Capitolul 1

SCURT ISTORIC ŞI CONŢINUTUL GENETICII MEDICALE

1.1. Genetica. Concepte generale

Genetica medicală reprezintă domeniul medicinii ce se ocupă cu descifrarea şi cunoaşterea naturii ereditare a bolilor umane. Aceasta studiază structurile, legile şi mecanismele de bază ale transmiterii eredităţii de la o generaţie la alta, atât pentru caracterele normale cât și pentru cele patologice.

Genetica umană este genetica generală aplicată la om ce se ocupă cu studiul eredităţii şi variabilităţii. Bateson în 1906 a introdus termenul de ―genetică‖ ce provine de la grecescul ―gennao‖ ce înseamnă a da naştere, a genera. Gregor Mendel în 1865 formulează principiile de bază ale eredităţii. Acestea reprezintă legile eredităţii care demonstrează

comportamentul factorilor ereditari în condiţionarea şi transmiterea caracterelor ereditare. Cuvântul ereditate este de origine latină şi înseamnă a moşteni. Spencer în 1863 definește ereditatea ca fiind ca procesul ce

realizează legătura organică dintre generaţii, determină asemănarea dintre ascendenți şi descendenţi, dar concomitent datorită aspectului de variabilitate a ereditaţii apar diferenţe între părinţi şi copii, astfel că nu se transmit caractere ca atare din generaţie în generaţie ci capacitatea de a se dezvolta aceste caractere. Caracterele morfologice şi funcţionale ale fiecărui organism constituie fenotipul, el fiind unic pentru fiecare individ şi constituindu-se pe baza genotipului, a eredităţii moştenite de la parinţi;din îmbinarea celor două genomuri parentale se constituie un nou organism, dar niciodată identic cu cel al părinţilor.

Fenotipul sumează totalitatea caracteristicilor (morfologice, anatomice, fiziologice, psihice şi comportamentale) determinate de ansamblul genelor (genotipul) organismului şi factorii externi nongenetici (factori de mediu).

În constituirea tuturor caracterelor fenotipice intervine alături de ereditate şi mediul cu o cotă variabilă. Există unele caractere pur ereditare, ca de exemplu grupele sanguine eritrocitare, proteinele plasmatice etc. Alte caractere sunt parţial ereditare inteligenţă, comportamentul psihic etc.

Foarte puţine caractere se consideră a fi determinate numai de factorii de mediu. Practic, în orice caracter există o cotă ereditară mai mare sau mai mică. În cazul caracterelor parţial ereditare se vorbeşte de moştenirea unei predispoziţii genetice.

Genetica umană este o disciplină fundamentală ce se ocupă cu cercetarea mecanismelor şi a legilor de bază ale eredităţii, a interacţiunii dintre substratul materialului ereditar şi mediu.

Genetica umană ca disciplină fundamentală studiază substratul material al eredităţii, interacţiunea acestuia cu factorii de mediu, mecanismele şi legile care guvernează transmiterea eredităţii mai exact a mesajului ereditar.

Chiar dacă noţiunea de transmitere a informaţiei ereditare între generaţii datează din secolul XVII, punerea în evidenţă a ADN-ului ca suport al eredităţii datează doar din 1943 iar structura acestuia nu avea să fie elucidată decât în 1953. Această perioadă marchează istoric începuturile geneticii moleculare, dar adevăratul demaraj al ei se situează în anii 1970.

Din punct de vedere clinic factorii genetici pot fi factori etiologici declanşatori sau favorizanţi pentru patologia umană fiind descrise peste zece mii de afecţiuni condiţionate genetic: sunt deja etichetate peste 6000 de boli genice şi la peste 2500 dintre acestea se ştie cu exactitate gena patologică.

În ultimii ani, genetica este tot mai mult implicată în descifrarea patogeniei unor boli multifactoriale, cu impact crescut în populaţie, încercând să descopere noi căi de abordare a acestor patologii, cu şanse mai mari în prevenire şi chiar în vindecare.

Sunt cunoscute implicaţiile factorilor genetici în tulburările de reproducere umană determinând sterilitate (aproximativ 10% din cupluri), avorturi spontane (50% avorturi de prim trimestru), naşteri de feţi morţi şi naşteri de copii cu anomalii congenitale (3%).

Managementul pacienţilor cu boli genetice dar şi al familiilor, sfatul genetic, diagnosticul prenatal, screeningul neonatal susţin caracterul clinic distinct al geneticii medicale.

Din punct de vedere medico-social, afecţiunile genetice sunt o problemă de sănătate publică influenţând indicatori ca natalitatea, morbiditatea, mortalitatea şi prin transmiterea în generaţii nu sunt o problemă doar a pacientului ci a familiei şi a populaţiei din care face parte.

Tot mai multe guverne, foruri medicale internaţionale, aplică programe de cercetare care vizează cercetarea informaţiei genetice şi încearcă să răspundă acestor deziderate. Din acest motiv, este astăzi unanim recunoscut faptul că a început era genomicii iar abordarea stării de sănătate şi de boală este diferită de a anilor trecuţi.

Descoperirile genetice vizează multiple aspecte terapeutice, profilactice, economice, ridicând şi importante probleme sociale şi etice: diagnosticul genetic preimplantatoriu, presimptomatic, farmacogenomica, terapia genică, clonarea, producerea de medicamente sau dezvoltarea de produse de interes agronomic prin utilizarea de organisme genetic modificate (OGM).

Cercetările ultimilor ani, dar mai ales îmbunătăţirea tehnicilor de citogenetică au permis identificarea anomaliilor cromozomiale subcromozomice şi relaţia lor cu diferite tablouri clinice.

Descoperirile geneticii moleculare vor permite o dezvoltare considerabilă a cunoaşterii genelor, a structurii, funcţiilor şi reglării lor. Tehnicile ating foarte repede un nivel crescut de performanţă, permiţând studierea genomului uman.

1.2. Determinismul patologiei umane

Fenotipul normal şi patologic este rezultanta interacţiunii factorilor genetici cu factorii de mediu. Raportat la participarea factorilor genetici patologia umană poate fi clasificată în:

boli genetice; boli parţial genetice; boli epigenetice.

Bolile genetice sunt efectul anomaliilor în cele 2 mari compartimente genetice: genic şi cromozomial generandu-se astfel boli genice şi boli cromozomiale.

Bolile genice sunt efectul mutaţiei unei perechi de gene alele şi sunt denumite boli monogenice. După puterea de exprimare a genei în fenotip genele au fost caracteri-zate ca dominante (D) şi recesive (r) plasate pe cromozomi autozomi şi pe gonozomi.

Bolile monogenice pot fi cu transmitere: dominant autozomala(DA): hiper-colesterolemia,neurofibromatoza; recesiv autozomală (ra): mucoviscidoza, fenil-cetonuria; recesiv-X-linkate (r-X-linkate): hemofilia; dominant-X-linkate (D-X-linkate): rahitism vitamino-D-rezistent.

Bolile monogenice sunt familiale şi se transmit din generaţie în generaţie. Patologia monogenică este conformă pattern-ului mendelian. Bolile cromozomiale în funcţie de dezechilibrul cromozomial sunt: numerice (cantitative) şi structurale (morfologice).

Dezechilibrul cromozomial poate afecta un cromozom în totalitatea sa (exces sau pierdere), mai mulţi cromozomi sau anumite segmente (părţi) de cromozomi, efectul fenotipic variind după caz.

Dezechilibrul afectează atât cromozomii autozomi cât şi pe cei gonozomi. Astfel bolile cromozomiale pot fi : numerice autozomale (Sindromul Down - trisomia 21-autozom suplimentar etc.) numerice gonozomale ( Sindromul Turner – monosomia X –lipsa unui gonozom la fetiţă, sindromul Klinefelter- cromozom X

suplimentar la băieţi etc.) structurale autozomale (Sindromul Lejeune 5p-, pierderea unui fragment al cromozomului 5 etc.). structurale gonozomale ( izocromozomul de braţ scurt sau lung al cromozo-mului X etc.)

Anomaliile cromozomiale sunt răspunzătoare de jumătate din avorturile din primul trimestru de sarcină, au o frecvenţă de 7/1000 de nou născuţii vii şi pot fi prezente în toate celulele organismului (omogen), sau în stare de mosaicism (două sau mai multe linii celulare diferite ca şi conţinut de cromozomi). Studiul lor face obiectul citogeneticii medicale.

Bolile parţial genetice sau comune sunt determinate de acţiunea variabilă dintre ereditate şi mediu. Factorii ereditari sunt reprezentaţi de mai multe gene plasate pe cromozomi diferiţi şi expresia acestor gene este declanşată de

factori de mediu. De aceea aceste boli se numesc multifactoriale. Important este că aceste boli multifactoriale au caracter familial dar nu se transmit conform legilor mendeliene. Cel mai adesea apare termenul de predispozţtie genetică care reprezintă modalitatea de participare a factorilor genetici în determinismul bolii (poligenice, multifactoriale).

Predispoziţia genetică conferă vulnerabilitate individuală la boală, dar boala apare numai la intervenţia anumitor factori de mediu

nocivi care transformă predispoziţia. Astfel, anumite configuraţii genetice cu structură normală conferă vulnerabilitate pentru unele boli, dar numai în prezenţa factorilor de mediu nocivi.

Exemple:

configuraţia genetică pentru grup sangvin O (OO) susceptibilitate pentru ulcer gastro-duodenal sau,

anumite configuraţii genice HLA (termen generic de haplotip) vulnerabilitate pentru unele boli: DZID juvenil – combinaţiile B8/B15.

Genele ce determină boala (boli determinate de gene candidate cunoscute, cu mutaţie, cum sunt HTA, schizofrenia,etc.) sau predispoziţia la boală (gene de risc cu efect minor dar acţiune aditivă, implicate în determinismul malformaţiilor congenitale ce cuprind o singură structură, cum sunt fisura labială, persistenţa canalului arterial etc.) se transmit în familie, de aici apare exprimarea că nu există boli ci familii de bolnavi.

Bolile multifactoriale cuprind deci două mari grupe: malformaţii congenitale izolate (despicatura labială şi/sau palatină, malformaţii cardiace etc.) şi boli comune ale adultului (diabetul zaharat, hipertensiunea arterială etc.).

Bolile epigenetice – Agenţii fizici, chimici şi biologici sunt incriminaţi în patologia traumatismelor, intoxicaţiilor, bolilor de iradiere. Aceste boli nu sunt aparent determinate de factori genetici, adevăr valabil pentru anumite afecţiuni ca arsurile, traumatismele etc.

Influenţele genetice sunt evidente însă în cazul susceptibilităţii la infecţii; marile epidemii au demonstrat că nu toţi expuşii la microorganisme patogene se îmbolnăvesc, dar severitatea bolii variază interindividual. Sensibilitatea la infecţii este condiţionată de constituţia genetică a individului, în special de structura proprie de antigene HLA.

1.3. Date reprezentative în istoria geneticii

1866, Gregor Mendel descrie unităţile ereditare pe care le denumeşte factori ereditari precizând existenţa lor în doză dublă (sau pereche) în celula somatică şi în doză unică în celula sexuală. Pe baza expresiei în fenotip cataloghează factorii ereditari în dominanţi şi recesivi şi urmărind modul lor de transmitere constată segregarea egală şi asortarea independentă formulând legile eredităţii valabile şi în prezent.

1869, Friedrich Miescher devansează existenţa unui substrat molecular în ereditate deoarece identifică în nuclei o substanţă bogată în fosfor pe care o consideră material genetic şi o denumeşte nucleină.

1900, Carl Correns Hugo de Vries şi Erich von Tschermark redescoperă legile eredităţii formulate de Mendel şi demonstrează valabilitatea lor universală ca modalitate de transmitere a caracterelor determinate monogenic.

1902, William Sutton observă existenţa cromozomilor pereche (cromozomi omologi) în celulele somatice şi leagă factorii ereditari de cromozomi.

1902, Garrod face legatura între factorii ereditari şi căile metabolice şi descrie alcaptonuria (prima anomalie genică) ca o anomalie ereditară de metabolism şi astfel apare conceptul erorilor ereditare de metabolism.

1905, Bateson introduce termenul de ―genetică‖ şi împreună cu Punnett formulează conceptul de linkaj genic. 1909, Wilhelm Johannsen redenumeşte factorul ereditar mendelian cu termenul de genă. 1910-1911, Thomas Hunt Morgan şi colaboratorii pe baza experimentelor efectuate pe Drosophila demonstrează că genele

sunt localizate pe cromozomi, existenţa linkajului genic, a fenomenului de crossing-over şi face legatura între genă cromozom şi caracterul din fenotip. Rezultatele sunt sintetizate în ceea ce va deveni teoria cromozomială a eredităţii publicată în 1926.

1926, Herman Muller descoperă efectul mutagen al razelor X prin iradierea experimentală la Drosophila şi stabileşte caracteristicile de acţiune al radiaţiilor ionizante.

1944, Avery McLeold şi McCarty demonstrează că ADN-ul este molecula purtătoare a eredităţii. 1941, George Beadle şi Edward Tatum formulează ipoteza ―o genă=o enzimă‖. 1953, Francis Crick şi James Watson descriu modelul de dublu helix al moleculei de ADN. 1956, Tjio şi Levan, îmbunătăţind tehnicile de evidenţiere a cromozomilor umani, stabilesc numărul normal al acestora în celule

umane. 1958, Meselson şi Stahl demonstrează modalitatea de replicare a ADN-ului de tip replicare semiconservativă. 1966, Marshall Nirenberg şi H. Gobind Khorana descifrează codul genetic stabilind semnificaţia exactă a codonilor. 1970, este obţinută prima enzimă de restricţie de către Hamilton Smith.

1972, Paul Berg şi Herb Boley produc prima moleculă de ADN recombinat. 1973, Berg şi Cohen au realizat prima clonare genică. 1979, Baxter a raportat clonarea genei pentru hormonul de creştere umană. 1986, Mullis Kary pune la punct metodologia PCR (polymerase chain reaction), ca tehnologie de analiză a ADN-ului. 1990, s-a realizat prima terapie genică în afecţiunea ADA şi tot în 1990 a început ―proiectul genomul uman‖. 1996, s-a realizat prima clonare la mamifere de către Ian Wilmut şi colaboratorii la institutul Roslin din Scoţia. 2001, s-a terminat secvenţializarea genomului uman şi din acest moment se instaurează era post-genomică. Din 2004 problematicile geneticii vizează controversele asupra clonării umane şi animale, clonării pe celule stem şi modificările

genetice ale alimentelor.

1.4. Nivele de studiu ale eredităţii

Nivelul molecular cuprinde totalitatea metodelor de studiu al acizilor nucleici, al structurii genelor normale şi patologice, al

funcţionalităţii acestora.

Tehnologiile folosite pentru clonarea de gene, pentru manipularea şi vehicularea lor în anumite genotipuri fac parte din ingineria

genetică, fundamentând în acelaşi timp terapia genică.

Nivelul molecular prin izolarea genelor şi studierea structurii lor pentru detectarea tipurilor de mutaţii în bolile genetice, permite

diagnosticarea acestora la nivel molecular.

Nivelul citogenetic studiază numărul, structura şi morfologia cromozomilor, permiţând stabilirea etiologiei cromozomiale a

diferitelor tablouri dismorfice, a eşecurilor de reproducere, a hipogonadismelor sau disgeneziilor gonadale, a unor forme de retard

mental, stabilirea sexului genetic în intersexualităţi etc.

Stabilirea cariotipului constituţional în bolile cromozomiale se realizează antenatal, din celule fetale obţinute prin puncţie–

biopsie sub control ecografic sau postnatal, din sângele periferic.

Un domeniu separat îl constituie studiul cromozomilor în tumorile maligne. În această situaţie anomaliile cromozomiale, sunt

dobândite, au caracter clonal, multe din ele sunt caracteristice unui tip tumoral şi apar prin modificarea genomului normal celular,

localizat, sub acţiunea factorilor mutageni cancerigeni.

Nivelul fenotipic – studiază caracterele morfologice, funcţionale, psihice, comportamentale, prin consult clinic efectuat de

medicul genetician.

Nivelul statistic-populaţional cuprinde extinderea consultului genetic la membrii familiei, pe mai multe generaţii (anchetă

familială, arbore genealogic), chiar la o comunitate de indivizi, ceea ce permite surprinderea modalităţii de transmitere a

caracterelor normale sau patologice.

În calcularea riscului genetic, mai ales pentru bolile genice, studiile statistice populaţionale permit aprecierea exactă a

frecvenţei genelor patologice în populaţie si a genotipurilor corespunzătoare, etapă indispensabilă pentru aprecierea riscului

genetic al unei boli la descendenţi.

1.5. Proiectul genomul uman

Proiectul genomul uman (PGU) a început în anii 1990. Iniţial a fost planificat pe parcursul a 15 ani, dar datorită resurselor

existente şi a avantajului tehnologic, proiectul a fost accelerat şi în anul 2003 s-a declarat finalizat, întreg genomul uman a fost

descifrat.

PGU a fost coordonat de Departamentul de Energie al Statelor Unite şi de Institutul Naţional de Sănătate.

Obiective generale ale PGU: identificarea celor aproximativ 30000 de gene din ADN-ul uman; determinarea secvenţializarii celor 3 bilioane de perechi de baze azotate care formează ADN-ul uman; stocarea acestor informaţii in baze de date; îmbunătăţirea instrumentelor şi metodelor pentru analiza informaţiilor; transferul tehnologiilor înrudite spre sectorul privat şi implicit dezvoltarea de noi aplicaţii medicale; identificarea implicaţiilor etice, legale şi sociale ce pot decurge din PGU.

Unele tipuri de localizări în genom au fost deja definitivate astfel încât secvenţializarea întregului genom uman a fost anunţată în iunie 2000, iar publicarea analizelor s-a făcut in februarie 2001.

În genomul uman, aproximativ 1/5 din totalul genelor sunt gene care specifică proteinele necesare transportului membranal şi pentru generare de energie; aceste gene sunt cunoscute ca gene housekeeping şi sunt localizate în regiunile ADN-ului bogat în

nucleotide C G. Celelalte 4/5 din genele genomului se află în regiunile ADN mai bogate în A = T şi sunt funcţionale în mod specific fiecărui ţesut. Ocazional, în genomul uman se găsesc: gene suprapuse, gene in interiorul genelor şi unităţi de transcripţie policistronice.

Secvenţializarea ADN-ul uman permite: finalizarea secvenţei complete a genomului uman; clonarea genelor localizate; punerea la dispoziţia publicului a întregii secvenţe de ADN, în mod gratuit.

Avantajele cercetării genomului

Medicina moleculară:

îmbunătăţirea diagnosticului bolilor; detectarea precoce a predispoziţiei genetice la boală; administrarea raţională a medicamentelor; terapia genică şi sistemul de control asupra medicamentelor; farmacogenomica.

Genomul microbian:

detectarea rapidă şi tratamentul microbilor patogeni în medicină; noi surse de energie;

monitorizarea mediului pentru detectarea poluanţilor; dezinfecţie sigură şi eficientă.

Bioarheologie, antropologie, evoluţie şi migraţie umană:

studii evolutive asupra mutaţiilor din linia germinativă; studiul migraţiilor grupurilor populaţionale diferite, pe baza transmiterii genetice pe linie maternă; studiul mutaţiilor cromozomului Y pentru a urmări filiaţia şi migraţia bărbaţilor.

Identificarea ADN:

identificarea persoanelor; stabilirea paternităţii şi a înrudirii cu alte familii; detectarea bacteriilor şi a altor organisme care pot polua; potrivirea organelor donate cu cei care au nevoie de transplant; determinarea pedigree-ului; autentificarea consumabilelor (caviarul, vinul).

Agricultură, zootehnie şi bioprocesare:

recolte rezistente la boli şi insecte; forme de animale mai productive şi mai rezistente la boli; produse mai nutritive; biopesticide; vaccinuri încorporate în produse alimentare; noi produse de curăţire a mediului.

CAPITOLUL 2

BAZELE MOLECULARE ALE EREDITĂŢII

Acizii nucleici sunt macromolecule în care este stocată şi care exprimă întrega informaţie genetică necesară pentru apariţia şi

menţinerea vieţii.

2.1. Scurt istoric Pe baza analizei biochimice a cromozomilor s-a stabilit că aceştia sunt formaţi din ADN şi proteine. Această descoperire a

determinat studii ulterioare pentru a se stabili care din cele două componente este deţinătoarea informaţiei ereditare. Iniţial s-a crezut că proteinele deţin informaţia deoarece au o structură mai complexă decât molecula de ADN, având 20 aminoacizi dispuşi într-o structură ramificată, globulară, iar ADN-ul doar 4 tipuri de nucleotide dispuse într-o structură liniară.

La începutul anilor 1950 a fost însă acceptată ipoteza că molecula de ADN este deţinătoarea informaţiei ereditare. Un experiment convingător a fost efectuat de către Hershey şi Chase. Au folosit un tip de fag (T2), la care ADN-ul a fost marcat cu P radioactiv, iar proteinele cu S radioactiv. Ulterior fagul a infectat o bacterie, urmărindu-se care dintre markerii radioactivi se va regăsi în bacteria infectată. Analizele efectuate au arătat că P radioactiv se găsea în interiorul celulei, în timp ce S radioactiv se găsea în afara ei. S-a dovedit astfel că ADN-ul deţine informaţia prin care apare infectarea celulei.

În acelaşi an, Erwin Chargaff a descoperit că indiferent de celula studiată, procentajul nucleotidelor cu citozină era egal cu procentajul nucleotidelor cu guanină, iar procentajul nucleotidelor cu adenină era egal cu cel al nucleotidelor cu timină.

Pe baza datelor preliminare, fiind deja un fapt cunoscut că ADN-ul este format din nucleotide şi că fiecare nucleotid este format dintr-un glucid, o grupare fosfat şi una din următoarele baze azotate: adenină, timină, citozină sau guanină, precum şi că numărul bazelor purinice este egal cu numărul bazelor pirimidinice, Watson şi Crick au utilizat cristalografia cu raze X în încercarea de a descifra structura moleculei de ADN. În anul 1953 ei au stabilit configuraţia moleculei de ADN, care prezintă o structură helicoidală, fiind recompensaţi cu premiul Nobel pentru această descoperire, în anul 1962.

2.2 Structura şi organizarea ADN-ului Molecula de ADN deţine codificată informaţia ereditară, care determină sinteza tuturor proteinelor din organism. Din punct de

vedere biochimic, ADN-ul este un polimer. Lungimea şi greutatea sa moleculară sunt uriaşe, permiţând stocarea unei impresionante

informaţii ereditare. Cantitatea de ADN variază de la o specie la alta, dar este constantă în celulele aceleiaşi specii.

+Cea mai mare cantitate de ADN (aprox. 98 %) se găseşte în nucleu, respectiv în cromozomi. Un procent de aproximativ 2% îl reprezintă ADN-ul mitocondrial din citoplasmă.

Fiecare moleculă de ADN este liniară, neramificată şi foarte lungă. Unităţile structurale ale moleculei de ADN sunt reprezentate de nucleotide. Fiecare nucleotid este alcătuit dintr-un glucid (dezoxiriboza), o bază azotată ataşată de glucid şi o grupare fosfat. În molecula de ADN se găsesc 4 tipuri de nucleotide, care diferă numai prin baza azotată. Cele 4 baze azotate sunt:

Baze purinice: adenina (A) şi guanina (G). Baze pirimidinice: citozina (C) şi timina (T).

Dezoxiriboza Dezoxiriboza este o pentoză la care grupările hidroxil de la atomii de carbon 5'- şi 3'- se vor lega de grupările fosfat, prin

legături fosfodiesterice, formând scheletul fosfoglucidic al moleculei de ADN. Nucleozidele Nucleozidul este format dintr-o bază azotată şi glucid. Nucleotidele Nucleotidul este format din nucleozid şi gruparea fosfat. Secvenţializarea nucleotidelor într-o catenă de ADN reprezintă structura primară a moleculei, şi în acelaşi timp informaţia

ereditară codificată. Molecula de ADN este bicatenară, fiind alcătuită din 2 catene polinucleotidice legate între ele prin legături de hidrogen, care se

formează în mod specific şi anume: între adenină şi timină sunt 2 legături de hidrogen (A=T), iar între citozină şi guanină sunt 3 legături de hidrogen (C≡G). Astfel, secvenţializarea bazelor azotate într-o catenă va determina secvenţializarea bazelor din cealaltă catenă. Această proprietate este denumită complementaritate şi reprezintă baza transferului informaţiei ereditare.

Cele 2 catene sunt antiparalele. Ele au orientare în sens diferit a legăturilor fosfodiesterice, o catenă având sensul 5' - 3', iar cealaltă 3' - 5'. Astfel, în timpul transcripţiei va fi copiată numai una dintre catene.

Cele 2 catene anti-paralele sunt înfăşurate una în jurul celeilalte şi în jurul unui ax central în forma unui dublu helix, care în forma cea mai frecventă a ADN-ului este rotit spre dreapta. Astfel, scheletul fosfoglucidic se va afla la exterior, iar bazele azotate spre interior, fiind protejate de acţiunea factorilor de mediu.

Configuraţia spaţială bicatenară, helicoidală a celor două catene polinucleotidice reprezintă structura secundară a moleculei de ADN (fig. 2 şi 3).

Structura dublului helix este menţinută stabilă prin legăturile de hidrogen dintre bazele azotate. În stabilitatea moleculei deţin un rol important şi aşezarea spre interior a bazelor hidrofobe, respectiv la exterior a axului fosfo-glucidic hidrofil, forţele Van der Waals şi interacţiunile hidrofobe. Legăturile dintre glucid şi baza azotată nu sunt opuse direct în cele 2 catene, ceea ce determină formarea a 2 şanţuri laterale cu mărimi diferite între lanţurile fosfoglucidice, la suprafaţa moleculei. În aceste şanţuri, bazele azotate sunt expuse

altor molecule sau unor solvenţi. Astfel, anumite substanţe pot interacţiona cu anumite baze, fără a altera structura dublu-catenară, helicoidală.

Molecula de ADN este foarte stabilă, mici fragmente mai pot rămâne intacte în fosile, chiar după mii de ani. Molecula de ADN prezintă şi o structură terţiară reprezentată de organizarea tridimensională realizată de dublul helix în

absenţa legării de proteine. Structura quaternară este reprezentată de plicaturarea helixului legat de proteine. Forme helicoidale de ADN ADN forma B prezintă structura dublu helicoidală descrisă anterior. Totuşi, în anumite condiţii de salinitate, pH şi temperatură

pot fi stabile şi alte forme de helix. Astfel, au fost descoperite forme triplu-helicoidale (triplex ADN, forma H). Anumite fragmente implicate in mecanismele de reglaj par a avea secvenţe ADN care iau o formă diferită de cea standard.

2.3 Polimorfismul moleculei de ADN Molecula de ADN este o moleculă dinamică. Sunt descrise 3 forme ale moleculei de ADN, care apar în mod natural. Acestea

sunt formele ADN: A, B şi Z (fig. 4). Ele sunt determinate de conformaţia glucidului şi de orientarea bazelor azotate faţă de glucid. Fiecare conformaţie prezintă parametrii specifici: diametrul helixului, numărul de baze azotate per pasul spiralei şi distanţa

dintre planurile bazelor azotate. 2.3.1 Forma B Forma B este cea mai frecventă formă, (forma standard, a cărei structură secundară a fost descrisă anterior), fiind prevalentă

în condiţii fiziologice (grad crescut de hidratare şi putere ionică redusă). În această formă, ADN-ul prezintă 10 perechi de nucleotide per pas spirală. Planul bazelor azotate este perpendicular pe axul helixului, iar la suprafaţa helixului se evidenţiază 2 incizuri laterale: majoră şi minoră.

Caracteristicile formei B: Diametrul helixului este de 20 angstromi

Helixul este mai subţire şi mai elongat

Distanţa intranucleotidică este de 3,4 angstromi

Numărul de baze azotate /o rotaţie completă a helixului este de 10,5

Înclinaţia bazelor azotate este de 6 grade

Interacţiunile dintre ADN şi proteine apar iniţial în incizura majoră

Anumite secvenţe nucleotidice sunt recunoscute de către nişte proteine de recunoaştere specifice.

Structura moleculei de ADN este dinamică

Dublul helix poate fi denaturat sau renaturat, acestea facilitând diferite tehnici de analiză moleculară ca de ex. Southern blotting, PCR, secvenţializarea ADN-ului, clonarea, etc.

2.3.2 Forma Z

Forma Z este întâlnită în regiunile în care ADN-ul este bogat în G-C. ADN-Z este mai lung, iar helixul este rotit spre stânga.

Bazele azotate se găsesc spre exterior, fiind mai expuse la factorii de mediu. Prezintă 12 perechi de baze/pas spirală şi o singură incizură. Aspectul de zigzag rezultă îndeosebi din alternarea bazelor purinice cu cele pirimidinice.

Caracteristicile formei Z: Dublul helix este rotit spre stânga Poate fi format în vivo, dar funcţia sa este încă necunoscută Helixul este mai subţire şi mai elongat decât în formele A sau B. Prezintă o incizură minoră îngustă Conformaţia necesită o alternare de secvenţe purinice şi pirimidinice şi este favorizată de concentraţii saline crescute,

precum şi de unele substituţii ale bazelor azotate. Bazele azotate sunt aproape perpendiculare pe axul helixului Scheletul fosfo-glucidic are formă de zig-zag 2.3.4 Forma A Forma A se găseşte uneori în unele regiuni ale moleculei de ADN în condiţii de hidratare scăzută sau în prezenţa unei

concentraţii crescute de cationi. Această formă prezintă 11 nucleotide/pas spirală şi două incizuri. Caracteristicile formei A: Această formă apare îndeosebi în duplexurile ARN-ADN Helixul este mai scurt şi mai lat Prezintă o incizură majoră adâncă, îngustă, care nu este uşor accesibilă pentru proteine, spre deosebire de forma B Incizura minoră este lată, accesibilă proteinelor, dar conţinutul informaţional este mai redus decât în incizura majoră. Bazele azotate înclinate pe axul helixului

Formele C şi D reprezintă subclase mai puţin obişnuite ale formei B. Forma C se observă uneori în condiţii de hidratare foarte

scăzută, iar forma D se observă doar în ADN artificial. În organismul uman cea mai mare parte din ADN este reprezentată de ADN forma B sau A şi doar anumite regiuni ale

moleculei pot forma ADN-Z. Aceste forme sunt reversibile, astfel forma B poate trece reversibil în forma A (îndeosebi în cursul transcripţiei, hibridul ADN-ARN fiind mai stabil în această formă), sau în forma Z.

Modificările formei moleculei de ADN pot fi implicate în unele procese reglatorii în timpul replicării şi a transcripţiei. De asemenea, ele pot afecta legarea moleculei de ADN de anumite proteine.

2.4 Organizarea ADN-ului nuclear Studiile moleculare privind structura genomului uman au relevat faptul că în general o genă este formată din aproximativ

10.000-20.000 perechi de baze azotate (au fost identificate însă şi gene mai lungi, formate din sute de mii de perechi de baze). Având în vedere faptul că ADN genomic este format din aproximativ 3 miliarde baze azotate, acesta ar putea forma sute de mii de gene. În genomul uman există însă numai aprox. 30.000 gene care codifică proteine. Rezultă că mai puţin de 50% din cantitatea totală de ADN codifică proteine, restul se va replica, dar nu va fi transcris. Aceasta ar părea o activitate ineficientă, comparativ cu genomul bacterian, care conţine numai secvenţe codante. ADN-ul non-codant se găseşte în secvenţele reglatoare, dar cea mai mare parte din acest tip de ADN este reprezentată de ADN-ul de legătură care separă genele funcţionale.

2.4.1. Tipuri de organizare a secvenţelor nucleotidice din ADN-ul nuclear ADN codant ADN noncodant ADN repetitiv ADN unic

2.4.1.1. ADN codant

- reprezintă aproximativ 10% din genom - codifică proteinele structurale şi funcţionale care stau la baza caracterelor din fenotip

2.4.1.2. ADN noncodant

- reprezintă aproximativ 90% din genom - nu specifică un produs finit - este conţinut în:

pseudogene

fragmente de gene

introni

secvenţe reglatoare ale transcripţiei (―leader‖ şi ―trailer‖). 2.4.1.3 ADN repetitiv

O secvenţă nucleotidică de o anumită lungime se poate repeta de mai multe ori în molecula de ADN a unei celule. Aproximativ 50% din ADN-ul non-codant constă din secvenţe de ADN repetitiv reprezentat de secvenţe nucleotidice care se repetă de mai mult de 20 ori per genom. Elementele repetitive diferă ca poziţie în genom, secvenţă nucleotidică, mărime, număr de copii şi prezenţa sau absenţa regiunilor codante în cadrul lor. Aceste elemente repetitive pot fi:

dispersate în genom sau

dispuse în tandem. În funcţie de numărul de repetări ale unei secvenţe, în genomul uman aceste secvenţe se subclasifică în:

ADN înalt repetitiv: este reprezentat de secvenţe de ADN foarte scurte repetate în tandem, care se găsesc în număr de milioane de copii per genom. Formează aproximativ 10% din genom. Rolul acestui tip de ADN nu este pe deplin cunoscut. ADN-ul uman necodant înalt repetitiv este organizat adeseori sub forma unor repetări în tandem a unor secvenţe mai scurte (1-10 nucleotide) sau mai lungi (zeci, sute de nucleotide). Repetările în tandem reprezintă repetări adiacente ale unei secvenţe constituite din 2 sau mai multe nucleotide. Ex. ATTCGATTCGATTCG = (ATTCG)3. În funcţie de mărimea acestor repetări, se pot distinge: ADN satelit, ADN minisatelit şi ADN microsatelit. ADN satelit este inactiv transcripţional, la fel şi majoritatea ADN-ului minisatelit, dar ADN microsatelit se găseşte şi în regiunile codante.

