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Tirocinio interno presso laboratori universitari: Programmi dei diversi percorsi.
Importante!
Per ogni percorso è indicato il periodo previsto ma si invitano gli studenti a controllare, prima dell’inizio, le informazioni sul sito Ariel del Tirocinio dove verranno comunicate per tempo eventuali modifiche.
Percorso 1 La fosfatasi alcalina di Escherichia coli: purificazione dell'enzima e suo utilizzo nello studio della topologia di una proteina transmembrana.
Docenti: Gnesutta Nerina (Responsabile), Burlini Nedda, Caretti Giuseppina, Dehò Gianni e Nardini Marco Laboratori didattici: 13 (biochimica), 15 (microbiologia, genetica) e aula calcolo (bioinformatica) 16 studenti Periodi: dal 7 al 31 ottobre, dal 18 novembre al 10 dicembre Esami Propedeutici: Genetica, Biologia molecolare e bioinformatica (obbligatorio almeno uno dei due esami)
Purificazione e caratterizzazione fosfatasi alcalina (3 CFU) Lab. 13: Burlini e Gnesutta
In questa prima parte gli studenti dovranno purificare l’enzima fosfatasi alcalina dalla coltura cellulare di un ceppo costitutivo di Escherichia coli. Ottenuto l’enzima dovranno poi caratterizzarlo valutandone: Massa Molecolare Relativa in condizioni denaturanti e native, struttura quaternaria, costanti cinetiche.
Purificazione ‐ L’enzima viene estratto tramite shock osmotico e purificato tramite trattamento al calore, Cromatografia a Scambio Ionico e a Esclusione Molecolare. L’andamento della purificazione è monitorato dosando attività enzimatica e proteine, calcolando attività specifica e resa. L’esito della purificazione è valutato anche mediante Elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS‐PAGE) dei campioni enzimatici ottenuti.
Caratterizzazione ‐ Sarà calcolata la Massa Molecolare Relativa in SDS‐PAGE e in Cromatografia a Esclusione Molecolare dell’enzima purificato, da cui si dedurrà la struttura quaternaria della proteina enzimatica. Infine saranno determinati i parametri cinetici dell’enzima: Km, Vmax e numero di turnover.
Studio della topologia di una proteina transmembrana 3 CFU Lab. 15: Caretti, Dehò e Nardini (analisi bioinformatica in aula calcolo)
In questa seconda parte la fosfatasi alcalina sarà utilizzata come strumento per lo studio della topologia di una proteina transmembrana. La fosfatasi alcalina è attiva solo nel periplasma e non nel citoplasma. Utilizzeremo costrutti plasmidici in cui il gene phoA (che codifica per la fosfatasi alcalina) è fuso in posizioni diverse al 3’ di un gene che codifica per una proteina con numerosi domini trans‐membrana. Nelle diverse chimere proteiche ottenute, la porzione enzimatica potrà risultare inattiva o attiva, suggerendo così che il punto di giunzione della proteina transmembrana si trovi, rispettivamente, nel versante citoplasmatico o periplasmatico della membrana.
Per ottenere queste informazioni eseguiremo i seguenti esperimenti:
Trasformazione col DNA plasmidico di un ceppo di E. coli; saggio qualitativo (in vivo) e quantitativo (spettrofotometrico) dell’attività enzimatica della fosfatasi alcalina; caratterizzazione dei plasmidi mediante analisi di restrizione e PCR; analisi delle proteine di fusione mediante western blotting; analisi bioinformatica della struttura di una proteina e predizione dei domini transmembrana.
Percorso 2 Tecniche di fisiologia cellulare e molecolare Fisiologia delle cellule vegetali e animali Docenti: Bucchi Annalisa (Responsabile), Bonza Cristina, Jennings Robert Laboratori didattici: 15 (Fisiologia Vegetale) e 12 (elettrofisiologia) 15 studenti Periodo: dal 8 ottobre a 15 novembre Esami Propedeutici: Fisiologia Generale Animale, Fisiologia Vegetale
Trasporto di elettroni fotosintetico(2 CFU): Robert Jennings, Cristina Bonza
Lo scopo principale delle esercitazioni sulla fotosintesi è di utilizzare l'elettrodo di ossigeno per determinare la velocità del trasporto degli elettroni in tilacoidi estratti e soggetti a diversi trattamenti sperimentali. In particolare verranno studiate le influenze di un disaccoppiante e dei substrati della fosforilazione sul trasporto degli elettroni in funzione all'intensità dell'illuminazione del sistema dei tilacoidi. Le interazioni dei vari trattamenti sperimentali sono complesse e, per meglio valutare i diversi effetti, verranno eseguite delle simulazioni numeriche al computer dei trattamenti sperimentali.
