relative Quantifizierung von
Proteinen aus 14N Zellkulturen und Proteinen aus 15N Zellkulturen (Conrads u. a., 2001;
Wu u. a., 2004). Die hohe Zuverlässigkeit dieses Ansatzes wurde schon in früheren
Arbeiten gezeigt (Dreisbach u. a., 2008; Hempel u. a., 2011). Im Jahre 2005 wurde ein
Versuchsansatz beschrieben, in dem ein Vergleich zwischen einer DIGE ("Di
In dem in dieser Arbeit erstellten Ansatz wurde die Pro-Q-Färbung lediglich als
Instrument für die zuverlässige Detektion der phosphorylierten Proteinspots
verwendet, wohingegen die metabolische Markierung zur Quantifizierung genutzt
wurde. Die Versuchsdurchführung ist in der
fferential
Gel Electrophoresis")-Markierung und einem metabolischen Labeling vorgenommen
wurde. Das Resultat ergab eine gute Übereinstimmung zwischen beiden
Quantifizierungsmethoden (Kolkman u. a., 2005). Ein solcher Vergleich ist mit dem
Pro-Q-Farbstoff jedoch nicht möglich.
Abbildung 42 schematisch dargestellt.
Von Jan Muntel (Inst. f. Mikrobiologie, Universität Greifswald) wurde ein 15N-markierter Standardproteinextrakt von B. subtilis zur Verfügung gestellt, der
Proteine aus verschiedenen Wachstumsphasen enthielt. Dieser wurde aus Zellen
gewonnen, die in einem Medium kultiviert wurden, in dem alle Stickstoffquellen das
Isotop 15N enthielten.
Dieser 15N-Standardproteinextrakt wurde mit dem zu untersuchenden Proteinextrakt
(14N) (WT exponentielles Wachstum oder WT 30 Minuten nach Ethanol-Zugabe) 1:1
gemischt und 2D-gelbasiert aufgetrennt.
140
Abbildung 42: Versuchsaufbau und -durchführung der auf metabolischer Markierung basierender Quantifizierung phosphorylierter Proteine. Die Pro-Q Färbung wurde ausschließlich zur Detektion der phosphorylierten Proteinisoformen verwendet.
2 Ergebnisse und Diskussion 141
Die anschließende Pro-Q-Färbung (in Verbindung mit der Gesamtproteinfärbung
Flamingo s.o.) diente ausschließlich der Identifizierung der phosphorylierten
Proteinspots und hatte somit ihre Relevanz bei der Quantifizierung verloren. Die
phosphorylierten Proteinspots wurden manuell ausgestochen und
massenspektrometrisch analysiert. Die Daten wurden mit der
Quantifizierungssoftware CenSus (Park u. a., 2008) ausgewertet.
Im Zuge der Etablierung dieser neuen Methode wurde eine repräsentative Auswahl an
phosphorylierten Proteinen, die eine Änderung in der Signalstärke unter 30 Minuten
Ethanolstress aufwiesen und welche, die keine Änderungen aufzeigten, ausgewählt.
Dieses Set an Proteinen differierte im Molekulargewicht, im pH und im Auftreten von
unterschiedlichen Proteinisoformen und deckte somit unterschiedliche physikalisch-
chemischen Proteineigenschaften ab. Diese phosphorylierten Proteine konnten
mithilfe der 14N/15N-Markierung quantifiziert werden. Zur Verifizierung der erhaltenen
Ergebnisse wurden drei biologische Replikate angefertigt. Für die Proteine PtsH,
RsbRA2, und PdxS1 konnten nur aus zwei Replikaten Quantifizierungsdaten erhoben
werden.
In Abbildung 43 sind die Ergebnisse der Quantifizierung der metabolischen Markierung
für die jeweiligen phosphorylierten Proteine von B. subtilis aufgeführt. Als Vergleich
wurden die 2D-gelbasierten Pro-Q-Quantifizierungsergebnisse aus dieser Arbeit
gegenübergestellt (Replikat 1). Das zweite 2D-gelbasierte Replikat wurde aus den
Daten von Anja Klutzny übernommen (Anja Klutzny, Diplomarbeit, Universität
Greifswald). In den Graphiken links sind die Ergebnisse eines Replikates und in den
Graphiken rechts die aus zwei bzw. 3 biologischen Replikaten wiedergegeben. In der
oberen Reihe sind die Pro-Q-Quantifizierungsresultate dargestellt, darunter die des
metabolischen Markierungsansatzes. In jede Graphik wurden die Signifikanzgrenzen
eingezeichnet. Aufgrund der großen Standardabweichung liegen die Grenzen für den
Pro-Q-basierten Quantifizierungsansatz bei log2 ≥ 1 und log2 ≤ -1 (siehe auch Abschnitt
2.1.5). Werden die Ergebnisse von einem Replikat mit denen aus zwei Replikaten
verglichen, so zeigt sich, dass Pro-Q-basiert nur ein Protein (RsbRB2) aus dem 1.
Replikat validiert werden konnte.
142
In dem Ansatz der metabolischen Markierung wurden die Ergebnisse des ersten
Ansatzes validiert und zusätzlich konnte für das Protein PdxS1, das in zwei Replikaten
quantifiziert werden konnte, die Zunahme durch das 2. Replikat bestätigt werden.
Aufgrund der für diesen Ansatz berechneten geringen Standardabweichung wurde für
den metabolischen Markierungsansatz die Signifikanzgrenzen auf log2 ≥ 0,555 und
log2 ≤ -0,555 heruntergesetzt. Diese Grenzen sind mit denen von Holland und
Mitarbeitern (im SILAC-Ansatz ermittelt, s. o.) vergleichbar (Holland u. a., 2011).
Abbildung 43: Ergebnisse der verschiedenen Quantifizierungsansätze. Die Säulendiagramme zeigen die normalisierten Ratios (Signalintensitäten der putativ phosphorylierten Proteine (Pro-Q-Färbung) aus 30 min EtOH-Stress versus den korrespondierenden aus der Kontrolle) der analysierten Phosphoprotein-Spots des metabolischen Markierungsansatzes (unten) und der Pro-Q-basierten Quantifizierungsergebnisse (oben). Auf der linken Seite wurden die Ergebnisse eines Versuches dargestellt, auf der rechten die zusammengefassten Ergebnisse aus zwei bzw. drei biologischen Replikaten. Die Standardabweichungen zwischen den biologischen Replikaten sind als Fehlerbalken in dem Säulendiagramm abgebildet. Des Weiteren wurden die jeweiligen Signifikanzgrenzen eingezeichnet.
Die Vorteile der Quantifizierung mithilfe des metabolischen Markierungsansatzes
bestehen in den durch eine geringere Standardabweichung erzielten niedrigeren
Signifikanzgrenzen und in der somit deutlicheren Ausprägung der Veränderung in der
2 Ergebnisse und Diskussion 143
Proteinintensität. Des Weiteren wird direkt die Quantifizierung der Peptide des
Proteins vorgenommen und nicht nur die Quantifizierung der Signalintensitäten eines
Proteinspots, der möglicherweise aus mehreren Proteinen zusammengesetzt ist.
Interessant ist das Ergebnis des Proteins RsbRA1. In der Pro-Q-basierten
Quantifizierung ist die Abnahme der Signalintensität zwar zu detektieren, aber
aufgrund der großen Standardabweichung als nicht signifikant zu werten. Im 14N/15N-
Ansatz hingegen konnte diese Abnahme als signifikant festgestellt werden.
Durch die geringe Standarabweichung und der somit niedrigeren Signifikanzgrenzen
werden schon schwächere Veränderungen als signifikant detektiert. Dies spielt für die
physiologische Betrachtung eine große Rolle. Dadurch dass im 14N/15N-Quantifizierungsansatz eine Abnahme des RsbRA1-Proteins und eine Zunahme
seiner Isoform RsbRA2 festgestellt werden konnte, kann ein Zusammenhang zwischen
diesen beiden Ereignissen angenommen werden. Im 2D-Gel befindet sich die Isoform
RsbRA2 in einem saureren pH-Bereich als RsbRA1. Dies lässt darauf schließen, dass
RsbRA2 eine zusätzliche Phosphorylierung aufweist. Werden nun die oben genannten
Ergebnisse aus Quantifizierung und Pro-Q-Bild zusammengefasst, kann eine Abnahme
des phosphorylierten RsbRA1 durch die Einführung einer zusätzlichen
Phosphorylierung erklärt werden, so dass das Protein seine Lokalisation im Gel
wechselt und somit die Zunahme des RsbRA2 Proteins begründet. Diese Annahme
konnte nur aus dem Markierungsansatz in Kombination mit 2D-Gel, Pro-Q-Färbung
und Quantifizierung geschlussfolgert werden. Kürzlich wurde beschrieben, dass RsbRA
bei starkem Stress (wie z. B. 10 % EtOH) zusätzlich phosphoryliert wird ((Eymann u. a.,
2011), die massenspektrometrischen Analysen wurden im Rahmen dieser Arbeit
durchgeführt) und dies bestätigt die aus dieser Arbeit gewonnene Erkenntnis und die
Richtigkeit der entwickelten Methode.
Die vorgestellte Methode der metabolischen Markierung in Verbindung mit der
Identifizierung der phosphorylierten Proteine unter Einsatz des Pro-Q-Farbstoffes,
zeigt die Möglichkeit für eine zuverlässige Quantifizierung der Dynamik des
Phosphoproteoms, ohne dass eine Quantifizierung über Signalintensitäten, die aus der
Pro-Q-Färbung resultieren, nötig ist. In Zukunft soll sich diese Methode in größer
angelegten Phosphoproteomstudien bewähren.
144
Berücksichtigt werden muss, dass in etwa nur die Hälfte der vorhandenen Proteine im
2D-Gel aufgetrennt werden können (Wolff u. a., 2006) und es daher der Kombination
der 2D-Gel-Methode mit gelfreien Quantifizierungsansätzen bedarf, um einen
möglichst vollständigen quantitativen Überblick über die Physiologie des
Phosphoproteoms zu erhalten (Soufi u. a., 2010).
Der Anspruch, zwei verschiedene Phosphoproteome gelfrei miteinander vergleichen zu
können, ist eine große Herausforderung an den Experimentator und an die
Analysetechnik, da gerade auch bei bakteriellen Phosphoproteomen eine Reduzierung
der Komplexität des zu untersuchenden Proteingemisches und eine Anreicherung der
phosphorylierten Peptide notwendig ist. In der Literatur wurden erste
Quantifizierungsergebnisse von phosphorylierten Peptiden des Phosphoproteomes
von B. subtilis beschrieben (Soufi u. a., 2010). Als Quantifizierungsmethode wurde
SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture) verwendet. Mithilfe der
TiO2-basierten Phosphopeptidanreicherungstechnik wurden dort insgesamt 35
phosphorylierte Peptide identifiziert. Zur Quantifizierung konnten sieben
phosphorylierte Peptide im Phosphathungerexperiment und 20 im
Succinatwachstumsexperiment herangezogen werden.
Kürzlich wurde das Phosphoproteom des Wildtyps von M. pneumoniae mit dem von
Kinase- und Phosphatasemutanten gelfrei mithilfe der Dimethylmarkierung
quantifiziert (van Noort u. a., 2012). Die Autoren konnten 67 verschiedene
phosphorylierte Peptide quantifizieren und fanden nur 16 als unverändert.
Der Nachteil der gelfreien Quantifizierungsmethoden liegt darin, dass nur das
markierte phosphorylierte Peptid quantifiziert wird, und eine Unterscheidung
zwischen verschiedenen Proteinisoformen nicht möglich ist. Daher wird erst die
Kombination der gelbasierten phosphosensitiven Färbemethode mit einem
metabolischen Markierungsansatzes, mit der gelfreien Phopshopeptid-
Anreicherungstechnik und der akuraten und sensitiven Massenspektrometrie bei der
Quantifizierung von phosphorylierten Proteinen vollständigere Einblicke in die
Physiologie des Phosphoproteoms liefern.
2 Ergebnisse und Diskussion 145
2.4 Analyse von Argininphosphorylierungen in Bacillus subtilis
Der grundlegende Fokus in der Analyse von bakteriellen
Phosphorylierungsgeschehnissen lag lange Zeit auf den Histidin- und
Aspartatphosphorylierungen der Zweikomponentensysteme (Stock u. a., 1990 und
Übersichtsartikel Casino u. a., 2010) und später zunehmend auf der Analyse der an
Serin, Threonin und Tyrosin gebildeten Phosphatester. Letztere wurden durch ihre
Stabilität in sauren pH-Bereichen mit den Hochdurchsatzmethoden der analytischen
Proteomforschung am intensivsten untersucht. Hierbei standen die 2D-gelbasierte
Phosphoproteommethodik und die gelfreie Phosphopeptidanreicherungsmethode,
welche beide mit der hoch akkuraten und sensitiven Massenspektrometrie gekoppelt
waren, im Vordergrund (Eymann u. a., 2007; Lévine u. a., 2006; Lomas-Lopez u. a.,
2007; Macek u. a., 2007, 2008; Schmidl u. a., 2010a; Soufi u. a., 2008).
Nur wenig wurde bisher über Argininphosphorylierungen in Proteinen, deren Labilität
mit zunehmendem sauren pH-Wert ansteigt, berichtet. Eine eukaryotische
Argininkinase, die für die Phosphorylierung des Histon3 verantwortlich ist, konnte
beispielsweise im Chromatin des Kalbthymus identifiziert werden (Wakim & Aswad,
1994; Wakim u. a., 1990).
Erst vor kurzem wurde in B. subtilis die Kinase McsB als Argininkinase identifiziert und
die Phosphorylierungsereignisse an ihrem Target (CtsR), einem Repressor der
Hitzeschockantwort, in vitro untersucht und beschrieben (Fuhrmann u. a., 2009). McsB
gilt als Adaptorprotein für die kontrollierte Degradationsaktivität der ClpCP-Protease
unter Hitzestress (Elsholz u. a., 2010; Kirstein u. a., 2005, 2007).
Eine weiterführende Analyse wurde von Elsholz und Mitarbeitern unternommen. In
diesen Untersuchungen wurde die Autophosphorylierungsreaktion der Kinase in vitro
mit isoliertem McsB und dessen Aktivatorprotein McsA in Anwesenheit von ATP
durchgeführt. Ziel war es, spezifische Autophosphorylierungen an Argininresten zu
identifizieren. Durch die spezielle Aufreinigung des McsB-Proteins standen für die
Analyse ausreichend große Mengen an Material zur Verfügung. Im Rahmen dieser
Arbeit wurden die Methodenoptimierung zur Anreicherung der am Arginin
phosphorylierten Peptide sowie die massenspektrometrischen Analysen durchgeführt.
146
Durch den Verzicht der Anwendung der SCX-Chromatographie bei der Durchführung
des Titandioxid-Anreicherungsprotokolls zur Anreicherung der phosphorylierten
Peptide wurde die Ausgangsmethode gemäß Olsen und Macek (siehe oben) erheblich
verkürzt. Aufgrund der methodisch bedingten sauren Verhältnisse wurde mit saurer
Hydrolyse gerechnet, es wurde jedoch hinsichtlich der Protokollverkürzung keine
vollständige Hydrolyse der Phosphoamidate erwartet. Mit diesem Protokoll und der
massenspektrometrischen Analyse an der LTQ Orbitrap XL konnten fünf spezifische
Phosphorylierungsstellen im McsB Protein identifiziert werden (Abbildung 44).
2 Ergebnisse und Diskussion 147
Abbildung 44: MS/MS-Fragmentionenspektren der identifizierten Phosphopeptide von McsB. Die b- und y-Fragmentionenserien wurden unterschiedlich farbig dargestellt. Die jeweilige Aminosäuresequenz des Peptides ist mit dem phosphorylierten Argininrest aufgeführt. Deutlich zu erkennen ist das jeweilige Neutralverlustfragment des Vorläuferions (mit NL markiert).