ADN satelit format dintr-un număr mare de repetări în tandem, reprezintă 5-10% din genom. În genom se pot găsi tipuri diferite de ADN satelit, în regiunile heterocromatice, îndeosebi pericentromeric (având probabil rol în ataşarea cromatidelor de fusul de diviziune) şi la nivelul telomerelor (cu rol în replicarea ADN-ului la acest nivel). ADN α-satelit reprezintă un subtip de ADN satelit, constând din repetări ale unei unităţi formate din 171 perechi de baze şi reprezintă ADN de legătură a heterocromatinei centromerice.

ADN minisatelit sau secvenţele hipervariabile (VNTRs) cuprind repetări ale unui număr de 14-100 perechi de baze. Aceste secvenţe sunt foarte polimorfe şi sunt localizate la nivelul telomerelor sau aproape de acestea. Rolul lor nu este cunoscut, deşi s-a remarcat faptul că reprezintă locurile în care au loc cu predilecţie recombinări omoloage în celulele umane. Studiul lor este utilizat în analizele de lincaj genic. O altă familie importantă de ADN minisatelit e reprezentată de ADN telomeric, format din repetări în tandem a 6 nucleotide, adăugate de o enzimă specializată, telomeraza. Aceste repetări sunt direct responsabile de funcţia telomerelor deoarece protejează capetele cromozomilor şi furnizează un mecanism pentru replicarea acestora. De asemenea au rol în reglarea expresiei genice, intervenind în controlul nivelului transcripţiei, procesul de splicing alternativ al transcriptului primar sau în controlul mecanismului de imprinting.

ADN microsatelit: (STRs-short tandem repeats) este compus din unităţi reprezentate de 1-6 nucleotide, repetate de aproximativ 100 000 ori/genom haploid. Instabilitatea STRs este implicata ca factor de progresie în anumite cancere (ex. cancer colorectal).Numărul repetărilor într-un anumit locus este foarte variabil între indivizii aceleiaşi specii. În prezent cromozomul Y este bine caracterizat pentru STRs, (Y-STR reprezintă STR pe cromozomul Y).

1/3 din aceste repetări sunt reprezentate de repetarea aceluiaşi nucleotid (cu adenină). Un procent important e reprezentat de repetările a 2 nucleotide (ex. CACACA…). Intr-o proportie mai mică, dar cu importanţă clinică deosebită, datorită implicării directe în determinismul unor

afecţiuni, sunt repetările de 3 nucleotide. Exemplu: Trinucleotidele CAG în boala Huntington sau CGG în sindromul X- fragil.

ADN moderat repetitiv: (elemente transpozabile) este reprezentat de secvenţe scurte de ADN (300-1000 pb) care se găsesc în număr de sute sau mii per genom. Reprezintă ≈ 35% din genom. Se găseşte în:

Elemente scurte intercalare (SINEs) (100-400 perechi de baze), reprezentând 14% din genom (de exemplu Secvenţele Alu care formează 10% din genom). Secvenţele SINEs nu codifică proteine şi nu sunt autonome. Secvenţele Alu se găsesc în număr de ≈ 1250000/genom haploid, sunt specifice primatelor, se află îndeosebi în introni, iar funcţia nu este deplin

cunoscută. Aceste secvenţe se găsesc într-un număr foarte mare în genomul uman, fiind întâlnite în medie o dată la fiecare 3 kb. Au o lungime totală de aproximativ 280 perechi de baze azotate şi constau din 2 repetări în tandem urmate de o secvenţă scurtă bogată în T într-o catenă, respectiv A în catena complementară. Secvenţele Alu au un conţinut bogat în C-G, sunt dispersate îndeosebi în regiunile eucromatice şi sunt preferenţial localizate în regiunile bogate în C-G, spre deosebire de secvenţele LINEs care sunt preferenţial localizate în regiunile bogate în A-T. Rol: în iniţierea replicării în diferite puncte ale ADN şi acţionează ca elemente transpozabile ale genomului, Prin modificarea poziţiei în genom se pot integra într-o genă structurală importantă şi disrupe funcţionalitatea acestei gene. ( De exemplu inserţia unui element Alu în gena NF1 de pe cromozomul 17 este una din mutaţiile care au ca şi consecinţă tabloul clinic al neurofibromatozei tip1). Unele dintre secvenţele Alu fiind în intronii genelor, prin recombinări între 2 elemente, alterează funcţia genei, cauzând boala. ( Exemplu: în hipercolesterolemia familială este implicată gena care specifică R-LDL).

Elemente lungi intercalare (LINEs) (5-7 kb) reprezentând 21% din genom (de ex.: elementele L1 ≈ 550000/genom haploid, formează 17% din genom). Secvenţele LINEs umane constau din 3 familii: LINE 1, LINE 2 şi LINE 3, localizate îndeosebi în regiunile eucromatice ale cromozomilor umani, preferenţial în zonele bogate în AT.Dintre aceste 3 familii numai familia LINE 1 deţine un rol activ ca element transpozabil, fiind de fapt cel mai important element transpozabil din genomul uman. Lungimea totală a elementului LINE 1 este aproximativ 6,1 kb şi codifică 2 proteine: o proteină care se leagă de ARN şi o proteină care are activităţi de endonuclează precum şi de revers-transcriptază. Unele dintre secvenţele LINEs pot cauza boli prin disrupţia funcţionalităţii unei gene consecutiv inserţiei lor în cadrul secvenţelor nucleotidice din gena respectivă (Exemplu: hemofilia A, hemofilia B, miodistrofia Duchenne).

Genele care codifică ARNr şi ARNt Unele secvenţe de ADN repetitiv se găsesc numai într-un loc pe un anumit cromozom, altele fiind dispersate în întregul genom.

La nivel genic, unele secvenţe repetitive se găsesc la nivelul intronilor. Importanţa repetărilor nucleotidice în studiile genomice umane:

Datorită faptului că aceste elemente sunt înalt conservate, polimorfe şi se găsesc în întregul genom, ele sunt utile studiilor genetice în:

identificarea persoanelor ( markeri VNTRs; STRs)

antropologie şi evoluţionism

studii populaţionale şi de filiaţie

studii de lincaj genic

studii de cartografiere genică. 2.4.1.4 ADN unic ADN unic (nerepetitiv) este reprezentat de secvenţe de ADN care nu se repetă în genom. La nivelul cromozomilor se găseşte

în benzile eucromatice, iar la nivel genic se află în exoni (porţiunile codante ale genelor) în proporţie relativ redusă (2%), restul se află în introni, sau în regiunile care separă genele, iar funcţia sa la acest nivel nu este cunoscută..

2.5 ADN mitocondrial

Mitocondriile deţin un genom autonom. Fiecare celulă conţine sute de mitocondrii şi fiecare mitocondrie conţine 2-20 molecule de ADN dublu catenar circular (ADNmt). Se estimează că ADN mitocondrial este format din aproximativ 16 569 perechi de nucleotide

Diferenţe ale ADN mitocondrial faţă de ADN nuclear Nu este asociat cu proteine Nu conţine ADN repetitiv Nu conţine promotori individualizaţi

Conţine în proporţie de aproximativ 93% secvenţe codante care formează 37 gene care codifică

fie polipeptide (constituenţi ai sistemului de fosforilare oxidativă) (13 gene)

fie ARNt (22 gene)

fie ARNr (2 gene) Genele ADNmt au structură continuă (fără introni) Din cei 64 de codoni 4 prezintă altă semnificaţie. Ei se numesc codoni eretici Mod de transmitere: exclusiv matern În aceeaşi celulă poate coexista ADNmt cu mutaţie şi ADNmt normal (heteroplasmie). Prezenţa în celulă a aceluiaşi tip

de ADNmt poartă numele de homeoplasmie Specificând componente (subunităţi) ale enzimelor din procesul fosforilării oxidative, mutaţia determină reducerea

energiei în celulă Bolile determinate de mutaţii ale ADNmt prezintă tablou complex, implicând neuronii (afectare neurologică severă) şi

sistemul muscular. Exemple de boli determinate de mutaţii ale genelor ADNmt:

Neuropatia optică ereditară Leber

Anomalii ale metabolismului energetic caracterizate prin distonia musculară, cu evoluţie paroxistică sau progresivă

2.6 Replicarea ADN Replicarea moleculei de ADN are loc înaintea diviziunii fiecărei celule. Replicarea poate fi definită ca multiplicarea unei

molecule vechi în 2 molecule noi. Se desfăşoară după modelul semiconservativ: dublul helix se desface, apar ˝furcile de replicare˝, iar în continuare fiecare catenă veche serveşte ca matriţă pentru sinteza unei catene noi, complementare. Ulterior catena veche va fi încorporată în molecula nouă de ADN, care are astfel o catenă nouă şi o catenă veche.

La om replicarea se desfăşoară cu o rată de aproximativ 50 nucleotide/secundă. Procesul se realizează în timpul interfazei, în faza S.

Replicarea este un proces foarte complex care trebuie să asigure integritatea şi fidelitatea informaţiei genetice, helixurile nou formate reprezentând copiile exacte ale helixului iniţial. Procesul are la bază complementaritatea bazelor azotate.

2.6.1 Etapele replicării

Procesul replicării se desfăşoară în mai multe etape: Într-o primă etapă are loc despiralizarea helixului cu ajutorul helicazei, urmând apoi separarea celor 2 catene ale ADN-ului.

Desfacerea helixului are loc în mai multe puncte deodată, aceste zone fiind denumite repliconi (datorită existenţei mai multor locuri de iniţiere a replicării, se apreciază că procesul durează aproximativ 1 oră în loc de 1 lună, cât ar fi durata replicării dacă ar fi iniţiată într-un singur punct). La aceste niveluri se formează furcile de replicare, cu aspect de literă Y. Prin desfacerea legăturilor de hidrogen dintre cele două catene ale moleculei vechi de ADN va rezulta ADN monocatenar.

Ambele catene ale moleculei de ADN se replică simultan (mai exact, în paralel). Moleculele de ADN monocatenar rezultate vor servi ca matriţe pentru sinteza noilor catene. Cele două catene de ADN sunt împiedicate să reunească (să refacă dublul helix iniţial) prin intermediul unor enzime: proteine care se leagă de ADN-ul monocatenar (single-stranded binding proteins, prescurtat: SSB).

Catenele moleculei de ADN care va fi replicată sunt antiparalele (una având sensul legăturilor fosfodiesterice 5'-3', iar cealaltă 3'-5'). Totuşi, enzima esenţială pentru procesul replicării, ADN polimeraza, funcţionează numai în direcţia 5'-3'. Datorită acestei particularităţi a enzimei, catenele fiice, nou-formate, vor fi sintetizate în moduri diferite, una dintre ele prin adăugare succesivă de nucleotide, unul câte unul, în direcţia furcii de replicare, iar cealaltă catenă va putea fi formată numai prin legarea unor blocuri de nucleotide. În cazul primei catene sinteza se face continuu, iar în cazul celei de a doua catene, sinteza se face discontinuu

Iniţierea sintezei catenei complementare are loc cu ajutorul enzimei ARN primaza, care aşează primul nucleotid în catena nouă, iar apoi ADN polimeraza va adăuga nucleotidele, unul câte unul, în direcţia furcii de replicare, păstrând orientarea corectă, antiparalelă.

Având în vedere faptul că enzima ADN polimeraza funcţionează numai în direcţia 5-3, pe cealaltă catenă ea va trebui să se deplaseze în direcţia opusă furcii de replicare. De aceea, pe această catenă va fi necesar ca replicarea să se facă într-un alt mod, şi anume în fragmente mici. Acestea au fost denumite fragmente Okazaki. Ele cuprind 100-200 nucleotide, care sunt sintetizate în direcţia 5'-3', în porţiunea de ADN monocatenar mai îndepărtată de furca de replicare. Aceste fragmente vor fi legate între ele cu ajutorul enzimei ADN ligaza.

Replicarea prin încatenarea fragmentelor Okazaki este puţin întârziată faţă de catena în care nucleotidele se leagă unul câte unul. Replicarea discontinuă a acestei catene necesită în plus şi mai mulţi primeri (iniţiatori) ai sintezei, câte unul pentru fiecare fragment în parte.

2.6.2 Enzimele necesare replicării moleculei de ADN

Replicarea moleculei de ADN are loc cu ajutorul mai multor enzime : Helicaza – separă cele două catene ale moleculei de ADN. Monocatenele vor servi ca matriţe pentru replicare şi vor fi incluse

ulterior în noile molecule de ADN. Proteine de replicare (SSB, single-strand binding protein) – menţin catenele distanţate.

Topoizomerazele – cu rol în înfăşurarea şi desfacerea helixului. Ele secţionează şi despiralizează catenele moleculei de ADN, iar ulterior intervin în refacerea structurii lor.

Primosom – complex proteic cu rol în sinteza primerului ADN-polimerazele – cu rol în aşezarea corectă a nucleotidelor şi încatenarea lor. În celulele mamiferelor se găsesc 5 tipuri de

ADN polimeraze: α, β, γ, δ şi ε. Subunitatea γ este localizată în mitocondrii, fiind responsabilă de replicarea ADN-ului mitochondrial. Celelalte subunităţi sunt localizate în nucleu, având următoarele roluri:

α: încatenarea nucleotidelor în catena cu sinteza discontinuă

β: repararea ADN

δ: încatenarea nucleotidelor în catena cu sinteza continuă.

ε: repararea ADN ADN-ligaza - leagă fragmentele nou sintetizate.

Asincronismul replicării: procesul de sinteză al moleculei de ADN are loc în timpul interfazei, în faza S. Există însă un

asincronism al replicării, astfel eucromatina se replică precoce, la începutul fazei S, iar ADN-ul din zonele heterocromatice se replică tardiv. De asemenea, asincronismul există şi la nivel cromozomial, cromozomii 4, 8, 13, 21 şi X replicându-se tardiv.

2.7 Repararea leziunilor ADN-ului

2.7.1. Generalitati

Sub acţiunea unor agenţi mutageni externi sau interni genomul uman suferă variate leziuni spontane sau induse. De aceea, o

gamă largă de gene pentru reparare a fost favorizată în evoluţie atât la PK cât şi la EK. Sistemele de recunoaştere a leziunilor ADN-ului şi de reparare enzimatică pot realiza fie restituţia fidelă a structurii iniţiale, fie

repararea parţială cu defect (tolerarea leziunilor ADN-ului), acţionând corelat cu mecanismele care coordonează progresia ciclului celular. Consecinţele asupra celulei şi/sau a organismului pot fi diverse, în funcţie de tipul celular, tipul leziunii şi de eficienţa reparării : mutaţii genice (patologia moleculară), boli asociate cu defecte în repararea ADN-ului şi cu creşterea susceptibilităţii la cancer, apoptoza.

Leziuni spontane ale ADN-ului pentru fiecare celula umană implică estimativ 10 000 situsuri diferite la aproximativ 24 de ore. Rata mutaţiilor este menţinută însă la un nivel scăzut datorită performanţei mecanismelor de reparare a leziunilor ADN-ului la nivel nuclear sau mitocondrial. Deşi nu au o eficienţă absolută, într-un an de zile , datorită mecanismelor de reparare, o celula germinală de la mamiferele cu genom de aproximativ 3x109 pb suferă modificări de numai 10-20pb.

Există multiple sisteme de reparare a leziunilor din structura ADN-ului. In tabelul 1 sunt menţionate principalele tipuri de leziuni şi mecanisme de reparare

Tip de leziune ADN Principalele mecanisme de reparare

Breşa intr-o catenă de ADN Reparare cu ajutorul ADN-ligazei

Baze imperecheate greşit Corectare prin repararea imperecherilor greşite (excizie –resinteză)

Uracil prezent în ADN Uracil suprimat cu ajutorul Uracil-glicozilazei

Situs apurinic sau apirimidinic Sistemul de reparare al endonucleazei «AP»

Dimeri de pirimidine (lumina U.V.) Reversie enzimatica

Regiuni de ADN lezat Reparare prin excizie (excizie si resinteză utilizând cealaltă catenă)

Regiuni de ADN lezat Reparare post- replicativa (reparare via recombinare)

Tabel 1. Leziuni şi mecanisme de reparare

2.7.2 Repararea leziunilor produse prin erori de imperechere intre bazele azotate (MMR- mismatch repair)

Rolul cel mai important al acestui sistem este de mecanism de «ultimă şansă» pentru a corecta erorile din cursul replicării (pe

lângă implicarea lui în contextul conversiei genice şi recombinărilor genetice). In cursul replicării ADN-ului au loc încorporări de nucleotide greşit înserate care conduc la împerecheri eronate ale bazelor

azotate, estimate la 10-5 per nucleotid şi per ciclu de replicare.

Aproximativ 99 % din aceste erori sunt imediat corectate prin operaţia de recitire (activitate de exonucleaza direcţie 3‘ 5‘) a polimerazei principale din timpul replicării. Rămân 10-7 imperecheri greşite per ciclu de replicare din care 99,9% sunt corectate prin sistemul de reparare al imperecherilor greşite, frecvenţa finală a acestora fiind:

10-5 x10-2 x10-3 = 10-10

Identificarea catenei de ADN care conţine o bază eronată la nivelul situsului numit «cu eroare de împerechere» se bazează pe o diferenţă de metilare între catena nou sintetizată (non-metilată) şi catena matriţă (metilată). Sistemul a fost descris prima oară la E.coli, iar talia regiunii excizate variază ( corecţie lungă, scurtă sau foarte scurtă, în funcţie de numărul nucleotidelor reparate), într-o regiune de aproximativ 1kb în jurul situsului cu eroare de împerechere. Genele implicate în procesul de reparare la E coli sunt Mut H, Mut L, şi Mut S. Cercetări ulterioare au identificat la om patru gene omoloage cu acestea. Mutaţia lor conduce pentru fiecare în parte la o formă de cancer ereditar colorectal non-polipozic (HNPCC). Mai multe cancere ar putea fi astfel induse prin mutaţii în aceste gene.

In etapa de excizie se formează o breşa mono- catenară consecutiv acţiunii exonucleazei care degradează catena

de ADN clivată anterior. Dupa excizie, ADN polimeraza reface breşa utilizând catena complementară ca matrice şi elimină în consecinţă nucleotidele eronate.

Acelasi sistem corecteaza de asemenea si mici insertii sau deletii. 2.7.3. Sistemul de reparare al endonucleazei «AP» Acest sistem poate acţiona în situsurile unde o bază purinică sau pirimidinică lipseşte din structura moleculei de ADN. Un astfel de situs numit situs apurinic sau apirimidinic (situs AP) poate fi produs prin mecanisme biochimice diferite, de exemplu hidroliza purinelor sau dezaminare urmată de detaşarea nucleotidului respectiv. Situsurile apurinice sau apirimidinice sunt reparate prin sistemul enzimatic de reparare al endonucleazei «AP». Endonuceaza AP clivează baza azotată fără glucid, lăsând o breşă în ADN, breşă care va fi reparată de ADN-polimerază şi în final prin ADN ligază.

2.7.4. Repararea prin excizie a leziunilor ADN

Repararea prin excizie este un proces ubiquitar care se realizează pentru un număr mare de leziuni ale ADN-ului. Procesul are loc în mai multe etape enzimatice şi permite eliminarea unui segment de ADN lezat din molecula dublu catenară,

urmat de înlocuirea segmentului eliminat printr-o noua sinteză, în care se utilizează catena nemodificată (catena cu structura normala) drept matrice a replicării (excizie-resinteză).

Leziunea ADN-ului poate fi cauzată de orice eveniment care conduce la distorsiunea moleculei dublu helicoidale, de exemplu prin dimeri de pirimidină (T-T, C-C, C-T). Dimerii de pirimidină sunt legături intra-catenare ale bazelor, apărute în molecula ADN după acţiunea radiaţiilor UV sau prin metaboliţi reactivi, respectiv prin modificări chimice determinate de benzipiren, aflatoxină, cisplatin, etc.

Sunt descrise multiple variante ale acestui mecanism general de reparare, funcţie de modul de recunoaştere al leziunii ţintă şi de moleculele efectoare.

Un exemplu din patologia umană în care sunt afectate gene pentru enzimele implicate în procesul de reparare prin excizie este o afecţiune rară, Xeroderma pigmentară (XP). Afecţiunea este încadrată în sindroamele cu instabilitate cromozomială şi prezintă o largă heterogenitate clinică şi genetică datorită mutaţiilor identificate în 7 gene, notate de la XPA la XPG.

2.7.5. Reversia enzimatică Diverse enzime pot recunoaşte şi cataliza reversia directă a unei leziuni ADN cauzată de radiaţiile UV. Un exemplu clasic este

cel al dimerilor de pirimidină induşi de U V realizată de enzime care rup legăturile dintre pirimidine în cadrul dimerilor, restaurând bazele de origine. Enzimele se leagă la dimeri în obscuritate şi unele au nevoie de prezenţa luminei de culoare albastră pentru a fi rupte legăturile dimerice.

2.7.6. Repararea post- replicativă a leziunilor ADN Este un proces care are loc atunci când leziunile ADN persistă, n-au putut fi eliminate prin excizie sau n-au putut suferi o

reversie înainte de pasajul prin replicare. Pentru a minimaliza efectele nefaste este necesară repararea post-replicativă prin recombinare (fig.11).

Repararea rupturilor apărute în molecula de ADN bicatenară sub acţiunea radiaţiilor gama de exemplu este realizată la om prin intervenţia a trei proteine codificate de genele ATM, BCRA1, şi BCRA2. Numele lor derivă din bolile cauzate de mutaţii ale acestor gene : ataxia telangiectazia (ATM) şi predispoziţia ereditară pentru cancer de sân (BCR).

2.7.7. Repararea leziunilor la nivelul ADN-ului mitocondrial Deoarece ADN-ul mitocondrial e mai susceptibil la mutaţii, rata mutaţiilor la acest nivel este de 10 ori mai mare faţă de ADN-ul

nuclear. Mecanismele de reparare sunt similare cu cele de la nivel nuclear cu mici excepţii, de exemplu lipsa mecanismului de excizie –

reparare a unui nucleotid (NER). Eficienţa mai scazută a reparării la acest nivel contribuie la procesul de îmbătrânire precoce şi la apariţia unor boli

degenerative. De asemenea, existenţa ADN mitocondrial în multiple copii la nivelul mitocondriilor, apariţia unei mutaţii se poate evidenţia în generaţia următoare la descendenţi deşi există heteroplasmie (mitocondrii cu ADN normal şi mitocondrii cu ADN cu mutaţie).

2.8 Acizii ribonucleici

Informaţia genetică este vehiculată şi exprimată prin intermediul unor molecule de polimeri numite acizi ribonucleici (ARN). Se disting trei clase de ARN care diferă între ele după mărime, localizare şi funcţie.

ARN mesager (ARNm) este o copie a secvenţei codante a unei gene şi serveşte ca matriţă pentru sinteza proteinei. ARN ribozomale (ARNr) şi ARN de transport (ARNt) furnizează structurile şi instrumentele necesare pentru ca mesajul adus de ARNm să poată fi structurat sub forma unei proteine.

Acizii ribonucleici sunt lanţuri de polinucleotide care diferă de ADN prin prezenţa bazelor de tip uracil (U) care înlocuiesc timina (T) şi glucidului de tip riboza, în loc de dezoxiriboză. Prezenţa ribozei este în mare parte responsabilă de proprietăţile conformaţionale diferite de cele ale ADN-ului. Grupul hidroxil de la nivelul ribozei în poziţia 2' este la originea numeroaselor interacţiuni suplimentare care au tendinţa de destabilizare a legăturilor 5'-3' fosfodiester şi împiedică adoptarea unei conformaţii în dublu helix de tip B.

ARN-urile sunt deci molecule constituite dintr-un singur lanţ (monocatenare). Cu excepţia ARN mesager care are o structură liniară, ARNr şi ARNt sunt formate dintr-un lanţ pliat prin împerecherea unor baze azotate. Astfel se realizează o conformaţie formată din bucle şi porţiuni drepte care se asociază cu proteine specifice.

2.8.1. Tipuri de ARN

Se disting diferite tipuri de ARN, care diferă între ele după mărime, localizare şi funcţie. 2.8.1.1. ARN mesager (ARNm) Majoritatea celulelor sintetizeaza molecule de ARNm mici diferite, fiecare fiind apoi

translate intr-un lanţ polipeptidic necesar celulei. Mărimea moleculei de ARN reflectă mărimea polipeptidului pe care îl codifică. Multe ARNm sunt comune pentru multe celule, ele codificand proteinele "housekeeping" necesare tuturor celulelor (ex enzimele pentru glicoliza). Alte ARNm sunt specifice doar pentru unele tipuri de celule. Acestea codifica proteine necesare functiei celulei specializate (ex ARNm pentru hemoglobina in precursorii eritrocitelor).

2.8.1.2 ARN ribozomal (ARNr) va fi folosit în construcţia ribozomului care serveşte sintezei proteinelor în urma procesului de

translaţie al ARNm. La eucariote există 4 tipuri diferenţiate după rata de centrifugare la ultracentifugă: ARNr (18S) formează subunitatea mică a ribozomului. ARNr (28S, 5.8S şi 5S.) formează subunitatea mare a ribozomului.

2.8.1.3 ARN de transport (ARNt) poartă aminoacizii care vor forma lanţul polipeptidic. În celula eucariotă există 32 de tipuri de

ARNt. Fiecare este produsul unei gene separate. Multe dintre bazele azotate au perechi în lanţul polinucleotidic formând astfel regiuni de dublu helix. Regiunile nepereche formează 3 bucle (bucla D, T şi bucla anticodonului). Fiecare dintre ARNt leagă (la capatul 3′ ) unul din cei 20 aminoacizi (fiecare aminoacid are mai mult de un ARNt responsabil de el). La una dintre bucle, 3 baze azotate nepereche formează un anticodon. Împerecherea bazelor între anticodon si codonul complementar de pe molecula ARNm permite legarea aminoacidului potrivit din lanţul polipeptidic în formare (detalii la procesul de translaţie).

2.8.1.4. ARN mic nuclear (small nuclear - sn RNA). Transcripţia ADN-ului produce molecule precursoare lungi ("transcript

primar") care pot fi procesate în nucleu pentru a produce molecule funcţionale care pot fi exportate în citosol. Unii dintre paşii necesari sunt mediaţi ARN-urile mici nucleare. Unele gene pentru ARNsn sunt prezente in mai multe copii . ARNsn au diferite roluri in procesarea altor clase de ARN. Astfel, unele sunt parte a spliceozomului care participă la convertirea pre-ARNm in ARNm prin excizia intronilor si aranjarea exonilor. Deasemenea, au rol In procesarea "transcriptului primar" pentru a deveni o moleculă funcţională

2.8.1.5. ARN mic nucleolar (small nucleolar RNAs - sno RNA). Acestea se găsesc în interiorul nucleolului şi au câteva funcţii. La vertebrate aceste ARN sunt codificate de intronii îndepartaţi in timpul procesarii ARN. Aşa cum sugerează numele, aceste ARN-uri (sunt peste 100) au fost gasite in nucleol si se pare ca sunt responsabile de cateva functii:

Unele participa la formarea ribozomului ajutand la tăierea marelui ARNr-precursor in subunitatile 28S, 18S, si 5.8S.

Unele servesc ca tipar pentru sinteza telomerelor.

2.8.1.6. Micro ARN (miARN). Acestea sunt mici molecule de ARN care se pare că reglează expresia moleculelor de ARNm.

2.8.1.7. ARN XIST. Acesta inactivează unul din cei doi cromozomi X la sexul feminin.

2.9.Organizarea genei structurale la EK

Gena are o structură modulară, fiind constituită din elemente necesare pentru procese de: Iniţiere, desfăşurare şi finalizare a transcripţiei şi translaţiei Specificarea secvenţializării AA în polipeptidul sintetizat Reglarea expresiei genelor

Promotorul: punctul start al transcripţiei apare în regiunea promotor a genei. Informaţia pentru funcţia promotorului e furnizată de însăşi secvenţa de ADN.

Promotorul e recunoscut de factorii de transcripţie (aprox. 50 proteine diferite) care controlează rata şi gradul transcripţiei. Această regiune nu este transcrisă, reprezentând situl iniţial de legare a ARN-polimerazei II. Promotorii vor orienta ARN-

polimeraza, astfel încât pentru transcripţie să fie utilizată catena corectă a ADN-ului. Majoritatea promotorilor au:

Cutia TATA localizată la aprox. 25-35pb. în amonte (―upstream‖) de situl de iniţiere a transcripţiei. Poziţia fixă a acestei secvenţe este esenţială pentru poziţionarea ARN-polimerazei.

Cutia CAAT reprezintă o altă secvenţă conservată, aflată la aprox. 70 pb. în amonte de situl de iniţiere a transcripţiei.

Mutaţiile care apar la nivelul regiunii promotor determină variaţii ale nivelului de expresie a genei. De exemplu mutaţia în

regiunea promotor a genei care codifică insulina determină o formă de DZ tip I. Situl de iniţiere a transcripţiei este locul din care porneşte transcripţia ADN-ului în pre ARNm. Se găseşte la capătul 5‘ al

secvenţei codante şi reprezintă începutul primului exon. Această secvenţă adaugă GTP “cap” la începutul ARNm matur pentru a-l proteja de acţiunea 5-exonucleazei.

Din acest punct până la situl de iniţiere a translaţiei, secvenţele următoare sunt: Regiunea netranslatată 5’ (5’-UTR) nu codifică o proteină, ci conţine zone de control, cu rol în menţinerea stabilităţii ARNm

şi legarea de ribozomi pentru iniţierea translaţiei. Polipeptidul semnal furnizează semnalul pentru localizarea celulară sau extracelulară corectă, fiind în final clivată şi

îndepărtată. Mutaţiile care interferă clivarea acestei secvenţe determină boli ca deficit de factor X sau hipoparatiroidism, forma RA Situl de iniţiere a translaţiei reprezintă secvenţa care codifică începutul lanţului polipeptidic. Codifică metionina, dar

aceasta va fi adesea eliminată posttranslaţional. Astfel, fiecare ARNm matur are ca prim codon AUG, care codifică metionina, dar nu toate polipeptidele încep cu metionina.

Cadrul de citire a genei propriu-zise folosite pentru sinteza unui polipeptid conţine: Exoni: secvenţe codante ale genei, transcrise şi translate Introni: secvenţe necodante ale genei, transcrise şi netranslate Graniţele exoni-introni: Fiecare intron începe cu o secvenţă denumită sit donor (GT) la capătul 5 şi se termină cu o

secvenţă denumită sit acceptor (AG) la capătul 3. Intronii vor fi înlăturaţi (proces denumit splicing) în cadrul modificărilor posttranscripţionale. Aceste secvenţe sunt puternic conservate şi sunt esenţiale pentru desfăşurarea corectă a procesului de splicing.

Mutaţiile la acest nivel determină splicing aberant. Astfel de exemple sunt: hiperplazia congenitală adrenaliană (apare prin mutaţie la situl de splicing la intronul 2 al genei) şi beta-talasemii (unele forme).

Codonul stop reprezintă semnalul de terminare al translaţiei şi este unul dintre cei 3 codoni stop. Regiune semnal de poliadenilare se găseşte în aval (―downstream‖) de codonul stop, în cadrul regiunii netranslatate 3‘ (3‘-

UTR). Reprezintă un semnal pentru adăugarea unei secvenţe poli-A (denumită ―coada‖ poli-A) cu lungime diferită, în cadrul modificărilor posttranscripţionale ale ARNm. Este plasat la 10-30 nucleotide în amonte de situl de clivare 3 (terminare a transcripţiei). Rolul acestei secvenţe este de a stimula iniţierea translaţiei dar este implicată şi în maturarea, transportul şi degradarea ARNm

Regiune netranslatată 3’ (3’-UTR) reprezintă secvenţa de ADN cuprinsă între semnalul de terminare a translaţiei (codon stop) şi terminarea transcripţiei. Transcripţia se termină la aprox. 0,5-2 kb în aval de semnalul de poliadenilare şi terminarea e determinată de prezenţa unor semnale de terminare a transcripţiei. Regiunea 3‘-UTR e implicată în controlul expresiei genelor, deşi nu are situri de control bine cunoscute. Este cunoscută implicarea acestei regiuni în controlul gametogenezei la ambele sexe şi a perioadei de început a dezvoltării embrionare. Mutaţiile acestei regiuni determină afecţiuni ca distrofia miotonică în care apar expansiuni trinucleotidice în reg 3‘-UTR a genei DMPK.

Semnalul de terminare a transcripţiei reprezintă o secvenţă palindromică bogată în G şi C. Are rol de a forma un burelet pe catena de ARN, care determină disocierea complexului polimerază-ADN-ARN.

2.10.Transcripţia genei: ADN ARN

Transcripţia este procesul de copiere a informaţiei conţinută într-o genă sub formă de ADN într-o secvenţă de ARN (Fig.1.).

Fig.1. ADN serveşte ca tipar pentru sinteza ARN

În procesul de transcripţie intervine enzima ARN polimeraza. Ea face parte dintr-un enorm complex enzimatic care derulează şi desparte cele două catene de ADN înconjurate helicoidal una în jurul celeilate. Astfel se recrutează mononucleotidele din viitorul lanţ de ARN şi se se asamblează conform complementarităţii cu bazele azotate din lanţul ADN. ARN polimeraza conţine multe subunităţi de complexe proteice.

