IDENTIFIKASI SENYAWA FRAKSI I EKSTRAK n-HEKSANA DAUN ... · daun binahong dan (b ) fraksi I kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daun binahong..... 45 Tabel III. Hasil KLT senyawa

IDENTIFIKASI SENYAWA FRAKSI I EKSTRAK n-HEKSANA DAUN BINAHONG(Anredera cordifolia (Ten.) Steenis)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Wilfrida Maria Du’a

NIM : 088114071

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA2012


SKRIPSI



Oleh:


NIM : 088114071


YOGYAKARTA2012


SKRIPSI



Oleh:


NIM : 088114071


YOGYAKARTA2012

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

IDENTIFIKASI SENYAWA FRAKSI I EKSTRAK n-HEKSANA DAUNBINAHONG (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis)

SKRIPSI



Oleh:


NIM : 088114071


YOGYAKARTA2012

i


SKRIPSI



Oleh:


NIM : 088114071


YOGYAKARTA2012

i


SKRIPSI



Oleh:


NIM : 088114071


YOGYAKARTA2012


ii


iii


iv

Berpikirlah bahwa kita tidak ingin menjadi seperti ini agar kelak kita tidak

akan melakukan kesalahan yang sama

tetap lakukan apa yg bisa kita lakukan sekarang seperti yang kita mau

aku ada, aku berdiri, aku bisa terus berjuang dengan semangat dan tidak menyerah pada

keadaan karena ada banyak kasih yang senantiasa memelukku dan aku tahu di belakangku

selalu ada doa dari orang-orang yang menyayangiku

papa


v


vi


vii

PRAKATA

Segala pujian dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan karena hanya

dengan anugerah, berkat, cinta, kasih, dan pertolongan-Nya, penulis dapat

menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul ”Identifikasi

Senyawa Fraksi I Ekstrak n-Heksana Daun Binahong (Anredera cordifolia

(Ten.) Steenis)”. Skripsi ini disusun guna memenuhi salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Farmasi (S.Farm).

Terselesaikannya penulisan laporan akhir ini tidak lepas dari bantuan

berbagai pihak, karena itu penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ibu Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si. selaku Dosen Pembimbing yang telah

memberikan petunjuk, saran, arahan, dan bimbingan kepada penulis dalam

proses penyusunan skripsi ini

2. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. dan Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt.

selaku Dosen Penguji skripsi yang telah memberikan saran dan masukan

demi kesempurnaan skripsi ini

3. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan dan segenap staf serta

karyawan Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta

4. Ma’Epa, teman seperjuangkanku yang telah dengan sabar menghadapi semua

kemalasanku, mendukung dan menyemangati aku selama masa-masa galau

bersama di lab.

5. Unyil dan Pitoeng yang mau-maunya dengerin semua keluhanku.


viii

6. Kawan-kawan seperjuangan di lab: Paul, Hepy, Adi, Pandu, Aldosa, Valent,

Novie, Ike, Usi, Satya, Sasa, Vica, Dimbek, Seco, Yuni, Elisa, dan Brian atas

kerja sama, kebersamaan dan keceriaan di lab selama proses penelitian ini

7. Seluruh teman-teman farmasi, khususnya kelas B angkatan 2008 dan FST A

2008 yang telah banyak berbagi keceriaan dan kesedihan

8. Nenek, Tante, Ma Heny, Tanta Ratna, Om Bruno, Kugu, Steve, Ceci, Ka Ibet,

Enenk, Metonk, Indah, Boge, Ma’u, Yelly, Putri , dan semua keluarga yang

selalu jadi saya punya semangat dan jadi obat waktu saya rindu rumah

9. “Cika-cika muah”: Rodhu, Giting dan Lombok yang selalu dukung beta

dengan besong pung cara masing-masing. Sayang besong buanyak2 :-*

10. Papao, yang setelah marah-marah karena beta ngawur tulis skripsweet tapi

terus rasa bersalah dan minta maaf

11. Huluk, Ivon, Nitha, Itin, Cumy, Liany, Stefi, Lina, Kaco-kaco, Tikus Klapa,

Anak Pelangi, Komunitas Sant’ Egidio

12. Serta semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini yang

tidak dapat disebutkan satu per satu

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih banyak kekurangan

dan kelemahan karena keterbatasan pikiran, tenaga, dan waktu penulis. Untuk itu

penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Akhir

kata semoga skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi pembaca semua.

Yogyakarta, 6 Juni 2012

Penulis


ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL.............................................................................. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN................................................................ iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................ iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................ v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA

ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ............................... vi

PRAKATA............................................................................................. vii

DAFTAR ISI.......................................................................................... ix

DAFTAR TABEL.................................................................................. xiv

DAFTAR GAMBAR ............................................................................. xvi

DAFTAR LAMPIRAN.......................................................................... xix

INTISARI............................................................................................... xx

ABSTRACT ............................................................................................. xxi

BAB I PENGANTAR............................................................................ 1

A. Latar Belakang ................................................................................. 1

1. Permasalahan.............................................................................. 4

2. Keaslian penelitian ..................................................................... 4

3. Manfaat penelitian...................................................................... 5

B. Tujuan Penelitian ............................................................................. 6


x

1. Tujuan umum ............................................................................. 6

2. Tujuan khusus ............................................................................ 6

BAB II PENELAHAAN PUSTAKA..................................................... 7

A. Tanaman Binahong ......................................................................... 7

B. Ekstraksi.......................................................................................... 9

1. Ekstraksi dengan alat sokhlet ..................................................... 9

2. Ekstraksi secara perkolasi .......................................................... 9

3. Ekstraksi secara maserasi ........................................................... 10

4. Ekstraksi secara refluks .............................................................. 10

5. Ekstraksi secara penyulingan ..................................................... 11

C. Skrining Fitokimia .......................................................................... 11

1. Alkaloid ...................................................................................... 11

2. Flavonoid.................................................................................... 12

3. Tanin........................................................................................... 13

4. Saponin....................................................................................... 14

5. Terpenoid ................................................................................... 14

6. Steroid ........................................................................................ 15

D. Isolasi .............................................................................................. 15

1. Kromatografi .............................................................................. 15

E. Elusidasi Struktur............................................................................ 18

1. Spektroskopi ............................................................................... 17

F. Landasan Teori................................................................................ 23

G. Hipotesis............................................................................................ 24


xi

BAB III METODE PENELITIAN......................................................... 25

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...................................................... 25

B. Variabel dan Defenisi Operasional ................................................. 25

1. Variabel penelitian ..................................................................... 25

2. Defenisi operasional ................................................................... 25

C. Bahan Penelitian ............................................................................. 26

D. Alat Penelitian................................................................................. 27

E. Tata Cara Penelitian ........................................................................ 27

1. Determinasi tanaman binahong .................................................. 27

2. Preparasi sampel......................................................................... 27

3. Uji pandahuluan ......................................................................... 28

4. Optimasi fase gerak 1 ................................................................. 33

5. Kromatografi kolom 1 ................................................................ 33

6. Kromatografi lapis tipis 1........................................................... 34

7. Kromatografi kolom 2 ................................................................ 34


9. Optimasi fase gerak 2 ................................................................. 35

10. Kromatografi lapis tipis preparatif ............................................. 36


12. Spektroskopi UV/Vis ................................................................. 37

13. GC-MS ....................................................................................... 37

14. Spektroskopi inframerah ............................................................ 38


xii

H. Analisis Data ................................................................................... 38

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................... 39

A. Determinasi Tanaman Binahong..................................................... 39

B. Preparasi Sampel............................................................................. 39

C. Ekstraksi Sampel............................................................................. 41

D. Uji Pendahuluan.............................................................................. 42

1. Alkaloid....................................................................................... 43

2. Flavonoid .................................................................................... 46

3. Tanin ........................................................................................... 48

4. Saponin ....................................................................................... 50

5. Triterpenoid dan steroid .............................................................. 51

E. Optimasi Fase Gerak 1.................................................................... 53

F. Kromatografi Kolom 1.................................................................... 55

G. Kromatografi Lapis Tipis 1............................................................. 55

H. Kromatografi Kolom 2.................................................................... 57

I. Kromatografi Lapis Tipis 2............................................................. 57

J. Optimasi Fase Gerak 2.................................................................... 58

K. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif ............................................... 61

L. Kromatografi Lapis Tipis 3............................................................. 62

M. Spektroskopi UV/Vis ...................................................................... 63

N. GC-MS............................................................................................ 65

O. Spektroskopi Inframerah................................................................. 78

P. Analisis Hasil .................................................................................. 80


xiii

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN................................................. 81

A. Kesimpulan ..................................................................................... 81

B. Saran ............................................................................................... 81

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................ 82

LAMPIRAN........................................................................................... 84

BIOGRAFI PENULIS ........................................................................... 101


xiv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Hasil uji pendahuluan ekstrak n-heksana daun binahong. 43

Tabel II. Hasil KLT senyawa alkaloid dalam (a) ekstrak n-heksana

daun binahong dan (b) fraksi I kromatografi kolom 2

ekstrak n-heksana daun binahong ..................................... 45

Tabel III. Hasil KLT senyawa flavonoid dalam (a) ekstrak n-

heksana daun binahong dan (b)fraksi I kromatografi

kolom 2 ekstrak n-heksana daun binahong....................... 47

Tabel IV. Hasil KLT senyawa triterpenoid dan steroid dalam (a)

ekstrak n-heksana daun binahong dan (b) fraksi I

kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daun binahong . 52

Tabel V. Hasil KLT ekstrak n-heksana daun binahong dengan

fase diam silika gel dan fase gerak asetonitril; n-

heksana; kloroform; kloroform : metanol (1:1); dan

metanol............................................................................... 54

Tabel VI. Hasil KLT fraksi I kromatografi kolom 1 dengan fase

diam silika gel dan fase gerak a. kloroform; b.

kloroform : metanol (1:1); c. metanol................................ 56

Tabel VII. Hasil KLT fraksi I kromatografi kolom 2 ekstrak n-

heksana daun binahong dengan fase diam silika gel dan

fase gerak a. kloroform; b. kloroform : metanol (1:1); c.

metanol............................................................................... 58


xv

Tabel VIII. Hasil KLT fraksi I kromatografi kolom 2 ekstrak n-



metanol............................................................................... 60

Tabel IX. Hasil KLT fraksi I kromatografi kolom 2 ekstrak n-



metanol............................................................................... 62

Tabel X. Hasil spektrum MS senyawa yang diisolasi dari

ekstrak n-heksana daun binahong ..................................... 73


xvi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Kromatografi kolom ......................................................... 16

Gambar 2. Reaksi antara alkaloid dan reagen Mayer ......................... 43

Gambar 3. Hasil KLT ekstrak n-heksana ekstrak daun binahong dan

fraksi 1 kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daun

binahong dengan a. pereaksi Dragendorff; b. asam sulfat 45

Gambar 4. Reaksi pembentukan warna antara flavonoid

dengan logam magnesium (Mg) ....................................... 46



binahong dengan pereaksi amonia .................................... 47

Gambar 6. Reaksi pembentukan warna antara tanin dengan

besi (III) klorida (FeCl3) ................................................... 49

Gambar 7. Reaksi pengendapan antara tanin dengan gelatin ............. 50



binahong dengan pereaksi Lieberman-Buncard................ 53

Gambar 9. Hasil KLT ekstrak n-heksana daun binahong dengan fase

gerak a. asetonitril; b. n-heksana; c. kloroform; d.

kloroform : metanol (1:1); e. metanol............................... 54

Gambar 10. Kromatografi kolom ekstrak n-heksana daun binahong

dengan fase diam silika gel dan fase gerak kloroform...... 55


xvii

Gambar 11. Hasil KLT fraksi I kromatografi kolom 1 ekstrak n-



metanol.............................................................................. 56

Gambar 12. Hasil KLT fraksi I kromatografi kolom 2 ekstrak n-



metanol.............................................................................. 58

Gambar 13. Hasil KLT fraksi I hasil kromatografi kolom 2 ekstrak n-


fase gerak kloroform : metanol; a. 15:1, b. 13:1, c. 11:1,

d. 9:1, e. 7:1, f. 5:1, g. 2:1, h. kloroform, i. 1:1, j.

metanol, k. 1:2, l. 1:3, m. 1:5, n. 1:9, dan o. 1:19 ............. 61

Gambar 14. Hasil KLT preparatif dengan fase gerak

kloroform : metanol 1:19 .................................................. 61

Gambar 15. Hasil KLT dengan fase gerak a. kloroform;

b. kloroform : metanol (1:1); c. metanol........................... 62

Gambar 16. Spektrum UV/Vis fraksi I ekstrak n-heksana ................... 63

Gambar 17. Senyawa 1,2,8a-trimethyl-1,2,3,4,8,8a-

hexahydronaphthalene ...................................................... 64

Gambar 18. Spektrum MS peak 1 pada GC dengan Retention time

18,721menit ...................................................................... 65

Gambar 19. Fragmen hasil penyusunan ulang senyawa karbonil......... 66


xviii

Gambar 20. (a) keton; (b) potongan gugus metil; (c) metil

karboksilat; (d) metil etil ester .......................................... 66

Gambar 21. Fragmen hasil pemutusan (-OCH3)................................... 66


20,496menit ...................................................................... 67


20,728menit ...................................................................... 68


23,192menit ...................................................................... 69

Gambar 25. (a) ion 1-oktanol; (b) ion hasil pemutusan ion

1-oktanol dari dioktil adipat.............................................. 69

Gambar 26. Fragmen hasil pemutusan (-OC8H17)................................ 69


24,509menit ...................................................................... 70

Gambar 28. isobenzofuran-1,3-dione..................................................... 71

Gambar 29. Fragmen hasil pemutusan (-OC8H17 dan –C8H17)............. 71


25,505menit ...................................................................... 72


26,961menit ...................................................................... 72

Gambar 32. Spektrum IR fraksi I ekstrak n-heksana daun binahong ... 79


xix

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Determinasi Binahong

(Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) .............................. 85

Lampiran 2. Contoh Perhitungan Nilai Rf KLT ................................. 86

Lampiran 3. Spektrum UV/Vis ........................................................... 86

Lampiran 4. Kromatogram GC dan Spektrum MS............................. 88

Lampiran 5. Spektrum IR.................................................................... 100


xx

INTISARI

Tanaman binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) telah diketahuisecara turun-temurun sebagai tanaman obat di Indonesia dan berpotensi untukdijadikan bahan fitofarmaka. Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasisenyawa yang terdapat dalam fraksi I ekstrak n-heksana daun binahong khususnyasenyawa terpenoid, steroid dan asam lemak.

Metode penelitian dilakukan secara deskriptif eksperimental. Penelitianini diawali dengan melakukan maserasi pada daun binahong menggunakan pelarutn-heksana, skrining fitokimia, fraksinasi menggunakan kromatografi kolom danfraksi I hasil kromatografi kolom diisolasi menggunakan Kromatografi LapisTipis (KLT) preparatif. Hasil isolasi dinyatakan murni setelah hasil KLT yangdiperoleh menghasilkan satu bercak dengan harga Rf yang berbeda pada tiga fasegerak dengan kepolaran yang berbeda. Fase gerak yang dipilih adalah kloroform(IP=4,1), kloroform:metanol (1:1) (IP=4,6) dan metanol (IP=5,1). Senyawa yangterbukti murni secara KLT lalu dielusidasi strukturnya dengan menggunakanUV/Vis, GC-MS, dan IR. Dari hasil skrining fitokimia dan elusidasi struktur makadapat disimpulkan bahwa senyawa yang terdapat pada ekstrak n-heksana daunbinahong adalah senyawa golongan steroid, asam lemak (metil heksadekanoat,asam oleat, metil 16-metilheptadekanoat, dioktil adipat, dioktil ptalat) dan alkana(metil oktakosana dan tetratetrakontana).

Kata kunci : maserasi, binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis), steroid,asam lemak, UV/Vis, GC-MS, IR.


xxi

ABSTRACT

Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) has been known forgenerations as medicinal plants in Indonesia and potential to make anphytopharmaca. The study was conducted to identify the compounds contained in1st fraction on n-hexane extracts from binahong leaves especially terpenoid,steroids and fatty acids compounds.

