Upload
ngocong
View
239
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Igazságügyi genetika alapjai
Molekuláris orvostudomány -
molekuláris bűnjelek genetikai analízise
Pádár Zsolt
„Nyomok” - Death Valley, CA 2007 / 10 / 11
… vannak az ÉLET dolgai …
… és vannak ROSSZ dolgok az életben …… ezek egy részét mi tesszük …… másokat velünk tesznek meg …
… és vannak, amiről azt állítják, mi tettük meg …
… vannak, az életben NAGYON ROSSZ dolgok is …
… amiről azt gondoljuk, csak mással történhet meg …
Igazságügyi genetika
BŰNCSELEKMÉNYEK
Genetika
Transzmissziós genetikaMolekuláris genetikaPopuláció genetikaÖkológiai genetikaKvantitatív genetikaViselkedés genetikaKlinikai genetikaCitogenetikaMitokondriális genetikaGenomika…
forward genetikareverse genetikaevolúciógenetika -molekuláris taxonómiaepigenetikafarmakogenetikaigazságügyi genetikapatogenetikagenetikai informatikagénsebészet -genetic engineeringgenetikai etika…
JogtudományokKriminalisztikaOrvos-tudományokÁllatorvos-tudományok
2008. 11. 1. / 2009. 05. 04.
Az igazságügyi genetika …Genetika és jogtudománya gyermek tulajdonságai nem csupán a szülői tulajdonságok
összegződése „a tudomány csak eljárás, nem maga az igazság”
Alkalmazott tudományfizikai nyomok és anyagmaradványok vizsgálata molekuláris
genetikai technikák objektív alkalmazásával, ezáltal igazolva az adott bűncselekményt illetve az azzal fennálló kapcsolatot
eszköz, melynek segítségével a kriminalisztikai hipotézisek megerősíthetők avagy elvethetőkKölcsönös befolyás az alaptudományokramolekuláris genetikai módszerek alkalmazása, módosításaalaptudományokkal kapcsolatos követelmények módosítása új tudományos adatok szolgáltatása gazdasági, társadalmi fejlődésére, közösségekre és a
mindennapok emberére gyakorolt hatások
Szakkérdések …Humán vonatkozások
bűncselekményekemberölés, rablás, erőszakos közösülés …
vitatott szülőségleszármazás
rendkívüli halálrendkívüli szívhalál (SCD)
arrhythmiás szívhalál szindróma
hirtelen csecsemőhalál (SIDS)tömegszerencsétlenségek
áldozatok azonosítása
Szakkérdések …
Nem humán vonatkozásokállatok
kutyák, macskák, vadvilág…állatkínzás, állat támadások, vadorzás …
entomologiahalál időpontja, helye
növények és gombáklevelek, magvak …pollenek
Mikrobáktalajbaktériumok
Genetikai polimorfizmusok analízise
Recesszív gén hőmérséklet szenzitív expressziójaTYR gén ► tirozináz enzim ► melanin szintézis
Defektív tirozináz ► funkcióvesztés normál testhőmérsékleten
Első lépés - a helyszín …
„CSIUniversity ☺”
Vizsgálati komplexitás - „DNA investigation”
Azonosítás – identifikációEredet meghatározása - honnan származik az eredmény?
