Identifikasi dan Fraksinasi Karotenoid pada Minyak Buah

Warta IHP/Journal of Agro-based Industry Vol.37 (No.1) 07 2020: 7-19 Halaman | 7

© WIHP; P-ISSN 0215-1243; E-ISSN 2654-4075; 2020; All rights reserved

Identifikasi dan Fraksinasi Karotenoid pada Minyak Buah Merah (Pandanus conoideus)

Identification and Fractionation of Carotenoids in Red Fruit Oil (Pandanus conoideus)

Erka Fitriaa, Nur Wulandaria*, Purwiyatno Hariyadia,b dan Hendra Wijayac*

a Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor

Jalan Raya Dramaga, Bogor 16680, Jawa Barat

b Southeast Asian Food & Agricultural Science & Technology (SEAFAST) Center Jalan Ulin No. 1 Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680, Jawa Barat

c Balai Besar Industri Agro Jalan Juanda No. 11 Bogor 16122, Jawa Barat

Riwayat Naskah: Diterima 05 2020 Direvisi 05 2020 Disetujui 05 2020

ABSTRAK: Karotenoid adalah golongan pigmen dengan struktur isoprenoid yang memiliki berbagai manfaat bagi kesehatan. Buah merah (Pandanus conoideus) merupakan sumber karotenoid yang potensial karena memiliki kadar karotenoid yang tinggi. Buah merah menyebar luas di daerah Papua dan Papua Nugini dan banyak digunakan sebagai makanan dan bahan masakan. Beberapa jenis karotenoid telah berhasil diidentifikasi namun dalam jumlah yang relatif sedikit, antara lain α-karoten, β-karoten, α-kriptoxanthin, dan β-kriptoxanthin. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan dengan tujuan mengidentifikasi karotenoid yang ada pada minyak buah merah selain α-karoten, β-karoten, α-kriptoxanthin, dan β-kriptoxantin. Dari penelitian ini, enam jenis karotenoid berhasil teridentifikasi dari ekstrak total karotenoid seperti (3S, 5R, 6R)-3,5-dihidroksi-6,7-didehidro-5,6-dihidro-12'-apo-β-karoten-12'-al, 10'-apo-beta-karotenal, (3S, 3'S, 5R, 5'R, 8'R, 9'cis)-3'-metil-6,7-didehidro-5,5',6,8'–tetrahidro–5',8'-epoksi-β,β-karotene-3,5-diol, phytoene, 3-hidroksi–3'-okso-β,ε-karoten, dan violaxanthin. Selain itu, terdapat dua fraksi terpilih dari hasil fraksinasi dengan Flash Column Chromatography untuk diidentifikasi lebih lanjut. Dari fraksi tersebut teridentifikasi lima jenis karotenoid pada fraksi kedua, termasuk dua di antaranya yaitu capsantin dan kriptoxantin yang belum teridentifikasi sebelumnya pada ekstrak total karotenoid. Diprediksi terdapat α-karoten dan β-karoten pada fraksi pertama apabila dilihat dari persamaan waktu retensinya dengan standar.

Kata kunci: buah merah, fraksi, identifikasi, karotenoid, kromatografi

ABSTRACT: Carotenoid is a group of isoprenoid pigment that provides numerous health benefits. Red fruit (Pandanus conoideus) is a potential source of carotenoid because it have high content of carotenoid. Red fruit is widely spread in Papua and Papua New Guinea and mainly used by Papua people as food and food ingredients. Several types of carotenoid from red fruit oil had already identified however in relatively small amount, such as α-carotene, β-carotene, α-cryptoxanthin, and β-cryptoxanthin. Therefore, this study is aimed to identify carotenoids from red fruit oil except α-carotene, β-carotene, α-cryptoxanthin, and β-cryptoxanthin. From this study, six types of carotenoid were successfully identified in the total carotenoid extract such as (3S, 5R, 6R)-3,5-dihydroxy-6,7-didehydro-5,6-dihydro-12'-apo-β-carotene-12'-al; 10'-apo-beta-carotenal; (3S, 3'S, 5R, 5'R, 8'R, 9'cis)-3'-methyl-6,7-didehydro-5,5',6,8'-tetrahydro-5',8'-epoxy-β,β-carotene-3,5-diol; phytoene; 3-hydroxy-3'-oxo-β,ε-carotene; and violaxanthin. Also, there are two fractions selected from fractionation by Flash Column Chromatography for further identification. From these fractions, there were five types of carotenoids identified from the second fraction including two carotenoids, capsanthin and cryptoxanthin, which had not been identified in the total carotenoid extract previously. The first isolate is predicted containing α-carotene and β -carotene due to the similarity between the retention time with authentic standards.

Keywords: red fruit, fraction, identification, carotenoids, chromatography

* Kontributor utama

Email : [email protected]

Citation: Fitria, E, Wulandari, N, Hariyadi, P, & Wijaya, H (2020) Identifikasi dan Fraksinasi Karotenoid pada Minyak Buah Merah (Pandanus conoideus)

Warta IHP, 37(1),7-19

Halaman | 8


1. Pendahuluan

Buah merah (Pandanus conoideus) merupakan tanaman yang menyebar secara luas di daerah Papua dan Papua Nugini (Rohman & Windarsih, 2018). Pada kehidupan sehari-hari, buah merah dan minyaknya banyak dimanfaatkan oleh masyarakat Papua sebagai makanan pokok, bumbu, pewarna alami, dan obat-obatan tradisional (Ea & Octivia, 2012; Sarungallo, Murtiningrum, & Santoso, 2016). Buah merah dikenal memiliki manfaat bagi kesehatan antara lain sebagai antikanker (Achadiyani, Septiani, Faried, Bolly, & Kurnia, 2016; Astirin, Harini, & Handajani, 2009; Tih, 2016), antiinflamasi (Khiong, Adhika, & Chakravitha, 2009), menstimulasi sistem imun yang berdampak positif dalam penanganan penyakit HIV (Tambaip, Karo, & Hatta, 2018), serta mengurangi stress oksidatif pada sel endotelial (Xia, Schirra, Hasselwander, Förstermann, & Li, 2018).