The method of research conducted by experiment description. The firstphase of the study was carried out by maceration of binahong leaves using the n-hexane solvent, further identification of the compound, fractionation by columnchromatography and isolated by preparative Thin Layer Chromatography (TLC).The results revealed the pure isolation if the isolate obtained a single spot on TLCwith different Rf on the three mobile phases with different polarity. The selectedmobile phase was chloroform (IP = 4.1), chloroform: methanol (1:1) (IP = 4.6)and methanol (IP = 5.1). Compound which proved to be pure by TLC and itsstructure was identification using UV/Vis, GC-MS, and IR. From the results ofphytochemical screening and identification of the structure it can be concludedthat the compounds contained in extracts of n-hexane from binahong leaves aresteroids, fatty acids (methyl hexadecanoate, oleic acid, methyl 16-methylheptadecanoate, dioctyl adipate, dioctyl phthalate) and alcane (octacosanedan tetratetracontane).

Keywords: maceration, binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis), steroids,fatty acids, UV/Vis, GC-MS, IR.


1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Sejak dahulu manusia telah menggunakan tanaman sebagai bahan obat

secara tradisional yang berfungsi untuk menjaga kesegaran tubuh, mencegah

penyakit, mengurangi rasa sakit, menyembuhkan penyakit, bahkan untuk

mempercantik diri. Salah satu tanaman yang biasa dijadikan sebagai bahan obat

ialah tanaman binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis). Tanaman ini

memiliki potensi yang sangat besar untuk dijadikan bahan fitofarmaka mengingat

manfaatnya yang banyak digunakan untuk mengobati berbagai macam penyakit.

Penggunaan tanaman binahong biasanya dengan langsung mengunyah daun

binahong, merebusnya, mencampurkan daun binahong dengan makanan lain

seperti ketika membuat mie serta dengan dibuat dalam bentuk jus. Secara

tradisional tanaman binahong telah digunakan untuk menyembuhkan sakit batuk,

muntah darah, penyakit paru-paru, diabetes melitus, radang ginjal, ambeien,

disentri, gusi berdarah, luka paska operasi dan melahirkan, jerawat, luka akibat

kecelakaan, luka bakar, meningkatkan vitalitas pria, menjaga stamina, serta

menurunkan kolesterol (Manoi, 2009). Namun belum dilakukan uji praklinis dan

klinis untuk membuktikan khasiat tanaman binahong tersebut.

Melihat begitu banyak khasiat binahong sebagai tanaman obat maka

banyak dilakukan penelitian terhadap senyawa metabolit sekunder yang terdapat

dalam tanaman binahong dengan skrining fitokimia untuk mengetahui golongan

senyawa metabolit sekunder yang bertanggung jawab terhadap khasiat tanaman


2

binahong sebagai bahan obat. Golongan senyawa metabolit sekunder yang

terdapat pada tanaman binahong antara lain steroid (Barboza, Cantero, Nunez,

Pacciaroni, and Espinar, 2009). Dalam jurnal ini dikatakan bahwa tanaman

binahong memiliki aktivitas biologi sebagai antibakteri dengan menggunakan

daun yang telah dikeringkan dan secara tradisional, daun kering tanaman

binahong digunakan sebagai antineuralgik, eye washes, neonatal dan paediatries

care, serta untuk perawatan kulit (jamur, kutil, gigitan serangga, gatal-gatal dan

iritasi). Dalam jurnal lain (Fai and Tao, 2009) dikemukakan bahwa tanaman

binahong mengandung asam oleanolat dan saponin, serta asam ursolat (Wibisono,

2010) yang telah ditetapkan kadarnya dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

fase terbalik. Berdasarkan hasil penelitian pendahuluan Universitas Gadjah Mada,

dinyatakan bahwa pada kultur in vitro daun binahong terkandung senyawa aktif

flavonoid, alkaloid, terpenoid, dan saponin (Manoi, 2009). Hasil uji pendahuluan

yang dilakukan oleh Khunaifi (2010) pada ekstrak etil asetat daun binahong

menunjukkan adanya alkaloid, flavonoid, dan polifenol, sedangkan menurut

Arisandi dan Andriani (2006) dikatakan bahwa daun tanaman binahong memiliki

kandungan kimia berupa γ-glucan, karoten, asam organik, mukopolisakarida dan

asam aldonat, juga mengandung saponin, vitamin A, B, dan C.

Selain kandungan metabolit sekunder, telah dilakukan juga uji efek

farmakologi yang dilakukan antara lain uji aktivitas antibakteri ekstrak daun

binahong terhadap bakteri staphylococcus aureus dan pseudomonas aerugino

(Khunaifi, 2010), uji aktivitas antimikroba ekstrak n-heksana dan fraksi terpenoid

tanaman Anredera cordifolia (Ten.) Steenis terhadap Staphylococcus aureus,


3

Eschericia coli dan Candida albicans (Arisadsita, 2010), uji efek tonikum infusa

daun binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) pada mencit putih (Mus

musculus) jantan galur Swiss Webster (Asriani, 2011), uji efektivitas ekstrak daun

binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis.) sebagai antibakteri Salmonella

typhi penyebab tifus (Kurniati, 2011), dan uji aktivitas penangkap radikal ekstrak

petroleum eter, etil asetat dan etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Ten.)

Stenis) dengan metode DPPH (2,2-difenil-1- pikrihidrazil) (Handayani, 2009).

Dilihat dari penggunaanya secara tradisional, senyawa metabolit

sekunder dan uji efek farmakologi maka tanaman binahong berpotensi sangat

besar untuk dijadikan bahan fitofarmaka. Potensi ini khususnya terkait dengan

kegunaannya secara tradisional untuk meningkatkan stamina dan vitalitas pria

yang berhubungan dengan kandungan metabolit sekunder berupa senyawa

golongan sterid yang belum banyak ditemukan pada tanaman lain serta uji

farmakologi berupa efek tonikum. Karena itu, pada penelitian ini akan digunakan

pelarut yang bersifat nonpolar untuk proses ekstraksi agar senyawa streroid yang

bersifat nonpolar akan ikut terekstrak. Namun, karena terdapat banyak senyawa

lain yang terkandung dalam tanaman binahong maka yang terdapat dalam ekstrak

bukan hanya senyawa metabolit sekunder golongan steroid tetapi terdapat juga

golongan terpenoid dan asam lemak yang bersifat nonpolar.

Seluruh bagian dari tanaman binahong ini dapat digunakan sebagai bahan

obat, namun bahan yang paling sering digunakan dalam penelitian adalah bagian

daun tanaman karena mudah diperoleh dan dibersihkan serta memiliki

kemampuan sebagai bahan obat yang baik.


4

Pada penelitian ini, daun tanaman binahong yang telah dikeringkan akan

dimaserasi dengan menggunakan n-heksana, kemudian akan dilakukan fraksinasi

dengan sistem kromatografi kolom serta KLT preparatif dan struktur dari senyawa

tersebut akan diketahui dengan spektrometri UV/Vis, GC-MS dan IR.

1. Permasalahan

a. Berdasarkan skrining fitokimia, senyawa golongan apakah yang

terkandung dalam fraksi I ekstrak n-heksana daun binahong?

b. Berdasarkan analisis spektroskopi, senyawa apakah yang terkandung

dalam fraksi I ekstrak n-heksana daun binahong?

2. Keaslian penelitian

Penelitian terhadap tanaman binahong telah banyak dilakukan, namun

penelitian ini hanya berkisar pada skrining fitokimia untuk mengetahui golongan

senyawa metabolit sekunder dan uji efek farmakologi dari tanaman binahong

tetapi belum diketahui secara spesifik senyawa kimia apa dari golongan metabolit

sekunder yang telah terbukti ada pada tanaman binahong ini.

Golongan senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada tanaman

binahong antara lain steroid (Barboza, Cantero, Nunez, Pacciaroni, and Espinar,

2009). Dalam jurnal ini dikatakan bahwa tanaman binahong memiliki aktivitas

biologi sebagai antibakteri dengan menggunakan daun yang telah dikeringkan dan

secara tradisional, daun kering tanaman binahong digunakan sebagai

antineuralgik, eye washes, neonatal dan paediatries care, serta untuk perawatan

kulit (jamur, kutil, gigitan serangga, gatal-gatal dan iritasi). Dalam jurnal lain (Fai

and Tao, 2009) dikemukakan bahwa tanaman binahong mengandung asam


5

oleanolat dan saponin, serta asam ursolat (Wibisono, 2010) yang telah ditetapkan

kadarnya dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi fase terbalik. Berdasarkan

hasil penelitian pendahuluan Universitas Gadjah Mada, dinyatakan bahwa pada

kultur in vitro daun binahong terkandung senyawa aktif flavonoid, alkaloid,

terpenoid, dan saponin (Manoi, 2009). Hasil uji pendahuluan yang dilakukan oleh

Khunaifi (2010) pada ekstrak etil asetat daun binahong menunjukkan adanya

alkaloid, flavonoid, dan polifenol, sedangkan dari menurut Arisandi dan Andriani

(2006) dikatakan bahwa daun tanaman binahong memiliki kandungan kimia

berupa γ-glucan, karoten, asam organik, mukopolisakarida, asam aldonat, juga

mengandung saponin, vitamin A, B, dan C.

Uji efek farmakologi yang dilakukan antara lain uji aktivitas antibakteri

ekstrak daun binahong terhadap bakteri staphylococcus aureus dan pseudomonas

aerugino (Khunaifi, 2010), uji aktivitas antimikroba ekstrak n-heksana dan fraksi

terpenoid tanaman binahong terhadap Staphylococcus aureus, Eschericia coli dan

Candida albicans (Arisadsita, 2010), uji efek tonikum infusa daun binahong pada

mencit putih (Mus musculus) jantan galur Swiss Webster (Asriani, 2011), uji

efektivitas ekstrak daun binahong sebagai antibakteri Salmonella typhi penyebab

tifus (Kurniati, 2011), dan uji aktivitas penangkap radikal ekstrak petroleum eter,

etil asetat dan etanol daun binahong dengan metode DPPH (2,2-difenil-1-

pikrihidrazil) (Handayani, 2009).

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, maka peneliti

ingin mengisolasi senyawa steroid yang dapat berfungsi untuk meningkatkan

imunitas dan dapat dikatakan meruuakan salah satu senyawa yang bertanggung


6

jawab terhadap efek farmakologis sebagai efek tonikum. Karena itu perlu

dilakukan penelitian lebih lanjut dengan skrining fitokimia untuk mencari

kandungan senyawa hasil isolasi dan identifikasi dengan metode spektroskopi

untuk mengetahui struktur senyawa kimia dalam tanaman binahong.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis. Mendapatkan informasi sebagai data kimia, metabolit

sekunder yang terkandung dalam daun tanaman binahong.

b. Manfaat metodologis. Mendapatkan informasi mengenai metode yang

digunakan untuk melakukan fraksinasi dan identifikasi senyawa kimia

dalam fraksi I ekstrak n-heksana daun binahong.

c. Manfaat praktis. Mengetahui kandungan senyawa kimia dalam fraksi I

ekstrak n-heksana daun binahong sehingga tanaman binahong dapat

dikembangkan menjadi suatu fitofarmaka.

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum

Mendukung memberikan informasi tentang aktifitas tanaman binahong

berdasarkan senyawa kimia yang terkandung di dalamnya.

2. Tujuan khusus

Mengetahui golongan senyawa metabolit sekunder yang terkandung

dalam ekstrak fraksi I n-heksana daun binahong dengan skrining fitokimia dan

mengidentifikasinya senyawa kimia tersebut dengan metode spektroskopi.


7

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Binahong

Binahong berupa tumbuhan menjalar, berumur panjang (perenial), bisa

mencapai panjang ± 5m. Akar berbentuk rimpang, berdaging lunak. Batang lunak,

silindris, saling membelit, berwarna hijau, bagian dalam solid, permukaan halus,

kadang membentuk semacam umbi yang melekat di ketiak daun dengan bentuk

tak beraturan dan bertekstur kasar. Daun tunggal, bertangkai sangat pendek

(subsessile), tersusun berseling, berwarna hijau, bentuk jantung (cordata), panjang

5-10cm, lebar 3-7cm, helaian daun tipis lemas, ujung runcing, pangkal berlekuk

(emerginatus), tepi rata, permukaan licin, bisa dimakan. Bunga majemuk

berbentuk tandan, bertangkai panjang, muncul di ketiak daun, mahkota berwarna

krem keputih-putihan berjumlah lima helai tidak berlekatan, panjang helai

mahkota 0,5-1cm, berbau harum. Perbanyakan generatif (biji), namun lebih sering

berkembang atau dikembangbiakan secara vegetatif melalui akar rimpangnya

(Manoi, 2009).

Klasifikasi tanaman binahong

Kingdom : Plantae (tumbuhan)

Subkingdom : Tracheobionta (tumbuhan berpembuluh)

Super Divisi : Spermatophyta (menghasilkan biji)

Divisi : Magnoliophyta (tumbuhan berbunga)

Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua/dikotil)

Sub Kelas : Hamamelidae


8

Ordo : Caryophyllales

Famili : Basellaceae

Genus : Anredera

Spesies : Anredera cordifolia (Ten.) Steenis

(Manoi, 2009).

Secara tradisional tanaman binahong telah digunakan untuk

menyembuhkan sakit batuk, muntah darah, penyakit paru-paru, diabetes melitus,

radang ginjal, ambeien, disentri, gusi berdarah, luka paska operasi dan

melahirkan, jerawat, luka akibat kecelakaan, luka bakar, meningkatkan vitalitas

pria, menjaga stamina, serta menurunkan kolesterol. Cara penggunaan tanaman

binahong sebagai bahan obat biasanya dilakukan dengan langsung mengunyah

daun binahong, merebusnya, mencampurkan daun binahong dengan makanan lain

seperti ketika membuat mie serta dengan dibuat dalam bentuk jus (Manoi, 2009).

Golongan senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada tanaman

binahong berdasarkan penelitian yang telah dilakukan antara lain: steroid

(Barboza, dkk., 2009), asam oleanolat, saponin, dan asam ursolat (Wibisono,

2010), flavonoid, alkaloid, terpenoid dan saponin (Anonim, 2009), alkaloid,

flavonoid dan polifenol pada ekstrak etil asetat daun binahong (Khunaifi, 2010),

serta γ-glukan, karoten, asam organik, dan mukopolisakarida seperti L-arabinosa,

D-galaktosa, L-ramnosa, dan asam aldonat, juga saponin, vitamin A, B, dan C

pada daun binahong (Arisandi dan Andriani, 2006).


9

B. Ekstraksi

Ekstraksi adalah penyarian zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari

bagian tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut. Tujuan

ekstraksi bahan alam adalah untuk menarik komponen kimia yang terdapat pada

bahan alam. Ekstraksi ini didasarkan pada prinsip perpindahan massa komponen

zat ke dalam pelarut, dimana perpindahan mulai terjadi pada lapisan antar muka

kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut (Umi, 2011).

Jenis ekstraksi bahan alam yang sering dilakukan adalah ekstraksi secara

panas dengan cara refluks, penyulingan uap air dan dengan alat sokhlet, serta

ekstraksi secara dingin dengan cara maserasi dan perkolasi (Umi, 2011).

1. Ekstraksi dengan alat sokhlet

Ekstraksi ini merupakan ekstraksi secara berkesinambungan. Cairan

penyari dipanaskan sampai mendidih, uap penyari akan naik melalui pipa

samping, kemudian diembunkan oleh pendingin tegak. Cairan penyari turun untuk

menyari zat aktif dalam simplisia. Selanjutnya bila cairan penyari mencapai sifon,

maka seluruh cairan akan turun ke labu alas bulat dan terjadi proses sirkulasi.

Demikian seterusnya sampai zat aktif yang terdapat dalam simplisia tersari

seluruhnya yang ditandai jernihnya cairan yang lewat pada tabung sifon (Umi,

2011).

2. Ekstraksi secara perkolasi

Perkolasi dilakukan dengan cara membasahkan 10 bagian simplisia

dengan derajat halus yang cocok, menggunakan 2,5 bagian sampai 5 bagian cairan

penyari dimasukkan dalam bejana tertutup sekurang-kurangnya 3 jam. Massa


10

dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator dan ditambahkan cairan

penyari. Perkolator ditutup dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran dibuka

dengan kecepatan 1 ml permenit, sehingga simplisia tetap terendam. Filtrat

dipindahkan ke dalam bejana, ditutup dan dibiarkan selama 2 hari pada tempat

terlindung dari cahaya (Umi, 2011).