Il miocita, proprietà funzionali e molecolari (2 CFU): Annalisa Bucchi
Il potenziale d’azione cardiaco, tessuto di conduzione e muscolo di lavoro. Simulazione al computer del potenziale d’azione cardiaco, analisi delle variazioni del pda in seguito a variazioni delle condizioni ioniche, mutazioni genetiche e somministrazione di farmaci. Tecniche di isolamento e coltura di miociti ventricolari di topo. Modulazione della frequenza di firing tramite somministrazione di agonisti adrenergici e muscarinici. Fissazione ed immunomarcatura delle colture di cardiomiociti. analisi di immunofluorescenza al microscopio confocale. Fisiologia dell’Eccitabilità(2 CFU): Annalisa Bucchi
Il lavoro di laboratorio sarà articolato nei seguenti punti: Teoria dietro alla tecnica del voltage‐clamp a due elettrodi Preparazione dell’apparato sperimentale e dei protocolli sperimentali con modelli di membrana cellulare; preparazione e messa a punto di microelettrodi; Preparazione degli oociti di Xenopus laevis Registrazione e rappresentazione grafica di una corrente endogena di potassio in oocita di Xenopus laevis con la tecnica del voltage‐clamp a due elettrodi; misura e analisi delle correnti del canale HCN4 espresso in oociti di Xenopus laevis; interpretazione e discussione dei dati.
Percorso 3 La risposta immune negli Invertebrati Docente: Scarì Giorgio (responsabile) Laboratori didattici: 11 e 15 16 studenti Periodo: dal 3 marzo al 4 aprile Esame propedeutico: Biologia e Sistematica Animale (obbligatorio)
Modelli sperimentali: varie larve di Ditteri Sarcophaga peregrina, Calliphora vomitoria, Chrysomya megacephala, in stagione anche ditteri Culicidae e anellidi oligocheti
Lo scopo del laboratorio sarà quello di fornire allo studente esercitazioni pratiche su alcune tecniche più
utilizzate per la valutazione istologica e citologica, al microscopio ottico, di cellule del sistema immunitario.
Il laboratorio prevede esercitazioni pratiche finalizzate all’acquisizione di alcune tecniche immunologiche e
metodiche immuno‐istologiche utilizzate anche nella comune diagnostica di laboratorio biologico‐medico.
Inoltre prevede l’apprendimento di nozioni di base e saggi in vitro per valutare la funzionalità del sistema
immunitario utilizzando cellule ottenute da vari donatori.
Cenni sull’evoluzione del sistema immunitario Cenni sulla sicurezza e lo smaltimento dei reflui. Preparazione soluzioni, impiego della bilancia e pHmetro. Allestimento preparati istologici mediante inclusione in paraffina, taglio al microtomo e colorazione con E.E. Colorazioni speciali ed istochimiche. Allestimento e colorazione di strisci ematici ed emolinfatici. Immunoistochimica e Immunocitochimica per la ricerca di antigeni. Osservazione vetrini al microscopio ottico. Separazione e purificazione emociti da emolinfa. Dosaggio dell’attività del sistema pro‐PO. Determinazione dell’attività complementare nell’emolinfa.
