Interferon - Presenter

7/26/2019 Interferon - Presenter

1/24

PRODUKSI TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

INTERFERON -1a DARI CHO (CHINESE HAMSTER OVARY)

MAKALAH

Dibuat untuk Melengkapi Tugas Tertulis Bioteknologi Farmasi (FA3231)

oleh:

Kelompok

Mia Savira 1!132

Stephani "a#hel Tanaka 1!133

$hairunnissa Aulia "ahmah 1!131%

&in' Angkasa 1!133!

Sevina utri Mahen'a 1!13%*

$artika $hoirunnisa 1!13!2

Aulia Mar'iningsih 1!13!!

+ani ,estari rati-i 1!13.3

Fusvita 2!1*32

PROGRAM STUDI SAINS DAN TEKNOLOGI FARMASI

SEKOLAH FARMASI

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

!1"

ABSTRAK


2/24

rotein rekombinan manusia inter/eron 01a merupakan pro'uk rekombinan ang

memiliki letak glikosilasi 'an urutan asam amino ang sama 'engan inter/eron 0 ang alami

a'a pa'a manusia nter/eron 01a ber/ungsi 'alam mengobati penakit multiple sclerosis

'engan memperlambat akumulasi 'ari 'istabilitas /isik 'an menurunkan /rekuensi ge4ala

parah ang timbul rotein ini 'igunakan untuk terapi 'alam bentuk in4eksi intramuskular

&ontoh se'iaan inter/eron 01a ang telah 'ipro'uksi oleh beberapa in'ustri /armasi aitu

Avone567"ebi/67 &inno+e567 'll nter/eron 01a ini mengalami serangkaian proses pro'uksi

'ari hulu hingga hilir sehingga 'iperoleh protein ang berguna untuk terapi a'a proses hulu7

/ragmen m"8A inter/eron 01a 'iisolasi 'ari sel 'arah manusia ang men'erita multiple

sclerosis'an 'itranskripsi balik men4a'i #D8A untuk selan4utna 'i &" 'an 'iligasi 'enganvektor pM1! sehingga 'ihasilkan vektor rekombinan +ektor rekombinan 'itrans/ormasi ke

sel inangE.coli untuk konstruksi 'an trans/orman 'iseleksi 'engan marka seleksi ampisilin

serta 'i'eteksi kebera'aan D8A sisipan 'engan analisis restriksi 'an analisis migrasi lasmi'

rekombinan 'imurnikan 'engan meto'e 9minipreps agar 'apat 'itrans/ormasi ke sel inang

ke'ua aitu sel &; a'a tahapan

pro'uksi7 'igunakan sistem pro'uksifed batch fermentation.rotein hasil pro'uksi 'iisolasi7

'imurnikan7 'ikarakterisasi7 'an 'i/ormulasi pa'a proses hilir sehingga 'ihasilkan protein

inter/eron 01a 'alam bentuk se'iaan larutan nter/eron 01a ang 'ihasilkan harus

memenuhi persaratan 'ari European Pharmacopoeia 7th Edition ersaratan tersebut

'iantarana karakter protein berupa #airan 4ernih ti'ak ber-arna atau kekuningan7 memenuhi

persaratan i'enti/ikasi pro'uk7 serta lolos 'alam u4i keti'akmurnian protein7 u4i bentuk

teroksi'asi7 u4i bakteri en'otoksin7 serta u4i potensi protein

Ka#a K$%&': nter/eron 01a7 protein rekombinan7 multiple sclerosis7E.Coli7 sel inang &;


3/24

DAFTAR ISI

ABST"A$???????????????????????????????? i

DAFTA" S??????????????????????????????? ii

BAB =8DA;@,@A8????????????????????????? 1

11 ,atar Belakang?????????????????????????? 1

12 "umusan Masalah????????????????????????? 2

13 Tu4uan?????????????????????????????? 2

BAB 8T="F="


4/24

BAB I

PENDAHULUAN

11 La#a) Belaka%*

Multiple sclerosis(MS) merupakan salah satu 4enis penakit sistem sara/7 'imana

organ ang 'iserang merupakan organ sistem sara/ pusat (otak 'an sumsum tulang

belakang) 'engan merusak selubung myelinang melin'ungi selsel sara/ $erusakan

ini menebabkan bloka'e pengiriman pesan antara otak 'an tubuh ang menebabkan

timbulna ge4alage4ala seperti otot melemah serta gangguan koor'inasi 'an

keseimbangan enebab penakit ini belum 'apat 'iketahui 'engan pasti7 namun

'ianggap sebagai penakit autoimun Ter'apat 3 4enis multiple s#lerosis ber'asarkan

perio'e kekambuhanna7 aitu multiple sclerosis kambuhan (""MS)7 multiple sclerosisprogresi/ primer7 'an multiple sclerosisprogresi/ sekun'er

Salah satu terapi untuk multiple sclerosiskhususna multiple sclerosiskambuhan

(""MS) a'alah 'engan inter/eron 0 Baik inter/eron 01a maupun inter/eron 01b 'apat

'igunakan sebagai inter/eron mo'ulator erbe'aan ke'ua 4enis inter/eron 0 ini aitu

inter/eron 01a memiliki 4umlah asam amino ang sama 'engan inter/eron 0 manusia

'an mengalami glikosilasi se'angkan inter/eron 01b ti'ak mengalami glikosilasi 'an

4umlah asam aminona lebih se'ikit 1 asam amino 'iban'ingkan inter/eron 0 a'a

inter/eron 01a belum 'iketahui pengaruh glikosilasi terha'ap aktivitas biologina

Salah satu #ontoh inter/eron 01a a'alah Avone56 Avone56 merupakan pro'uk

inter/eron 01a komersil ang 'ipro'uksi 'i sel mamalia (&;