Die Spektren der phosphorylierten Peptide zeigen eine überwiegend vollständige
Abdeckung der b- und y-Ionen Serien, wobei der spezifisch phosphorylierte Argininrest
identifiziert werden konnte. Im Gegensatz zu Fuhrmann und Mitarbeitern, in dessen
Versuchen die spezifische Phosphorylierungsstelle ausschließlich mit „electron-capture
dissociation“ (ECD) direkt identifiziert wurde, konnte in diesem Ansatz die eindeutige
Phosphorylierungsstelle mit der kollissions-induzierten Fragmentierungsmethode (CID)
spezifisch detektiert werden. In allen aufgenommenen Spektren der am Arginin
phosphorylierten Peptide konnte ein Neutralverlustfragment (Vorläuferion abzüglich
m/z 97,98 Da) detektiert werden (trotz Anwendung der "Multistage Activation" (MSA,
s.o.)). Dieses überraschende Phänomen konnte gleichermaßen von Fuhrmann und
Mitarbeitern beobachtet werden (Fuhrmann u. a., 2009) Dieser Neutralverlust
148
entspricht normalerweise dem Verlust von H3PO4, der bei der CID-Fragmentierung an
phosphorylierten Serinen und Threoninen auftreten kann. Aus der Struktur des
Phosphoamidats ist dieser Neutralverlust nicht erklärbar. Kürzlich wurde dieses
Ereignis bei Peptiden, die einen phosphorylierten Histidinrest aufweisen, ebenfalls
beobachtet, und es wird angenommen, dass dieser Verlust von einer Abspaltung von
HPO3 und H2O herrührt (Kleinnijenhuis u. a., 2007; Medzihradszky u. a., 1997). Ein
ähnliches Phänomen könnte auch bei Phosphoamidaten auftreten.
Als Antagonist der McsB Kinase wurde schon vormals die Phosphatase YwlE
beschrieben (Elsholz u. a., 2010; Kirstein u. a., 2005).
In einem in dieser Arbeit durchgeführten 2D-gelbasiertem Phosphoproteomansatz
konnten phosphorylierte Proteinisoformen des ClpC-Proteins in dem Extrakt einer
∆ywlE-Deletionsmutante beobachtet werden, die sich kettenartig aneinanderreihten
(siehe Abbildung 45).
Abbildung 45: Zweikanalfalschfarbenbild der Auftrennung des cytosolischen Extraktes einer ∆ywlE-Mutante im 2D-Gel. Die Phosphoproteine wurden mit dem phosphosensitiven Farbstoff Pro-Q (rot) und die Proteine mit der Gesamtproteinmengenfärbung Flamingo (grün) angefärbt. Das Bild wurde mit der Decodon Delta2D Software erstellt. Speziell wurde das ClpC-Protein hervorgehoben, welches durch eine Kette von phosphorylierten Proteinisoformen (rot) auffällt.
2 Ergebnisse und Diskussion 149
Gelbasiert war es damals nicht möglich, die spezifischen phosphorylierten
Aminosäuren in den Peptiden des ClpC-Proteins massenspektrometrisch zu
identifizieren.Mit der vor kurzem erlangten Erkenntnis der Existenz bakterieller
Argininphosphorylierungen entstand in Zusammenarbeit mit Alexander Elsholz
(Institut f. Mikrobiologie, Universität Greifswald) die Charakterisierung der ClpC-
Argininphosphorylierungsstellen.
Hierbei fand eine Aufreinigung des ClpC-Proteins aus der ∆ywlE-Mutante statt. Die
phosphorylierten Peptide wurden unter Zuhilfenahme der Titandioxid-basierenden
Phosphopeptid-Methode angereichert und im Rahmen dieser Arbeit
massenspektrometrisch analysiert (es wurde die für McsB in dieser Arbeit etablierte
Methode angewendet s.o.). Mit diesem Ansatz konnten fünf spezifische
Argininphosphorylierungsstellen identifiziert werden (Abbildung 46).
150
Abbildung 46: MS/MS Fragmentionenspektren der identifizierten phosphorylierten Peptide von ClpC. Die b- und y-Fragmentionenserien sind unterschiedlich farbig dargestellt und die jeweilige Aminosäuresequenz des Peptides ist mit dem phosphorylierten Argininrest aufgeführt.
Ob die in dem 2D-Gel-Ansatz detektierten phosphorylierten ClpC-Isoformen wirklich
Argininphosphorylierungen aufweisen und somit der Pro-Q-Farbstoff auch
Phosphoamidate anfärbt, bleibt fraglich, denn aufgrund der Instabilität der
Phosphoamidate ist es nicht geklärt, ob Phosphoamidate die Methode der
2D-Gelelektrophorese und der Pro-Q-Färbung überdauern.
An die detaillierten Einzelproteinstudien schloss sich ein globaler Ansatz an. Das
cytosolische Phosphoproteom der ∆ywlE-Phosphatase-Mutante wurde mittels
Titandioxidanreicherung und massenspektrometrischer Analyse untersucht. Hierbei
stand der Überblick über die Argininphosphorylierungen im Vordergrund und nicht der
Anspruch nach einer vollständigen Charakterisierung des Arginin-Phosphoproteoms.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Phosphopeptidanreicherungsmethode für diese
Aufgabenstellung optimiert. In dem Optimierungsprozess wurde eine Abwägung
zwischen Funktionalität der Anreicherungsmethode und der Vermeidung verstärkter
Hydrolyse getroffen. Aufgrund der Ergebnisse dieser Abwägung wurde die Methode
gemäß Macek und Olsen (Olsen & Macek, 2009) modifiziert. Im Hinblick auf die
Instabilität der Argininphosphorylierungen in stark sauren Bedingungen konnte die
saure Hydrolyse nicht ausgeschlossen werden. Durch die zeitliche Einschränkung des
2 Ergebnisse und Diskussion 151
Protokolls (s. o.) und der genauen Einhaltung des pH-Wertes (pH 2,7-3) sollte diese
insoweit eingeschränkt werden, dass die Menge der N-phosphorylierten Peptide
(Phosphoamidate) für eine Identifizierung ausreichend ist, um sie mit den etablierten
massenspektrometrischen Methoden analysieren zu können. Die chromatographische
Auftrennung vor der massenspektrometrischen Analyse fand bei Raumtemperatur und
nicht, wie sonst üblich, in einem erwärmten Säulenofen statt, um die Hydrolyse der N-
Phosphorylierung nicht zu beschleunigen. Auf eine
Kationenaustauschchromatographie wurde im Hinblick auf das Vorhergesagte
verzichtet. Da diesem Vorfraktionierungsschritt jedoch eine wichtige Aufgabe bei der
Reduzierung der Proteinkomplexität zukommt, wurde ein komplementäres Verfahren
in die Titandioxidanreicherung mit eingebunden, indem die Überstände aus der
Beladung des Titaniumdioxides erneut einer Titaniumdioxidanreicherung zugeführt
wurden. Diese Prozedur wurde mehrfach wiederholt, und am Ende des
Anreicherungsprotokolls schloss sich die Vereinigung der Eluate an. Diese Methode
resultierte in einer Schritt-für-Schritt-Reduzierung der Komplexität des für die
Anreicherung vorgesehenen Peptidgemisches. Aufgrund der Instabilität der
Phosphoamidate wurde die massenspektrometrische Analyse der vereinigten Eluate
sofort nach Beendigung der Anreicherungsmethode angeschlossen.
In dieser fand eine Separierung der Peptide über eine selbstgepackte „reversed
phase“-(Umkehrphasen-) C18-Säule statt, die gleichzeitig als Emittertip genutzt wurde,
um den Weg zwischen Auftrennung und der Analyse im Massenspektrometer so kurz
wie möglich zu halten. In der massenspektrometrischen Untersuchung der separierten
Peptide wurden zwei verschiedene Methoden basierend auf zwei unterschiedlichen
Fragmentierungstechniken angewandt, da die MS-Analyse von den strukturellen
Informationen aus den Fragmentierungssreaktionen der Peptide abhängig ist. Durch
die Anwendung zweier unterschiedlicher Fragmentierungstechniken wurde eine
vermehrte Identifizierung von phosphorylierten Peptiden und deren spezifischer
Phosphorylierungstellen erwartet. Bei der einen Fragmentierungstechnik handelte es
sich um die Kollisions-induzierte Fragmentierung CID (collision induced fragmentation)
der 20 höchst abundantesten Peptidionen, die in eine Daten abhängige Messmethode,
bei der der Übersichtsscan in der Orbitrap (Auflösung R= 60000) durchgeführt wird,
mit einbezogen wurde. Die CID-Fragmentierungstechnik (hier mit der LTQ-Orbitrap-
152
Velos durchgeführt) wird bevorzugt für die Hochdurchsatzanalyse von
Peptidgemischen eingesetzt, da sie in Verbindung mit dem Multiplierdetektionssystem
der linearen Ionenfalle eine sehr schnelle und sensitive Methode darstellt, Peptide zu
detektieren (Becher u. a., 2009; Olsen u. a., 2009; Wolff u. a., 2006). Ein Nachteil dieser
Fragmentierungstechnik besteht darin, dass die "weiche"-Fragmentierung
charakteristische Neutralverluste durch die vorzeitige Dissoziation funktioneller
Gruppen hervorruft. Dies spiegelt sich in einem fragmentärmeren Spektrum wider, in
dem das Vorläuferion abzüglich des Neutralverlusts dominiert (Boersema u. a., 2009a).
Dieser Nachteil kann durch die Anwendung der Multistage-Aktivierung (siehe
Abschnitt 2.2.2.1) kompensiert werden. Wie in den vorangegangenen Messungen bei
der Identifizierung von Argininphosphorylierungen von McsB und ClpC festgestellt
werden konnte, wurde trotz der MSA-Technik ein sehr intensiver Neutralverlust-
Vorläuferionenpeak detektiert, der vermutlich aus einer Zweifachabspaltung herrührt.
Um qualitativ hochwertigere Spektren zu erzielen, wurde daher zusätzlich eine weitere
Fragmentierungsmethode eingesetzt.
Die zweite Fragmentierungsmethode stellt die HCD-Fragmentierung (HCD = higher
energy collisional dissociation) der 10 höchst abundanten Peptide des Übersichtsscan
(siehe Abschnitt 3.2.6.4) dar. Die HCD-Fragmentierungstechnik beruht auf der
hochenergetischen Kollision mit Stickstoffatomen und liefert eine höhere
Dissoziationsenergie als die vorher beschriebene CID-Fragmentierung. Die daraus
resultierende höhere Anzahl intensiverer Fragmentionen produziert qualitativ
hochwertigere Spektren. Die Analyse der Fragmentionen erfolgt in der
hochauflösenden Orbitrap. Aufgrund des spezifischen Fourier-Transform-Analysators
benötigt die HCD-Messung jedoch ungefähr die doppelte Zeit im Vergleich zur CID-
Anwendung (Jedrychowski u. a., 2011; Olsen u. a., 2007).
Die Proben wurden jeweils mit einer CID- und einer HCD-Methode analysiert, wobei
die chromatographische Auftrennung (Gradientenlänge, Eluentenbedingungen) für
beide Methoden gleich gewählt wurden (siehe Abschnitt 3.2.6.4). Des Weiteren
wurden die optimalen Parameter für die einzelnen Fragmentierungsmethoden
ausgewählt, um für jede Methode die bestmöglichsten Ergebnisse zu erzielen. Für die
CID-Methode (Fullscan FT R=60000) wurde ein TOP20- und für die HCD-Methode ein
2 Ergebnisse und Diskussion 153
Top10-Ansatz (Fullscan FT R=30000, MS/MS FT R=7500) verwendet. Bei den Resultaten
muss berücksichtigt werden, dass mit der HCD- im Vergleich zur CID-Analyse
methodisch bedingt nur die Hälfte der MS/MS-Spektren aufgenommen werden
konnten. Die Daten wurden mit der MaxQuant-Software ausgewertet.
Mit dem gewählten Ansatz und der Anwendung zweier unterschiedlicher
Fragmentierungstechniken war es möglich 111 Arginin Phosphorylierungsstellen in 84
Proteinen von B. subtilis zu identifizieren (Fragmentspektren und Tabelle siehe Anhang
III und III_S). Durch die Anwendung der HCD-Fragmentierungstechnik konnten 14
phosphorylierte Peptide dem Ergebnis hinzugefügt werden, die entweder ein qualitativ
hochwertigeres Spektrum aufwiesen oder eine Neuidentifizierung darstellten.
Damit konnte dargelegt werden, dass mit der oben beschriebenen Methode eine
erfolgreiche Identifizierung von Argininphosphorylierungen aus komplexen
bakteriellen Proteingemischen möglich ist, und die hier erzielten Ergebnisse einen
ersten größeren Einblick in das Arginin-Phosphoproteom von B. subtilis liefern.
Aufgrund der Untersuchungen von Andreas Schmidt (Universität Wien) zu der
Stabilität der Argininphosphorylierung eines synthetischen Peptides unter
verschiedenen pH- und Temperatur- Bedingungen, die er in seiner Dissertation 2010
aufzeigte, kann geschlussfolgert werden, dass maximal die Hälfte der ursprünglich
vorhandenen, am Arginin phosphorylierten Peptide, zur massenspektrometrischen
Analyse zur Verfügung standen. Die nächste Aufgabe besteht somit in einer weiteren
Optimierung der Methode, so dass eine vollständige Analyse der
Argininphosphoproteome bakterieller Systeme möglich wird.
2.5 Zusammenfassung und Ausblick
Im Gegensatz zu den eukaryotischen Zellen, in denen ca. 30 % der synthetisierten
Proteine phosphoryliert vorliegen (Mann u. a., 2002), findet sich im bakteriellen
Organismus nur eine geringe Menge an phosphorylierten Proteinen. Der Anteil an
phosphorylierten Proteinen in Bakterien beträgt durchschnittlich 0,5-4 % (Macek &
Mijakovic, 2011).
154
Diese geringe Stöchiometrie erfordert eine Differenzierung innerhalb des Proteoms
durch Vorfraktionierung der Proteine gemäß ihren physiko-chemischen Eigenschaften,
um die Komplexität des Proteingemisches herabzusetzen. Das Ziel dieser Arbeit war es
Methoden zur Analyse von Phosphoproteomen zu etablieren, zu optimieren und die
bakteriellen Phosphoproteome von B. subtilis und S. aureus zu charakterisieren.
Zur Reduzierung der Komplexität des Proteingemisches und zur Visualisierung der
phosphorylierten Proteinisoformen wurde eine 2D-gelbasierte Methode eingesetzt,
die auf der phosphosensitiven Pro-Q Diamond-Färbung beruht. Diese Methode wurde
im Zuge der Untersuchungen zum Phosphoproteom von B. subtilis in der Art optimiert,
dass ein sauberes, reproduzierbares und quantifizierbares Färbeergebnis erzielt wurde
und somit die Visualisierung eines Großteils des cytosolischen Phosphoproteoms von
B. subtilis gelungen ist. Des Weiteren wurden Gesamtproteinfärbungen getestet, die
zur Identifizierung putativ phosphorylierter Proteine in Verbindung mit der Pro-Q-
Färbung Anwendung finden sollten. Hierbei stellte sich der Fluoreszenzfarbstoff
Flamingo der Firma Biorad als optimal dar. Es konnte mit zwei unterschiedlichen
Versuchsansätzen gezeigt werden, dass die Identifizierung phosphorylierter Proteine
durch den Vergleich mit einer fluoreszierenden Gesamtproteinfärbung validierbare
Ergebnisse liefert.
Des Weiteren konnte mit Hilfe dieser Methode die Dynamik des Phosphoproteoms von
B. subtilis zwischen verschiedenen physiologischen Umweltbedingungen global
visualisiert und relativ quantifiziert werden. Die Phosphoproteom-Untersuchungen
einer sigB-Mutante von B. subtilis lieferten das Ergebnis, dass die Mutation im Gen des
Sigmafaktors B einen negativen Einfluss auf die Pro-Q-Signalintensität des
phosphorylierten Anti-Anti-Sigmafaktors RsbV und des phosphorylierten RsbRD
Proteins des Stressosoms ausübt.
Diese Ergebnisse wurden in der gemeinsamen Arbeit "Dynamics of protein
phosphorylation on Ser/Thr/Tyr in Bacillus subtilis." mit Christine Eymann und
Kollegen veröffentlicht (Eymann u. a., 2007).
In enger Zusammenarbeit mit Sebastian Schmidl (Universität Göttingen) wurde die
optimierte 2D-Gel- und Pro-Q-basierte Phosphoproteommethode zur Analyse des
pathogenen, zellwandlosen Mollicuten Mycoplasma pneumoniae erfolgreich
2 Ergebnisse und Diskussion 155
eingesetzt. Die im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit durchgeführten 2D-Gele und
massenspektrometrischen Analysen der putativ phosphorylierten Proteinspots
lieferten die Basis für die entstandenen Gemeinschaftsarbeiten:
"The phosphoproteome of the minimal bacterium Mycoplasma pneumoniae:
analysis of the complete known Ser/Thr kinome suggests the existence of novel
kinases." (Schmidl u. a., 2010a) und "The stability of cytadherence proteins in
Mycoplasma pneumoniae requires activity of the protein kinase PrkC" (Schmidl u. a.,
2010b).
Darüber hinaus wurde die optimierte 2D-Gel- und Pro-Q-basierte
Phosphoproteommethode bei der Untersuchung des Phosphoproteoms von S. aureus
angewendet. Es konnten Phosphoproteommasterkarten für zwei unterschiedliche
pH-Bereiche erstellt werden. Hierbei zeigte sich, dass der Einsatz von Gelen mit einem
engen pH-Bereich für die Analyse von phosphorylierten Proteinen von Vorteil ist.