3. Ekstraksi secara maserasi

Maserasi dilakukan dengan cara memasukkan 10 bagian simplisia

dengan derajat halus yang cocok ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan

penyari 75 bagian, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari, terlindung dari cahaya

sambil diaduk sekali-kali setiap hari lalu diperas dan ampasnya dimaserasi

kembali dengan cairan penyari. Penyarian diakhiri setelah pelarut tidak berwarna

lagi, lalu dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan pada tempat yang tidak

bercahaya, setelah dua hari lalu endapan dipisahkan (Umi, 2011).

4. Ekstraksi secara refluks

Ekstraksi dengan cara ini pada dasarnya adalah ekstraksi

berkesinambungan. Bahan yang akan diekstraksi direndam dengan cairan penyari

dalam labu alas bulat yang dilengkapi dengan alat pendingin tegak, lalu

dipanaskan sampai mendidih. Cairan penyari akan menguap, uap tersebut akan

diembunkan dengan pendingin tegak dan akan kembali menyari zat aktif dalam

simplisia tersebut, demikian seterusnya. Ekstraksi ini biasanya dilakukan 3 kali

dan setiap kali diekstraksi selama 4 jam (Umi, 2011).


11

5. Ekstraksi secara penyulingan

Penyulingan dapat dipertimbangkan untuk menyari serbuk simplisia yang

mengandung komponen kimia yang mempunyai titik didih yang tinggi pada

tekanan udara normal, yang pada pemanasan biasanya terjadi kerusakan zat

aktifnya. Untuk mencegah hal tersebut, maka penyari dilakukan dengan

penyulingan (Umi, 2011).

C. Skrining Fitokimia

Salah satu pendekatan untuk penelitian tumbuhan obat adalah

penampisan senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman. Cara ini digunakan

untuk mendeteksi senyawa tumbuhan berdasarkan golongannya. Sebagai

informasi awal dalam mengetahui senyawa kimia apa yang mempunyai aktivitas

biologi dari suatu tanaman (Umi, 2011).

1. Alkaloid

Alkaloid, sekitar 5500 telah diketahui, merupakan zat tumbuhan

sekunder yang terbesar. Pada umumnya alkaloid mencakup senyawa bersifat basa

yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan,

sebagai bagian dari sistem siklik. Alkaloid sering kali beracun bagi manusia dan

banyak yang mempunyai kegiatan fisiologi yang menonjol; jadi digunakan secara

luas dalam bidang pengobatan. Alkaloid biasanya tidak berwarna, sering kali

bersifat optis aktif, kebanyakan berbentuk kristal tetapi hanya sedikit yang berupa

cairan pada suhu kamar. Uji sederhana, tetapi sama sekali tidak sempurna, untuk

alkaloid dalam daun atau buah segar adalah rasa pahitnya di lidah (Harborne,

1987).


12

Secara umum, golongan senyawa alkaloid mempunyai sifat-sifat sebagai

berikut:

I. Biasanya berupa kristal tak berwarna, tidak mudah menguap, tidak larut

dalam air, larut dalam pelarut-pelarut organik seperti etanol, eter dan

kloroform. Beberapa alkaloid (seperti koniina dan nikotina) berwujud cair

dan larut dalam air. Ada juga alkaloid yang berwarna, misalnya berberina

(kuning).

II. Bersifat basa; pada umumnya berasa pahit, bersifat racun, mempunyai efek

fisiologis serta optik aktif.

III. Dapat membentuk endapan dengan larutan asam fosfolframat, asam

fosfomolibdat, asam pikrat, kalium merkuriiodida, dan lain sebagainya. Dari

endapan-endapan ini, banyak juga yang memiliki bentuk kristal yang khusus

sehingga sangat bermanfaat dalam identifikasinya (Tobing, 1989).

2. Flavonoid

Semua flavonoid, menurut strukturnya, merupakan turunan senyawa

induk flavon yang terdapat berupa tepung putih pada tumbuhan primula, dan

semuanya mempunyai sejumlah sifat yang sama. Flavonoid terutama berupa

senyawa yang larut dalam air. Dapat diekstraksi dengan etanol 70% dan tetap ada

dalam lapisan air setelah ekstrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid

berupa senyawa fenol, karena itu warnanya berubah bila ditambah basa atau

amonia; jadi, mereka mudah dideteksi pada kromatogram atau dalam larutan

(Harborne, 1987).


13

Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi dan karena itu

menunjukan pita serapan kuat pada daerah spektrum UV dan spektrum tampak.

Flavonoid umumnya terdapat pada tumbuhan, terikat pada gula sebagai glikosida

dan aglikon flavonoid yang manapun mungkin terdapat dalam satu tumbuhan

dalam beberapa bentuk kombinsi glikosida. Flavonoid terdapat pada semua

tumbuhan berpembuluh tetapi beberapa kelas lebih tersebar dari pada yang

lainnya (Harborne, 1987).

3. Tanin

Tanin terdapat luas dalam tumbuhan berpembuluh, dalam angiospermae

terdapat khusus dalam jaringan kayu. Menurut batasanya, tanin dapat bereaksi

dengan protein membentuk kepolumer mantap yang tidak larut dalam air. Dalam

industri, tanin adalah senyawa yang berasal dari tumbuhan, yang mampu

mengubah kulit hewan yang mentah menjadi kulit siap pakai karena

kemampuanya menyambung silang protein (Harbrorne, 1987).

Di dalam tumbuhan letak tanin terpisah dari protein dan enzim

sitoplasma, tetapi bila jaringan rusak, misalnya bila hewan memakanya, maka

reaksi penyamakan dapat terjadi. Reaksi ini menyebabkan protein lebih sukar

dicapai oleh cairan pencernaan hewan. Pada kenyataanya, sebagian besar

tumbuhan yang banyak bertanin dihindari oleh hewan pemakan tumbuhan karena

rasanya yang sepat. Kita menganggap salah satu fungsi utama tanin dalam

tumbuhan ialah sebagai penolak hewan pemakan tumbuhan (Harbrorne, 1987).

Secara kimia terdapat dua jenis utama tanin yang tersebar tidak merata

dalam dunia tumbuhan. Tanin terkondensasi hampir terdapat semesta di dalam


14

paku-pakuan dan gimnospermae, serta tersebar luas dalam angiospermae,

terutama pada jenis tumbuhan berkayu. Sebaliknya, tanin yang terhidrolisiskan

penyebaranya terbatas pada tumbuhan berkeping dua (Harborrne, 1987).

4. Saponin

Komponen surface-active ini terdistribusi secara luas pada tumbuhan dan

terdapat pada daun yang digunakan secara tradisional sebagai sabun. Saponin

tersusun dari residu gula yang memiliki gugus β-OH pada C3 dari C27-aglikon

yang berhubungan langsung dengan sapogenin (Mann, Davidson, Hobbs,

Banthorpe, and Harbone, 1994).

5. Terpenoid

Terpenoid mencakup sejumlah besar senyawa tumbuhan dan istilah ini

digunakan untuk menunjukan bahwa secara biosintesis semua senyawa tumbuhan

itu berasal dari senyawa yang sama. Jadi semua terpenoid berasal dari molekul

isoprena CH2═C(CH3)─CH═CH2 dan kerangka karbonnya dibangun oleh

penyambungan dua atau lebih satuan C5 ini. Kemudian senyawa itu dipilah-pilah

menjadi beberapa golongan berdasarkan jumlah satuan yang terdapat dalam

senyawa tersebut: dua (C10), tiga (C15), empat (C20), enam (C30), atau delapan

(C40) satuan. Terpenoid terdiri dari beberapa senyawa, mulai dari komponen

minyak atsiri, yaitu monoterpena dan siskuiterpena yang mudah menguap (C10

dan C15), diterpena yang lebih sukar menguap (C20), sampai ke senyawa yang

tidak menguap, yaitu triterpenoid dan sterol (C30). Masing-masing golongan

terpenoid itu penting, baik bagi pertumbuhan dan metabolisme maupun pada

ekologi tumbuhan (Harborne, 1987).


15

6. Steroid

Senyawa sederhana steroid dapat diartikan sebagai kelas senyawa

organik bahan alam yang kerangka strukturnya terdiri dari androstan

(siklopentanofenantren). Androstan adalah suatu sistem cincin tetrasiklik;

keempat cincinnya berturut-turut ditandai dengan A, B, C, dan D dan semua atom

C yang terdapat dalam struktur diberi nomor mulai dari 1 sampai dengan 19.

Sebagian besar dari steroid mempunyai sifat-sifat sebagai berikut:

I. mengandung gugus fungsi oksigen (sebagai = O atau –OH) pada C3

II. mengandung gugus sampai pada C17

III. banyak yang mengandung ikatan rangkap di antara C4-C5 atau C5-C6

(Tobing, 1989).

D. Isolasi

1. Kromatografi

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik di mana komponen-

komponen yang dipisahkan didistribusikan di antara dua fase, salah satu fase

tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya

sebagai fluida yang mengalir lembut di sepanjang landasan stasioner (Day and

Underwood, 2002).

a. Kromatografi kolom

Kromatografi cair yang dilakukan di dalam kolom besar

merupakan metode kromatografi terbaik untuk memisahkan campuran

dalam jumlah besar (lebih dari 1g). Fase diam dalam banyak kasus

pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fase gerak adalah molekul pelarut


16

yang mengisi ruang antar partikel yang teradsorbsi. Kolomnya (tabung

gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang

dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan ke dalam kolom.

Gambar 1. Kromatografi kolom (Gritter, Bobbitt, and Schwarting, 1991)

Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan

diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang berada di

dalam tabung kaca, tabung logam, atau bahkan tabung plastik. Larutan

sampel kemudian diisikan ke dalam kolom dari atas sehingga sampel

diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa gerak; pembawa)

ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut

berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa gerak) dan pelarut yang

teradsorbsi oleh adsorben (fasa diam). Selama perjalanan turun, zat

terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju

penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung

pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut

akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan dan masing-masing

lapisan dapat dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan

spesimen murninya. Metode ini merupakan contoh kromatografi elusi


17

karena senyawa yang akan dipisahkan, dielusi dari kolom (Gritter et al.,

1991).

b. Kromatografi lapis tipis

Pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya akan berupa lapisan

tipis (tebal 0,1-2mm) yang terdiri atas bahan padat yang dilapiskan

kepada permukaan penyangga datar yang biasanya terbuat dari kaca

tetapi dapat pula terbuat dari plat polimer atau logam dan fase geraknya

mengalir karena kerja kapiler. Lapisan fase diam akan melekat pada

permukaan dengan bantuan bahan pengikat, biasanya kalsium sulfat atau

amilum (pati) (Gritter et al., 1991).

Perilaku senyawa tertentu di dalam sistem KLT dinyatakan

dengan harga Rf. Angka ini diperoleh dengan membagi jarak yang

ditempuh oleh bercak eluen dengan jarak yang ditempuh oleh garis depan

pelarut. Keduanya diukur dari titik awal, dan harga Rf beragam mulai

dari 0 sampai 1 (Gritter et al., 1991).

Salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan

paling murah dan memakai peralatan paling dasar ialah Kromatografi

Lapis Tipis Preparatif (KLTP). Penjerap yang paling umum ialah silika

gel untuk campuran senyaa lipofil maupun hidrofil, dengan ketebalan

yang sering digunakan 0,5-2mm dan ukuran plat 20x20cm atau 20x40cm.

Pembatasan ketebalan dan ukuran pelat dapat mengurangi jumlah bahan

yang dapat dipisahkan dengan KLT (Hostettmann, Hostettmann, and

Marston, 1986).


18

Cuplikan yang ditotolkan harus berupa pita yang harus sesempit

mungkin karena pemisahan bergantung pada lebar pita. Konsentrasi

cuplikan harus sekitar 5-10%. Cuplikan 10-100mg dapat dipisahkan pada

lapisan silika gel atau aluminium oksida 20x20cm yang tebalnya 1mm.

Pilihan pelarut dapat ditentukan berdasarkan pemeriksaan pendahuluan

dengan memakai KLT analitik. Karena ukuran partikel penjerap kira-kira

sama, pelarut yan dipakai pada KLT analitik dapat langsung dipakai pada

KLTP. Fase gerak biner (dalam berbagai perbandingan) yang sering

digunakan pada pemisahan secara KLTP adalah n-heksana-etil asetat, n-

heksana-aseton, kloroform-metanol (Hostettmann et al., 1986).

Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari plat

dengan spatula atau pengerok berbentuk tabung yang disambungkan ke

pengumpul vakum. Senyawa harus diekstraksi dari penjerap dengan

pelarut yang paling kurang polar (sekitar 5mL pelarut untuk 1g penjerap)

karena makin polar pelarut pengekstraksi, makin banyak bahan yang

tidak diinginkan terekstraksi. Harus diperhatikan bahwa makin lama

senyawa berkontak dengan penjerap makin besar kemungkinan

terjadinya penguraian (Hostettmann et al., 1986).

E. Elusidasi Struktur

1. Spektroskopi

Spektroskopi serap merupakan pengukuran suatu interaksi antara radiasi

elektromagnit dan molekul atau atom dari suatu zat kimia (Departemen Kesehatan

Republik Indonesia, 1979). Pada analisis spektrokimia, spektrum radiasi


19

elektromagnitik digunakan untuk menganalisis spesies kimia dan menelaah

interaksinya dengan radiasi elektromagnitik. Suatu foton memiliki energi tertentu

dan dapat menyebabkan transisi tingkat energi suatu atom atau molekul. Karena

tiap spesies kimia memiliki tingkat energi yang berbeda, maka transisi perubahan

energinya juga berbeda. Berarti suatu spektrum yang diperoleh dengan memplot

beberapa fungsi frekwensi terhadap frekwensi radiasi elektromagnitik adalah khas

untuk spesies kimia tertentu dan berguna untuk identifikasi (Khopkar, 1990).

a. Spektroskopi UV/Vis

Spektroskopi ini didasarkan pada serapan sinar UV tampak yang

menyebabkan terjadinya transisi di antara tingkat energi elektronik

molekul. Transisi ini dapat terjadi antar orbital ikatan (bonding) atau

orbital anti ikatan (antibonding). Panjang gelombang sinar yang diserap

sebanding dengan perbedaan tingkat energi orbital. Kegunaan utama

Spektroskopi UV adalah untuk identifikasi jumlah ikatan

rangkap/konjugasi aromatik. Spektrum UV biasanya diukur dalam

larutan sangat encer, dengan syarat pelarut harus tidak menyerap pada

panjang gelombang di mana dilakukan pengukuran, agar tidak ada

serapan (back ground) (Panji, 2012).

b. Kromatografi gas dan spektroskopi massa

Kromatografi gas adalah suatu proses dimana suatu campuran

dipisah menjadi komponen-komponennya oleh fase gas yang bergerak

melewati suatu lapisan serapan (sorben) yang diam. Suatu kromatografi

gas pada hakekatnya terdiri dari bagian: suatu suplai gas pengemban dari


20

tabung bertekanan tinggi (seperti helium, nitrogen, hidrogen, atau argon,

tergantung pada faktor ketersediaan, kemurnian yang dituntut, konsumsi

dan tipe detektor yang digunakan), tempat penginjeksian, kolom, dan

detektor (berfungsi untuk merasakan dan mengukur kualitas kecil dari

komponen yang telah terpisah yang ada dalam aliran gas pengembang

yang meninggalkan kolom). Pemilihan detektor akan bergantung pada

tingkat konsentrasi yang harus diukur dan sifat dasar komponen-

komponen yang akan dipisahkan (Bassett, Denney, Jeffery, and

Mendham, 1994).

Spektroskopi massa didasarkan pada fragmen molekul yang

dihasilkan pada reaksi fragmentasi (pemecahan molekul). Dengan kata

lain, dari data fragmentasi dapat diidentifikasi struktur senyawa utuhnya.

Perkembangan alat spektrometer yang dilengkapi dengan komputer dapat

membantu membandingkan spektrum yang dihasilkan dengan spektrum

senyawa standar yang disimpan dalam basis data komputer. Salah satu

metode komputer dalam membandingkan spektrum suatu senyawa

dengan spektrum senyawa standar adalah dengan mengelompokan

komponen spektrum ke dalam kategori kesamaan (similarity), kelebihan

(excess), dan kehilangan (missing). Komputer akan menghitung

probabilitas makin besar atau makin positif bahwa senyawa yang

dianalisis sama dengan standar dalam basis data jika makin banyak

kesamaan. Hasil perbandingan tersebut dinyatakan sebagai probabilitas

kesamaan atau kualitas kesamaan, dalam satuan persen. Dalam banyak


21

kasus, jika persentase kesamaan mencapai 97% atau lebih, hasilnya

cukup dapat dipercaya bahwa memang benar senyawa yang dianalisis

identik dengan senyawa standar (Panji, 2012).

Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS) saat ini

menjadi alat yang handal untuk penentuan struktur molekul senyawa

organik, khususnya untuk senyawa organik yang cukup volatil. Bahkan,

beberapa senyawa yang memiliki titik didih cukup tinggi, seperti minyak

dengan asam lemak rantai panjang, masih dapat dianalisis langsung

dengan GC-MS, sedangkan jika dianalisis dengan GC saja (tanpa MS)

harus diesterifikasi terlebih dahulu untuk menurunkan titik didih. Hal ini

disebabkan pada GC-MS, perangkat MS dilengkapi sistem vakum hingga

10-6 torr yang sangat membantu dalam proses penguapan cuplikan. GC

dan MS sangat compactible (cocok), karena senyawa yang keluar dari

kolom GC berupa gas atau uap, dan yang dibutuhkan oleh MS juga

senyawa dalam fase uap (Panji, 2012).

c. Spektroskopi infra merah

Spektroskopi inframerah pada dasarnya sama dengan

spektroskopi ultraviolet dan cahaya tampak, hanya berbeda pada sumber

energi, bahan optik dan detektor. Spektroskopi inframerah harus sering

dikalibrasi terhadap skala panjang gelombang, misalnya menggunakan

film polistiren (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1979). Di

daerah inframerah dan inframerah dekat diperlukan kadar masing-masing

sebesar 1mg hingga 10mg per mL, untuk menghasilkan serapan yang


22

memadai; untuk daerah spektrum ini biasanya dipakai sel dengan panjang

0,01mm hingga 3mm. Daerah inframerah spektrum elektromagnit yang

digunakan untuk analisis obat meliputi 4000cm-1 hingga 250cm-1

(2,5µm-40µm). Spektrum serapan inframerah suat zat mempunyai

gambaran yang khas untuk zat yang bersangkutan hingga dapat

digunakan untuk identifikasi. Untuk keperluan identifikasi spektrum zat

yang diuji dapat dibandingkan dengan spektrum zat pembanding yang

ditetapkan dengan cara yang sama, atau dibandingkan dengan spektrum

pembanding (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1979).

Spektroskopi IR biasanya digunakan untuk menentukan struktur,

khususnya senyawa organik (Khopkar, 1990). Daerah inframerah dekat

terutama sesuai untuk penetapan gugus –OH dan –NH, seperti air dalam

alkohol –OH dalam lingkungan amina, alkohol dalam hidrokarbon, dan

amina primer dan sekunder dalam lingkungan amina tersier. Spektrum

inframerah bersifat khas untuk suatu senyawa kimia tertentu, dengan

pengecualian isomer optik yang mempunyai spektum identik. Namun

polimorfisme kadang-kadang dapat menjadi penyebab perbedaan dalam

spektrum inframerah suatu senyawa tertentu dalam keadaan padat.

Seringkali perbedaan kecil dalam struktur menyebabkan perbedaan

segnifikan dalam spektrum. Karena banyaknya maksimum yang terdapat

dalam spektrum serapan inframerah, kadang-kadang dimungkinkan untuk

melakukan pengukuran kuantitatif masing-masing komponen dari suatu


23

campuran yang komposisi kualitatifnya diketahui tanpa pemisahan

terlebih dahulu (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995).

F. Landasan Teori

Dari putaka yang ada, telah diketahui bahwa tanaman binahong memiliki

senyawa aktif golongan steroid, saponin, flavonoid, alkaloid, terpenoid, polifenol,

asam organik, asam oleanolat, asam ursolat, γ-glukan, karoten, mukopolisakarida

(L-arabinosa, D-galaktosa, L-ramnosa), asam aldonat, serta vitamin A, B, dan C.

Serta adanya efek farmakologi sebagai antibakteri, tonikum dan penangkap

radikal. Pustaka-pustaka memberitahukan golongan senyawa yang terdapat pada

tanaman binahong dan uji efek farmakologinya, namun belum diketahui senyawa

aktif spesifik yang bertanggung jawab terhadap efek farmakologi yang diberikan

oleh tanaman binahong, karena itu pada penelitian ini akan dilakukan isolasi dan

identifikasi struktur dari isolat yang diperoleh dari fraksi I ekstrak n-heksana daun

binahong.

Dalam identifikasi, langkah awal yang dilakukan adalah mengekstraksi

simplisia daun tanaman binahong dengan metode maserasi menggunakan pelarut

n-heksana. n-Heksana merupakan pelarut yang bersifat nonpolar maka senyawa

yang akan ikut tersari ke dalam n-heksana adalah senyawa yang bersifat nonpolar.

Metabolit sekunder yang bersifat nonpolar ini antara lain senyawa golongan

terpenoid, steroid dan asam lemak. Metode identifikasi yang sering dilakukan

untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder yang terdapat pada tanaman

adalah dengan uji pendahuluan (skrining fitokimia). Uji pendahuluan ini hanya

akan memberitahukan golongan metabolit sekunder, sedangkan untuk mengetahui


24

secara spesifik senyawa kimianya penelitian akan dilanjutkan dengan pemisahan

(fraksinasi) ekstrak n-heksana daun binahong dengan menggunakan kromatografi

kolom dan kromatografi lapis tipis preparatif dan kemudian senyawa yang

terpisah diidentifikasi strukturnya dengan metode spektroskopi (UV/Vis, GC-MS,

dan IR).

G. Hipotesis

Struktur senyawa yang berhasil diidentifikasi dari fraksi I ekstrak n-

heksana daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) merupakan senyawa

metabolit sekunder dari golongan steroid dan terpenoid, serta asam lemak.


25

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian deskriptif eksperimental.

Penelitian ini merupakan penelitian yang bersifat deskriptif karena dalam penelitian

hanya mendeskripsikan keadaan pada saat penelitian dan merupakan jenis

penelitian eksperimental karena tidak dilakukan manipulasi terhadap subjek uji.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel penelitian

a. Variabel utama

1) Variabel bebas : ekstrak n-heksana daun binahong

2) Variabel tergantung : kandungan steroid, terpenoid dan asam

lemak ekstrak n-heksana daun binahong

b. Variabel pengacau

1) Variabel pengacau terkendali:

a) tempat hidup tanaman binahong

b) paparan sinar matahari yang diterima daun tanaman binahong

2) Variabel pengacau tidak terkendali:

a) waktu pemetikan daun binahong

2. Definisi operasional

1) Preparasi sampel merupakan salah satu tahap dalam sampel yang dapat

menentukan efisiensi dalam analisis, karena preparasi analisis dapat


26

menentukan kelayakan dan reproduksibiltas suatu analisis dalam matrik

pengotor.

2) Ekstraksi adalah penyarian zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari bagian

tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut.

3) Evaporasi merupakan suatu tahapan yang bertujuan untuk memekatkan

larutan.

4) Spektrum adalah jarak atau rentang frekuensi yang mengandung sinyal.

5) Peak merupakan puncak dari suatu kromatogram atau spektrum.

6) Kromatogram adalah presentasi hasil analisa atau pemisahan komponen

zat dengan teknik kromatografi dengan maksud mengenali masing-masing

zat.

7) Isolasi merupakan proses pemisahan suatu senyawa dari campuran

beberapa senyawa.

8) Detektor adalah alat yang digunakan untuk membaca serapan dari sistem

kromatografi.

C. Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tanaman

binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis), air mengalir, aquadest, n-heksana,

asetonitril, asam siliko wolframat LP, asam fosfomolibdat LP, asam fosfowolframat

LP, Bouchardat LP, Wagner LP, Mayer LP, Dragendorff LP, Marme LP, Hager LP,

amonia pekat P, eter P, kloroform, natrium sulfat anhidrat P, asam asetat anhidrat P,

Molish LP, asam sulfat P, metanol P, Baljet LP, Kadde LP, kalium hidroksida 1N,

xantidrol P 0,01% b/v dalam asam asetat P, asam asetat P, besi (III) klorida 0,3M,


27

asam sulfat 2N, benzena P, natrium hidroksida 2N, serbuk seng P, asam klorida 2N,

asam klorida pekat P, etanol (95%) P, serbuk magnesium P, serbuk halus asam

borat P, serbuk halus asam oksalat P, eter P, FeCl3 1%, gelatin, silika gel,

kloroform p.a., metanol p.a., KBr, DMSO d6, tetrametilsilan (TMS).

D. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven, blender,

pengayak nomor 40, timbangan analitik, shaker, erlenmeyer, kertas saring, rotary

vaccum evaporator, labu alas bulat, labu hisap, sendok, batang pengaduk, beaker

glass, gekas ukur, pipet tetes, gelas arloji, corong pisah, corong, penangas air,

cawan porselin, bunsen, gelas ukur, tabung reaksi, pipa kapiler, spatula,

spektrofluorometer, alat degassing ultrasonik, Milipore ukuran pori 0,45 μm, TLC

Plate Coater, chamber, plat KLT, kolom, seperangkat alat UV/Vis, seperangkat

alat GC-MS, seperangkat alat spektrometer inframerah.

E. Tatacara Penelitian

1. Determinasi tanaman binahong

Determinasi tanaman binahong dilakukan dengan membandingkan dengan

Flora of Java. Kemudian tanaman binahong dibuat herbariumnya dalam bentuk

kering meliputi akar, batang, daun, bunga dan rimpang.

2. Preparasi sampel

a. Pemilihan sampel

Sampel yang dipilih adalah daun tanaman binahong yang segar

dan tidak berpenyakit (tidak dijangkiti oleh infeksi virus, bakteri atau

jamur). Pada saat mengumpulkan sampel, harus dipastikan bahwa daun


28

terpisah dari pencemar lain seperti tangkai binahong, atau bahan lain selain

daun binahong. Daun tanaman binahong yang diambil berasal dari daerah

Yogyakarta.

Daun dipanen kemudian dicuci dengan air mengalir dan

dipisahkan daun binahong dan pengotor (tangkai, bunga, umbi dan akar).

Tiriskan dan keringanginkan daun agar air sisa pencucian dapat hilang.

Keringkan daun binahong dengan oven pada suhu 40-60ºC. Setelah

dikeringkan, daun diserbuk dengan menggunakan blender dan diayak

dengan menggunakan pengayak nomor 40.

b. Ekstraksi sampel

Maserasi dilakukan dengan perbandingan simplisia kering daun

tanaman binahong : n-heksana (1:10). Ditimbang sebanyak 5g daun

tanaman binahong kering kemudian diekstraksi selama 3jam dengan

pelarut n-heksana sebanyak 50mL, dilakukan sebanyak 3kali. Hasil

maserasi lalu disaring dengan menggunakan kertas saring dan bantuan

vakum. Ekstrak kemudian dikentalkan dengan rotary vaccum evaporator.

3. Uji pendahuluan

a. Alkaloida

Larutan percobaan untuk pengendapan alkaloid dibagi menjadi 4

golongan sebagai berikut.

I. Golongan I : larutan percobaan dengan alkaloida membentuk garam

yang tidak larut: asam siliko wolframat LP, asam fosfomolibdat LP dan

asam fosfowolframat LP.


29

II. Golongan II : larutan percobaan yang dengan alkaloid membentuk

senyawa kompleks bebas, kemudian membentuk endapan: Bouchardat

LP dan Wagner LP.

III. Golongan III : larutan percobaan yang dengan alkaloida membentuk

senyawa adisi yang tidak larut : Mayer LP, Dragendorff LP dan Marme

LP.

IV. Golongan IV : larutan percobaan yang dengan alkaloida membentuk

ikatan asam organik dengan alkaloid: Hager LP.

Cara percobaan :

Ambil kurang lebih 25mL ekstrak kental daun binahong

ditambahkan 1mL HCl 2N dan 9mL air, dipanaskan di atas penangas air

selama 2menit, dinginkan dan saring. Pindahkan 3tetes filtrat pada kaca

arloji, tambahkan 2tetes Bouchardat LP atau Mayer LP. Jika pada kedua

percobaan tidak terjadi endapan maka serbuk tidak mengandung alkaloida.

Jika dengan Mayer LP terjadi endapan menggumpal berwarna

putih atau kuning yang larut dalam metanol P dan dengan Bouchardat LP

terbentuk endapan berwarna cokelat sampai hitam, maka ada kemungkinan

terdapat alkaloida.

Lanjutkan percobaan dengan mengocok sisa filtrat dengan 3mL

amonia pekat P dan 10mL campuran 3 bagian volume eter P dan 1 bagian

volume kloroform (hati-hati jangan menggojok terlalu kuat, bisa terjadi

emulsi, pakai corong pisah). Ambil fase organik, tambahkan natrium sulfat

anhidrat P, saring. Uapkan filtrat di atas penangas air, larutkan sisa dalam


30

sedikit HCl 2N. Lakukan percobaan dengan keempat golongan larutan

percobaan. Serbuk mengandung alkaloida jika sekurang-kurangnya

terbentuk endapan dengan menggunakan 2 golongan larutan percobaan.

Dengan KLT :

Ekstrak kental n-heksan daun binahong ditotolkan pada plat KLT

yang telah dibuat. Plat kemudian dielusikan dengan menggunakan larutan

pengembang berupa kloroform dan dimasukkan ke dalam chamber yang

telah dijenuhkan dengan kloroform. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dan

dibiarkan kering lalu disemprotkan dengan pereaksi Dragendorff dan asam

sulfat encer.

b. Flavonoid

Cara percobaan

I. Uapkan hingga kering 1mL larutan percobaan, sisa dilarutkan dalam

1mL sampai 2mL etanol (95%) P; tambahkan 0,5mg serbuk seng P dan

2mL asam klorida 2N, diamkan selama 1menit. Tambahkan 10tetes

asam klorida pekat P. Jika dalam waktu 2 sampai 5menit terjadi warna

merah intensif, menunjukan adanya flavonoid (glikosida 3-flavonol).

II. Uapkan hingga kering 1mL larutan percobaan, sisa dilarutkan dalam

1mL etanol (95%) P, tambahkan 0,1g serbuk magnesium P. Jika terjadi

warna merah jingga sampai merah ungu, menunjukan adanya flavonaid.

Jika terjadi warna kuning jingga, menunjukan adanya flavon, kalkon,

dan auron.


31

III. Uapkan hingga kering 1mL larutan percobaan, basahkan sisa dengan

aseton P, tambahkan sedikit serbuk halus asam borat P dan serbuk halus

asam oksalat P, panaskan hati-hati di atas penangas air dan hindari

pemanasan yang berlebihan. Campur sisa yang diperoleh dengan 10mL

eter P. Amati dengan sinar UV 366nm; larutan berfluorosensi kuning

intensif, menunjukan adanya flavonoid.

(MMI)

Dengan KLT :

Ekstrak kental n-heksana daun binahong ditotolkan pada plat

KLT yang telah dibuat. Plat kemudian dielusi dengan menggunakan

larutan pengembang berupa kloroform dan dimasukkan ke dalam chamber

yang telah dijenuhkan dengan kloroform. Setelah dielusi, plat dikeluarkan

dan dibiarkan kering lalu disemprotkan dengan pereaksi amonia.

c. Tanin

i. Uji dengan FeCl3

Ekstrak kental n-heksana daun binahong ditambahkan dengan 2-3tetes

larutan besi (IV) klorida 1%. Jika larutan menghasilkan warna hijau

kehitaman atau biru tinta, maka bahan tersebut mengandung tanin.

ii. Uji dengan larutan gelatin

Ekstrak kental n-heksana daun binahong dimasukkan dalam tabung

reaksi ditambah dengan larutan gelatin. Jika terbentuk endapan putih,

menunjukkan adanya tanin.


32

d. Saponin

Encerkan 1mL ekstrak kental n-heksana daun binahong dengan

10mL air dan kocok kuat-kuat selama 10menit. Terbentuk buih yang

mantap selama tidak kurang dari 10menit setinggi 1-10cm. Pada

penambahan 1 tetes asam klorida 2N, buih tidak hilang.

e. Triterpenoid dan steroid

Ekstrak kental n-heksana daun binahong dimasukkan dalam

tabung reaksi, dilarutkan dalam 0,5mL kloroform lalu dipanaskan dan

didinginkan. Diambil 1mL dan dimasukkan dalam tabung reaksi lalu

diteteskan pereaksi Lieberman-Burchard. Jika hasil yang diperoleh berupa

cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut menunjukkan

adanya triterpenoid, sedangkan jika terbentuk warna hijau kebiruan

menunjukkan adanya steroid.