5/24

1 R$m$+a% Ma+ala,

1 Bagaimana si/at bahan akti/ inter/eron 01a ang merupakan pro'uk teknologi

rekombinanC

2 Apa sa4a kegunaan 'ari protein inter/eron 01a rekombinan serta penakit apa sa4a

ang 'apat 'i#egah atau 'iobati oleh pro'uk tersebutC

3 Bagaimana sistem pro'uksi protein inter/eron 01a rekombinan mulai 'ari tahap hulu

hingga ke hilirC

% Apa sa4a persaratan untuk protein inter/eron 01a rekombinan ang ter#antum

'alam FarmakopeC

1 T$.$a%

1 Menentukan si/at bahan akti/ inter/eron 01a

2 Menentukan kegunaan serta pen#egahan atau pengobatan penakit oleh protein

inter/eron 01a rekombinan

3 Menetukan tahapan pro'uksi mulai 'ari hulu hingga hilir beserta sistemsistem angberpengaruh

% Menentukan persaratan untuk protein inter/eron 01a rekombinan 'engan

ber'asarkan pa'a Farmakope

BAB II

INTERFERON -1a

1 S'/a# Ba,a% Ak#'/


6/24

rotein rekombinan manusia inter/eron 01a memiliki rumus molekul

&.;1%.82%


7/24

bentuk in4eksi ro'uk ini 'igunakan pa'a pasien 'engan an4uran tiga kali 'alam

seminggu 'engan rute pemberian berupa in4eksi subkutan

&inno+e56

&inno+e5 6 merupakan nama 'agang 'ari protein rekombinan inter/eron 01a 'i ran

ro'uk ini 'ikembangkan oleh F)a$%,o/e) I%+#'#$#e'engan berkolaborasi bersama

C'%%aGe% Beberapa 4urnal terkait stu'i klinik 'ari &inno+e56 membuktikan bah-a

e/ek terapi 'ari &inno+e56 sama 'engan Avone56 &inno+e56 merupakan biosimilar

'ari Avone5 (8a/issi7 212) &inno+e56 'ipasarkan 'alam bentuk se'iaan serbuk

lio/ilisasi rekonstitusi 'an 'i4ual bersama 'engan water for in)ection ro'uk ini

'igunakan pa'a pasien 'engan an4uran satu kali per minggu 'engan rute pemberian

berupa in4eksi intramuskular7 serupa 'engan Avone56

legri'6

legri'6 merupakan salah satu pro'uk rekombinan inter/eron 01a ang 'iprakarsai

oleh perusahaan B'o*e% Ie& Sama seperti pro'uk lainna7 legri'6pun memiliki

/ungsi untuk mengatasi penakit multiple sclerosis ang kambuh legri'6merupakan

pro'uk pengembangan 'ari Avone56'an telah men'apat persetu4uan 'ari FDA pa'a

tahun 21% legri'6 'ipasarkan 'alam bentuk se'iaan sin'le"use prefilled pen 'an

sin'le"use prefilled syrin'e'an 'ian4urkan untuk 'igunakan 'ua kali 'alam seminggu

Pe%**$%aa%

nter/eron merupakan sekelompok protein 'an glikoprotein ang 'ipro'uksi oleh

sel eukariotik sebagai respon 'ari in/eksi virus 'an in'user biologis lainna nter/eron

merupakan sitokin ang meme'iasi antivirus7 antiproli/erasi 'an aktivitas

imunomo'ulator 'alam merespon in/eksi virus 'an in'user biologis lainna nter/eron

'apat 'ibe'akan men4a'i tiga kelompok besar aitu al/a7 beta 'an gamma nter/eron

beta 'an al/a merupakan inter/eron tipe se'angkan inter/eron gamma termasuk

inter/eron tipe nter/eron beta 'alam tubuh manusia 'ipro'uksi oleh berbagai ma#am

4enis sel termasuk /ibroblas 'an makro/ag nter/eron beta menimbulkan e/ek

biologisna 'engan berikatan pa'a reseptor spesi/ik pa'a permukaan sel manusia

katan ini menginisiasi 'iekspresikanna beberapa pro'uk genetika ang mengin'uksi

inter/eron seperti 2G7*Goligoa'enilat sintase7 02mikroglobulin7 'an neopterin nter/eron

beta alami 'an inter/eron 01a ang merupakan pro'uk rekombinan memiliki letak

glikosilasi 'an urutan asam amino ang sama Hlikosilasi 'ari proteinprotein lain

'iketahui akan mempengaruhi stabilitas7 aktivitas7 bio'istribusi 'an -aktu paruh 'alam

'arah Hlikosilasi 'ari protein lainna 4uga 'apat menurunkan agregasi 'ari protein


8/24

inter/eron 01a ini Bentuk agregasi 'ari inter/eron 01a 'iketahui akan membuat

protein rekombinan ini men4a'i bersi/at imunogenik Bentuk agregat 'ari inter/eron 0

1a 'iketahui memiliki aktivitas spesi/ik lebih lemah 'aripa'a bentuk agregatna

nter/eron 01a ber/ungsi 'alam mengobati penakit multiple s#lerosis 'engan

memperlambat akumulasi 'ari 'istabilitas /isik 'an menurunkan /rekuensi ge4ala parah

ang timbul Selain itu7 pro'uk rekombinan ini pun 'apat mengurangi 4umlah 'an

volume 'ari lesi otak ang akti/ 'an teri'enti/ikasi pa'a saat 'ilakukan scannin'

