INFORME PASANTIAS 2

UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL

“FRANCISCO DE MIRANDA”

ÁREA DE TECNOLOGÍA

NÚCLEO EL SABINO

PASANTÍAS INDUSTRIALES II

DISEÑO DE UN MANUAL DE CURVAS DE CALIBRACIÓN DE

DIFERENTES MÉTODOS POR ESPECTROFOTOMETRÍA APLICADOS EN

LOS LABORATORIOS DE QUÍMICA DE LA UNEFM – SABINO



ÁREA DE TECNOLOGÍA

NÚCLEO EL SABINO

PASANTÍAS INDUSTRIALES II

Miquilena nava, Sugey Ramírez Quesada, Jorge Gutiérrez Barbuena, Julio

Autor Tutor Académico Tutor Industrial

C.I.: 21.158.385 C.I.: 13.554.159 C.I.: 13.106.111

[email protected] [email protected] [email protected]

PUNTO FIJO, JULIO 2015

DISEÑO DE UN MANUAL DE CURVAS DE CALIBRACIÓN DE

DIFERENTES MÉTODOS POR ESPECTROFOTOMETRÍA APLICADOS EN

LOS LABORATORIOS DE QUÍMICA DE LA UNEFM – SABINO

LUGAR: LABORATORIO DE QUIMICA C 4

FECHA DE INICIO: 26/05/2015 – 20/07/2015

DURACIÓN: 8 SEMANAS

INDICE GENERAL

p.p

Índice General i

Índice de Figuras ii

Índice de Tablas

Índice de Graficas

iii

Introducción

Planteamiento del Problema

Objetivo General

Objetivos Específicos

Justificación del Problema

Fases de la Investigación

Resultados y Análisis de resultados

Conclusiones

Recomendaciones

Referencias Bibliográficas

Apéndice

Anexos

ÍNDICE DE FIGURAS

Figur

a

p.p

1 Solución de Nitritos en frasco ámbar

2 Spectronic 20 D en reposo.

INDICE DE TABLAS

Tabla

s

p.p

1 Valores obtenidos de patrones para método Nitrito

1.1

2

2.1

3

4

5

5.1

6

6.1

Absorbancias Calculadas para nitritos

Valores obtenidos de patrones para método Cromo

Absorbancias calculadas para cromo

Valores obtenidos de patrones para método Sulfato

Muestra problema analizada

Valores obtenidos de patrones para método Hierro

Absorbancias calculadas para hierro

Valores obtenidos de patrones para método Fosfato

Absorbancias calculadas para fosfato

INDICE DE GRAFICAS

Tabla

s

p.p

1 Curva de Calibración para Nitritos

2

3

4

5

Curva de Calibración para Cromo

Curva de Calibración para Sulfato

Curva de Calibración para Hierro

Curva de Calibración para Fosfato

INTRODUCCIÓN

Desde hace muchos años se ha usado el color como ayuda para

reconocer las sustancias químicas; al reemplazar el ojo humano por otros

detectores de radiación se puede estudiar la absorción de sustancias, no

solamente en la zona del espectro visible, sino también en ultravioleta e

infrarrojo.

Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de

energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud

de onda de la radiación, y a las mediciones a una determinada longitud de

onda.

Para realizar estudios de espectrofotometría se da el uso de las

curvas de calibración generadas por los patrones leídos en el equipo

específico, este tipo de análisis genera mayor precisión en los ensayos a

distintas sustancias. Actualmente en el componente práctico no se dispone

de las curvas correspondientes para los distintos análisis relacionados a la

medición de las concentraciones de un soluto en sustancias problema.

Es por ello que el principal motivo por el cual se requiere solventar

esta problemática, recae en la simplificación del trabajo dentro del

laboratorio, el diseño de un manual que contenga las respectivas curvas de

calibración generadas por el equipo, facilitara a los estudiantes de ingeniería

química, la realización de estudios correspondientes a trabajos de grados o

pasantías. Los resultados se obtienen a través del espectrofotómetro marca

Spectronic 20 D.

Este trabajo surgió con la finalidad de fortalecer el complemento

práctico del laboratorio por medio de la propuesta de la realización de un

manual que será de gran utilidad y ayudara a la ejecución exacta de los

ensayos que requieren de este material para su estudio.

Para dar a conocer los aspectos desarrollados durante la ejecución de

la Pasantía Industrial II, que lleva por título“Diseño de un manual de curvas

de calibración de diferentes métodos por espectrofotometría aplicados en los

laboratorios de química de la Unefm – sabino” se empleó la siguiente

estructura para la elaboración del informe:

Planteamiento del problema, el cual describe de forma amplia la

situación de estudio de la investigación, la situación actual que caracteriza al

objeto de estudio y la presentación de alternativas para dar solución a dicha

problemática.