Berbagai manfaat bagi kesehatan yang dimiliki oleh buah merah didukung oleh banyaknya kandungan senyawa bioaktif yang dimiliki, seperti senyawa fenolik, flavonoid, karotenoid, tokoferol, dan asam lemak tidak jenuh (Rohman et al., 2010; Sarungallo, Hariyadi, Andarwulan, & Purnomo, ari e erapa enyawa ioaktif ter e ut, minyak uah merah diketahui memiliki kadar karotenoid yang tinggi dalam ki aran mg/kg (Sarungallo, Hariyadi, Andarwulan, Purnomo, & Wada 2015). Kadar karotenoid buah merah ini jauh le ih tinggi di andingkan dengan um er- um er karotenoid lain eperti minyak awit merah dengan total karotenoid erki ar antara mg/kg (Muhammad, Choong, Chuah, Yunus, & Yap, , wortel dengan total karotenoid e e ar mg kg ozalan aradeniz , dan juga tomat dengan total karotenoid erki ar mg kg endelova , ik elova , endel, 2013)

Karotenoid adalah pigmen larut lemak berwarna kuning sampai merah (Rodrigues, Mariutti, & Mercadante, 2012). Karotenoid merupakan senyawa isoprenoid dengan kerangka poliena yang memiliki ikatan ganda terkonjugasi (Rodriguez-Concepcion et al., 2018). Karotenoid dikenal sebagai senyawa antioksidan yang akan bereaksi dengan senyawa oksigen reaktif. Beberapa jenis karotenoid juga dikenal memiliki aktivitas sebagai pro-vitamin A (Sartori & Silva, 2014) .

Dari kandungan total karotenoid yang tinggi pada buah merah, informasi tentang jenis karotenoid pada minyak buah merah masih terbatas. Selain itu, hanya beberapa jenis karotenoid yang telah teridentifikasi sebelumnya, antara lain α–kriptoxantin, β–kriptoxantin, α–karoten, dan β–karoten. Penelitian yang telah dilakukan oleh Sarungallo et al., (2015) berhasil mendeteksi hanya

empat puncak karotenoid e agai α-kriptoxanthin, β-kriptoxanthin, α-karoten, dan β-karoten yang hanya mengisi kurang dari 10% dari total area puncak keseluruhan. Hal ini yang berarti bahwa keempat karotenoid tersebut bukanlah karotenoid dominan yang terdapat pada minyak buah merah dan masih banyak karotenoid lain yang yang jumlahnya lebih tinggi yang belum teridentifikasi. Tahapan-tahapan yang akan dilakukan dalam penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi lebih lanjut karotenoid yang ada pada minyak buah merah (selain 4 jenis karotenoid yang sudah pernah teridentifikasi sebelumnya).

Penelitian tentang karotenoid pada minyak buah merah menjadi suatu kajian yang penting dan menarik untuk dilakukan karena selain kandungan karotenoidnya yang tinggi, informasi tentang jenis senyawa karotenoid yang terdapat pada minyak buah merah masih belum banyak diketahui. Dengan diketahuinya identitas senyawa dan struktur karotenoid tersebut, akan memudahkan analisis senyawa karotenoid target serta isolasi senyawa karotenoid spesifik pada minyak buah merah. Hasil isolasi lebih lanjut dapat diaplikasikan di dalam industri sebagai pewarna makanan, nutrasetikal, dan kosmetik.

2. Bahan dan Metode

2.1. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain buah merah (Unit Konservasi Budidaya Biofarmaka, LPPM IPB), reagen dan pelarut untuk analisis berupa heksana, aseton, etanol absolut, toluena, dan etil asetat, (Merck, Jerman), serta NaOH, KOH, dan NaCl (Himedia, India), asam askorbat, bubuk silika gel Wakosil C-200 dengan ukuran partikel 64-210 µm (Wako, Jepang). Fase gerak untuk kromatografi cair kinerja tinggi yaitu etil asetat, asetonitril (Merck, Jerman), dan metanol (JT Baker, Amerika). Fase gerak untuk kromatografi cair–MS/MS berupa air, asam format, dan metanol (Merck, Jerman), bahan-bahan lainnya antara lain gas nitrogen Ultra High Purity, air destilata, pelat silika gel 60 F254 20×20cm (Merck, Jerman), standar α–karoten dan standar β–karoten (Wako, Jepang).

