Herstellung, Charakterisierung und Anwendung von ... Herstellung, Charakterisierung und Anwendung

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  • Herstellung, Charakterisierung und Anwendung

    von kurzkettigen Chitosanen

    Dissertation

    zur Erlangung des Doktorgrades

    der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

    der Christian-Albrechts-Universität

    zu Kiel

    vorgelegt von

    Sven Krohn

    Kiel 2003

  • Referent: Prof. Dr. Dr. h. c. B. W. Müller

    Korreferent: Prof. Dr. D. Heber

    Mündliche Prüfungen: 03., 07. und 10.07.2003

    Zum Druck genehmigt: 03.07.2003

    Prof. Dr. W. Depmeier

    (Dekan)

  • Ist ein Geheimnis erst gelöst, ist es nur

    noch Tatsache. Wird Magie erklärt, ent-

    puppt sie sich als Wissenschaft.

    Harold R. Foster

  • Das Fehlen einer besonderen Kennzeichnung oder eines entsprechenden Hin-

    weises auf ein Warenzeichen, ein Gebrauchsmuster oder einen Patentschutz lässt

    nicht den Schluss zu, dass über die in dieser Arbeit angegebenen Dinge frei ver-

    fügt werden kann.

  • Inhaltsverzeichnis

    I

    Inhaltsverzeichnis

    1 Einleitung und Zielsetzung 1

    1.1 Einleitung 1

    1.2 Zielsetzung 2

    2 Chitosan als Hilfsstoff in der Pharmazie 4

    2.1 Langkettige Chitosane 4

    2.2 Kurzkettige Chitosane 7

    2.3 Charakterisierung von Chitosan 15

    2.3.1 Bestimmung des Molekulargewichtes 15

    2.3.2 Bestimmung des Deacetylierungsgrades 21

    2.3.2.1 UV-Spektroskopie 21

    2.3.2.2 IR-Spektroskopie 22

    2.3.2.3 Kernresonanzspektroskopie 23

    2.3.2.4 Titrationsverfahren 25

    2.3.2.5 Partikelladungsdetektor 28

    2.4 Chitosan-Mikro- und Nanopartikel 31

    2.4.1 Herstellungstechniken 31

    2.4.2 DNA-Vakzinierung 33

    3 Experimenteller Teil 40

    3.1 Herstellung von kurzkettigen Chitosanen 40

    3.1.1 Einleitung 40

    3.1.2 Methode 1 41

    3.1.3 Ergebnis der Methode 1 42

    3.1.4 Methode 2 44

    3.1.5 Statistischer Versuchsplan 45

    3.1.6 Ergebnisse des Versuchsplanes nach Methode 2 47

  • Inhaltsverzeichnis

    II

    3.1.6.1 Statistische Betrachtung der Einflüsse der Variablen auf das

    Molekulargewicht der ersten Fraktion 50

    3.1.6.2 Statistische Betrachtung der Einflüsse der Variablen auf die

    Ausbeute der ersten Fraktion 55

    3.1.6.3 Statistische Betrachtung der Einflüsse der Variablen auf das

    Molekulargewicht der Säure löslichen Fraktion 56

    3.1.6.4 Statistische Betrachtung der Einflüsse der Variablen auf die

    Ausbeute der zweiten Fraktion 56

    3.1.7 Prognosen 59

    3.1.8 Zusammenfassung 60

    3.2 Charakterisierung von kurzkettigen Chitosanen mittels MALDI-

    TOF 62

    3.2.1 Einleitung 62

    3.2.2 Methode 63

    3.2.3 Ergebnisse 63

    3.2.4 Zusammenfassung 70

    3.3 Bestimmung des Deacetylierungsgrades von Chitosan 72

    3.3.1 Einführung 72

    3.3.2 Bestimmung des Deacetylierungsgrades mittels 1H-NMR und 13C-NMR 74

    3.3.2.1 Probenbereitung 1H-NMR 74