Objetivo general, para ofrecer resultados amplios relacionados con el

título de la investigación, y objetivos específicos que se refieren a situaciones

particulares que se llevaron a cabo para el cumplimiento del objetivo general.

Justificación del problema, con la finalidad de dar a conocer las razones por

las cuales se realiza la investigación y los aportes teóricos o prácticos que

ofrece; Fases de la Investigación, en las cuales se desglosan las normas,

procedimientos y/o actividades que fueron ejecutadas en cada uno de los

objetivos específicos de la investigación

Resultados y Análisis de Resultados, aquí se presentan todos los resultados

obtenidos durante los procedimientos ejecutados en cada una de las

actividades de la investigación, estableciéndose una comparación con

valores teóricos o estudios previos realizados.

Conclusiones, las cuales presentan en forma clara y sintética, todo el

conjunto de resultados obtenidos a lo largo de la investigación,

demostrándose que se han cumplido, o no, los objetivos propuestos;

Recomendaciones, es decir, las posibles mejoras que durante el estudio se

observaron pero no se llevaron a cabo y referencias bibliográficas, la cual

contiene el listado de cada obra consultada durante la investigación y citada

a lo largo del trabajo.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los Laboratorios de Química representan los componentes prácticos

de las distintas unidades curriculares, impartidas en el programa de

Ingeniería Química, cuyo objetivo es que el estudiante compruebe

experimentalmente los distintos métodos previamente estudiados en la parte

teórica, a través de la aplicación de técnicas básicas de laboratorio.

Los estudios que se ejecutan dentro del laboratorio, usualmente

corresponden a las prácticas que se encuentran a disposición del estudiante,

así como los métodos o guías que le permitirán resolver un problema en

estudio que dependerá de alcance del mismo.

En la actualidad el componente practico no posee un manual o guía

para los estudios que se aplican a determinadas soluciones problemas

(aguas residuales o sólidos en cuestión) con respecto a su evaluación en el

área de espectrofotometría, es decir, no se encuentran copilados los datos

correspondientes a las curvas de calibración de compuestos disueltos en

dichas soluciones.

Esto genera una fuerte problemática, ya que en el análisis de aguas

este tipo de estudio resulta ser fundamental al momento de caracterizar una

muestra, lo cual forma parte de análisis de mayor importancia, como lo es, un

trabajo de grado o pasantía.

Es por ello, que la finalidad de ésta pasantía industrial es el Diseño de

un manual de espectrometría correspondiente a distintos métodos de análisis

de muestras problema por medio del uso de curvas de calibración y

contribuir así con el laboratorio de química de la UNEFM y facilitar la

ejecución de los ensayos correspondientes.

OBJETIVO GENERAL

Diseñar un manual de curvas de calibración de diferentes métodos por

espectrofotometría aplicados en los laboratorios de química de la

UNEFM – Sabino

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Evaluar las condiciones de los reactivos a preparar para los diferentes

métodos de espectrofotometría

Verificar la calibración y funcionamiento del Spectronic 20 D.

Elaborar el manual de curvas de calibración de los diferentes métodos

de espectrofotometría con sus respectivas graficas aplicando la ley de

Lambert – Beer.

JUSTIFICACION DEL PROBLEMA

El propósito fundamental de este trabajo es que el estudiante tenga a

disposición un manual que le ayude a la ejecución de estudios en muestras

problema, y facilite su labor, además de aportar al componente practico dicho

complemento el cual permanecerá en el área para los futuros estudios que

se realicen.

A su vez, disminuirá el uso de las sustancias necesarias para el

análisis de las muestras, ya que, al copilar los resultados obtenidos en dicho

manual, evitara que gran cantidad de reactivos se desperdicien debido a las

repeticiones de los ensayos.

FASES DE LA INVESTIGACIÓN

1 –Evaluar las condiciones de los reactivos a preparar para los

diferentes métodos de espectrofotometría

En esta fase se llevó a cabo la evaluación de los reactivos a utilizar en

los diferentes métodos, los cuales son:

Análisis colorimétrico de:

- Sulfatos

- Nitritos

- Cromo

- Fosfato

- Hierro

La cantidad de reactivos a utilizar fueron aportados por el almacén del

laboratorio C4-A, fundamentalmente se dispone de la realización de tres

sustancias en específico en cada uno de los métodos.