2.2. Alat

Peralatan yang digunakan antara lain neraca analitik ABJ 220-4 NM (Kern, Jerman), ultrasonikator DSA 100-SK2 4.0 liter, Sepacore® Flash Chromatography X-10 (BUCHI, Switzerland), set penguap putar dengan pompa vakum, penangas air, dan interface (BUCHI R-100, Switzerland), hotplate dan magnetic stirrer Velp Scientifica,



Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dilengkapi dengan pompa LC-20 AD, detektor UV-VIS SPD 20A, detektor fluoresen RF-20 A, kolom oven CTO 20 A/C, dan autosampler SIL-20AC, kolom Shim-Pack GIST C18 dengan dimensi 150x4.6 mm dan ukuran partikel 5µm (Shimadzu Prominence High Performance Liquid Chromatography, Jepang), syringe filter PTFE 0.2 µm dengan diameter 15 mm (Agilent, Amerika), evaporator V-10 touch (Biotage, Swedia) UHPLC Vanquish dengan spektrometer massa tandem quadropole exactive plus orbitrap HRMS kolom yang digunakan adalah accucore phenyl hexyl 100x2.1 mm, 2.6 µm (Thermoscientific, Amerika).

2.3. Metode

Beberapa tahapan yang akan dilakukan pada penelitian ini antara lain ekstraksi total karotenoid dari minyak buah merah dilanjutkan dengan identifikasi karotenoid pada sampel ekstrak total karotenoid. Selanjutnya dilakukan fraksinasi karotenoid dengan Flash Column Chromatography (FCC) lalu dilakukan pengecekan fraksi-fraksi karotenoid tersebut dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) untuk dipilih fraksi yang memiliki pemisahan terbaik. Fraksi-fraksi terpilih selanjutnya diidentifikasi dengan dengan Kromatografi Cair-Spektrometri Massa (LC–MS/MS).

2.3.1. Ekstraksi total karotenoid dari minyak buah merah

Ekstraksi karotenoid dari minyak buah merah dilakukan berdasarkan metode yang telah dilakukan dengan beberapa modifikasi (Wijaya et al. 2018). Minyak buah merah ditimbang sebanyak 6 g di dalam botol gelap, dilarutkan dalam campuran pelarut heksana: aseton: etanol: toluena (HAET) dengan perbandingan 9:7:6:7 sebanyak 112.5 mL, diultrasonikasi selama 2 menit, ditambahkan 3 g asam askorbat, 30 mL air, dan 80 mL larutan KOH 40% di dalam metanol. Campuran disonikasi selama 5 menit lalu dipanaskan di dalam penangas air 60 C selama 30 menit. Reaksi saponifikasi dihentikan dengan pendinginan cepat dan penambahan NaCl 25 mg/mL sebanyak 120 mL. Campuran hasil saponifikasi dipindahkan ke dalam corong pisah gelap, tambahkan 112.5 mL HAET, dikocok, fase nonpolar yang berada di bagian atas dikumpulkan. Pemisahan diulang dengan pencucian dengan air destilata sebanyak 4 kali atau hingga diperoleh fase polar yang jernih. Hasil ekstraksi selanjutnya dipindahkan ke dalam labu ekstraksi dan diuapkan pelarutnya dengan menggunakan penguap putar pada suhu 40 60 C hingga terbentuk konsentrat karotenoid.

2.3.2. Identifikasi karotenoid dengan UHPLC–HESI-MS/MS

Tahapan identifikasi dilakukan berdasarkan metode yang telah dilakukan oleh Abate-Pella, Freund, Slovin, Hegeman, & Cohen, (2017) dengan beberapa modifikasi. Sebelum sampel diinjeksi, terlebih dahulu sampel dilarutkan di dalam metanol 2 mL, disonikasi selama 5 menit, lalu disaring dengan syringe filter berukuran 0.20 µm. Dua jenis fase gerak yang digunakan yaitu fase gerak A yang terdiri dari asam format 0.1% dalam air dan fase gerak B terdiri dari asam format 0.1% dalam metanol. Gradien linier 0 – 60% B selama 5 menit, dilanjutkan 60% – 95% B selama 15 menit dan dipertahankan selama 3 menit, lalu kembali ke kondisi awal 0% B dipertahankan selama 5 menit. Laju alir yang digunakan 0.4 mL/menit dan suhu kolom diatur pada 25 C. Spektrum MS diperoleh dalam rentang m/z 100 sampai 1200. Identitas senyawa karotenoid diketahui melalui aplikasi Compound Discoverer versi 2.1.0.401 Thermoscientific.

2.3.3. Fraksinasi dengan Flash Column

Cromatography (FCC)

Ekstrak karotenoid ditimbang sebanyak 0.3 – 0.4 g lalu ditambahkan bubuk silika sebanyak empat kali bobot sampel. Sampel dijerap ke dalam bubuk silika dengan cara menambahkan pelarut perlahan sambil dipanaskan dan diaduk dengan sudip di atas penangas air hingga semua pelarut berhasil diuapkan. Ekstrak yang sudah terjerap di dalam bubuk silika diletakkan di dalam sample loader lalu dipasang di atas kolom sehingga fase gerak akan melewati sampel sebelum melalui kolom. Fase gerak yang digunakan terdiri dari dua jenis, yaitu fase gerak A: heksana, fase gerak B: etil asetat. Gradien konsentrasi yang digunakan yaitu 0% B selama 8 menit, gradien linier 0 – 5% B selama 1 menit, isokratik 5% B selama 10 menit, gradien linier 5 – 10% B selama 1 menit, isokratik 10% B selama 5 menit, gradien linier 10–15% B selama 1 menit, isokratik 15% B selama 10 menit, gradien linier 15 – 20% B selama 1 menit, isokratik 20% B selama 5 menit, gradien linier 20 – 90% B selama 5 menit, isokratik 90% B selama 20 menit, gradien linier 90 – 100% B selama 1 menit, isokratik 100% B selama 5 menit. Laju alir yang digunakan adalah 2.5 mL/menit, fraksi-fraksi yang terbentuk ditampung etiap mL etiap terdetek i adanya puncak pada λ < nm, nm < λ < nm,