Ma'netic *esonance +ma'in' (M") nter/eron 01a ti'ak 'ian4urkan penggunaanna

pa'a pasien ang pernah mengalami hipersensitivitas baik terha'ap inter/eron beta

alami maupun terha'ap pro'uk rekombinan7 hipersensitivitas albumin manusia atau

komponen 'alam /ormulasi Selama penggunaanna7 pro'uk rekombinan ini 'apat

menimbulkan reaksi 'an e/ek samping berupa 'epresi7 kerusakan hati7 ana/ilaksis ataureaksi alergi lainna7 reaksi pa'a lokasi in4eksi7 'an mikroangiopati trombotik

4 S'+#em P)o$k+'

41 P)o+e+ H$l$ (Up Stream5

Teknologi D8A rekombinan a'alah meto'e rekombinasi antara molekul D8A

'ari organisme berbe'a7 meto'e ini ter'iri 'ari beberapa tahapan7 aitu:

1 eniapan D8A (sisipan 'an vektor)

a eniapan D8A sisipan (sumber D8A sisipan: #D8A )

Fragmen m"8A inter/eron 01a 'iisolasi 'ari sel 'arah manusia ang men'erita

multiple sclerosis ('engan kit isolasi "8A) Fragmen m"8A kemu'ian

'itranskripsi balik se#ara in vitro 'engan menggunakan enIim reerse

transcriptase sehingga akan 'ihasilkan #D8A 'ari inter/eron 01a Setelah itu7

'ilakukan proses &" untuk memperbanak #D8A 'engan menggunakan primer

ang spesi/ik mengenali D8A sisipan (inter/eron 01a) rimer spesi/ik ang

akan 'igunakan untuk ampli/ikasi inter/eron 01a ini misalna a'alah

*GATHAH&TA&AA&TTH&TTHH3G untuk primer forward 'an*G&AHHTTA&&T&&HAAA&THA3G untuk primer reerse a'a u4ung *G 'ari

primer forward 'itambahkan situs pemotongan enIim restriksi %am; 'an 'i

u4ung *G 'ari primer reerse 'itambahkan situs pemotongan enIim restriksi

Eco" emilihan situs enIim restriksi ini 'isesuaikan 'engan situs pemotongan

enIim restriksi ang bera'a pa'a vektor ang akan 'igunakan Situs pemotongan

enIim restriksi ini ti'ak ter'apat pa'a urutan D8A sisipan Fragmen &"

kemu'ian 'ipisahkan 'engan 17E gel agarosa7 'imurnikan 'engan D8A 'el

e&traction #it 'an 'ipotong 'engan enIim restriksi %am; 'an Eco"


9/24

Ber'asarkan%ritish Pharmacopeia tahun 27 inter/eron 01a memiliki urutan

asam amino sebagai berikut:

Gam0a) @rutan asam amino inter/eron 01a (B 2)

Dari berbagai literatur7 ti'ak 'itemukan urutan nukleoti'a spesi/ik untuk

inter/eron 01a7 sehingga urutan nukleoti'ana 'apat menga#u pa'a urutan

inter/eron beta 8amun inter/eron beta memiliki 1.! asam amino 'an 'ia-ali'engan start ko'on (ATH) 'an sinal pepti'a Berikut merupakan urutan asam

amino 'an urutan D8A 'ari inter/eron beta:

Gam0a) @rutan asam amino inter/eron beta

Gam0a) 4@rutan D8A inter/eron beta

Sehingga urutan asam amino 'an urutan D8A 'ari inter/eron 01a ang ti'ak

memiliki sinal pepti'a 'an 'ia-ali 'engan start ko'on (ATH) urutan D8Ana

sebagai berikut:

Gam0a) 6@rutan D8A inter/eron 01a

MT8$&,,JA,,,&FSTTA,SMSK8,,HF,J"SS8&J&J$,,LJ,8H",=K&,$D""8FD==$J,JJ

FJ$=DAA+TK=M,J8FAF"JDSSSTHL8=T+=8,,A8+K;J"8;,$T+,==$,=$=DFT"H$"MSS

,;,$"KKH",;K,$A$=DS;&ALT+"+=,"8FK+8",THK,"8

ATHA&&AA&AAHTHT&T&&T&&AAATTH&T&T&&THTTHTH&TT&T&&A&HA&AH&T&TTT&& ATHAH&TA&AA&TTH&TTHHATT&&TA&AAAHAAH&AH&AATTHT&AHTHT&AHAAH&T&&THTHH&AATTHAA