(Sriwahyuni, 2010)

Dengan KLT :

Ekstrak kental n-heksana daun binahong ditotolkan pada plat

KLT yang telah dibuat. Plat kemudian dielusi dengan menggunakan

larutan pengembang berupa kloroform dan dimasukkan ke dalam chamber

yang telah dijenuhkan dengan kloroform. Setelah dielusi, plat dikeluarkan

dan dibiarkan kering lalu disemprotkan dengan pereaksi Lieberman-

Burchard.


33

4. Optimasi fase gerak 1

Sebanyak 7g adsorben (silika gel) yang akan digunakan untuk pelapis

dibuat bubur dengan 21mL aquadest. Bubur yang telah ada kemudian diratakan

pada plat kaca dengan ukuran 5x15cm dengan menggunakan alat TLC Plate

Coater. Setelah adsorben pada plat kaca rata, plat lapis tipis yang terbentuk

dikeringkan dalam oven pada suhu 100–120oC selama paling kurang 1jam.

Ekstrak kental n-heksana daun binahong ditotolkan pada plat KLT yang

telah dibuat. Ekstrak kemudian dielusi dengan menggunakan 5 larutan

pengembang, yaitu: asetonitril, n-heksana, kloroform, kloroform:metanol (1:1), dan

metanol.

Dari hasil elusi dilihat fase gerak mana yang menghasilkan pemisahan

terbaik. Fase gerak yang memberikan pemisahan terbaik kemudian digunakan

sebagai fase gerak pada kromatografi kolom.

5. Kromatografi kolom 1

Campurkan adsorben (silika gel) dengan fase gerak (kloroform) hingga

terbantuk suspensi yang seperti bubur. Suspensi ini kemudian dimasukan ke dalam

kolom hingga pencapai tiga perempat dari tinggi kolom.

Sampel yang berupa ekstrak kental n-heksana daun binahong sebanyak

0,5mL dimasukkan ke dalam kolom, dibiarkan mengendap lalu dialirkan fase gerak

berupa kloroform untuk mengelusi dan eluen ditampung pada flakon tiap 3menit.

6. Kromatografi lapis tipis 1


dibuat bubur dengan 21mL pelarut (aquadest). Bubur yang telah ada kemudian


34

diratakan pada plat kaca dengan ukuran 5x15cm dengan menggunakan alat TLC

Plate Coater. Setelah adsorben pada plat kaca rata, plat lapis tipis yang terbentuk


Eluen hasil isolasi dengan kromatografi kolom dari ekstrak kental n-

heksana daun binahong ditotolkan pada plat KLT yang telah dibuat. Eluen

kemudian dielusi dengan menggunakan 3 larutan pengembang, yaitu: kloroform,

kloroform:metanol (1:1), dan metanol.

Dari hasil elusi dilihat apakah telah diperoleh senyawa yang dikatakan

murni secara KLT.

7. Kromatografi kolom 2

Campurkan adsorben (silika gel) dengan fase gerak (kloroform) hingga

terbantuk suspensi yang seperti bubur. Suspensi ini kemudian dimasukkan ke dalam

kolom hingga pencapai tiga perempat dari tinggi kolom.

Sampel yang berupa fraksi 1 hasil kromatografi kolom 1 dari ekstrak

kental n-heksan daun binahong sebanyak 0,5mL dimasukkan ke dalam kolom. Ke

dalam kolom lalu dialirkan fase gerak berupa metanol dan eluen ditampung pada

flakon tiap 3menit. Kemudian ke dalam kolom dialirkan kloroform dan ditampung

setian 3menit.

Eluen kemudian dikembangkan dengan KLT, dengan menggunakan 3 fase

gerak yaitu kloroform, kloroform:metanol (1:1), dan metaol. Jika dari hasil elusi

telah diperoleh senyawa yang murni secara KLT maka dapat dielusidasi.


35







Eluen hasil isolasi dengan kromatografi kolom 2 kemudian ditotolkan pada

plat KLT yang telah dibuat. Eluen kemudian dielusi dengan menggunakan 3 larutan

pengembang, yaitu: kloroform, kloroform:metanol (1:1), dan metanol.


murni secara KLT, jika belum murni maka dapat dilanjutkan dengan isolasi

menggunakan KLTP dengan terlebih dahulu melakukan optimasi fase gerak untuk

mendapatkan pemisahan terbaik.

9. Optimasi fase gerak 2


dibuat bubur dengan 21mL aquadest. Bubur yang telah ada kemudian diratakan

pada plat kaca dengan ukuran 5x15cm dengan menggunakan alat TLC Plate

Coater. Setelah adsorben pada plat kaca rata, plat lapis tipis yang terbentuk


Eluen hasil isolasi dengan kromatografi kolom eluen hasil kolom2

kemudian ditotolkan pada plat KLT yang telah dibuat. Eluen kemudian dielusi

dengan menggunakan larutan pengembang berupa kloroform:metanol dengan


36

perbandingan: 1:1, 1:2, 1:3, 1:5, 1:9, 1:19, 15:1, 13:1, 11:1, 9:1, 7:1, 5:1, 3:1, dan

2:1.

Dari hasil elusi dilihat fase gerak mana yang menghasilkan pemisahan

terbaik. Fase gerak yang memberikan pemisahan terbaik kemudian digunakan

sebagai fase gerak pada KLTP.

10. Kromatografi lapis tipis preparatif






Eluen hasil isolasi dengan kromatografi kolom eluen hasil kolom 2

kemudian ditotolkan berupa pita pada plat KLT yang telah dibuat. Eluen kemudian

dielusi dengan menggunakan larutan pengembang berupa kloroform:metanol (1:19)

hasil optimasi sebelumnya.

Hasil elusi kemudian dikeringkan dan dikerok dengan menggunakan

spatula kemudian ditampung dan diekstraksi dengan menggunakan kloroform.

Hasil ekstraksi lalu dipekatkan dengan menggunakan rotary vaccum evaporator.






37



Eluen hasil isolasi dengan KLTP kemudian ditotolkan pada plat KLT yang

telah dibuat. Eluen kemudian dielusi dengan menggunakan larutan pengembang

berupa kloroform, kloroform:metanol (1:1), dan metanol.


murni secara KLT, jika diperoleh satu bercak hasil elusi dengan harga Rf yang

berbeda.

12. Spektroskopi UV/Vis

Sebanyak 0,05mg senyawa hasil isolasi dilarutkan dalam 10,0mL metanol

lalu dimilipore dan didegasing dengan ultrasonikator. Senyawa lalu dimasukkan ke

dalam kuvet dan diukur absorbansinya dengan menggunakan metanol p.a. sebagai

blanko.

13. GC-MS

Sebanyak 1,0mg senyawa hasil isolasi dilarutkan dalam 10,0mL metanol

lalu dimilipore dan didegasing dengan ultrasonikator. Senyawa lalu diinjeksikan

pada GC-MS, sehingga didapatkan peak hasil pemisahan senyawa campuran serta

spektrum massanya.

14. Spektroskopi inframerah

Sebanyak 1,0mg senyawa hasil isolasi dicampur homogen dengan kurang

lebih 10,0mg KBr, kemudian dikempa dan dibuat tablet. Tablet tersebut dianalisis

dengan spektrometer inframerah, kemudian hasilnya direkam pada alat pencatat

sehingga didapatkan spektrum untuk mengetahui gugus fungsi dari senyawa.


38

F. Analisis Hasil

Analisis yang dilakukan dalam penelitian ini adalah analisis kualitatif

dengan mengidentifikasikan senyawa tunggal hasil isolasi ekstrak n-heksana daun

binahong. Analisis dilakukan dengan melihat hasil uji pendahuluan dan membaca

spektrum UV/Vis, GC-MS, dan IR hasil isolasi sampel dari ekstrak n-heksana daun

binahong lalu membandingkannya dengan pustaka yang diacu. Sehingga dapat

diketahui gambaran tentang struktur senyawa yang diisolasi.


39

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada bab ini akan dijelaskan tentang hasil penelitian dan pembahasan

data pengamatan yang meliputi determinasi tanaman binahong, preparasi sampel,

ekstraksi senyawa aktif dengan maserasi, skrining fitokimia senyawa aktif dengan

uji reagen dan KLT, pemisahan ekstrak dengan kromatografi kolom dan KLTP

serta analisis struktur senyawa yang diisolasi dengan menggunakan spektrometri

UV/Vis, GC-MS, dan IR.

A. Determinasi Tanaman Binahong

Tanaman binahong telah dideterminasi di Laboratorium Kebun Obat

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Hasil determinasi menyatakan

bahwa tanaman binahong merupakan spesies Anredera cordifolia (Ten.) Steenis

seperti yang tertera pada surat pengesahan determinasi pada lampiran 1.

B. Preparasi Sampel

Sampel yang dipilih adalah daun tanaman binahong yang segar dan tidak

berpenyakit (tidak dijangkiti oleh infeksi virus, bakteri atau jamur). Pada saat

mengumpulkan sampel, harus dipastikan bahwa daun tepisah dari pencemar lain

seperti tangkai binahong, akar binahong, atau bahan lain selain daun binahong.

Daun tanaman binahong yang diambil berasal dari daerah Yogyakarta.

Tahap pertama daun binahong dipanen, kemudian dicuci untuk

menghilangkan kotoran yang berupa tanah atau debu yang dapat mengganggu

dalam proses ekstraksi kemudian air sisa pencucian ditiriskan dan

dikeringanginkan agar sisa air hasil pencucian dapat hilang. Jika masih terdapat


40

sisa air pencucian maka dapat menyebabkan daun menjadi busuk pada saat proses

pengeringan karena air merupakan media hidup mikroorganisme yang baik.

Selanjutnya daun binahong dikeringkan dengan oven pada suhu 40-60ºC sampai

kering (garing dan mudah diremuk). Pengeringan dilakukan pada suhu 40-60ºC

agar kandungan senyawa kimia yang terdapat pada tanaman tidak mengalami

kerusakan akibat panas dan dikeringkan hingga garing dan mudah diremuk untuk

memudahkan penyerbukan. Setelah dikeringkan, daun diserbuk dengan

menggunakan blender dan diayak dengan menggunakan pengayak nomor 40

untuk memperoleh luas permukaan serbuk yang seragam.

Pengeringan dimaksudkan untuk mengurangi kadar air sehingga aktifitas

enzimatis yang dapat menguraikan zat kimia yang ada dapat terhenti, dan

mencegah tumbuhnya jamur agar dapat disimpan lebih lama (pengawetan) tanpa

mengubah komposisi kimia daun binahong kering. Selain itu, karena ekstraksi

dilakukan dengan menggunakan pelarut n-heksana yang tidak dapat bercampur

dengan air maka air harus dihilangkan untuk memudahkan n-heksana masuk ke

dalam sel daun selama proses maserasi. Daun binahong yang telah dikeringkan

akan berwarna hijau kecoklatan lalu dihaluskan menggunakan blender sehingga

diperoleh serbuk sampel yang berwarna hijau kecoklatan. Pembuatan serbuk ini

dapat mempermudah proses ekstraksi karena akan memperbesar luas permukaan

dari bahan yang diekstraksi. Dimana semakin kecil ukuran serbuk, semakin besar

luas permukaannya maka interaksi serbuk dengan penyari (n-heksana) akan

semakin besar, sehingga proses ekstraksi akan semakin efektif karena akan makin

banyak senyawa yang ikut terlarut ke dalam n-heksana.


41

C. Ekstraksi Sampel

Prinsip ekstraksi adalah pemisahan berdasarkan perbedaan kelarutan dari

suatu senyawa. Ada beberapa cara dalam mengekstraksi, namun pada penelitian

ini digunakan cara maserasi. Dipilih cara maserasi karena maserasi adalah proses

ekstraksi yang paling sederhana dan mudah dilakukan yaitu dengan perendaman

serbuk ke dalam pelarut dengan atau tanpa penggojokkan. Prinsip utama dalam

maserasi adalah mengekstrak senyawa aktif yang dapat larut dalam pelarut

berdasarkan tingkat kepolaran masing-masing pelarutnya atau dikenal dengan

istilah like dissolves like. Maserasi dilakukan dengan perbandingan simplisia

kering daun tanaman binahong : n-heksana (1:10). n-Heksana merupakan pelarut

yang bersifat nonpolar maka n-heksana akan melarutkan senyawa yang bersifat

nonpolar sedangkan senyawa yang bersifat polar tidak ikut terekstraksi.

Ditimbang sebanyak 30g serbuk daun tanaman binahong kering kemudian

dimaserasi selama 3jam dengan pelarut n-heksana sebanyak 3000ml, dilakukan

sebanyak 3kali. Proses pengadukannya dibantu dengan shaker selama 3jam

dengan kecepatan 120rpm untuk mempercepat proses ekstraksinya karena

kecepatan pengadukannya dapat dilakukan secara konstan. Pelarut akan

menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung

senyawa kimia. Senyawa kimia yang ada akan larut karena adanya perbedaan

konsentrasi senyawa kimia di dalam dan di luar sel, maka pelarut akan masuk ke

dalam sel dan melarutkan senyawa kimia kemudian mengeluarkannya ke luar sel

sehingga terjadi keseimbangan. Pengadukan diperlukan untuk menyeimbangkan

konsentrasi larutan di luar sel sehingga tetap terjaga perbedaan konsentrasi antara


42

larutan di dalam dan di luar sel. Dilakukan 3 kali maserasi agar diperoleh hasil

ekstraksi yang maksimal, dimana senyawa yang belum terekstraksi pada maserasi

pertama dapat terekstraksi pada maserasi kedua dan ketiga.

Hasil maserasi lalu disaring dengan menggunakan kertas saring untuk

memisahkan sari dan ampas dan bantuan vakum untuk rmempercepat waktu

penyaringan. Filtrat hasil dari maserasi masing-masing pelarut yang telah

diperoleh selanjutnya dipekatkan dengan menguapkan pelarut (n-heksana) dengan

bantuan rotary vaccum evaporator untuk mendapatkan ekstrak pekat. Pada rotary

vaccum evaporator, pelarut lebih cepat menguap di bawah titik didihnya karena

adanya vakum yang dapat menyebabkan tekanan dalam alat turun. Rotary vaccum

evaporator dihentikan ketika diperoleh ekstrak yang cukup pekat yang ditandai

dengan berhenti menetesnya n-heksana pada labu penampung.

D. Uji Pendahuluan

Uji pendahuluan dilakukan untuk mengetahui golongan kandungan

senyawa kimia pada tanaman. Pada penelitian ini pengujian dilakukan dengan

menggunakan reagen kimia yang dilakukan dengan dua cara, yaitu: mengambil

sampel ekstrak pekat n-heksana, dimasukkan dalam pada tabung reaksi, lalu

ditambahkan reagen yang sesuai dengan senyawa yang akan diidentifikasi serta

dengan menggunakan KLT dimana ekstrak n-heksana daun binahong dipisahkan

dahulu (dengan elusi) sebelum ditambahkan reagen kimia untuk identifikasi. Uji

fitokimia dilakukan terhadap golongan senyawa alkaloid, flavonoid, tanin,

saponin, dan triterpenoid.


43

Tabel I. Hasil uji pendahuluan ekstrak n-heksana daun binahong

Keterangaan: - = tidak ada+ = ada

1. Alkaloida

Uji alkaloid dilakukan dengan cara memasukkan sedikit ekstrak n-

heksana daun binahong ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan HCl dan

H2O. Penambahan HCl yang bersifat asam dimaksudkan untuk mengubah alkaloid

yang bersifat basa ke bentuk garamnya agar mudah larut dalam air. Bukti

kualitatif yang menunjukkan adanya alkaloid diperoleh dengan menggunakan

reagen Dragendorf dan Mayer. Reaksi dugaan yang terjadi pada uji alkaloid

adalah sebagaimana pada reaksi berikut:

Reaksi antara alkaloid dengan reagen Mayer :

HgCl2 + 2 KI HgI2↓ + 2 KCl (1)

HgI2↓ + 2 KI [HgI4]2- + 2 K+ (2)

Golongan senyawa Hasil uji pendahuluan

Alkaloid -

Flavonoid -

Tanin -

Saponin -

Triterpenoid -

Steroid +


44

Gambar 2. Reaksi antara alkaloid dan reagen Mayer (Arisadita, 2012)

Pada reaksi antara alkaloid dengan reagen Mayer (Gambar 2), akan

terlihat endapan putih yang terjadi akibat adanya kompleks yang terbentuk karena

adanya ikatan antara gugus amin pada alkaloid dan ion logam (Hg) dari reagen

Mayer. Dari percobaan tidak terlihat adanya endapan putih, maka dapat dikatakan

bahwa pada ekstrak n-heksana daun binahong yang diteliti tidak mengandung

alkaloid.