    3.3.2.2 Spektrenauswertung 1H-NMR 75

    3.3.2.3 Probenbereitung und -vermessung 13C CP/MAS NMR 82

    3.3.2.4 Spektrenauswertung 13C-NMR 85

    3.3.3 Bestimmung des Deacetylierungsgrades mit Hilfe des

    Partikelladungsdetektors 87

    3.3.4 Ergebnisse 89

    3.3.5 Vergleich der ermittelten Deacetylierungsgrade mit den

    Herstellerangaben 95

  • Inhaltsverzeichnis

    III

    3.3.6 Zusammenfassung 96

    3.4 Mikro- und Nanopartikel als Träger von Vakzinen 98

    3.4.1 Einleitung 98

    3.4.2 Herstellung von Mikropartikeln durch Fällung mit Natriumsulfat 99

    3.4.3 Abhängigkeit der Partikelgröße von der Titrationsmenge 103

    3.4.4 Charakterisierung der Mikropartikel in Abhängigkeit vom

    eingesetzten Molekulargewicht 104

    3.4.4.1 Partikelgröße und -gestalt 104

    3.4.4.2 Bestimmung der Kristallinität 107

    3.4.4.3 Zetapotential 109

    3.4.5 Herstellung von Nanopartikeln durch Fällung mit Tripolyphosphat 112

    3.4.6 Charakterisierung der Nanopartikel in Abhängigkeit vom

    eingesetzten Molekulargewicht 113

    3.4.6.1 Partikelgröße 113

    3.4.6.2 Zetapotential 114

    3.4.7 Durchführung der In-vitro-Untersuchungen zur Aufnahme von

    pDNA 115

    3.4.8 Auswertung der inkubierten Zellen 116

    3.4.9 Einfluss der Partikelart und des Chitosan-Molekulargewichtes auf

    den Transfektionserfolg 117

    3.4.10 Einfluss der Partikelbeladung auf die Fluoreszenz und Granularität 120

    3.4.11 Einfluss der Ultraschallbehandlung auf Fluoreszenz und

    Granularität 122

    3.4.12 Zusammenfassung 124

    4 Zusammenfassung der Arbeit 125

    5 Abstract (English Version) 129

    6 Anhang 132

    6.1 Allgemeine Materialien und Geräte 132

  • Inhaltsverzeichnis

    IV

    6.1.1 Verwendete Chemikalien 132

    6.1.2 Verwendete Chitosanqualitäten 133

    6.1.3 Geräte 134

    6.2 Spezielle Methoden und Geräte 136

    6.2.1 Säurehydrolyse 136

    6.2.2 Molekulargewichtsbestimmungen 137

    6.2.2.1 Gelfiltrationschromatographie (GFC/MALLS) 137

    6.2.2.2 Flugzeitspektrometrie, MALDI-TOF MS 138

    6.2.3 Bestimmung des Deacetylierungsgrades 139

    6.2.3.1 1H-NMR 139

    6.2.3.2 Festkörper- 13C CP/MAS NMR 140

    6.2.3.3 Polyelektrolyttitration 140

    6.2.4 Herstellung der Mikro- und Nanopartikel 141

    6.2.4.1 Gefriertrocknung der unbeladenen Mikropartikel 142

    6.2.5 In-vitro-Testmethode 143

    6.2.5.1 Beladung der Partikel 144

    6.2.5.2 Beladung und Bebrütung der Zellen 144

    6.2.5.3 Aufarbeitung 144

    6.2.5.4 Durchflusszytometrie 145

    7 Literaturverzeichnis 146

    8 Danksagung 165

  • Inhaltsverzeichnis

    V

  • Verzeichnis der verwendeten Symbole und Abkürzungen

    VI

    Verzeichnis der verwendeten Symbole und Abkürzungen

    a Mark-Houwink-Exponent A2 zweiter Virialkoeffizient a.i. absolute Intensität APC Antigenpräsentierende Zellen ASTM American Society for Testing and Materials

    b Achsenabschnitt c Konzentration CD Cytotoxische T-Zelle CMV Cytomegalivirus CP Kreuzpolarisation (Cross Polarization)