Percorso 4 Biologia e genetica dello sviluppo: zebrafish come sistema modello Docenti: Cotelli Franco (responsabile), Beltrame Monica, Guerrini Luisa, Zuccato Chiara Laboratori didattici: 13 e 14 12 studenti Periodo: dal 5 maggio al 6 giugno Esami propedeutici: Genetica (obbligatorio), Biologia dello Sviluppo
Negli ultimi anni l’utilizzo di zebrafish (Danio rerio) come sistema modello ha presentato enormi vantaggi legati alle sue potenzialità nel campo della ricerca di base e biomedica in vivo e sull’organismo intero. Grazie alla sua versatilità, questo sistema modello offre approcci multipli (genetici, biochimici, morfogenetici e farmacologici) che consentono uno studio approfondito di numerosi processi di sviluppo fisiologici e patologici quali vasculogenesi, angiogenesi, ematopoiesi, fisiologia cardiovascolare, cancro e metastasi. Il tirocinio è basato sull’analisi dell'espressione e della funzione di geni coinvolti nello sviluppo embrionale. Le metodologie utilizzate, fra di loro interconnesse, verteranno su approcci di analisi del fenotipo e di biologia molecolare e cellulare. Durante il tirocinio lo studente verrà guidato:
‐ nell’acquisizione e nell'applicazione di tecniche per la localizzazione in situ di trascritti genici (ibridazione in situ “whole mount” o WISH, e su sezione) e proteine; di inclusione di embrioni e larve in paraffina e/o resina e realizzazione di sezioni istologiche;
‐ nell’acquisizione e nell'applicazione di tecniche di biologia molecolare (RT‐PCR e qRT‐PCR, estrazione e/o digestione di acidi nucleici, trascrizione di sonde per WISH, elettroforesi su gel di acidi nucleici e proteine, Western blotting)
‐ nell’uso di morfolino (oligonucleotidi antisenso) per l’analisi funzionale del ruolo di prodotti genici nello sviluppo;
‐ nell’analisi più approfondita dei fenotipi mediante Teoria e pratica per l’utilizzo del Microscopio Confocale e del Microscopio Elettronico nello studio dello sviluppo embrionale;
‐ nella gestione e nell'attività di monitoraggio di una “facility” di zebrafish;
‐ nell'utilizzo di database per ricerche bioinformatiche e bibliografiche.
Letture consigliate: alcune parti dei capitoli riguardanti lo sviluppo embrionale del libro di testo, disponibile in biblioteca: S. F. Gilbert, Biologia dello Sviluppo, Zanichelli
Percorso 5 Proteine coinvolte nella risposta ai danni al DNA da lievito all'uomo: un'analisi molecolare, genetica, biochimica e cellulare.
Docenti: Pellicioli Achille (responsabile), Cappelletti Graziella, Lazzaro Federico 20 studenti Laboratorio didattici: 15 e 11 Periodo: dal 10 marzo al 10 aprile Esami Propedeutici: Biologia molecolare e bioinformatica (obbligatorio), Genetica
Il tirocinio di laboratorio sarà suddiviso in 3 parti indipendenti, ma strettamente interconnesse tra loro per la tematica trattata. Gli studenti saranno guidati nella preparazione di specifici reagenti, al fine di studiare una famiglia di proteine, le Polo chinasi, la cui funzione è fondamentale per la proliferazione e il differenziamento cellulare, anche in presenza di danni al DNA. Gli studenti dovranno applicare specifici protocolli sperimentali, eseguire esperimenti e discutere criticamente i risultati ottenuti. Pertanto, durante lo svolgimento dell’attività di laboratorio, gli studenti familiarizzeranno con le più comuni metodologie e saranno guidati nell’affrontare criticamente una problematica scientifica di ricerca.
L’obiettivo generale prevede la preparazione di reagenti utili per studiare gli interattori e la localizzazione intracellulare della Polo chinasi PLK1, oltre che gli effetti indotti dalla sua overespressione sulla dinamica del citoscheletro microtubulare. Si utilizzeranno opportune fusioni geniche eterologhe e l’espressione di mutanti di PLK1.
Seguiremo un programma sperimentale ideale, che prevede la preparazione di specifici reagenti mediante comuni pratiche di biologia molecolare in cellule batteriche di E. coli. I reagenti ottenuti saranno poi utilizzati per svolgere determinati esperimenti di biologia molecolare e cellulare in cellule eucariotiche, quali il lievito S. cerevisiae e specifiche linee cellulari umane.
Si utilizzeranno comuni tecniche di biologia molecolare e cellulare, tra cui: PCR; analisi di restrizione enzimatica; elettroforesi in gel di agarosio; SDS P.A.G.E.; colture cellulari; trasformazione e transfezione; induzione di espressione eterologa; immunofluorescenza e microscopia; saggio di doppio ibrido; saggi di vitalità cellulare in presenza di danni al DNA; e altro ancora.
In previsione della valutazione finale, saranno fornite indicazioni dettagliate per scrivere una relazione dell’attività svolta, che comprenderà anche la lettura e presentazione critica di un articolo scientifico.