Procesul de transcripţie este similar la procariote (bacterii) şi la eucariote (animale şi plante). Toate celulele eucariotelor au trei tipuri de ARN polimeraze (I, II, II) faţă de un singur tip la procariote. Fiecare variantă de polimerază este responsabilă de de sinteza unei clase de ARN. La eucariote există trei tipuri:

ARN polimeraza I (Pol I) - transcrie genele pentru subunităţile ARNr.

ARN polimeraza II (Pol II) - transcrie gene care codifică proteine în ARNm si gene pentru ARN mic nucleolar.

ARN polimeraza III (Pol III) - transcrie genele pentru subunitatea 5S a ARNr şi toate genele pentru ARNt . 2.10.1.Etapele transcripţiei

Transcripţia se efectuează în trei etape sucesive: iniţierea, elongarea, terminarea.

2.10.1.1. Etapa de iniţiere începe când ARN polimeraza se asociază cu o regiune specifică de pe o catenă de ADN numită promotor. Un promotor este constituit dintr-o secvenţă consens care conţine un aranjament de baze TATA şi CAAT (la eucariote). Aproximativ 50 de proteine diferite sunt factori de transcripţie care se leagă de site-urile promotorului de la capătul 5′ al genei care va fi transcrisă. Enzima ARN polimeraza se leagă de complexul factorilor de transcripţie. Mai exact, un factor proteic specific (factor sigma) se asociază cu polimeraza şi îi permite să se fixeze pe un lanţ de transcriere. Printr-o activitate comună acestea deschid dublul helix al ADN-ului, separă cele două lanţuri de ADN şi crează o buclă de transcripţie care permite apariţia nucleotidelor complementare cu secvenţa de ADN transcrisă. 2.10.1.2. Elongarea catenei de ARN se efectueză prin polimerizarea succesivă a nucleotidelor în sens 5' - 3'. ARN polimeraza acţionează pe o catenă miscându-se în direcţia 3′ → 5′. La eucariote aceasta necesită — cel puţin pentru genele care codifică proteine — înlăturarea nucleozomului din faţa avansării ARN polimerazei (ARNP II). Aceasta este posibil datorită complexului de proteine menţionat care reamplasează nucleozomul după ce ADN-ul a fost transcris şi ARN polimeraza s-a îndepărtat. Pe măsură ce ARN polimeraza avansează de-a lungul catenei de ADN, se asamblează ribonucleotidele (ajutate de ATP) formând catena de ARN. 2.10.1.3. Etapa de terminare intervine când un semnal indica sfârsitul genei. Un semnal de terminare este în general constituit dintr-o secvenţă palindromică bogată în guanină şi citozină care urmează unei regiuni compusă în special din adenină. Această secvenţă determină formarea unui burelet pe catena de ARN, care provoacă disocierea complexului polimerază-ADN-ARN. Când transcripţia este completă transcriptul este eliberat de polimerază iar aceasta din ADN.

La procariote procesul de transcripţie are loc direct în citoplasmă. În aceste condiţii, dacă transcripţia este terminată ARN-ul format poate fi utilizat pentru sinteza proteinelor. În unele cazuri translaţia se efectuează chiar în timp ce transcripţia este în curs, permiţand deasemenea o autoreglare a expresiei genelor. La eucariote transcripţia se efectuează în nucleul celular. Sunt transcrise gene care conţin secvenţe necodante (introni). Înaitea exportului în citoplasmă transcriptele primare ARN, numite şi ARN nuclear heterogen suferă modificări importante.

De menţionat că în orice zonă din molecula de ADN, fiecare catenă poate servi ca matriţă astfel, unele gene rulează în altă direcţie decât celălalte (există câteva cazuri în care, acelaşi segment al dublu helix-ului conţine informaţie genetică pe ambele catene). În toate cazurile ARN polimeraza avansează de-a lungul catenei în direcţia 3′ → 5′. Se pare că ARN polimeraza se roteşte de jur împrejur dublul helix-ul ADN-ului.

2.10.2. Procesarea ARN: preARNm ARNm

Toate moleculele de transcript primar (pre-ARNm) sintetizate în nucleu vor trece printr-o procesare ulterioară prin care se va sintetiza o moleculă de ARN funcţională care va fi exportată în citoplasmă. ARN-urile mesager sunt profund modificate astfel încât la sfârşit stabilitatea lor creşte şi devin biologic active. Se pot delimita mai multe etape:

Sinteza cap

Sinteza poli-A

Îndepărtarea intronilor

Sinteza cap. Când se termină faza de iniţiere, extremitatea 5' a ARNm este învelită de o moleculă de GTP, (secvenţa cap). Aceasta determină o creştere a stabilităţii ARNm şi o protecţie faţă de activitatea enzimatică a exonucleazelor. În plus reprezintă un semnal de recunoaştere pentru proteinele implicate în procesul ulterior de maturare şi translaţie în proteină.

Sinteza poli(A). În partea opusă, extremitatea 3' este completată de o secvenţă poliadenină (coadă poliA). În timpul etapei de terminare o secvenţă specifică AAUAAA este recunoscută de o enzimă numită poliadenil polimeraza care secţionează transcriptul primar cu 20 baze în aval. Fragmentul poli(A) se ataşează de capătul liber 3‘ al unui alt pre-ARNm. Acesta completează molecula de ARNm, care este acum gata de a fi exportată în citoplasmă.

Îndepărtarea intronilor, unul câte unul, din preARNm şi legarea cap la cap a exonilor rămaşi, mecanism denumit splicing sau matisare. Acest pas este necesar deoarece la eucariote genele sunt mozaicate, respectiv conţin exoni şi introni.

2.10.3. Matisarea genelor

Majoritatea genelor eucariotelor au structură mozaicată fiind împărţite pe segmente, numite introni şi exoni. Fragmentul de ADN, care va fi transcris în ARN dar nu va fi translat în proteină se numeşte intron. Fragmentele din ADN care codifică aminoacizi în proteină se numesc exoni. În general, intronii sunt mai lungi decât exonii. Produsul transcripţiei, lanţul ARN sintetizat este numit transcript primar deoarece el reprezintă negativul secvenţei complete a genei. Maturarea transcriptului primar se efectuează prin expulzarea secvenţelor necodante sau introni (proces de matisare). Mecanismul implică formarea unei bucle de ARNm. Tăierea şi matisarea ARNm se face cu mare precizie. Înlăturarea intronilor şi aranjarea exonilor se face de către spliceosome. Acesta este un complex format din câteva molecule de ARNsn şi din 145 proteine. În marea majoritate a ARNm intronii incep cu GU şi se termină cu AG. Se presupune că aceste secvenţe scurte asistă in ghidarea spliceozomului. În unele cazuri, se pare că unele ribonucleoproteine legate de ARNm, uşurază trecerea prin porii nucleului şi asocierea cu ribozomii.

Fig. 2. Matisare obişnuită

Pentru majoritatea genelor, modalităţile de matisare diferă, în funcţie de ţesut, stadiul de dezvoltare sau statusul fiziologic al celulei. Numărul de gene descoperite la om în urma definitivării proiectului genomului uman s-a dovedit a fi mai mic decât s-a crezut iniţial. Discrepanţa dintre numărul de gene şi cel al proteinelor (în număr de 10 ori mai mare decât numărul de gene) a determinat efectuarea de cercetări referitoare la procesarea moleculei de ARNm

Matisare obişnuită (Fig. 2.) Pentru unele gene matisarea ARN are loc într-un singur mod, în urma translaţiei rezultând o singură proteină. Asamblarea exonilor se face în ordinea în care aceştia erau în cadrul genei.

Matisarea alternativă : mecanismul prin care sunt generate mai multe forme de ARNm matur de pe aceeaşi genă (mai mult de 50% din genele noastre folosesc această variantă). În funcţie de etapa de dezvoltare ontogenetică sau de tipul de ţesut căruia îi aparţin, celulele îşi selectează alternativ combinaţiile exonice cele mai adecvate. Este un mecanism reglator prin care variaţiile în încorporarea exonilor în ARNm determină producerea mai multor proteine înrudite sau izoforme sau chiar proteine diferite, deaceea este considerat un mecanism cheie pentru generarea complexităţii proteinelor.

Exemple de proteine izoforme: cele 4 tipuri tipuri de bază ale mielinei gena fibronectinei poate specifica 20 forme diferite ale proteinei care are rol în determinarea adezivităţii, morfologiei şi

arhitecturii celulare. Exemple de proteine diferite : gena pentru calcitonină este procesată diferit în tiroidă şi SNC. In tiroidă produsul este calcitonina iar în SNC este un

peptid înrudit cu calcitonina, cu rol de neurotransmiţător.

In unele cazuri, în procesul de maturare, celula, elimină din ARNm precursor nu numai intronii ci şi unii exoni codanţi. Alegerea unei anumite configuraţii exonice este rezultatul interacţiunii între dispozitivul de matisare constitutivă şi alţi factori încă neprecizaţi.

Matisarea prin amestecarea exonilor (exon shuffling), este o variantă posibilă dar rar folosită. Editarea ARNm este o formă mai rară de procesare posttranscripţională a ARNm. Reprezintă un proces care conduce la

modificări predeterminate ale regiunii codante a transcriptului primar. Aceste procese implică inserţia, deleţia sau substituţia unui nucleotid.

De exemplu ARNm pentru apolipoproteina B produce în ficat Apo-B100, iar în intestinul subţire Apo-B48, care e o proteină mai mică cu o secvenţă de AA identică cu prima parte a Apo-B100 şi care apare datorită unei substituţii (C înlocuit cu U în codonul 2152), astfel codonul sens devine codon stop şi se opreşte translaţia.

2.10.4. Boli genetice cauzate de perturbarea procesului de matisare.

Cel mai frecvent apar mutaţii care constau în substituţia unei singure perechi de baze din cadrul secvenţelor de clivare sau din interiorul intronilor.

Se apreciază că 10% din mutaţiile punctiforme determină anularea adevăratelor situsuri de clivare sau activarea unor situsuri criptice.

Efectul constă în neintegrarea unor exoni sau retenţia unor introni în ARNm final care devine astfel nefuncţional. De exemplu în beta-talasemii (absenţa lanţurilor beta-globinice) 25% din cazuri sunt datorate existenţei unor mutaţii la nivelul

situsurilor de clivare. Probabil în timpul evoluţiei, genele eucariotelor s-au asamblat pornind de la genele primitive cărora azi le spunem exoni. Unele proteine, cum sunt anticorpii sunt organizate in secţiuni separate sau domenii fiecare având o funcţie specifică în

cadrul unei molecule complete. Fiecare domeniu este codificat de un exon separat. Molecula de anticorp având diferite părţi funcţionale codificate de exoni separaţi fac posibilă folosirea fiecărei unităti in diferite combinaţii. Astfel un set de exoni din genom poate fi echivalentul genetic al unor piese variate şi modulare de tip "Lego" care se pot asambla în forme diferite. Unii exoni nu par a corespunde unor domenii ale proteinelor. Se ştie că genele pentru ARNr şi ARNt sunt deasemeni matisate deşi nu codifică proteine. Probabil unii exoni reprezintă simple legături ale ADN fiind inserate în gene în timpul evoluţiei fără a avea un rol.

2.11. Translaţia

Proteinele sunt elemente constitutive ale celulei. Ele au o structură complexă formată din lanţuri polipeptidice, obţinute prin polilmerizarea aminoacizilor. Translaţia este procesul prin care informaţia genetică vehiculată de ARNm se traduce în lanţul polipeptidic.

Translaţia este un proces complex care utilizează trei clase de ARN:

ARNm transportă informaţia genetică de la locul de stocare (dublul helix al ADN) până la locul de expresie, unde serveşte ca matriţă pentru sinteza polipeptidului.

ARNt fac legătura între nucleotide şi aminoacizi. Ei se încarcă cu aminoacizii prezenţi în citoplasmă şi îi transportă la ribzomi unde efectuează sinteza polipeptidului; diferite ARNt care recunosc un acelaşi aminoacid se numesc isoaceptoare. Teoretic ar

trebui să existe 61 de tipuri de ARNt (există 61 codoni sens), însă s-a observat că majoreitatea celulelor au doar 56 de variante de ARNt. Unii ARNt vor fi fi capabili să să recunoască cel puţin 2 codoni diferiţi pentru acelaşi aminoacid (ipoteza Wobble).

ARNr sunt elementele constitutive principale ale ribozomilor, locul de sinteză al proteinelor. Ribozomii suportă lanţul de ARNm care serveşte ca matriţă pentru asamblarea aminoacizilor. Ei permit aşezarea pe baza complementarităţii între codonii codonii secvenţei de ARNm şi anticodonii fiecărui ARNt care poartă un aminoacid, în plus catalizează procesul de de formare a peptidului.

2.11.1. Etapele translaţiei

Traducerea unui lanţ de ARNm într-un lanţ polipeptidic este un proces complex care are trei etape: iniţiere, elongare, terminare. Procesul necesită o mare cantitate de energie pentru că la el participă un ARNm, un ribozom, aminoacizi, mai multe ARNt şi numeroşi factori proteici de reglare.

Iniţierea - începe cu formarea unui complex de pre-iniţiere între subunitatea mică a ribozomului, un factor proteic specific

şi un ARNt iniţiator care poartă aminoacidul metionină (ARNtmet). Subunitatea mică a ribozomului leagă în „amonte" (la capătul 5' ) al start-lui mesajului. Avanseză în direcţia (5' -> 3') până întâlneşte codonul start AUG. (Regiunea dintre cap şi AUG este cunoscută ca regiunea 5'-netranslată [5'-UTR]). În dreptul codonului start (AUG) al ARNm se aşează ARNt cu anticodonul (UAC) complementar. La eucariote ARNt iniţiator poartă metionina (Met). Sub controlul unor factori proteici, subunitatea mare a ribozomului poate lega complexul ARNt iniţiator pe sit-ul P. Un alt ARNt care aduce un alt aminoacid este introdus în sit-ul A şi prima legătură peptidică este catalizată de o proteină ribozomală (peptidil-transferaza).

Elongarea este faza următoare, în care ribozomul parcurge ARN-ul mesager codon după codon în sensul 5' - 3' şi

ataşează fiecare aminoacid selecţionat, la extremitatea C-terminală a polipeptidului. Complexul ARNt-aminoacil ( ARNt se leagă covalent de aminoacid) se leagă de sit-ul A al ribozomului astfel încat anticodonul său să fie complementar cu următorul codon al ARNm; la proces participă un factor de elongare şi o moleculă de GTP (sursă de energie). Legarea aminoacizilor (Met este startul translaţiei) se face prin legături covalente de tip peptidic. În timpul formării legăturii peptidice, peptidil-transferaza deplasează cu totul polipeptidul de ARNt situat în sit-ul P, spre noul aminoacid purtat de ARNt din sit-ul A (Transpeptidare). O dată legătura peptidică formată, ribozomul se deplasează spre codonul următor. ARNt este dezlegat de peptidul său şi este eliminat de pe sit-ul P iar ARNt purtător de peptid este deplasat din sit-ul A spre sit-ul P (Translocare). Ribozomul se mută un codon mai jos. Această mişcare a celui mai recent sosit ARNt care are ataşat un peptid, pe sit-ul P permite eliberarea sit—ului A pentru sosirea unui nou aminoacil-ARNt. Această subetapă este ajutată de un factor de elongare al proteinei (numit EF-G) iar energia este furnizată de o nouă moleculă de GTP.

ARNt iniţiator este singurul membru al familiei de ARNt care se poate lega direct pe sit-ul P. Situl P se numeşte astfel deoarece, cu excepţia ARNt iniţiator, el se leagă doar de molecula ARNt-peptidil, moleculă de ARNt ataşată de peptidul în creştere. Sit-ul A se numeşte aşa deoarece leagă doar ARNt-aminoacil care vine, respectiv ARNt care leagă următorul aminoacid. De exemplu ARNt care leagă Met în interiorul polipeptidului se poate lega doar de sit-ul A.

Etapa de terminare începe când ribozomul recunoaşte unul din cei trei codoni stop (UAA, UAG, UGA) care nu au echivalent

un anticodon. Din acest punct pană la poly(A) nucleotidele formează regiunea netranslabilă -3' [3'-UTR] a ARNm. Nu există nici un ARNt cu anticodoni pentru codonii STOP (excepţie fac genele mitocondriale). Ei sunt recunoscuţi de un factor proteic specific care se insinuează în sit-ul A al ribozomului şi induce eliberarea polipeptidului sintetizat. Ribozomul inactiv disociază cele două subunităţi şi eliberează ARNm. Subunităţile ribozomului se vor reasambla mai târziu pentru o nouă rundă de sinteză proteică.

2.11.2. Polizomii

Mai mulţi ribozomi pot participa la sinteza unui polipeptid în paralel dar în stadii diferite, progresând în lungul aceluişi ARNm.

Acest complex se numeşte polizomi şi se găseşte liber în citoplasmă unde se poate lega de reticulul endoplasmatic.

2.11.3. Controlul calităţii translaţiei Mutaţiile sau transcripţia greşită pot produce molecule de ARNm care au:

Codoni STOP prematuri. Translaţia acestora produc proteine amputate care sunt nefuncţionale. Problema este rezolvată de descompunerea ARNm. Codonii stop prematuri pot apărea prin mutaţii în frameshift sau prin erori de procesare a ARNm.

Dispariţia codonilor STOP. În aceste situaţii se produc transcripte "nonstop". Problema este rezolvată de descompunerea continuă a ARNm. Transcriptele nonstop apar când nu mai este codon stop în mesaj. Ca rezultat, ribozomul nu poate să aleagă factorul eliberator necesar pentru a părăsi ARNm-ul. Transcriptele nonstop se formează în timpul procesării ARN-urilor, având coada de poli(A) aşezată înaintea codonului stop.

Reglarea translaţiei Expresia majorităţii genelor este controlată la nivelul transcripţiei lor. Factorii de transcripţie (proteine) se leagă de promotori şi intensificatori activând sau dezactivând genele pe care le activează. Totuşi, sunt unele cazuri în care expresia genelor este controlată la nivelul translaţiei. Interferenţa ARN-ului Molecule de ARNm mici se leagă de porţiunea complementară a ARNm şi împiedică procesul de translaţie la

nivelul ribozomilor sau declanşează distrugerea lui.

2.12. Codul genetic

În cadrul codului genetic, fiecare AA este desemnat de un triplet de nucleotide numit codon. Există 64 codoni posibili (4 baze

azotate A,T,G,C deci 43 posibilităţi). Şaizeci şi unu de codoni specifică (codifică) 20 de aminoacizi şi trei sunt codoni de terminare (codoni Stop) care opresc translaţia.

În măsura în care mai mulţi codoni codifică acelaşi aminoacid, codul genetic se numeşte degenerat sau redundant. Majoritatea AA sunt codificaţi de codoni sinonimi care diferă prin BA din poziţia a treia a codonului. În unele cazuri, un singur

ARNt poate recunoaşte doi sau mai mulţi din aceşti codoni sinonimi. Un exemplu este ARNt cu anticodonul AAG, care leagă fenilalanina recunoaşte nu doar UUC dar şi UUU.

Codul genetic este considerat "oscilant" atunci când se constată nerespectarea principiului complementarităţii pentru al treilea nucleotid al codonului.

Codonul AUG are două funcţii apropiate:

începe orice mesaj; astfel el semnalizează startul translaţiei plasând aminoacidul metionină la capătul amino terminal al polipeptidului care trebuie sintetizat.

când el apare în cadrul mesajului, orientează incorporarea metioninei. Codonul AUU care specifică izoleucina este codonul start pentru PK. Trei codonI UAA, UAG şi UGA, sunt semnale ale terminării translaţiei, deaceea se numesc codoni STOP. În genetica clasică

codonii stop aveau nume: UAG era amber, UGA era opal, iar UAA era ocru. Aceste nume erau numele de origine ale genelor specifice în care s-au detectat mutaţii ale codonilor stop.

Codul genetic standard este prezentat în tabelul nr...care prezintă fiecare aminoacid corespunzător celor 64 codoni specifici. Pentru elucidarea corespondenţei între codoni şi aminoacizii din proteină doi cercetători Gobind Khorana and Marshall W

Nirenberg au primit în 1968 Premiul Nobel pentru Fiziologie şi Medicină..

2.12.1.Degenerarea codului genetic

Mulţi codoni sunt degeneraţi sau redundanţi ceea ce înseamnă că doi sau mai mulţi codoni codifică acelaşi aminoacid. Codonii degeneraţi diferă tipic în poziţia a treia, de exemplu codonii GAA şi GAG codifică amândoi aminoacidul acid glutamic. Un codon este numit de patru ori degenerat dacă orice nucleotid este în poziţia a treia a codonului pentru un anumit

aminoacid; sau este numit de două ori degenerat dacă doar două din cele patru nucleotide posibile (una dintre purine A/G sau una dintre pirimidine C/T) sunt în poziţia a treia a unui codon care specifică acelaşi aminoacid (Tabelul 1.).

Degenerarea codului genetic face posibilă existenţa mutaţiilor silenţioase.

Al doilea nucleotid

U C A G

U

UUU Fenilalanina (Phe)

UCU Serina (Ser)

UAU Tirozina (Tyr)

UGU Cisteina (Cys)

U

UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys C

UUA Leucina (Leu)

UCA Ser UAA STOP UGA STOP A

UUG Leu UCG Ser UAG STOP UGG Triptofan (Trp) G

C

CUU Leucina (Leu)

CCU Prolina (Pro)

CAU Histidina (His)

CGU Arginina (Arg)

U

CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg C

CUA Leu CCA Pro CAA Glutamina

(Gln) CGA Arg A

CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg G

A

AUU Izoleucina (Ile)

ACU Treonina (Thr)

AAU Asparagina (Asn)

AGU Serina (Ser) U

AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser C

AUA Ile ACA Thr AAA Lysine

(Lys) AGA Arginine

(Arg) A

AUG Methionina (Met) sau START

ACG Thr AAG Lys AGG Arg G

G

GUU Valina Val GCU Alanina

(Ala) GAU Acid aspartic

(Asp) GGU Glicina

(Gly) U

GUC (Val) GCC Ala GAC Asp GGC Gly C

GUA Val GCA Ala GAA Acid glutamic

(Glu) GGA Gly A

GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly G

Tabelul 1. Codonii ARN

Tabelul 2 prezintă codonii care specifică fiecare din cei 20 aminoacizi implicaţi în translaţie. Acesta se numeşte tabelul cu codonii inverşi. De exemplu, codonii GAU şi GAC reprezintă aminoacidul asparagină (Asp), iar cisteina (Cys) este codificată de codonii UGU şi UGC.

Ala A GCU, GCC, GCA, GCG Leu L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG

Arg R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG

Lys K AAA, AAG

Asn N AAU, AAC Met M AUG

Asp D GAU, GAC Phe F UUU, UUC

Cys C UGU, UGC Pro P CCU, CCC, CCA, CCG

Gln Q CAA, CAG Ser S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU,AGC

Glu E GAA, GAG Thr T ACU, ACC, ACA, ACG

Gly G GGU, GGC, GGA, GGG Trp W UGG

His H CAU, CAC Tyr Y UAU, UAC

Ile I AUU, AUC, AUA Val V GUU, GUC, GUA, GUG

Start AUG, GUG Stop UAG, UGA, UAA

Tabelul 2. Codonii ARN inversaţi

Degenerarea este necesară pentru că doar datorită ei se pot produc suficient de mulţi codoni diferiţi pentru a codifica cei 20

aminoacizi plus un codon start şi un codon stop (cel puţin 22 codoni sunt necesari). Există patru BA diferite iar codonii trebuie să poată produce cel puţin 22 codoni diferiţi. De exemplu dacă s-ar folosi doar două BA pentru un codon s-ar putea codifica doar 16 AA (4²=16). Deoarece sunt necesari cel puţin 22 codoni se produc codoni tripletici astfel încât 4³ fac 64, ceea ce este un număr de codoni posibili.

Această proprietate a codului genetic face posibilă tolerarea mutaţiilor punctiforme. De exemplu codonii de patru ori degeneraţi pot tolera orice mutaţie punctiformă în poziţia a treia; codonii de două ori degeneraţi pot tolera una din trei mutaţii punctiforme posibile în poziţia a treia.

Doar doi AA sunt specificaţi de un singur codon; unul dintre aceştia este metionina specificat de codonul AUG, care are semnificaţia de codon start al transcripţiei; iar celălalt este triptofanul, specificat de codonul UGG.

2.12.2 Cadrul de citire al secvenţei

Un "codon" este definit de poziţia start. De exemplu secvenţa GGGAAACCC, dacă se citeşte de la prima poziţie conţine codonii GGG, AAA şi CCC, dacă se citeşte de la poziţia a doua conţine codonii GGA şi AAC (codonii parţiali se ignoră) iar dacă citim start-ul de la poziţia a treia, GAA şi ACC.

Fie care secvenţă de ADN poate fi citită în trei cadre de citire fiecare dintre acestea produce secvenţe de AA radical diferite (în

exemplul nostru, Gly-Lys-Pro, Gly-Asp, şi Glu-Thr). Cadrul secvenţei proteice este translat începând cu codonul start, respectiv AUG în secvenţa ARN. Mutaţiile strică cadrul de

citire (de exemplu inserţiile sau deleţiile pentru una sau două nucleotide) determinnd anomalii ale funcţiei proteinei; acestea sunt extrem de rar descoperite in vivo deoarece sunt letale.

2.12.3. Originea codului genetic

Numeroase variaţii ale codului genetic standard au fost găsite la mitocondrii. Protozoarele ciliate au câteva variaţii ale codului genetic: UAG şi adesea UAA codifică Glutamina (variantă găsită în unele alge verzi), iar UGA codifică Cisteina. O altă variantă este găsită la unele specii de candida unde CUG codifică Serina.

La alte specii de bacterii câţiva AA non-standard sunt substituiţi de codonii standard stop; UGA poate codifica selenocisteina iar UAG poate codifica pirolizina.

În afară de câteva excepţii, codul genetic folosit pentru toate formele de viaţă de pe Terra este similar. Teoria evoluţiei sugerează că codul genetic s-a stabilit foarte devreme în istoria vieţii. Selecţia naturală determină alinierea

codonilor din codul genetic ceea ce minimalizează efectul erorilor genetice (mutaţii).

CAPITOLUL 3

CONCEPTUL DE GENĂ MECANISME ALE EXPRESIEI GENICE

3.1. Istoria şi definirea genei

1866 - În urma unor riguroase observaţii asupra unei plante (mazărea), Gregor Mendel stabilea existenţa unor elemente

autonome şi reproductibile care controlează caracterele ereditare de la o generaţie la alta. Aceste particule, elemente autonome au fost numite ―unităţi ale eredităţii” sau ―factori ereditari”. Sutton (1903) şi Boveri (1904) (independent unul de altul) elaborau ipoteza amplasării genelor pe cromosomi. 1909 - Biologul danez Wilhem Johannsen (1857 - 1927) denumeşte aceste particule “gene”. El denumeşte genotipul ca

fiind totalitatea informaţiei genetice prezente într-un organism iar fenotipul ca expresie fizică a genotipului. 1910 - Morgan formulează Teoria cromosomială a eredităţii care aduce precizări la definirea genei, ―o genă – un caracter‖. 1902 - Archibald Garrod stabileşte prima relaţie între o genă şi o enzimă, pornind de la observaţiile privind anomalia

metabolică numită alcaptonuria. El susţine că maladiile metabolice sunt consecinţa absenţei unor enzime şi demonstrează caracterul familial al acestor maladii, deci caracterul lor ereditar.

1941 - George Wells Beadle şi Edward Tatum, demonstrează, prin studiul unor microorganisme, corespondenţa dintre genă şi

enzimă. 1949 – chimistul Linus Pauling (1901 – 1994) – este primul care aduce o explicaţie moleculară unei boli genetice: anemia

falciformă, stabilind ca patogenie o mutaţie în hemoglobină şi astfel conceptual ―o genă – o enzimă― se reformulează ca ―o genă - o proteină‖.

1957 – Vernnon Ingram demonstrează că în cadrul anemiei falciforme numai lanţul al Hb a suferit o mutaţie punctiformă, conceptul ―o genă – o proteină‖ se lărgeşte: ―o genă – un lanţ polipeptidic‖.

Definiția moleculară actuală a genei: La nivel molecular, gena este definită ca un fragment de ADN, care conține

informația ereditară necesară pentru sinteza unui ARN sau a unui lanț polipeptidic. Gena a fost considerată unitatea structurală și unitatea funcțională a eredității, unitate de replicare, de recombinare și unitate de mutație.

Studiile efectuate în ultimele decenii au arătat că într-o mare măsură au rămas valabile principiile formulate la începutul secolului XX, dar azi se cunoaște faptul că o singură genă poate duce la sinteza mai multor proteine, nu este obligatoriu ca o anumită genă să fie o entitate distinctă, existând în genomul uman gene suprapuse sau gene în interiorul altor gene.

La începutul secolului XX, noile descoperiri citologice permit elaborarea “Teoriei cromosomiale a eredităţii” Morgan şi echipa lui (Sturtevant, Muller, Bridges) folosesc pentru experimente musculiţa de oţet (Drosophila) care oferă

condiţii ideale de studiu: are 4 perechi de cromosomi mari, uşor de diferenţiat la microscop, cromosomii sexuali sunt, la fel ca cei ai speciei umane, XX la sexul feminin şi XY la sexul masculin, succesiune rapidă a generaţiilor).

Teoria cromosomială a eredităţii stabileşte relaţia dintre cromosomi şi factorii ereditari descrişi de Mendel: Se descoperă fuziunea gameţilor în cursul fecundaţiei, existenţa cromosomilor şi comportamentul lor în cursul mitozei

şi a meiozei. Comportamentul cromosomilor este corelat cu cel al factorilor mendelieni în cursul meiozei şi al fecundării Factorii ereditari asociaţi cromosomilor sunt numiţi gene. Studiul eredităţii legate de sex permite prima localizare a unei gene pe un cromosom. Morgan stabileşte că un caracter va fi transmis diferit la descendenţi dacă gena normală sau cu mutaţie este purtată de tată

sau de mamă. Această transmitere se explică prin localizarea genei pe cromosomul X (ereditatea legată de X). Studiul şi observarea modului de transmitere a mai multor gene situate pe acelaşi cromosom permite formularea noţiunii de

legătură genetică. Existenţa mai multor gene este pusă în evidenţă la Drosophilă pe baza fenotipurilor rezultate în urma mutaţiilor provocate.

Studiul recombinărilor între genele linkate (legate într-un grup) i- a permis să precizeze dispoziţia liniară a genelor pe cromosomi şi să realizeze harta genică la Drosophilă.

Observarea chiasmei în timpul meiozei permite postularea existenţei de schimburi fizice între cromatidele cromosomilor omologi, fenomen numit crossing over.

Frecvenţa schimburilor (crossing over) este cu atât mai crescută cu cât distanţa dintre gene este mai mare, procentul de recombinare nepuînd depăşi 50 % În urma încrucişărilor a două gene situate pe loci omologi pot apare fenotipuri recombinate la descendenţi.

Resultatele experimentelor efectuate de echipa lui Morgan aduce precizări la definiţia genei:

Gena este unitatea funcţională a materialului genetic. Gena determină realizarea unui caracter. Gena este o unitate de mutaţie. ea este susceptibilă de a suferi o schimbare, determinând o alelă nouă. Această alelă

determină o variaţie a caracterului respectiv. Gena este o unitate de recombinare. Două alele ale unei gene pot fi schimbate în cursul meiozei, prin crossing over

între cromatidele cromosomilor omologi. Genele sunt dispuse liniar pe cromosom. Gena ocupă o poziţie determinată, un locus, pe un cromosom precis. Unele gene învecinate au tendinţa de a rămâne asociate, transmiţându-se împreună la descendenţi (fenomen de

înlănţuire genică – linkage).

O teorie similară fusese avansată anterior de Weismann, apoi de Sutton (1903) şi Boveri (1904), teorie care nu a fost însă acceptată la acel moment.

Chiar Morgan s-a numărat printre opozanţi urmând ca propriile date experimentale să-l conducă la aceleaşi concluzii, pe care le formulează sub numele de Teoria cromosomială a eredităţii (1910).

Pentru cercetările sale, în anul 1933 Morgan primeşte premiul Nobel pentru medicină şi fiziologie.