Corresponden básicamente a la solución madre del reactivo, a la

solución patrón y a solución intermedia.

La solución madre del reactivo se deriva de la combinación de la

sustancia correspondiente al método en conjunto a su disolución en agua

destilada, de esta muestra se tomara una alícuota de cierta cantidad del

reactivo, el cual se diluirá hasta un aforo comprendido en el rango de 25 a

100ml, seguidamente la solución patrón, conocida como aquella que dará el

color a la muestra, se combinara con la solución intermedia y se obtendrán

los patrones correspondientes para el respectivo análisis.

En base a esto se determino que la cantidad de reactivos necesarios

para los estudios se encuentra disponible.

2 -Verificar la calibración y funcionamiento del Spectronic 20 D.

Se verifico la calibración mediante el uso de un blanco o sustancia

pura, principalmente agua destilada, en donde deben observarse los valores

de absorbancia, concentración y tramitancia, para una muestra blanco la

tramitancia debe estar en un rango de 100% respecto a la longitud de onda

a la cual el equipo quiere ser utilizado.

3 - Elaborar el manual de curvas de calibración de los diferentes

métodos de espectrofotometría con sus respectivas graficas aplicando

la ley de Lambert – Beer.

El procedimiento de elaboración del manual, consiste en la generación

de las curvas de calibración correspondientes para cada método, de acuerdo

a los utilizados, se obtuvieron 5 graficas, generadas por medio de 5 a 6

patrones previamente preparados, estos, fueron leídos en el Spectronic 20 D

a la longitud onda correspondiente, obteniéndose los datos de absorbancia,

concentración y tramitancia.

Se utilizaron los valores de los ppm para los patrones, y se graficaron

con respecto a la absorbancia obtenida. La curva debe representarse en

forma de recta, lo cual se comprueba con la ley de Lambert - Beer en donde

mediante una formula se permitió conocer si la precisión del

espectrofotómetro era exacta.

RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS

Evaluar las condiciones de los reactivos a preparar para los diferentes

métodos de espectrofotometría.

Se realizaron las soluciones madres, intermedias y patrón para cada método.

Para el método Sulfato se prepararon las siguientes soluciones:

-Solución patrón de sulfatos

-Solución acondicionadora o intermedia de sulfatos

-Cloruro de bario.

Para método Nitritos:

- Reactivo de Zambelli

- Solución Madre de Nitritos

- Solución intermedia de Nitritos

- SoluciónPatrón de Nitritos

- Amoniaco Concentrado.

Para método Hierro:

- Solución estándar de hierro

- Agua oxigenada

- Solución intermedia de tiocionato

Para método Cromo:

- Solución de Difenilhidrazina

- Solución Intermedia y Madre de Cromo

- Solución de Ácido Sulfúrico

Para método Fosfato:

- Reactivo Vanado – molibdico

- Solución patrón de ortofosfatos

- Solución intermedia de ortofosfatos

Los reactivos utilizados fueron evaluados para cada uno de los

métodos, de acuerdo a su preparación, todos ellos, se almacenaron en

frascos ámbar, para de esta manera poder conservarlos y así estos se

encuentren disponibles para su uso en los próximos estudios.

Figura 1. Solución de Nitritos en frasco ámbar

Verificar la calibración y funcionamiento del Spectronic 20 D.

Al encender el espectrofotómetro se colocó la longitud onda

correspondiente y se llevó el valor de tramitancia a 0.0 en este instante el

haz de luz para una muestra se encuentra cerrado.

Se calibro utilizando un blanco o sustancia pura sin sólidos,

generalmente agua destilada, esta muestra debe leerse a la longitud de

onda en la cual se desea realizar el estudio, es por ello que en estas

condiciones el valor de la tramitancia debe estar en el rango de 100%, los

valores de absorbancia y la concentración se comprende en rangos de 0,01

a 0,09.

Para su funcionamiento el espectrofotómetro debió dejarse en reposo,

encendido y calibrado en un tiempo de 30 min a 1 hora, ya que su

sensibilidad al movimiento normalmente puede afectar los análisis

posteriores. Una vez pasado este tiempo, el equipo se encontraba listo para

la lectura de patrones.

Las celdas o tubos de ensayos, debieron limpiarse con el fin de

remover tanto suciedad como huellas digitales, ya que estas afectan la

lectura de los patrones correspondientes.

Figura 2. Spectronic 20 D en reposo.

Elaborar el manual de curvas de calibración de los diferentes métodos de espectrofotometría con sus respectivas graficas aplicando la ley de Lambert – Beer.