Insgesamt konnten mittels des 2D-Gel-basierten Ansatzes 121 verschiedenen putativ
phosphorylierte Proteinspots, die 80 verschiedenen Proteinen zugeordnet werden
konnten, detektiert werden. Durch eine auf die Messungen von phosphorylierten
Peptiden angepasste massenspektrometrische Analyse ist es gelungen, trotz der sehr
geringen Menge an vorliegenden phosphorylierten Peptiden, 22 verschiedene
Phosphorylierungsstellen zu identifizieren.
Durch die Untersuchungen zur Dynamik des cytosolischen Phosphoproteoms von
S. aureus unter verschiedenen physiologischen Bedingungen sollten Einblicke in
Regulationsmechanismen und ihrer möglichen Hauptakteure erhalten werden.
Insgesamt konnten 10 signifikante Veränderungen der Signalintensitäten
phosphorylierter Proteine, bedingt durch Stresseinwirkung oder Glukosehunger, im
Phosphoproteom relativ quantifiziert werden: sechs unter Glukose-
hungerbedingungen, zwei unter nitrosativem Stress, eine unter oxidativer Stress und
eine Veränderung unter osmotischem Stress. Für das phosphorylierte Protein DeoB
konnte eine Veränderung in der Signalintensität unter mehreren Stressbedingungen
beobachtet werden. Die Veränderungen des Signals des phosphorylierten Spots der
Pyruvatkinase unter Glukosehungerbedingungen in Verbindung mit der für dieses
Enzym identifizierten Phosphorylierungsstelle und den neuesten Literaturdaten
156
ergaben Hinweise auf eine durch Phosphorylierung regulierte Teilsteuerung des
Enzyms. Ebenso konnte durch das Auftreten eines zusätzlichen phosphorylierten Spots
des Enzyms HchA auf einen putativen Methylglyoxal detoxifizierenden Mechanismus
unter nitrosativen Bedingungen geschlossen werden.
Ziel war es, einen möglichst umfassenden Überblick über das gesamte
Phosphoproteom von S. aureus zu gewinnen. Eine weitere leistungsstarke Technik, die
Phosphopeptidanreicherungsmethode gemäß Olsen und Macek (2009), konnte
etabliert und für die Untersuchungen des Phosphoproteoms von S. aureus eingesetzt
werden. Mit dieser war es möglich 49 verschiedene Phosphorylierungsstellen aus 33
unterschiedlichen Proteinen zu detektieren.
Insgesamt konnten mit Hilfe der gelbasierten und der gelfreien Methode 103
phosphorylierte Proteine und 68 verschiedene Phosphorylierungsstellen von S. aureus
identifiziert werden. Welche weitreichende Bedeutung die
Phosphorylierungsgeschehnisse besitzen, wurde aufgrund der funktionellen
Einordnung der identifizierten phosphorylierten Proteine in 15 verschiedene Klassen
deutlich. Für mehrere phosphorylierte Proteine konnten Verbindungen zum
Virulenzgeschehen hergestellt werden. Besonders interessant für das
Pathogenitätsgeschehen ist der phosphoryliert vorliegende Virulenz-Regulator SarA,
der vermutlich, wie ein Sequenzvergleich zeigte, einen ähnlichen durch
Phosphorylierung geregelten Regulationsmechanismus aufweist, wie der "multi-drug-
resistenz"-Regulator MgrA. Schließlich konnten für das glykolytische Enzym FbaA, das
als antimikrobielles Ziel in der Literatur beschrieben wurde, drei
Phosphorylierungsstellen im aktiven Zentrum identifiziert werden. Es wird
angenommen, dass sie für die Regulation der Substratbindung und somit für die
Aktivität des Enzyms verantwortlich sind. Ferner wird vermutet, dass die
Phosphorylierungsereignisse möglicherweise die Wirkung von auf Substratanaloga
basierenden Inhibitoren unter in vivo Bedingungen negativ beeinflussen.
Die Ergebnisse der Untersuchungen zum Phosphoproteom sind in der Arbeit "The
cytoplasmic phosphoproteome and its physiological dynamics in Staphylococcus
aureus" (Katrin Bäsell u.a., eingereicht bei dem "Journal of Proteome Research")
zusammenfassend aufgeführt.
2 Ergebnisse und Diskussion 157
Es war im Rahmen dieser Arbeit ebenfalls möglich die für S. aureus angewendete
Phosphopeptidanreicherungsmethode in der Form zu modifizieren, dass sie in der
Analyse der Argininphosphorylierungen von B. subtilis Anwendung finden konnte. Mit
Hilfe der angepassten Methode und der massenspektrometrischen Analyse war es
möglich, fünf Argininphosphorylierungsstellen der Argininkinase McsB und fünf der
ATPase ClpC zu identifizieren. In einem globalen Phosphoproteomansatz, in dem
zusätzlich zu der optimierten Methode zwei verschiedenen Fragmentierungstechniken
bei der massenspektrometrischen Analyse verwendet wurden, konnten in der
Phosphatasemutante ∆ywlE 111 Argininphosphorylierungsstellen in 84 Proteinen von
B. subtilis identifiziert werden. Diese Ergebnisse flossen in die Arbeiten von A. Elsholz:
"Activity control of the ClpC adaptor McsB in Bacillus subtilis" (Elsholz u. a., 2011)
und "Global impact of protein arginine phosphorylation on the physiology of Bacillus
subtilis" (Elsholz u. a., 2012) mit ein.
Die Quantifizierung der Veränderungen im Phosphoproteom, die aufgrund der
Anpassung an unterschiedliche physiologische Bedingungen auftreten, ist ein wichtiger
Bestandteil der Phosphoproteomic. Sie ist nötig, um eventuell bestehende
Regulationsmechanismen erkennen und erklären zu können. In dieser Arbeit wurde die
Dynamik des Phosphoproteoms für B. subtilis und S. aureus mithilfe des Pro-Q-
basierten Phosphoproteomansatzes analysiert. Die Untersuchungen zeigten jedoch,
dass die biologischen Replikate größeren Schwankungen unterliegen, und es einer
Vielzahl von Wiederholungen und somit eines großen materiellen und zeitlichen
Aufwands bedarf, um eine signifikante Aussage treffen zu können. Bezug nehmend auf
diese Problematik wurde eine Methode entwickelt, die die Vorteile des 2D-Gels, die
Identifizierung des phosphorylierten Proteins über den Pro-Q-Farbstoff und die
metabolische Markierung als Quantifizierungsansatz miteinander kombiniert. Mit
dieser Methode konnten am Beispiel des Ethanolstress für B. subtilis signifikante
Aussagen zu Veränderungen phosphorylierter Proteine getroffen und somit die
Funktionalität der Methode gezeigt werden. Der Vorteil dieser Methode, im
Unterschied zu dem Pro-Q-Quantifizierungsansatz, zeichnet sich durch eine bessere
Reproduzierbarkeit und eine höhere Empfindlichkeit gegenüber geringeren
Veränderungen aus. In Zukunft soll sich die Qualität der Methode in größer angelegten
Phosphoproteom-Quantifizierungsanalysen bewähren.
158
Des Weiteren werden die Etablierung und Optimierung eines gelfreien
Quantifzierungsansatzes angestrebt, um für einen möglichst großen Teil des
bakteriellen Phosphoproteoms quantifizierbare Daten ermitteln zu können.
Dieser Ansatz soll es dann in der Untersuchung von Kinase- und Phosphatasemutanten
ermöglichen, die Unterschiede zum Wildtyp aufzuzeigen und somit potentielle
Zielproteine der Kinasen bzw. Phosphatasen zu identifizieren.
Ein in Zukunft intensiv zu untersuchendes Feld wird neben den einzelnen
Phosphorylierungsereignissen, das Wechselspiel verschiedenster Modifikationen im
Regulationsgeschehen sein. Erste Untersuchungen von van Noort und Mitarbeitern
zeigen das gemeinsame Auftreten von Acetylierungen am Lysin und
Phosphorylierungen am Serin, Threonin oder Tyrosin an demselben Protein und es
wurde gemutmaßt, dass ein regulatorischer Zusammenhang zwischen den
verschiedenen Modifikationen bestehen könnte (van Noort u. a., 2012; Soufi u. a.,
2012). In einem von Soufi und Mitarbeitern durchgeführten Vergleich der in der
Literatur beschriebenen Modifikationen der Isocitratdehydrogenase von E. coli zeigte
sich, dass die Phosphorylierung bzw. Acetylierung des Proteins jeweils einen Effekt auf
die Aktivität zeigen und somit beide einen Einfluss auf das Regulationsgeschehen
ausüben (Soufi u. a., 2012).
Aufgrund dessen wird die Analyse des "cross-talk" zwischen Modifikationsereignissen
in der Zukunft eine wichtige Rolle bei der Aufklärung von Regulationsmechanismen
spielen.
3 Material und Methoden 159
3 Material und Methoden
3.1 Materialien
3.1.1 Bakterienstämme
Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme sind in der
nachfolgenden Tabelle zusammen mit dem für die Selektion eingesetzten Antibiotikum
und den dazugehörigen Referenzen aufgeführt.
Tabelle 14: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus Stämme.
Bakterien-stamm
Relevanter Genotyp Antibiotika Resistenzen
Referenz
B. subtilis 168
trpC2 / (Anagnostopoulos & Spizizen, 1961)
B. subtilis ML6
trpC2 ΔsigB CmR Chloramphenicol (Igo u. a., 1987)
S. aureus COL Klinisches Isolat, mec, hoch Methicillin resistent, TcR
/ (Shafer & Iandolo, 1979)
3.1.2 Medien und Medienzusätze
Im Folgenden sind die verschiedenen Medien und Medienzusätze, die für die Anzucht
von B. subtilis oder S. aureus COL verwandt worden sind, aufgeführt. Das LB-Medium
wurde für beide Stämme zur Anzucht von Glycerinkulturen im Zuge der Stammhaltung
genutzt. Die Kultivierung von B. subtilis erfolgte in den verschiedenen Belitzky-Medien,
die von S. aureus wurde im chemisch-definierten Medium durchgeführt. Die
Herstellung der jeweiligen Medien und Komponenten erfolgte, soweit nicht anders
beschrieben, mit A. bidest.
LB-Medium:
LB Broth Base von Invitrogen (20 g/l, pH 7,5)
160
Belitzky-Minimalmedium (Bacillus subtilis Stämme): BMM
Das BMM besteht aus dem Grundmedium (1-fach konzentriert) und den
verschiedenen Supplementen, die gemäß dem Supplementierungsschema (siehe
unten) kurz vor der Bakterienanzucht hinzugefügt wurden.
Grundmedium, 2-fach Konzentrat:
30 mM (NH4)2SO4 16 mM MgSO4 * 7H2O 54 mM KCl 14 mM Na3Citrat * H2O 100 mM Tris Base
Der pH-Wert wurde mit HCl auf 7,5 eingestellt und das Medium nachfolgend
autoklaviert.
Belitzky Minimalmedium ohne Citrat (B. subtilis-Stämme): BOC
Für die Glukosehungerversuche wurde das Belitzky-Medium ohne Citrat eingesetzt, um
eine Nutzung des Citrats als alternative C-Quelle bei Glukosehunger auszuschließen.
Grundmedium nach Stülke und Mitarbeitern modifiziert (Stülke u. a., 1993), 2-fach
Konzentrat:
15 mM (NH4)2SO4 8 mM MgSO4 * 7 H2O 27 mM KCl 50 mM Tris-HCl
Der pH-Wert wurde mit HCl auf 7,5 eingestellt und das Medium nachfolgend
autoklaviert.
Supplementierungsschema für Belitzky- und BOC-Medien:
Das Schema (Tabelle 15) beschreibt die Medienzusätze, die Konzentration ihrer
Stammlösung und die Endkonzentration im jeweiligen Medium. Zusätzlich wurde die
verwendete Sterilisationsmethode aufgeführt.
3 Material und Methoden 161
Tabelle 15: Supplementierungsschema für Belitzky- und BOC-Medien.
Sterilisation Konz. Stammlsg. ÜN-Medium Glukoselimitation
KH2PO4 autoklavieren 0,2 M 0,6 mM 0,4 mM
L-Tryptophan filtrieren 39 mM 0,78 mM 0,78 mM
CaCl2 x 2 H2O autoklavieren 1 M 2 mM 2 mM
FeSO4 x 7 H2O filtrieren 0,5 mM 1 µM 1 µM
MnSO4 x 4 H2O filtrieren 25 mM 10 µM 10 µM
Glukose punktautoklavieren 20 % (w/v) 0,2 % 0,05 %
Glutaminsäure punktautoklavieren 0,5 M 4,5 mM 4,5 mM
Chemisch-definiertes-Medium (S. aureus COL): CDM
Grundmedium, 2-fach Konzentrat: 9,88 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 3,3 mM MgSO4 * 7 H2O 18,67 mM NH4Cl 17,11 mM NaCl
Das Medium wurde punktautoklaviert.
Supplemente für CDM:
Es wurden die folgenden Supplemente, gemäß dem Suplementierungsschema der
Tabelle 16, dem Grundmedium (1-fach konzentriert) kurz vor der Bakterienanzucht
hinzugefügt.
• je 1 mM der folgenden Aminosäuren: Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Valin
Die Aminosäuren wurden in 50 mM-Stammlösungen angesetzt und
sterilfiltriert.
• Vitamine:
Endkonzentration im Medium: 0,04 mM Biotin 0,21 mM Ca-D-Panthothensäure
162
0,036 mM Cyanocobalamin 0,81 mM Nicotinsäure 0,29 mM p-Aminobenzoat 0,62 mM Pyridoxaminhydrochlorid 0,26 mM Riboflavin 0,29 mM Thiaminiumchlorid
Die Vitamine wurden in 1000-fach konzentrierten Stammlösungen angesetzt
und sterilfiltriert.
• Spurenelemente:
Endkonzentration im Medium: 1,46 mM CoCl2 * 6 H2O 0,015 mM CuCl2 * 2 H2O 0,5 mM FeCl3 * 6 H2O in 2 N HCl 0,097 mM H3BO3 0,5 mM MnCl2 * 4 H2O 0,148 mM Na2MoO4 * 2 H2O 0,1 mM NiCl2 * 6 H2O 0,51 mM ZnCl2
Die Spurenelemente wurden in 1000-fach konzentrierten Stammlösungen
angesetzt und sterilfiltriert.
• Glukose: Es wurde eine 20 %ige Stammlösung (w/v) angesetzt und
punktautoklaviert.
• Citrat: Es wurde eine 1 M Citrat-Stammlösung hergestellt und
punktautoklaviert.
Tabelle 16: Pipettierschema für 100 ml chemisch definiertes Medium
Übernacht-/Hauptkultur Glukose limitiert
je Aminosäuren 2 ml (Stammlsg.) 2 ml (Stammlsg.)
je Vitamine 100 μl (Stammlsg.) 100 μl (Stammlsg.)
je Spurenelemente
(außer FeCl3) 100 μl (Stammlsg.) 100 μl (Stammlsg.)
1 M Citrat 14 μl (EK: 0,142 mM) 14 μl
FeCl3 150 μl (Stammlsg.) 150 μl (Stammlsg.)
2 N NaOH (steril) 150 μl 150 μl
20 % (w/v) Glukose 740 μl (EK: 7,5 mM/0,15 %) 246 μl (EK: 2,5 mM/ 0,05%)
3 Material und Methoden 163
3.1.3 Antikörper, Beads, Säulenmaterialien
Die folgende Aufzählung beinhaltet die in dieser Arbeit verwendeten Antikörper, Beads
und Säulenmaterialien.
primärer Antikörper: Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) (Cell Signaling Technology®) sekundärer Antikörper: "Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate" (Bio-Rad) Titansphäre 10 µm: GL Sciences Inc. Japan (MZ-Analysentechnick, Mainz) Säulenmaterial, C8 3M: Infochroma AG, Zug, CH Säulenmaterial, C18(2) Luna 3n: Phenomenex Ltd., Torrance, USA
3.1.4 Antibiotika und Enzyme
Das zur Stammselektion bzw. als Translationshemmer genutzte Antibiotikum wird in
der Tabelle 17 aufgeführt.
Tabelle 17: verwendetes Antibiotikum.
Antibiotikum Firma Firmenstandort Lösungs-mittel Endkonzentration
Chloramphenicol Serva Electrophoresis GmbH
Heidelberg 100 % Ethanol 5 µg/ml
Nachfolgend sind alle in dieser Arbeit verwendeten Enzyme aufgeführt.
Tabelle 18: verwendete Enzyme.