THHHAHH&TTHAATA&TH&&T&AAHHA&AHHAHHAA&TTTHA&AT&&&THAHHAHATTAAH&AH&TH

&AH&AHTT&&AHAAHHAHHA&H&&H&AHTHA&&AT&TATHAHATH&T&&AHAA&AT&TTTH&TATTTT

&AHA&AAHATT&AT&HAH&A&THH&THHAATHAHA&TATTHTTHAHAA&&T&&THH&TAATHT&TAT&

AT&AHAHAAA&&AT&THAAHA&AHT&&THHAAHAAAAA&THHAHAAAHAAHATTT&A&&AHHHHAA

AA&H&ATHAH&AHT&TH&A&&THAAAAHATATTATHHHAHHATT&TH&ATTA&&THAAHH&&AAHHA

HHA&AHT&A&THTH&&THHA&&ATAHT&AHAHTHHAAAT&&TAAHHAA&TTTTA&HT&ATTAA&AHA&

TTA&AHHTTA&&T&&HAAA&THA

ATHAH&TA&AA&TTH&TTHHATT&&TA&AAAHAAH&AH&AATTHT&AHTHT&AHAAH&T&&THTHH&AAT

THAATHHHAHH&TTHAATA&TH&&T&AAHHA&AHHAHHAA&TTTHA&AT&&&THAHHAHATTAAH&AH&

TH&AH&AHTT&&AHAAHHAHHA&H&&H&AHTHA&&AT&TATHAHATH&T&&AHAA&AT&TTTH&TATTTT

&AHA&AAHATT&AT&HAH&A&THH&THHAATHAHA&TATTHTTHAHAA&&T&&THH&TAATHT&TAT&AT&

AHAHAAA&&AT&THAAHA&AHT&&THHAAHAAAAA&THHAHAAAHAAHATTT&A&&AHHHHAAAA&H

&ATHAH&AHT&TH&A&&THAAAAHATATTATHHHAHHATT&TH&ATTA&&THAAHH&&AAHHAHHA&AHT

&A&THTH&&THHA&&ATAHT&AHAHTHHAAAT&&TAAHHAA&TTTTA&HT&ATTAA&AHA&TTA&AHHTT

A&&T&&HAAA&THA


10/24

b eniapan vektor

Tu4uan akhir ang 'iinginkan a'alah untuk men'apatkan protein berupa

inter/eron 01a7 maka vektor ang 'igunakan a'alah vektor ekspresi +ektor ang

'igunakan 'alam pro'uksi inter/eron 01a ini a'alah plasmi' M1! ang ter'iri

'ari: 'ua 4enis ori ang menatakan bah-a vektor pM1! merupakan vektor

shuttle aitu ori B"322 untuk E. coli'an ori S+% untuk sel mamalia7 gen

resistensi ampisilin untuk seleksi trans/orman pa'aE. coli7 M&S 'engan berbagai

situs enIim restriksi7 promotor MMT+7 'an gen pengko'e D;F" untuk seleksi

trans/orman pa'a sel &;< 'an untuk meregulasi proses pro'uksi inter/eron 01a

a'a vektor ter'apat komponen transkripsi 'an translasi untuk 'ilakukan pa'a sel

inang E. coli 'an &;< (sel mamalia) eniapan vektor 'ilakukan 'engan

memotong vektor pM1! 'engan enIim restriksi %am; 'an Eco" sehingga

bentukna men4a'i linear 'an 'apat 'isisipi 'engan D8A sisipan

Gam0a) "+ektor ekspresi pM1!

2 ,igasi

,igasi a'alah proses penambungan antara satu /ragmen D8A 'engan /ragmen

D8A lainna Dalam hal ini D8A sisipan 'isambungkan 'engan vektor berupa

vektor ekspresi Faktor ang sangat berperan 'alam proses ligasi a'alah enIim ligase

ang ber/ungsi menggabungkan /ragmen D8A ang telah 'ipotong 'engan enIim

restriksi 'engan /ragmen D8A vektor ang mensintesis pembentukan ikatan

/os/o'iester ang menghubungkan nukleoti'a ang satu 'engan nukleoti'a 'i

sebelahna7 sehingga terbentuk plasmi' rekombinan


11/24

Gam0a) 7roses ligasi

3 Trans/ormasi ke sel inangE. coli

Trans/ormasi merupakan langkah untuk menisipkan materi genetik ang

berupa /ragmen D8A baik itu D8A kromosom maupun plasmi' rekombinan ke

'alam sel inang (E. coli) Trans/ormasi ini hana 'apat 'ilakukan pa'a sel ang

kompeten (sel ang memiliki kemampuan untuk menerima D8A telan4ang)

erlakuan untuk membuat membran sel inang siap untuk 'isisipi perlu 'ilakukan

aitu 'engan menambahkan &a&l2 kemu'ian 'ilakukan heat shoc#'engan tu4uan

agar plasmi' rekombinan masuk ke 'alam sel inang Sel inang ang telah menerima

materi genetik 'isebut 'engan trans/orman

% Seleksi trans/orman

Seleksi trans/orman 'ilakukan 'engan tu4uan untuk memastikan apakah 'i

'alam sel inang telah ter'apat trans/orman atau ti'ak Ber'asarkan plasmi' ang

'igunakan 'imana ter'apat gen resistensi antibiotik ampisilin (Amp")7 maka seleksi

trans/orman 'ilakukan 'engan menambahkan me'ia tumbuh sel inang 'engan

ampisilin Apabila pa'a sel E. coli ter'apat trans/orman 'imana ter'apat gen

pengko'e resistensi ampisilin maka sel inang E. coliakan hi'up7 se'angkan apabila

ti'ak ter'apat trans/orman makaE. coliakan mati 8amun kelemahan marka seleksi

ini a'alah ti'ak 'apat membe'akan trans/orman 'engan plasmi' rekombinan 'an

trans/orman 'engan plasmi' kosong

* Deteksi$lon trans/orman ang su'ah 'iseleksi kemu'ian perlu 'i'eteksi kebera'aan

'an kebenaran 'ari D8A sisipan ang tersisipi 'i plasmi' merupakan D8A sisipan

ang 'iinginkan Maka itu 'ilakukan:

a Analisis migrasi7 salah satu #ara untuk men'eteksi kebenaran plasmi'

rekombinan pa'a klon trans/orman ber'asarkan ukuran a'a meto'e ini plasmi'

rekombinan hasil isolasi 'ari sel klon trans/orman 'iisolasi untuk kemu'ian

'iban'ingkan ke#epatan migrasina 'engan plasmi' kosong pa'a elektro/oresis

gel agarosa lasmi' rekombinan akan bergerak lebih lambat 'iban'ingkan

'engan plasmi' kosong

Liga

+ektor D8A sisipan

lasmi' rekombinan


12/24

b Analisis restriksi7 meto'e 'eteksi kebenaran plasmi' rekombinan pa'a klon

trans/orman ber'asarkan ukuran linear plasmi' rekombinan 'an ukuran D8A

sisipan a'a meto'e ini 'igunakan enIim restriksi %am; 'an Eco" ang

mampu mengenali situs restriksi pa'a plasmi' rekombinan $e#epatan

migrasina kemu'ian 'iban'ingkan 'engan marka D8A pa'a elektro/oresis gel

agarosa lasmi' ang mengan'ung D8A sisipan akan menghasilkan 'ua pita

pa'a gel elektro/oresa aitu satu pita untuk plasmi' ang berukuran .2!*

pasangan basa 'an satu pita lainna untuk D8A sisipan ang berukuran %.