Para la elaboración del manual de curvas de calibración, se obtuvieron

los datos de cada uno de los patrones leídos por el espectrofotómetro, los

siguientes fueron resumidos en tablas para mayor apreciación.

Para Método Nitritos:

Para 0 - 0,200 ppmLongitud de Onda: 425 mn

Ppm Absorbancia Concentración Tramitancia

0 0,01 0 100

0,025 0,030 0,06 93,6

0,050 0,043 0,09 90,4

0,100 0,064 0,14 86,2

0,150 0,157 0,33 69,8

0,200 0,200 0,42 63,0

Tabla 1. Valores obtenidos de patrones para método Nitrito

Ahora se procedió a realizar la curva de calibración con los valores de

ppm vs absorbancia, como se ven subrayados en la tabla 1.

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.250.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

f(x) = 0.968421052631579 x − 0.000736842105263161R² = 0.951606578137873

Nitritos

Ppm

Abso

rban

cia

Grafica 1. Curva de Calibración para Nitritos

Se realizó una regresión lineal a la curva para ver el rango de

desviación de la misma, para la comprobación de su tendencia, se utilizó la

ecuación de Lambert – beer, la cual plantea la comparación entre el valor de

absorbancia arrojado por el equipo y el calculado mediante una formula

empírica, esto con el fin de saber cuánta fue la precisión del equipo en el

momento del estudio.

Tomando como ejemplo las absorbancias de la curva nitritos reflejadas en la

tabla 1, se aplicó la siguiente formula:

Abs: 2 – Log (T)

En donde:

Abs: absorbancia

T: Tramitancia experimental arrojada por el espectrofotómetro

Sustituyendo tenemos:

Abs: 2 – Log (93,6) = 0,029

El resultado describe que la precisión del equipo era exacta, debido a

la similitud entre los valores ya tabulados. Esto se realizó para todas las

demás absorbancias de cada uno de los métodos.

Abs. Experimental Abs. Calculada

Nitritos

0,01 0

0,030 0,029

0,043 0,044

0,064 0,064

0,157 0,156

0,200 0,201

Tabla 1.1 Absorbancias Calculadas para nitritos

Para Método Cromo:

Para 0 - 0,200ppmLongitud de Onda: 540mn


0 0,089 0,19 81,4

0,030 0,159 0,33 69,6

0,050 0,173 0,36 67

0,100 0,245 0,51 56,8

0,150 0,260 0,54 55

0,200 0,292 0,61 50,8

Tabla 2. Valores obtenidos de patrones para método Cromo

Graficando:

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.250

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

f(x) = 0.953467048710602 x + 0.118777077363897R² = 0.919128181212021

Cromo

Ppm

Abso

rban

cia

Grafica 2. Curva de Calibración para Cromo

La desviación de esta curva es significativa debido a distintos factores

que pudieron afectar la lectura de algunos patrones, aun así, la regresión

lineal de la misma, demuestra un alejamiento mínimo entre los puntos a la

recta.

Abs Experimental Abs. CalculadaCromo

0,089 0,0890,159 0,1570,173 0,1740,245 0,2460,260 0,2600,292 0,294

Tabla 2.1 Absorbancias calculadas para cromo

Para Método Sulfato:

Para 0 - 80 ppmLongitud de Onda: 420mn

Ppm Absorbancia

0 0,03

5 0,079

10 0,084

20 0,233

30 0,325

40 0,392

50 0,542

60 0,638

70 0,704

80 0,726

Tabla 3. Valores obtenidos de patrones para método Sulfato

Graficando:

0 10 20 30 40 50 60 70 80 900

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8f(x) = 0.0094446321717705 x + 0.0305709257303766R² = 0.985650554990394

Ppm

Abso

rban

cia

Sulfato

Grafica 3. Curva de Calibración para Sulfatos

La tabla 3. No posee valores de concentración y tramitancia debido a

que estos patrones fueron realizados por un equipo de trabajo en el

laboratorio, es por ello, que se tomo una muestra problema y se analizo con

las soluciones patrones y madres. Se obtuvo los siguientes datos:

Ppm AbsorbanciaConcentración

Tramitancia

Muestra 1 28,5 0,314 0,66 48,4Tabla 4. Muestra problema analizada

Utilizando la Grafica 3. Se grafico el valor de absorbancia para obtener

los ppm de sulfato en la muestra problema, como se observa:

0 10 20 30 40 50 60 70 80 900

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8f(x) = 0.0094446321717705 x + 0.0305709257303766R² = 0.985650554990394

Ppm

Abso

rban

cia

Sulfato

Grafica 3.1 Curva de Calibración para Sulfatos con punto en

absorbancia.