Enzym Firma Firmenstandort Reinheitsgrad
Nucleasemix GE Healthcare Chalfont St. Giles, GB -
Lysozym Fluka AG Buchs, CH -
Lysylendopeptidase (LysC)
Wako Pure Chemical Industries Neuss "Mass Spectrometry
Grade"
Trypsin Promega USA "Sequencing Grade"
Alkalische Phosphatase Sigma-Aldrich® St. Louis, USA -
Glutamylendopeptidase (GluC)
Roche Diagnostics GmbH Mannheim "Sequencing Grade"
164
3.1.5 Chemikalien und Lösungsmittel
Die Tabelle 19 umfasst alle im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Chemikalien und
Lösungsmittel.
Tabelle 19: verwendete Chemikalien und Lösungsmittel.
Chemikalien/Lösungsmittel Hersteller Firmensitz 15N-Ammoniumsulfat Cambridge Isotope Laboratories Inc. USA 15N-L-Tryptophan Cambridge Isotope Laboratories Inc. USA 2-Gycerolphosphat Sigma-Aldrich® St. Louis, USA 33P-Phosphosäure Hartmann GmbH Braunschweig Aceton (≥ 99,8%) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Acetonitril (ultrapure) AppliChem GmbH Darmstadt Acrylamid 40 % AppliChem GmbH Darmstadt Alanin Fluka AG Buchs, CH Ammoniak 25 % Fluka AG Buchs, CH Ammoniumbicarbonat Fluka AG Buchs, CH Ammoniumchlorid (NH4Cl) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Ammoniumhydrogencarbonat (NH4HCO3)
Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe
Ammoniumpersulfat (APS) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Arginin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Aspartat Sigma-Aldrich® St. Louis, USA BCIP Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Biotin Fluka AG Buchs, CH Bisacrylamid 2 % AppliChem GmbH Darmstadt Borsäure (H3BO3) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Bromphenolblau Sigma-Aldrich® St. Louis, USA BSA (Rinderserumalbumin) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Butanol (≥ 99,5 %) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Calciumchlorid (CaCl2 * 2 H2O) Serva Electrophoresis GmbH Heidelberg Calcium-D-Panthothensäure Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe CHAPS Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Citrat-Monohydrat Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Cobaldchlorid (CoCl2 * 6 H2O) Fluka AG Buchs, CH Coomassie-Brillant Blue G-250 Sigma-Aldrich® St. Louis, USA CuCl2 * 2 H2O Fluka AG Buchs, CH Cyanocobalamin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Cystein Sigma-Aldrich® St. Louis, USA DHB Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Diamid Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Dimethylformamid (≥99,8) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe DTT (Dithiothreitol) GE Healthcare Chalfont St. Giles,
GB Eisenchlorid (FeCl3) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Eisensulfat- Heptahydrat (FeSO4 * 7H2O)
Serva Electrophoresis GmbH Heidelberg
Essigsäure (100 %) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Essigsäure (100 %, Ultraqualität) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe
3 Material und Methoden 165
Chemikalien/Lösungsmittel Hersteller Firmensitz Ethanol Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Flamingo Bio-Rad Laboratories GmbH Hercules, USA Formaldehyd (≥ 37 %) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Glukose Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Glycerin Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Glycin Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Harnstoff Merck KGaA Darmstadt Histidin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Iodacetamid Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Isoleucin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Isopropanol (≥ 99,95 %) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Kaliumcarbonat (KCO3) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Kaliumchlorid (KCl) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck KGaA Darmstadt Leucin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA L-Glutaminsäure Sigma-Aldrich® St. Louis, USA L-Tryptophan- HCl Fluka AG Buchs, CH Lysin Fluka AG Buchs, CH Lysozym Fluka AG Buchs, CH Magnesiumchlorid (MgCl2) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4 * 7H2O)
Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe
MAHMA NONOate Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Manganchlorid-Tetrahydrat (MnCl2 * 4H2O)
Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe
Mangansulfat-Tetrahydrat (MnSO4 * 4H2O)
Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe
Methanol Rotipuran (99,9 %) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Methanol Lichrosolv (HPLC grade) Merck KGaA Darmstadt Milchpulver Fluka AG Buchs, CH Natrium fluorid (NaF) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Natriumacetat-Trihydrat Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Natriumcarbonat (Na2CO3) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Natriumchlorid (NaCl) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Natriumcitrat-Dihydrat (Na3Citrat * 2H2O)
Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Merck KGaA Darmstadt Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Natriumhydroxid (NaOH) (≥ 99 %) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Natriummolybdat-Dihydrat (Na2MoO4 * 2H2O)
Merck KGaA Darmstadt
Natrium-Pyrophosphat Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Natriumthiosulfat-Pentahydrat (Na2S2O3 * 5H2O)
Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe
Natriumvanadat (Na3VO4) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA NBT Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe NiCl2 * 6 H2O Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Nicotinsäure Fluka AG Buchs, CH N-Octylglucosid Roche Diagnostics GmbH Mannheim Nuklease-Mix GE Healthcare Chalfont St. Giles,
GB O-Phosphorsäure (reinst) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe p-Aminobenzoat AppliChem GmbH Darmstadt
166
Chemikalien/Lösungsmittel Hersteller Firmensitz Pharmalyte 3-10 GE Healthcare Chalfont St. Giles,
GB Phenylalanin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA PMSF Fluka AG Buchs, CH Prolin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Propylenglykol Fagron GmbH & Co. KG Barsbüttel Pro-Q Diamond Life Technologies GmbH Carlsbad, USA Pyridoxaminhydrochlorid Fluka AG Buchs, CH Riboflavin Fluka AG Buchs, CH Roti®-Nanoquant Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Salzsäure (HCl) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe SDS ultrapure (reinst) AppliChem GmbH Darmstadt Serin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Silbernitrat (AgNO3) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe TEMED Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Thiaminiumchlorid Fluka AG Buchs, CH Thioharnstoff (≥ 99 %) Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Threonin Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Trifluoressigsäure (TFA) (spectroscopy grade)
AppliChem GmbH Darmstadt
Tris Base (≥ 99.5 %) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe Tryptophan Sigma-Aldrich® St. Louis, USA Tween 20 Serva Electrophoresis GmbH Heidelberg Valin Fluka AG Buchs, CH Zinkchlorid (ZnCl2) Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe
Folgende Wasserqualitäten wurden verwendet:
- Reinstwasser aus Aufbereitungsanlage der Fa. Grünbeck: hier A. dest genannt
- destilliertes A. dest aus dem Wasserdestilliergerät der Fa. Marienfeld: hier A. bidest
oder MS-Wasser genannt
3.2 Methoden
3.2.1 Stammhaltung
Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme wurden in Glycerinkulturen bei
-70°C gelagert. Die Herstellung dieser erfolgte nach der Stammanzucht in einer 20 ml
LB-Schüttelkultur (180 rpm) bei 37°C im Wasserbad, die je nach Stamm mit den
entsprechenden Antibiotika zur Selektion versetzt war. Die Zugabe von 5 ml sterilem
3 Material und Methoden 167
Glycerols fand bei einer optischen Dichte von OD540nm = 0,5 statt. Die Kultur wurde
nachfolgend in Aliquots eingefroren.
3.2.2 Proteinextraktgewinnung
3.2.2.1 Zellkultivierung
Die Vorkultivierung erfolgte nach der Inokulation aus einer Glycerinkultur im
Wasserbad schüttelnd (180 rpm B. subtilis, 120 rpm S. aureus) bei 37°C in dem für den
Organismus entsprechenden Medium. Am darauffolgenden Tag wurde das
vorgewärmte Hauptkulturmedium (100 ml, 37°C) mit den Zellen aus der Vorkultur auf
eine optische Dichte (gemessen mit: Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences,
Uppsala, Schweden) von OD500nm = 0,1 beimpft. Während des Versuches wurde das
Wachstum der Zellen durch das Messen der optischen Dichte verfolgt.
Die auf Eis geernteten Zellen wurden sofort bei 8000 rpm und 4°C für 5-10 min
zentrifugiert (Heraeus Biofuge PrimoR Centrifuge, Thermo Scientific). Nach Verwerfen
des Überstandes, schlossen sich zwei Waschschritte an, bei denen die Zellen in 50 ml
kaltem T-NaF-Puffer gewaschen und anschließend durch Zentrifugation (8000 rpm,
4°C, 5-10 min) pelletiert und vom Überstand befreit wurden. Die Zellen wurden dann
bei -70°C bis zur Weiterverarbeitung kurzfristig gelagert.
T-NaF-Puffer: 0,1 M Tris (pH 7,5 mit HCl) 10 mM NaF (Phosphatase-Inhibitor)
Die Kultivierung erfolgte schüttelnd (180 rpm) im BMM bei 37°C im Wasserbad. Nach
der Entnahme der Kontrollprobe in der logarithmischen Wachstumsphase bei der
OD500nm = 0,5 wurde Ethanol der Kultur hinzugefügt, so dass eine Endkonzentration
Bacillus subtilis
Stressexperimente für WT und sigB-Mutante (ML6):
Ethanolstress (EK: 10 %) (WT und ML6):
168
von 10 % (v/v) EtOH im Medium vorlag. Weitere Probenentnahmen folgten zu den
Zeitpunkten 10, 20, 30 und 60 min nach Stressauslösung. Das Probenvolumen
umfasste jeweils 20 ml der Kultur.
Hitzestress (54°C) (WT und ML6):
Die Kultivierung erfolgte schüttelnd (180 rpm) im BMM bei 37°C im Wasserbad. Bei der
OD500nm = 0,5 wurde in der exponentiellen Wachstumsphase die Kontrollprobe
entnommen und nachfolgend die Kultur in ein Wasserbad mit der Temperatur von
54°C umgesetzt. Die Probenentnahme von jeweils 20 ml erfolgte 10, 20, 30 und 60 min
nach Temperaturwechsel.
Glukosehunger (ML6):
Die Kultivierung erfolgte schüttelnd (180 rpm) bei 37°C in BOC mit einer
Glukosesupplementierung von 0,05 % (w/v). Bei der OD500nm = 0,5 wurde in der
exponentiellen Wachstumsphase der Kultur eine Kontrollprobe entnommen. Weitere
Probenentnahmen erfolgten in der transienten Phase sowie 30 und 60 min nach
Eintritt in die stationäre Phase. Das Probenentnahmevolumen umfasste jeweils 20 ml
der Kultur.
33P-Phosphorsäuremarkierung:
Zur Detektion phosphorylierter Proteine von B. subtilis unter Kontroll- und
Ethanolstressbedingungen wurde eine radioaktive Markierung mit Phosphorsäure, die
das 33P-Isotop enthielt, durchgeführt. Dazu wurde B. subtilis bis zu einer OD500nm = 0,4
in BMM angezogen, das mit 0,15 mM KH2PO4 statt mit 0,6 mM supplementiert war.
Bei Erreichen dieser optischen Dichte wurden 60 µCi/ml 33P-Phosphorsäure (entspricht
22,2 MBq) der Kultur hinzugegeben. 10 min später wurde die Kontrollprobe (10 ml)
entnommen, sowie Ethanol (EK in der Kultur 10 % (v/v)) hinzugefügt. Nach 20 min
erfolgte eine weitere Probenentnahme (10 ml). Beide Proben wurden mit 1 ml Stopp-
Puffer versetzt. Die Zellen wurden in Falkonröhrchen bei 8000 rpm und 4°C pelletiert
und zweimal mit T-NaF-Puffer gewaschen. Die Lagerung der Zellpellets erfolgte bei
-20°C. Zellaufschluss, 2D-Gel-Herstellung und Pro-Q-Färbung wurde wie unten
beschrieben vorgenommen.
3 Material und Methoden 169
Nach erfolgreicher Pro-Q-Färbung wurden die Gele getrocknet (Geltrockner/
Thermostat, UNIQUIP) und auf einen Phosphoscreen (Molecular Dynamics) gelegt. Die
Expositionslänge erfolgte gemäß Einbaurate (diese wurde über eine
Szintillationsmessung bestimmt) und die Digitalisierung wurde nachfolgend mit dem
Storm 840 (Molecular Dynamics) vorgenommen.
Stopp-Puffer: 0,1 M Tris 0,1 % (w/v) Chloramphenicol 5 mM KH2PO4
Metabolische Markierung /15N-Standard als interne Referenz:
Der interne 15N-Proteinextrakt-Standard wurde von Jan Muntel (Inst. f. Mikrobiologie,
Universität Greifswald) zur Verfügung gestellt. Er wurde aus einer B. subtilis-Kultur
gewonnen, in der die Zellen in Minimalmedium, das mit 15N-Ammoniumsulfat und 15N-
L-Tryptophan (Cambridge Isotope Laboratories Inc., USA) supplementiert war,
kultiviert wurden. Die Zellernte erfolgte zu unterschiedlichen Zeitpunkten (in der
logarithmischen, transienten und stationären Phase), so dass möglichst ein Großteil
des Proteinkomplements der Zelle in der internen Referenz enthalten war
(Zellaufschluss siehe Abschnitt 3.2.2.2)
Der Standardproteinextrakt wurde dann vor der Auftrennung im 2D-Gel in gleichen
Teilen zu dem eigentlichen 14N-Proteinextrakt aus dem Ethanolstress-Experiment
(Kontrollzeitpunkt und Zeitpunkt 30 min nach Ethanolzugabe) hinzugegeben.
Weiter wurde wie unter Abschnitt 3.2.3.3 beschrieben verfahren.
Für die Anzucht eines biologischen Replikates (insgesamt wurden drei biologische
Replikate angefertigt) wurden jeweils 3 Kolben à 100 ml vortemperiertem Medium
(37°C) aus einer Vorkultur inokuliert. Dies garantierte, dass für die spätere Analyse
ausreichend Zellmaterial zur Verfügung stand. Die Probenentnahme erfolgte jeweils
Staphylococcus aureus
Kultivierung von S. aureus COL für die gelbasierten Phosphoproteomanalysen:
170
durch die Ernte des Inhalts eines Kolbens mittels Zentrifugation (8000 rpm, 4°C für 5-
10 min; Heraeus Biofuge PrimoR Centrifuge, Thermo Scientific).
Glukosehunger:
Die Anzucht erfolgte schüttelnd (120 rpm) im Wasserbad bei 37°C im chemisch
definierten Medium (CDM) mit einer Glukosesupplementierung von 0,05 %. Die Ernte
der Zellen wurde in der exponentiellen Wachstumsphase (OD500nm = 0,5), in der
transienten Phase und 180 min nach Eintritt in die stationäre Phase durchgeführt. Die
Zellen traten bei einer OD500nm von 0,9 in die stationäre Phase ein.
osmotischer Stress (durch Salzzugabe):
Bei einer OD500nm = 0,5 wurde NaCl zur Hauptkultur hinzugegeben, so dass im Medium
eine Endkonzentration von 8 % (w/v) vorlag. Die Probenentnahmen erfolgten vor der
Salzzugabe bei einer OD500nm = 0,5 sowie 15 und 45 min nach Stressinduzierung.
oxidativer Stress (durch Diamidzugabe):
Um oxidativen Stress auszulösen, wurde das Thiol-spezifische Oxidant Diamid bei einer
OD500nm = 0,5 in einer Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben. Die
Probenentnahme erfolgte wie unter dem Abschnitt Salzstress beschrieben.
nitrosativer Stress:
MAHMA NONOate [6-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-
1-hexanamine; Sigma-Aldrich®] wurde als NO-Donor in einer Endkonzentration von
500 µM verwendet, um den nitrosativen Stress auszulösen. Die Experimente erfolgten
gemäß Falko Hochgräfe und Mitarbeitern (Hochgräfe u. a., 2008). Die
Probenentnahme erfolgte wie unter dem Punkt Salzstress beschrieben.
Kultivierung von S. aureus COL für die gelfreien Phosphoproteomanalysen:
Für den gelfreien Ansatz wurden die S. aureus COL Zellen bis zu einer optischen Dichte
OD500nm = 1,5-2 in CDM bei 37°C schüttelnd (120 rpm) im Wasserbad kultiviert und
3 Material und Methoden 171
nachfolgend auf Eis geerntet (siehe oben). Die Zellen befanden sich bei der Ernte in der
späten logarithmischen, bzw. der transienten Wachstumsphase.
3.2.2.2 Zellaufschluss
Ultraschall (B. subtilis):
Der Aufschluss wurde in 400 µl T-P-VF Aufschlusspuffer mittels Ultraschall (B. Braun
Biotech International) durchgeführt. Eine Beschallung fand 3 x 1 min bei 50 W
(Impulsfrequenz: 0,6 s) statt. Während des Ultraschalls wurden die Proben auf Eis
gelagert und zwischen den Zyklen ebenso eine Minute auf Eis gekühlt. Die Zelltrümmer
wurden durch zwei Zentrifugationsschritte (2 x 30 min, 15000 rpm, 4°C; Heraeus
Biofuge PrimoR Centrifuge, Thermo Scientific) entfernt.