Docenti:
Parte 1: Dr. Federico Lazzaro ([email protected])
Parte 2: Dr. Achille Pellicioli ([email protected])
Parte 3. Dr.ssa Graziella Cappelletti ([email protected])
Percorso 6 Tecniche di fisiologia cellulare e molecolare. Fisiologia e citochimica animale e vegetale
Docenti: Olivari C. (responsabile turno B), Costa A., De Michelis I., Morandini P., Moroni A. Laboratori didattici: 11 e 15 (Fisiologia Vegetale), 12 (elettrofisiologia) 16 studenti Periodo: dal 21 ottobre al 29 novembre Esami propedeutici: Fisiologia Generale Animale, Fisiologia Vegetale
Modulo di Immunocitochimica (2 CFU) Lab. 11: Piero Morandini, Alex Costa
Obiettivo dell’esercitazione è rivelare l’attività dell’enzima β‐glucuronidasi (GUS) e la presenza della Green Fluorescent Protein (GFP) nei tessuti di germinelli transgenici di Arabidopsis thaliana. I germinelli verranno cresciuti in piastra in condizioni sterili. L’enzima β‐glucuronidasi verrà rivelato per aggiunta di un substrato che forma un precipitato blu quando idrolizzato, mentre la GFP verrà rivelata mediante un microscopio a fluorescenza.
Verranno analizzate diverse linee di Arabidopsis thaliana in cui il gene GUS o GFP è stato posto sotto controllo di diversi promotori (e quindi con una diversa distribuzione dell’enzima/proteina fluorescente) e anche popolazioni segreganti per il transgene.
Verranno discusse le variabili che influenzano la colorazione e come interpretare i risultati
Modulo di Enzimologia (2 CFU) Lab 15: Claudio Olivari e M.I. De Michelis
Dosaggio dell’attività β‐Glicuronidasi in piante transgeniche di Arabidopsis thaliana. L’obiettivo dell’esperienza è il dosaggio dell’attività dell’enzima β‐glucuronidasi (GUS) in tessuti fogliari di piante transgeniche e la determinazione dei suoi parametri cinetici (Km e Vmax). A questo scopo si utilizzano piante di Arabidopsis thaliana transgeniche per inserzione del gene GUS sotto controllo del promotore 35S. Mediante tecniche spettrofotometriche e fluorimetriche, utilizzando un estratto enzimatico grezzo, saranno determinate la concentrazione di proteine totali, la velocità di catalisi e la sua dipendenza dalla concentrazione dell’enzima e del substrato fornito. L’attività enzimatica della GUS sarà inoltre misurata sia in funzione del pH della miscela di dosaggio, sia in presenza di inibitori specifici nella miscela stessa. Elaborazioni matematiche dei dati ottenuti consentiranno di verificare la coerenza o meno con meccanismi di catalisi noti.
Modulo di Fisiologia dell’eccitabilità (2 CFU) Lab. 12: Anna Moroni, Alex Costa Il lavoro di laboratorio sarà articolato nei seguenti punti:
1. tecnica del voltage‐clamp a due elettrodi: teoria, messa a punto e utilizzo dell’apparato sperimentale e preparazione dei protocolli sperimentali per programmi specifici con modelli di membrana cellulare, preparazione e messa a punto di microelettrodi;
2. registrazione, modulazione e rappresentazione grafica di una corrente endogena di potassio in oocita di Xenopus laevis con la tecnica del voltage‐clamp a due elettrodi;
3. misura e analisi delle correnti del canale di potassio KAT1 espresso in oociti di Xenopus laevis;
4. interpretazione e discussione dei dati.
Percorso 7 Biologia animale: struttura e funzioni di modelli animali.
Docenti: Sugni Michela (Responsabile), Pasini Maria Enrica Laboratori didattici: 108, 11, 14 16 studenti Periodo: dal 31 marzo al 15 maggio
Esame propedeutico: Biologia e Sistematica Animale (obbligatorio)
Il tirocinio propone un percorso multidisciplinare basato su diverse tecniche analitiche e incentrato su diversi aspetti della biologia funzionale degli echinodermi:
Norme di sicurezza specifiche per le metodiche impiegate.
Gli echinodermi.
Il comune riccio di mare Paracentrotus lividus: dissezione di esemplari e fissazione di campioni biologici per le analisi successive.
La rigenerazione: introduzione teorica e esperienze pratiche con stelle di mare e ofiure.
Biologia riproduttiva e fecondazione nel riccio di mare.
Colture cellulari da gonadi di riccio di mare.
I tessuti mutabili degli echinodermi
Tecniche istologiche: fissazione, inclusione e microtomia di campioni inclusi in paraffina.
Tecniche immunocitochimiche: teoria, preparazione e osservazione dei campioni (microscopio a fluorescenza).