Uji lain yang dilakukan adalah uji dengan menggunakan KLT (Gambar

3). Pengujian dengan KLT ini dimaksudkan agar senyawa yang berada di dalam

ekstrak n-heksana daun binahong dipisahkan terlebih dahulu sebelum

ditambahkan reagen agar perubahan warna senyawa yang dianalisis tidak

dipengaruhi oleh senyawa lain yang terdapat dalam ekstrak. Uji dilakukan dengan

menggunakan pereaksi Dragendorff dan asam sulfat.

Pada KLT gambar 3 terlihat adanya 2 totolan, di mana dari kiri ke kanan

tiap totolannya adalah (a) ekstrak n-heksana daun binahong, (b) fraksi 1 hasil

kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daun binahong. Sistem KLT yang

digunakan menggunakan fase diam silika gel dan fase gerak kloroform.


45

a. b.Gambar 3. Hasil KLT (a) ekstrak n-heksana ekstrak daun binahong dan (b) fraksi

1 kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daun binahong dengan a. pereaksiDragendorff; b. asam sulfat

Tabel II. Hasil KLT senyawa alkaloid dalam ekstrak n-heksana daun binahongdan fraksi I kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daun binahong

Gambar No. bercak Nilai Rf

Warnasebelum

ditambahkanreagen

Warna setelahditambahkan

reagen

3. a. (a) 1 -Hijau

kehitamanHijau

kehitaman2 0,3 Kuning Kuning3 0,45 Hijau Hijau4 0,6 Hijau tua Hijau tua5 0,9 Kuning Kuning

3. a. (b) 1 0,9 Kuning Kuning

3. b. (a) 1 -Hijau

kehitamanHijau


3. b. (b) 1 0,67 Kuning Kuning

45





Warnasebelum

ditambahkanreagen


reagen

3. a. (a) 1 -Hijau

kehitamanHijau



3. b. (a) 1 -Hijau

kehitamanHijau



45





Warnasebelum

ditambahkanreagen


reagen

3. a. (a) 1 -Hijau

kehitamanHijau



3. b. (a) 1 -Hijau

kehitamanHijau




46

Dari gambar 3 dapat dilihat bahwa uji yang dilakukan baik dengan

pereaksi Dragendorff (Gambar 3. a) maupun asam sulfat (Gambar 3. b)

memberikan hasil negatif yang tampak dengan tidak adanya perubahan warna

seperti yang dijabarkan pada tabel II. Hal ini semakin mempertegas hasil yang

peroleh dari uji warna sebelumnya bahwa ekstrak n-heksana daun binahong tidak

mengandung senyawa alkaloid.

2. Flavonoid

Uji pendahuluan untuk flavonoid dapat dikatakan positif apabila paling

kurang terdapat dua hasil positif dari tiga percobaan yang dilakukan. Secara garis

besar, uji warna dilakukan dengan melarutkan sampel ke dalam etanol untuk

menghidrolisis flavonoid menjadi aglikonnya. Glikosida akan tergantikan oleh H+

dari asam klorida (Gambar 4.) karena sifatnya yang elektrofilik. Kemudian

ditambahkan logam magnesium (Mg) yang akan membentuk kompleks berwarna

dengan senyawa flavonoid. Warna yang dihasilkan akan spesifik tergantung dari

logam yang digunakan.

Gambar 4. Reaksi pembentukan warna antara flavonoid dengan logammagnesium (Mg) (Arisadita, 2012)


47

Gambar 5. Hasil KLT (a) ekstrak n-heksana ekstrak daun binahong dan (b) fraksi1 kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daun binahong dengan pereaksi

amonia

Tabel III. Hasil KLT senyawa flavonoid dalam ekstrak n-heksana daun binahongdan fraksi I kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daun binahong

GambarNo.

bercakNilai Rf

Warna sebelumditambahkan reagen

Warna setelahditambahkan reagen

5. (a) 1 - Hijau kehitaman Hijau kehitaman2 0,2 Kuning Kuning3 0,56 Hijau Hijau4 0,6 Hijau tua Hijau tua5 0,78 Kuning Kuning

5. (b) 1 0,79 Kuning Kuning

Senyawa golongan flavonoid umumnya berwarna dan fraksi yang

ditampung dari pemisahan dengan kromatografi kolom berupa senyawa berwarna,

karena itu dilakukan uji flavonoid pada ekstrak n-heksana daun binahong dan

fraksi hasil pemisahan kromatografi kolom. Untuk membuktikan keberadaan

senyawa flavonoid dalam ekstrak n-heksana daun binahong maka dilakukan uji

warna dengan menggunakan KLT agar senyawa dapat dipisahkan dahulu sebelum

ditambahkan reagen sehingga keberadaan senyawa lain tidak mempengaruhi

perubahan warna yang dialami misalnya di dalam ekstrak n-heksana daun

47


amonia


GambarNo.

bercakNilai Rf













47


amonia


GambarNo.

bercakNilai Rf














48

binahong terdapat senyawa flavonoid. Pada KLT (Gambar 5) terlihat adanya 2

totolan, di mana dari kiri ke kanan tiap totolannya adalah (a) ekstrak n-heksana

daun binahong, (b) fraksi 1 hasil kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daun

binahong. Sistem KLT yang digunakan adalah fase diam silika gel dan fase gerak

kloroform. Dari gambar dapat dilihat bahwa uji dengan pereaksi amonia

memperlihatkan tidak adanya perubahan warna seperti yang dijabarkan pada tabel

III. Hal ini menyatakan bahwa dalam ekstrak n-heksana tidak terdapat flavonoid.

3. Tanin

Uji fitokimia senyawa tanin dilakukan dengan penambahan larutan besi

(III) klorida ke dalam sedikit ekstrak n-heksana daun binahong. Digunakan besi

(III) klorida karena tanin yang merupakan senyawa polifenol dapat membentuk

senyawa kompleks dengan besi (III) klorida dengan menghasilkan warna hijau

kehitaman atau biru tinta.

Kecenderungan besi dalam pembentukan senyawa kompleks dapat terjadi

karena besi dapat mengikat 6 pasang elektron bebas (Gambar 6). Ion Fe3+ dalam

pembentukan senyawa kompleks akan terhibridisasi membentuk hibridisasi d2sp3,

sehingga akan terisi oleh 6 pasang elektron bebas atom oksigen pada tanin.

Kestabilan dapat tercapai jika tolakan antara ligan pada 3 tanin minimal. Hal ini

terjadi jika 3 tanin tersebut posisinya dijauhkan. Dari penelitian dapat dilihat

bahwa ekstrak n-heksana daun binahong menunjukan hasil positif yang

menyatakan adanya gugus polifenol dengan berubahnya warna ekstrak menjadi

hijau kehitaman.


49

O

OH

HO

O

O

Fe

H

H

O

HO

OH

O

OH

H

O OH

HO

O

O

H

H

3+

+ 3 Cl

Gambar 6. Reaksi pembentukan warna antara tanin dengan besi (III) klorida(Arisadita, 2012)

Untuk membuktikan bahwa senyawa polifenol yang terdapat di dalam

ekstrak adalah senyawa tanin maka dilakukan uji dengan menggunakan gelatin.

Harborne (1987) menyebutkan bahwa semua tanin menimbulkan endapan sedikit

atau banyak jika ditambahkan dengan gelatin, karena gelatin merupakan protein

alami yang memberikan sifat penstabil dan pengental bagi media yang

berbasiskan air, mengandung asam amino dengan kandungan glisin (27%), prolin

(16%) dan hidroxiprolin (14%). Tanin merupakan himpunan polihidroksifenol


50

yang dapat dibedakan dari fenol-fenol lain karena kemampuannya untuk

mengendapkan protein, sehingga apabila tanin direaksikan dengan gelatin akan

terbentuk endapan putih karena adanya ikatan hidrogen yang membentuk senyawa

komplek tanin-protein. Ikatan hidrogen ini terbentuk dari atom hidrogen yang

berikatan dengan 2 atom yang memiliki keelektronegatifan yang tinggi seperti

atom nitrogen dan oksigen dari struktur tanin dan gelatin (Gambar 7.).

Gambar 7. Reaksi pengendapan antara tanin dengan gelatin (Arisadita, 2012)

Dari percobaan diperoleh hasil negatif dengan tidak terbentuknya

endapan putih yang menyatakan tidak adanya senyawa tanin.

4. Saponin

Identifikasi kandungan saponin dapat dilakukan dengan memasukkan

1mL ekstrak kental n-heksana daun binahong ke dalam tabung reaksi.

Menambahkan 10mL air panas, dinginkan dan kemudian kocok kuat-kuat selama

10menit.


51

Buih yang ditimbulkan saponin dikarenakan adanya kombinasi struktur

senyawa penyusunnya yaitu rantai sapogenin nonpolar dan rantai samping polar

yang larut dalam air (Kristianingsih, 2002). Widyasari (2008) menyatakan bahwa

buih yang timbul disebabkan saponin mengandung senyawa yang sebagian larut

dalam air (hidrofilik) dan senyawa yang larut dalam pelarut nonpolar (hidrofobik)

sebagai surfaktan yang dapat menurunkan tegangan permukaan. Dari hasil

percobaan terlihat tidak adanya buih yang mantap selama tidak kurang dari

10menit setinggi 1-10cm. Hasil percobaan ini menunjukkan tidak adanya

kandungan saponin pada ekstrak n-heksana daun binahong.

5. Triterpenoid dan steroid

Adanya senyawa triterpenoid dan steroid dalam ekstrak n-heksana daun

binahong dapat ditunjukan dengan penambahan reagen Lieberman-Burchard.

Triterpenoid memberikan reaksi dengan terbentuknya cincin berwarna kecoklatan

ketika senyawa ini ditetesi reagen Lieberman-Burchard melalui dindingnya,

sedangkan steroid akan menghasilkan warna hijau kebiruan (Robinson, 1995).

Perubahan warna ini disebabkan terjadinya reaksi oksidasi pada golongan

triterpenoid/steroid melalui pembentukan ikatan rangkap terkonjugasi (senyawa

pentaenilik). Dari hasil percobaan dapat dilihat bahwa ekstrak n-heksana daun

binahong menunjukkan adanya senyawa steroid dengan terbentuk warna hijau

kebiruan.

Untuk mendukung hasil reaksi warna maka dilakukan dengan

menggunakan KLT dan kemudian disemprotkan pereaksi Lieberman-Buncard

(Gambar 8).


52


Lieberman-Buncard

Tabel IV. Hasil KLT senyawa triterpenoid dan steroid dalam ekstrak n-heksanadaun binahong dan fraksi I kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daun

binahong


Warnasebelum

ditambahkanreagen


reagen

8. (a) 1 0,03Hijau

kehitamanHijau

kehitaman2 0,3 Kuning Kuning3 0,42 Hijau Hijau4 0,62 Hijau tua Hijau tua

5 0,9 KuningHijau

kebiruan

8. (b) 1 0,79 KuningHijau

kebiruan

Pada KLT (Gambar. 8) terlihat adanya 2 totolan, di mana dari kiri ke

kanan tiap totolannya adalah (a) ekstrak n-heksana daun binahong, (b) fraksi 1

hasil kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daun binahong. Sistem KLT yang

digunakan adalah fase diam silika gel dan fase gerak kloroform. Dari gambar 8

52


Lieberman-Buncard


binahong


Warnasebelum

ditambahkanreagen


reagen

8. (a) 1 0,03Hijau

kehitamanHijau


5 0,9 KuningHijau

kebiruan


kebiruan





52


Lieberman-Buncard


binahong


Warnasebelum

ditambahkanreagen


reagen

8. (a) 1 0,03Hijau

kehitamanHijau


5 0,9 KuningHijau

kebiruan


kebiruan






53

dapat dilihat bahwa uji dengan pereaksi Lieberman-Buncard memberikan hasil

positif yang tampak dengan adanya perubahan warna dari kuning menjadi hijau

kebiruan pada gambar 8. (a) bercak 5 dan gambar 8. (b) bercak 1 (Tabel IV). Hal

ini membuktikan bahwa dalam ekstrak n-heksana daun binahong terdapat steroid.

E. Optimasi Fase Gerak 1

Tujuan dilakukan optimasi fase gerak adalah untuk mengetahui dengan

fase gerak apa ekstrak n-heksana daun binahong dapat terpisah dengan baik

sehingga dapat diisolasi suatu senyawa. Sistem yang digunakan dalam

kromatografi ini adalah sistem normal dimana fase diam bersifat polar dan fase

geraknya bersifat nonpolar. Optimasi fase gerak dilakukan dengan melakkan uji

pendahuluan menggunakan KLT analitik. Fase diam yang digunakan pada KLT

analitik ini adalah silika gel dan pada kromatografi kolom nantinya fase gerak

yang digunakan adalah silika gel yang memiliki kepolaran yang sama dengan

silika gel pada sistem KLT. Ekstrak dielusi pada lima fase gerak yang berbeda

kepolarannya, yaitu: asetonitril dengan indeks polaritas 5,8, n-heksana dengan

indeks polaritas 0,1, kloroform dengan indeks polaritas 4,1, kloroform:metanol

(1:1) dengan indeks polaritas 4,6, dan metanol dengan indeks polaritas 4,1.

Dari gambar 9 hasil elusi dapat dilihat bahwa fase gerak yang

menghasilkan pemisahan terbaik adalah kloroform yang dapat memisahkan

ekstrak menjadi 8 totol sedangkan fase gerak lain hanya menghasilkan 1 dan 2

bercak yang mengekor dan tidak memisah. Karena itu kloroform kemudian

digunakan sebagai fase gerak pada kromatografi kolom.


54

a b c d eGambar 9. Hasil KLT ekstrak n-heksana daun binahong dengan fase gerak a.asetonitril; b. n-heksana; c. kloroform; d. kloroform : metanol (1:1); e. metanol

Tabel V. Hasil KLT ekstrak n-heksana daun binahong dengan fase diam silika geldan fase gerak asetonitril; n-heksana; kloroform; kloroform : metanol (1:1); dan

metanol

Gambar No. bercak Nilai Rf Warna9. a 1 0,4 Hijau

2 0,6 Kuning kehijauan9. b 1 0,05 Hijau kehitaman

2 0,32 Kuning9. c 1 - Hijau kehitaman

2 0,05 Hijau tua3 0,25 Hijau4 0,31 Kuning5 0,4 Hijau6 0,64 Hijau tua7 0,72 Hijau8 0,85 Kuning

9. d 1 0,3 Kuning kehijauan9. e 1 - Hijau tua

2 0,34 Kuning kehitaman

54



metanol







54



metanol








55

F. Kromatografi Kolom 1

Sistem kromatografi yang digunakan adalah sistem normal, dengan fase

diam dan fase gerak yang digunakan sesuai hasil optimasi sebelumnya, yaitu

silika gel sebagai fase diam dan kloroform sebagai fase geraknya.

Gambar 10. Kromatografi kolom ekstrak n-heksana daun binahong dengan fasediam silika gel dan fase gerak kloroform

Ekstrak pekat n-heksan daun binahong kemudian dimasukkan ke dalam

kolom (Gambar 10.) dan dibiarkan mengendap lalu dielusi menggunakan

kloroform. Eluen kemudian ditampung pada flakon tiap 3menit.

G. Kromatografi Lapis Tipis 1

Kromatografi ini bertujuan untuk membuktikan bahwa eluen yang

diisolasi dari kromatografi kolom 1 merupakan senyawa tunggal. Eluen hasil

isolasi dengan kromatografi kolom dari ekstrak kental n-heksana daun binahong

ditotolkan pada plat KLT yang telah dibuat. Eluen kemudian dielusi dengan

menggunakan tiga fase gerak dengan kepolaran yang berbeda, yaitu: kloroform,


56

kloroform:metanol (1:1), dan metanol untuk membuktikan bahwa isolat yang

diperoleh merupakan senyawa tunggal (Gambar 11.).