T-P-VF Aufschlusspuffer: 0,01 M Tris/Hcl pH 7,5 1 mM PMSF in EtOH 1 mM Na3VO4, pH 10 (Phosphatase- Inhibitor) 10 mM NaF (Phosphatase-Inhibitor) Ribolyser (S. aureus):
Gelbasierter Ansatz:
Das Zellpellet wurde in dem Aufschlusspuffer resuspendiert und in mit
Glasperlen gefüllte Stammhaltungsröhrchen überführt. Der Aufschluss erfolgte
mit dem Precellys 24 Homogenisator (PeqLab) (bei 6500 rpm für 6 x 10
Sekunden). Die Glasperlen (0,1 mm Durchmesser) wurden durch Zentrifugation
(15000 rpm, 15°C, 5 min) pelletiert und der Überstand durch zwei weitere
Zentrifugationsschritte (15000 rpm, 15°C, 30 min) von den Zelltrümmern
befreit.
Aufschlusspuffer: 8 M Harnstoff 2 M Thioharnstoff 10 mM NaF
172
Gelfreier Phosphopeptidanreicherungsansatz
3.2.3 Methoden zur Proteinanalyse
(angelehnt an Olsen & Macek, 2009):
Die Zellen wurden in 1 ml Lysis-Puffer aufgenommen und für 15 min bei 37°C
inkubiert.
Lysis-Puffer: 50 mM Tris/HCl 5 mg/ml Lysozym 5 mM der folgenden Phosphatase-Inhibitoren: NaF, 2-Gycerolphosphat, Natriumvanadat, Natrium-Pyrophosphat
Es folgte der Zellaufschluss mit dem Ribolyser (siehe oben). Bevor die
Glasperlen und Zelltrümmer abzentrifugiert wurden, fand zur Hydrolyse von
Nucleinsäurenketten ein Verdau der Suspension mit einem DNase und RNase
enthaltendem Nucleasemix (GE Healthcare) statt. Hierbei wurde nach den
Herstellerangaben verfahren. Des Weiteren wurde das Gemisch mit dem
Detergenz N-Octylglucosid versetzt (Endkonzentration: 1 % (w/v)). Die Zugabe
hatte das Herauslösen von integralen Membranproteinen zum Ziel. Es folgten
ein 5- und zwei 30-minütige Zentrifugationsschritte bei 15000 rpm (4°C).
Die erhaltenen Proteinextrakte wurden bei -70°C bis zur Weiterverarbeitung gelagert.
3.2.3.1 Proteinbestimmung nach Bradford
Die quantitative Bestimmung des Gesamtproteingehalts erfolgte gemäß der Bradford-
Methode. Diese wurde von der Amerikanerin Marion M. Bradford 1976 beschrieben
und beruht auf der Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffes
Coomassie Brilliant blue G-250, die durch die Komplexbindung mit Proteinen
hervorgerufen wird (Bradford, 1976).
Als Bradfordreagenz wurde Roti®-Nanoquant (Roth) eingesetzt und die Bestimmung
laut Herstellerangaben durchgeführt.
3 Material und Methoden 173
Für die Bestimmung des Proteingehalts in S. aureus-Extrakten, die 8 M Harnstoff/2 M
Thioharnstoff enthielten, wurde eine entsprechende BSA-Eichreihe zur Ermittlung des
Proteingehaltes eingesetzt.
3.2.3.2 Verdau des Proteinextraktes mit alkalischer Phosphatase
Für den Verdau mit alkalischer Phosphatase wurden 400 µg Proteinextrakt mit einer
Unit alkalischer Phosphatase von E. coli (Sigma-Aldrich®) für eine Stunde bei 37°C
inkubiert.
3.2.3.3 Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE)
Zur Auftrennung der Proteine mittels 2D-PAGE wurden für die erste Dimension
Proteinextrakt-Aliquots mit der für den Organismus entsprechenden
Rehydratisierungslösung versetzt. Je nach pH-Bereich des IPG-Streifens (Immobiline
Dry Strips, GE Healthcare) wurden 200 µg (für den pH-Bereich 4-7) oder 400 µg (für
den pH-Bereich 4,5-5,5) Proteinextrakt eingesetzt. Das Gemisch wurde mehrfach
geschwenkt, 2 x 30 min bei 12000 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert und in eine
Rehydratisierungsschale überführt. Der IPG-Streifen wurde mit der Gelseite nach
unten auf den in der Schale befindlichen Flüssigkeitsfilm luftblasenfrei gelegt, mit
DryStripFluid (GE Healthcare) überschichtet und die Schale mit Parafilm abgedichtet.
Die Rehydratisierung erfolgte abgedunkelt für 22 h bei konstanter Raumtemperatur.
Aufgrund der unterschiedlichen Aufschlusspuffer für B. subtilis (Basis=Trispuffer) und
S. aureus (Basis=Harnstoff/Thioharnstoff) mußten verschiedene Rehydratisierungs-
protokolle verwendet werden.
Rehydratisierung - B. subtilis: 8 M Harnstoff 2 M Thioharnstoff 1 % (w/v) CHAPS 0,5 % (v/v) Pharmalyte™ pH 3-10 für IEF 0,3 % (w/v) DTT lösen in A. bidest
174
Das eingesetzte Volumen des Proteinextraktes durfte 40 µl nicht überschreiten und
wurde gegebenenfalls durch Vakuumzentrifugation verkleinert. Der Proteinextrakt
wurde auf 400 µl mit Rehydratisierungslösung aufgefüllt.
Rehydratisierung - S. aureus:
Zu jeder einzelnen Proteinprobe (200 µg oder 400 µg Proteinextrakt) wurden 40 µl
10-fach-Konzentrat hinzugegeben und mit der Stammlösung auf ein
Rehydratisierungsvolumen von 400 µl aufgefüllt.
Stammlösung: 8 M Harnstoff 2 M Thioharnstoff 10-fach Konzentrat: 10 % (w/v) CHAPS 1 % (v/v) Pharmalyte™ pH 3-10 für IEF 3 % (w/v) DTT Die isoelektrische Fokussierung fand in einer MultiphorII-Kammer (Pharmacia Biotech,
Uppsala) bei 20°C statt. Folgendes Programm wurde gewählt:
Phase 1: Gradient 500 V 500 Vh 1 mA 5 W 2h Phase 2: Stufe 500 V 2500 Vh 1 mA 5 W 5h Phase 3: Gradient 3500V 10 kVh 1 mA 5 W 5h Phase 4: Stufe 3500 V 35 kVh 1 mA 5 W 10h
Nach erfolgter isoelektrischer Fokussierung wurden die Streifen, um Diffusionen zu
vermeiden, möglichst umgehend in die Prozedur der zweiten Dimension überführt
oder bei -20°C in Folie gelagert.
Für die Auftrennung in der zweiten Dimension wurden die nach ihrem isoelektrischen
Punkt separierten Proteine im IPG-Streifen mit DTT reduziert und mit Iodacetamid
alkyliert. Dazu wurde der Streifen jeweils 15 min in Äquilibrierungslösung A und B bei
Raumtemperatur geschwenkt.
3 Material und Methoden 175
Äquilibrierungslösung : 50 mM 0,5 M Tris-HCl pH 6,8
6 M Harnstoff 30 % (v/v) Glycerol 4 % (w/v) SDS A: + 0,35 % (w/v) DTT B: + 4,5 % (w/v) Iodacetamid + Spatelspitze Bromphenolblau
Anschließend wurde der Streifen auf das Sammelgel überführt und mit SDS-Laufpuffer
(1-fach konzentriert) überschichtet. Die Elektrophorese erfolgte in einer Apparatur von
Genomic Solutions in der 5-Gele (Gelgröße: ca. 20 x 20 cm Trenngel und ca. 5 x 20 cm
Sammelgel, mit einer Dicke von 0,8 mm) gleichzeitig vertikal in Laufpuffer stehen
konnten. Die elektrophoretische Trennung wurde über 18-20 h bei 12°C mit 1-2 W pro
Gel, 300 mA und 500 V durchgeführt, wobei der Fortgang der Elektrophorese durch die
mit Bromphenolblau angefärbte Lauffront erkennbar war. Bei Erreichen der unteren
Gelseite wurde der Lauf gestoppt. Die Gele wurden der Apparatur entnommen und für
die weitere Behandlung vorsichtig in saubere Färbeschalen überführt.
Trenngel (10 Gele) 12,5 %: 303,6 ml A. bidest 334,4 ml 40 % Acrylamid 187 ml 2 % Bisacrylamid 275 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 2,75 ml 10 % (w/v) APS 0,55 ml TEMED Sammelgel (10 Gele) 4 %: 61 ml A. bidest 9 ml 40 % Acrylamid 4,5 ml 2 % Bisacrylamid 25 ml 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 380 µl 10 % (w/v) APS 62,5 µl TEMED 10 x SDS-Laufpuffer: 250 mM Tris Base 1,92 M Glycin 1 % (w/v) SDS
176
3.2.3.4 Färbemethoden für Proteine im 2D-Gel
3.2.3.4.1 Phosphoproteinfärbung im 2D-Gel mit Pro-Q® Diamond
Die Färbung der phosphorylierten Proteine im 2D-Gel erfolgte mit dem Pro-Q®
Diamond Phosphoprotein Gel Stain (Molecular Probes®, life technologies™). Es wurde
darauf geachtet, dass die Färbeschalen nicht durch einen anderen Farbstoff, wie z. B.
Flamingo oder Colloidal Coomassie kontaminiert waren. Bei Bedarf wurde das Gel
immer nur an der gleichen Ecke, an der keine phosphorylierten Spots zu erwarten
waren, berührt.
Die Färbung erfolgte wie nachfolgend beschrieben:
Fixieren: 2 x 30 min in 500 ml Fixierlösung, schwenkend
Fixierlösung: 50 % (v/v) EtOH 12 % (v/v) Essigsäure ad A. dest
Waschen: 4 x 15 min mit 500 ml A. dest waschen (der 3. Waschschritt wurde
häufig auch über Nacht durchgeführt)
Färben: Die Färbung fand in 450 ml Färbelösung leicht schwenkend für 2,5 h
statt. Die Färbelösung wurde gemäß Agrawal und Thelen angesetzt,
indem eine dreifache Verdünnung des Farbstoffes vorgenommen wurde
(Agrawal & Thelen, 2005).
Färbelösung pro Gel: 300 ml A. dest 150 ml Pro-Q Diamond
Entfärben: Nach der Färbung wurde das Gel entfärbt, um die Hintergrundfärbung
zu minimieren. Dies fand in 500 ml Entfärbelösung für 3 x 30 min und 1 x
45 min statt. Zwischen den Schritten wurde der Entfärber getauscht.
Entfärbelösung: 20 % (v/v) Propylenglykol 5 % (w/v) Natriumacetat pH 4,0 ad A. dest
3 Material und Methoden 177
Waschen: 2 x 10 min in 500 ml A. dest Scannen: Molecular Imager FX (Bio-Rad Laboratories, Inc.) Excitations Quelle: 532 nm Laser Emissions Filter: 555 nm longpass
3.2.3.4.2 Gesamtproteinfärbung im 2D-Gel mit Flamingo™
Die Gesamtproteinfärbung mit dem fluoreszierenden Farbstoff Flamingo™ Fluorescent
Gel Stain (Bio-Rad) wurde wie nachfolgend beschrieben durchgeführt.
Fixieren: 40 % (v/v) EtOH 10 % (v/v) Essigsäure 500 ml pro Gel mindestens 1h Färben: Flamingo 1:10 mit A. dest verdünnt 200 ml pro Gel mindestens 3 h, besser über Nacht Scannen: Typhoon Scanner 9400 (GE Healthcare) 532 nm (Excitation) 610 nm BP 30 oder 560 nm LP (Emission)
Die Gele wurden in der Färbelösung gelagert, erneut gefärbt oder eingeschweißt bei
4°C gelagert.
3.2.3.4.3 Gesamtproteinfärbung im 2D-Gel mit Deep Purple™
Die Gesamtproteinfärbung mit dem fluoreszierenden Farbstoff Deep Purple™ total
protein stain (GE Healthcare) wurde wie nachfolgend beschrieben durchgeführt:
Fixieren: 7,5 % (v/v) Essigsäure 10 % (v/v) Ethanol 1 l pro Gel, mindestens 1 h, besser über Nacht
178
Waschen: 300 mM Na2CO3 35 mM NaHCO3 pH 10-11, 1 l pro Gel 30 min Färben: Deep purple 1:200 mit A. dest verdünnt für 1h Stabilisieren: 7,5 % (v/v) Essigsäure 1 l pro Gel 2 x 15 min Scannen: Typhoon 9400 Scanner 532 nm (Excitation) 610 nm BP 30 oder 560 nm LP (Emission)
3.2.3.4.4 Colloidal Coomassie/ Coomassie "blue silver"
Eine Colloidal Coomassie Färbung (Neuhoff u. a., 1988) oder die Coomassie "blue
silver" Färbung (Candiano u. a., 2004) wurde durchgeführt, wenn Proteine aus dem
2D-Gel ausgeschnitten und massenspektrometrisch identifiziert werden sollten. Die
blaue Färbung der Proteinspots diente hierbei als Orientierungshilfe, um im Vergleich
zu einem Zweikanalfarbenbild (Coomassie vs. Pro-Q), die Lokalisierung der
phosphorylierten Spots auszumachen. Häufig wurde die Färbung im Anschluss an die
Flamingo-Färbung ohne einen zusätzlichen Fixierungsschritt durchgeführt. Die Färbung
erfolgte für mindestens 2 h (Coomassie "blue silver") oder über Nacht (Colloidal
Coomassie). Die Entfärbung des Hintergrundes wurde durch mehrmaliges Waschen mit
A. dest realisiert.
Colloidal Coomassie-Färbung:
Die Colloidal Coomassie Färbelösung wurde kurz vor der Färbung aus dem CCD-stock
und Methanol angesetzt. Pro Gel wurden 250 ml Färbelösung eingesetzt.
Coomassie Brillant Blue stock (CBB-stock):
5 % (w/v) Coomassie-Brillant Blue G-250
3 Material und Methoden 179
Colloidal Coomassie dye stock (CCD-stock):
50 g Ammoniumsulfat + 6 ml 85 % Phosphorsäure
ad 490 ml A. dest + 10 ml CBB stock
Colloidal Coomassie Lösung:
200 ml CCD stock + 50 ml Methanol
Coomassie "blue silver"-Färbung:
1l Färbelösung: 100 ml A. dest 100 ml O-Phosphorsäure 100 g Ammoniumsulfat ad 800 ml mit A. dest + 1,2 g Coomassie G-250 ÜN rühren kurz vor Anwendung: + 200 ml MetOH
Nach der Entfärbung des Hintergrundes mit A. dest wurde die Digitalisierung mit dem
Lichtscanner "x-finity ultra 1600" der Firma Quatographic (Braunschweig)
vorgenommen.
3.2.3.4.5 Gesamtproteinfärbung im 2D-Gel mit Silbernitrat
Vorgegangen wurde nach der von Blum et al. (1987) beschriebenen Methode. Alle
nachfolgend beschriebenen Schritte wurden bei RT in Färbeschalen mit 200 ml
Lösungsvolumen auf einem Gelschüttler durchgeführt.
Fixieren: 50 % (v/v) Ethanol 12 % (v/v) Essigsäure 0,05 % (v/v) Formaldehyd mindestens 1 h
Waschen: 2 x 20 min mit 50 % (v/v) Ethanol
180
Sensitivieren: 1 min in 0,2 g/l Na2S2O3* 5 H2O Waschen: 3 x 20 s mit A. dest
Färben: 2 g/l AgNO3 750 µl/l 37 % Formaldehyd 20 min
Waschen: 2 x 20 s in A. dest Entwickeln: 30 g/l KCO3 4 mg/l Na2S2O3 * 5 H2O 0,5 ml/l 37 % Formaldehyd 4-5 min, je nach Bedarf Stoppen: 30 s mit 1 % (w/v) Glycin Waschen: 30 s mit A. dest Stoppen: 10-30 min mit 1 % (w/v) Glycin Waschen: 30 s mit A. dest
Nach dieser Prozedur konnte das Gel eingescannt (digitalisiert), in Folie aufbewahrt
oder im Fall von radioaktiven Gelen getrocknet werden.