pasangan basa (1 asam amino > 3 pasangan basa)

uri/ikasi plasmi' rekombinan

@ntuk memurnikan plasmi' rekombinan 'apat menggunakan meto'e

minipreps 'engan prinsip melisiskan sel 'an memurnikan D8A 'engansentri/ugasi 'an atau membrane"bindin' Membran silica 'eluntuk mengikat D8A

ang telah 'ikembangkan oleh perusahaan Jiagen Sel 'ilisiskan 'engan

menggunakan meto'e lisis alkali ang 'imo'i/ikasi oleh Birnboim 'an Dol

! Trans/eksi ke sel inang ke'ua (&;


13/24

purin timin glisin7 sel inang mutan D;F" akan tetap menghasilkan nukleoti'a

purin7 timin 'an glisin 'an tumbuh

Deteksi

$lon trans/orman ang su'ah 'iseleksi kemu'ian perlu 'i'eteksi kebera'aan

'an kebenaran 'ari D8A sisipan ang tersisipi 'i plasmi' merupakan D8A sisipan

ang 'iinginkan Maka itu 'ilakukan:

a Analisis migrasi7 salah satu #ara untuk men'eteksi kebenaran plasmi'

rekombinan pa'a klon trans/orman ber'asarkan ukuran a'a meto'e ini plasmi'

rekombinan hasil isolasi 'ari sel klon trans/orman 'iisolasi untuk kemu'ian

'iban'ingkan ke#epatan migrasina 'engan plasmi' kosong pa'a elektro/oresis

gel agarosa lasmi' rekombinan akan bergerak lebih lambat 'iban'ingkan

'engan plasmi' kosong

b Analisis restriksi7 meto'e 'eteksi kebenaran plasmi' rekombinan pa'a klon

trans/orman ber'asarkan ukuran linear plasmi' rekombinan 'an ukuran D8A

sisipan a'a meto'e ini 'igunakan enIim restriksi %am; 'an Eco" ang

mampu mengenali situs restriksi pa'a plasmi' rekombinan $e#epatan

migrasina kemu'ian 'iban'ingkan 'engan marka D8A pa'a elektro/oresis gel

agarosa lasmi' ang mengan'ung D8A sisipan akan menghasilkan 'ua pita

pa'a gel elektro/oresa aitu satu pita untuk plasmi' ang berukuran .2!*

pasangan basa 'an satu pita lainna untuk D8A sisipan ang berukuran %.

pasangan basa (1 asam amino > 3 pasangan basa)

1 Sistem ekspresi inter/eron 01a

Dalam sistem ekspresi inter/eron 01a 'iperlukan komponen penting7 aitu

komponen transkripsi (promotor7 situs inisisasi transkripsi 'an terminator) 'an

komponen translasi (ribosom bindin' sites7 start ko'on 'an stop ko'on) romotor

'an terminator ang 'igunakan harus 'ikenali oleh "8A polimerase sel inang &;

maka sel ti'ak akan menghasilkan nukleoti'a purin7 timin 'an glisin7 sehingga sel

merasa kekurangan D;F" 'an sel memaksa untuk melakukan transkripsi 'an

'ihasilkan nuklteoti'a purin7 timin 'an glisin Dengan 'ihasilkanna nukleoti'a


14/24

purin7 timin 'an glisin maka se#ara ti'ak langsung gen inter/eron 01a 4uga ikut

tertranskripsi sehingga 'ihasilkan protein inter/eron 01a

4 P)o$k+' (Fe)me%#a+'5

@ntuk men'apatkan pro'uk ang berkualitas pilihan me'ia kultur 'an meto'e

untuk proses pro'uksi sangat penting7 FDA menetu4ui bah-a pro'uk 'ipro'uksi

'engan menggunakan me'ia ang bebas serum @ntuk proses pro'uksina7 'apat

menggunakanfed batch fermentation Beberapa komponen 'asar 'ari me'ia7 aitu:

1 Haram anorganik

Haram anorganik 'igunakan untuk mempertahankan keseimbangan osmotik sel

'an membantu mengatur potensial membran 'engan a'ana ion natrium7 kalium

'an kalsium Semua ini 'iperlukan 'alam matriks sel untuk attach sel 'ansebagai ko/aktor enIim

2 $arbohi'rat

$arbohi'rat merupakan sumber energi utama7 biasana 'igunakan glukosa 'an

galaktosa atau maltosa atau /ruktosa 'engan konsentrasi 1g, O %7*g,

3 Asam amino

Asam amino 'apat meningkatkan stabilitas 'ari me'ia 'an 'apat mempengaruhi

kelangsungan hi'up sel 'an la4u pertumbuhan $ebanakan glutamin 'iperlukan

oleh sebagian besar sel sebagai sumber energi 'an karbon

% +itamin

Serum merupakan sumber vitamin penting 'alam kultur sel Banak vitamin

terutama kelompok vitamin B ang 'iperlukan untuk pertumbuhan sel 'an

proli/erasi

* Asam lemak 'an lipi'

Seperti protein 'an pepti'a ang keha'iranna penting 'alam me'ia ang bebas

serum7 asam lemak 4uga 'iperlukan misalna kolesterol 'an steroi'

rotein

rotein sangat penting untuk menggantikan keti'akbera'aan serum 'alam me'ia

seperti albumin7 trans/erin7 /ibronektin 'an /etuin

! =lemen lain

=lemen lain seperti Pn7 &u7 Se 'an asam trikarboksilat a'alah komponen ang

'ibutuhkan 'alam 4umlah se'ikit 'alam pembuatan me'ia7 #ontohna a'alah

selenium ang membantu menghilangkan ra'ikal oksigen bebas

. Sistem 'apar


15/24

a p; 'iatur 'i antara 7*!7* (tergantung 'ari 4enis sel ang 'igunakan)

b


16/24

'engan perlakuan sentri/ugasi 'an karena protein inter/eron 01a merupakan protein

intrasel7 'ibutuhkan proses lisis sehingga protein 'apat terpisahkan 'ari sel inangna