3.2. Alelia multiplă

Alelia multiplă: existenţa în populaţie a mai multor fenotipuri posibile pentru o trăsătură particulară şi a mai mult de 2 alele

pentru acest fenotip. Fenomenul de existenţă a mai multor variante alelice pentru acelaşi locus se mai numeşte polialelie sau polimorfism alelic. Pentru a evita confuzia de termeni revenim cu definirea noţiunilor de poligenie şi pleiotropism. Poligenia = expresia unui caracter poligenic este determinată de un număr variabil de gene, situate pe diferiţi cromosomi. Pleiotropismul = în contrast cu poligenia, unele gene au efect pleiotrop = mecanismul prin care o genă se implică în

constituirea mai multor caractere pe diferite organe şi aparate. Un individ nu are decât 2 dintre aceste alele, pentru un anumit caracter, moştenind câte o alelă de la fiecare părinte. Alelele noi, diferite, sunt consecinţa mutaţiilor intervenite în decursul evoluţiei filogenetice şi creează o largă variabilitate în

populaţie, conferind, în unele situaţii - o adaptabilitate particulară în funcţie de tipul genei respective. Conceptul de polialelie se referă la nivelul popoulaţional, un individ posedînd la nivelul unui locus o sigură genă alelă din cele

care există în populaţie. Aproximativ 30% din genele umane sunt di-alelice (există în două forme), restul de 70% sunt mono-alelice. Extrem de puţine sunt poli-alelice având mai mult de două forme. Acesta caracteristică este foarte importantă pentru sistemul imun. Exemple . de alelie multiplă :

Sistemul ABO Complexul major de histocompatibilitate (CMH)

. Sistemul ABO Sistemul ABO este considerat sistem cu alelie multiplă pentru că există mai mult de 2 posibilităţi de a alege alele pereche

pentru un locus. Există 4 grupuri de sânge posibile: O, A, B şi AB. Sistemul este controlat de o genă tri-alelică i, IA şi IB care controlează structura proteinelor, mai exact alelele controlează

producţia de antigene de pe suprafaţa eritrocitelor.Aceste alele generează deci 6 genotipuri:

FENOTIP GENOTIP

A AA sau AO

B BB sau BO

AB AB

O OO

Complexul major de histocompatibilitate (CMH) Unul dintre importantele grupuri alelice din genomul uman îl constitue CMH implicat în sistemele majore de apărare, de

reactivitate a organismului. Studiile pentru descrierea CMH au fost răsplătite în 1980 cu premiul Nobel. Genele CMH au un înalt polimorfism alelic fiind cunoscute câteva sute de alele polimorfe în populaţie (pentru regiunea HLA-A

fiind identificate 250 de haplotipuri, pentru HLA-B 500 de haplotipuri iar pentru locusul DR sunt cunoscute 300 de alele.

3.3. Structura genei 3.3.1. Structura genei la eucariote (EK)

Structura genei la eucariote este extrem de complexă, având mai multe elemente structurale necesare expresiei genelor. În genomul uman, aproximativ 1/5 din totalul genelor sunt gene care specifică proteinele necesare transportului membranal şi

pentru generare de energie; aceste gene sunt cunoscute ca gene housekeeping şi sunt localizate în regiunile ADN-ului bogat în nucleotide C G.

Celelalte 4/5 din genele genomului se află în regiunile ADN mai bogate în A = T şi sunt funcţionale în mod specific fiecărui ţesut. În general, fiecare genă structurală are o secvență nucleotidică ce formează cadrul de citire al genei, care pornește de la un

codon inițiator și se termină la un codon stop. La ambele capete ale cadrului de citire se găsesc secvențe nucleotidice noncodante, de diferite mărimi și cu funcții diferite. La capătul 5‘ se află secvențe nucleotidice cu rol de promotor, iar la capătul 3‘ se află secvențe terminale.

Elementele structurale ale unei gene la eucariote sunt: regiunea promotor, urmată de o regiune transcrisă, dar care nu participă la translație, denumită "regiunea netradusă" 5 'UTR. Urmează apoi exonul inițial care conține codonul start. În urma exonului inițial, urmează alternanța exon-intron, urmată de un exon de încheiere, care conține codonul stop. Acesta este urmat de o altă regiune necodantă denumită "regiunea netradusă" 3 'UTR. Gena se termină cu un semnal de poliadenilare (PolyA): nucleotide cu adenină repetate de mai multe ori.

3.3.2. Structura genei la procariote (PK) Gena la procariote este constituită din secvenţe nucleotidice codante neîntrerupte, dispuse liniar şi care vor determina

aranjarea tot liniară a AA în lanţul polipeptidic, stare denumită coliniaritate. Caracteristica specifică de organizare a genelor este reprezentată de termenul policistron. Astfel, genele care specifică proteine sau enzime pentru o aceeaşi activitate metabolică sunt plasate adiacent, între promotor

şi terminator, constituind o unitate de transcripţie, denumită operon. Consecinţa acestei aranjări este un reglaj genic mai eficient, descris ca teoria operonului (detalii la reglajul genic). Gena atât la procariote, cât şi la eucariote are aceeaşi organizare generală, având o regiune reglatoare - promotor, şi o

regiune care este transcrisă ORF (open reading frame).

Promotor: ARN polimeraza - legătura cu unele subunităţi: Cutia TATAAT Factorul proteic specific (sigma) Punctul de start al transcripţiei Situl de legare la ribozom secvenţa specifică Shine-Dalgarno (AGGA) Regiunea codantă: secvenţa AA în proteină punct start al translaţiei (AUG) punct stop al translaţiei (UAA, UAG, UGA) Punct stop al transcripţiei

3.3.3. Structura genei la eucariote ( EK ) in comparaţie cu procariotele ( PK) Nu este organizată în operon Polimerizarea la capătul 5’ şi poliadenilarea la 3’ Transportul ARNm în afara nucleului Efecte în stabilitatea şi eficienţa translaţiei Posedă introni Matisarea poate fi alternativă Insulele CpG în jurul regiunii promotor

Sunt implicate în metilare şi apariţia mutaţiilor 3.4. Organizarea bidirecţională a genelor şi gene parţial suprapuse

Genomurile simple au o densitate mare de gene (1 genă/0,5kb, în mitocondriile umane, 1 genă/1 kb la E. Coli etc), genele fiind parţial suprapuse. În vederea sintezei proteice pot fi folosite diferite cadre de citire, de pe o catenă de ADN.

Genele din organismele complexe sunt mai puţin aglomerate (numai 1 genă/100 kb în genomul nuclear uman) iar fenomenul de suprapunere genică este mult mai rar. Totuşi, ocazional, se întâlnesc gene foarte apropiate, unele având catenele 5‘ separate numai de câteva sute de nucleotide, aceste gene fiind transcrise în sens opus pe catenă.

Asemenea organizare genică bidirecţională, apare adeseori în cazul genelor care codifică enzime implicate în repararea ADN .

Aglomerările genice (‖Cluster-ul‖ genic) apar îndeosebi în regiunile bogate in GC, aici apărând şi genele suprapuse. De exemplu, genele care codifică HLA clasa III, localizate cromozonul 6p21.3 prezintă o densitate crescută (aproximativ 1

gena/15kb), determinând o suprapunere genică.

3.4.1. Gene in interiorul genelor

O particularitate a genelor pentru ARN mic nucleolar: sunt localizate in interiorul altor gene, adesea în interiorul genelor care codifică o proteină asociată ribozomilor sau o proteină nucleolară.

Probabil că acest aranjament s-a mentinut pe parcursul evoluţiei pentru a permite coordonarea producţiei componentelor ARN şi proteice ale ribozomilor .

Alte exemple de gene localizate în intronii unor gene mai mari: gena pentru NF tip I (3 gene interne mici transcrise în sens opus, acestea sunt în cadrul intronului 27 al genei ) gena pentru factorul VIII al coagulării ( 2 gene interne mici, în intronul 22 al genei ) gena pentru retinoblastom (o singură genă internă )

3.4.2. Unităţi de transcripţie policistronice:

-se întîlnesc frecvent în genomurile simple. -în genomul uman asemenea unităţi sunt menţionate în genomul mitocondrial şi în „clusters‖ de gene pentru ARNr. -în genomul uman nuclear exista unitati de transcripţie bicistronice: transcripţia incepe la nivelul unei gene şi continuă cu gena invecinată, formindu-se un precursor proteic ce va fi ulterior clivat şi vor rezulta proteine diferite .

Lanţurile A şi B ale insulinei se consideră a fi derivate dintr-o unitate de transcripţie bicistronică, ele fiind strâns înrudite dpdv funcţional.

În alte cazuri unităţile de transcripţie bicistronice generează proteine cu funcţii distincte. De exemplu, genele UBA52 şi UBA80 codifică ubiquitina şi respectiv proteinele ribozomale S27a sau L40 . Alte gene care codifică ubiquitina sunt organizate ca secvenţe codante (fără introni) repetate în tandem.

3.5. Familii de gene

Un procent important de gene umane care codifică fie polipeptide, fie ARN non-codant sunt membre ale familiilor de gene care prezintă un grad crescut de similitudine ale secvenţelor nucleotidice.

Familiile de gene care codifică proteine pot fi clasificate în funcţie de gradul şi extinderea înrudirii secvenţelor între membrii familiei de gene.

Totuşi există variaţii ale extinderii secvenţelor comune, precum şi ale organizării membrilor familiilor de gene. Mulţi membri pot fi non-funcţionali (pseudogene şi fragmente de gene) şi pot acumula diferenţe în secvenţele nucleotidice. Genele din familia de gene pot fi organizate în “clustere” mici, pot fi larg dispersate sau ambele. Genele care formează familia de gene pot fi plasate alăturat, în ―clusters‖ pe acelaşi cromosom sau localizate pe cromosomi

diferiţi: familii de gene organizate într-un singur “cluster”. Aceste gene se pare că au apărut prin duplicaţii ale genelor în tandem. Ele pot fi organizate astfel: o organizare în tandem: genele sunt puternic înrudite dpdv al secvenţializării şi funcţiei. Ex. gene pt. ubiquitină, gene pt.

ARN (ARNr etc.).

o “clustering” apropiat: genele nu sunt repetate chiar în tandem dar sunt foarte apropiate şi pot fi reglate de aceeşi regiune de control. Aceste gene prezintă similaritate dar multe gene din această familie pot fi pseudogene.

o “cluster” compus: în unele familii de gene, genele nu sunt foarte apropiate iar ―cluster‖-ul poate conţine şi gene care au structură şi funcţionalitate diferită. Ex. Complexul de gene HLA de pe cromosomul 6p21.3 este dominat de genele HLA clasele I şi II, gene care codifică fracţiuni ale complementului, dar aceste gene sunt separate de gena pentru 21-hidroxilază.

familii de gene organizate în “clustere” multiple. Ele pot fi: - aşezate alăturat, pe acelaşi cromosom, ca rezultat al unei duplicaţii recente. Ex.: Gene care determină atrofia

musculară spinală. - plasate pe 2 sau mai multe locaţii cromosomiale. Ex. Familia de gene pentru receptorul olfactiv ( 900 membri, în

peste 25 locaţii cromosomiale). familii de gene dispersate Genele din cadrul unor familii sunt dispersate pe diferiţi cromosomi şi au secvenţe nucleotidice relativ diferite. Ex.: există

peste 40 de loci pt. genele care codifică produşi implicaţi în hipoacuzie.

3.5.1. Familii de gene clasice Membrii familiilor clasice de gene prezintă un grad ridicat de omologie a secvenţelor nucleotidice. Exemple: - familia de gene pentru histone - familia de gene pentru lanţurile globinice ale Hb Familii de gene care codifică produşi cu domenii mari, înalt conservate În cadrul unor familii de gene există omologie numai pentru anumite secvenţe nucleotidice, din anumite regiuni puternic

conservate. Exemplu: familia de gene care codifică factorii de transcripţie – rol în dezvoltarea embrionară. Familii de gene care codifică domenii proteice mici (scurte) Membrii altor familii de gene prezintă secvenţe scurte, nu par să fie înrudiţi la nivelul secvenţelor nucleotidice dar codifică produşi care au

funcţii comune.

3.5.2. Superfamiliile de gene

Membrii superfamiliilor de gene codifică produşi care sunt înrudiţi din punct de vedere funcţional într-un sens general, având o omologie redusă pentru un anumit segment, fără a codifica domenii proteice conservate în mod semnificativ.Exemplu:

superfamilia Ig este o familie mare, care cuprinde genele pentru Ig, receptorii cel. T, HLA etc. Genele codifică produşi implicaţi în funcţionalitatea sistemului imunitar şi conţin domenii Ig-like.

superfamilia pentru lanţuri globinice: o familie mică care include gene pentru şi globine precum şi gene care codifică mioglobina şi neuroglobina.

3.6. Pseudogene

Pseudogene, copii truncate ale genelor şi fragmente de gene se găsesc frecvent în familiile de gene Familiile de gene care codifică polipeptide sau ARN-uri prezintă adeseori:

copii defective (pseudogene) ale tuturor secvenţelor genei funcţionale copii defective doar ale secvenţelor codante copii truncate (cărora le lipsesc capetele 5‘ sau 3‘) fragmente interne (uneori doar un singur exon) Exemple de tipuri de pseudogene : pseudogene neprocesate prezente într-un “cluster”. Anumite ―clustere‖ deţin copii genice defective, care au fost copiate

prin duplicaţii genice în tandem. Copiile conţin secvenţe corespunzătoare promotorului, exonilor, intronilor, dar au codoni stop inadecvaţi. Ex. pt. “clusterele” genice ale şi globinelor (pseudogenă şi respectiv ).

gene truncate sau fragmente din interiorul genelor sunt prezente în ―clusterul‖ pentru genele HLA. În acest cluster au fost identificate: 6 gene exprimate, 4 pseudogene, 5 copii truncate şi 2 mici fragmente din interiorul genei. Ac. familie de gene a apărut prin duplicaţii în tandem iar fragmentele genice au rezultat în urma crossing-over-ului nelegitim şi a schimbului inegal între cromatidele surori.

pseudogenele neprocesate într-o familie dispersată de gene sunt exemplificate de secvenţele asemănătoare genei NF1 şi pentru rinichiul polichistic al adultului (PKD1). Genele sunt localizate pe 17q 11.3, pericentromeric, respectiv pe 16p13.3, subtelomeric. În cazul genei NF1 există cel puţin 11 pseudogene neprocesate sau copii de fragmente distribuite pe 7 cromosomi diferiţi. Gena PKD1 prezintă o copie truncată, replicată de 3 ori şi plasată pe 16p13.1

pseudogene procesate în cadrul fam. de gene dispersate Fam. de gene dispersate prezintă adeseori copii genice defective. Aceste copii se pot găsi în număr foarte mare în genom (

se cunosc peste 2000 copii pentru unele gene).

3.6. Dogma centrală a geneticii moleculare F. Crick (1958) emite ipoteza transmiterii unidirecţionale a mesajului informaţional genetic de la ADN la proteine, prin

intermediul ARN-m, menţionând că este imposibil transferul de informaţie de la ADN direct la proteine şi în sens invers. Această afirmaţie a devenit unanim acceptată, fiind supranumită "Dogma centrală a geneticii moleculare" şi notată sintetic:

Transcripţie Translaţie ADN ARNm Proteină Replicare semiconservativă

Temin – studiază mecanismul de oncogeneză virală prin retrovirusuri (virusuri cu ARN) şi avansează o nouă ipoteză de transcriere a informaţiei genetice de la ARN-ul viral la ADN. Ipoteza făcea referiri directe la un posibil mecanism de formare a unui ADN monocatenar, complementar cu ARN-ul viral şi prin care s-ar permite integrarea retrovirusurilor în ADN-ul gazdei.

Confirmarea acestei ipoteze - în 1970 de Temin şi Baltimore (pentru care au fost răsplătiţi cu premiul Nobel), care au demonstrat existenţa transcrierii inverse a informaţiei genetice, de la ARN la ADN în cazul virusurilor cu genom constituit din ARN.

În acelaşi timp s-a descoperit şi existenţa în genomul retrovirusurilor şi a celulelor canceroase a enzimei revers-transcriptaza (sau transcriptază inversă), care joacă rol important în transferul de informaţie de la ARN la ADN şi în polimerizarea noii catene de ADN.

Descoperirea transcrierii inverse a dus inerent la revizuirea şi reformularea dogmei centrale. Astfel, în 1970, F. Crick concluzionează că transcrierea inversă nu infirmă dogma centrală, dar că aceasta din urmă necesită o

reformulare, respectiv o nouă viziune asupra posibilităţilor de transfer informaţional, sumarizată astfel: transfer general, prezent în toate celulele cu genom ADN, care se face: ADN ARN proteine; transfer special, prezent numai în anumite circumstanţe, de la

ARN ADN ARNm proteine;

transfer (mai puţin cunoscut) de la proteină la ADN, prin produşii de sinteză ai unor gene structurale, care interacţionează specific cu ADN-ul în reglajele genice.

3.7. Mecanismele expresiei genice

Expresia genei este coordonată la nivel molecular de intervenţia mai multor structuri şi mecanisme. Exemplu: procesul transcripţiei este condiţionat de: - funcţionalitatea normală a promotorului - elementele reglatorii din genă - introni - capacitatea de excizie a fragmentelor de ARNm - capacitatea de asamblare a ARN matur

- în unele situaţii şi de amprenta genomică

3.7.1. Expresia monoalelică

Pentru majoritatea genelor, ambele alele se exprimă la nivel molecular. Pentru unele gene poate apare o expresie monoalelică, respectiv se va exprima fie alela maternă, fie alela paternă. Acest fenomen este denumit excluzie alelică şi determină un fel de hemizigoţie funcţională. Expresia monoalelică poate fi împărţită în 2 categorii:

1. In funcţie de originea parentală a genei = fenomen de amprentare genomică 2. Independentă de originea parentală, prin represie ―întâmplătoare‖ a unei alele. În acest grup se încadrează:

Excluderea alelică prin inactivarea unui cromosom X la sexul feminin. Excluderea alelică prin rearanjarea ADN-ului (mecanism întâlnit în sinteza imunoglobulinelor) Excluderea alelică prin mecanisme necunoscute.

3.7.2. Amprenta genomică Pentru majoritatea bolilor genetice nu contează dacă gena sau cromozomul defect este moştenit de la tată sau de la mamă,

efectul fenotipic fiind acelaşi. Totuşi este posibil ca unele gene sau regiuni cromozomiale să aibă efect diferit în funcţie de originea parentală (maternă sau paternă) a materialului genetic. Expresia deiferită a genei în funcţie de origine este rezultatul fenomenului de numit amprentare genomică. Ea este definită ca mecanismul prin care o genă din perechea alelică se exprimă diferit fenotipic în funcţie de provenienţa maternă sau paternă. Acest fenomen constituie şi o abatere de la legile clasice ale eredităţii formulate de Mendel.

Amprentarea genomică (imprinting) este un fenomen de reglare genică care determină un efect specific în expresia genei. Existenţa acestui fenomen demonstrează că în perioada embrionară este nevoie de ambele alele (maternă şi paternă) pentru ca procesul de dezvoltare să fie normal. Expresia fenotipică diferită constă în:

1. debut variabil al bolii (moment cronologic); astfel de exemple sunt neurofibromatoza şi distrofia miotonică, în care dacă gena patologică este moştenită pe linie maternă, debutul bolii este mai precoce.

2. intensitate de manifestare şi severitate diferită. De exemplu în neurofibromatoză şi distrofia miotonică dacă gena patologică este moştenită pe linie maternă evoluţia este mai severă. În alte situaţii, de exemplu în boala Huntington şi în ataxie-telangiectazie dacă gena patologică este moştenită pe linie maternă expresia fenotipică este mai redusă.

3. două boli (sindroame) total diferite. Exemplul cel mai bun este al celor două sindroame Prader-Willi şi Angelman, cu microdeleţii la nivelul cromosomului 15, anomalii care se încadrează în evidenţierea mutaţiei genice la nivel cromosomial.

- deleţia 15q11-q12 de origine paternă este responsabilă de sindromul Prader-Willi caracterizat fenotipic de nanism, disgenezie gonadică, hipotonie musculară, retard mental etc

- deleţia 15q11-q12 de origine maternă antrenează sindromul Angelman în care fenotipic apar o dismorfie facială particulară, afectare neurologică (ataxie), dispoziţie ―happy‖, tulburări de vorbire, retard mental sever etc.

Există situaţii în care mutaţia genei care este implicată în mecanismul de amprentare se răsfrânge şi asupra unor gene învecinate, antrenând modificări cromosomiale structurale (frecvent microdeleţii, mai rar microduplicaţii).

Aceste microdeleţii sau microduplicaţii sunt vizibile şi detectate microscopic la nivel de cromosom. În funcţie de întinderea mutaţiei acestea pot fi uneori vizibile prin tehnici standard de bandare cromosomială dar cu siguranţă sunt evidenţiate prin tehnica specială de bandare de înaltă rezoluţie şi prin metoda FISH.

În toată patologia genică există numai câteva situaţii în care mutaţia genei antrenează şi modificări morfologice cromosomiale: 1. sindroamele cu instabilitate cromosomială 2. sindroamele cu microdeleţie şi microduplicaţie 3. sindroamele cu X-fragil.

Mecanismul amprentei genomice se transmite conform modelului mendelian şi a fost evidenţiat la mai multe gene patologice situate pe cromosomii 7, 11, 14, 15.

3.8. Baza genetică a relaţiei genă-proteină

Primul nivel de expresie al informaţiei codificate în genă este nivelul biochimic (sinteza de proteină). Există un paralelism între structura genei (ADN) şi structura lanţului polipeptidic (structura proteinei)

ADN - 3 nivele de structură Proteina – 3 nivele de structură

Structura primară = înşiruirea liniară a nucleotidelor 3 baze azotate= 1 codon CONCLUZIE: existenţa parale-lismului numit COLINEARITATE Mutaţia în structura primară priveşte: a. 1 sau 2 nucleotide din codon

(minus, plus, substituirea sau inversia unui nucleotid cu altul)

b. 1 codon întreg (minus, plus, substituţie de codon)

c. mai mulţi codoni până la întreaga genă

Structura primară = secvenţe liniare de AA în lanţul polipeptidic

1 AA din lanţul polipeptidic Mutaţie în lanţul polipeptidic lanţ patologic:

- minus AA - plus AA - substituţie de AA

Structura secundară ADN

- se realizează prin legături de H

Structura secundară a proteinei - se realizează tot prin legături de H

Structura terţiară ADN Structura terţiară (spaţială) a proteinei – este realizată prin legături disulfidice între AA, plasate în anumite situsuri; determină structura spaţială esenţială pentru funcţionalitatea normală a proteinei. Formarea lanţurilor disulfidice este condiţionată de secvenţele normale de AA în structura primară. Orice modificare în structura primară induce modificări în structura terţiară obţinandu-se o proteină cu structură

şi funcţie modificate

Tabel 6. Paralelismul dintre structura genei şi proteinelor Concluzii : Structura primară a proteinei este unică, specifică şi constantă pentru fiecare proteină. Structura primară este determinată genetic prin informaţia din genă. Structura primară imprimă specificitatea de specie; de exemplu insulina bovină sau porcină diferă de insulina umană doar

prin câţiva aminoacizi, suficient pentru a induce fenomene de respingere. Tratamentul diabetului zaharat cu aceste tipuri de insulină a generat complicaţii, astăzi insulina umana este sintetizată prin tehnologii ale ingineriei genetice, evitându-se fenomenele de sensibilizare. Mutaţiile genice determină modificarea secvenţei unui/unor codoni antrenând o modificare a structurii proteinei, care

reprezintă substratul patogenic al unei boli moleculare. Se descriu 3 categorii de efecte în acţiunea unei gene: efectul primar (la nivel molecular), efectul secundar (la nivel celular) şi

efectele terţiare multiple (pleiotropism). Această relaţie genă-proteină poate fi demonstrată în toate bolile moleculare iar dintre acestea Hb-patiile umane sunt un

exemplu elocvent:

1. substituţia în codon sens la nivelul genei pentru lanţul al Hb substituţia unui nucleotid în codonul sens alt codon sens (codon missense) care va specifica alt AA

în lanţul , poziţia 6, acidul glutamic este înlocuit cu valina

Hb este patologică, nu mai are structură spaţială normală, deaceea apare modificarea formei hematiei (seceră). Aceasta are tendinţă la hemoliză precoce şi aderarea hematiilor de pereţii vasculari în microcirculaţie determinand infarcte tisulare. În concluzie un singur nucleotid înlocuit este responsabil de o boala severa.

2. substituţia în codon sens codon non-sens(STOP)

scurtarea lanţului polipeptidic cu un

nr. de AA; ex. talasemii

3. substituţia în codon non-sens (STOP) codon sens

alungirea lanţului polipeptidic cu un

nr. de AA; ex: Hb CS (Constant Spring

4. deletia de 1-2 nucleotide in codon sens structurarea codonului după deleţie

substituţii multiple de AA (mutaţie în frame-shift); ex. talasemii

5. deleţia unui codon întreg- ex. gena CFTR implicată în mucoviscidoză

deleţia unui AA; în proteina CFTR- absenţa unui AA (mutaţia F508)

6.deleţia parţială de genă Ex. miodistrofia Duchenne

7. deleţia totală de genă Ex. absenţa lanţului în talasemii

În practica medicală curentă este esenţială cunoaşterea secvenţei nucleotidice în gena care produce o boală moleculară deoarece diagnosticul genotipic prenatal sau postnatal precoce permite depistarea acestei boli încă din stadiul asimptomatic şi în unele situaţii aplicarea unui tratament ţintit (terapie genică), care va corecta defectul şi va înlătura consecinţele bolii.

3.9. Excepţii ale relaţiei “o genă – un polipeptid”

Dezvoltarea posibilităţilor de analiză a structurii moleculare a genei a evidenţiat o serie de fenomene care nu respectă relaţia fundamentală ―o genă – un polipeptid‖.

Prima excepţie “o genă – mai multe polipeptide” este determinată de intervenţia unor mecanisme în diferitele etape ale expresiei genice (transcripţie, matisare, translaţie, procesare post-translaţională a proteinei). Mecanisme care determină această excepţie: Matisarea alternativă.

Aşa cum s-a precizat, deja, majoritatea genelor EK au structură mozaicată fiind formate din introni şi exoni. Pentru unele gene matisarea ARNm din preARNm are loc într-un singur mod, intronii sunt excizaţi iar exonii sunt legaţi unul

după altul, în urma translaţiei rezultând o singură proteină. Pentru alte gene, însă, modalităţile de matisare diferă, în funcţie de ţesut, stadiul de dezvoltare sau statusul fiziologic al celulei.

Una din modalităţile de procesare este matisarea alternativă: mecanismul prin care sunt generate mai multe forme de ARNm matur de pe aceeaşi genă. Acesta este un mecanism reglator prin care variaţiile în încorporarea exonilor în ARNm determină producerea mai multor proteine înrudite sau izoforme sau chiar proteine complet diferite ca funcţie.

o Ex. de proteine izoforme : cele 4 tipuri de bază ale mielinei o Ex. de proteine diferite : gena pentru calcitonină este procesată diferit în tiroidă şi SNC. In tiroidă produsul

este calcitonina iar în SNC este un peptid înrudit cu calcitonina, cu rol de neurotransmiţător.

Folosirea alternativă a unuia dintre promotorii multipli: informaţia deţinută de aceeaşi genă determină formarea unor proteine izoforme cu diferite proprietăţi şi specificitate tisulară, exprimate în diferite perioade ontogenetice şi având diferite funcţii.

Alegerea promotorilor nu este întâmplătoare, ci este dependentă de intervenţia unor factori trans-regulatori, unii având specificitate tisulară.

De exemplu gena distrofinei are cel puţin 8 promotori: 4 sunt specifici pentru cortexul cerebral, muşchi, cerebel, limfocite. Alegerea lor va determina sinteza a 4 proteine izoforme mari ale distrofinei, diferite între ele prin capătul amino-terminal. Alţi 4 promotori sunt localizaţi în structura zonei centrale a genei. Transcripţia pornind de la aceşti promotori foloseşte doar o parte din exoni izoforme mici de distrofină, prezente în rinichi, retină, celulele Schwann. Clivarea posttranslaţională: mecanismul intervine după sinteza polipeptidului, acesta fiind secţionat în mai multe polipeptide de dimensiuni mai mici. Fenomenul este întâlnit în cazul sintezei unor hormoni dintr-un prohormon, polipeptid de dimensiuni mari.

A doua excepţie “mai multe gene – un polipeptid”, este evidentă în cazul polipeptidelor alcătuite din regiuni diferite. De exemplu lanţurile uşoare (L) şi grele (H) ale imunoglobulinelor prezintă o regiune variabilă (V) – care constituie situl de recunoaştere şi fixare a antigenului şi o regiune constantă (C). Cele două regiuni (V şi C) sunt specificate de gene diferite, situate pe acelaşi cromosom. Aceste gene se rearanjează (prin recombinare somatică) în timpul diferenţierii limfocitelor B, formând o secvenţă completă funcţional care codifică lanţul respectiv al imunoglobulinelor.

3.10. Pleiotropismul

Pleiotropismul se caracterizează prin efecte fenotipice multiple, diverse, în mai multe sisteme, organe şi funcţii, determinate de o singură genă (dominantă) sau de o pereche de gene (recesive).

Exemple de boli în care se manifestă pleiotropismul: sindromul Marfan, neurofibromatoza, osteogeneza imperfecta (dominant autosomale), anemia Fanconi, sindromul Bloom, ataxia telangiectazia, fibroza chistică, sindromul Biedl-Bardet etc (recesiv autosomale).

Sindromul Marfan se caracterizează prin trei categorii de manifestări clinice: Modificări scheletale (membre lungi, degete lungi şi efilate (arahnodactilie), hiperlaxitate articulară (având drept

consecinţă luxaţiile frecvente), deformaţii ale coloanei vertebrale (cifoză, scolioză) sau ale sternului etc. Modificări oculare: subluxaţie/ectopie de cristalin, vicii severe de refracţie etc Modificări cardiovasculare: anevrisme ale aortei, prolaps de valvă mitrală etc.

Modificările fenotipice din sindromul Marfan sunt consecinţa unei singure mutaţii genice, mutaţie care determină un defect în

structura primară a fibrilinei, componentă majoră a ţesutului conjunctiv. Manifestările multiple caracteristice sindromului sunt produse, deci, prin alterarea ţesutului conjunctiv în diferitele teritorii în care este prezent şi au o legătură patogenică şi un mecanism comun. În astfel de situaţii pleiotropismul este relaţional.

Pentru alte numeroase afecţiuni în care este evident pleiotropismul, legătura dintre diferitele manifestări nu este nici evidentă şi nici explicabilă. În aceste situaţii se vorbeşte de un pleiotropism nerelaţional.

Astfel, în sindromul Biedl-Bardet, pe lângă hipogonadism sunt prezente: polidactilie, obezitate, hipoacuzie, chiar surditate, retinopatie, retard mental ş.a. fără ca între aceste manifestări să existe o legătură patogenică evidentă. Aceste modificări apar succesiv, la vârste diferite şi au o cauză comună: sunt produse de o mutaţie recesivă (homozigoţie).

În practica medicală curentă sindroamele cu pleiotropism ridică probleme în stabilirea diagnosticului deoarece nu întotdeauna sunt prezente toate modificările descrise. Unele se pot manifesta în evoluţie, mai târziu, altele pot lipsi, datorită unei expresivităţi variabile.

Un alt exemplu îl constituie grupul de boli monogenice, recesiv autosomale, în care sunt prezente şi anomalii citogenetice consecutive mutaţiei. Aceste boli sunt incluse în grupul denumit generic sindroame cu instabilitate cromosomială: anemia Fanconi, sindromul Bloom, ataxia telangiectazia ş.a.

De exemplu, în anemia Fanconi sunt evidente: statura mică, hipoplazii osoase (în special ale radiusului), pancitopenie, hiperpigmentaţia tegumentelor ş.a.

În ataxie telangiectazie sunt prezente: afectare cerebeloasă, dilataţii ale pereţilor vasculari, retard mental, imunodeficienţă etc. (vezi capitolul Sindroame cu instabilitate cromosomială).

Printre numeroasele boli recesiv autozomale, una dintre cele mai răspândite în patologia copilului este mucoviscidoza, în care de asemenea, pleiotropismul genic este foarte evident. Astfel, tabloul clinic este marcat de tulburări pulmonare în grade variabile de expresivitate, chiar insuficienţă pulmonară, insuficienţă pancreatică exocrină, tulburări digestive şi tulburări electrolitice ale sudorii. Boala se caracterizează şi printr-o largă heterogenitate alelică, fiind prezente în populaţie mai multe forme alelice, fiecare determinând un tablou clinic mai mult sau mai puţin sever (alte aspecte vor fi discutate în capitolul Boli metabolice).

Capitolul 4

MATERIALUL NUCLEAR CROMOZOMIAL

Organizarea materialului genetic este diferită în interfază faţă de diviziune. Cromozomii (în diviziune), respectiv cromatina (din interfază), reprezintă două forme morfologice reversibile ale aceluiaşi

material nuclear-cromozomial.

Materialul nuclear = cromozomi cromatina cromozomial (în diviziune) (în interfază)

4.1. Compoziţia cromatinei

La eucariote ADN-ul se asociază cu proteine şi formează un complex numit cromatină. Proteinele sunt de tip histone şi nonhistone.

4.1.1. Tipuri de cromatină

Indiferent de stadiul ciclului celular, în cromatină ADN-ul este asociat cu proteine. Diferenţele care apar sunt datorate plicaturării diferite după legarea ADN-ului de histone. În fazele ciclului celular cromatina apare cu grade diferite de condensare distingându-se două tipuri morfo-funcţionale :

eucromatina şi heterocromatina.

Heterocromatina

Intens colorată, relativ condensată, compactă, genetic inactivă, se replică tardiv, înalt metilată, cu câteva gene active. Este de două tipuri: constitutivă – totdeauna heterocromatică (ex. la nivelul centromerelor, telomerelor), de obicei formată din secvenţe

repetitive, noncodante; facultativă : ex. X inactiv (uneori heterocromatică, depinde de ţesut, de moment cronologic).

Eucromatina

Colorată luminos, mai puţin condensată, replicată precoce în faza S a diviziunii celulare, hipometilată. Cu activitate transcripţională, este statusul obişnuit al majorităţii ADN-ului în timpul interfazei. ADN-ul trebuie să fie eucromatic

pentru a fi activ, dar nu toată eucromatina este activă genetic. Adesea eucromatina este divizată în câteva niveluri distinctive de plicaturare şi funcţionalitate.