Gambar 11. Hasil KLT fraksi I kromatografi kolom 1 ekstrak n-heksana daunbinahong dengan fase diam silika gel dan fase gerak a. kloroform; b. kloroform :

metanol (1:1); c. metanol

Tabel VI. Hasil KLT fraksi I kromatografi kolom 1 dengan fase diam silika gel danfase gerak a. kloroform; b. kloroform : metanol (1:1); c. metanol


2 0,9 Kuning9. b 1 0,89 Kuning9. c 1 - Hijau

2 0,3 Kuning

Dari hasil elusi dapat dilihat bahwa senyawa yang diperoleh bukan

merupakan senyawa tunggal karena pada elusi dengan menggunakan fase gerak

kloroform dan metanol masih diperoleh dua bercak. Senyawa yang diperoleh

belum murni secara KLT maka dapat dilakukan pemisahan lagi dengan

menggunakan kromatografi kolom.

56








2 0,3 Kuning






56








2 0,3 Kuning







57

H. Kromatografi Kolom 2

Dari hasil KLT 1 dapat dilihat bahwa dengan menggunakan fase gerak

metanol senyawa dapat dipisahkan menjadi 2 spot, yang mana terlihat adanya

spot yang tertahan pada titik totolan dan ada spot yang terelusi. Karena itu pada

kromatografi kolom ini dilakukan elusi dengan fase gerak metanol.

Sampel yang berupa fraksi 1 hasil kromatografi kolom 1 dari ekstrak n-

heksana daun binahong sebanyak 0,5mL dimasukkan ke dalam kolom. Ke dalam

kolom lalu dialirkan fase gerak berupa metanol dan eluen ditampung pada flakon

tiap 3menit.

I. Kromatografi Lapis Tipis 2

Eluen hasil isolasi dengan kromatografi kolom 2 ditotolkan pada plat

KLT yang telah dibuat (Gambar 12.). Eluen kemudian dielusi dengan

menggunakan larutan pengembang berupa kloroform (Gambar 12. a),

kloroform:metanol (1:1) (Gambar 12. b), dan metanol (Gambar 12. c).

Dari hasil elusi (Gambar 12.) dapat dilihat bahwa senyawa yang

diperoleh belum berupa senyawa tunggal karena pada elusi dengan menggunakan

fase gerak metanol (Gambar 12. c.) masih dilihat adanya dua spot. Senyawa yang

diperoleh belum murni secara KLT maka perlu dilakukan lagi pemisahan. Karena

dari dua kali pemisahan dengan kromatografi kolom hasil yang diperoleh belum

murni secara KLT, maka penelitian dilanjutkan dengan isolasi menggunakan KLT

preparatif.


58

a b cGambar 12. Hasil KLT fraksi I kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daun

binahong dengan fase diam silika gel dan fase gerak a. kloroform; b. kloroform :metanol (1:1); c. metanol

Tabel VII. Hasil KLT fraksi I kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daunbinahong dengan fase diam silika gel dan fase gerak a. kloroform; b. kloroform :


Gambar No. bercak Nilai Rf Warna12. a 1 0,89 kuning12. b 1 0,2 Kuning12. c 1 - Hijau

2 0,47 Kuning

J. Optimasi Fase Gerak 2

Dari hasil KLT (Gambar 12.) dapat dilihat bahwa dengan menggunakan

kloroform senyawa tidak dapat dipisahkan (Gambar 12. a) (1 bercak pada KLT)

sedangkan dengan menggunakan metanol senyawa dapat terpisah menjadi dua

bercak (Gambar 12.c) namun terdapat dua spot yang tidak saling berpisah, karena

itu perlu dilakukan optimasi fase gerak untuk memisahkan senyawa tersebut agar

diperoleh senyawa murni secara KLT. Fase gerak yang digunakan pada optimasi

ini adalah kloroform dan metanol dengan berbagai perbandingan, yaitu

58






2 0,47 Kuning









58






2 0,47 Kuning










59

kloroform:metanol 15:1, 13:1, 11:1, 9:1, 7:1, 5:1, 3:1, 2:1, kloroform, 1:1,

metanol, 1:2, 1:5, 1:9, dan 1:19.


60

Gambar 13. Hasil KLT fraksi I hasil kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daunbinahong dengan fase diam silika gel dan fase gerak kloroform : metanol; a.15:1, b. 13:1, c. 11:1, d. 9:1, e. 7:1, f. 5:1,g. 3:1, h. 2:1, i. kloroform, j. 1:1, k.

metanol, l. 1:2, m. 1:5, n. 1:9, dan o. 1:19

Tabel VIII. Hasil KLT fraksi I kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daunbinahong dengan fase diam silika gel dan fase gerak a. kloroform; b. kloroform :


Gambar No. bercak Nilai Rf Warna13. a 1 0,91 Kuning13. b 1 0,91 Kuning13. c 1 0,98 Kuning13. d 1 0,92 Kuning13. e 1 0,92 Kuning13. f 1 0,88 Kuning13. g 1 0,85 Kuning13. h 1 0,55 Kuning

2 0,65 Hijau13. i 1 0,86 Kuning13. j 1 0,3 Kuning kehijauan13. k 1 - Kuning

2 0,5 Hijau13. l 1 0,77 Kuning13. m 1 - Kuning

2 0,35 Kuning3 0,55 Hijau muda

13. n 1 - Kuning2 0,29 Kuning3 0,48 Hijau muda

13. o 1 - Kuning2 0,28 Kuning3 0,5 Hijau muda


61

Dari gambar 13 dapat dilihat bahwa pemisahan paling baik diperoleh

dengan menggunakan fase gerak kloroform:metanol (1:19) (Gambar 13. o).

Karena itu fase gerak ini kemudian digunakan pada KLT preparatif.

K. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Berdasarkan hasil optimasi sebelumnya maka pada KLT preparatif ini

digunakan silika gel sebagai fase diam dan kloroform:metanol (1:19) sebagai fase

gerak.

Dari gambar 14 dapat dilihat adanya tiga pita yang menunjukan adanya

tiga senyawa. Yang diisolasi adalah senyawa pada pita pertama karena pita ini

menunjukkan pemisahan yang baik dan pita tidak mengekor. Pita pertama

kemudian dikerok dan diekstraksi dengan menggunakan kloroform. Ekstrak encer

ini kemudian dikentalkan dengan menggunakan rotary vaccum evaporator.

Gambar 14. Hasil KLT preparatif dengan fase gerak kloroform : metanol (1:19)


62

Tabel IX. Hasil KLT fraksi I kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daunbinahong dengan fase diam silika gel dan fase gerak a. kloroform; b. kloroform :


Gambar No. bercak Nilai Rf Warna14. a 1 - Hijau muda14. b 1 0,15 Kuning14. c 1 0,5 Kuning

L. Kromatografi Lapis Tipis 3

Isolat hasil isolasi dengan KLT preparatif kemudian ditotolkan pada plat

KLT yang telah dibuat. Eluen kemudian dielusi dengan menggunakan larutan

pengembang berupa kloroform (Gambar 15. a), kloroform:metanol (1:1) (Gambar

15. b), dan metanol (Gambar 15. c).

a b cGambar 15. Hasil KLT dengan fase gerak a. kloroform; b. kloroform : metanol

(1:1); c. metanol

Dari hasil elusi dapat dilihat bahwa senyawa yang diperoleh telah berupa

senyawa tunggal (Gambar 15) karena pada elusi dengan menggunakan tiga fase

gerak yang berbeda kepolarannya telah diperoleh satu bercak dengan nilai Rf yang

berbeda; yaitu 0,85 untuk fase gerak kloroform (Gambar 15.a), 0,7 untuk fase


63

gerak kloroform:metanol (1:1) (Gambar 15. b), dan 0,55 untuk fase gerak

metanol(Gambar 15. c). Senyawa yang diperoleh telah murni secara KLT maka

dapat dilakukan elusidasi struktur.

M. Spektrometri UV/Vis

Bila cahaya UV/Vis dikenakan pada suatu senyawa maka sebagian dari

cahaya tersebut akan diserap oleh molekul yang memiliki tingkat energi yang

spesifik. Karena level energi dasar ke energi eksitasi tiap molekul spesifik maka

energi (sinar) yang diserap juga spesifik yang merupakan dasar analisa kualitatif.

Untuk menaikan elektron ke energi eksitasi yang lebih tinggi maka dibutuhkan

cahaya dengan energi tinggi atau energi dengan panjang gelombang yang lebih

pendek.

Gambar 16. Spektrum UV/Vis fraksi I ekstrak n-heksana


64

Dari spektrum UV/Vis (Gambar 16) dapat dilihat adanya serapan pada

panjang gelombang 274,5nm, yang dapat menyatakan adanya senyawa 1, 2, 8a-

trimethyl-1, 2, 3, 4, 8, 8a-hexahydronaphthalene yang memiliki panjang

gelombang maksimum teoritis sebesar 273nm dan pengamatan 275nm (Panji,

2012). Pergeseran panjang gelombang yang terjadi dari percobaan dan teori

adalah sebesar 1,5nm, sedangkan pergeseran yang diperbolehkan adalah sebesar

2nm sehingga dapat dikatakan merupakan senyawa ini merupakan 1, 2, 8a-

trimethyl-1, 2, 3, 4, 8, 8a-hexahydronaphthalen.

Perhitungan panjang gelombang maksimum senyawa :

harga pokok λ maks diena homoanuler = 253 nm

tiga sisi cincin @ 5nm (tanda x) = 15 nm

satu ikatan rangkap eksosiklik (terhadap cincin) = 5 nm +

λ maks teoritis = 273 nm

λ maks pengamatan = 274,5 nm

x

x

x

1,2,8a-trimethyl-1,2,3,4,8,8a-hexahydronaphthaleneGambar 17. Senyawa 1,2,8a-trimethyl-1,2,3,4,8,8a-hexahydronaphthalene


65

N. GC-MS

Identifikasi struktur dengan menggunakan kombinasi antara kromatografi

gas dan spektrometri massa memiliki kelebihan karena senyawa dapat dipisahkan

dahulu dengan menggunakan kromatografi gas kemudian dielusi dengan

spektrometri massa. Spektra massa yang diperoleh dapat digunakan untuk

menentukan bobot molekul senyawa hasil isolasi dari ekstrak n-heksana daun

binahong. Spektra massa juga dapat digunakan sebagai petunjuk keberadaan

gugus-gugus fungisional dan penyelidikan kerangka molekul senyawa hasil reaksi

melalui interpretasi fragmen-fragmennya.

Untuk mendapatkan struktur senyawa dari spektrum yang dihasilkan

maka dapat dilakukan pendekatan dengan pola fragmentasi dari masing-masing

spektrum. Dalam spektroskopi massa, fragmen-fragmen yang akan terdeteksi

adalah fragmen-fragmen bermuatan positif, sedangkan fragmen yang berupa

molekul netral atau radikal tidak akan terdeteksi.

Dari spektrum (Gambar 18) senyawa yang merupakan peak pertama pada

kromatogram GC dengan TR 18,721, dapat diketahui bobot molekul dari senyawa

yaitu 270 yang dapat dilihat dari peak paling kanan. Peak ini muncul dengan

intensitas rendah, artinya ion molekul ini tidak stabil dan mudah terfragmentasi

menjadi ion-ion lain atau menjadi molekul netral atau radikal.

Gambar 18. Spektrum MS peak 1 pada GC dengan Retention time 18,721menit


66

Pada spektrum juga dapat dilihat bahwa ion dengan nilai m/z = 74

merupakan ion dengan kelimpahan paling besar dan merupakan ion yang paling

stabil atau juga disebut base peak. Peak ini juga menyatakan adanya gugus metil

ester (Panji, 2012).

CHHC11H23

H2CCH2

COCH3

OH3C(H2C)10HC CH2

OH

H2C OCH3

Gambar 19. Fragmen hasil penyusunan ulang senyawa karbonil

Peak dengan m/z = 43 menyatakan adanya keton (Gambar 20. (a)) (Panji, 2012).

CCH3

O

(a)

-CH2-

(b)

O

COCH3

(c)

CH2CH2COCH3

O

(d)Gambar 20. (a) keton; (b) potongan gugus metil; (c) metil karboksilat; (d) metil etil

ester

O

COH3C

CH3 -OCH3 CCH3

O

Gambar 21. Fragmen hasil pemutusan (-OCH3)

m/z = 57 menyatakan adanya keton dengan adanya penambahan gugus metil

(Gambar 20. (b)), m/z = 59 menyatakan adanya metil karboksilat (Gambar 20. (c))

(Panji, 2012) dan m/z = 87 menyatakan adanya metil etil ester (Gambar 20. (d))

(Hartomo, 1986). Penambahan kelipatan 14 setelahnya berasal dari potongan

gugus metil (Gambar 20. (a)) (Panji, 2012). Dari hasil fragmentasi maka dapat


67

disimpulkan bahwa senyawa ini merupakan metil heksadekanoat. Hasil ini dapat

dibuktikan dengan similiarity index yang bernilai 95.

Dari spektrum (Gambar 22) senyawa yang merupakan peak kedua pada






Pada spektrum dapat dilihat bahwa ion dengan nilai m/z = 55 merupakan

ion dengan kelimpahan paling besar dan merupakan ion yang paling stabil atau

juga disebut base peak. Peak ini juga menyatakan adanya ikatan tidak jenuh pada

senyawa, yang merupakan senyawa alkena (Panji, 2012).

Peak dengan m/z = 41 menyatakan adanya pemutusan ikatan metil

(Gambar 20. (b)) dari senyawa alkena, peak dengan m/z = 43 menyatakan adanya

keton (Gambar 20. (a)) (Panji, 2012), m/z = 57 menyatakan adanya keton dengan

adanya penambahan gugus metil (Gambar 20. (b)), m/z = 59 menyatakan adanya

metil karboksilat (Gambar 20. (c)) (Panji, 2012) dan m/z = 87 menyatakan adanya

metil etil ester (Gambar 20. (d)) (Hartomo, 1986). Penambahan kelipatan 14

setelahnya berasal dari gugus metil (Gambar 20. (b)) (Panji, 2012). Dari hasil

fragmentasi maka dapat disimpulkan bahwa senyawa ini merupakan metil 10-


68

metil oktadekanoat. Hasil ini dapat dibuktikan dengan similiarity index yang

bernilai 96.

Dari spektrum (Gambar 23) senyawa yang merupakan peak ketiga pada








stabil atau juga disebut base peak. Peak ini juga menyatakan adanya gugus metil

ester (Panji, 2012).

Peak dengan m/z = 43 menyatakan adanya keton (Gambar 20. (a)) (Panji,

2012), m/z = 57 menyatakan adanya keton dengan adanya penambahan gugus

metil (Gambar 20. (b)), m/z = 59 menyatakan adanya metil karboksilat (Gambar

20. (c)) (Panji, 2012) dan m/z = 87 menyatakan adanya metil etil ester (Gambar

20. (d)) (Hartomo, 1986). Penambahan kelipatan 14 setelahnya berasal dari gugus

metil (Gambar 20. (b)) (Panji, 2012). Dari hasil fragmentasi maka dapat

disimpulkan bahwa senyawa ini merupakan metil isostearat. Hasil ini dapat

dibuktikan dengan similiarity index yang bernilai 95.


69

Dari spektrum (Gambar 24) senyawa yang merupakan peak keempat

pada kromatogram GC dengan TR 23,192, dapat diketahui bobot molekul dari

senyawa yaitu 259 yang dapat dilihat dari peak paling kanan. Peak ini muncul

dengan intensitas rendah, artinya ion molekul ini tidak stabil dan mudah

terfragmentasi menjadi ion-ion lain atau menjadi molekul netral atau radikal.




stabil atau juga disebut base peak (Panji, 2012). Peak ini juga menyatakan adanya

1-oktanol (Gambar 25. (a)).

O C8H17

(a)

O

CC4H8O

CC8H17

O

(b)Gambar 25. (a) ion 1-oktanol; (b) ion hasil pemutusan ion 1-oktanol dari dioktil

adipat

O

CC4H8O

CC8H17

O

OC8H17

O

CC4H8O

CC8H17

O

+

O C8H17

Gambar 26. Fragmen hasil pemutusan (-OC8H17)


70

Peak dengan m/z = 43 menyatakan adanya keton (Gambar 20. (a)) (Panji,

2012), m/z = 57 dan 71 menyatakan adanya keton dengan adanya penambahan

gugus metil (Gambar 20. (b)), dan m/z = 241 menyatakan adanya ion hasil

pemutusan ion 1-oktanol dari dioktil adipat (Gambar 25. (b)). Dari hasil

fragmentasi maka dapat disimpulkan bahwa senyawa ini merupakan dioktil

adipat. Hasil ini dapat dibuktikan dengan similiarity index yang bernilai 95.