    CpG Cytidin-Phophat-Guanosin CT Kontaktzeit (Contact Time) Da Dalton DD Deacetylierungsgrad (Degree of deacetylation) DHB 2,5-Dihydroxybenzoesäure

    dn/dc Brechungsindexinkrement DP Polymerisationsgrad (Degree of polymerisation) DSC Differential Scanning Calorimetry d Partikeldurchmesser FA Molenfraktion der N-acetylierten Einheiten

    FACS Fluorescence Activated Cell Sorter FCS Fetal Calf Serum FL1-H Fluoreszenzstreulicht, Detektor1 FSC (Vorwärtsstreuung) Forward scatter GFC Gelfiltrationschromatographie

    K Mark-Houwink-Konstante k. A. keine Angabe LD Letale Dosis m Masse

    MA Molekulargewicht eines acetylierten Chitosanmonomers

  • Einleitung

    VII

    MALDI-TOF MS Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of

    Flight Mass Spectroscopy MALLS Multi Angel Laserlight Scattering MAS Magic Angel Spinning MD Molekulargewicht eines deacetylierten Chitosanmonomers

    MHC Major Histocompatibility Complex Mn zahlenmittleres Molekulargewicht Mw massenmittleres Molekulargewicht MW Molekulargewicht m/z Masse pro Ladung

    nA Anzahl der acetylierten Chitosanmonomere nD Anzahl der deacetylierten Chitosanmonomere nP Anzahl der PES-Monomere NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy P(�) Streufunktion, particle scattering factor

    PCD Partikelladungsdetektor (Particle Charge Detector) PCS Photonenkorrelationsspektrometer PD Polydispersitätsgrad Mw/Mn PES Polyethylensulfonsaures Natrium Polydadmac Polydimethylallylammoniumchlorid

    pDNA Plasmid-DNA R² Bestimmtheitsmaß R� reduzierte Streuintensität, Rayleigh-Verhältnis REM Rasterelektronenmikroskop RT Raumtemperatur

    SC Somatische Zelle SSC Rechtwinkelstreulicht (Side scatter) t Zeit T Temperatur T1H Protonen-Spin-Gitter-Relaxationszeit

    T1�H Protonen-Spin-Gitter-Relaxationszeit im rotierenden Device

    TCH Kreuzpolarisationszeit

  • Verzeichnis der verwendeten Symbole und Abkürzungen

    VIII

    THAP 2,4,6-Trihydroxyacetophenon

    TMSPS-Na Trimethylsilylpropansulfonsäure-Natrium TPP Tripolyphosphat U/min Umdrehungen pro Minute V Volumen

    � chemische Verschiebung

    [η] Grenzviskosität � Wellenlänge � Detektionswinkel

  • Einleitung und Zielsetzung

    1

    1 Einleitung und Zielsetzung

    1.1 Einleitung

    Die Geschichte des Chitosans geht bis in das Jahr 1859 zurück, als Rouget beim

    Kochen von Chitin in Kaliumhydroxid ein neues, säurelösliches Produkt beo-

    bachtete, die deacetylierte Form des Chitins, welches 1811 von Braconnot zum

    ersten mal als Bestandteil von Pilzen beschrieben wurde. Der Name „Chitosan“

    wurde allerdings erst 35 Jahre später von Hoppe-Seyler in einem Bericht der

    Deutschen Chemischen Gesellschaft geprägt [Paul und Sharma 2000]. In den

    letzten Jahrzehnten ist das Interesse an dem vor allem aus Krabbenschalen ge-

    wonnen, biokompatiblen Produkt stark gestiegen. Zahlreiche Veröffentlichun-

    gen berichten über die Einsatzgebiete des bioabbaubaren Mate