Para la muestra 1 el resultado fue de 28,5 ppm en concentración de sulfatos.

Para Método Hierro:

Para 0 - 0,0020ppmLongitud de Onda: 480mn


0 0,018 0,04 95,8

0,0005 0,152 0,32 82

0,0010 0,245 0,4 65

0,0015 0,362 0,76 43,4

0,0020 0,390 0,82 40,6Tabla 5. Valores obtenidos de patrones para método Hierro

Graficando:

0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.00250

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

f(x) = 190.8 x + 0.0425999999999999R² = 0.96595598349381

Hierro

Ppm

Abso

rban

cia

Grafica 4. Curva de Calibración para Hierro

Aplicando ley de Lambert – Beer a las Absorbancias:

Abs Experimental

Abs. Calculada

Hierro0,018 0,0190,152 0,0860,245 0,1870,362 0,3630,390 0,391

Tabla 5.1 Absorbancias calculadas para hierro

Para Método Fosfato:

Para 0 - 20ppmLongitud de Onda: 420mn


0 0,027 0,06 93,8

3 0,132 0,28 73,6

5 0,179 0,37 66,2

10 0,307 0,64 49,2

15 0,406 0,85 39,2

20 0,564 1,18 27,4Tabla 6. Valores obtenidos de patrones para método Fosfato

Graficando:

0 5 10 15 20 250

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

f(x) = 0.0256681948424069 x + 0.0424309455587393R² = 0.99453222481023

Fosfato

Ppm

Abso

rban

cia

Grafica 5. Curva de Calibración para Fosfatos

Aplicando ley de Lambert – Beer a las Absorbancias:

Tabla 6.1 Absorbancias calculadas para fosfato

Abs Experimental

Abs. Calculada

Fosfato0,027 0,0280,132 0,1330,179 0,1790,307 0,3080,406 0,4070,564 0,562

De esta forma, todas las graficas fueron construidas con sus respectivos

datos, se comprobó la precisión del equipo mediante el análisis de las

absorbancias por la Ley de Lambert – Beer, determinando que los estudios

realizados fueron exactos para cada uno de los métodos.

CONCLUSIONES

Se evaluó la condición de los reactivos para los respectivos estudios

Se llevo a cado la verificación de la calibración del Spectronic 20 D a

su vez se comprobó su correcto funcionamiento.

Se obtuvieron los datos correspondientes para cada uno de los

métodos de espectrofotometría

Se graficaron las curvas de calibración de cada método de

espectrofotometría

Se comprobó la precisión del equipo y de los datos obtenidos

mediante la ley de Lambert – Beer

Se diseño el manual con sus curvas de calibración para los métodos

analizados.

RECOMENDACIONES

Mantenimiento adecuado al espectrofotómetro, para futuros análisis

Revisión del tiempo de duración de las soluciones madres e

intermedias para evitar la pérdida de las mismas

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Severriche, C., Castillo, M. y Acevedo, R. (2013). Manual de Métodos

Analíticos para la Determinación de Parámetros Fisicoquímicos

Básicos en Aguas. [Versión Electrónica]. Colombia. Recuperado el 22

de mayo de 2015 de

http://www.eumed.net/librosgratis/2013/1326/index.htm

Tierra, P. (2008). Trabajos prácticos de química analítica cuántica. .

[Versión Electrónica]. México. Recuperado el 4 de junio de 2015 de:

http://www.etpcba.com.ar/Documentos/Nivel_Medio/Especialidades/Q

uimica/Anexo/guia_de_analitica_instrumental.pdf

Harris, C. (2003). Técnicas avanzadas en química. México. [Versión

Electrónica]. Recuperado el 4 de junio de 2015 de:

http://ecovi.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderfiles/fosfatos.pdf

Brunatti, C. (2008). Introducción a la Espectroscopia de Absorción

Molecular Ultravioleta, Visible e Infrarrojo Cercano. México. [Versión

Electrónica]. Recuperado el 16 de julio de 2015 de:

http://materias.fi.uba.ar/6305/download/Espectrofotometria.pdf

Apéndice:

Diseño de un manual de curvas de calibración de diferentes métodos por espectrofotometría aplicados en los laboratorios de química



AREA DE TECNOLOGIA

NUCLEO EL SABINO

DEPARTAMENTO DE QUIMICA

MANUAL DE CURVAS DE

CALIBRACIÓN POR

ESPECTROFOMETRÍA

AUTOR:

MIQUILENA, SUGEY

JULIO 2015

INDICE GENERAL

INTRODUCCIÓN

FUNDAMENTO TEÓRICO

CURVAS DE CALIBRACION DE:

NITRITOS

CROMO

HIERRO

SULFATO

FOSFATO

P.P

INTRODUCCION

El siguiente manual tiene como finalidad ayudar al estudiante de

ingeniería química a realizar los análisis a muestras problemas, que

necesiten de pruebas de espectrofotometría y así obtener los resultados

deseados.

La espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más

utilizadas para la detección específica de moléculas de distinta naturaleza

(contaminantes, biomoléculas, etc.) y estado de agregación (sólido, líquido,

gas). El fundamento físico-químico de la espectrofotometría está relacionado

con la capacidad de las moléculas de absorber energía luminosa y

almacenarla en forma de energía interna. Esto permite que se inicien ciclos

vitales de muchos organismos, entre ellos el de la fotosíntesis en plantas y

bacterias.

A continuación se muestra de manera ordenada el procedimiento a

seguir para el análisis de muestras y la correcta interpretación de los datos

obtenidos.

FUNDAMENTO TEÓRICO

La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados, y se

basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un

compuesto y su concentración. Cuando se hace incidir luz monocromática (de

una sola longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de la luz

incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de

la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la

intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido.

Dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a medir, la muestra puede

estar en fase líquida, sólida o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta

del espectro electromagnético, la muestra es generalmente disuelta para

formar una solución.

Cada sustancia tiene su propio espectro de absorción, el cual es una curva que

muestra la cantidad de energía radiante absorbida, Absorbancia, por la

sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagnético, es decir, a

una determinada longitud de onda de la energía radiante, cada sustancia

absorbe una cantidad de radiación que es distinta a la que absorbe otro

compuesto. (Fig. 1)

El método espectrofotométrico se rige por dos leyes fundamentales: Ley de Lambert y Ley de Beer.

1.- Ley de Lambert. :

Esta ley establece que cuando pasa luz monocromática por un medio

homogéneo, la disminución de la intensidad del haz de luz incidente es

proporcional al espesor del medio, lo que equivale a decir que la intensidad de

la luz transmitida disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente el

espesor del medio absorbente (Fig. 2)

La siguiente relación matemática da cuenta de esta ley: P / P0 = e –kb

Po: Intensidad de la luz incidente

P: Intensidad de la luz transmitida

b : Espesor del medio absorbente

k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de

onda de la luz incidente, del espesor del medio absorbente y de la naturaleza

del medio.

2.- Ley de Beer:

La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente al

aumentar aritméticamente la concentración de la sustancia absorbente, cuando

este haz pasa a través de un medio homogéneo (Fig. 3).

La relación matemática que da cuenta de esta ley se muestra a continuación:

P / P0 = e -k’c

Donde:

Po: Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida

c : Concentración de la solución

k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de

onda de la luz incidente, de la concentración de la solución, y frecuentemente,

de la naturaleza del medio.

Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de Lambert-Beer

log P0 / P = a b c ó A = a b c

A = log P0 / P = - log T

Donde:

a : Absortividad

b : Longitud o espesor del medio (longitud de la cubeta)

c : Concentración de la solución P/Po= T : Transmitancia

Los términos absorbancia y Transmitancia son definidos a continuación

Transmitancia (T): Es la razón entre la luz monocromática transmitida (P) por

una muestra y la energía o luz incidente (Po) sobre ella. Tanto la energía

radiante incidente como la transmitida deben ser medidas a la misma longitud

de onda.

T = P / P0 = 10-abc ó %T = 100 P / P0

Se acostumbra a considerar la transmitida como la razón de la luz transmitida

por la muestra y la luz transmitida por un estándar arbitrario. Este estándar

puede ser el liquido (solvente) en que esta disuelta la muestra, aire, blanco

analítico (solución que contiene todos los componentes de la solución problema

menos la sustancia problema) u otra sustancia elegida arbitrariamente.

Debido a que la transmitancia de este estándar no es necesariamente 100%,

es necesario especificar el estándar con el cual la muestra es comparada.

Absorbancia(A): Se define como la cantidad de energía radiante absorbida

por una sustancia pura o en solución. Matemáticamente, corresponde al

logaritmo negativo de la transmitancia. T, transmitancia expresada como

fracción decimal %T, Transmitancia expresada como porcentaje.

A = - log T = 2 – log %T

Pero.