3.2.3.5 2D-Gel Westernblot mit Phospo-Tyrosin-Antikörper (P-Tyr-100)
Die 2D-Gelelektrophorese wurde wie unter Abschnitt 3.2.3.3 beschrieben
durchgeführt. Der Transfer der Proteine vom 2D-Gel auf eine Membran wurde mit
einer Semi-Dry Apparatur (Amersham Biosciences) durchgeführt, in der Gele von der
Größe 23 x 26 cm eingelegt werden konnten. Zu Beginn wurde die PVDF-Membran
(Roth) für 1 min in 60 % (v/v) Methanol aktiviert und in die Blotapparatur auf das 2D-
Gel überführt. Das Blotten fand in Transferpuffer für 3 h bei 250 mA statt.
Transferpuffer: 25 mM Tris Base 0,2 M Glycin 20 % (v/v) Methanol pH 8,5
3 Material und Methoden 181
Zur Detektion der am Tyrosin phosphorylierten Proteine auf der Membran wurde
folgendes Antikörper-basiertes Protokoll durchgeführt:
Waschen der Membran: 1 x 5 min mit 100 ml 1x TBS bei RT 10 x TBS: 60 g Tris 90 g NaCl ad 1 l A. dest., pH 7,6 Blocking: 1 x 1 h mit 100 ml Blocking-Puffer Blocking-Puffer: 0,1 % (v/v) Tween 20 5 % (w/v) Magermilchpulver in 1 x TBS Waschen der Membran: 3 x 5 min mit 100 ml TBS/T bei RT TBS/T: 0,1 % (v/v) Tween 20 in 1x TBS primärer Antikörper: 120 ml Verdünnungspuffer + 60 µl P-Tyr100 Antikörper ÜN, schüttelnd bei 4°C Verdünnungspuffer: 0,1 % (v/v) Tween 20 5 % (w/v) BSA in 1 x TBS Waschen: 2 x 7,5 min mit 100 ml TBS/T Blocking: 1 x 30 min mit 100 ml Blocking-Puffer sekundärer Antikörper: 2 h Inkubation mit sekundärem Antikörper (Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate, Bio-Rad) (60 µl Antikörper in 120 ml Blocking-Puffer) Waschen: 3 x min A. dest die Membran spülen Äquilibrieren: 1 x mit AP-Puffer äquilibrieren AP-Puffer: 100 mM Tris-HCl, pH 9,5 100 mM NaCl 5 mM MgCl2
182
Detektieren: 800 µl NBT + 400µl BCIP in 120 ml AP-Puffer
Nach Ausbildung des Farbkomplexes wurde die Reaktion
durch waschen in A. dest gestoppt.
NBT-Stammlösung: 5 % (w/v) in 70 % (v/v)
Dimethylformamid
BCIP-Stammlösung: 5 % (w/v) in 100 % Dimethylformamid Die Digitalisierung erfolgte mithilfe des Lichtscanners "x-finity ultra 1600" der Firma
Quatographic (Braunschweig).
3.2.3.6 Bildananalyse der gefärbten 2D-Gele
Die digitalisierte Bildanalyse wurde jeweils mit der aktuellen Version der Delta2D
Software von Decodon GmbH (Greifswald) durchgeführt.
3.2.4 Anreicherung von Proteinkinasen mittels eukaryotischen Kinaseinhibitoren
Die Anreicherung bakterieller Proteinkinasen mittels eukaryotischer Kinaseinhibitoren
wurde in Kooperation mit Prof. Dr. Lothar Jänsch und Dr. Josef Wissing (Mikrobielle
Krankheitserreger/Zelluläre Proteomforschung, HZI Braunschweig) am HZI in
Braunschweig durchgeführt. Sie wurde gemäß Wissing und Kollegen an einem
Proteinextrakt von B. subtilis vorgenommen (Wissing u. a., 2007). Das Protokoll wurde
dahingehend geändert, dass zwei getrennte Anreicherungsschritte durchgeführt
wurden. Der erste Anreicherungsschritt erfolgte in einem "Batchansatz", in dem der
Proteinextrakt mit dem an Sepharose gekoppelten Inhibitor PP58 im Falkongefäß
inkubiert wurde. Der Überstand aus diesem Ansatz wurde in dem zweiten
Anreicherungsschritt zugeführt. Dieser bestand aus einer chromatographischen
Auftrennung mithilfe des Äkta-Explorers 900 (Pharmacia Biotech/GE Healthcare,
Uppsala, Schweden) unter Verwendung von drei hintereinandergeschalteten Säulen,
die jeweils einen an Sepharose gekoppelten Inhibitor enthielten. Die Reihenfolge
entsprach den Inhibitoren BisX (BisindolylmaleimideX) --> AX14596 --> PurB
3 Material und Methoden 183
(Purvalanol B). Die Elutionen der putativen Proteinkinasen erfolgten für beide
Anreicherungsansätze getrennt. Die Eluate wurden massenspektrometrisch am FT-ICR-
MS/MS (Thermo Scientific) am Inst. für Mikrobiologie der Universität Greifswald
analysiert (siehe unter Absatz 3.2.6.1).
3.2.5 Phosphopeptidanreicherung
Zur Analyse des Phosphoproteoms von S. aureus wurde die gelfreie
Phosphopeptidanreicherung gemäß Olsen und Macek 2009 durchgeführt, die im
Rahmen eines Besuches bei Prof. Boris Macek am Proteome Center der Universität
Tübingen erlernt und geringfügig modifiziert wurde.
Für jeweils einen Versuch wurden 50 mg Proteinrohextrakt (siehe Abschnitt 3.2.2.2
gelfreier Aufschluss) eingesetzt. Um einen Pufferwechsel zu ermöglichen wurde eine
Acetonfällung durchgeführt. Hierbei erfolgte die Fällung bei -70°C in einem fünffachen
Acetonüberschuss über Nacht. Am nächsten Tag wurden die präzipitierten Proteine
per Zentrifugation pelletiert und zweimal mit Aceton gewaschen (30 min, 8000 rpm,
4°C). Das restliche Aceton wurde durch Lufttrocknung entfernt.
Für den Verdau wurde das Proteinpellet in 100-200 µl Denaturierungspuffer
resuspendiert und eine Reduzierung der Disulfidbrücken mit DTT und die Alkylierung
der entstandenen Sulfhydrylgruppen mit Iodacetamid vorgenommen.
Denaturierungspuffer: 6 M Harnstoff 2 M Thioharnstoff in 10 mM Tris/ HCl pH 8,0 Reduktionspuffer: 1 M DTT in 50 mM Ammoniumbicarbonat (Stammlösung) Endkonzentration in der Verdaulösung 1mM 1 h bei RT schütteln Alkylierungspuffer: 550 mM Iodacetamid in 50 mM Ammoniumbicarbonat (Stammlösung)
184
Endkonzentration in der Verdaulösung 5,5 mM 1 h bei RT abgedeckt schütteln Nach dem Überprüfen des pH-Wertes, der sich bei pH 8,0 befinden sollte und
gegebenenfalls nötiger Adjustierung, wurde dem Proteinextrakt die
Lysylendopeptidase LysC (Wako) in einer Endkonzentration von 1 µg Enzym zu 500 µg
Protein zugesetzt. Es folgte ein Inkubationsschritt von 6-8 h bei Raumtemperatur. Nach
diesem Vorverdau wurde das Protein/Peptidgemisch mit der vierfachen Menge an
A. bidest verdünnt und der pH-Wert auf pH 8,0 eingestellt. Ein weiterer Verdauschritt
folgte, in dem über Nacht das Gemisch mit der Proteinase Trypsin (Promega) in einem
1:100 Verhältnis bei 37°C inkubiert wurde.
3.2.5.1 Kationenaustauschchromatographie (SCX-Chromatographie)
Zur Vorfraktionierung des aus dem Verdau hervorgegangenen Peptidgemisches wurde
eine Kationenaustauschchromatographie mit dem Äkta-Explorer 900 (Pharmacia
Biotech/GE Healthcare, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Die chromatographische
Trennung fand mittels einer 1 ml Resource S Säule (GE Healthcare) statt. Vor der
chromatographischen Auftrennung wurde das Peptidgemisch auf ein Volumen von
45 ml mit A. bidest (MS-Wasser) verdünnt und der pH auf 2,7 mit TFA adjustiert.
Eventuell entstehende Präzipitate wurden mittels Zentrifugation (8500 rpm, 20 min,
22°C) entfernt.
Die Probe wurde mithilfe eines Probengefäßes und einem Fluss von 1 ml/min auf die
Säule geladen. Eine Trennung der Peptide erfolgte aufgrund eines binären Gradienten
aus Eluent A und B (0 % - 30 % Eluent B) über einen Zeitraum von 30 min mit einem
Fluss von 1 ml/min. Die Chromatographie wurde durch UV-Detektion bei 214 nm
dokumentiert. Es wurden während des Ladevorgangs, des Gradienten und des
darauffolgenden Waschschritts bei 100 % Eluent B Fraktionen (jeweils 1,5 ml)
gesammelt und bis zur weiteren Verarbeitung bei - 70°C gelagert.
Eluent A: 5 mM Kaliumdihydrogenphosphat 30 % (v/v) ACN pH 2,7 (mit TFA adjustieren)
3 Material und Methoden 185
Eluent B: 5 mM Kaliumdihydrogenphosphat 30 % (v/v) ACN 350 mM Kaliumchlorid pH 2,7 (mit TFA adjustieren)
3.2.5.2 TiO2-Phosphopeptidanreicherung
Aufgrund des UV-Spektrums aus der durchgeführten Kationen-
austauschchromatographie wurde der Peptidgehalt jeder Fraktion bewertet und
danach diejenigen Fraktionen mit einem niedrigen Peptidgehalt vereinigt ("gepoolt").
Die Anreicherung über die Titandioxidbeads (5 mg; Titansphere, GL-Sciences) erfolgte
für jede Fraktion oder gepoolte Fraktion separat. Bevor die Beads eingesetzt werden
konnten, musste deren Äquilibrierung mit DHB (EK: 30 mg/ml in 80 % (v/v) ACN,
50 µl/5 mg Beads) über einen Zeitraum von 10 min schüttelnd bei RT unter
Lichtausschluss erfolgen. Die Beadsuspension wurde anschließend zu den Fraktionen
hinzugegeben und das Gemisch für 1 h bei RT auf einem Überkopfschüttler unter
Lichtausschluss inkubiert.
Anschließend wurde der Überstand nach einem zweiminütigem Zentrifugationsschritt
(10000 rpm, RT; Heraeus Biofuge Pico, Thermo Scientific) entfernt. Die Beads wurden
zweimal mit Waschlösung I und einmal mit Waschlösung II für jeweils zehn Minuten
gewaschen (Rotation auf Überkopfschüttler) und der Überstand nach dem
Zentrifugieren (2 min, 10000 rpm) entfernt. Die Beads wurden in 50 µl Waschlösung 2
aufgenommen und in vorbereitete C8-Stage-Tips (Rappsilber u. a., 2007) überführt. Die
Elution erfolgte 3 x mit 100 µl Elutionslösung aus 40 % (v/v) NH4OH (aq 25 % NH3 Fluka;
EK NH3 = 10 %) und 60 % (v/v) ACN (pH >10) durch Zentrifugation für 3 min bei 5000
rpm. Die Eluate wurden vereinigt und das Flüssigkeitsvolumen durch
Vakuumzentrifugation auf 5 µl reduziert. Das Eluat wurde mit A*-Lösung angesäuert
und sofort massenspektrometrisch analysiert.
Äquilibrierungslösung: 30 mg/ml DHB 80 % (v/v) ACN in MS-Wasser
186
Waschlösung 1: 30 % (v/v) ACN 3 % (v/v) TFA in MS-Wasser Waschlösung 2: 80 % (v/v) ACN 0,1 % (v/v) TFA in MS-Wasser Elutionslösung: 40 % (v/v) NH4OH (aq 25 % NH3) 60 % (v/v) ACN pH > 10,5 A*-Lösung: 3 % (v/v) ACN 0,5 % (v/v) TFA in MS-Wasser
3.2.5.3 TiO2-Anreicherung: Peptide mit Argininphosphorylierungen
Die Anreicherung von den am Arginin phosphorylierten Peptiden wurde gemäß der
oben beschriebenen Phosphopeptidanreicherungsprozedur durchgeführt. Folgende
Modifikationen wurden im Hinblick auf die Instabilität der Phosphoamidate eingeführt:
Die SCX-Chromatographie wurde nicht durchgeführt. Anstelle dessen wurden die
Titandioxidanreicherung mehrfach wiederholt und die Eluate vereinigt. Dabei wurde
jeweils der Beladungsüberstand erneut mit Titandioxid inkubiert.
Es wurde darauf geachtet, dass die Schritte im Protokoll, die eine saure Hydrolyse der
Phosphoamidate begünstigen, möglichst kurz und bei Raumtemperatur durchgeführt
wurden. Ebenso wurde nach der Elution und Volumenreduzierung die
massenspektrometrische Analyse sofort angeschlossen, wobei auf eine Vorsäule und
die Temperierung der Trennsäule verzichtet wurde (siehe auch Abschnitt 2.4).
3 Material und Methoden 187
3.2.6 Massenspektrometrische Analyse der Phosphoproteine
Die phosphorylierten Peptide aus den gelfreien Anreicherungsansätzen wurden sofort
der massenspektrometrischen Analyse zugeführt werden. Bei den phosphorylierten
Proteinen aus dem 1D- oder 2D-Gel bedurfte es nachfolgender Prozedur:
Die gewünschten Proteinspots/-banden wurden aus dem 2D-Gel/1D-Gel manuell
mithilfe einer abgeschnittenen Pipettenspitze oder einem Skalpell ausgeschnitten und
in ein speziell beschichtetes Reaktionsgefäß ("low binding polymer", Safe Seal
Microcentrifuge Tube; Sorenson BioScience Inc. USA) überführt. In diesen wurden die
Gelstückchen mit 200 µl Gelwaschlösung für 2 x 30 min schüttelnd gewaschen.
Gelwaschlösung: 0,2 M NH4HCO3 30 % (v/v) Acetonitril in A. bidest Der Überstand wurde abgenommen und die Gelstückchen in der Vakuumzentrifuge
(Concentrator 5301, Eppendorf) getrocknet. Es folgte die Inkubation der Gelstückchen
in Trypsinlösung (2 ng/µl) (alternativ GluC-Lösung, 2 ng/µl) bis deren Quellvorgang
abgeschlossen war. Der Überstand wurde abgenommen und die Gelstückchen bei 37°C
über Nacht inkubiert. Die Peptide wurden in einem entsprechenden Volumen A. dest
mittels Ultraschall (15 min) aus dem Gelstückchen extrahiert und der
massenspektrometrischen Analyse zugeführt.
3.2.6.1 nanoHPLC-ESI-LTQ-FT-ICR-MS
Die LC-MS/MS Analyse wurde mit einem LTQ-FT-ICR Massenspektometers (Thermo
Scientific) in Verbindung mit einem Ettan MDLC System (GE Healthcare) durchgeführt.
Die Peptide wurde auf eine C18-Vorsäule (nano-Precolumn™, PepMap™, C18, 300 μm
Innendurchmesser × 5 mm, Dionex LC Packings) geladen und für 15 min mit Eluent A
(0,05 % (v/v) Essigsäure) gewaschen. Die Separierung und Elution erfolgte auf bzw. von
einer analytischen Säule (PepMap, C18, 75-μm Innendurchmesser × 15 cm, Dionex LC
Packings) mithilfe eines binären Gradienten aus Eluent A und B (90 % (v/v) Acetonitril,
188
0,05 % (v/v) Essigsäure) bei einem Fluss von 250 nl/min über eine Zeitspanne von 60
min (2D-Gelspot) oder 80 min (Kinaseanreicherung).
Das LTQ-FT-ICR Massenspektrometer arbeitete im Daten-abhängigen Modus, indem
der FT-Übersichtsscan über einen Massenbereich von m/z 300-2000 aufgenommen
wurde und die drei abundantesten Vorläuferionen einer Fragmentierung im LTQ-
Instrument unterzogen wurden. In der Zwischenzeit wurde die Masse der
Vorläuferionen in der ICR-Zelle mit hoher Massengenauigkeit bestimmt (Wolff u. a.,
2006).
Für die Auswertung der massenspektrometrischen Daten wurde mithilfe des Sequest
Algorithmus (Version 27.12, Thermo Scientific) eine Datenbanksuche gegen eine aus
SubtiList (genolist.pasteur.fr/SubtiList/) extrahierte B. subtilis 168-Datenbank
durchgeführt. Als Suchparameter wurde eine Massenabweichung für Vorläufer- und
Fragmentionen bis einschließlich 0,01 Da toleriert. Eine ausgelassene
Enzymschnittstelle wurde erlaubt. Als variable Modifikationen wurden
Methioninoxidation (15,99 Da), Carbamidomethylierung des Cysteins (57,02 Da) und
STY-Phosphorylierungen (79,97 Da) berücksichtigt. Die Suchergebnisse wurden mithilfe
der BioWorks 3.2 Software (Thermo Scientific) gefiltert. Folgende Filterparameter
wurden genutzt (angelehnt an (Wolff u. a., 2006)):
• "peptide sequence length: 7-30 amino acids"
• "RSp ≤ 4"
• "Xcorr versus charge state: 1,9 for z=1; 2,2 for z=2; 3,75 for z=3"
Das Spektrum des phosphorylierten Peptids von RsbRB (YkoB) wurde manuell validiert
(b- und y-Ionen mußten die Phosphorylierungsstelle bestätigen) und ist im Anhang
aufgeführt.