Warta IHP, 37(1),7-19

Halaman | 10


2.3.4. Pengecekan fraksi dengan Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi

Pengecekan fraksi dilakukan berdasarkan metode yang telah dilakukan oleh Sarungallo et al., (2015). Sebelum sampel diinjeksi, terlebih dahulu sampel dilarutkan di dalam asetonitril lalu disaring dengan syringe filter berukuran 0.20 µm. Fase gerak terdiri dari dua jenis, fase gerak A merupakan campuran asetonitril dan air (80: 20) dan fase gerak B merupakan campuran asetonitril, metanol, dan etil asetat (68: 5: 27). Gradien fase gerak diprogram sebagai berikut: 1 – 10% B selama 4 menit, 50 – 80% B selama 21 menit, isokratik 100% B selama 20 menit, dan isokratik 1% B selama 15 menit. Pemisahan dilakukan pada suhu autosampler 15 C, suhu kolom 400C. Karotenoid yang terpisah terdeteksi dan diukur pada 450 nm.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Identifikasi Karotenoid pada ekstrak total karotenoid minyak buah merah

Terdapat enam jenis senyawa karotenoid yang berhasil teridentifikasi di dalam ekstrak total karotenoid buah merah (Tabel 1). Senyawa karotenoid pertama adalah (3S,5R,6R)–3,5–dihidroksi–6,7–didehidro–5,6–dihidro–12'–apo–beta–karoten–12'–al (Gambar 1) dengan ion molekular terprotonasi pada m/z 383 yang sesuai dengan rumus molekul C25H34O3. Fragmen-fragmen ion yang dihasilkan antara lain m/z 365 yang menunjukkan kehilangan molekul air [M+H–18]+. Selanjutnya, fragmen ion pada m/z 157 menunjukkan fragmen dari molekul C12H13. Senyawa selanjutnya yaitu 10'–apo–beta–karotenal dengan rumus molekul C40H64 (Gambar 2) memiliki fragmen ion pada m/z 171 yang merupakan pemutusan pada C1 dan fragmen ion m/z 105 merupakan pemutusan pada C6.

Pada m/z 599, terdeteksi ion molekular terprotonasi yang sesuai dengan senyawa (3S,3'S,5R,5'R,8'R,9'cis)–3'–metil–6,7–didehidro–5,5',6,8'–tetrahidro–5',8'–epoksi–β,β–karoten–3,5–diol dengan rumus molekul C41H58O3 (Gambar 3).

Fragmen ion 567 menunjukkan pemutusan dua molekul air [M+H–18-18]+. Fragmen ion 405 menunjukkan pemutusan pada rantai C7 dan fragmen 157 merupakan fragmen dari C12H13.

Ion molekular yang terdeteksi pada m/z 544 sesuai dengan rumus molekul C40H64 (Gambar 4), yaitu phytoene. Phytoene merupakan senyawa tak berwarna yang tetap digolongkan sebagai karotenoid karena ia merupakan prekursor dari senyawa karotenoid lainnya (Meléndez-Martínez, Mapelli-Brahm, Benítez-González, & Stinco, 2015). Fragmentasi senyawa phytoene pada m/z 327 merupakan indikasi putusnya ikatan antara C13 dan C14 yang juga teramati pada studi yang dilakukan oleh Lu, Huang, Lv, & Pan, (2017). Fragmen ion pada m/z 229 dan 203 menunjukkan pemutusan pada rantai C19 dan C20, C21 dan C22, fragmen ion m/z 149 merupakan indikasi putusnya ikatan pada C24, fragmen ion m/z 95 dan m/z 81 berturut-turut merupakan indikasi putusnya ikatan pada C27 dan C28.

Spektrum massa ion molekular pada m/z 567 sesuai dengan senyawa 3–hidroksi–3'–okso–β,ε–karoten (Gambar 5) yang memiliki rumus molekul C40H54O2, fragmen ion pada m/z 535 menunjukkan hilangnya dua molekul air yang setara dengan [M–18–18]+, fragmen m/z 221 mengindika ikan pemutu an pada rantai C ’, fragmen m/z 121 menunjukkan fragmen cincin beta yang kehilangan gugus oksigen.

Terdeteksi pula violaxanthin dengan ion molekular yang terdeteksi pada m/z 601 sesuai dengan rumus molekul C40H56O4 (Gambar 6). Fragmen pada m/z 583 yang setara dengan [M+H–18]+ menunjukkan hilangnya molekul air, fragmen m/z 367 mengindikasikan pemutusan pada C11

fragmen m/z 300 mengindikasikan pemutusan pada rantai poliena di antara C15 dan C ’, fragmen m/z 221 mengindikasikan pemutusan pada rantai poliena C ’ yang juga teramati pada penelitian yang dilakukan oleh (Saini, Moon, Gansukh, & Keum, 2018) yang menandakan struktur cincin dengan gugus epoksida dan hidroksil. Fragmen ion khas pada m/z 221 juga dilaporkan dapat diamati pada golongan xantofil yang memiliki gugus epoksi terhidroksilasi (Schex et al., 2018), di antaranya seperti violaxanthin, capsanthin, dan juga 3–hidroksi-3'-okso-β,ε-karoten.