La microscopia elettronica: teoria e osservazione dell’impiego da parte di operatori qualificati di microscopi elettronici a trasmissione e scansione.
L’acquario marino: lezione teorica e visita presso l’Acquario Civico di Milano
Questo percorso è particolarmente consigliato per gli studenti che hanno inserito nel loro piano di studi "Metodologie di citochimica”
Percorso 8 Tossicologia dello sviluppo: approcci sperimentali su modelli animali diversi.
Docenti: Menegola Elena (responsabil), Del Giacco Luca Laboratori didattici: 14 e 13 16 studenti Periodo: dal 3 marzo al 4 aprile Esame propedeutico: Biologia dello sviluppo Durante questo modulo verranno proposte attività sperimentali nell’ambito della tossicologia dello
sviluppo. Ci si avvarrà di modelli sperimentali alternativi (l’Anfibio Xenopus laevis e il Pesce Danio rerio) per
valutare gli effetti tossici di inquinanti ambientali sullo sviluppo e per indagare i meccanismi
dismorfogenetici da essi evocati. Embrioni di X. Laevis e D. rerio verranno selezionati dallo studente e
mantenuti in adeguati mezzi di crescita in presenza o meno delle sostanze da testare. Lo sviluppo
embrionale, normale ed alterato, verrà seguito fino allo stadio di larva. Su embrioni a diversi stadi di
sviluppo si applicheranno tecniche per lo studio della espressione e distribuzione di proteine e mRNA
specifici: western blot ed immunocolorazione, RT‐PCR e ibridazione in situ. Si applicheranno metodi di
indagine per lo studio dettagliato della morfologia macroscopica e microscopica.
I risultati ottenuti nei due modelli sperimentali verranno analizzati, comparati e discussi.
Questo percorso è particolarmente consigliato per gli studenti che hanno inserito nel loro piano di studi "Metodologie di embriologia sperimentale" e che sono particolarmente interessati a temi di Biologia dello Sviluppo animale.
Percorso 9 La trasformazione cellulare e la crescita tumorale. Docenti: Minucci Saverio (responsabile), Foiani Marco, Dejana Elisabetta 12 Studenti Tirocinio svolto presso le postazioni del laboratorio didattico IFOM, presso il Campus IFOM‐IEO Periodo: aprile ‐maggio Esame propedeutico: Biologia Molecolare e bioinformatica (obbligatorio) Obiettivi generali
Gli studenti svolgeranno attività sperimentale "diretta" presso spazi di laboratorio appositamente allestiti. Tale attività sarà basata sull'introduzione a definiti problemi sperimentali, alla loro contestualizzazione nell'ambito di un progetto specifico, con l'obiettivo principale di avvicinare gli studenti al "pensiero sperimentale", alla corretta impostazione manuale/teorica dell'ideazione sperimentale, ed ad una good laboratory practice.
L'attività sperimentale sarà disegnata in modo di affrontare problemi "di base" mediante l’utilizzo di metodiche di base nell’ambito della biologia molecolare. A questa parte pratica verrà affiancata una parte teorica, che consisterà nella tenuta di un quaderno di laboratorio, e nella preparazione di un journal club selezionando un lavoro attinente alla tematica sperimentale affrontata.
Il percorso sperimentale avverrà nell'ambito delle specifiche competenze dei gruppi di ricerca coinvolti, qui brevemente riassunte.
Alterazioni della cromatina nei tumori: Saverio Minucci
Le nostre attività di ricerca hanno come obiettivo lo studio della perdita di regolazione della struttura e funzione della cromatina nei tumori. In particolare, ci stiamo concentrando sulla funzione delle istone deacetilasi in cellule sane e cancerose nella speranza di sfruttare la conoscenza dettagliata del loro meccanismo di azione per migliorare l' impiego di inibitori delle istone deacetilasi nella terapia antitumorale. Il modello da noi scelto e' quello della Leucemia Promielocitica Acuta, per la quale esiste una dettagliata caratterizzazione delle alterazioni epigenetiche che ne causano lo sviluppo.
Stabilità del genoma e riparo del danno al DNA: Marco Foiani
Il controllo dell'integrità' dei cromosomi e' un processo di fondamentale importanza per la vita della cellula la cui compromissione porta all'accumulo di mutazioni e riarrangiamenti genomici, morte cellulare e cancro. Il nostro laboratorio studia i meccanismi che mediano il controllo della stabilità del genoma nelle cellule eucariotiche su tre linee di ricerca principali: i) il controllo della stabilità dei cromosomi durante la fase di replicazione del DNA; ii) la risposta cellulare al danno al DNA; iii) studio farmacogenomico di composti antitumorali.