3.2.6.2 nanoHPLC-ESI-Qtrap-MS
Die Identifikation der Phosphorylierungsstelle des Anti-Anti-Sigmafaktors RsbV erfolgte
an der Q-Trap4000 (Applied Biosystems MDS Sciex) einem "Linear Ion Trap Quadrupole
MS/MS Massenspektrometer" in Verbindung mit einem Dionex HPLC-Systems (Dionex
LC Packings). Jan Pané-Farré (Inst. f. Mikrobiologie, Universität Greifswald) lieferte das
3 Material und Methoden 189
überexprimierte und phosphorylierte RsbV Protein im 1D-Gel aufgetrennt. Aus diesem
wurde die entsprechende Bande ausgeschnitten und wie unter Abschnitt 3.2.6
beschrieben trypsiniert. Das Eluat wurde der massenspektrometrischen Analyse
zugeführt.
Die RsbV-Peptide wurden auf einer Vorsäule (nano Precolumn, PepMap, C18, 300 μm
Innendurchmesser, 5 mm Länge; Dionex LC Packings) geladen und mit Eluent A
gewaschen. Die Separierung erfolgte über eine analytische Trennsäule (PepMap, C18,
75 μm Innendurchmesser, 15 cm Länge; Dionex LC Packings) bei einem Fluss von
200 nl/min mit einem binären Gradienten über 80 min aus Eluent A und B.
Eluent A: 0,1 % (v/v) Essigsäure 99,9 % (v/v) A. bidest Eluent B: 90 % (v/v) Acetonitril 0,1 % (v/v) Essigsäure 9,9 % (v/v) A. bidest Über ein T-Stück im MicroonSprayHead II der NanoSpray II Quelle der Q-Trap4000
wurde ein Zusatzlösungsmittel zugeführt, um die Ionisierung und die Sprayqualität zu
verbessern.
Zusatzlösungsmittel: 80 % (v/v) Isopropanol 10 % (v/v) Acetonitril 0,1 % (v/v) Essigsäure 9,1 % (v/v) A. bidest Der zusätzliche Lösungsmittelfluss von 100 nl/min wurde mit einer 11Plus Harvard
Apparatus Spritzenpumpe hergestellt.
Es wurde eine datenabhängige Messmethode durchgeführt, bei der ein
Vorläuferionenscan für m/z 79 (PO3−) im negativem Ionenmodus bei Detektion des
Vorläuferions einen Scan mit erhöhter Auflösung (enhanced resolution scan) sowie im
Positivionenmodus durchgeführte MS/MS auslöste.
190
wichtige Parameter/"IDA Properties": First Criteria: Intense peaks from 1 to 2 Ions greater than: 300.000 m/z Ions smaller than: 1500.000 m/z Charge state from 1 to 4 Unknowns included. Rolling collision energy: Yes Exclude former target ions: for 90.000 seconds Mass Tolerance: 1000.000 mDa Exclude isotopes within 4.0 Da window Use Enhanced Resolution scan to confirm Charge State and\or Isotope Pattern selection: Yes Exclude 1+ precursors from Enhanced Resolution Scan confirmation and MS/MS: No Dynamic Background Subtraction: No
Scan Type: Precursor Ion (Prec) Polarity: Negative Scan Mode: Peak Hopping Precursor Of: 79.00 Da Resolution Q1: Low Resolution Q3: Unit Intensity Thres.: 0.00 cps Step Size: 1.00 Da Start (Da) Stop (Da) Time (sec) Param Start Stop 400.00 1500.00 3.00 CE -60.00 -120.00
Scan Type: Enhanced Resolution (ER) Scan Mode: Profile # Scans to Sum: 2 Resolution Q1: Open Scan Rate: 250 Da/s Intensity Thres.: 0.00 cps Center/Width: Yes LIT fill time: 20.00 msec Dynamic Fill Time: On
3 Material und Methoden 191
TIC Target EMS Scan: 2.00 x1e7 cps. TIC Target ER Scan: 0.30 x1e7 cps. TIC Target EPI Scan: 10.00 x1e7 cps. Max Fill EMS Scan: 75 msec Max Fill ER Scan: 150 msec Max Fill EPI Scan: 300 msec Min Fill EMS Scan: 2 msec Min Fill ER Scan: 2 msec Min Fill EPI Scan: 2 msec
Scan Type: Enhanced Product Ion (EPI) Polarity: Positive Scan Mode: Profile Ion Source: Nanospray # Scans to Sum: 2 Resolution Q1: Low Scan Rate: 4000 Da/s Intensity Thres.: 0.00 cps
Die Daten wurden manuell mithilfe der Analyst® 1.4.1 und BioAnalyst™ Software (AB
Sciex) für die Q-Trap 4000 ausgewertet.
3.2.6.3 nanoHPLC-ESI-LTQ-OrbitrapXL-MS
Die LC-MS/MS-Analyse putativ phosphorylierter 2D-Gelspots sowie der gelfreien
Phosphopeptidanreicherungsfraktionen von S. aureus wurden mit dem LTQ Orbitrap
XL™ Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) in Verbindung
mit einem nanoACQUITY UPLC System (Waters, Milford, MA) durchgeführt. Die
Konzentrierung und Entsalzung der Peptide (nur für die gelbasierten Peptide
angewendet, nicht aber für die Peptide aus dem gelfreien Ansatz) wurde über eine
Vorsäule (Symmetry® C18, 5 µm, 180µm Innendurchmesser x 20mm, Waters, Milford,
MA) vorgenommen und die Elution erfolgte über eine analytische C18-Trennsäule
(BEH130 C18, 1,7 µm, 100 µm Innendurchmesser x 100mm, Waters) mit einem binären
45 min-Gradienten (80 oder 90 min-Gradient für die gelfreien Proben) aus Eluent A
und B mit einer Flussrate von 400 nl/min.
192
Eluent A: 99,9 % A . bidest 0,1 % (v/v) Essigsäure Eluent B: 99,9 % (v/v) Acetonitril 0,1 % (v/v) Essigsäure
Die massenspektrometrische Analyse erfolgte mit einer datenabhängigen MS/MS-
Methode. Der Übersichtsscan wurde im Orbitrap Analysator bei einer Auflösung von
R=60000 aufgezeichnet. Für die fünf intensivsten Vorläuferionen wurde eine
kollissionsinduzierte Fragmentierung (CID) in der LTQ vorgenommen und mit dem LTQ-
Analysator aufgezeichnet. Zur "realtime"-Kalibrierung wurde die "lockmass"-Option für
die Masse 445.120025 ausgewählt (Graumann u. a., 2008). Nur Ionen mit einem
Ladungszustand von 2 und höher wurden berücksichtigt.
Es wurde die Möglichkeit der "Multistage"-Aktivierung für den putativen
Neutralverlust von -97,98, -48,99, -36,66 und -24,49 Thompson aktiviert. In der
Analyse der Peptide aus einem 2D-Gelspot wurde bei Bedarf in die Methode eine
"parent mass list" implementiert, die alle Massen der theoretisch vorkommenden
Phosphopeptide des betreffenden Proteins enthielt.
wichtige Parameter:
ITMS: Activation Type: CID Min. Signal Required: 1000 Isolation width: 2 Normalized Coll. Energy: 35 Activation Q: 0,250 Activation time: 30 ms
Datenanalyse:
Gelbasiert:
Die massenspektrometrischen Daten wurden anhand einer Datenbanksuche
ausgewertet. Dabei wurden alle MS/MS-Spektren im .dta Format in einer Target-Decoy
3 Material und Methoden 193
Datenbank von S. aureus COL (5236 Einträge) mithilfe des Sorcerer™-SEQUEST®
(ThermoFinnigan, San Jose, CA; version v.27, rev. 11) in Verbindung mit Scaffold2
(Version Scaffold_2_02_03, Proteome Software Inc., Portland, OR) gesucht. Die
Datenbank wurde aus der öffentlichen "NCBI bacteria genomes" (National Center for
Biotechnology Information) extrahiert und mit allgemeinen Kontaminationen
versehen. Die mit dem BioworksBrowser 3.2 EF2 (Elias & Gygi, 2007) erstellten
"reversen" Sequenzen der Datenbankeinträge wurden der Datenbank hinzugefügt.
Folgende Parameter wurden in die Suche miteinbezogen: Die Massentoleranz
bezüglich der Vorläuferionen betrug 10 ppm und die der Fragmentionen 1 Da. Zwei
übersprungene Enzymschnittstellen wurden erlaubt. Methioninoxidation (+15.99 Da)
und Cystein-Carbamidomethylierung (+57.02 Da) sowie Phosphorylierungen (+79.97
Da) am Serin, Threonin oder Tyrosin wurde als variable Modifikationen eingesetzt. Für
die Proteinidentifikation wurden mindestens zwei Peptide vorausgesetzt sowie ein
"Probability Score" von mindestens 99,9 %, der durch den "Protein Prophet
Algorithmus" zugewiesen wurde (Nesvizhskii u. a., 2003). Für die phosphorylierten
Peptide wurde ein "Peptide Probability Score" gemäß dem "Peptide Prophet
Algorithmus" von größer als 95 % vorausgesetzt (Keller u. a., 2002). Des Weiteren
wurden folgende Kriterien eingehalten:
• Mindestanzahl von Aminosäuren im Peptid = 6
• b- und y-Ionen bestätigen die Phosphorylierungsstelle
Die Spektren der phosphorylierten Peptide wurden manuell validiert und sind im
Anhang aufgeführt.
Gelfrei:
Die massenspektrometrischen Daten aus den gelfreien Experimenten wurden mit der
MaxQuant Software (Version 1.1.1.14, Max Plank Institute of Biochemistry,
Martinsried) prozessiert. Die Peaklisten wurden mit der in MaxQuant implementierten
Suchmaschine Andromeda gegen eine aus der NCBI-Datenbank (National Center for
Biotechnology Information) extrahierten S. aureus COL-Datenbank (2618 Einträge)
gesucht. Die Möglichkeit der Randomisierung sowie das Hinzufügen von
Kontaminanten wurden ausgewählt.
194
Folgende Parameter wurden angesetzt:
• zwei ausgelassene Enzymschnittstellen wurden erlaubt
• Carbamidomethylierung am Cystein wurde als fixierte Modifikation ausgewählt
• Oxidierung von Methionin und Phosphorylierungen an Serin, Threonin und Tyrosin wurden als variable Modifikationen angegeben
• die Massenabweichung der Vorläuferionen durfte höchstens 6 ppm betragen, für die Fragmentionen 0,5 Da
Für die Phosphopeptidvalidierung wurde ebenfalls die MaxQuant-Software benutzt.
Die Peptide mussten mindestens aus 6 Aminosäuren bestehen. Die Falschpositivenrate
wurde auf Protein- und Peptidlevel auf 1 % beschränkt. Nur diejenigen
Phosphopeptide, die einen "site probability score"/"localization score" (Olsen u. a.,
2006) von größer als 0,75 aufwiesen, wurden für die Bestimmung der spezifischen
Phosphorylierungsstelle akzeptiert. Die Spektren der phosphorylierten Peptide, die
den Kriterien entsprachen, wurden manuell validiert und sind im Anhang aufgeführt.
3.2.6.4 nanoHPLC-ESI-LTQ-Orbitrap-Velos-MS
Die massenspekrometrischen Analysen zum Argininphosphoproteom von B. subtilis
wurden mit der LTQ Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) in
Verbindung mit einem nano-HPLC EASY-nLC II System (Thermo Fisher Scientific Inc.,
Waltham, MA) durchgeführt. Die Trennung der Peptide erfolgte über eine selbst
hergestellte analytische Säule (C18-Material (Luna 3u C18(2)100A, Phenomenex®), 100
µm i.D. x 200 mm Säule), die ebenfalls als Emmittertip genutzt wurde. Die Elution der
Peptide wurde durch einen binären Gradienten aus Eluent A und B über einen
Zeitraum von 80 min und einem Fluss von 300 nl/min hervorgerufen.
Eluent A: 99,9 % A. bidest 0,1 % (v/v) Essigsäure
3 Material und Methoden 195
Eluent B: 99,9 % (v/v) Acetonitril 0,1 % (v/v) Essigsäure
Für die massenspektrometrische Analyse wurden zwei unterschiedliche Methoden
angewendet, die sich aufgrund der gewählten Fragmentierungstechnik unterschieden.
Zum einen wurde die Methode der kollisionsinduzierten Fragmentierung (CID) und
zum anderen die Methode der hochenergetischen Kollisionsdissoziierung (HCD)
gewählt.
CID-Fragmentierungsmethode:
Es kam eine Daten-abhängige MS/MS-Methode zum Einsatz, bei der der
Übersichtsscan mit dem Orbitrap-Analysator mit einer Auflösung von R=60000
aufgenommen wurde. Für die Echtzeitkalibrierung wurde die "Lockmass"-Option für
das Ion m/z 445,120025 gewählt. Ebenfalls wurde die "Wideband-activation"
ermöglicht. Für die zwanzig intensivsten Vorläuferionen wurde ein
Fragmentierungsevent (CID) ausgelöst und die Fragmente mit dem LTQ-Analysator
detektiert. Für den erwarteten Verlust von -97,98 Th (H3PO4-Verlust am p-Serin oder p-
Threonin) und -79,97 Th (für HPO3 -Verlust am p-Tyrosin) wurde die "Multistage-
Activation"-Option für alle MS/MS-Ereignisse aktiviert. Die Option "the use of m/z
values as masses" wurde genutzt.
wichtige Parameter der "Instrument"-Methode:
normalized collision energy: 35 isolation width: 2 activation Q: 0,25 activation time: 10 dynamic exclusion: repeat count: 1
exclusion list size: 500 exclusion duration: 20
wichtige Parameter in der "Tune"-Methode:
FTMS Full Max Ion Time: 500 ms ITMS MSn Max Ion Time: 200 ms
196
FTMS Full AGC Target: 1E6 ITMSn AGC Target: 5E3
HCD- Fragmentierungsmethode
Es kam eine datenabhängige MS/MS-Methode zum Einsatz, bei der der Übersichtsscan
mit dem Orbitrap-Analysator mit einer Auflösung von R=30000 aufgenommen wurde.
Für die Echtzeitkalibrierung wurde die "Lockmass"-Option für das Ion m/z 445,120025
gewählt. Ebenfalls wurde die "Wideband-activation" ermöglicht. Für die zehn
intensivsten Vorläuferionen wurde ein Fragmentierungsevent (HCD) in der C-Trap
ausgelöst und die Fragmente mit dem Orbitrap Analysator mit einer Auflösung von
7500 detektiert.
wichtige Parameter der "Instrument"-Methode:
normalized collision energy: 40 isolation width: 2 activation time: 0,1 dynamic exclusion: repeat count: 2
repeat duration: 30 exclusion list size: 500 exclusion duration: 60
wichtige Parameter in der "Tune"-Methode:
FTMS Full Max Ion Time: 250 ms FTMS MSn Max Ion Time: 150 ms FTMS Full AGC Target: 1E6 FTMSn AGC Target: 4E4
Die gewählten Einstellungen für die HCD-Methode wurden an die Publikation von
Nagaraj und Mitarbeitern angelehnt (Nagaraj u. a., 2010).
MS-Datenanalyse
Die massenspektrometrischen Daten der Untersuchungen des
Argininphosphoproteoms wurden mit der MaxQuant-Software (Version 1.1.1.36, Max
Plank Institute of Biochemistry, Martinsried) prozessiert. Die Peaklisten wurden mit
3 Material und Methoden 197
der in MaxQuant implementierten Suchmaschine Andromeda gegen eine aus der
UniprotKB release 12.7 (Uniprot Consortium) extrahierten B. subtilis 168-Datenbank
(4105 Einträge) gesucht. Die Möglichkeit der Randomisierung sowie das Hinzufügen
von Kontaminanten wurden ausgewählt.