Sensibilitate la DN-ază. Diferitele stadii ale cromatinei pot fi distinse prin efectul produs de tratarea cu DN-ază. Un nivel crescut al plicaturării va determina o sensibilitate relativă la degradarea cu diferite DN-aze.

4.2. Împachetarea ADN-ului şi structura supramoleculară a cromatinei

Desfăşurată, molecula de ADN are o lungime de 2 m. Pentru a putea fi cuprinsă în spaţiul nuclear, molecula suferă procese de împachetare, compactare, plicaturare.

Primul nivel de împachetare este reprezentat de nucleosom care este şi unitatea fundamentală primară, structură periodică a cromatinei.

Nucleosomul este constituit din : un miez octameric format din 4 perechi de proteine histonice (H2A, H2B, H3, H4); ADN lung de 146 nucleotide înfăşurat de 2 ori în jurul octamerului protejând miezul histonic.

Nucleosomul este unitate de repetare, formându-se un lanţ ―beads of string‖ sau fibra de cromatină de 10 nm. Constituirea acestui lanţ necesită ADN de legătură între doi nucleosomi şi H1. Histona1 este implicată în superspiralizarea nucleosomului, ADN-ului internucleosomal şi împachetarea lor în fibra de cromatină. ADN-ul linker conţine 50-60 pb şi este cel mai expus şi cel mai sensibil la acţiunea nucleazelor.

Fibra de cromatină de 10 nm este unitatea care se repetă formându-se un lanţ şi are o rată de împachetare de 7 şi reprezintă 1/7 din lungimea de ADN.

Al doilea nivel de împachetare este fibra de 30 nm formată prin aranjarea în sole-noid a nucleosomilor (6 nucleosomi/pas de spirală şi 1/42 din lungimea ADN).

Pentru realizarea unui nivel superior de împachetare fibra de 30 nm formează bucle (domenii) în jurul unui schelet proteic celular rezultând o fibră de 300 nm (1/750 din lungimea ADN). Buclele sunt "întinse" atunci când are loc transcripţia. Buclele laterale împreună cu scheletul proteic se vor plicatura pentru a realiza un nivel superior care apare ca fibră de 700 nm din cromatidă, la începutul profazei.

Aglomerările de bucle sunt denumite cromomere şi pe măsură ce cromozomul se condensează cromomerele vecine formează o structură mai mare, banda cromo-zomială condensată şi colorată (G+).

Astfel pe cromozom vor alterna benzi condensate şi colorate (G+) cu benzi mai puţin condensate şi colorate (G-). În timpul metafazei condensarea este maximă şi reprezintă 1/15000-1/20000 din lungimea totală a ADN-ului.

Capitolul 5

LOCALIZAREA GENELOR PE CROMOZOMI

Cartografierea genelor pe cromozomii umani se poate realiza prin două metode: cartografierea genetică (obţinerea hărţii genetice) şi cartografierea fizică (obţinerea hărţii fizice).

Cartografierea genetică constă în stabilirea tendinţei ca două gene să segrege împreună în meioză şi să se transmită înlănţuite de la părinţi la descendenţi. Acest tip de cartografiere foloseşte studiul fenomenului de înlănţuire şi recombinare genetică (crossing over), care are loc în meioză, pentru stabilirea poziţiei relative a genelor pe cromozom.

Harta genetică reprezintă poziţiile relative ale genelor pe un cromozom, pe baza frecvenţei de recombinare meiotică între două segmente de ADN.

Cartografierea fizică constă în localizarea reală a genelor pe cromozomi folosind anumiţi markeri şi diferite metode de analiză cromozomială şi moleculară, care permit stabilirea distanţelor dintre markeri.

Harta fizică reprezintă poziţiile reale ale genelor pe fiecare cromozom, ordinea şi distanţa dintre ele, măsurate în pb. Ţelul final al cartografierii fizice este să stabilească integral secvenţele nucleotidice liniare la nivelul fiecărui cromozom.

5.1. Cartografierea genetică

5.1.1. Analiza de înlănţuire

Se consideră două gene care ocupă doi loci (A şi B), situaţi fie pe cromozomi diferiţi, fie pe aceeaşi pereche de cromozomi. În situaţia în care locii A şi B sunt situaţi pe cromozomi diferiţi, genele alele Aa şi Bb segregă independent în meioză şi formează 4 tipuri de gameţi: AB, Ab, Ba, ab, în proporţie egală (25%). În cazul în care locii A şi B sunt situaţi pe aceeaşi pereche de cromozomi, segregarea lor în meioză depinde de distanţa dintre loci. Genele nealele situate aproape una de alta, pe acelaşi cromozom nu segregă în meioză şi au tendinţa de a se transmite cel mai adesea împreună, în succesiunea generaţiilor. Acest fenomen poartă denumirea de înlănţuire genică (linkage) şi se referă la loci şi nu la alele.

Genele dintr-o regiune cromozomică, care se transmit împreună formează un grup de înlănţuire sau un haplotip. Dacă cei doi loci A şi B sunt situaţi foarte aproape ei au tendinţa de a se transmite împreună (înlănţuire genică), formând gameţi AB şi ab. Dacă locii A şi B se află la distanţă mai mare unul de celălalt, între ei se poate realiza crossing over iar genele alele Aa şi Bb pot forma combinaţii noi: 2 gameţi vor fi nerecombinaţi, AB şi ab şi 2 recombinaţi, Ab şi Ba (recombinare genică omoloagă).

Distanţa genetică ce separă 2 loci de pe acelaşi cromozom este constantă, independentă de alelă şi de familia studiată. Această distanţă influenţează frecvenţa recombinărilor şi poate fi măsurată prin evaluarea frecvenţei de recombinare. Frecvenţa de recombinare este dată de proporţia descendenţilor recombinanţi în raport cu numărul total de descendenţi.

Unitatea de măsură a distanţei genetice dintre 2 loci este denumită Morgan.

Un centiMorgan (cM) este distanţa genetică în care se produc recombinări cu o frecvenţă de 1%. Analiza de înlănţuire genică se poate efectua prin studii familiale, comparând genotipurile descendenţilor cu cele ale părinţilor.

Reprezintă o metodă valoroasă de cartografiere a unor gene, permiţând stabilirea prezenţei unor gene pe acelaşi cromozom (sintenie), a ordinii şi distanţei dintre ele. Analiza de înlănţuire genică se bazează pe studiul segregării în familie a unei gene mutante şi a unui marker genotipic.

Locii-markeri utilizaţi în cartografierea genetică trebuie să fie codominanţi, numeroşi, distribuiţi în toate regiunile fiecărui cromozom şi să aibă un grad ridicat de polimorfism. În genetica medicală analiza de înlănţuire este utilizată pentru iden-tificarea şi localizarea genelor responsabile pentru o anumită boală ereditară, mai ales când nu este cunoscut efectul lor biochimic. Analiza permite

detectarea prezenţei unei gene mutante urmărind transmiterea în familie a unui locus marker. În acest mod se poate stabili un diagnostic

presimptomatic (evidenţierea genei mutante la indivizi la care gena nu se exprimă fenotipic) datorită penetranţei scăzute sau tardive sau un

diagnostic antenatal.

5.2. Cartografierea fizică

Cartografierea fizică se realizează în două etape: localizarea globală a unei gene pe un anumit cromozom şi apoi localizarea regională, din ce în ce mai precisă, la nivelul acelui cromozom. Metodele utilizate sunt diferite în funcţie de nivelul de rezoluţie:

Metode de analiză citogenetică: hibridarea celulară somatică; dozajul genic; hibridizarea in situ (FISH);

Metode de cartografie de înaltă rezoluţie

5.2.1. Metode de analiză citogenetică

Hibridarea celulară somatică – nivel de rezoluţie cromozomial Prin fuziunea celulelor provenite de la specii diferite (exemplu om-şoarece) se formează hibrizi celulari somatici interspecifici.

Hibrizii obţinuţi au tendinţa de a pierde în primele diviziuni, preferenţial, majoritatea cromozomilor umani. După câteva generaţii se formează clone celulare stabile, ce păstrează fiecare anumiţi cromozomi umani, identificaţi prin marcaj individual. Se realizează astfel câteva seturi de clone de hibrizi, deosebite prin numărul de cromozomi umani. Aceste seturi sunt utilizate pentru cartografierea genică.

Urmărind evoluţia celulelor hibride în mitoză, s-a observat că în timpul fiecărei diviziuni se elimină preferenţial câte o pereche din cromozomii umani. Mecanismul eliminării preferenţiale a cromozomilor umani nu este încă cunoscut. Evidenţiindu-se cariotipul după

fiecare diviziune şi efectuându-se în paralel o serie de teste biochimice, s-a observat corespondenţa constantă între dispariţia unei perechi de cromozomi şi înce-tarea sintezei unor produşi proteici. Cu alte cuvinte, s-a relevat corelaţia dintre încetarea sintezei unor proteine şi eliminarea unei anumite perechi de cromozomi. Aceasta a condus logic la stabilirea amplasării locusurilor genelor respective pe cromozomi.

Datorită faptului că ultimul cromozom care se elimină este cromozomul X (proces determinat, probabil, de momentul replicării ADN-ului), până astăzi sunt cunoscute numeroase locusuri genice pe acest cromozom. Din multitudinea acestora notăm: genele pentru factorii VIII şi IX ai coagulării, genele pentru vizibilitatea culorilor roşu şi verde ("gene daltonice"), gena pentru grupa eritrocitară Xg, gena pentru enzima G6PD, gena pentru boala Lesch-Nyhan, gena pentru miodistrofia Duchenne şi respectiv forma sa alelică pentru miodistrofia Becker, gena pentru albinismul ocular, gena (gene?) pentru Ig, gene implicate în etiologia unor boli de piele, gene cu rol în procesul sexualizării etc.

Metoda hibrizilor celulari interspecifici este folosită pentru determinarea sinteniei dintre gene (prezenţa lor pe acelaşi cromozom) şi localizarea unui grup de înlănţuire pe un anumit cromozom. Această metodă clasică va avea o putere de rezoluţie mai mare dacă se realizează hibrizi folosind celule umane cu anomalii cromozomiale structurale. În acest caz se poate stabili localizarea genică subcromo-zomială, delimitând poziţia genei pe o anumită regiune a cromozomului.

Dozajul genic: metoda se bazează pe stabilirea diferenţelor cantitative de ―dozaj‖ ale produsului unei gene pe clone celulare conţinând un număr diferit de cromozomi.

Această metodă a fost utilizată pentru localizarea unor gene pe cromozomul 21, pe linii celulare de la pacienţii cu sindrom Down (evaluarea activităţii enzimei SOD1) sau pentru localizarea unor gene pe cromozomul X, folosind clone celulare cu 1, 2, 3 sau 4 cromozomi X.

Hibridizarea moleculară in situ: este o metodă directă de localizare a unei gene, deja identificate şi clonate. Nivelul de rezoluţie corespunde unei regiuni de 1-2 milioane pb dintr-un cromozom metafazic. Sonda marcată (secvenţa de AND clonat) se fixează pe regiunea complementară de AND, situată într-o anumită regiune cromozomială.

5.2.2. Metode de cartografie de înaltă rezoluţie

Permit localizarea fină a genelor şi se bazează pe tehnicile de AND recombinant. Foarte pe scurt, etapele utilizate de aceste metode sunt:

Secţionarea AND dintr-o regiune cromozomică prin endonucleaze de restricţie, obţinând fragmente de anumită dimensiune. Segmentele se clonează în vectori adecvaţi pentru mărimea lor (YACs, BACs, cos-mide, plasmide, realizând biblioteci sau bănci de

fragmente ale aceluiaşi cromozom. Se analizează fragmentele dintr-o colecţie identificând anumite repere şi sec-venţele suprapuse. Fragmentele vecine (care au suprapuneri) se ordonează pentru a forma o secvenţă continuă de AND.

Aceste etape au fost realizate în cadrul proiectului Genomul uman, prin eforturile conjugate ale marilor centre de cercetare americane şi europene.

Secvenţa continuă de ADN este analizată prin alte tehnici de genetică moleculară pentru a identifica genele dispuse la nivelul fiecărui cromozom.

Capitolul 6

MECANISMELE REGLAJULUI GENIC REGLAREA ACTIVITATII GENELOR LA EUCARIOTE

Reglajul genetic la eucariote este complex, datorat următoarelor aspecte: molecula de ADN este legată de histone; genele sunt discontinue; sinteza ARNm parcurge etapa de matisare (eliminarea intronilor); sinteza proteică se realizează în citoplasmă iar ARNm migrează din nucleu spre citoplasmă.

Reglarea expresiei genice implică o multitudine de factori ce intervin în mai multe etape şi se realizează prin două tipuri principale de reglaj:

reglaj genetic, pe termen scurt - cunoscut şi sub numele de reglaj adaptativ, bazat pe mecanisme moleculare reversibile, reprezentate de modificări în acti-vitatea unor gene, ce determină fluctuaţii în intensitatea sintezei de ADN, ARN şi proteine;

reglaj genetic pe termen lung - este de regulă ireversibil şi implică fenomene legate de diferenţierea celulară. Acţionează în cursul dezvoltării ontogenetice, este cunoscut şi sub numele de reglaj programat, este întipărit în memoria celulei, este ereditar şi stabil.

Reglarea expresiei genice se realizeză la mai multe nivele sau în mai multe etape: reglarea globală a expresiei genice (reglarea pretranscripţionala); reglarea transcripţională; reglarea postranscripţională; reglarea translaţională; reglarea posttranslaţională.

6.1. Reglarea globală a expresiei genice (reglarea pretranscripţională)

Se realizează printr-o serie de mecanisme, unele incomplet elucidate, dintre care enumerăm: 1. semnalizarea localizată dependentă de poziţia celulei; 2. modificări în structura cromatinei.

Semnalizarea localizată dependentă de poziţia celulei – intervine în cursul embriogenezei şi al organogenezei, când unele gene sunt activate specific, determinând dezvoltarea particulară a anumitor celule.

Modificări în structura cromatinei

Moleculele de ADN sunt complexate/legate de histone formând fibre de cromatina. Pentru iniţierea transcripţiei, factorii

proteici de reglare trebuie să aibă acces la promotorul genei. Acest proces se realizează prin modificari ale histonelor (metilare,

acetilare, fosforilare) şi metilarea ADN-ului, mecanisme care determină modificări ale structurii cromatinei, mai ales în regiunile

eucromatice.

În regiunile decondensate ale cromatinei (eucromatina) proteina H1 se găseşte în cantităţi mici, în timp ce restul proteinelor

histonice se găsesc în cantitate normală, proteina H1 având rol important în condensarea cromatinei.

Metilarea ADN (în special în regiunile CpG, localizate mai frecvent la nivelul promotorului) determină represia transcripţiei,

inhibând legarea unor factori de trans-cripţie la secvenţele ţintă, secvenţele care vor fi transcrise activ necesitând demetilare.

Modificările de metilare a ADN-ului au un rol şi un loc important în dezvoltarea embrionară precoce.

Metilarea ADN asociată cu dezacetilarea histonelor creşte gradul de compactare a cromatinei, reprezentând mecanismul principal

de represie a transcripţiei.

6.2. Reglarea transcripţională

Reglarea transcripţională constă în reglarea activităţii ARN-polimerazei II (implicată în formarea ARNm), cu realizarea

interacţiunii dintre factorii transreglatori (anumite proteine) cu elementele cis-reglatoare (secvenţe specifice de ADN), interacţiune

care determină transcripţia specifică a unor anumite gene, în funcţie de necesarul de moment (care genă va fi transcrisă, în ce

moment şi cât timp).

Iniţierea transcripţiei este influenţată de anumite secvenţe situate la distanţă de promotor. Acestea sunt denumite enhancers,

deoarece majoritatea tind să activeze sau să crească transcripţia. Se pare că mai puţine secvenţe reduc activitatea promotorului.

Secvenţele de tip enhancer sunt rare în bacterii.

Enhancerii se leagă de anumite proteine şi împreună vor facilita formarea complexului transcripţional.

Enhancer-ul este un tip de secvenţă reglatoare în ADN-ul eucariotelor (rar la procariote), care poate fi localizată la o distanţă mare

în amonte sau în aval de promotorul pe care îl influenţează, uneori chiar în intron.

Legarea anumitor proteine de enhancer stimulează rata transcripţiei genei.

Enhancerii au activitate dependentă de ţesut. S-a dovedit că ei lucrează şi cu alţi promotori dar numai în ţesuturile în care gena

din care ei sunt derivaţi este activă în mod normal.

Promotorul este secvenţă de ADN care determină situl de iniţiere a transcripţiei pentru o ARN-polimerază, constituit din secvenţele

CG, CAAT, TATA (vezi structura genei).

Unele gene au 2 sau mai mulţi promotori care pot fi utilizaţi alternativ pro-ducând izoforme diferite ale unei proteine. Selectarea promotorilor este un meca-nism de reglare transcripţională.

Elemente situate proximal de promotor: orice secvenţă reglatoare în ADN-ul eucariotelor localizat aproape de un promotor (P) (până la 200 pb) şi care se leagă de o proteină specifică, modulând transcripţia. Multe gene sunt controlate de mai multe elemente situate proximal de promotor.

Regiune de control a transcripţiei: termen folosit pentru toate secvenţele reglatoare cis care reglează transcripţia unei anumite gene. Elementele cis-reglatoare = secvenţe scurte de ADN care permit fixarea factorilor de transcripţie specifici (factori transreglatori).

Factor de transcripţie: termen general pentru orice proteină, alta decât ARN-polimerază sau componente polipeptidice, necesară pentru iniţierea sau reglarea transcripţiei în celulele eucariote. Factorii generali necesari pentru transcripţia tuturor genelor, participă la formarea complexului de iniţiere a transcripţiei lângă situl start. Factorii specifici stimulează sau în unele cazuri reprimă transcripţia unor anumite gene prin legarea de elementele lor reglatoare (de ex. enhancer sau elemente proximale promotorului).

Elemente de specificitate tisulară: localizate în amonte de promotor, activitatea lor este influenţată de factori externi: hormoni, factori de creştere, AMPc.

Factorii de transcripţie au o structură modulară, prezintă 2 situsuri specifice, unul de fixare la ADN şi altul de legare a unor molecule cu rol reglator.

Iniţierea transcripţiei este cea mai importantă modalitate de control a expresiei genelor la EK. Factorii specifici implicaţi în control includ:

puterea elementului promotor ale diferitelor gene; prezenţa sau absenţa elementelor enhancer; interacţiunea dintre multiplele proteine activatoare sau inhibitoare.

Există diferenţe importante privind structura genelor la EK şi PK, care vor determina diferenţe ale reglajului genic între EK şi

PK. Dintre aceste diferenţe menţionăm :

la EK genele sunt formate din exoni şi introni;

promotorii din genele bacteriilor sunt compacţi;

promotorii genelor la EK tind să fie dispersaţi pe o porţiune mai întinsă (lungă) din ADN.

Controlul iniţierii transcripţiei la EK:

Transcripţia diferitelor clase de ARN-uri la EK are loc cu ajutorul diferitelor ARN-polimeraze:

ARN-polimeraza I cu rol în sinteza ARNr (cu excepţia tipului 5s);

ARN-polimeraza II cu rol în sinteza ARNm şi unele ARNsn;

ARN-polimeraza III cu rol în sinteza ARNr tip 5s şi ARNt.

Majoritatea ARN-urilor la EK vor fi procesate post transcripţional. Cele mai complexe mecanisme de control la EK sunt cele

care reglează expresia genelor transcrise cu ajutorul ARN-polimerazei II. Genele la EK au o structură complexă constând din

secvenţe codante (exoni), secvenţe non-codante (introni), două tipuri de promotori precum şi diferite domenii de reglare

transcripţională.

Elementele promotor sunt:

cutia CAAT;

cutia TATA.

Cutia TATA se află la 25-35 pb în amonte de situl de iniţiere a transcripţiei şi este similară cu cutia "Pribnow" de la PK.

Au fost identificate numeroase proteine denumite TF II A,B,C etc. (factori de transcripţie care reglează ARN-polimeraza II) care

interacţionează cu cutia TATA.

Cutia CAAT se află la 70 pb în amonte de situsul de iniţiere a transcripţiei. Proteina denumită C/EBP va interacţiona cu cutia

CAAT.

În genele din ARNm-urile diferitelor gene se găsesc şi alte secvenţe reglatoare care vor lega diverşi factori de transcripţie.

Aceste secvenţe reglatoare sunt plasate predominant în amonte de situl de iniţiere a transcripţiei, dar unele se pot găsi şi în aval sau

chiar în interiorul genei.

Numărul şi tipul elementelor reglatoare diferă de la genă la genă. Diferite combinaţii ale factorilor de transcripţie pot

determina efecte reglatoare diferite asupra situsului de iniţiere.

Combinaţiile dintre factorii de transcripţie sunt diferite, în funcţie de tipul celular acestea reprezentând mecanismul major pentru

reglarea expresiei genice în funcţie de specificitatea celulară.

6.3. Reglarea posttranscripţională

Reglarea posttranscripţională este reprezentată de mecanismele care asigură maturarea moleculei de ARNm. La organismele superioare cel mai frecvent mecanism constă în matisarea alternativă a exonilor şi poliadenilarea preARNm.

1. Procesarea transcriptului primar şi modificarea sa : La EK, ARNm trebuie să adiţioneze secvenţa "cap" şi "coadă poli A", iar intronii trebuie îndepărtaţi cu acurateţe. Au fost

identificate anumite gene pentru care are loc procesul de matisare alternativă (cu specificitate de ţesut), generând formarea de proteine diferite pornind de la informaţia codificată într-o singură genă. (vezi curs transcripţia genei). Ex. Prin matisare alternativă a exonilor genei care specifică calcitonina, în tiroidă se va sintetiza calcitonina iar în neuroni un peptid înrudit cu aceasta, având rol de neurotransmiţător.

2. ARNm procesat trebuie să părăsească nucleul în vederea realizării procesului de translaţie.

3. Editarea ARNm: este forma de procesare în care se produc modificări specifice. Astfel, prin modificarea ARNm se vor produce proteine diferite ca lungime. Exemplu: ARNm pentru Apolipoproteina B produce în ficat Apo-B100 în timp ce în intestinul subţire produce Apo-B48, primii 48 de AA fiind identici cu cei ai Apo-B100. Apo-B48 apare datorită unei modificări într-un codon sens, care devine codon stop şi opreşte translaţia ARNm la AA cu numărul 48.

4. Stabilitatea transcriptului: spre deosebire de ARNm al PK (cu timp de înjumătăţire cuprins în general între 1-5 minute), la EK ARN-urile pot varia foarte mult ca stabilitate. Anumite transcripte primare instabile au secvenţe care reprezintă semnale pentru degradarea rapidă. Creşterea stabilităţii este determinată de lungimea secvenţei poliadenilice din regiunea 3‘.

6.4. Reglarea translaţională

Este un mecanism mai puţin cunoscut şi probabil puţin utilizat. Se apreciază că unele mecanisme implicate în acest tip de reglare influenţează stocarea ARNm.

Alte mecanisme implică recunoaşterea unor secvenţe cis-reglatoare din regiunile netranslate 5‘ UTR sau 3‘UTR. Exemplu: reglarea sintezei de feritină în funcţie de nivelul Fe: creşterea nivelului Fe va stimula producţia de feritină şi invers. La

nivel molecular, pe un element cis-reglator se va fixa o proteină care va sista temporar sinteza feritinei, în absenţa Fe. Iniţierea translaţiei: ARNm-urile prezintă multipli codoni care codifică metionina. Abilitatea ribozomilor de a recunoaşte şi iniţia

sinteza lanţului polipeptidic pornind de la codonul AUG corect, poate afecta expresia unui produs genic.

6.5. Reglarea posttranslaţională

După terminarea procesului de translaţie, numeroase polipeptide suferă o serie de modificări în urma cărora ele pot îndeplini funcţii specifice.

Modificările post-translaţionale mai frecvente includ: glicozilarea, acetilarea, fosforilarea, hidroxilarea, formarea legăturilor disulfidice etc.

Unele proteine, în special hormonii, suferă procese de clivare posttranslaţională, procese care permit activarea funcţiei lor. Transportul proteinelor: pentru ca proteinele să fie biologic active, este necesar ca după translaţie şi procesare să fie

transportate la locul lor de acţiune. Controlul stabilităţii proteinelor : multe proteine sunt rapid degradate în timp ce altele sunt foarte stabile. Anumite secvenţe de

AA pot să determine o degradare rapidă a proteinelor.

Capitolul 7

TRANSMITEREA MONOGENICĂ. LEGILE LUI MENDEL

Maria Puiu

7.1. Legile lui Mendel

Transmiterea caracterelor parentale la descendenţi se face pe baza legilor eredităţii, (Mendel, 1865, reevaluate la începutul sec. XX).

Ele si-au dovedit valabilitatea la toate vieţuitoarele, în ceea ce priveşte ereditatea transmisă monogenic. Mendel a efectuat experimente sistematice, pe mai multe soiuri de plante, pe baza cărora a descifrat modalităţile de transmitere a

caracterelor parentale la descendenţi. Ansamblul cercetărilor lui Mendel a permis elaborarea teoriei factorilor ereditari, numite şi legile lui Mendel (legile

eredităţii): ereditatea organismelor este determinată de factorii ereditari parentali vehiculaţi de gameţi; unele caractere ereditare deşi sunt moştenite nu se exprimă în toate generaţiile, dar se transmit neschimbate la următoarele

generaţii. Pentru a explica aceste fenomene, Mendel a presupus că fiecare caracter este determinat de factori ereditari în dublu exemplar,

care, în momentul formării gameţilor, se separă (segregă). Experimentele lui au constat în hibridări între două soiuri care se deosebeau fenotipic printr-o pereche de caractere

(monohibridare), prin două caractere (dihibridare) sau prin mai multe caractere contrastante (polihibridare). Încrucişând două soiuri de plante pure genetic (homozigote) şi care diferă între ele printr-un caracter, Mendel constituie generaţia parentală (P):

D D r r P

Dr Dr Dr Dr F1

În urma încrucişării a doi indivizi puri (homozigoţi), DD şi rr, în generaţia filială F1 au apărut hibrizi heterozigoţi genotipic (Dr), la care, în fenotip, era exprimat unul din caracterele plantelor din generaţia parentală (P). Plantele hibride din generaţia filială (F1) prezentau aşadar uniformitate fenotipică datorită exprimării numai a genei dominante (D), deci numai a uneia din genele perechii de alele.

Această constatare reprezintă prima lege a lui Mendel, lege care evidenţiază uniformitatea hibrizilor din generaţia F1. În timpul meiozei, alelele unei perechi se separă, ceea ce face ca gameţii să fie ―puri‖ din punct de vedere genetic; fiecare gamet va

purta deci numai una dintre genele alele (fie gena D, fie gena r), acestea distribuindu-se la întâmplare în celulele sexuale mature.

D r D r F1

DD Dr Dr rr F2 1/4 ½ 1/4

A doua lege a lui Mendel se referă la segregarea (disjuncţia) genelor prin încru-cişarea hibrizilor heterozigoţi din generaţia F1. Astfel, generaţia filială F2 va fi neuniformă fenotipic, o proporţie de 1/4 din descendenţi vor prezenta ambele alele recesive

(rr), deci vor manifesta fenotipic, datorită stării de homozigoţie, caracterul din prima generaţie parentală. În aceeaşi generaţie filială F2, o altă pătrime vor fi indivizi homozigoţi pentru caracterul dominant (DD) iar 1/2 dintre indivizi vor fi heterozigoţi (Dr), ca şi genitorii.

Din totalul indivizilor rezultaţi, 3/4 vor prezenta caracterul dominant iar 1/4 vor fi homozigoţi recesivi, astfel că în fenotipul lor apare din nou (segregă) caracterul recesiv moştenit. Se relevă deci că fiecare individ primeşte în mod egal material genetic de la genitori, dar genele pot fi diferite ca exprimare fenotipică (unele dominante, altele recesive).

A treia lege a lui Mendel exprimă libera combinare (asortare) a perechilor de alele, fiecare segregându-se independent faţă de celelalte perechi. Legea afirmă că în meioză genele care alcătuiesc diferite perechi de alele se asortează independent unele de altele. Prin aceasta se creează un plus de variabilitate, cu apariţia de genotipuri noi.

7.2. Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale. Bolile monogenice

Un caracter monogenic este determinat de acţiunea (sau interacţiunea) genelor dintr-o pereche alelică. Trăsăturile monogenice se transmit conform legilor lui Mendel trăsături „mendeliene‖. În patologia umană sunt descrise peste 6.000 de fenotipuri monogenice, din care aproximativ 4.500 sunt boli genice al

căror tablou clinic este bine cunoscut (Catalogul „Mendelian Inheritance in Man‖ - OMIM realizat de un colectiv de cercetători condus de Victor McKusick, 2000).

Aceste boli afectează aproximativ 1-2% din nou-născuţii vii şi au un impact deosebit asupra individului şi a familiei sale, fiind boli cronice, cu risc crescut de recurenţă la descendenţi.

7.3. Manifestări variabile ale mutaţiilor genice

Bolile monogenice prezintă particularităţile caracterelor ereditare descrise de Mendel, ceea ce teoretic face ca transmiterea lor să realizeze cel mai simplu model de transmitere şi să poată fi uşor de recunoscut după aspectul arborelui genealogic.

In realitate, numeroase boli cu transmitere monogenică ridică probleme de diagnostic şi fac dificil de calculat riscul de recurenţă, datorită variabilităţii expresiei fenotipice a mutaţiei.

Manifestările variabile ale mutaţiilor genice sunt fenomene incomplet elucidate şi pot imbrăca diferite aspecte, legate de: penetranţă; expresivitate; specificitate de organ; pleiotropism; heterogenitate genetică.

a. Penetranţa – este o noţiune cantitativă, aplicabilă bolilor dominante şi defineşte frecvenţa manifestărilor genei mutante în stare heterozigotă, în raport cu numărul de purtători ai genei anormale (DD, Dr).

Penetranţa poate fi: completă, când gena, în stare heterozigotă, se exprimă la toţi indivizii care o poartă; incompletă sau redusă, când se exprimă numai la unii dintre indivizii care o poartă; tardivă, când exprimarea genei în fenotip se face pe parcursul vieţii (în functie de vârstă, sex şi alţi factori de mediu).

Un exemplu de penetranţă redusă îl constituie ectrodactilia, caracterizată prin malformaţii ale degetelor. În cadrul aceleiaşi familii, expresia genei poate fi remarcată doar la unii dintre membri (în general penetranţa genei pentru ectrodactilie este de aproximativ 70%). In acest caz arborele genealogic poate îmbrăca aspectul transmiterii dominante neregulate, în care doi părinţi aparent sănătoşi pot avea copii bolnavi sau transmiterea este discontinuă, cu salturi peste o generaţie.

Penetranţa tardivă se referă la situaţia în care o genă dominantă se exprimă postnatal la o anumită vârstă. Astfel, în boala Huntington, debutul bolii se instalează în genere între 30-40 de ani. In acest caz penetranţa este un fenomen dependent de vârsta individului. Penetranţa genei pentru coreea Huntington este de 50% la vârsta de 40 de ani dar atinge 100% la vârsta de 70 de ani. Alte afecţiuni cu penetranţă tardivă: otoscleroza, guta.

b. Expresivitatea – este o noţiune calitativă, aplicabilă de asemenea bolilor dominante şi defineşte intensitatea manifestării fenotipice a mutaţiei genice. Manifestările fenotipice pot avea grade diferite de severitate în aceeaşi familie sau în familii diferite.

Fig. 7. 1. Arbore genealogic care surprinde penetranţa incompletă

a genei dominant autozomale

Expresivitatea variabilă este frecvent întâlnită în patologie şi poate îmbrăca aspecte diferite:

în afecţiunile dominante caracterizate prin anomalii unice, cum sunt polidactilia sau ectrodactilia, anomaliile pot fi prezente în aceeaţi

familie sau în familii diferite, la indivizi afectaţi unilateral, bilateral, numai la mâini, numai la picioare sau la toate membrele;

în afecţiunile dominante determinate de gene anormale cu efect pleiotrop pot exista indivizi care prezintă forma tipica a bolii

sau forme incomplete, cu manifestări fruste, subclinice. Aşa de exemplu, sindromul Marfan, boală mono-genică DA, cu tulburări

ale ţesutului conjunctiv, în care anomaliile din cele trei sisteme: scheletal, ocular şi cardio-vascular, cât şi severitatea tabloului

clinic variază în limite largi, de la un pacient la altul.

Recunoaşterea cazurilor cu manifestări reduse, monosimptomatice este esenţială pentru aprecierea riscului de recurenţă al

bolii. Expresivitatea variabilă a bolii se regăseşte de asemenea în neurofibromatoză, exostozele multiple şi în alte boli

monogenice.

expresivitatea variabilă a unor boli se poate manifesta prin predominanţa sau limitarea la unul dintre sexe. De exemplu,

hemocromatoza (DA) este de 10 ori mai frecventă la sexul masculin, guta este şi ea mai frecventă la bărbaţi, porfiria acută

intermitentă predomină la sexul feminin.

c. Specificitatea de organ este o noţiune calitativă ce caracterizează tipul şi localizarea efectelor fenotipice ale unei gene

mutante. Acest aspect se întâlneşte în unele familii cu boli dominant autozomale, de obicei afectând multiple, ţesuturi, organe. In boala

Rendu-Osler (telangiectazia hemoragică ereditară) tabloul clinic este dominat de hemoragii în diferite ţesuturi sau organe. In unele familii

indivizii afectaţi prezintă numai epistaxis sau numai hematurie.

d. Pleiotropismul Pleiotropismul se caracterizează prin efecte fenotipice multiple, diverse, în mai multe sisteme, organe şi funcţii, determinate

de o singură genă (dominantă) sau de o pereche de gene (recesive).