Azonosságok megállapítása – közös eredet –individualizáció
sejtmagi és mitokondriális DNSBármilyen biológiai anyagból és anyagmaradványból történhet
Mennyiségi korlátok – vizsgálhatóság, reprodukálhatóság, igazolhatóságMinőségi korlátok – minőségromlás, degradálódás, bomlás, szennyezettség, felülszennyezettségReakció komplexitás – sztochasztikaGenetikai komplexitás - pigmentáció
Követelmények …Az igazságügyi genetikai vizsgálatok nem tudományos kísér-letek, hanem tudományos módszerekkel végzett analízisek…
Érzékenység, megbízhatóság, ismételhetőség, ellenőrizhetőség
Technológia, módszertanTudományos kritériumok, statisztikaEtikai kritériumok
FelelősségMinőségirányítás
… és vannak, amiről azt állítják, mi tettük meg …
A kiindulás …Humán és nonhumán DNS
Sejtmagi DNSAutoszómák
Repetitive markerek (VNTR, STR)Single nucleotide polymorphisms (SNP)
Ivari kromoszómákRepetitive markerek (VNTR, STR)Single nucleotide polymorphisms (SNP)
Mitokondriális DNSCytochrome (b)Kontroll régió (HVI, HVII, CR)SNP
Mérföldkövek …
LandsteinerJeffreys
Mullis
PCR
Short Tandem Repeats (STRs)
AATG AATG AATG
Fluoreszcensfesték
7 repetíció
8 repetíció
A flanking régiók (ahol a PCR primerek kötnek)konstans, a repetitív régió variabilis a mintákban
Homozigota = mindkét allél egyforma hosszúHeterozigota = különböző allélhosszakA primerek pozíciója meghatározza a PCR termék méretét
Elválasztás és detektálás
Minta detektálás
CCD Panel
Szín szerinti
szeparálás
Ar+ LASER (488 nm)
Fluoreszcencia ABI Prism spectrograph
Kapillárisvagy gél
Méret-szeparálás
Detektá-lási régió
Fluoreszcens detektálás
Jelölt DNA fragmens(PCR termék)
A laboratóriumban …
Short Tandem Repeats (STRs)
13 STR lokusz kromoszómális pozíciója
CSF1PO
D5S818
D21S11
TH01
TPOX
D13S317
D7S820
D16S539 D18S51
D8S1179
D3S1358
FGAVWA
AMEL
AMEL
amelogenin
D19
D3
D8
TH01
VWA D21FGA
D16D18 D2
amelogeninD19
D3D8 TH01
VWA D21
FGA
D16D18 D2
Két
elté
rősz
emél
y
Allélméret (bp)
Gombostűfejnyi vérfoltból kb. 5 óra elteltével nyert eredmény
véletlenszerű egyezés esélye: ~1 a 3 milliárdhoz
Személyazonosító vizsgálat-multiplex STR
10 STR és a biológiai nem egyidejű vizsgálata
AmpFlSTR® SGM Plus™ kit
9 autoszómás lokusz
15 autoszómás lókusz …
… mondjuk, egy szúnyogból ?
Ez itt én vagyok !!!
Növekvő jelentőség - Y-kromoszóma …Növekvő jelentőség - Y-kromoszóma …
STR lokuszokDYS19
DYS389I/II
DYS390
DYS391
DYS392
DYS393
DYS385
YCAII
DYS437
DYS438
DYS439
Y
http
://w
ww
.ncb
i.nlm
.nih
.gov
/gen
ome/
guid
e/
Human Genome
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
17 Y-kromoszómás lokusz - haplotípus
Beszédes boríték …brutálisan meggyilkolt áldozat…ellentmondó vallomás…
egyszerű személyiség…„nem én voltam …”kevés információ, sok kétség …
… boríték a helyszínen …sejtmagi DNS vizsgálat …
Az ujjnyomat…
Az ujjnyomat - eredményekautoszómális lókuszokY-STR lókuszok
származás
Egy-nukleotid polimorfizmusok (SNP’s)
Több millió SNP a genombankb. 500-1000 bázispáronkéntpontmutációk génekben és/vagy regulátor régiókban
Fenotípus kapcsolatokpigmentáció, testalkat, …
Leszármazási vonalak (Y-SNP’s)Diagnosztika
multifaktoriális poligénes betegségek
T T C A A G Templát
Primer
Különböző hosszúságúfarokkal tervezett primerek
SNaPshotTM Multiplex Kit:egy bázis extenzió
C G
Primer extenzióés termináció
TA
T
C
A
GA AT
GC
CG
G
T
C Szín = genotípus
Hossz = lókuszElektroforézis
Automatikus analízis
A mitokondriális genomcirkuláris DNSCambridge Referencia Szekvencia~ ezer kópia sejtenkéntnincs hiszton asszociációmagas mutációs ráta
D-loop esetében ~ 9000 év alatt 1%oxidáló szabadgyök érzékenység
betegségek, öregedésnincs excíziós repair-rendszer
nem javítódik, csak szelektálódikpalacknyak hatás
heteroplazmiarekombináció egy mitokondriumonbelül, nukleáris DNS-re jellemzőrekombinációs variancia nincskizárólag anyai öröklődésű
öröklődése földrajzilag determinálta nem kódoló szakaszok mutációinak rögzülése és maternális öröklődése lehetőséget ad a populációk geológiai eredet szerinti elkülönítésére
A kontroll régió
Kontroll Régió (CR) –D(isplacement)-loop
~1120 bpreplikációs origóhipervariábilis szakaszok
HV1, HV2 és HV3alacsony szelekciós nyomása variációk forrása csak mutáció
Szekvencia-adatbázisokEMPOP
Kontroll Régió (D-loop)
1/16569
cyt b
ND5ND6
ND4
ND4L
ND3
COIIIATP6
ATP8 COII
12S rRNS
16S rRNS
ND1
ND2
COI
OH
OL
HV1 HV216024 16365 73 340
16024 576
„16 569” bp
Igazságügyi szempontok …A mtDNS egyedi azonosításra kevésbé alkalmas, mint a
nuDNSNem az egyént, hanem az anyai leszármazási haplotípustidentifikálja
UgyanakkorA diverzitás mértéke miatt nagy a valószínűsége annak, hogy két véletlenül kiválasztott személy különböző mtDNShaplotípussal rendelkezik
Populációtól függetlenül ez az érték általában 95 % valószínűség fölött vanÚj minták esetén kb. 2/3 része a mintáknak új haplotípust mutatCsak kevés ún. “közönséges” gyakori haplotípus van, melyek gyakorisága több mint 1%Több ezer haplotípus figyelhető meg, emiatt a haplotípusokrelatív gyakorisága alacsony
Terminális (Sanger-féle) szekvenálásdNTP és ddNTPeltérő fragmenshosszjelölt primerekvagyjelölt nukleotidok
dideoxi inhibits !