Folgende Parameter wurden angesetzt:
• Trypsin-Spezifität
• zwei ausgelassene Enzymschnittstellen wurden erlaubt
• Carbamidomethylierung am Cystein wurde als fixierte Modifikation ausgewählt
• Oxidierung von Methionin und Phosphorylierungen an Arginin, Serin, Threonin und Tyrosin wurden als variable Modifikationen angegeben
• die Massenabweichung der Vorläuferionen durfte höchstens 6 ppm betragen, für die Fragmentionen der CID-Fragmentierung 0,5 Da (CID)oder 20 ppm für die HCD-Fragmente
Die Phosphopeptidvalidierung wurde ebenfalls mit der MaxQuant-Software
durchgeführt. Die Falschpositivenrate wurde auf Protein- und Peptidlevel auf 1 %
beschränkt. Nur diejenigen Phosphopeptide, die einen "site probability/localization
score" (Olsen u. a., 2006) von größer als 0,75 aufwiesen, wurden für die Bestimmung
der spezifischen Phosphorylierungsstelle akzeptiert. Die Peptide mussten mindestens
aus 6 Aminosäuren bestehenund die Phosphorylierungsstelle musste durch b- oder y-
Ionen bestätigt sein. Die Spektren der phosphorylierten Peptide, die den Kriterien
entsprachen, wurden manuell validiert und sind im Anhang aufgeführt.
3.2.7 Quantifizierung der MS-Daten (metabolischer Markierungsansatz) mittels Census
Die putativ phosphorylierten 2D-Gelspots (aus Zoomgelen des pH-Bereiches 4,5-5,5)
aus dem EtOH-Stress-Experiment mit metabolischer Markierung wurden, wie oben
beschrieben, trypsiniert und die extrahierten Peptide der massenspektrometrischen
Analyse zugeführt.
Die MS/MS-Spektren wurden mithilfe von Sequest v.27 (implementiert im Sorcerer-
SequestTM v4.0.3 (rev. 11) (SageN research, USA)) durch eine B. subtilis-
198
Datenbanksuche (extrahiert aus UniProt (UniProtKB release 12.7;
UniProtConsortium)(„The Universal Protein Resource (UniProt)“, 2007) analysiert.
Folgende Parameter wurden eingesetzt:
• Trypsin-Spezifität
• zwei ausgelassene Enzymschnittstellen waren möglich
• die Massenabweichung der Vorläuferionen durfte höchstens 10 ppm und für die Fragmentionen 1 Da betragen
• variable Modifikationen: Oxidation am Methionin (+15.99 Da), Carbamidomethylierung am Cystein(+57.02 Da) und Phosphorylierungen am Serin, Threonin und Tyrosin (+79.97 Da)
Die Datenbanksuche wurde mit 15N als statische Modifikation wiederholt. Die
entstandenen *.dta and *.out files wurden mit dtaselect 2.0.25 zusammengefasst und
gefiltert (Tabb u. a., 2002). Folgende Filterkriterien wurden angewendet:
• erlaubte Ladungszustände: 2-4
• nur komplett tryptische Peptide
• minimal mussten mindestens zwei Peptide pro Lokus vorliegen
• zwei ausgelassene Enzymschnittstellen waren möglich
• Xcorr-Filter: z2 = 2,2; z3 = 3,3; z4 = 3,75
Die Konvertierung der *.raw Dateien in *.ms1 Datein erfolgte mit dem RawExtractor
des CenSus-Pakets (Park u. a., 2008). Die Quantifizierung wurde dann mit CenSus 1.31
unter der Benutzung der nachfolgend beschriebenen config-Datei durchgeführt.
config-Datei:
• "mass accuracy": 10 ppm
• "enrichment factor": 0.98
• "masses for 14N and 15N amino acids"
Der Export der Ergebnisse aus CenSus erfolgte unter folgenden Kriterien:
• "determination factor": 0.7
3 Material und Methoden 199
• "unique peptides"
• "area lower threshold": 0.001
• "area upper threshold": 1000
• "composite score threshold": 0.95
• "minimum peptide per protein": 2
Für die Normalisierung der Daten wurde derselbe N14/N15-Extrakt auf ein 1D-Gel oder
2D-Gel aufgetragen und aufgetrennt. Die Spuren/Spots wurden ausgeschnitten und
wie oben beschrieben tryptisch verdaut, extrahiert, massenspektrometrisch analysiert
und quantifiziert.
Das 14N/15N-Verhältnis wurde mit einer Medianbildung auf 0 über alle Peptidratios
normalisiert. Die 14N/15N-Verhältnisse der Quantifizierung der 2D-Gelspots wurden mit
diesem Medianfaktor normalisiert. Die biologischen Replikate wurden gemittelt und
die Standardabweichung berechnet. Die korrigierten Ratios der Kontrolle und des
Stresszeitpunktes wurde zueinander ins Verhältnis gesetzt und in den Log2-
Zahlenraum überführt.
200
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5 Anhangsübersicht 237
5 Anhangsübersicht
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Anhang I: Identifizierte putativ phosphorylierte Proteine (Bacillus subtilis)
Anhang Ib: Identifizierung der Phosphorylierungsstelle T186 von RsbRB (B. subtilis)
Anhang II: Phosphorylierte Proteine und Peptide (Staphylococcus aureus)
Anhang II S1: Spektren phosphorylierter Peptide: gelbasierter Ansatz (S. aureus)
Anhang II S2: Spektren phosphorylierter Peptide: gelfreier Ansatz (S. aureus)
Anhang III: Peptide mit Argininphosphorylierungsstellen (B. subtilis)
Anhang III S: Spektren der Phospho-Arginin-Peptide (B. subtilis)
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6 Abkürzungsverzeichnis
Im Duden enthaltene Abkürzungen, Symbole chemischer Elemente, SI-Einheiten,
chemische und mathematische Formeln sowie Gen- und Proteinbezeichnungen
wurden nicht aufgeführt.
1D-Gel eindimensionale Gelelektrophorese
2D-Gel zweidimensionale Gelelektrophorese
AA Essigsäure
ACN Acetonitril
BMM Belitzky Minimalmedium
BOC Belitzky ohne Citrat
BY-Kinase bakterielle Tyrosinkinase
CDM chemisch definiertes Medium
CID "collision induced dissociation"
DHB Dihydroxybenzoesäure
DIGE "differential gel electrophoresis"
ECD "electron capture dissociation"
EK Endkonzentration
ERLIC Elektrostatische Repulsions - hydrophile Interaktionschromatographie
ESI "electrospray ionisation"
ETD "electron transfer dissociation"
GeLC-MS/MS "in-gel tryptic digestion followed by liquid chromatography-tandem mass
spectrometry"
FTICR "Fourier transform ion cyclotron resonance" Massenspektrometer
HCD "higher energy collision activated dissociation"
HILIC hydrophile Interaktionschromatographie
HPLC "high performance liquid chromatograph" (Hochleistungschromatographie)
IMAC "Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography"
IPG immobilisierter pH-Gradient
iTraQ "isobaric tags for relative and absolute quantitation"
LC "liquid chromatography" (Flüssigkeitschromatographie)
6 Abkürzungsverzeichnis 239
LMWPTP "low molecular weight protein-tyrosine phosphatases"
LTQ "linear trap quadrupole" (lineare Ionenfalle)
MALDI "matrix assisted laser desorption/ionization" Massenspektrometer
MS Massenspektrometrie
MS/MS Tandem Massenspektrometrie
MSA "Multistage"-Aktivierung
MS-Analyse massenspektrometrische Analyse
NMR-Analyse "nuclear magnetic resonance"-Spektroskopie
OD optische Dichte
PAC Phosphoamidat-Chemie
PP2C "protein phosphatase 2C-family"
PPM "metal-dependent phosphatases"
PPP "phosphoprotein phosphatases"
p-Serin (pSer) phosphoryliertes Serin
P-Stelle Phosphorylierungsstelle
p-Threonin (pThr) phosphoryliertes Threonin
PTM posttranslationale Modifikationen
PTPs "protein tyrosine phosphatases"
PTS Phosphotransferasesystem
p-Tyrosin (pTyr) phosphoryliertes Tyrosin
RT Raumtemperatur
RT-PCR "Realtime"-Polymerasekettenreaktion
SCX "strong cation exchange chromatography"
SDS Natrium Dodecylsulfat
SDS-PAGE "sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis"
SILAC "stable isotope labeling of amino acids in cell culture"
TOF "time of flight" Massenspektrometer
ÜN über Nacht
UPLC "ultra performance liquid chromatography"
WT Wildtyp
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7 Publikationsverzeichnis
1) Dynamics of protein phosphorylation on Ser/Thr/Tyr in Bacillus subtilis. Eymann C, Becher D, Bernhardt J, Gronau K, Klutzny A, Hecker M. Proteomics. 2007 Oct; 7(19):3509-26. 2) Role of RsbU in controlling SigB activity in Staphylococcus aureus following alkaline stress. Pané-Farré J, Jonas B, Hardwick SW, Gronau K, Lewis RJ, Hecker M, Engelmann S. J. Bacteriol. 2009 Apr; 191(8):2561-73. 3) The stability of cytadherence proteins in Mycoplasma pneumoniae requires activity of the protein kinase PrkC. Schmidl SR, Gronau K, Hames C, Busse J, Becher D, Hecker M, Stülke J. Infect. Immun. 2010 Jan; 78(1):184-92. 4) The phosphoproteome of the minimal bacterium Mycoplasma pneumoniae: analysis of the complete known Ser/Thr kinome suggests the existence of novel kinases. Schmidl SR, Gronau K, Pietack N, Hecker M, Becher D, Stülke J. Mol. Cell. Proteomics. 2010 Jun; 9(6):1228-42. 5) Staphylococcal PknB as the first prokaryotic representative of the proline-directed kinases. Miller M, Donat S, Rakette S, Stehle T, Kouwen TR, Diks SH, Dreisbach A, Reilman E, Gronau K, Becher D, Peppelenbosch MP, van Dijl JM, Ohlsen K. PLoS One. 2010 Feb 4; 5(2):e9057. 6) The redox-sensing regulator YodB senses quinones and diamide via a thiol-disulfide switch in Bacillus subtilis. Chi BK, Albrecht D, Gronau K, Becher D, Hecker M, Antelmann H. Proteomics. 2010 Sep; 10(17):3155-64. 7) In vivo phosphorylation patterns of key stressosome proteins define a second feedback loop that limits activation of Bacillus subtilis σB. Eymann C, Schulz S, Gronau K, Becher D, Hecker M, Price CW. Mol. Microbiol. 2011 May; 80(3):798-810. 8) Activity control of the ClpC adaptor McsB in Bacillus subtilis. Elsholz AK, Hempel K, Michalik S, Gronau K, Becher D, Hecker M, Gerth U. J. Bacteriol. 2011 Aug; 193(15):3887-93.
7 Publikationsverzeichnis 241
9) Surface shaving as a versatile tool to profile global interactions between human serum proteins and the Staphylococcus aureus cell surface. Dreisbach A, van der Kooi-Pol MM, Otto A, Gronau K, Bonarius HP, Westra H, Groen H, Becher D, Hecker M, van Dijl JM. Proteomics. 2011 Jul; 11(14):2921-30. 10) Involvement of protein acetylation in glucose-induced transcription of a stress-responsive promoter. Lima BP, Antelmann H, Gronau K, Chi BK, Becher D, Brinsmade SR, Wolfe AJ. Mol. Microbiol. 2011 Sep; 81(5):1190-204. 11) S-bacillithiolation protects against hypochlorite stress in Bacillus subtilis as revealed by transcriptomics and redox proteomics. Chi BK, Gronau K, Mäder U, Hessling B, Becher D, Antelmann H. Mol. Cell. Proteomics. 2011 Nov; 10(11):M111.009506. 12) Structural insights into the redox-switch mechanism of the MarR/DUF24-type regulator HypR. Palm GJ, Khanh Chi B, Waack P, Gronau K, Becher D, Albrecht D, Hinrichs W, Read RJ, Antelmann H. Nucleic Acids Res. 2012 May; 40(9):4178-92. 13) Global impact of protein arginine phosphorylation on the physiology of Bacillus subtilis. Elsholz AK, Turgay K, Michalik S, Hessling B, Gronau K, Oertel D, Mäder U, Bernhardt J, Becher D, Hecker M, Gerth U. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2012 May 8; 109(19):7451-6. 14) Inhibition of acetyl phosphate-dependent transcription by an acetylatable lysine on RNA polymerase. Lima BP, Huyen TT, Bäsell K, Becher D, Antelmann H, Wolfe AJ. J. Biol. Chem. 2012 Sep 14; 287(38):32147-60. 15) S-bacillithiolation protects conserved and essential proteins against hypochlorite stress in Firmicutes bacteria. Chi BK, Roberts AA, Huyen TT, Bäsell K, Becher D, Albrecht D, Hamilton CJ, Antelmann H. Antioxid. Redox Signal. 2012 Oct 18 (Epub ahead of print). 16) The phosphoproteome and its physiological dynamics in Staphylococcus aureus. Bäsell K, Otto A, Zühlke D, Rappen GM, Schmidt S, Hentschker C, Macek B, Ohlsen K, Hecker M, Becher D. J. Proteome. Res.: Status: eingereicht
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8 Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch-
Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch
einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht
wurde.
Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die
darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines
Dritten ohne Kennzeichnung übernommen habe.
10 Danksagung 245
10 Danksagung
Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Michael Hecker, für
die Überlassung dieses interessanten und herausfordernden Themas, für die
Betreuung, für die Möglichkeit, ein weitreichendes Arsenal an unterschiedlichsten
Massenspektrometern nutzen zu können und für die Gelegenheiten an
verschiedensten Tagungen teilnehmen und die eigenen Daten präsentieren zu dürfen.
Frau PD Dr. Dörte Becher möchte ich ganz herzlich für die engagierte Betreuung und
Ihren Einsatz bei meiner Weiterbildung in die Funktionsweise verschiedenster
Massenspektrometer danken und für das mir entgegen gebrachte Vertrauen, mehrere
Diplomanden betreuen und in mehreren Kooperationen mitarbeiten zu dürfen.
Bei Dr. Andreas Otto möchte ich mich für seine tatkräftige Unterstützung bei der
Fertigstellung des S. aureus-Manuskriptes, für angeregte Diskussionen und für die
angenehme Zusammenarbeit bedanken.
Mein herzlicher Dank gilt Dr. Daniela Zühlke, die mich bei der Kultivierung von
S. aureus unterstützte, immer ein offenes Ohr für jegliche Art von Fragen gehabt hat
und dem Laboralltag eine freundliche Atmosphäre einhauchte. Ein zusätzliches
Dankeschön für jeden einzelnen "Bindestrich".
Gerd-Martin Rappen und Dr. Jan Muntel danke ich für die Unterstützung bei
MaxQuant und Census und für die kollegiale Arbeitsatmosphäre.
Ganz herzlich bedanke ich mich bei Sebastian Grund für seine technische
Unterstützung und für seine "sozialistische" Ader, dem "Gruppenkollektiv" eine
freundliche Atmosphäre zu verschaffen.
Den Diplomanden Sabrina Schmidt und Martin Zander danke für die Durchführung
praktischer Arbeiten.
Den Mitgliedern der MS-Gruppe, darunter Susann Meyer, danke ich für die lustige
Arbeitsatmosphäre und die stetige Diskussionsbereitschaft.
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Ich danke allen Mitarbeitern des Instituts für Ihre Hilfsbereitschaft und das sehr
angenehme Arbeitsklima.
Prof. Dr. Lothar Jänsch und Dr. Josef Wissing aus Braunschweig möchte ich für die
Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Kinaseanreicherung bedanken.
Bei Prof. Boris Macek und seiner Gruppe in Tübingen bedanke ich mich dafür, dass ich
Einblick in ihre Arbeitsgruppe nehmen und von ihnen die Phosphopeptidanreicherung
lernen durfte.
Ich danke folgenden Kooperationspartnern:
- Dr. Christine Eymann und Dr. Jörg Bernhardt für die Zusammenarbeit
beim Phosphoproteom von B. subtilis
- Prof. Dr. Jörg Stülke und Dr. Sebastian Schmidl für die Zusammenarbeit
beim Phosphoproteom von M. pneumoniae
- Dr. Jan Pané-Farré für die Zusammenarbeit an dem RsbV-Protein von
S. aureus
- Dr. Alexander Elsholz und Dr. Ulf Gerth für die Zusammenarbeit bei den
Argininphosphorylierungen von B. subtilis
und allen weiteren Kooperationspartnern, darunter PD Dr. Haike Antelmann, für das
in mich gesetzte Vertrauen, ihre Proben massenspektrometrisch analysieren zu dürfen.
Ich danke meinem Lieblingsonkel Sönke, der nicht müde wurde, mich während dieser
Zeit zu unterstützen.
Ganz besonders innig und herzlich möchte ich meinem Vater, meiner Mutter und
meinem Bruder danken, die mir immer mit Rat und Tat zur Seite gestanden haben und
ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.
Zuletzt bedanke ich von ganzem Herzen bei meinem Mann Torsten für seine Liebe und
seine Unterstützung.