Exemple de boli în care se manifestă pleiotropismul: sindromul Marfan, neurofibromatoza, osteogeneza imperfecta (dominant autozomale), anemia Fanconi, sindromul Bloom, ataxia telangiectazia, fibroza chistică, sindromul Biedl-Bardet etc. (recesiv autozomale).

Sindromul Marfan se caracterizează prin trei categorii de manifestări clinice: modificări scheletale (membre lungi, degete lungi şi efilate (arahnodactilie), hiperlaxitate ariculară (având drept consecinţă

luxaţiile frecvente), deformaţii ale coloanei vertebrale (cifoză, scolioză) sau ale sternului etc.; modificări oculare: subluxaţie/ectopie de cristalin, vicii severe de refracţie etc.; modificări cardiovasculare: anevrisme ale aortei, prolaps de valvă mitrală etc.

Modificările fenotipice din sindromul Marfan sunt consecinţa unei singure mutaţii genice, mutaţie care determină un defect în structura primară a fibrilinei, componentă majoră a ţesutului conjunctiv. Manifestările multiple caracteristice sindromului sunt produse, deci, prin alterarea ţesutului conjunctiv în diferitele teritorii în care este prezent şi au o legătură patogenică şi un mecanism comun. În astfel de situaţii pleiotropismul este relaţional.

Pentru alte numeroase afecţiuni în care este evident pleiotropismul, legătura dintre diferitele manifestări nu este nici evidentă şi nici explicabilă. În aceste situaţii se vorbeşte de un pleiotropism nerelaţional.

Astfel, în sindromul Biedl-Bardet, pe lângă hipogonadism sunt prezente: polidactilie, obezitate, hipoacuzie, chiar surditate, retinopatie, retard mental ş.a., fără ca între aceste manifestări să existe o legătură patogenică evidentă. Aceste modificări apar succesiv, la vârste diferite şi au o cauză comună: sunt produse de o mutaţie recesivă (homozigoţie).

În practica medicală curentă sindroamele cu pleiotropism ridică probleme în stabilirea diagnosticului deoarece nu întotdeauna sunt prezente toate modificările descrise.

Unele se pot manifesta în evoluţie, mai târziu, altele pot lipsi, datorită unei expresivităţi variabile (vezi si curs 5).

e. Heterogenitatea genetică Variabilitatea expresivitatii genice este adeseori determinată de heterogenitatea genetică. Termenul de heterogenitate genetică se

referă la o boală genetică (un sindrom), în care tabloul clinic, simptomatic, poate prezenta variaţii de la un pacient la altul, în funcţie de tipul mutaţiei prezente în genotip.

În genetica clinică, în funcţie de cauzalitate, heterogenitatea genetică este împărţită în două categorii: heterogenitatea alelică şi heterogenitatea nonalelică (de locus).

Heterogenitatea alelică este starea în care pe un locus anume pot exista, la diferiţi pacienţi, diferite tipuri de mutaţii genice, ceea ce în genetica medicală este cunoscut sub numele de polimorfism alelic sau alelia multiplă. În aceste cazuri, variaţiile clinice (heterogenitatea clinică) sunt dependente de tipul mutaţiei alelice prezenta în acel locus.

Heterogenitatea alelică este frecvent întâlnită în bolile moleculare (erori înnascute de metabolism) şi în care, în funcţie de alela respectivă, tabloul clinic poate varia de la un bolnav la altul (exprimat mai blând sau mai sever).

În fibroza chistică au fost identificate sute de forme alelice. Cele mai numeroase variante alelice şi cu tot atâtea variaţii de exprimare au fost identificate în deficienţa de glucozo-6 fosfat dehidrogenaza (G6PD), în care pâna în prezent se cunosc peste 300 de forme alelice. Heterogenitatea alelică este observată şi în multe alte boli monogenice (tabel 1).

Heterogenitatea nonalelică (heterogenitatea de locus) rezultă din starea în care variaţia tabloului clinic la pacienţi cu acelaşi sindrom este generată de diferite mutaţii genice, plasate pe loci diferiţi (mutaţii nonalelice).

În diferitele variante de ichtioză, dermatoză ereditară cu tablouri clinice diferite, unele forme de boală fiind determinate de mutaţii cu transmitere dominant autozomală, altele cu transmitere recesiv autozomală, dar sunt descrise şi unele forme X-linkate.

În multiple alte boli genice heterogenitatea nonalelică este la fel de evidentă, existând astfel, în funcţie de tipul genei, pentru acelaşi sindrom (în cadrul formelor sale clinice) diferite moduri de transmitere: dominant autozomal, recesiv autozomal, sau legat de cromozomul X.

Astfel, Boala Alzheimer (demenţă progresivă) poate fi determinată de mutaţii specifice situate pe cromozomii 1, 14, 19, 21, boala polichistică renala a adultului (ADPKD) prezintă loci-boală pe cromozomii 4 sau 16.

Tabelul 1. Exemple de boli (sindroame) în care pot fi prezente variante ale heterogenităţii genetice

Boala Tipul heterogenităţii

Fibroza chistică Alelică

Osteogeneza imperfectă Alelică şi nonalelică

Deficienţa de glucozo 6-P-dehidrogenaza Alelică

Distrofiile musculare Duchenne şi Becker Alelică

Homocistinuria Alelică şi nonalelică

Mucopolizaharidozele Alelică şi nonalelică

Beta talasemia Alelică

Boli lizozomale de stocare Alelică şi nonalelică

Rinichiul polichistic al adultului Alelică şi nonalelică

Boala Alzheimer (demenţa presenilă) Alelică şi nonalelică

Retinita pigmentară Nonalelică

O serie de boli din patologia umană se caracterizează prin prezenţa ambelor tipuri de heterogenitate genetică, astfel încât, variaţiile simptomatice pot fi tributare formelor alelice posibile, dar în acelaşi timp, boala poate fi generată de mutaţii genice de pe locusuri diferite (heterogenitatea nonalelică).

7.4. Transmiterea autozomală

Transmiterea autozomală se referă la expresia fenotipică a genelor plasate pe cromozomii autozomi.

7.4.1. Dominanţa autozomală (DA)

O genă autozomală dominantă se exprimă fenotipic atât în stare homozigotă cât şi în stare heterozigotă. În forma homozigotă expresia fenotipică este, de regulă, mai puternică.

În situaţia în care unul dintre părinţi prezintă fenotipic un caracter dominant, gena fiind în heterozigoţie, iar celălalt părinte este indemn (homozigot pentru alele normale, respectiv nu prezintă acel caracter), raportul dintre numărul descendenţilor care vor prezenta caracterul şi numărul celor indemni este de 1:1; ca atare, jumătate din descendenţi (indiferent de sex) vor prezenta fenotipic trăsătura dominantă.

Dacă ambii părinţi sunt heterozigoţi pentru o genă dominant autozomală, raportul dintre descendenţii afectaţi şi indemni este de 3:1; 75% din descendenţi vor prezenta deci fenotipic trăsătura iar din acest procent, 1/3 vor fi homozigoţi (respectiv 25% din totalul descendenţilor).

Dacă unul dintre părinţi este homozigot pentru gena dominantă iar celălalt indemn, toţi descendenţii vor fi heterozigoţi, deci vor prezenta trăsătura respectivă.

Arborele genealogic al unei familii în care este prezentă o boală autozomală dominantă evidenţiază faptul că un copil afectat are cel puţin un părinte afectat:

Fig. 7. 2. Aspectul unui arbore

genealogic tipic pentru transmiterea

dominant autozomală

Rezultă că în transmiterea unei gene dominante se remarcă o continuitate în succesiunea de generaţii (transmiterea pe "verticală"), numărul persoanelor afectate din familie fiind în genere de aproximativ 50%, de ambele sexe.

Acesta însă nu este un criteriu absolut, deoarece, în unele boli dominant autozomale mutaţia poate fi "de novo", în generaţiile

precedente cazului index (proband) nemaiexistând alte cazuri. În transmiterea dominant autozomală sunt evidente câteva caracteristici:

gena (trăsătura) dominantă poate fi moştenită de la un singur părinte; părinţii bolnavi heterozigoţi pot avea copii sănătoşi în proporţie de 1:3, indiferent de sexul copiilor; homozigoţii prezintă un tablou fenotipic mult mai exprimat; în majoritatea bolilor dominant autozomale severitatea

simptomatologiei este mai mare; trăsătura dominantă se regăseşte, de regulă, în fiecare generaţie; caracterele dominante pot fi prezente în familii, fără ca acestea să fie consangvine; incidenţa caracterelor dominante nu este influenţată de sex; anomalia (trăsătura) este prezentă în fiecare generaţie dacă penetranţa genei este completă (excepţie fac mutaţiile "de novo")

iar numărul membrilor afectaţi din familie este de aproximativ 50%;

un părinte heterozigot, transmite gena la jumătate din descendenţi.

Teoretic, genele dominante ar trebui să se exprime identic la toate persoanele care le au în genotip. În realitate însă, adeseori, se constată diferenţe în penetranţa şi expresivitatea lor.

În patologia umană sunt identificate peste 2.000 de boli monogenice dominant autozomale. În cele ce urmează vor fi discutate sub aspectul lor genetic câteva exemple de boli dominant autozomale.

Hipercolesterolemia familială este o boală metabolică care determină, încă de la vârsta tânară, cardiopatie ischemică. Caracteristic este faptul că ambele forme, homozigotă şi heterozigotă, au tablou clinic similar, fară a fi distinctive ca gravitate (gena are putere mare de penetranţă).

Ectrodactilia (malformaţii scheletice şi de părţi moi la nivelul degetelor) cuprinde multiple forme de dismorfogenezii congenitale; expresivitatea fenotipică a genei este foarte variată, încât, în cadrul aceleiaşi familii, pot fi remarcate grade variabile ale dismorfogeneziilor degetelor.

Boala Huntington este o boală neurologică, caracterizată prin penetranţă tardivă si expresivitate în grade variabile. Boala se caracterizează prin mişcări coreice (dezordonate, involuntare) si tulburări neuropsihice progresive. Debutul se situează în jurul vârstei de 40 de ani. În general, în boala Huntington expresia fenotipică la homozigoti şi heterozigoti are aceeaşi intensitate.

Cunosându-se locusul genei patologice este posibil diagnosticul presimptomatic şi în familiile cu risc, chiar prenatal.

Neurofibromatoza sau boala Von Recklinghausen este caracterizată prin expresivitate variabilă, heterogenitate nonalelică şi adesea apare ca o mutaţie "de novo".

Există două forme diferite genetic şi clinic. Neurofibromatoza tip I - determinată de gena NF1, genă supresoare de tumoră, situată pe cromozomul 17, ceea ce are drept

consecinţă un potenţial malign al tumorilor benigne apărute în evoluţia bolii. Neurofibromatoza tip II, mai rară, gena NF2 este situată pe cromozomul 22.

Clinic, boala se caracterizează prin pete "café au lait", apărute în copilărie, cu aspect evolutiv, majoritatea lor fiind localizate pe torace. Alături de modificările pigmentare se asociază frecvent tumori benigne ale celulelor gliale (glioame), care determină tulburări neurologice şi tendinţa spre malignizare.

Acondroplazia este boală în care sunt prezente de la naştere tulburări scheletale, netă subdezvoltare staturală, perimetrele craniene putând ramâne în limite normale. În forma homozigotă severitatea tabloului clinic este mai mare. Apare frecvent prin mutaţie "de novo".

Rinichiul polichistic sau boala polichistică renală a adultului (ADPKD) prezintă loci-boală pe cromozomii 4 sau 16. Este o malformaţie congenitală în care expresia fenotipică variază în limite largi şi are o frecvenţă foarte ridicată în populaţie. Frecvent se remarcă apariţia mutaţiilor "de novo".

7.4.2. Transmiterea recesiv autozomală (ra)

În contrast cu trăsăturile dominant autozomale, în care caracterul este prezent fenotipic şi la indivizii heterozigoţi, trăsăturile recesiv autozomale (respectiv bolile recesiv autozomale) sunt exprimate fenotipic numai în homozigoţie, ceea ce înseamnă ca alelele moştenite de la genitori au fost identice. Cu alte cuvinte, în afecţiunile recesive, spre deosebire de cele dominante, moştenirea se face prin ambii părinţi. Majoritatea bolnavilor homozigoţi provin din părinţi sănătoşi şi heterozigoţi (purtători de genă "ascunsă"), întrucât,

din multiple considerente, bolnavii homozigoţi procreează foarte rar. Din căsătoria a doi părinţi heterozigoti pentru acelasi tip de gena recesivă, 25% din descendenţi vor fi homozigoţi, prezentând boala respectivă, iar 50% din descendenţi devin purtători heterozigoţi ai genei recesive, ca şi părinţii lor, transmiţând gena patologică în urmatoarele generaţii. Deoarece în expresia fenotipică a genelor recesive este nevoie de homozigoţie, în generaţiile ascendente ale unui bolnav (caz index sau proband), majoritatea membrilor de familie sunt sănătoşi:

Fig. 7. 3. Arbore genealogic care

sugerează transmi-terea recesiv autozomală

Când unul dintre părinţi este bolnav pentru o genă recesivă iar celălalt este indemn (homozigot cu alele normale), toţi descendenţii vor deveni heterozigoţi fenotipic sănătoşi.

Când unul dintre părinţi este bolnav pentru o gena recesivă iar celălalt este heterozigot pentru acelaşi tip de genă, 50% din copii vor fi homozigoţi (bolnavi), cealaltă jumătate devenind heterozigoţi, dar fenotipic sănătoşi.

Caracteristicile transmiterii recesive Doi părinţi sănătoşi fenotipic dar heterozigoţi (Dr, Dr) pot avea copii bolnavi (de ambele sexe), cu anomalie recesivă. Riscul

acesta este de 1/4 la fiecare sarcină. Descendenţii unui bolnav (rr) căsătorit cu o persoană indemnă (DD) vor fi sănătoşi dar heterozigoţi (Dr), transmiţând gena

recesivă din generaţie în generaţie. Aceasta va deveni manifestă fenotipic numai dacă purtătorul heterozigot va întâlni din întâmplare un partener heterozigot

pentru aceeaşi genă recesivă. Se realizează astfel aspectul transmiterii discontinue a anomaliilor recesive, în care, în general, afecţiunea sare peste generaţii, numărul persoanelor bolnave într-un grup familial (2-3-4 generaţii) nu depăşeşte 25% la ambele sexe.

Situaţiile în care un bolnav homozigot se căsătoreşte cu o persoană heterozigotă sunt în general rare. În această situaţie jumătate din copii vor fi bolnavi, boala fiind prezentă la două generaţii succesive; această situaţie este catalogată ca o pseudodominanţă.

Când ambii părinţi sunt bolnavi (rr, rr), toţi descendenţii vor fi bolnavi (rr). Excepţii însa există, ele fiind determinate de heterogenitatea genetică, stare în care doi bolnavi cu tablou clinic asemanător

prezintă gene mutante diferite. Întrucât părinţii bolnavi nu sunt homozigoţi pentru aceeaşi genă, descendenţii vor fi dublu heterozigoţi, dar sănătoşi fenotipic. Ex. În fibroza chistică heterozigoţii au frecvent o alelă normală şi una anormală, cu mutaţie (NA). Ei pot fi însă şi hetrozigoţi compuşi, ambele alele prezentând mutaţii, diferite între ele (A 1A 2).

În afecţiunile cu transmitere recesiv autozomală se observă că printre rudele bolnavului există adeseori căsătorii consangvine:

Criteriile pentru diagnosticul eredităţii recesiv autozomale: majoritatea bolnavilor afectaţi provin din părinţi aparent sănătoşi dar heterozigoţi; din căsătoria unei persoane sănătoase cu una bolnavă, toţi copiii vor fi sănătoşi; dacă un bolnav se căsătoreşte cu o persoană sănătoasă dar heterozigotă, riscul de a da naştere la copii bolnavi este de 50%; consangvinitatea este mai frecvent întâlnită în ascendenţa bolnavilor.

Consangvinitatea este una din cauzele importante pentru întâlnirea a două persoane heterozigote, favorizând deci apariţia de subiecţi bolnavi homozigoţi (mai frecvent în izolate genetice).

În transmiterea recesiv autozomală o importanţă aparte o reprezintă studiul şi depistarea heterozigoţilor. Ei sunt fenotipic sănătoşi dar cu risc de a avea 25% din descendenţi bolnavi.

În momentul de faţă cercetările de genetică moleculară, biochimie şi alte investigaţii de laborator, au pus la punct unele metode de depistare a heterozigoţilor pentru câteva sute de gene recesive.

O mare parte dintre genele recesiv autozomale au efecte pleiotrope, încât simptomatologia afectează diferite ţesuturi, organe.

Fig. 7. 4. Pedigree în care consangvinitatea părinţilor sugerează transmiterea

recesiv autozomală

7.5. Transmiterea gonozomală

Bolile numite gonozomale sunt consecinţa mutaţiilor unor gene situate pe cromozomul X. Genele situate pe cromozomul Y sunt implicate în procesul de sexualizare şi până în prezent nu se cunosc boli ereditare determinate de mutaţii ale acestor gene.

7.5.1. Transmiterea recesivă legată de X

Un caracter recesiv legat de X se manifestă fenotipic la sexul feminin când este în ‖doza dublă‖, deci în stare homozigotă. Femeile sănătoase fenotipic pot avea următoarea structură genetică: homozigotă pentru gena normală sau heterozigotă cu o genă

recesivă, situaţie în care femeile sunt purtătoare de genă recesivă („conducătoare‖) şi o vor transmite descendenţilor. Bărbaţii cu gena recesiv X-linkata în stare hetero-zigotă vor manifesta fenotipic boala datorită stării de hemizigoţie. Prin hemizigoţie se înţelege starea

caracteristică sexului masculin prin care genele plasate pe cromozomul X nu au alelă pe cromozomul Y. Acesta este motivul pentru care

bolile recesiv X-linkate sunt întâlnite frecvent la sexul masculin. La sexul feminin trăsăturile recesiv X-linkate sunt foarte rare, deoarece pentru manifestarea fenotipică este nevoie de stare

homozigotă (aceasta în funcţie de tipul genei mutante poate avea caracter letal). Dintre bolile recesiv X-linkate, cele mai cunoscute sunt: hemofilia, daltonismul, distrofiile musculare Duchenne şi Becker,

deficienţa în G6PD (glucozo-6-fosfat dehidrogenaza), sindromul Lesch-Nyhan, agamaglobulinemia etc. Ca regulă generală, boala se transmite de-a lungul generaţiilor în felul următor: un bolnav (hemizigot) transmite gena patologică

fetiţelor, acestea devenind purtătoare.

Fig. 7. 5. Arbore genealogic tipic pentru transmiterea recesiv X-linkată (hemofilia A)

Mama purtătoare (heterozigotă) va transmite gena patologică în procent egal la fete (50% dintre ele vor deveni purtătoare ca şi mama), dar şi la băieţi, încât, datorită hemizigoţiei, 50% din descendenţii de sex masculin vor fi bolnavi.

Ca şi la transmiterea autozomal recesivă, marea majoritate a persoanelor bolnave provin din părinţi sănătoşi, pe arborele genealogic fiind remarcata discontinuitatea bolii.

Din căsătoria unei femei purtătoare cu un partener sănătos, toate fetele vor fi sănătoase dar 1/2 vor fi purtătoare de genă patologică, în timp ce băieţii, 1/2 dintre ei vor fi bolnavi si 1/2 vor fi sănătoşi.

Când un bolnav se căsătoreşte cu o femeie purtătoare pentru acelaşi tip de genă, descendenţii lor – băieţi – vor fi bolnavi în proporţie de 50%, iar fetele 1/2 dintre ele devin purtătoare de „doză dublă‖, deci bolnave, cealaltă 1/2 devenind purtătoare.

În patologia umană nu există practic femei hemofilice pentru că „doza dublă‖ de genă patologică are caracter letal încă din perioada de dezvoltare intrauterină. Femeile însă, fiind purtătoare, transmit gena patologică prin generaţii.

În cazul daltonismului, boala este de asemenea mai frecventă la sexul masculin dar se poate întâlni şi la sexul feminin, gena în „doză dublă‖ neavând caracter letal.

În mod obişnuit starea heterozigotă la femei nu determină simptomatologie. Totuşi, în funcţie de procesul lyonizarii, dacă procentul de inactivare al cromozomului X normal este mai mare decât a celui cu gena patologica, apar unele manifestări clinice care permit depistarea purtătoarelor.

În general, transmiterea recesiv X-linkată respecta criteriile transmiterii recesive, prezentând desigur unele particularităţi care conferă arborelui genealogic un aspect tipic:

incidenţa la sexul masculin este mult mai mare decât la sexul feminin; numai femeile sunt heterozigote; femeile sănătoase, heterozigote, transmit afecţiunea numai la băieţi, niciodată la fete; un bărbat bolnav nu transmite boala la băieţi; femeile bolnave vor avea cu bărbaţi sănătoşi băieţi bolnavi, fetele fiind sănătoase.

7.5.2. Transmiterea dominanta legata de X

În cazul genelor dominante cu mutaţie, situate pe cromozomul X, atât sexul feminin cât şi cel masculin pot prezenta heterozigoţie. În general, un caracter dominant X-linkat respectă criteriile generale ale transmiterii dominante, în ceea ce priveşte continuitatea în generaţii şi frecvenţa caracterului respectiv printre membrii familiei.

Un exemplu de dominanţă legată de X îl reprezintă gena pentru grupa sangvină Xg (se va prezenta la Lucrari practice). Transmiterea dominant X-linkată este rar întâlnită în patologia umană. Trans-miterea unei gene patologice dominante legate de X

degajă următoarele particularităţi specifice: tatăl bolnav transmite afecţiunea fetelor sale, niciodată la băieţi; din doi părinţi bolnavi, numai jumătate din băieţi vor putea fi sănătoşi.

Fig. 7.6. Arbore genealogic specific transmiterii dominant X-linkate

Dintre bolile cu transmitere dominantă legată de X amintim: rahitismul hipofosfatemic rezistent la vitamina D, hipoplazia smalţului şi a canalelor radiculare dentare, unele boli de piele (keratoza foliculară), sindromul Rett ş.a.

Sindromul Rett este o boala rară, transmisă dominant X-linkat, la care produşii de concepţie de sex masculin cu gena patologică sunt avortaţi. De aceea boala se întâlneşte numai la fete heterozigote. Simptomatic, bolnavele prezintă un evident retard mental. Se presupune că apariţia acestei boli este sporadică, determinată de o mutaţie nouă, intervenită la un moment dat.

Femeile bolnave (heterozigote) vor da naştere la fete bolnave în procent de 25%, fete sănătoase 25% , 25% vor fi băieţi sănătoşi iar un procent de 25% din produşii de concepţie de sex masculin vor fi avortaţi spontan.

7.6. Ereditatea legată de cromozomul Y (holandrică)

Transmiterea genelor plasate pe cromozomul Y se face din tată în fiu. Dintre genele sexualizante ale cromozomului Y, cu rol în formarea gonadelor masculine notăm: gena H-Y (gena pentru Ag H-Y), gena TDF (gena ce codifică o proteină cu rol covârşitor în iniţierea masculinizării), gena Sp, cu rol în desfaşurarea spermato-genezei. Genele cu rol în sexualizare situate pe cromozomul Y se constituie într-o „regiune determinatoare a sexului‖, notată simbolic SRY, regiune care, prin genele pe care le conţine, intervine direct în sexualizarea masculină.

Dintre genele somatice plasate pe cromozomul Y notăm: gene pentru statură, gene pentru forma şi mărimea dinţilor, gena pentru hipertrichoza auriculară, gene implicate în modelul comportamental, moral masculin.

7.7. Ereditatea monogenica non-clasică (modalităţi de transmitere particulara a eredităţii monogenice)

De regulă, bolile monogenice se transmit conform modelului mendelian. În patologia umană există însă unele boli monogenice a căror transmitere şi expresie sunt guvernate de alte mecanisme, care imprimă anumite particularităţi; se vorbeşte în aceste situaţii de ereditatea non-clasică (non-traditională). Din acest grup menţionăm: mutaţiile de novo, ereditatea mitocondrială, amprenta genomică, disomia uniparentală, mozaicismul somatic şi repetările secvenţiale din ADN (sindromul cu X fragil).

7.7.1. Mozaicismul

Termenul de mozaicism se referă la prezenţa a 2 sau mai multe linii celulare diferite în acelaşi organism. Iniţial a fost recunoscut în bolile cromozomiale, ulterior fiind descris şi în bolile genice. Astfel, într-o familie în care părinţii erau sănătoşi şi 2 copii aveau osteogeneza imperfectă s-a detectat o deleţie genică în 20% din sperma-tozoizii tatălui.

Acesta prezenta mozaicism gonadal. Alt exemplu: un părinte cu neurofibromatoza segmentară. Numai anumite arii ale corpului erau afectate. Celulele din ariile

afectate aveau gena care codifică neurofibromatoza; celulele din ariile neafectate aveau gena normală = mozaicism somatic.

7.7.2. Amprentarea genomică

Se referă la expresia unei gene in funcţie de originea parentala. Conceptul este exemplificat de sindroamele Prader-Willi si Angelman. Ambele sunt datorate deleţiei aceluiaşi segment cromozomial: 15q11-13. Dacă deleţia este de origine paternă pacientul va avea sindromul Prader-Willi, iar daca deleţia este de origine maternă pacientul va avea sindromul Angelman. Pentru ca deleţia să aibă efect clinic diferit, s-a sugerat că trebuie să existe o modificare a segmentului cromozomial, care apare în timpul meiozei paterne sau materne.

7.7.3. Disomia uniparentală

Se referă la moştenirea unei perechi de cromozomi de la un singur părinte. Ambii cromozomi proveniţi de la acelaşi părinte au gene identice (de la un/o bunic/ă) = isodisomie uniparentală.

Heterodisomia uniparentala se referă la moştenirea unei perechi de cromozomi de la un părinte, dar cromozomii au gene diferite (de la ambii bunici).

Aprox. 20-30% din pacienţii cu sindromul Prader-Willi nu prezintă deleţia cromozonului 15. La aceştia, ambii cromozomi 15 sunt de origine maternă, analog cu sindromul Prader-Willi secundar deleţiei moştenite de la tată.

Fibroza chistică apare consecutiv disomiei uniparentale, cu cei doi cromozomi 7 având mutaţia F508 provenind de la mamă (purtătoare).

Disomia uniparentală se presupune că apare într-un zigot care în momentul concepţiei avea trei cromozomi 15 sau 7. Aceste trisomii nu sunt compatibile cu viaţa. Embrionii supravieţuiesc datorită pierderii unui cromozom provenit din gametul normal, rezultând disomia uniparentală.

7.7.4. Repetările trinucleotidice

Repetările trinucleotidice cu lungimi variabile se găsesc şi la indivizi sănătoşi. Funcţia lor nu este cunoscută. La trecerea in generaţia următoare ele pot suferi expansiuni şi pot determina apariţia unei boli, un debut timpuriu al bolii (anticipaţie) sau o severitate mai mare a bolii.

Sindromul X-fragil se asociază cu repetări CGG. La persoanele sănătoase numărul repetărilor este 6-40. Purtătorii aşa-numitei premutaţii au între 50-200 repetări. Persoanele afectate, cu mutaţie, au 200-1000 repetări.

Majoritatea bărbaţilor care au gena FMR-1 prezintă retard mental. Totuşi, 20% dintre bărbaţi nu au retard mental. Prezenţa premutaţiei la aceştia a fost dovedită de faptul că au transmis această genă cu premutaţie fiicelor, care au avut băieţi afectaţi. Bărbaţii care au transmis boala prezentau premutaţia genei. Gena rămâne stabilă şi se transmite nemodificată in timpul meiozei paterne. Fiicele vor avea şi ele premutaţia dar in timpul meiozei, la sexul feminin, poate să apară o expansiune a repetărilor trinucleotidice, cu mai mult de 200 copii, respectiv mutaţia, rezultatul fiind apariţia bolii la descendenţi.

Boala Huntington se asociază cu repetări CAG. Este o afecţiune neurodege-nerativă care afectează îndeosebi nucleii bazali, manifestările clinice esenţiale fiind mişcări coreo-atetozice şi demenţa. Boala are debut tardiv. Numărul repetărilor trinucleotidice este 11-34 la persoanele sănătoase, bolnavii având peste 39 repetări. La persoanele cu 60-70 repetări debutul bolii este timpuriu. Majoritatea pacienţilor cu acest număr mare de repetări moştenesc gena de la tată, astfel încât se presupune că expansiunea trinucleotidică a apărut în timpul meiozei paterne.

Distrofia miotonică se asociază cu repetări CTG. Apare o imposibilitate de relaxare musculară după contracţie, precum şi alte manifestări clinice. Numărul normal de repetări este 5-30. In cazul premutaţiei apar 30-70 repetări, iar boala se declanşează dacă există peste 70 repetări. Particularitatea acestei afecţiuni: apariţia distrofiei miotonice congenitale la nou-născuţii care moştenesc boala de la mamă, fenomen care nu se observă dacă boala este moştenită de la tată.

7.7.5. Sindroame cu gene contigue

Sunt boli care apar în urma microdeleţiilor sau microduplicaţiilor implicând câteva gene învecinate. Exemple: sindromul Prader-Willi; sindromul Angelman; sindromul Cri-du-chat; sindromul Wolf-Hirschhorn; retinoblastomul; sindromul DiGeorge; sindromul velo-cardio-facial; sindromul Beckwith-Wiedemann.

7.7.6. Transmiterea mitocondrială

Câteva afecţiuni sunt datorate mutaţiilor din ADN mitocondrial. Mitocondriile furnizează energia pentru metabolismul celular prin fosforilare oxidativă. In fiecare celulă se găsesc câteva sute de mitocondrii al căror ADN se replică independent de ADN nuclear.

Transmiterea mitocondrială se caracterizează printr-o mare variabilitate, în funcţie de numărul mitocondriilor normale şi anormale din celulă. Transmiterea se face pe linie maternă. Descendenţii de ambele sexe pot fi afectaţi.

Exemple: neuropatia optică ereditară Leber; encefalomiopatia mitocondrială; o formă de epilepsie mioclonică.

Fig. 7. 7. Arbori genealogici sugestivi pentru transmiterea mitocondrială

Capitolul 8 EREDITATEA POLIGENICĂ, MULTIFACTORIALĂ

Termenul de ereditate poligenică se referă la acţiunea aditivă a mai multe gene nealele (plasate pe cromozomi diferiţi) în determinarea unui caracter sau a unei boli. Pentru marea majoritate a caracterelor poligenice normale şi mai ales patologice, pe lângă gene cooperează şi

factori de mediu, de unde şi termenul de ereditate multifactorială. Ponderea componentei genetice în determinarea oricărui caracter se numeşte heritabilitate. Heritabilitatea intervine în cote

variabile de la un caracter la altul şi diferă ca proporţie în cadrul aceluiaşi caracter, de la o persoană la alta. În ereditatea poligenică, multifactorială din patologia umană, componenta ereditară este reprezentată de un număr variabil de gene

de risc cu efecte aditive, care generează starea de susceptibilitate (vulnerabilitate) pentru o boală, stare denumită predispoziţie genetică. Numărul genelor implicate este diferit de la o boală la alta şi chiar în cadrul aceleiaşi entităţi, aceasta explicând în parte, variaţia fenotipică, heterogenitatea din bolile poligenice. Un exemplu de afecţiune determinată poligenic este diabetul zaharat de tip 1 insulino-dependent, în determinismul căreia se presupune că sunt implicate cel puţin 10 gene nealele, inclusiv genele care codifică antigenele HLA şi gena pentru insulină. Nici una dintre aceste gene nu pare a avea o contribuţie majoră pentru tipul 1 al diabetului zaharat, genele având o acţiune aditivă.

Heterogenitatea genetică este evidentă şi bine documentată în hipertensiunea arterială. În patogenia bolii sunt implicate mai multe gene care pot avea efecte majore şi care determină tulburări la nivelul canalelor de sodiu, tulburări ale sistemului renină-angiotensină-aldosteron, tulburări ale cotransportorului de NaCl etc. Aceste modificări determină variaţii uneori chiar şi în cadrul aceleaşi familii şi desigur, impun utilizarea unor procedee terapeutice diferite, bazate pe defectul existent la fiecare caz în parte. Descoperirile actuale privind bazele genetice ale hipertensiunii arteriale ilustrează potenţialul oferit de ―medicina genomică‖.

8. 1. Modelul multifactorial poate fi sistematizat astfel:

1. un anumit caracter este determinat de mai multe gene, dar nu de un număr nelimitat.

2. nu există o expresie dominantă sau recesivă pentru aceste gene

3. genele au acţiune aditivă, fiecare influenţând o mică parte a fenotipului.

4. factorii de mediu interacţionează cu genotipul realizând fenotipul final.

Având în vedere că în ereditatea poligenică, multifactorială se intrică componenta genetică (mai multe gene minore de risc) cu factori de mediu, transformarea predispoziţiei în boală este dependentă pe de o parte de pragul acţiunii genelor (ele au efect de sumare), iar pe de altă parte de factorii ambientali. Din aceasta rezultă că nu toate persoanele cu predispoziţie genetică vor fi bolnave fenotipic.