Dari spektrum (Gambar 27) senyawa yang merupakan peak kelima pada








stabil atau juga disebut base peak. Peak ini juga menyatakan adanya

isobenzofuran-1,3-dione (Gambar 28.) (Panji, 2012).


71

O

O

OGambar 28. isobenzofuran-1,3-dione

OOC8H17

O

O

C8H17-C8C17-OC8H17

O

O

OGambar 29. Fragmen hasil pemutusan (-OC8H17 dan –C8H17)

Pada efek orto, interaksi yang terjadi adalah interaksi ruang. Jika ada

gugus letaknya dalam ruang berdekatan, ada kemungkinan dilepaskan satu

fragmen netral yang bagian-bagiannya berasal dari kedua gugus tersebut. Peak

dengan m/z = 43 menyatakan adanya keton (Gambar 20. (a)), m/z = 57

menyatakan adanya keton dengan adanya penambahan gugus metil (Gambar 20.

(b)), m/z = 77 menyatakan adanya gugus benzen (Panji, 2012). Dari hasil

fragmentasi maka dapat disimpulkan bahwa senyawa ini merupakan metil

isostearat. Hasil ini dapat dibuktikan dengan similiarity index yang bernilai 95.

Dari spektrum (Gambar 30) senyawa yang merupakan peak keenam pada






72




stabil atau juga disebut base peak. Peak ini juga menyatakan bahwa senyawa

adalah suatu hidrokarbon (Panji, 2012).

Peak dengan m/z = 43 menyatakan adanya pemutusan metil (Gambar 20.

(b)), m/z = 71, 85, 99, 113, 127, 141, 155, dan 169 yang merupakan penambahan

kelipatan 14 yang berasal dari gugus metil (Gambar 20. (b)) (Panji, 2012). Dari

hasil fragmentasi maka dapat disimpulkan bahwa senyawa ini merupakan n-

oktakosana. Hasil ini dapat dibuktikan dengan similiarity index yang bernilai 96.

Dari spektrum (Gambar 31) senyawa yang merupakan peak ketujuh pada







73



stabil atau juga disebut base peak. Peak ini menyatakan adanya senyawa

hidrokarbon (Panji, 2012).

Peak dengan m/z = 43 menyatakan adanya pemutusan metil (Gambar 20.

(b)), m/z = 71, 85, 99, 113, 127, 141, 155, 169,183, dan 197 yang merupakan

penambahan kelipatan 14 berasal dari gugus metil (Gambar 20. (b)) (Panji, 2012).

Dari hasil fragmentasi maka dapat disimpulkan bahwa senyawa ini merupakan n-

tetratetrakontana. Hasil ini dapat dibuktikan dengan similiarity index yang bernilai

97.

Dari 10 peak yang ada, dapat dianalisis senyawa yang terkandung dalam

ekstrak n-heksana daun binahong, antara lain seperti yang terdapat pada tabel X di

bawah ini:

No.

Peak

TR

(menit)

Area

(%)

SI

(%)Formula BM Nama dan Struktur Senyawa

(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g)

1 18,721 3,86

95 C17H34O2 270

O

O

Methyl hexadecanoate

95 C17H34O2 270

O

O



74

(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g)

1 18,721 3,86

95 C17H34O2 270

O

O


95 C16H32O2 256

O

O

Methyl pentadecanoate

94 C20H40O2 312

O

O

Methyl nonadecanoate

2 20,496 4,25

96 C19H36O2 296

O

OH

Oleic acid

96 C19H36O2 296

O

O

Methyl octadec-10-enoate

96 C19H36O2 296

O

O


95 C19H36O2 296

O

O


95 C19H36O2 296

O

O



75

(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g)

3 20,728 4,21

95 C19H38O2 298

O

O

Methyl 16-methylheptadecanoate

95 C19H38O2 298

O

O

Methyl stearate

95 C20H40O2 312

O

O

Methyl nonadecanoate

95 C16H32O2 256

O

O

Methyl pentadecanoate

95 C19H38O2 298

O

O

Methyl stearate

4 23,192 1,70

95 C22H42O4 370O

O

O

O

Dioctyl adipate

95 C22H42O4 370O

O

O

O

Dioctyl adipate

95 C22H42O4 370O

O

O

O

Dioctyl adipate


76

(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g)

4 23,192 1,70 91 C22H42O4 370O

O

O

O

Dioctyl adipate

5 24,509 13,30

97 C24H38O4 390

O

O

O

O

Dioctyl phthalate

96 C24H38O4 390

O

O

O

O

Bis(6-methylheptyl) phthalate

96 C24H38O4 390O

O O

O

Bis(2-ethylhexyl) phthalate


77

(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g)

5 24,509 13,30

96 C24H38O4 390

O

O O

O

Bis(2-ethylhexyl) phthalate

93 C24H38O4 390

O

O

O

O

Dioctyl phthalate

6 25,505 1,49

96 C28H58 394Octacosane

96 C24H50 338Tetracosane

96 C21H44 296 Henicosane

96 C44H90 618Tetratetracontane


78

(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g)

6 25,505 1,49 96 C44H90 619Tetratetracontane

7 26,961 2,34



96 C27H56 380Heptacontane

96 C36H74 507Hexatriacontane

96 C35H72 492Pentatriacontane

Dari spektrum ini dapat diketahui adanya senyawa asam lemak dan

alkana yang terdapat pada ekstrak n-heksana daun binahong.

O. Sktroskopi Inframerah

Spektrum infra merah yang diperoleh dapat digunakan untuk mengetahui

secara spesifik gugus-gugus fungisional yang terdapat pada senyawa hasil isolasi

dari ekstrak n-heksana daun binahong sehingga dapat diperoleh gambaran yang

lebih jelas mengenai struktur senyawa hasil isolasi.


79

Gambar 32. Spektrum IR fraksi I ekstrak n-heksana daun binahong

Idealnya sebuah spektrum IR akan berfungsi ketika senyawa yang diuji

merupakan senyawa tunggal, sedangkan dari hasil GC-MS sebelumnya telah

diketahui bahwa senyawa yang diidentifikasi bukan merupakan senyawa tunggal.

Namun dari spektrum ini (Gambar 32) dapat dilihat adanya gugus-gugus

fungisional khusus yang terdapat pada senyawa yang diidentifikasi, antara lain:

adanya serapan pada bilangan gelombang 3448,62/cm yang menyatakan adanya

gugus asam karboksilat, 3016,67/cm yang menyatakan adanya gugus metil (sp2),

2924,09 dan 2854,65/cm yang menyatakan adanya gugus metil (sp3), 1712,79/cm


80

yang menyatakan adanya gugus karbonil, 1589,34/cm yang menyatakan adanya

gugus aromatis, 1219,01/cm yang menyatakan adanya gugus ester.

P. Analisis Hasil

Dari uji pendahuluan ekstrak n-heksana tanaman binahong dan fraksi I

hasil kromatografi kolom ekstrak n-heksana tanaman binahong diperoleh adanya

senyawa golongan steroid. Hasil ini didukung dengan spektrum UV/Vis fraksi I

ekstrak n-heksana tanaman binahong yang dapat menyatakan adanya seyawa 1, 2,

8a-trimethyl-1, 2, 3, 4, 8, 8a-hexahydronaphthalene, dimana dari strukturnya

dapat dilihat bahwa senyawa ini merupakan potongan dari struktur umum

senyawa metabolit sekunder golongan steroid. Untuk membuktikan struktur

senyawa yang diperoleh maka identifikasi dilanjutkan dengan menggunakan GC-

MS. Dari kromatogram GC diperoleh 10 peak yang menyatakan bahwa senyawa

yang diidentifikasi bukan merupakan senyawa tunggal dan dari spektrum MS

diperoleh adanya asam lemak (metil heksadekanoat, asam oleat, metil 16-

metilheptadekanoat, dioktil adipat, dioktil ptalat) dan senyawa golongan alkana

(oktakosana, dan tetratetrakontana) dan tidak menunjukan adanya senyawa

metabolit sekunder golongan steroid. Tidak terlihat adanya senyawa metabolit

sekunder golongan steroid dapat disebabkan karena steroid tidak dapat

diidentifikasi dengan menggunakan GC-MS berhubungan dengan sifat steroid

yang tidak mudah menguap. Sedangkan senyawa asam lemak dapat diidentifikasi

walaupun memiliki titik didih yang tinggi karena ketika masuk ke dalam GC,

asam lemak mengalami proses esterifikasi yang menyebabkan turunnya titik didih

asam lemak.


81

Idealnya senyawa yang diidentifikasi dengan IR adalah senyawa tunggal,

namun spektrum IR yang diperoleh dapat menunjukan adanya gugus-gugus yang

dapat mengarahkan pada struktur senyawa yang terdapat pada fraksi I ekstrak n-

heksana tanaman binahong, antara lain adanya gugus asam karboksilat, gugus

metil, gugus karbonil, gugus aromatis, dan gugus ester, yang mana gugus

aromatis, dan metil terdapat pada sttruktur steroid sedangkan gugus asam

karboksilat, gugus metil, gugus karbonil, dan gugus ester terdapat pada struktur

asam lemak dan alkana.


82

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Pada penelitian ini dapat disimpulkan :

1. Skrining fitokimia dan analisis spektroskopi dengan menggunakan

spektrofotometri UV/Vis dapat diidentifikasi adanya steroid dalam fraksi I

ekstrak n-heksana daun binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis).

2. Spektroskopi massa senyawa hasil pemisahan dengan kromatografi gas

menunjukan bahwa terdapat asam lemak : metil heksadekanoat, asam oleat,

metil 16-metilheptadekanoat, dioktil adipat, dioktil ptalat; dan senyawa metil

oktakosana, dan tetratetrakontana dari golongan alkana.

B. Saran

Perlu dilakukan identifikasi lebih lanjut untuk mengetahui struktur

steroid yang terkandung di dalam fraksi I ekstrak n-heksana daun binahong

(Anredera cordifolia (Ten.) Steenis).


83

Daftar Pustaka

Arisadita, R., 2010, Uji Aktivitas Antimikroba Ekstrak n-Heksana dan Fraksi TerpenoidTanaman Anredera Cordifolia (Ten.) Steenis Terhadap Staphylococcus aureus,Eschericia coli dan Candida albicans, skripsi, Univerversitas Muhammadiyah,Surakarta.

Arisandi, Y., dan Andriani, Y., 2006, Khasiat Berbagai Tanaman untuk Pengobatan,Eksamedia, Jakarta, pp. 119.

Asriani, J. A., 2011, Uji Efek Tonikum Infusa Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.)Steenis) pada Mencit Putih (Mus musculus) Jantan Galur Swiss Webster, skripsi,Universitas Muhammadiyah, Surakarta.

Barboza, G., E., Cantero, J., J., Nunez, C., Pacciaroni, A., and Espinar, L., A., 2009, MedicalPlants; A General Review and A Phytochemical and Ethnopharmacological Screeningof The Native Argentine Flora, 34 (1-2), 162.

Bassett, J., Denney, R.C., Jeffery, G. H., and Mendham, J., 1994, Vogel’s Textbook OfQuantitative Inorganic Including Elementary Instrumental, diterjemahkan olehPudjaatmaka, H. A., dan. Setiono, L., Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Day, R. A. JR., and Underwood, A. L., 2002, Quantitative Analisis, ed 6, diterjemahkan olehWibi, H. H., dan Simartama, L., Erlangga, Jakarta.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1979, Farmakope Indonesia, ed 3, DepartemenKesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1989, Materia Medika Indonesia, ed 5, 549-553,Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995, Farmakope Indonesia, ed 4, DepartemenKesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Fai, Y. M., and Tao, C. C., 2009, A Review on Presence of Oleanolic Acid in NaturalProducts, (2). 91.

Gritter, R. J., Bobbitt, J. M., and Schwarting, A. E., 1991, Pengantar Kromatografi, ed 2,Penerbit ITB, Bandung.

Harborne, J. B., 1987, Phytochemical Methods, 2sd ed, diterjemahkan oleh Padmawinata, K,.dan Soediro, I., Penerbit ITB, Bandung.

Hostettmann, K., Hostettmann, M., and Marston, A., 1986, Cara Kromatografi PreparatifPenggunaan Pada Isolasi Senyawa Alam, Penerbit ITB, Bandung, pp. 9-11.

Kurniati, H., 2011, Uji Efektivitas Ekstrak Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.)Steenis.) sebagai Antibakteri Salmonella typhi Penyebab Tifus, skripsi, UniversitasBengkulu, Bengkulu.


84

Khopkar, S. M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta.

Khunaifi, M., 2010, Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Binahong (Anredera cordifolia(Ten.) Steenis) Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus dan Pseudomonasaeruginosa., skripsi, Universitas Islam Negeri Malana Malik Ibrahim, Malang.

Mann, J., Davidson, R. S., Hobbs, J. B., Banthorpe, D. V., Harbone, J. B., 1994, NaturalProducts: Their Chemistry and Biological Significance, Prenticehall, Inggris, pp. 339.

Manoi, F., 2009, Binahong (Anredera cordifolia) Sebagai Obat, Warta Penelitian danPengembangan Tanaman 4 Industri, Volume 15 Nomor 1.

Octavia, D. R., 2009, Uji Aktivitas Penangkap Radikal Ekstrak Petroleum Eter, Etil Asetatdan Etanol Daun Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen) dengan MetodeDPPH (2,2-difenil-1- pikrihidrazil). skripsi, Univerversitas Muhammadiyah, Surakarta.

Panji, T., 2012, Teknik Spektroskopi untuk Elusidasi Struktur Molekul, Graha Ilmu,Yogyakarta, pp. 3-4; 56-57.

Tobing, R. L., 1989, Kimia Bahan Alam (Suatu Penelitian Kepustakaan), DepartemenPendidikan dan Kebudayaan, Jakarta, pp. 131-132.

Umi, 2011, Metode Ekstraksi, www.fitokimiaumi.pdf, diakses tanggal 2 Maret 2012.

Wibisono, R. S., 2010, Penetapan Kadar Asam Ursolat dalam Ekstrak Daun Binahong(Anredera cordifolia (Ten.) Steenis dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja TinggiFase Terbalik, skripsi, 38, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.


85

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Determinasi Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis)


86

Lampiran 2. Contoh Perhitungan Nilai Rf KLT

Rf =

Kromatografi Lapis Tipis 3

I. Fase gerak kloroform

Rf =,

= 0,85

II. Fase gerak kloroform : metanol (1:1)

Rf = = 0,7

III. Fase gerak metanol

Rf =,

= 0,55

Lampiran 3. Spektrum UV/Vis


87PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

88

Lampiran 4. Spektrum GC-MS













100

Lampiran 5. Spektrum IR


101

BIOGRAFI PENULIS

Wilfrida Maria Du’a merupakan anak kedua dari tiga

bersaudara dari pasangan Frederikus Mena dan Yosefina Wawo.

Lahir di Kupang pada tanggal 7 Oktober 1989. Pendidikan awal

dimulai di Taman Kanak-kanan Sta. Maria Assumpta Kupang pada

tahun 1995-1996. Dilanjutkan ke Sekolah Dasar Katolik Don

Bosco II Kupang pada tahun 1996-1999 dan menyelesaikan sekolah

dasar di Sekolah Dasar Katolik Ngedukelu pada tahun 1999-2002.

Pendidikan Menengah dilakukan di Sekolah Lanjutan Tingkat Pertama Negeri II Bajawa

pada tahun 2002-2005 dan pada tahun 2005-2008 melanjutkan di Sekolah Menengah Atas

Negeri I Bajawa kemudian menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Sanata Dharma pada

Tahun 2008. Selama menempuh kuliah, penulis aktif dalam beberapa kegiatan

kemahasiswaan, yaitu Sie Dekorasi dan Dokumentasi PpnEC 2010, aktif menjadi anggota

Unit Kegiatan Fakultas (UKF) Dance Fakultas Farmasi 2008-2010, UKF Paduan Suara

Veronica 2009-2010 dan Komunitas Sant Egidio 2009-2012. Selain itu, penulis juga aktif

dalam kegiatan akademik dengan menjadi Asisten Dosen Praktikum Kimia Analisis dan

Farmasi Fisika pada tahun 2011.


Documents

IDENTIFIKASI SENYAWA FRAKSI I EKSTRAK n-HEKSANA DAUN ... · daun binahong dan (b ) fraksi I kromatografi kolom 2 ekstrak n-heksana daun binahong..... 45 Tabel III. Hasil KLT senyawa