Meto'e lisis ang 'igunakan a'alah meto'e 'lass bead roses ini 'ia-ali 'engan

sentri/ugasi protein pa'a * 'au'e selama 1 menit pa'a suhu %o& 'an akan

'iperolehpelletselPelletsel ang telah 'ipanen selan4utna 'i#airkan hingga suhu

ruang 'an 'ilarutkan kembali 'alam larutan 'apar hipertonis ang 'ibuat segar 'an

mengan'ung sukrosa7 Tris&l p; . 'an =DTA p; . elarutan ini bertu4uan untuk

melisis sel sehingga protein inter/eron 01a 'apat 'ikeluarkan 'ari sel ,arutan ang

'iperoleh 'isimpan 'i atas es selama 3 menit pa'a % o& ,arutan ang berisipellet

sel 'isentri/ugasi pa'a *'au'eselama 1 menit pa'a %o& 'an 'ipisahkan bagian

supernatanna Se'angkan bagian 'ebris selna 'ilarutkan kembali 'alam larutan

hipotonis MgS


17/24

M 8a&l7 'an 1 mM =DTA7 kemu'ian 'ilakukan penampungan larutan washin'

Tahapan washin' 'ilakukan 'engan mele-atkan pa'a kolom larutan 2 mM 8a

Asetat p; * 'an 7!* M 8a&l Tahapan terakhir a'alah tahapan elusi7 'engan

mengalirkan 2 mM 8aasetat p; * (Arnol'7 et al7 212)

b $romatogra/i enukar Anion

$romatogra/i enukar Anion atau -nion E&chan'e Chromato'raphy (A=>)

'ilakukan sebagai proses lan4utan 'ari ;& A=> 'ilakukan untuk membuang sisa

D8A sel inang ang mungkin a'a 'an kontaminasi viral atau kontaminan lain ang

bermuatan negati/ ,angkah ini 'ilakukan langsung setelah proses ;& 'ilakukan

rinsip 'ari A=> a'alah memurnikan protein target ber'asarkan perbe'aan

muatanna 'engan pengotor atau kontaminanna pa'a p; tertentu nter/eron 01a

ang memiliki p #en'erung tinggi aitu .73 akan bermuatan positi/ apabila p;

lingkungan 'iasamkan Dengan muatan protein target ang positi/ 'an pengotor

berupa D8A sel inang atau kontaminan berupa virus atau lainna ang bermuatan

negati/7 maka ketika 'ile-atkan pa'a A=> 'engan membran /iltrasi penukar ion7

protein target akan 'ile-atkan sementara pengotor 'an kontaminan akan tertahan

sehingga protein murni Tahapan A=> ini 'ilakukan 'engan mele-atkan larutan

protein target hasil ;& kepa'a kromatogra/i penukar anion 'engan kolom butyl

sepharose rinsip tahapan ini a'alah melakukan penaringan pa'a /iltrasi membran

A=> 'engan tipe penaring Mustang J Sebelum 'ilakukan loadin'7 membran

/iltrasi 'ibersihkan 'engan 1 M 8a


18/24

bera'a 'alam rentang 321 O %%33 gm, Setelah 'ilakukan proses ultra/iltrasi7

'ilakukan proses washin''engan 2 mM 8aasetat7 p; * (Arnol'7 et al7 212)

' $romatogra/i =ksklusi @kuran

$romatogra/i =ksklusi @kuran atau Si$e E&clusion Chromato'raphy (S=&)

'ipilih sebagai langkah terakhir 'alam pemurnian protein inter/eron 01a atau tahap

polishin' a'a tahapan ini 'ilakukan pengurangan pro'uk ang ti'ak sesuai

ukuranna rinsip 'ari S=& a'alah memisahkan protein target 'engan pengotor 'an

atau kontaminan ber'asarkan perbe'aan ukuran rotein target ang ukuranna lebih

ke#il 'iban'ing pengotor atau kontaminanna akan tertahan lebih lama 'i 'alam

kolom karena terabsorpsi ke 'alam poripori kolom Sebalikna7 kontaminan 'an

atau pengotor 'engan ukuran ang lebih besar akan lebih #epat keluar 'ari kolom

S=& $olom S=& ang 'apat 'igunakan 'apat berupa kolom Super'e5 2 a'a

sistem S=& ini7 'igunakan runnin' bufferberupa 2* mM 8aasetat p; %7.7 71* M

8a&l 71!E (vv)7 'an T-een 2 ;al pertama ang 'ilakukan a'alah proses

ekulibrasi 'engan loadin' buffer ang telah 'ialiri gas 82untuk mengusir oksigen

'ari larutan rotein hasil pemekatan 'iloadin'ke 'alam kolom 'engan volume

loadin'maksimal 27*E volume kolom roses elusi pa'a sampel lalu 'ilakukan

Ka)ak#e)'+a+'