Tabel 1 Data kromatografi dan karakteristik spektroskopi massa karotenoid dari ekstrak total karotenoid minyak buah merah yang diperoleh dari UHPLC-HESI-MS/MS

Jenis karotenoid Waktu retensi

(menit) Rumus molekul [M+H]+ Fragmen ion (m/z)

(3S,5R,6R)-3,5-dihidroksi-6,7-didehidro-5,6-dihidro-12'-apo- β-karoten-12'-al

11.1871 C25H34O3 383.2565 365, 343, 227, 213, 195, 157, 145, 109, 105, 95, 67

10'-apo-beta-karotenal 18.464 C27H36O 377.2823 209, 197, 171, 121, 119, 109, 105, 95

(3S,3'S,5R,5'R,8'R,9'cis)-3'-metil-6,7-didehidro-5,5',6,8'-tetrahidro-5',8'-epoksi-β,β-karoten-3,5-diol

19.839 C41H58O3 599.4433 567, 405, 157, 145, 119, 107, 81

Phytoene 22.305 C40H64 545.5058 327, 229, 203, 149, 95, 81 3-Hidroksi-3'-okso-β,ε-karoten 22.910 C40H54O2 567.4197 535, 221, 157, 121, 109, 95, 81

Violaxanthin 22.454 C40H56O4 601.4230 583, 367, 300, 221, 165, 119, 109, 81

Gambar 1. Spektra massa dan struktur dari (3S,5R,6R)-3,5-dihidroksi-6,7-didehidro-5,6-dihidro-12'-apo-beta-karoten-12'-al

Gambar 2. Spektra massa dan struktur dari 10'-apo-beta-karotenal

m/z

Inte

nsi

tas

(10

6)

3 1

5

’ 7

’ ’ ’ ’ ’

1

3

5 3 5 7 9 11

13 15 1

m/z

Inte

nsi

tas

(10

3)


Warta IHP, 37(1),7-19

Halaman | 12


Gambar 3. Spektra massa dan struktur dari (3S,3'S,5R,5'R,8'R,9'cis)-3'-metil-6,7-didehidro-5,5',6,8'-tetrahidro-5',8'-epoksi-β,β-karoten-

3,5-diol

Gambar 4. Spektra massa dan struktur dari phytoene

Gambar 5. Spektra massa dan struktur dari 3-hidroksi-3'-okso-β,ε-karoten

m/z

Inte

nsi

tas

(10

6)

1 3 5 7 11 13 15 9

19

17 21

23

25

27

29

31

Inte

nsi

tas

(10

3)

13 15

15’

’ ’ ’ ’ ’ ’

’

’ ’

8’

1 3

5

7

9 11

16 17

18

m/z

m/z

1

3 5

’

’

7 9 11 13

’

’ 14

9’

’ ’ ’

Inte

nsi

tas

(10

3)



Gambar 6. Spektra massa dan struktur dari violaxanthin

Gambar 7. Kromatogram fraksinasi karotenoid minyak buah merah dengan flash column chromatography (FCC) (a) fraksi ke-16, (b) fraksi ke-51, (c) fraksi ke-81, (d) fraksi ke-84, (e) fraksi ke-103

3.2. Fraksinasi dengan Flash Column Chromatography

Flash kromatografi adalah bentuk cepat dari kromatografi kolom preparatif berdasarkan pada prinsip pendorongan fase gerak di dalam fase diam oleh tekanan udara di dalam suatu kolom yang relatif pendek (Huang et al., 2016). Senyawa dalam campuran memiliki kemampuan interaksi yang berbeda di dalam fase diam dan fase gerak, dengan demikian senyawa target akan mengalir sepanjang fase gerak pada interval waktu yang berbeda-beda. Dengan cara ini, pemisahan senyawa dari campuran tercapai (Bajpai, Majumder, & Park 2016). Masing-masing puncak senyawa dikumpulkan sebagai fraksi-fraksi dan dianalisis lebih lanjut.

Fraksinasi dengan menggunakan Flash Column Kromatografi seringkali digunakan untuk meningkatkan kemurnian karotenoid dengan cepat

sampai pada taraf yang diinginkan (Shibata, Ishihara, & Matsumoto, 2004). Untuk mendapatkan senyawa dengan kemurnian tinggi, diperlukan pemisahan secara berulang atau instrumen dengan yang lebih tinggi seperti KCKT semipreparatif dan preparatif (Queiroz et al., 2019).

Fraksinasi dilakukan pada fase normal dengan fase diam berupa silika gel dan fase gerak atau eluen berupa campuran heksana dan etil asetat dengan gradien kepolaran yang berbeda-beda. Gradien fase gerak dimulai dari tingkat kepolaran yang paling rendah yaitu heksana 100% menuju ke tingkat kepolaran yang paling tinggi yaitu etil asetat 100%. Tujuan dari fraksinasi ini adalah memisahkan karotenoid berdasarkan polaritasnya dan diperoleh profil kromatografi yang lebih sederhana. Fraksi-fraksi yang terkumpul melalui proses fraksinasi dengan Flash Column Chromatography terdiri atas 110 fraksi (Gambar 7).

m/z

Inte

nsi

tas

(10

6)

Sin

yal d

etek

tor

(AU

V)

Waktu

1.45 1.40 1.35 1.30 1.25 1.20 1.15 1.10 1.05 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.7 00:10:00 00:20:00 00:30:00 00:40:00 00:50:00 00:60:00 01:10:00 01:20:00

a

b c

d

e

c a

Citation: Fitria, E, Wulandari, N, Hariyadi, P, & Wijaya, H (2020) Identifikasi dan Fraksinasi Karotenoid pada Minyak Buah Merah (Pandanus

conoideus) Warta IHP, 37(1),7-19

Halaman | 14


3.3. Pengecekan fraksi dengan kromatografi cair kinerja tinggi

Fraksi-fraksi terpilih yang telah terkumpul melalui Flash Column Chromatography dianalisis dengan KCKT. Dilakukan pengecekan pada puncak-puncak yang melebihi ambang batas deteksi dari detektor yang digunakan. Fraksi-fraksi tersebut antara lain fraksi ke-16, fraksi ke-51, fraksi ke-81, fraksi ke-84, fraksi ke-86, dan fraksi ke-103.