T = P / P0 = 10-abc

Luego

A = - log ( P / P0 ) = - log 10-abc

A = a b c

Esta ecuación indica que la absorbancia es una función lineal de la

concentración, donde a es una constante de proporcionalidad llamada

absortividad. La magnitud de a depende de las unidades de b y c. Si la

concentración c está expresada en moles por litro y la longitud de la cubeta b

en centímetros, la constante a recibe el nombre de absortividad molar( ξ ) .

Luego

A = ξ b c

Mediciones de transmitancia y absorbancia.

Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparación

entre la muestra problema y un estándar arbitrario o referencia. Como la

referencia debe poseer un porcentaje de transmitancia de 100%, esta es

llamada referencia de 100%., o una absorbancia de cero.

Selección de longitud de onda de trabajo.

La longitud de onda de trabajo corresponde, generalmente, a la longitud de

onda en la cual la absorbancia del analito (sustancia a analizar) es máxima, y

recibe la denominación de Lambda máximo (λmax). Para seleccionar el λmax.,

se hace un espectro de absorción o curva espectral, y que consiste en una

gráfica de la absorbancia de una solución de la sustancia absorbente de

concentración adecuada, medida a distintas longitudes de onda y en ella se

determina el λmax. (Fig.4).

Las mediciones de absorbancia se hacen en la zona de longitudes de onda

donde se espera que absorba la sustancia problema. Si se trata de sustancias

coloreadas, las mediciones se realizan en la zona visible del espectro

electromagnético (380 a 800nm). En el caso de sustancias no coloreadas, las

mediciones se realizan en la región ultravioleta del espectro electromagnético

(200 a 380nm).

Curva de Calibración.

Uno de los métodos más utilizados para determinar la concentración de una

muestra problema, es el método de la curva de calibración. Esta curva de

calibración es una gráfica que relaciona la concentración de al menos cinco

soluciones de estándar de concentraciones conocidas, con la absorbancia de

cada uno de ellos a la longitud de onda máxima (λ max) (Fig. 5).

Una vez obtenida la gráfica se determina la función matemática que presenta

dicha recta a través del tratamiento estadístico de regresión de los mínimos

cuadrados, la cual relaciona la absorbancia y la concentración de un analito.

Al hacer la curva de calibración, se debe emplear la longitud de onda de

máxima absorbancia (λmax.), para obtener una recta con la máxima pendiente

y así tener mayor sensibilidad y precisión al hacer las mediciones. La medición

de la absorbancia de la solución problema debe hacerse a la misma longitud de

onda que fue hecha la curva de calibración.

Las siguientes curvas de calibración están diseñadas por los datos obtenidos

por el Spectronic 20 D, equipo espectrógrafo que se encuentra en los

Laboratorios de Química de UNEFM – SABINO.

Una vez analizado el fundamento teórico de espectrofotometría, procedemos a

la muestra de las curvas realizadas y la breve explicación de cómo aplicar los

métodos a las muestras problemas.

RECOMENDACIÓN ESPECIAL: PARA EL USO DEL SPECTRONIC 20 D, SE

RECOMIENDA EL ENCENDIDO DEL EQUIPO ANTES DE LA

PREPARACION DE MUESTRAS POR UN TIEMPO DE 30 MIN. DE ESTA

FORMA SE ASEGURA LA PRECISION DEL MISMO

PARA OBTENER EL VALOR DE PPM EN LA MUESTRA PROBLEMA, DEBE

BUSCARSE EN LA GRÁFICA EL VALOR DE LA ABSORBANCIA

OBTENIDO, SEGUIDAMENTE CHOCAR CON LA CURVA Y LEER HACIA

ABAJO LA CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA.

CURVAS DE

CALIBRACIÓN

CURVA DE

CALIBRACIÓN PARA

NITRITOS

SOLUCIONES A UTILIZAR:

(Disponibles en el almacén de reactivos):

- Reactivo de Zambelli.

- Solución Madre de Nitritos

- Solución Intermedia de Nitritos

- Solución Patrón de Nitritos

Equipos:

- Spectronic 20 D

- Cubetas de paso óptico de 1 cm

Nota: Longitud de onda de este método: 425nm

PREPARACION DE MUESTRA PROBLEMA

- Transferir 50 mL de muestra (previamente filtrada por membrana de 0.45

mm o sometida a centrifugación, en caso de ser necesario por presentar

alta turbiedad), a un vaso de precipitados de 100 mL, adicionarle 2 mL

de reactivo de Zambelli. Agitar para mezclar bien y esperar 2 minutos.

- Añadir 2 mL de amoníaco, agitar y esperar 5 minutos.