Într-o boală multifactorială, pedigree-ul nu are o caracteristică anume, modelul putând fi variabil de la o familie la alta. Riscul recurenţei bolii la membrii aceleiaşi familii este de obicei mediu, putând fi mai mare sau mai mic decât media, în funcţie de frecvenţa bolii în familia respectivă şi de gradul de rudenie cu persoana afectată.

Membrii unei familii deţin în comun un anumit procent de gene în funcţie de gradul lor de rudenie: de exemplu:

Grad de rudenie % gene în comun Exemple

Rude de gradul I 50 Parinţi, copii, fraţi

Rude de gradul II 25 Matuşi, unchi, bunici

Rude de gradul III 12.5 Veri primary

Exemplificare risc de recurenţă pentru defect de tub neural:

3-5% dacă parinţii mai au un copil afectat.

2% dacă un unchi sau matuşa au fost afectaţi.

0.5% dacă un văr primar a fost afectat.

8. 2. Clasificarea eredităţii multifactoriale

Sub aspect genetic, ereditatea poligenică multifactorială poate fi împărţită în trei tipuri: a. Într-un prim grup sunt cuprinse caracterele normale determinate poligenic, multifactorial, care se caracterizează printr-o variaţie continuă de exprimare. Acestea sunt: talia (statura), greutatea corporală (robusteţea), tensiunea arterială, refracţia oculară, pigmentaţia pielii, caracterele psihice, inteligenţa etc. În acest grup mai sunt cuprinse şi unele fenotipuri patologice cu largi variaţii de exprimare faţă de normal, cum ar fi unele forme de retard mental nespecific, unele fenotipuri de statură scundă ş.a.

În ereditatea poligenică, multifactorială cuprinsă în acest grup, se remarcă evident existenţa unor variaţii valorice continue ale indivizilor din populaţie, variaţii ale căror valori se înscriu în modelul unei curbe gaussiene; astfel, în distribuţia variaţiilor în populaţie, valorile medii au frecvenţă mai mare faţă de cele două extreme, contrastante.

Analiza eredităţii staturii spre exemplu, arată că descendenţii unui cuplu prezintă mai degrabă statură încadrabilă în valorile medii ale populaţiei, decât în cele ale genitorilor. b. Al doilea grup cuprinde tulburări multifactoriale comune, în care se poate constitui o malformaţie congenitală (un singur tip de malformaţie), în funcţie de pragul de sensibilitate al organismului (de numărul şi penetranţa genelor) şi de anumiţi factori de mediu care au acţionat în timpul dezvoltării intrauterine. În aceste cazuri se vorbeşte de trăsături multifactoriale "cu prag". În cadrul lor sunt evidente variaţii ale susceptibilităţii - variaţii ale pragului de susceptibilitate-, astfel, deşi susceptibilitatea (componenta poligenică) este răspândită în populaţie, incidenţa tulburărilor multifactoriale "cu prag" este mai frecventă numai în anumite familii. Trăsăturile multifactoriale sunt trăsături cantitative cu distribuţie continuă, dar pot determina apariţia unor defecte congenitale care fie apar, fie nu, fără a exista o variantă intermediară. Modelul eredităţii multifactoriale cu prag explică apariţia acestor anomalii congenitale. Sensibilitatea pentru apariţia lor se distribuie după modelul curbei lui Gauss. Dacă susceptibilitatea depăşeşte un anumit prag, va apare defectul, iar dacă este sub prag, trăsătura respectivă nu se exprimă fenotipic. Se deduce că pragul susceptibilităţii este depăşit prin sumarea acţiunii factorilor genetici predispozanţi cu factorii de mediu.

Dintre tulburările multifactoriale cu prag fac parte:

defecte de tub neural (spina bifida, anencefalia);

anomalii congenitale de cord: stenoza aortică, stenoza de arteră pulmonară, defecte septale atriale sau ventriculare, trunchi

arterial comun, ventricule hipolplazice, tetrada Fallot;

stenoza pilorică;

despicăturile labio-palatine;

luxaţia coxo-femurală;

hidrocefalia;

Defectele congenitale amintite pot fi determinate poligenic sau pot fi determinate de alte cauze ca de exemplu: defecte congenitale

asociate în sindroame cromozomiale, boli metabolice, putând fi de asemenea determinate de factori teratogeni.

c. Al treilea grup cuprinde boli comune multifactoriale cu debut (expresie fenotipică) la un moment dat în decursul vieţii; ele

sunt larg răspândite în patologie.

Dintre bolile multifactoriale larg răspândite în populaţie notăm:

boala coronariană (risc pentru infarct miocardic);

hipertensiunea arterială (în afara determinismului poligenic se presupune că ar exista o formă transmisă după modelul

dominant autozomal);

diabetul zaharat: diabetul zaharat al adultului (noninsulinodependent), diabetul zaharat de tip MODY care debutează la tineri (20-

25 ani);

obezitatea;

ulcerul duodenal;

astmul bronşic;

alergii cutanate sau respiratorii;

scleroza multiplă;

cele mai multe dintre formele de cancer;

bolile psihice:

Boala maniaco-depresivă

forma unipolară (posibil mai puţine gene implicate în determinismul său);

forma bipolară (componenta ereditară mai însemnată, reprezentată de mai multe gene).

Studiile linkajului au evidenţiat unele gene candidate, care ar acţiona poligenic, de ex:

pe cromozomul 18q (pentru ambele forme);

pe cromozomul 8;

pe cromozomul 21q, ultimele mai ales în forma bipolară.

Schizofrenia

Genele candidate implicate în predispoziţia pentru schizofrenie sunt plasate în regiunile cromozomiale: 2q, 4q, 9q, 6p, 8p, 11q.

8. 3. Caracteristicile eredităţii multifactoriale

Tulburările multifactoriale au incidenţă crescută în anumite familii cu risc, dar aspectul şi distribuţia lor la membrii familiei nu sunt întotdeauna distinctive (prezintă variaţii). Părinţii bolnavului pot fi sănătoşi.

Riscul de apariţie a unei tulburări multifactoriale la alţi membri ai familiei este mai mare la rudele de gradul I. Riscul recurenţei scade pentru rudele de gradul II şi este mai mic la gradele de rudenie mai îndepărtate. Transmiterea eredităţii multifactoriale se distinge de cea a dominanţei autozomale pentru că procentul membrilor afectaţi este în

genere mai mic de 50%. Deosebirea se păstrează şi faţă de modelul recesiv autozomal deoarece în tulburările multifactoriale se remarcă risc pentru rude în general şi nu numai în fratrie.

Riscul recurenţei (reapariţiei) este mult mai mare dacă sunt afectaţi mai mulţi membri din familie. Cu cât malformaţiile sunt mai severe, cu atât riscul recurenţei este mai mare (de exemplu în despicăturile labio-palatine). În afecţiunile multifactoriale mai frecvent întâlnite la unul dintre sexe, riscul este mai mare dacă afecţiunea a fost prezentă la

părintele de sex opus; de exemplu, stenoza pilorică este de 5 ori mai frecventă la sexul masculin; dacă mama a prezentat boala în antecentele sale, riscul pentru descendenţii săi băieţi este mult mai crescut.

Studiul concordanţei trăsăturilor multifactoriale la gemenii monozigoţi faţă de cei dizigoţi, relevă cota cu care componenta ereditară (heritabilitatea) intervine în determinarea afecţiunilor respective.

Riscul recurenţei creşte notabil pentru căsătoriile în consangvinitate. Consangvinitatea creşte riscul apariţiei unui copil afectat de o boală multifactorială, dar numai într-o măsură mai mică decât în cazul bolilor recesiv autozomale. De exemplu, căsătoria dintre veri primari creşte de două ori riscul de a avea un descendent cu o afecţiune multifactorială, faţă de populaţia generală.

CAPITOLUL 9 BOLI CU PREDISPOZIŢIE GENETICĂ

9. 1. Factori genetici implicaţi în patologia umană

Aplicarea descoperirilor din genetica medicală în medicina clinică permite astăzi o tot mai bună înţelegere a complexităţii şi heterogenităţii etiologice a multiplelor boli din patologia umană.

Studiile genetice seriate pe grupe largi de boli cu etiologie încă incertă, au relevat că în majoritatea covârşitoare a acestora este evidentă cooperarea dintre o componentă genetică (în cotă mai mare sau mai mică) şi factorii de mediu.

Componenta genetică are pondere diferită de la o boală la alta, chiar de la un bolnav la altul şi este reprezentată fie de moştenirea unei mutaţii genice, respectiv a unei forme alelice – gena candidată – care se va exprima fenotipic sau nu în funcţie de factorii de mediu, fie de moştenirea unei predispoziţii ereditare care are la bază câteva mutaţii de risc minor, dar a căror acţiune aditivă antrenează potenţarea efectelor acestora. Predispoziţia ereditară conferă organismului o susceptibilitate (vulnerabilitate) care în prezenţa unor factori de mediu se poate converti în boală, încă din timpul dezvoltării intrauterine (anomalii congenitale), sau ulterior, la un moment dat, pe parcursul vieţii ontogenetice.

Moştenirea predispoziţiei genetice în generaţii stă la baza etiopatogeniei bolilor multifactoriale (prin intricarea factorilor genetici cu cei de mediu) şi se exprimă prin termenul de heritabilitate.

În bolile multifactoriale apare pregnantă incidenţa familială, prin care frecvenţa bolii este mai crescută în anumite familii cu risc. Deşi bolile multifactoriale se caracterizează printr-o largă heterogenitate genetică şi clinică (ca tablou simptomatic) în populaţia cu risc, indivizii pot fi sănătoşi sau bolnavi, fără forme intermediare. Susceptibilitatea dată de predispoziţia genetică se converteşte în boală numai atunci când prin intervenţia factorilor de mediu se depăşeşte valoarea pragului de risc.

9. 2. Factori genetici în boli ale aparatului cardio-vascular

Bolile cardio-vasculare constituie cea mai importantă cauză a morbidităţii şi mortalităţii; aproximativ jumătate din decesele prin boli cardio-vasculare sunt datorate bolii coronariene. Dintre bolile cardio-vasculare cu etiologie multifactorială fac parte: boala coronariană (cardiopatia ischemică), hipertensiunea arterială şi defectele congenitale de cord.

Multiple studii genetice întreprinse în acest domeniu, relevă că boala coronariană este determinată multifactorial, prin

cooperarea unei predispoziţii genetice (familiale) considerată ca un mare factor de risc, cu diverşi factori de mediu. Ponderea dintre

cei doi factori cauzali este diferită de la un bolnav la altul. Studiile întreprinse pe serii de bolnavi cu ischemie coronariană, relevă că

heritabilitatea atinge valori de peste 0,63, aceasta sugerând că intervenţia eredităţii are pondere mai mare comparativ cu factorii de

mediu. În seriile de pacienţi luaţi în calcul, riscul era şi mai mare în familiile cu incidenţă crescută a hipercolesterolemiei şi a

hiperlipidemiei.

Chiar şi în studiile care au exclus cazurile cu hiperlipidemie şi hipercolesterolemie, heritabilitatea se înscrie la valori de aproximativ 0,56,

aceasta sugerând că factorii genetici sunt reprezentaţi nu numai de genele răspunzătoare de nivelul lipoproteinelor plasmatice, ci şi de alţi parametri (tensiunea arterială, concentraţia fibrinogenului ş.a.)

Studiile genetice familiale şi pe grupuri largi din populaţie reliefează fără echivoc implicarea predispoziţiei ereditare alături de

factorii de mediu în etiologia multor boli cardio-vasculare precum: hipertensiunea arterială, cardiopatia ischemică-infarctul de miocard,

unele forme de miocardopatii, disritmii ş.a. Hipertensiunea arterială are de asemenea etiologie multifactorială; intervenţia componentei genetice este demonstrată de marea

incidenţă familială şi de concordanţa notabilă la gemenii monozigoţi.

Din componenta poligenică a hipertensiunii arteriale sunt incriminate ca făcând parte mai multe gene, numite sugestiv ―candidate―, specificatoare ale sistemului renină-angiotensină-aldosteron. De exemplu: Gena pentru angiotensinogen: pe cromozom 1 Gena pentru renină: pe cromozom 1 Gena pentru enzima de conversie a angiotensinei: pe cromozom 17 În populaţie există un larg polimorfism alelic pentru aceşti produşi. Prin tehnicile de genetică moleculară s-a identificat în populaţie un larg polimorfism alelic pentru aceşti produşi, ceea ce susţine supoziţia implicării unora dintre formele alelice în producerea bolii.

Cercetări paralele indică şi intervenţia altor gene şi anume a celor care specifică enzima convertoare a angiotensinei I şi oxid

sintetaza, ambele implicate în mecanismele de control ale tensiunii arteriale. Tulburări ale sistemului venos

În sistemul venos, constituirea varicelor are un puternic determinism genetic alături de care, factorii de mediu favorizează apariţia

timpurie a varicelor.

Defectele congenitale de cord au etiologie heterogenă. Mai multe studii sugerează posibilitatea determinării poligenice, în

anumite familii, dată fiind incidenţa crescută a acestor defecte în timpul organogenezei. Defectele congenitale de cord pot fi însă

determinate şi de anomalii cromozomice (prezente în peste 30% din sindroamele cromozomice), de mutaţii monogenice (însoţind

tabloul clinic al unor boli genice dominant autozomale sau recesiv autozomale), de asemenea de unii factori teratogeni care au

acţionat în timpul dezvoltării intrauterine (de exemplu virusul rubeolei, infecţia luetică, alţi agenţi biologici).

Cardiomiopatii

Cardiomiopatiile însoţite sau nu de tulburări de ritm se asociază cu unele boli monogenice (lipidoze).

Se pot asocia cu unele haplotipuri HLA

9. 3. Factori genetici în boli ale aparatului respirator

Astmul bronşic are la bază un determinism poligenic multifactorial; incidenţa familială este foarte mare, astfel încât, pedigree-ul

îmbracă adeseori un aspect asemănător transmiterii dominant autozomale. Debutul şi forma astmului sunt dependente de amploarea

predispoziţiei genetice şi a alergenilor din mediu.

Studiile efectuate pe gemeni monozigoţi şi dizigoţi au evidenţiat concordanţa net crescută a bolii la monozigoţi, cu valori între

29-40%, faţă de dizigoţi, la care concordanţa bolii nu depăşeşte 5-8%. Analizele moleculare din ultimul deceniu au evidenţiat unele gene ―candidate―, ca răspunzătoare de predispoziţia ereditară din

astm, cum ar fi genele reglatoare pentru procesul inflamator, plasate pe cromozomul 5, genele specificatoare de citokine şi alte câteva gene (markeri genetici) implicate în procesul afinităţii receptorilor pentru imunoglobulinele E, plasate pe cromozomul 11.

Deficienţa în alfa-1-antitripsină, boală monogenică recesiv autozomală, se caracterizează prin scăderea în grade variabile a

nivelului enzimei alfa-1-antitripsină, în funcţie de forma alelică existentă; până în prezent au fost identificate peste 75 de variante

alelice în populaţie.

În mod normal, alfa-1-antitripsina acţionează ca un inhibitor al elastazei elaborată de neutrofilele din pereţii alveolari ai

plămânilor. Scăderea nivelului alfa-1-antitripsinei duce la alterarea balanţei dintre elastază şi alfa-1-antitripsină, determinând

degradarea progresivă a elastinei din pereţii alveolari şi implicit, emfizem pulmonar (tulburări respiratorii severe). În paralel, se

asociază şi tulburări severe ale funcţiei hepatice.

În genere, efectele mutaţiei genei pentru alfa-1-antitripsină se exprimă fenotipic sub influenţa noxelor din mediu, reprezentate

de fumat şi alte noxe chimice din atmosferă. Deficienţa în alfa-1-antitripsină este un exemplu tipic de interacţiune între factori de

mediu şi genotip, respectiv de influenţare a expresiei genice în funcţie de condiţiile de mediu.

9. 4. Factori genetici în boli neuro-psihice

Retardul mental Definiţie

Coeficient de inteligenţă sub 70 Afectarea a cel puţin 2 dintre următoarele funcţii: comunicare, îngrijire proprie, activitate casnică, relaţii interpersonale,

şcolarizare Debut înainte de 18 ani

Clasificare

După severitate:

Categorie Coeficient de inteligenţă Prevalenţa (%)

Uşor 55-70 0,9-2,7

Moderat 40-54 0,3-0,4

Sever 25-39 0,3-0,4

Profund Sub 25 0,3-0,4

Retardul mental poate fi: sindromic, dacă se asociază cu trăsături dismorfice, sau

nonsindromic, dacă nu se asociază cu trăsături dismorfice sau malformaţii. Frecvenţa: 1 la 300 pentru formele severe şi 1 la 77 pentru formele uşoare. S-a observat prezenţa asocierii unor afecţiuni psihiatrice:

o Schizofrenia are prevalenţa de 3% la bolnavii cu retard mental faţă de 0.8% în populaţia generală. o Psihoza bipolară este de 2-3 ori mai frecventă decât în populaţia generală. o Epilepsia apare la 20 % dintre bolnavii cu retard mental. o Hiperactivitatea şi deficitul de atenţie, comportamentul autoagresiv, depresia, autismul sunt mai frecvente la bolnavii cu retard

mental. Etiologie Inteligenţa este determinată poligenic, multifactorial. Retardul mental poate fi cauzat prenatal de factori genetici: genici şi cromozomiali, precum şi de factori teratogeni, factori genetici asociaţi cu factori de mediu sau cauza nu este cunoscută. Anomaliile cromozomiale

reprezintă cea mai frecventă cauză: sindrom Down, trisomia 13, trisomia 18, sindrom Lejeune, sindrom Klinefelter, precum şi sindromul cu X-fragil Boli monogenice:

Boli dominant autozomale: distrofia miotonică, neurofibromatoza Boli recesiv autozomale: fenilcetonuria, galactozemia, tezaurismozele Boli recesiv X-linkate: sd. Lesch-Nyhan, mucopolizaharidoza Hunter Factori teratogeni:

Infecţii congenitale: virusul rubeolei, citomegalovirus, toxoplasma gondii, şi treponema pallidum.

Consumul de alcool→sindrom de alcoolism fetal şi în urma administrării de hidantoină→sindromul hidantoin fetal

Malnutriţia Poligenic, multifactorial.

In 60-80% din cazuri, cauza este necunoscută. Factori perinatali: complicaţii ale prematurităţii, placenta previa, preeclampsia, asfixia neonatală. Factori postnatali: encefalite, meningite virale sau bacteriene, traumatisme, intoxicaţii. Psihozele unipolare şi bipolare sunt boli cu netă determinare multifactorială, având o frecvenţă de 1% în populaţia generală. Studiile pe gemeni şi studiile de adopţie au relevat o heritabilitate crescută, cu valori mai evidente şi o agregare familială importantă în forma bipolară. Genetica bolii este complexă, fiind presupusă intervenţia mai multor mecanisme:

transmiterea mitocondrială;

imprinting-ul genomic (amprentă genomică); expansiunea repetărilor trinucleotidice; prezenţa unor gene care contribuie sau determină riscul pentru apariţia bolii; dintre acestea au fost menţionate gene cu

localizare pe cromozomii 8, 18q, 21q (mai ales în forma bipolară), gene care ar putea avea penetranţă incompletă şi o interacţiune cu factorii de mediu care este incomplet elucidată.

Schizofrenia este o tulburare psihică majoră determinată poligenic multifactorial, având o puternică implicare genetică. Concordanţa bolii la gemenii MZ este de aproximativ 70%, ceea ce reprezintă cota de participare a factorilor genetici la determinismul bolii. Incidenţa bolii este net mai mare în anumite familii, unele studii sugerând că dacă unul dintre părinţi prezintă schizofrenie riscul apariţiei bolii la descendenţi este de 40%. Metode moderne de genetică moleculară (analiza linkajului genic) atestă deocamdată, unele dovezi care sprijină ipoteza mai veche

referitoare la unii loci pe cromozomii 5, 11, 14, 19, 21, 22 şi la regiunea pseudo-autozomală de pe cromozomul X, care ar prezenta

variaţii genetice implicate în determinarea nivelului de susceptibilitate la schizofrenie, fără să existe însă o dovadă certă în acest sens.

Unele studii sugerează că predispoziţia genetică pentru schizofrenie ar putea favoriza hipoxia ce poate apare în timpul complicaţiilor

travaliului, hipoxie ce ar conduce la instalarea unor tulburări ale neurotransmiterii prin leziunile regionale de pe scoarţa cerebrală.

S–a remarcat şi o asociere mai frecventă a bolii cu haplotipul HLA A9.

Boala Alzheimer sau demenţa presenilă de tip Alzheimer este o boală neurodegenerativă responsabilă de reducerea progresivă

a ansamblului de funcţii cognitive (memorie, atenţie, capacitate de raţionament, limbaj) şi de pierderea progresivă a autonomiei

individului.

Efectul predominant al factorilor genetici asupra factorilor de mediu este demonstrat de formele familiale, în care riscul dezvoltării

bolii este crescut la rudele bolnavului faţă de riscul în populaţia generală. Boala prezintă heterogenitate fenotipică şi de loci

(heterogenitate nonalelică).

În formele familiale sau precoce de boală Alzheimer (debut la 40 de ani) transmiterea factorilor genetici a fost confirmată prin

punerea în evidenţă, în 75% din cazuri, a unei mutaţii pe una din cele două gene situate pe cromozomii 14 şi 1, gene ce codifică

presenilina 1 şi respectiv presenilina 2 şi prin evidenţierea în 10-15% din cazuri a mutaţiei unei gene ce codifică precursorul

amiloidului Aβ, situată pe cromozomul 21. Cel mai frecvent, forma precoce a bolii îmbracă aspectul transmiterii autozomal

dominante.

În formele sporadice sau tardive (debut după 60 de ani), pe cromozomul 19 s-a evidenţiat prezenţa a trei variante alelice a genei

pentru apolipoproteina E, gene ce se consideră a determina susceptibilitatea pentru boală. Recent, pe cromozomul 12, a fost pusă în

evidenţă o nouă genă ce favorizează apariţia formei tardive a bolii. Din cele de mai sus se desprinde ideea că boala Alzheimer

prezintă atât heterogenitate alelică cât şi nonalelică (de locus).

Alte tulburări neuro-psihice

Studii familiale şi pe gemeni au demonstrat rolul factorilor genetici în numeroase alte boli neuro-psihice apărute în perioada copilăriei,

cum ar fi:

deficitul de atenţie şi hipermotricitatea

dislexia şi tulburările de învăţare

stările hiperkinetice

Este de asemenea evidentă componenta ereditară în variate tulburări comportamentale, perversiuni sexuale, ca şi în stările de

dependenţă-adicţie la alcool, droguri, diverse stimulente.

9. 5. Factori genetici în afecţiuni digestive

Ulcerul peptic – are o etiologie complexă şi o largă heterogenitate genetică.

Agregarea familială, incidenţa mai mare în unele familii, precum şi asocierea acestuia cu grupul sangvin O, statusul nesecretor şi cu

unele haplotipuri HLA (HLA B5, B12, B35) susţin determinismul poligenic multifactorial al ulcerului gastro-duodenal. Concordanţa bolii

este de asemenea considerabil mai crescută la gemenii MZ.

Cele mai multe rapoarte indică o istorie familială pozitivă la 20-50% din indivizii cu ulcer peptic, comparativ cu 5-15% în populaţia generală. Date recente evidenţiază faptul că predispoziţia genetică pentru ulcer peptic constă în susceptibilitatea mucoasei gastrice faţă de Helicobacter pylori şi această susceptibilitate este convertită în boală prin sumarea cu alţi factori de mediu (agenţi microbieni, dezechilibre şi excese alimentare, stress etc.). Stenoza congenitală de pilor Este o boală multifactorială caracterizată prin hipertrofia musculaturii circulare a pilorului. Debutează între a doua şi a şasea săptămână de viaţă, cu vărsături explozive, în jet, după fiecare masă, ce se intensifică progresiv. Frecvenţa bolii este de 25/10 000 de nou născuţi, mai mare în unele familii.

Studiile familiale şi pe gemeni au evidenţiat o concordanţă mai mare la gemenii MZ (frecvent afectaţi concomitent) şi o incidenţă

crescută la sexul masculin (sex ratio M:F = 5:1); de asemenea este mai frecvent afectat primul născut.

Se presupune că susceptibilitatea pentru boală ar fi generată de o serie de gene de risc, iar la sexul feminin protecţia hormonală ar face

ca pragul susceptibilităţii să fie mai ridicat, pentru manifestarea bolii fiind necesară o acţiune mai puternică a factorilor de risc. Fiii

femeilor afectate au un risc de 200 de ori mai mare de a prezenta boala faţă de populaţia generală în timp ce fiii taţilor afectaţi

prezintă un risc pentru aceeaşi boală doar de 10 ori mai mare faţă de populaţia generală. Manifestările clinice şi investigaţia

radiologică cu substanţă de contrast permit diagnosticul rapid, ceea ce în general duce la cura chirurgicală radicală.

Boala Hirschsprung (megacolonul congenital aganglionar)

Boala Hirschsprung este o afecţiune multifactorială cu o frecvenţă de 1/5000 nou născuţi şi sex ratio M:F= 6:1. La fel ca şi în cazul

stenozei hipertrofice de pilor, dacă probandul este băiat, riscul de recurenţă este estimat la 4% iar dacă este fată la 12%.

Afecţiunea este mai frecventă în anumite familii şi prezintă o concordanţă ridicată la gemenii MZ, aspectul bolii variind de la

constipaţia cronică la obstrucţia acută intestinală. Diagnosticul este clinic şi radiologic iar tratamentul este chirurgical.

9. 6. Factori genetici în diabetul zaharat (DZ)

Ca urmare a dezvoltării tehnologiilor ADN-ului recombinat dar şi a eforturilor conjugate, sub forma studiilor clinice, epidemiologice,

imunologice, biochimice, au fost elucidate aspecte semnificative ale etiopatogeniei DZ. Este de aşteptat ca în următorii câţiva ani şi

celelalte mecanisme moleculare ce intervin în menţinerea homeostaziei glucozei să fie pe deplin cunoscute.

DZ este o afecţiune poligenică multifactorială. La baza predispoziţiei ereditare stau mecanisme complexe, cu multiple componente, ce

acţionează aditiv sau independent creând un teren de susceptibilitate.

Rolul componentei genetice în determinismul DZ este ilustrat de clasificarea propusă de AAD (Asociaţia Americană pentru Diabet) în

1999:

1. DZ tip 1 (insulino-dependent, DZID, DZ juvenil);

2. DZ tip 2 (non insulino-dependent, DZNID, DZ al adultului);

3. Alte tipuri specifice incluzând DZ determinat de defecte genetice ale funcţiei celulelor β pancreatice (MODY), defecte

genetice ale activităţii insulinei, boli ale pancreasului exocrin sau DZ asociat altor sindroame genetice.

Intervenţia factorilor genetici în etiopatogenia DZ este susţinută de:

a) agregarea familială a cazurilor: incidenţa familială a DZID este de 35-50%;

b) concordanţa crescută la gemenii MZ faţă de gemenii DZ: în DZID concordanţa este de 34-50% la MZ şi de 5% la DZ, în timp

ce în DZNID concordanţa la MZ poate ajunge la 100%;

c) asocierea bolii cu anumite combinaţii HLA: DZID este mai frecvent asociat cu haplotipurile HLA B8 cu DW3, HLA B15, DQ;

d) descoperirea genelor candidate ―diabetogene‖.

Studiile de linkaj genic şi cercetările pe şoareci transgenici au permis evidenţierea asocierii dintre DZID şi o serie de gene candidate,

presupuse a avea rol major în etiologia bolii: gena DZID1 (locus pe cromozomul 6p21) şi gena DZID2 (11p15, în vecinătatea

locusului pentru gena insulinei). Alte gene de susceptibilitate pentru DZID au fost localizate pe cromozomii 2q, 10p, 11q, X. Un locus

asociat cu DZNID a fost localizat pe cromozomul 12q; loci adiţionali au fost localizaţi pe cromozomii 1q, 2p, 11q şi 15.

Dincolo de supoziţiile existente şi achiziţiile ultimilor ani, DZ rămâne o boală cu etiologie complexă, în care se implică cu siguranţă

factori genetici, o componentă autoimună şi foarte probabil acţiunea unor factori de mediu specifici (virali, alimentari, stress). Aceştia

pot interveni asupra unor verigi a căror alterare se soldează cu declanşarea DZ: secreţia şi acţiunea insulinei, masa celulelor β

insulare, răspunsul imun, metabolismul glucozei.

9. 7. Factori genetici implicaţi în anomalii congenitale de schelet şi părţi moi învecinate

Defecte congenitale de tub neural, din care menţionăm: anencefalia spina bifidă

Aceste defecte fac parte din categoria malformaţiilor cu etiologie multifactorială. Frecvenţa diferă în populaţie, de la 2/1000 la mongoli şi africanii din Sahara, până la peste 10/1000 în alte zone de pe glob, cum sunt: Irlanda, Wales, Alexandria, Bombay. S-a evidenţiat o preponderenţă a acestor defecte la primul născut şi la nou născuţii a căror mame aveau 40 de ani.

În determinismul bolii sunt implicaţi factori teratogeni, foarte probabil prin interacţiunea cu o susceptibilitate genetică (se estimează chiar acţiunea unor gene majore). Dintre factorii teratogeni implicaţi se apreciază în principal efectul medicamentelor pe bază de valproat administrate în sarcină precum şi scăderea aportului de acid folic în diabetul zaharat insulino-dependent al mamei. Au fost stabilite corelaţii ale bolii cu sezonul (anotimpul) în care se produce naşterea, starea socio-economică, regiunea geografică.

Aceste defecte congenitale pot fi întâlnite şi ca asocieri în diferite sindroame malformative care sunt cauzate fie de mutaţii monogenice, fie de aberaţii cromozomiale, etiologia multifactorială fiind plauzibilă pentru defectele solitare.

Anencefalia – nedezvoltarea neurocraniului şi a encefalului, este o anomalie gravă, incompatibilă cu viaţa. Etiologia anencefaliei este complexă, fiind implicaţi factori genetici predispozanţi şi diverşi factori de mediu cu acţiune asupra dezvoltării intrauterine.

Spina bifida – defecte de fuziune a arcurilor vertebrale în diferite zone ale coloanei. Anomalia poate fi aperta, când la locul defectului scheletic lipsesc părţile moi şi oculta, în care defectul scheletic este acoperit de planurile muscular şi tegumentar.

Defectul vertebral are etiologie multifactorială, componenta genetică fiind reprezentată de predispoziţia ereditară (mai multe gene de risc cu efect aditiv) care, poate depăşi pragul susceptibilităţii prin intervenţia unor factori teratogeni în timpul dezvoltării intrauterine.

Despicăturile congenitale labio-palatine – lipsa suturii părţilor moi labiale asociată sau nu cu lipsa suturii oaselor palatine. Studiile genetice evidenţiază în unele forme o transmitere autozomal dominantă, ca în alte forme să fie estimată intervenţia

predispoziţiei genetice (determinism poligenic multifactorial), cu alte cuvinte, a unei susceptibilităţi ce se va suma la diverşi factori nocivi, teratogeni. Despicăturile congenitale labio-palatine pot apare ca anomalii unice sau ca malformaţii asociate în diverse sindroame determinate monogenic şi în care coexistă şi alte defecte congenitale oro-faciale.

Anomalia poate fi determinată deci:

genetic:

cromozomial: aberaţii ale cromozomilor 13 (sindromul Patau), 18 (sindromul Edwards)

genic: sindromul oro-facio-digital

poligenic multifactorial: incidenţă mai mare în unele familii, deci risc crescut de recurenţă. Concordanţa afecţiunii atinge

valori de 26% la gemenii MZ faţă de 5% la gemenii DZ

epigenetic: intervenţia unor factori teratogeni care perturbă sutura părţilor moi şi/sau a oaselor palatine.

Cunoaşterea determinismului despicăturii labio-palatine asigură recunoaşterea etiologiei şi acordarea sfatului genetic adecvat.

Luxaţia congenitală de şold (displazia luxantă a şoldului)

Este o afecţiune determinată poligenic multifactorial cu un evident substrat familial. Componenta genetică este susţinută de

agregarea bolii în anumite familii şi de concordanţa crescută la gemenii MZ. Boala este mai frecventă la fetiţe.

Mai recent, implicarea factorilor genetici în determinismul bolii este relevată de întârzierea sau scăderea activităţii sistemului

enzimatic ce intervine în degradarea hormonilor materni, care, transmişi transplacentar, provoacă relaxarea ligamentară.

În declanşarea bolii, efectul genelor de risc este completat de intervenţia factorilor de mediu în perioada dezvoltării intrauterine

sau a unor factori mecanici intrauterini cum ar fi oligohidramniosul, bridele amniotice etc

CAPITOLUL 10 VARIABILITATEA GENETICĂ

Variabilitatea genetică reprezintă ansamblul de fenomene care asigură apariţia diferenţelor între indivizii aceleiaşi populaţii şi

între populaţii diferite. Aceste diferenţe de informaţie genetică pot rămâne fără efect asupra fenotipului sau pot determina apariţia bolilor genetice.