Apabila dibandingkan dengan kromatogram ekstrak total karotenoid (Gambar 8), fraksi-fraksi terpilih memiliki profil kromatogram yang lebih sederhana (Gambar 9) meskipun belum didapatkan puncak senyawa tunggal. Pemilihan fraksi terbaik dilakukan berdasarkan pada profil kromatogram yang paling sederhana atau fraksi yang mampu memisahkan senyawa karotenoid paling baik di

antara fraksi-fraksi lainnya. Terlihat pada Gambar 9 bahwa fraksi ke-16 dan fraksi ke-103 merupakan fraksi dengan profil kromatografi paling sederhana dengan pemisahan terbaik dibandingkan fraksi terpilih lainnya apabila dilihat dari jumlah puncak yang dimiliki. Dua fraksi tersebut diduga terdapat golongan karotenoid yang berhasil terpisah dengan golongan karotenoid lain yang menggerombol.

Dua fraksi terpilih yaitu fraksi ke-16 selanjutnya disebut sebagai fraksi pertama dan fraksi ke-103 disebut dengan fraksi kedua. Dilakukan pemilihan fraksi terbaik dari fraksi-fraksi yang telah terkumpul untuk dilakukan identifikasi lebih lanjut dengan harapan profil kromatografi yang lebih sederhana akan mempermudah proses identifikasi sehingga diperoleh identitas senyawa karotenoid yang lebih beragam.

Gambar 8. Pengecekan dengan KCKT pada ekstrak total karotenoid

(a) (b)

Waktu (menit)

Inte

nsi

tas

(mV

)

Inte

nsi

tas

(mV

)

Waktu (menit)

Inte

nsi

tas

(mV

)

Waktu (menit)



(c) (d)

(e)

(f)

Gambar 9. Kromatogram pengecekan fraksi karotenoid dengan KCKT dengan (a) fraksi ke-16, (b) fraksi ke-51, (c) fraksi ke-81, (d)

fraksi ke-84, (e) fraksi ke-86, (f) fraksi ke-103

3.4. Identifikasi Karotenoid pada Fraksi Hasil

Fraksinasi

Karotenoid yang teridentifikasi pada fraksi kedua tertera pada Tabel 2. Terdapat dua senyawa karotenoid yang belum teridentifikasi pada ekstrak total karotenoid yaitu capsanthin dan kriptoxantin sedangkan tiga karotenoid lainnya juga teridentifikasi pada ekstrak total karotenoid.

Ion molekular yang terdeteksi pada m/z 584 sesuai dengan rumus molekul C40H56O3 yaitu capsanthin (Gambar 10). Capsanthin memiliki rantai panjang ikatan rangkap terkonjugasi dengan akhir satu atau dua gugus polar keton (Shah, Tian, Gong, & Arisha, 2014). Capsanthin adalah kappa-karotenoid yang merupakan karotenoid penciri pada genus Capsicum (Giuffrida et al., 2013). Fragmen m/z 221 mengindikasikan pemutusan pada rantai C11.

Senyawa karotenoid berikutnya adalah kriptoxantin dengan Ion molekular terprotonasi yang terdeteksi pada m/z 553 dan rumus molekul C40H56O (Gambar 11). Fragmen ion pada m/z 296 menandakan putusnya ikatan pada di antara C13 dan C14. Fragmen ion pada m/z 177 menandakan putusnya ikatan di antara C ’ dan C ’.

Belum teridentifikasi senyawa karotenoid pada fraksi pertama hal ini diduga disebabkan karena kombinasi fase gerak yang digunakan tidak mampu mengelusi golongan karotenoid yang lebih nonpolar atau waktu analisis yang kurang lama. Diprediksi pada frak i pertama ini mengandung α–karoten dan β–karoten apabila dilihat dari kesamaan waktu reten inya dengan tandar α–karoten dan standar β–karoten pada Gambar 12.

Waktu (menit)

Inte

nsi

tas

(mV

)

Waktu (menit)

Inte

nsi

tas

(mV

)

Waktu (menit)

Inte

nsi

tas

(mV

)

Waktu (menit)

Inte

nsi

tas

(mV

)

Citation: Fitria, E, Wulandari, N, Hariyadi, P, & Wijaya, H (2020) Identifikasi dan Fraksinasi Karotenoid pada Minyak Buah Merah (Pandanus

conoideus) Warta IHP, 37(1),7-19

Halaman | 16


Tabel 2 Data kromatografi dan karakteristik spektroskopi massa karotenoid dari fraksi kedua yang diperoleh dari UHPLC-HESI-MS/MS

Jenis karotenoid Waktu retensi

(menit) Rumus molekul [M+H]+ Fragmen ion (m/z)