D-loop szekvencia – anyai leszármazási vonal azonosításának igazságügyi eszköze
A vizsgált minták mtDNS szekvenciáját a referenciaként használt CRS-hoz illesztjük (pl. 16071-16140)
A referencia szekvenciától való eltérések pozíciója és nukleotidja megadja az adott minta mtDNS haplotípusát
Bizonyíték (Q)
16093C 16129A
Összehasonlító(R)
16093C 16129A
A haplotípusok …
Leszármazás
3 AFRIKAI - 9 EURÓPAI - 7 ÁZSIAI FŐ HAPLOCSOPORT
Eseti alkalmazás
2004 – házaspár eltűnésehasználati tárgyak, fésű, fogkefe, sapka, pohár
2006 – NN férfi holttest emberölésgépkocsiból hajszál-töredék
morfológiai hasonlatosság a fésű hajszálaival2007 – koponya, állkapocs2008 – összehasonlító minták♀ gyermek és ♂ testvér
Kié a koponya és a hajszál töredék?
Koponya maradvány
Eredményekfésűcsonthajszálgyermektestvér
Eredmények
kizárás
A cytochrome b gén
14747 → 15886 pozíció(1140 bázispár)
cytochrome b-c1 komplex
kódoló szekvencia: - kisebb mutációs ráta - szinonim mutációk
Genetikai drift - fajok közötti szekvenciális különbségek
Filogenetikai analízisek
A cytochrome b gén mint a fajazonosításigazságügyi eszköze
14747 → 15886 pozíció (1140 bázispár) PCR: 358 bp szakasz
Átlagos eltérés kb. 15-20%
SNP a cytochrome b génben (Canis f.)
A vélemény …Szakértői válasz – kiértékelés
Populáció genetikaReprezentatív populáció
Statisztikai genetikaSzármazásLeszármazás, rokonság
Téves véleményekTechnikai okok
Kontamináció, inkompatibilitásSzemélyi okok
Jártasság
Bayes-féle hipotézis tesztelésVád hipotézise (Hp):
Pl.: A helyszínen talált vérnyom XY-tól származott
Védelem ellenhipotézise (Hd):Pl.: A vérnyom az adott népességből véletlenszerűen
kiválasztott másik, NN személytől származott
Bayes-formula (valószínűségi tesztelés)Pr: valószínűség
E: bizonyíték
I: információ
H: hipotézis
p: ügyész
d: ügyvéd
I)E,Pr(HI)E,Pr(H
I),HPr(EI),HPr(E
I)Pr(HI)Pr(H
d
p
d
p
d
p=×
a priorivalószínűségi
hányados(PrPR)
valószínűségihányados
(genetikai bizonyíték)
a posteriorivalószínűségi
hányados(PoPR)
A valószínűségi hányadosHa a biológiai nyom egy személytől származott, és a laboratóriumi hiba kizárt, Pr(E|Hp,I)=1.
A valószínűségi hányados – legegyszerűbb formájában – a genetikai-profil előfordulási gyakoriságának reciprokával egyezik meg.
I),HPr(G1
I),H,GPr(G1
I),HPr(EI),HPr(E
LRdcdscd
p≈==
Egyezési valószínűség Profilgyakoriság
Pr: valószínűségE: bizonyítékG: genetikai profilI: információH: hipotézisp: ügyészd: ügyvédc: helyszíns: gyanúsított
Köszönöm a figyelmet!
Genetikailag módosított karácsonyfa, Amboy, CA