Angiogenesi tumorale: Elisabetta Dejana
La formazione di vasi nel tumore è essenziale per la sua crescita. Noi studiamo l’angiogenesi tumorale, ed in particolare: i) meccanismi alla base della proliferazione vascolare nelle malattie mieloproliferative; ii) meccanismi di regolazione della stabilità dei vasi tumorali; iii) regolazione trascrizionale dello sviluppo del sistema vascolare nell'embrione.
Percorso 10 Immunologia dei tumori Docente: La Porta Caterina (Responsabile) Laboratori didattici: 14 e 11 20 studenti Periodo: dal 7 gennaio al 7 febbraio Esami propedeutici: Genetica (obbligatorio), Immunologia
Il tirocinio ha l’obiettivo di avvicinare gli studenti alle più moderne tecniche utilizzate per lo studio dei tumori affrontando allo stesso tempo aspetti innovativi emersi nell’ambito della ricerca sui tumori come le cellule staminali tumorali e il ruolo del sistema immunitario.
Il corso sarà quindi suddiviso in due parti: in una prima parte si affronteranno le strategie che usano i tumori per evadere il sistema immunitario e si utilizzeranno tecniche di immunofluorescenza per la visualizzazione di infiltrati linfocitari o cellule tumorali mediante marcatori specifici. Mediante tecniche di biologia molecolare verranno poi studiati specifici fattori che sembrano svolgere un ruolo chiave nella progressione del tumore come molecole di adesione, integrine etc. Pertanto su cellule trasfettate con plasmidi GFP opportuni, si valuterà la loro capacità di migrazione utilizzando la camera di Boyden. Nella seconda parte si discuterà dell’eterogeneità dei tumori e di come possono essere identificate e isolate sottopopolazioni tumorali con caratteristiche di aggressività diversa con le ovvie problematiche legate alla scelta terapeutica più opportuna e sulla mancata risposta da parte del sistema immunitario. Sottopopolazioni tumorali verranno portate al citofluorimetro a flusso e si analizzeranno le loro potenzialità di crescita e l’espressione di specifici marcatori mediante RT‐PC. La parte di citometria a flusso verrà svolta presso l’Istituto Neurologico Carlo Besta.
Percorso 11 Genetica molecolare e biologia dello sviluppo applicate alle piante
Docenti: Kater Martin (Responsabile), Pesaresi Paolo, Masiero Simona Laboratori didattici: 13 e 14 16 studenti Periodo: dal 10 marzo al 11 aprile Esami propedeutici: Biologia molecolare e bioinformatica (obbligatorio), biologia dello sviluppo Arabidopis thaliana è il sistema modello più utilizzato nei laboratori di biologia vegetale per studiare le basi molecolari dello sviluppo, della fisiologia e della riproduzione delle piante. In questo tirocinio gli studenti impareranno a lavorare con questo organismo e acquisiranno le principali metodiche per lo studio della funzione di geni coinvolti nello sviluppo.
1. Individuazione di alleli mutati per inserzione di T‐DNA in popolazioni segreganti e analisi dell’espressione genica
In questa fase gli studenti acquisiranno esperienza: Con l’estrazione di acidi nucleici, DNA e RNA Con la generazione di oligonucleotidi specifici per l’amplificazione di alleli selvatici e mutati e con la tecnica della PCR Con l’esecuzione di RT‐PCR e qRT‐PCR e frazionamento degli amplificati su gel di agarosio 2. Analisi morfologiche delle piante selvatiche e mutate per identificare la presenza di malformazioni Le piante mutate dapprima saranno osservate con l’ausilio di stero‐microscopi per una prima descrizione. In seguito gli studenti acquisiranno familiarità con alcune tecniche di microscopia ottica utili per condurre dettagliate analisi dei fenotipi. Gli studenti utilizzeranno la tecnica del Contrasto d’Interferenza Differenziale (DIC) in luce trasmessa, inoltre saranno introdotti all’impiego dei più comuni fissativi utilizzati per le osservazioni microscopiche in campo chiaro e a fluorescenza. Eseguiranno anche delle colorazioni istologiche per meglio evidenziare i difetti delle piante mutate. Il profilo d’espressione spazio‐temporale di un gene d’interesse verrà inoltre analizzato mediante saggio GUS