(3S,5R,6R)-3,5-dihidroksi-6,7-didehidro-5,6-dihidro-12'-apo-beta-karoten-12'-al

11.771 C25H34O3 383.2566 365, 309, 213, 195, 157, 145, 109, 105, 95,67

Violaxanthin 17.554 C40H56O4 601.4238 583, 367, 300, 221, 165, 119, 109, 81

Capsanthin 18.537 C40H56O3 585.4291 221, 157, 119, 109, 81 3-hidroksi-3'-okso-beta,epsilon-karoten 18.673 C40H54O2 567.4187 535, 221, 157, 121, 95, 109, 81 Cryptoxanthin 22.091 C40H56O 553.4388 296, 177, 121, 119, 95 (3S,5R,6R)-3,5-dihidroksi-6,7-didehidro-5,6-dihidro-12'-apo-beta-karoten-12'-al

11.771 C25H34O3 383.2566 365, 309, 213, 195, 157, 145, 109, 105, 95,67

Gambar 10. Spektra massa dan struktur dari capsanthin

Gambar 11. Spektra massa dan struktur dari kriptoxantin

1 3

5

7 9 11 13 15

’ ’ ’ ’ ’

’ ’ ’ 16 17

18

’

’ 8’

m/z

Inte

nsi

tas

(10

3)

8’

7 9 11 13 15

’ ’ ’ ’ ’

3 5

1

16 17 ’ ’

’

’ ’

m/z

Inte

nsi

tas

(10

3)



Gambar 12. Kromatogram KCKT dari (a) fraksi pertama di- piked dengan tandar α-karoten dan tandar β-karoten, (b) campuran standar

α-karoten ppm dan tandar β-karoten 50 ppm, (c) fraksi pertama

4. Kesimpulan

Terdapat enam jenis karotenoid yang berhasil teridentifikasi pada ekstrak total karotenoid minyak buah merah antara lain (3S, 5R, 6R)-3,5-dihidroksi-6,7-didehidro-5,6-dihidro-12'-apo-β-karoten-12'-al, 10'-apo-beta-karotenal, (3S, 3'S, 5R, 5'R, 8'R, 9'cis)-3'-metil-6,7-didehidro-5,5',6,8'-tetrahidro-5',8'-epoksi-β,β-karoten-3,5–diol, phytoene, 3-hidroksi-3'-okso-β,ε-karoten, dan violaxanthin. Fraksinasi dengan menggunakan Flash Column Chromatography menghasilkan dua fraksi dengan tingkat pemisahan yang relatif baik yang akan dilakukan identifikasi lebih lanjut. Dari dua fraksi terpilih, berhasil diidentifikasi lima jenis karotenoid pada fraksi kedua yang termasuk di antaranya adalah capsanthin dan kriptoxanthin yang belum teridentifikasi pada ekstrak total karotenoid. Fraksi pertama yang belum teridentifikasi dengan LC– S S diduga mengandung α–karoten dan β-karoten apabila dilihat dari kesamaan waktu retensinya dengan standar.

Ucapan Terima Kasih

Ucapan terima kasih kami ucapkan kepada Balai Besar Industri Agro yang telah memfasilitasi mendanai penelitian ini.

Daftar Pustaka

Abate-Pella, D., Freund, D. M., Slovin, J. P., Hegeman, A. D., & Cohen, J. D. (2017). An improved method for fast and selective separation of carotenoids by LC–MS. Journal of

Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 1067, 34–37.

Achadiyani, Septiani, L., Faried, A., Bolly, H., & Kurnia, D. (2016). Role of the red fruit (Pandanus conoideus LAM) ethyl acetate fraction on the induction of apoptosis vs. downregulation of survival signaling pathways in cervical cancer cells. European Journal of Medicinal Plants, 13, 1–9.

Astirin, O. P., Harini, M., & Handajani, N. (2009). The effect of crude extract of Pandanus conoideus Lamb. var. yellow fruit on apoptotic expression of the breast cancer cell line (T47D). Biodiversitas, Journal of Biological Diversity, 10, 44–48.

Bajpai, V. K., Majumder, R., & Park, J. G. (2016). Isolation and purification of plant secondary metabolites using column-chromatographic technique. Bangladesh Journal of Pharmacology, 11, 844–848.

Bozalan, N. K., & Karadeniz, F. (2011). Carotenoid profile, total phenolic content, and antioxidant activity of carrots. International Journal of Food Properties, 14, 1060–1068.

Ea, M. H., & Octivia, T. (2012). Eksplorasi dan konservasi tanaman buah merah (Pandanus conoideus) dalam upaya pengelolaan sumber daya genetik yang berkelanjutan. Lokakarya Nasional Pengelolaan dan Perlindungan Sumber Daya Genetik Di Indonesia: Manfaat Ekonomi Untuk Mewujudkan Ketahanan Nasional, 81–92.

Giuffrida, D., Dugo, P., Torre, G., Bignardi, C., Cavazza, A., et al. (2013). Characterization of 12 Capsicum varieties by evaluation of their

Waktu (menit)

Inte

nsi

tas

(mV

)

a

b c


Warta IHP, 37(1),7-19

Halaman | 18


carotenoid profile and pungency determination. Food Chemistry, 140, 794–802.

Huang, Y.-Y., Liu, X.-F., Liu, J.-Z., Li, L., Cui, Q., Wang, L.-T., et al. (2016). Separation and purification of indigotin and indirubin from Folium isatidis extracts using a fast and efficient macroporous resin column followed reversed phase flash chromatography. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 67, 61–68.

Khiong, K., Adhika, O. A., & Chakravitha, M. (2009). Inhibition of NF-κ pathway a the therapeutic potential of red fruit (Pandanus conoideus Lam.) in the treatment of inflammatory bowel disease. Jkm, 9, 69–75.

Lu, Q., Huang, X., Lv, S., & Pan, S. (2017). Carotenoid profiling of red navel orange “Cara Cara” harvested from five regions in China. Food Chemistry, 232, 788–798.