$arakterisasi 'ilakukan untuk melakukan kon/irmasi i'entitas pa'a protein

;alhal ang perlu 'itentukan 'alam karakterisasi protein a'alah i'entitas7

kuanti/ikasi protein7 penetuan kemurnian7 stabilitas7 'an spesi/isitas rotein ang

su'ah 'ipuri/ikasi 'iu4i 'engan menggunakan SDSAH= 12E lalu 'igunakan pula

reagen Coomassie %lue untuk i'enti/ikasi protein 'enti/ikasi ini 'ilakukan

ber'asarkan ukuran 'ari protein ang 'ihasilkan rotein 'ari hasil SDSAH=

kemu'ian 'iproses 'engan meto'e estern %lot 'imana gel 'itransblot ke

nitroselulosa 'an 'iblok 'engan BSA (3E 'i 'alam BS) 8itroselulosa 'iinkubasi

'engan anti0inter/eron monoklonal /mouse anti"human 0"+,!1 &hemi#on ntl)

ang 'iikuti 'engan gH antitikus kambing ang terkon4ugasi 'engan alkalin

/os/atase lalu 'ikembangkan 'engan nitro blue tetraIolium 'an *bromo%kloro3

in'olil /os/at (Sigma) rinsip 'ari SDSAH= ini a'alah penentuan ukuran 'ari

protein ang 'iinginkan Melalui meto'e ini7 'apat 4uga 'iketahui keti'akmurnian 'i

'alam protein ang 'apat terlihat 'ari terbentukna pita 'i marka ukuran ang ti'ak

sesuai 'engan protein ang kita inginkan estern %lot'ilakukan untuk memastikan

protein ang 'i'apatkan a'alah F8 0 karena 'igunakan antibo'i ang spesi/ik

berikatan 'engan protein F8 0 Dengan meto'e ini7 'apat pula 'iketahui kuantitas

'ari protein Meto'e karakterisasi lainna ang harus 'ilakukan a'alah penentuan


19/24

aktivitas biologis 'ari protein 'engan #ara memban'ingkan kemampuan protein

tersebut 'engan stan'ar internasional 'ari protein rekombinan inter/eron 01a

manusia untuk memproteksi sel terha'ap e/ek sitopatik virus atau 'engan preparasi

ang telah terkalibrasi 'alam+nternational Units.

4 Fo)m$la+'

8o Bahan umlah ('alam 1 m, se'iaan)

1 nter/eron 01a 3 g

2 8a&l *7. mg

3 Albumin Manusia 1* mg

% 8atrium Fos/at Dibasik (8a2;


20/24

in/eksi virus 'an in'user lain Fungsina sebagai antivirus7 antiproli/erati/7 'an memiliki

aktivitas imunomo'ulator ,arutan konsentrat inter/eron 01a 'ipro'uksi 'engan meto'e

teknologi D8A rekombinasi (rD8A) menggunakan kultur sel mamalia ,arutan

konsentrat inter/eron 01a memiliki karakteristik 4ernih7 ti'ak ber-arna atau #airan

se'ikit kekuningan 'enti/ikasi inter/eron 01a 'apat 'ilakukan 'engan spektrometri

massa 'anpeptide mappin'('an kromatogra/i #air)

Spektrometri massa

Meto'e spektrometri massa 'igunakan untuk melihat 'istribusi gliko/orm &ara

ionisasina menggunakan electrospray Si'nal ac2uisition menggunakan spektrum

112% Meto'e kalibrasi 'igunakan myo'lobin 'engan rentang mI 2%R

'eviasi 'ari massa ratarata ti'ak melebihi 72E 'ari massa ang 'i'apat sehingga 'apat

'ikatakan massa tersebut a'alah 'ata ang vali' nterpretasi 'ari hasil ang 'i'apat7spektrum khas ter'iri 'ari gliko/orm utama (AF) ang 'ibe'akan ber'asarkan

tingkatan sialilasi 'anatau tipe antena ang terlihat pa'a tabel:

un#ak MS Hliko/ormU ML ang 'iharapkan Tingkat sialilasi

A 2A2S1F 22 3!* Ter'isialilasi

B 2A2S1F 22 .% Termonosialilasi

&3A2S1F 'anatau 2A2S1F N

1 ;e58a#;e5 repeat22 !3 Ter'isialilasi

D 3A3S1F 23 31 Tertrisialilasi

=%A3S1F 'anatau 3A3S1F

N1 ;e#8a#;e5 repeat23 % Tertrisialilasi

F 2AS1F 21 !3 Ti'ak tersialilasi(Ke#e)a%*a%9 U2A V kompleks 2 antena tipe oligosakari'aR 3A V kompleks 3 antena tipe oligosakari'aR

%A V kompleks % antena tipe oligosakari'aR S V ti'ak tersialilasiR 1S V termonosialilasiR 2S V

ter'isialilasiR 3S V tertrisialilasiR 1F V ter/ukosilasi)

Peptide mappin''an kromatogra/i #air

Meto'e i'enti/ikasi ini 'ilakukan 'engan menggunakan kromatogra/i #airrekolom ang 'igunakan memiliki pan4ang 72 m 'an 'iameter 'alam 271 mm 'engan

/ase 'iam berupaspherical octadecylsilyl silica 'eluntuk kromatogra/i " (*Wm) 'engan

ukuran pori 3nm $olom ang 'igunakan memiliki pan4ang 72* m 'an 'iameter

'alam 271 mm7 /ase 'iam berupaspherical octadecylsilyl silica 'eluntuk kromatogra/i

" (*Wm) 'engan ukuran pori 3nm7 'an /ase gerak berupa asam tri/luoroasetat 'alam air

(A) 'an asam tri/luoroasetat 'alam asetonitril untuk kromatogra/i " (B) Sistem

kromatogra/i #air ang 'igunakan memiliki ke#epatan alir 72 m,menit7 sistem 'eteksi

spektro/otometer pa'a pan4ang gelombang 21% nm7 'an volume in4eksi mengan'ung


21/24

2Wg di'ested protein $esesuaian sistem terpenuhi 4ika larutan re/erensi memiliki

kemiripan kualitati/ 'engan kromatogram inter/eron 01a ;asil pro/il kromatogram

menun4ukan larutan u4i sesuai kromatogram larutan stan'ar

Selain itu 'ilakukan pula beberapa pengu4ian lain7 seperti:

Mengukur keti'akmurnian 'ari inter/eron 01a 'engan menggunakan gel poliakrilami'

elektro/oresis 'engan kon'isi reducin' menggunakan agen 2merkaptoetanol ,arutan

re/erensi ang 'igunakan ialah (a) larutan marker ang #o#ok untuk kalibrasi SDS

AH= gel pa'a rentang 1*! kDa ang 'ilarutkan 'alam buffer sampel (#ampuran

ang setara 'engan volume SDSAH= buffersampel pekat 'alam air) (b) 7!* mgm,

larutan inter/eron 01a &"S 'alam buffer sampel Deteksi 'engan menggunakan

pe-arna coomassie Massa molekul ang terlihat aitu inter/eron 01a sekitar 237inter/eron 01a ang terglikosilasi sekitar 217 inter/eron 01a ang ti'ak

terglikosilasi sekitar 27 'an inter/eron 01a 'imer sekitar %

Mengukur inter/eron 01a ang teroksi'asi (sarat: maksimum E) menggunakan

kromatogram ang 'iperoleh 'engan larutan u4i i'enti/ikasi & un#ak /ragmen pepti'a

ang ter'iri 'ari asam amino 3%3* 'an bentuk teroksi'asi akan terlihat pa'a

kromatogram 'ari intisari inter/eron 01a ang teroksi'asi ang 'isuplai inter/eron 01a

&"S $emu'ian persentase oksi'asi inter/eron 01a 'ihitung menggunakan rumus

A3445 ox

A3445+A3445ox100

'engan A3%%*o5 a'alah luas 'aerah pun#ak 'ari

/ragmen pepti'a 3%%* ang teroksi'asi 'an A3%%* a'alah luas 'aerah pun#ak 'ari

/ragmen pepti'a 3%%*

Bakteri en'otoksin 'ipersaratkan kurang 'ari 7! @ 'alam volume ang mengan'ung

151@ inter/eron 01a 4ika 'imaksu'kan untuk pembuatan se'iaan parenteral tanpa

prose'ur lebih lan4ut untuk penghilangan bakteri en'otoksin

engu4ian protein 'ilakukan 'engan menggunakan meto'e kromatogra/i #air

'engan prekolom 'an kolom butilsilil silika gel untuk kromatogra/i " 'engan perbe'aan

pa'a pan4ang kolom Fase gerak ang 'igunakan a'alah larutan 71E vv asam

tri/loroasetat (a) 'an #ampuran air 'an asam tri/loroasetat 'alam asetonitril (b)

$e#epatan aliran 72 m,menit Deteksi menggunakan spektro/otometer pa'a pan4ang

gelombang 21% nm Laktu retensi 'ari inter/eron 01a a'alah sekitar 2 menit

$esesuaian sistem aitu 'ilihat 'ari /aktor simetri (7. sampai 2 untuk pun#ak inter/eron

01a) 'an keberulangan (maksimum relati/ stan'ar 'eviasi 3E 'iantara pun#ak area


22/24

ang 'iperoleh setelah in4eksi 'ari 3 larutan in'epen'en) otensi 'ari inter/eron 01a

'iperkirakan 'engan memban'ingkan kemampuan men4aga sel 'ari e/ek virus sitopatik

'engan kemampuan ang sama sesuai 'engan Stan'ar nternasional 'ari rekombinan

inter/eron 01a manusia atau 'engan re/erensi preparasi ang 'ikalibrasi menggunakan

satuan internasional (@) Satuan internasional a'alah pengukuran 4umlah Iat

ber'asarkan Stan'ar nternasional ;asil ang 'i'apat a'alah potensi ang 'iperkirakan

ti'ak kurang 'ari .E 'an ti'ak lebih 'ari 12*E 'ari potensi ang 'itentukan Batas

keper#aaan ( V 7*) ti'ak kurang 'ari %E 'an ti'ak lebih 'ari 1*E 'ari potensi

ang 'iperkirakan ($eterangan: $onten inter/eron 01a 'inatakan 'alam miligram per

mililiterR Aktivitas antiviral 'inatakan 'alam unit internasional per mililiterR Saat bisa

'ilaksanakan7 Iat g sesuai 'igunakan 'alam manu/aktur persiapan parental)

BAB III

KESIMPULAN

nter/eron 01a ang merupakan protein rekombinan manusia memiliki rumus molekul

&.;1%.82%


23/24

'ilakukan 'engan menambahkan me'ia tumbuh sel inang 'engan ampisilin Deteksi klon

trans/orman lalu 'ilakukan 'engan meto'e analisis migrasi 'an analisis restriksi Sebelum

'itrans/eksi ke sel inang ke'ua (&;


24/24

@tsumi7 un7 et al 1. Characteri$ation of ,our Differrent Mammalian"cell"deried

*ecombinant Human +nterferon 0"a $anaga-a: =ur Bio#hem (halaman *%***3)

www.dailymed.nlm.nih.'o8dailymed8dru'info ('iakses pa'a tanggal 2. Maret 21 pukul

.:2 LB)

www.nationalmssociety.or'8-bout"the"Society8!ew8,D-"-pproes"Ple'ridy"Pe'ylated"

+nterferon"%eta('iakses pa'a Tanggal 2. Maret 21 pukul :3)

www.ncbi.nlm.nih.'o8protein8report?fasta ('iakses pa'a Tanggal 2 Maret 21

pukul 22:23)

www.ple'ridy.com ('iakses pa'a Tanggal 2. Maret 21 pukul :3)

www.rebif.com('iakses pa'a Tanggal 2. Maret 21 pukul :%*)

Documents

Interferon - Presenter