- Preparar y analizar un blanco de reactivos con agua destilada.

- Leer en espectrofotómetro a 425 nm con cubetas de paso óptico de 1cm

respecto a la curva de calibración de nitritos.

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.250.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

f(x) = 0.968421052631579 x − 0.000736842105263161R² = 0.951606578137873

Nitritos

Ppm

Abso

rban

cia

CURVA DE

CALIBRACIÓN PARA

CROMO



- Solución de Difenilhidrazina: esta solución debe prepararse al momento

de uso: Habitualmente 10 mL son suficientes, lo que implica pesar 50

mg de 1,5-difenilcarbazida (difenilcarbohidrazida) y disolverlos en 10 mL

de acetona.

- Solución de Acido Sulfúrico 1:1

- Solución madre de cromos

- Solución intermedia de cromos

Equipos:

- Spectronic 20 D


-

Nota: Longitud de onda de este método: 540 nm


- Transferir 50 mL de muestra (previamente filtrada si la muestra lo amerita), aun vaso de precipitados de 100 mL, adicionarle 0.5 mL de ácido sulfúrico 1:1.

- Agitar para mezclar bien.

- Añadir 1 mL de solución de difenilcarbazida, agitar y dejar reposar 5 a 10 minutos para desarrollar color.

- Preparar y analizar un blanco de reactivos con agua.

- Leer en espectrofotómetro a 540 nm con cubetas de 5 cm de paso óptico.

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.250

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

f(x) = 0.953467048710601 x + 0.118777077363897R² = 0.919128181212021

Cromo

Ppm

Abso

rban

cia

CURVA DE

CALIBRACIÓN PARA

HIERRO



- Solución estándar de hierro

- Agua oxigenada 30%

- Solución de Tiocianato de Amonio

Equipos:

- Spectronic 20 D




- Transferir 1ml de solución problema a un matraz de100ml, agregar

suficiente nítrico (1: 1) asegurando un contenido total de 5ml. Diluir hasta

60ml con agua destilada.

- Agregar 1ml de agua oxigenada y mezclar.

- Agregar 20ml de tiocianato de amonio, diluir a la marca y mezclar.

- Transferir una porción adecuada al tubo de lectura y medir la

absorbancia a 480nm. Con el valor obtenido buscar en la curva de

calibración los miligramos de hierro presentes en la solución incógnita.

0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.00250

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

f(x) = 190.8 x + 0.0425999999999999R² = 0.96595598349381

Hierro

Ppm

Abso

rban

cia

CURVA DE

CALIBRACIÓN PARA

SULFATO



- Solución patrón de sulfato

- Solución acondicionadora de sulfato

- Cloruro de Bario concentrado

Equipos:

- Spectronic 20 D




- Transferir 50 mL de muestra (en caso de turbiedad evidente,

centrifugarla o filtrarla) a un vaso de precipitados de 100 mL, adicionar

2.5 mL de solución acondicionadora y agitar; adicionar una cucharilla de

cristales de cloruro de bario y agitar nuevamente en forma vigorosa.

- Leer antes de 5 minutos en espectrofotómetro a 420 nm con celdas de 1

cm de paso óptico respecto a la curva de calibración de sulfato. Si la

absorbancia de la muestra resultase mayor que la del mayor patrón, es

necesario repetir el proceso mediante la lectura de diluciones de la

muestra. Para esto, debe realizarse como mínimo dos diluciones, se

calculará el coeficiente de variación y si éste no supera 10 %, se

informará el valor promedio; en estos casos, es necesario multiplicar

previamente por el factor de dilución.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 900

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8f(x) = 0.0094446321717705 x + 0.0305709257303766R² = 0.985650554990394

Ppm

Abso

rban

cia

Sulfato

CURVA DE

CALIBRACIÓN PARA

FOSFATO



- Reactivo de vanado-molibdico

- Solución patrón de ortofosfato

Equipos:

- Spectronic 20 D




- Pipetear 5 ml de la disolución problema y pasarlos a un matraz aforado

de 25 ml.

- Añadir 10 ml de la disolución vanado-molibdato y enrasar con agua

destilada.

- Repetir este procedimiento otras 2 veces más para tener 3 muestras

problema.

- Dejar reposar 10 minutos

0 5 10 15 20 250

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

f(x) = 0.0256681948424069 x + 0.0424309455587393R² = 0.99453222481023

Fosfato

Ppm

Abso

rban

cia

ANEXOS

Patrones preparados

Lecturas en espectrofotómetro.

Documents

INFORME PASANTIAS 2