Meléndez-Martínez, A. J., Mapelli-Brahm, P., Benítez-González, A., & Stinco, C. M. (2015). A comprehensive review on the colorless carotenoids phytoene and phytofluene. Archives of Biochemistry and Biophysics, 572, 188–200.

Mendelová, A., Fikselová, M., & Mendel, L. (2013). Carotenoids and lycopene content in fresh and dried tomato fruits and tomato juice. Acta Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis, 61, 1329–1337.

Muhammad, Choong, T. S., Chuah, T. G., Yunus, R., & Yap, Y H T Ad orption of β-carotene onto mesoporous carbon coated monolith in isopropyl alcohol and n-hexane olution : equilibrium and thermodynamic study. Chemical Engineering Journal, 164, 178–182.

Queiroz, E. F., Alfattani, A., Afzan, A., Marcourt, L., Guillarme, D., et al. (2019). Utility of dry load injection for an efficient natural products isolation at the semi-preparative chromatographic scale. Journal of Chromatography A, 1598, 85–91.

Rodrigues, E., Mariutti, L. R. B., & Mercadante, A. Z. (2012). Scavenging capacity of marine carotenoids against reactive oxygen and nitrogen species in a membrane-mimicking system. Marine Drugs, 10, 1784–1798.

Rodriguez-Concepcion, M., Avalos, J., Bonet, M. L., Boronat, A., Gomez-Gomez, L., Hornero-Mendez, D., et al. (2018). A global perspective on carotenoids: Metabolism, biotechnology, and benefits for nutrition and health. Progress in Lipid Research, 70, 62–93.

Rohman, A., Riyanto, S., Yuniarti, N., Saputra, W. R., Utami, R., et al. (2010). Antioxidant activity, total phenolic, and total flavaonoid of extracts and fractions of red fruit (Pandanus conoideus Lam). International Food Research Journal, 17, 97–106.

Rohman, A., & Windarsih, A. (2018). Characterization, biological activities, and authentication of red fruit (Pandanus conoideus Lam) oil. Food Research, 2, 134–138.

Saini, R. K., Moon, S. H., Gansukh, E., & Keum, Y. S. (2018). An efficient one-step scheme for the purification of major xanthophyll carotenoids from lettuce, and assessment of their comparative anticancer potential. Food Chemistry, 266, 56–65.

Sartori, A. G. de O., & Silva, M. V. da. (2014). Main food sources of carotenoids, according to the purpose and degree of processing, for eneficiarie of the “ ol a amília” in Brazil. Food Science and Technology (Campinas), 34, 408–415.

Sarungallo, Z. L., Hariyadi, P., Andarwulan, N., & Purnomo, E. H. (2015). Characterization of chemical properties, lipid profile, total phenol and tocopherol content of oils extracted from nine clones of red fruit (Pandanus conoideus). Kasetsart Journal - Natural Science, 49, 237–250.

Sarungallo, Z. L., Hariyadi, P., Andarwulan, N., Purnomo, E. H., & Wada, M. (2015). Analysis of α-Cryptoxanthin, β-Cryptoxanthin, α -Carotene, and β-Carotene of Pandanus Conoideus Oil by High-performance Liquid Chromatography (HPLC). Procedia Food Science, 3, 231–243.

Sarungallo, Z. L., Murtiningrum, & Santoso. (2016). Nutrient content of three clones of red fruit ( Pandanus conoideus ) during the maturity development. 23, 1217–1225.

Schex, R., Lieb, V. M., Jiménez, V. M., Esquivel, P., Schweiggert, R. M., et al. (2018). HPLC-DAD-APCI/ESI- Sn analy i of carotenoid and α-tocopherol in Costa Rican Acrocomia aculeata fruits of varying maturity stages. Food Research International, 105, 645–653.

Shah, S. N. M., Tian, S.-L., Gong, Z.-H., & Arisha, M. H. (2014). Studies on metabolism of capsanthin and its regulation under different conditions in pepper fruits (Capsicum spp.). Annual Research & Review in Biology, 4, 1106–1120.

Shibata, S., Ishihara, C., & Matsumoto, K. (2004). Improved separation method for highly purified lutein from Chlorella powder using jet mill and flash column chromatography on silica gel. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 6283–6286.

Tambaip, T., Karo, M. B., & Hatta, M. (2018). Immunomodulatory effect of orally red fruit (Pandanus conoideus) extract on the expression of cc chemokine receptor 5 mrna in HIV patients with antiretroviral therapy. Res. J. Immunol., 11, 15–21.

Tih, F. (2016). Aktivitas sitotoksik minyak buah



merah (Pandanus conoideus Lam.) dan inhibisi ekspresi gen siklooksigenase-2 (COX-2) pada sel raji. Journal of Medicine and Health, 1, 214–223.

Wijaya, H., Wardayanie, N. I. A., Astuti, R. M., & Arif, R 8 I ola i enyawa β-karoten dari minyak kelapa sawit mentah (Elaeis guineensis

Jacq.) dengan metode kromatografi kolom terbuka. Warta Industri Hasil Pertanian, 35, 74.

Xia, N., Schirra, C., Hasselwander, S., Förstermann, U., & Li, H. (2018). Red fruit (Pandanus conoideus Lam) oil stimulates nitric oxide production and reduces oxidative stress in endothelial cells. Journal of Functional Foods, 51, 65–74.

Documents

Identifikasi dan Fraksinasi Karotenoid pada Minyak Buah