Intre cele două extreme se situează polimorfismele fenotipice normale (biochimice, fiziologice, anatomice). Variabilitatea genetică este asigurată de trei categorii de fenomene:

d. Recombinările genetice e. Mutaţiile genetice f. Migraţiile populaţionale

10.1. Recombinările genetice

Recombinările genetice sunt fenomene normale care se produc pe parcursul meiozei şi a fecundării şi care determină apariţia de combinaţii genetice noi. Aceste recombinări sumează interschimburi naturale de material genetic de mărimi variabile: între cromosomi, genomuri şi gene.

10.1.1. Recombinarea cromosomială în cursul meiozei

In cursul meiozei I se produc 2 fenomene recombinatorii: intracromosomială şi intercromosomială.

4. Recombinarea intracromosomială are loc în cursul profazei I şi este consecinţa crossing-over-ului. Acest tip de

recombinare este asigurat de schimbul egal şi reciproc de material genetic între cromosomii omologi. In cursul profazei cromosomii omologi se aliniază perfect de-a lungul cromatidelor formand sinapsa. La nivelul acesteia, între cromatidele omologilor se produc încrucişări. La nivelul punctelor de încrucişare au loc rupturi cromosomice urmate de schimbul de gene între cromosomii omologi.

Datorită recombinărilor intracromosomice, la sfârşitul profazei I fiecare cromosom va avea segmente de origine maternă şi paternă. Numărul de recombinări intracromosomice depinde de mărimea cromosomilor şi de sex, fiind de 5-6 pentru cromosomii

mari şi de cel puţin 1-2 pentru cromosomii mici. Numărul recombinărilor intracromosomiale este mai mare în ovogeneză, fiind estimat la 70-75 recombinari per celulă, faţă de 40-45 recombinări per celulă în spermatogeneză.

În cazuri patologice, imperfecta aliniere a cromosomilor omologi va duce la crossing-over “nelegitim”, în care se schimbă părţi din genele neomoloage, având drept consecinţă sinteza de proteină modificată structural şi funcţional.

Exemplu de crossing-over ―nelegitim‖: Hb Lepore: o parte din gena Δ situată alături de gena β, se va asocia acesteia din urmă. Rezultatul va fi sinteza de lanţ β-globinic modificat, în care o parte din aminoacizi sunt corespunzători secvenţelor din gena Δ (lanţ globinic ―delta-beta‖). În funcţie de lungimea fragmentului de genă Δ transferat la gena β, există diferite variante de expresie fenotipică a hemoglobinei Lepore.

Recombinarea intercromosomială se produce în anafaza meiozei I. După disjuncţia şi migrarea cromosomilor, la fiecare pol celular va ajunge un grup cromosomial alcătuit dintr-un amestec de cromosomi de origine maternă şi paternă. Numărul posibil de recombinări este de 223 (peste 8 milioane de variante), nivelul recombinării meiotice fiind mult mai mare dacă considerăm că fiecare cromosom a suferit cel puţin un crossing over.

Cele două procese de recombinare meiotică fac ca gameţii să fie diferiţi din punct de vedere genetic, iar fiecare cromosom al unui gamet va conţine material genetic de origine maternă în amestec cu material genetic de origine paternă.

10.1.2. Recombinarea în timpul mitozei

Fenomenul de crossing-over poate avea loc şi în mitoză, între cromatidele surori, fiind denumit ―sister chromatid exchange‖.

Frecvenţa acestui tip de crossing-over creşte sub acţiunea agenţilor mutageni; de aceea el este folosit în testarea eventualelor efecte mutagene ale diferitelor substanţe. Mecanismul de producere a crossing-over-ului în mitoză nu este complet cunoscut.

10.2. Recombinarea genomică Recombinarea genomică se realizează prin fuziunea genomului matern cu genomul patern în timpul fecundării. La om,

căsătoriile dintre indivizi diferiţi genetic (neînrudiţi) fac ca gameţii participanţi la fecundare să prezinte ―zestre ereditară‖ diferită între ei, încât descendenţii unui cuplu să fie diferiţi din punct de vedere genetic, asigurându-se astfel o heterogenitate, variabilitate ereditară. Invers, când indivizii unui cuplu sunt înrudiţi (consangvini), gradul de variabilitate se reduce, crescând riscul de recurenţă a bolilor recesive (risc de întâlnire a doi heterozigoţi pentru acelaşi tip de genă recesivă).

10. 3. Diversitatea genetică dintre indivizi

10.3.1. Polimorfismul genetic

Diversitatea fenotipică este una dintre proprietăţile generale ale populaţiilor. În orice populaţie indivizii prezintă, pentru cea mai mare parte a caracterelor, fenotipuri foarte diferite. Genetica populaţiilor studiază amploarea variabilităţii genetice în populaţie, explică originea acesteia, modalităţile de menţinere şi importanţa evolutivă.

Exemple de polimorfisme genetice: grupele sangvine, unele proteine (enzime) sau variaţiile de lungime ale fragmentelor de restricţie (polimorfisme ale ADN).

Aplicaţiile studiului polimorfismelor genetice: 5. pentru reconstituirea evoluţiei ancestrale a populaţiilor, sau a unor grupe populaţionale, 6. pentru cercetarea relaţiilor genetice între subpopulaţii. 7. ca markeri genetici: într-o familie la care se cunoaşte istoria unei boli pe mai multe generaţii se pot urmări markerii

genetici pentru a determina membri purtători ai genei mutante şi pentru efectuarea unui diagnostic precoce al indivizilor susceptibili de a face boala.

8. polimorfismele ADN au utilitate în medicina legală, în identiicarea de persoane sau stabilirea paternităţii.

10.3. 2. Polimorfismul proteic

Modificarea unui codon în gena structurală (ex. înlocuirea GGU cu GAU) det. substituţia unui AA în polipeptidul

corespondent (ex. glicina este înlocuită cu acidul aspartic). Dacă o proteină specifică poate fi purificată şi secvenţializată, atunci va fi posibilă detectarea variaţiei genetice a acestei proteine în populaţie. Ea se bazează pe schimbarea proprietăţilor fizice ale unei proteine, atunci când un AA este înlocuit cu altul. Pentru a detecta o astfel de schimbare proteina va fi supusă unei electroforeze în gel. Este deci posibilă cercetarea proporţiei genelor structurale polimorfice în genomul speciei umane ca şi heterozigoţia medie a unei populaţii.

Conceptul de polimorfism proteic permite deci evidenţierea diferitelor variante pentru o proteină şi reflectă gradul de diversitate individuală existent în cadrul populaţiei.

Multitudinea de variante genotipice individuale va da naştere la infinite combinaţii genotipice şi fenotipice. Variaţia genetică a alfa1 -antitripsinei Alfa1-antitripsina este o proteină serică cu acţiune inhibitoare asupra unor enzime proteolitice specifice cum sunt: tripsina,

chimotripsina, elastaza pancreatică. Ţinta sa principală este elastaza leucocitară, enzimă care, în lipsa inactivării de către alfa1-antitripsină, distruge proteinele ţesutului conjunctiv pulmonar, în special elastina, determinând dezorganizarea alveolelor pulmonare.

Locusul genei care specifică alfa1-antitripsina, cunoscut sub numele de PI (protease inhibitor) este situat la nivelul cromosomului 14 şi prezintă un înalt polimorfism. Unele variante alelice sunt mai frecvente în populaţie, altele mai rare. Cele mai frecvente alele (M1, M2, M3) codifică variante proteice structural diferite dar cu funcţie normală. Alte alele specifică variante proteice cu activitate inhibitorie proteazică semnificativ redusă, ceea ce duce la apariţia manifestărilor clinice.

Mutaţiile Mutaţia este definită ca o modificare bruscă şi permanentă apărută în structura şi funcţionalitatea unei părţi din materialul

genetic. Mutaţiile stau la baza tuturor bolilor genetice umane. Mutaţiile pot fi determinate de expunerea la diferiţi factori mutageni externi sau interni. Aceştia din urmă reprezintă sursa cea

mai importantă de mutaţii, producând îndeosebi erori în timpul replicării moleculei de ADN. Mutațiile sunt rare, deoarece ADN-ul este o moleculă foarte stabilă din mai multe motive:

2. ADN-ul este în mod normal dublu catenar, o mutație care afectează o catenă poate fi reparată folosind informația de pe catena complementară.

3. Bazele azotate se găsesc în interiorul helixului, fiind protejate de scheletul fosfoglucidic. 4. Structura dublu helicoidală a ADN-ului și spiralizarea nucleozomilor realizează o structură geometrică stabilă.

Datele statistice arată că în cursul vieţii unui individ au loc 1017 diviziuni celulare: aproximativ 2 × 1014 diviziuni sunt necesare

pentru a genera aproximativ 1014 celule ale adultului, iar celelalte mitoze vor asigura înnoirea unor anumite tipuri de celule. La fiecare diviziune este necesară încorporarea a 6 × 109 nucleotide noi, iar procesul replicării ADN trebuie să se realizeze cu foarte mare acurateţe pentru copierea exactă a informaţiei ereditare. Menţinerea acestui grad înalt de fidelitate este foarte greu de realizat, astfel încât se estimează că pe parcursul celor aproximativ 1017 mitoze din cursul vieţii, în general, fiecare genă poate suferi aproximativ 108-1010 mutaţii. În multe cazuri, o mutaţie aparută într-o celulă somatică poate fi letală pentru acea celulă, astfel mutaţia nu se va propaga la alte celule. Totuşi, în unele cazuri, mutaţia poate determina o continuare inadecvată a diviziunii celulare, determinând astfel un proces malign.

În general mutaţiile pot să afecteze orice parte a moleculei de ADN. Mutaţiile ADN-ului codant au cele mai importante

consecinţe asupra fenotipului. Mutaţiile care afectează ADN-ul codant sunt de 2 tipuri: mutaţii silenţioase: datorită apariţiei unui codon sinonim în urma mutaţiei, (cod genetic degenerat) nu determină modificarea

secvenţei aminoacizilor în lanţul polipeptidic. Sunt mutaţii neutre, care nu conferă avantaje sau dezavantaje organismului în care au apărut.

mutaţii care nu determină formarea unui codon sinonim (non-sinonime): alterează secvenţa aminoacizilor în lanţul polipeptidic. Ele vor fi exprimate fenotipic cu intensităţi diferite în funcţie de tipul genei afectate şi de întinderea mutaţiei, unele fiind chiar letale, caz în care alterarea materialului genetic este incompatibilă cu viaţa (uneori chiar incompatibilă cu dezvoltarea prenatală, ducând la avort spontan).

Mutaţiile non-sinonime pot avea fi:

detrimentale, generează alele patologice şi reprezintă baza etiologică a bolilor genetice

neutre, determinând producerea de forme alternative de alele pentru acelaşi locus (de exemplu alelele pentru grupele sanguine ABO, alelele pentru sistemul HLA, etc.).

avantajoase, prin noua sa structură, conferă organismelor o mai bună adaptabilitate şi rezistenţă la mediu; Majoritatea mutaţiilor noi au efecte detrimentale, determinând boli cu severitate diferită, unele chiar letale.

10.4.1. Originea şi rata mutaţiilor

Mutaţiile pot să afecteze orice tip de celule, atât celulele germinale, cât şi celulele somatice. Mutaţiile germinale se vor transmite la generațiile următoare, fiind responsabile de apariţia bolilor ereditare la descendenţi. Mutaţiile somatice se pot produce în orice alt tip de ţesut, astfel că celulele organismului respectiv devin mozaicate: aceste

mutaţii, denumite şi dobândite, nu sunt transmisibile descendenţilor.

Mutaţiile pot fi prezente în genotipul genitorilor sau sunt produse "de novo" în celulele sexuale ale acestora. Dacă o mutaţie se produce în celulele sexuale în timpul diviziunilor mitotice premergătoare procesului meiozei, sau în plină meioză, gameţii maturi vor prezenta mutaţie "de novo", care va fi moştenită de către descendenţi.

Dat fiind faptul că spermatogeneza se desfăşoară continuu pe tot parcursul perioadei de maturitate sexuală, frecvenţa mutaţiilor "de novo" de origine paternă este mai ridicată decât a celor de provenienţă maternă. Acest fapt este observat în mai multe boli cum ar fi: neurofibromatoza, acondroplazia, distrofia musculară Duchenne, hemofilia A, rinichiul polichistic, etc. În acondroplazie din 10 copii bolnavi, 8 cazuri sunt considerate ca prezentând mutaţie "de novo".

Mutaţ i i le pot f i :

spontane, reprezintă modificări în materialul genetic apărute în cursul vieţii, sub acţiunea factorilor mutageni din natură; induse (artificiale), care se produc de către factorii mutageni fizici şi chimici administraţi pe o perioadă limitată de timp,

fie pentru efectele lor terapeutice (röntgenterapie sau chimioterapie în cancer), fie în laborator, în scop de cercetare. Mutaţiile genomice rezultă din tulburări de segregare - disjuncţie - a uneia sau mai multor perechi de cromozomi cu formare

de gameţi aneuploizi. Pe baza observaţiilor privind incidenţa anomaliilor cromozomice la feţii avortaţi spontan, ca şi printre nou-născuţi, se estimează că disjuncţiile patologice în diviziunea meiotică afectează aproximativ 25-50 dintre celulele care parcurg fazele meiozei (cele mai frecvente disjuncţii patologice se produc în meioza primară).

Mutaţiile cromozomice (aberaţii structurale) apar cu o frecvenţă ceva mai mică decât cele genomice. Deşi rata de producere a mutaţiilor genomice şi cromozomice împreună este destul de ridicată, frecvenţa lor în patologie este mai scăzută, datorită faptului că cele mai multe dintre mutaţii sunt incompatibile cu reproducerea normală.

Mutaţiile genice sunt rezultatul perturbărilor de secvenţializare a nucleotidelor din ADN şi care au de obicei repercursiuni grave asupra expresiei genelor în fenotip.

10.4.2. Baza moleculară a mutaţiilor În principiu, bolile genetice pot fi determinate de următoarele tipuri de mutaţii:

Mutaţii cu substituţii de nucleotide: 4. Mutaţii sens: substituţia unui nucleotid (mutaţii punctiforme) în exon, care poate fi:

- în tranziţie, baza azotată fiind înlocuită cu alta de acelaşi tip; - în transversie, o bază de tip purinic fiind înlocuită cu una de tip pirimidinic şi invers. substituţia unui nucleotid în intron; substituţia unui nucleotid în promotor;

b) Mutaţii nonsens: codonul stop aşezat ―prematur‖ înaintea capătului genei; dispariţia codonului stop care devin codon sens, care determină elongarea lanțului polipeptidic

Substituţia unui singur nucleotid în ADN, cunoscută şi sub denumirea de mutaţie punctiformă, poate altera informaţia

codonului respectiv, cauzând specificarea altui aminoacid în structura proteinei. De aceea, asemenea mutaţii mai sunt denumite şi missense, ele modificând ―sensul‖ informaţiei codificate în genă (prin mutaţia unui codon cu sens). În patologia umană sunt cunoscute multiple boli care au ca etiologie substituţia unui nucleotid într-o anumită genă. Exemple de asemenea afecţiuni sunt: hemoglobinopatiile S, C, E, M etc.

În hemoglobinopatia S (anemia cu hematii sicklice), mutaţia unui nucleotid din gena beta (în codonul din poziţia 6) determină specificare greşită de aminoacid în lanţul beta-globinic, respectiv înlocuirea acidului glutamic cu valina. Această mutaţie punctiformă este responsabilă de anemia hemolitică din hemoglobinopatia S (gravitatea tabloului clinic este mai mare în forma homozigotă).

În hemoglobinopatia C, ca şi în cea de tip S, substituţia unui nucleotid în aceeaşi poziţie 6 din gena beta, antrenează înlocuirea acidului glutamic din lanţul beta-globinic cu lizina (în această hemoglobinopatie, anemia hemolitică este mai blândă).

În afară de mutaţiile punctiforme pentru un codon cu sens, descrise mai sus, substituţia unui nucleotid poate avea loc în afara secvenţelor codante ale genei, cum ar fi în interiorul promotorului sau în regiunile netranslabile din genă. Astfel, o mutaţie punctiformă în promotor va induce implicit perturbarea expresiei genice, în principal prin procesare defectuoasă a ARN-m matur (situaţie frecvent întâlnită în unele hemoglobinopatii).

Pe de altă parte, o mutaţie punctiformă se poate instala într-una din regiunile netranslabile, perturbând, de asemenea, expresia genei. Aşa de exemplu, mai multe cercetări au descoperit că în hemofilia B (boală cu transmitere X-linkată), mutaţia genei care specifică factorul IX al coagulării constă într-o substituţie nucleotidică din regiunea netranslabilă învecinată promotorului genei, ceea ce va perturba nivelul normal de sinteză al factorului IX. Ultimele studii în acest domeniu demonstrează că această mutaţie perturbă procesul normal al maturării ARN-m.

Mutaţia nonsense este reprezentată, de obicei, fie prin schimbarea poziţiei unuia din cei trei codoni stop (prin aşezarea prematură în genă), fie prin dispariţia codonului stop. În primul caz, transcripţia şi respectiv translaţia se vor opri prematur, încât va fi afectată lungimea polipeptidului ce urmează a fi specificat (asemenea cazuri sunt frecvent întâlnite în unele hemoglobinopatii).

De curând, studiile efectuate în neurofibromatoză (boală monogenică cu transmitere dominant autozomală) au descris tipul mutaţiei ca fiind reprezentată de apariţia unui codon stop de-a lungul genei. Referitor la cele expuse mai sus, trebuie precizat faptul că unii cercetători presupun că mutaţia nonsense nu ar avea efecte în transcripţie, ci ar perturba procesul translaţiei.

În cazul în care codonul stop dispare, gena va fi citită în continuare până la apariţia unui următor codon stop, încât lanţul polipeptidic va cuprinde mai multe inserţii de aminoacizi decât în mod obişnuit. Un asemenea mecanism stă la baza apariţiei hemoglobinei Constant-Spring, în care lanţul alfa-globinic sau cel beta-globinic cuprind peste 30 de aminoacizi în plus faţă de catena normală.

2. Mutaţia cu defect de asamblare a ARN-m

Formarea ARN-m matur, prin care sunt excizate porţiunile (fragmentele) de ARN-m transcrise de pe introni, este dependent de secvenţializarea nucleotidelor plasate între exoni şi introni. Atunci când una dintre aceste secvenţializări a suferit mutaţii, în ARN-m matur va lipsi – la locul corespunzător – legătura dintre două fragmente ale sale. Asemenea tulburări de încatenare de ARN-m matur (tulburări de splicing), consecutive substituţiei unui singur nucleotid, s-au observat în: hemofilia A, hemofilia B, b-talasemie, neurofibromatoza, fenilcetonurie (boală monogenică cu transmitere recesiv autozomală), gangliozidoza Tay-Sachs (boală metabolică recesiv autozomală) ş.a.

3. Mutaţii extinse (deleţii, inserţii, duplicaţii)

a) mutaţii în frame-shift: deleţia/ inserţia implică un număr de nucleotide care nu este multiplu de trei, astfel încât de la locul mutaţiei procesul de

translaţie va fi decalat, rezultând ample modificări în structura proteinei. Exemple: boli metabolice lisosomale, talasemia, miodistrofia Duchenne.

b) mutaţii prin deleţia sau inserţia unuia sau mai multor codoni: pierderea unui codon determină absenţa unui aminoacid în proteină. Exemplu: gena care specifică fibroza chistică, localizată pe cromozomul 7, conţine 27 exoni; una dintre cele mai frecvente alele

mutante se caracterizează prin deleţia unui codon, aceasta conducând la absenţa fenil-alaninei în poziţia 508 din totalul aminoacizilor din proteină; deleţii extinse de codoni în genă. Exemple: ichtioza (forma X-linkată), alfa-talasemia, miodistrofia Duchenne; inserţii largi de codoni. Exemple: hemofilia A (poate apare şi prin mutaţie cu defect de asamblare a ARN-m);

c) mutaţii cu deleţia unor gene alăturate; Aceste tipuri de mutaţii determină apariţia de microdeleţii. Exemple: sindroame cu microdeleţii: Prader-Willi, Angelman etc.

d) mutaţii cu deleţii şi inserţii cauzate de recombinări genice defectuoase; astfel de mutaţii apar prin crossing-over patologic;

Exemple: hemoglobina Lepore, disgeneziile gonadale prin recombinări genice între cromozomii X şi Y (translocaţii produse între genele de pe X şi Y) care determină apariţia bărbaţilor XX (disgenezie gonadală);

e) mutaţii cu duplicaţii şi inserţii întinse; Exemple: hipercolesterolemia familială, afecţiune în care se pot decela peste 150 de tipuri de mutaţii genice, dintre care amintim: duplicaţia mai multor exoni în genă şi inserţii greşite de codoni;

f) mutaţii cu expansiuni (repetări) de trinucleotide; Exemple: boala Huntington, sindromul cu X-fragil.

Mutaţiile extinse sunt cauzate de inserţia sau deleţia mai multor perechi de nucleotide, putând fi interesată chiar o genă întreagă. În genere, decelarea şi studiul acestora se face prin metodele perfecţionate de electroforeză a ADN-ului. În cazuri mai rare, când deleţia este foarte extinsă, pot apare şi modificări morfologice pe cromozomi, vizibile microscopic.

În cazul în care deleţia sau inserţia implică câteva perechi de baze, dar numărul acestora nu este un multiplu de trei (adică nu interesează totalitatea bazelor din codonii implicaţi în mutaţie), ordinea procesului de translaţie va fi complet decalată de la locul mutaţiei, specificându-se astfel greşit mai mulţi aminoacizi. Aceste mutaţii sunt cunoscute sub denumirea de mutaţii în frame-shift (cu ample modificări în structura proteinei).

Dacă inserţia sau deleţia cuprinde un număr de nucleotide multiplu de trei, mutaţiile nu vor determina modificări în frameshift în proteină, ci doar specificări greşite de aminoacizi, în raport cu numărul codonilor mutaţi. Un exemplu tipic în acest sens îl reprezintă deleţia decelată în fibroza chistică (boală monogenică recesiv autozomală), în care mutaţia cuprinde trei perechi de baze şi consecutiv, în produsul proteic al genei respective, lipseşte un singur aminoacid. Deleţiile şi inserţiile pe lungimi mai mari ale genei antrenează alterări grave ale funcţiei genice, acestea stând la baza multora dintre bolile genetice.

În ichtioză spre exemplu (boală de piele transmisă X-linkat), gena responsabilă pentru producerea bolii a fost observată ca deletată total, în peste 90% din cazuri.

În miodistrofia Duchenne (boală monogenică X-linkată), deleţia cuprinde cea mai mare parte a genei. În a-talasemie (hemoglobinopatie), de asemenea, unul din cei doi loci pentru specificarea a-globinei prezintă o deleţie extinsă.

În hipercolesterolemia familială (boală metabolică dominant autozomală), studiile moleculelor de ADN au relevat prezenţa unor duplicaţii la mai mulţi exoni în gena patologică, acestea antrenând o importantă scădere a funcţiei receptorilor pentru lipoproteine şi consecutiv apariţia bolii.

10.4.3. Deleţii şi duplicaţii cauzate în timpul recombinărilor genetice În timpul meiozei primare, apropierea (alinierea) neparalelă a perechii de cromozomi omologi va duce la desfăşurarea unui

crossing-over ―nelegitim‖ cu schimburi între gene neomoloage şi consecutive alterări secvenţiale în gene, prin ataşarea unui fragment dintr-o genă la o alta învecinată.

Unul din exemplele din patologia umană îl reprezintă hemoglobinopatia Lepore în care printr-un crossing-over nelegitim, o parte din gena delta se ataşează genei beta. Consecutiv, lanţurile beta – globinice vor prezenta secvenţe mixte de aminoacizi ―beta-delta‖, care vor antrena, în funcţie de lungimea schimbului, tulburări mai mult sau mai puţin importante ale funcţiei hemoglobinei.

În alte situaţii, recombinările patologice din meioză antrenează transfer al unei gene de pe un cromozom sexual pe altul. Astfel, prin translocarea genică de pe cromozomul Y pe X rezultă cazurile de ―bărbaţi XX‖ (această stare va fi tratată

amplu în cadrul tulburărilor de sexualizare). 10.4.4. Mutaţii cu expansiuni de trinucleotide In ultimii ani au fost însă descrise modificări ale ADN-ului care au fost denumite mutații dinamice. Ele se caracterizează prin

instabilitate și anume cu trecerea de la o generație la alta crește numărul de copii ale unor anumite repetări trinucleotidice. Mutaţiile cu repetări ale unor secvenţe trinucleotidice reprezintă, de asemenea, mutaţii extinse. Expansiunea trinucleotidelor

poate avea loc fie în exonul sau intronul de la capătul genei, fie în alte regiuni necodante. Caracteristica acestor mutaţii o constituie creşterea numărului de repetări cu ocazia diviziunilor celulei care le poartă.

Expansiunea de un anumit număr de ori a trinucleotidelor este denumită premutaţie. Indivizii care prezintă premutaţii sunt fenotipic sănătoşi. Mutaţia este definită ca expansiunea secvenţelor trinucleotidice peste o anumită valoare.

Efectul patologic al acestor inserții este dominant (mutaţie cu câștig de funcție), numai o singură alelă fiind necesar să fie afectată pentru apariția bolii (ex boala Huntington). Acumularea repetărilor trinucleotidice se observă în bolile ereditare neurologice, în care o genă mutantă trece dintr-o generație in alta și se alungește cu fiecare meioză. Acest tip de mutaţii induce în special o patologie neurologică.

Creşterea numărului repetărilor trinucleotidice odată cu trecerea de la o generaţie la alta determină fenomenul de anticipaţie prin care o boală ereditară debutează mai devreme şi devine mai severă pe masura transmiterii de la o generaţie la alta, fenomene care decurg în paralel cu creşterea numărului repetărilor trinucleotidice.

Dintre afecţiunile datorate repetărilor trinucleotidice menţionăm boala Huntington, moştenită dominant autozomal şi sindromul cu X fragil, la care transmiterea este X-linkată. În acest sindrom mutaţia este reprezentată de expansiunea de mai mult de 200 de ori a trinucleotidelor CCG. Ea antrenează şi modificări morfologice ale telomerelor cromozomului X, evidenţiabile prin tehnici speciale de citogenetică sau prin tehnici moleculare.

10.4.5. Agenţii mutageni

Factorii mutageni fizici

Factorii mutageni fizici capabili să inducă alterări în materialul ereditar sunt: radiaţiile ionizante, radiaţiile neionizante

(ultravioletele) şi oscilaţiile mari de temperatură (radiaţii termice). Prin radiaţii ionizante se înţeleg radiaţiile electromagnetice cu lungimi de undă sub 100 Å, precum şi radiaţiile corpusculare ca:

electronii, neutronii, particulele a, protonii, ionii grei acceleraţi şi fragmentele de fisiune. Radiaţiile electromagnetice difuzate în spaţiu, acţionează rapid, scăzând capacitatea de încorporare a precursorilor în ADN şi

perturbând biosinteza acestuia. Radiaţiile gamma au efect drastic ionizant asupra celulelor, cele mai sensibile fiind celulele tinere. Acţiunea mutagenă,

cancerigenă a razelor gamma este cunoscută de foarte mult timp şi demonstrată experimental. Dat fiind efectul lor distructiv asupra celulelor în plină proliferare, razele gamma sunt folosite în terapia tumorilor canceroase, în încercarea de oprire a procesului proliferativ (iradieri terapeutice). Efectul acestei conduite terapeutice este tranzitor, limitat, producând în acelaşi timp în ţesutul iradiat,

alte mutaţii consecutive radioterapiei. Efectele radiaţiilor ionizante asupra materialului ereditar sunt dăunătoare, gravitatea lor fiind dependentă de doza radiaţiei, timpul cât acţionează şi tipul de ţesut asupra căruia au loc iradierile.

Asupra acizilor nucleici pot produce: substituţii de baze; inversii de baze; deleţii; ruperea catenelor de ADN (denaturare); inhibarea replicării ADN; inhibarea sintezei ARN. La nivel cromozomial pot determina: disjuncţie patologică în timpul diviziunilor; aneuploidii; rupturi cromozomice; deleţii; alte rearanjamente cromozomiale. Agenţii mutageni chimici

Sunt de o mare diversitate în natură. Ei sunt reprezentaţi de diferite substanţe chimice medicamentoase sau nemedicamentoase (folosite în industria chimică, agricultură etc.).

Concomitent cu lărgirea paletei de medicamente utilizate în terapie s-a observat încă de mai mulţi ani efectul posibil mutagen a numeroase substanţe medicamentoase. La fel, folosirea în mediul ambiant a multor agenţi chimici ca: pesticide, ierbicide, fungicide ş.a. duce la o adevărată poluare chimică cu efecte drastice de tip mutagen şi/sau teratogen.

Acţiunea nocivă a substanţelor chimice din natură şi a unor substanţe chimice medicamentoase se exprimă prin: erori de replicare a ADN; inhibarea enzimelor necesare replicării reparatorii a ADN; deleţii de baze azotate în ADN; substituţii de baze azotate în ADN; ruperi ale catenelor de ADN; perturbări ale sintezei ARN; perturbări ale procesului diviziunilor celulare; activarea provirusurilor tumorale; modificări ale morfologiei cromozomilor (rearanjamente structurale). Dintre substanţele cu efect sigur mutagen, notăm: agenţii alkilanţi, hidrocarburile policiclice aromate, substanţele pe bază de

nitrozoderivaţi, acridinele, medicamentele cu efect citostatic etc.

Agenţii mutageni biologici

De mai mulţi ani este cunoscut faptul că unele virusuri, atât dintre retrovirusuri (cu genom ARN), cât şi dintre adenovirusuri (cu genom ADN), au efecte mutagene asupra celulelor.

Prin multiplele cercetări efectuate în vederea cunoaşterii mecanismelor oncogenezei s-a evidenţiat prezenţa unor particule virale în genomul celulelor canceroase din unele forme de cancer. Studiile de oncogeneză reliefează astfel că virusurile oncogene se ataşează de genomul celulei gazdă în anumite situsuri, determinând, mai devreme sau mai târziu, inducerea procesului canceros, în raport cu acţiunea altor factori cancerigeni din mediu (şi a unei predispoziţii genetice a organismului respectiv).

Retrovirusurile prezintă o enzimă, reverstranscriptaza, cu ajutorul căreia se va sintetiza o moleculă de ADN de pe tiparul ARN-ului genomic viral. După sinteză, acest ADN se integrează în genomul celulei gazdă şi rămâne sub formă de provirus, putând determina imediat sau ulterior transformarea celulei în celulă canceroasă.

Unele cercetări de mutageneză sugerează efectele mutagene posibile şi a altor virusuri ca: virusul herpetic, virusul hepatitei epidemice, virusurile gripale ş.a.

Capitolul 11

CITOGENETICĂ CLINICĂ

Citogenetica se ocupă cu studiul morfologiei cromozomilor în contextul cariotipului, structura lor normală şi modificările pe care le prezintă asociat sindroa-melor cromozomiale.

Anomaliile cromozomiale sunt responsabile de o parte importantă a bolilor genetice având o incidenţă de 1/150 de nou-născuţi vii şi reprezintă cauza principală a retardului mental, a eşecurilor de reproducere şi a defectelor congenitale. Se estimează că 7,5% din totalul concepţiilor prezintă aberaţii cromozomiale, dar majoritatea se pierd ca avorturi în procent de 50% şi 20% în cadrul avorturilor spontane din trimestrul I respectiv II de sarcină.

Studiile de citogenetică au identificat până în momentul de faţă peste 90 de sindroame cromozomiale la copii, dintre care o parte – dependent de variabilitatea sindromului – poate fi întâlnită şi în patologia adultului.

11.1. Descrierea anomaliilor cromozomice

Aberaţiile cromozomice pot fi constituţionale sau dobândite. Aberaţiile cromozomice constituţionale pot fi moştenite de la unul din părinţi sau pot apărea ca mutaţii noi în timpul gametogenezei sau

embriogenezei timpurii. Aberaţia este întâlnită de obicei în toate celulele individului afectat şi fiind prezentă în celulele germinale poate fi transmisă în descendenţă.

Aberaţiile cromozomice dobândite pot apărea în timpul creşterii fetale sau mai târziu în celulele care-şi păstrează capacitatea de a se divide. Aberaţiile dobândite de celulă vor fi transmise tuturor descendenţilor acesteia. Unele dintre aceste aberaţii sunt letale pentru celulă, dar altele sunt benigne şi se pot cumula în timp. Aberaţii cromozomice dobândite au fost descrise în unele leucemii şi tumori solide.

După aspectul modificării, anomaliile cromozomiale pot fi numerice sau structurale.

11.1.1. Anomalii cromozomiale numerice

Acestea sunt reprezentate de un număr deviant de cromozomi faţă de normal, stare denumită aneuploidie. Existenţa unui cromozom în plus într-o pereche de cromozomi poartă denumirea de trisomie, iar absenţa unui cromozom, monosomie.

Când cromozomul trisomic este prezent în toate celulele organismului trisomia este omogenă iar dacă trisomia, este prezentă doar într-un procent din celule se vorbeşte de trisomie în mozaicism. Similar, în cazul monosomiei, când cromozomul este absent în toate celulele organismului, monosomia este omogenă şi dacă el lipseşte doar într-un anumit procent al celulelor, se vorbeşte de monosomie în mozaicism.

Cromozomul trisomic poate fi liber, neataşat altui cromozom sau translocat, lipit pe un cromozom din aceeaşi pereche sau din altă pereche de cromozomi.

Se ştie că la baza producerii anomaliilor stau disjuncţiile patologice din meioză pentru aneuploidiile omogene şi din mitoza zigotului pentru aneuploidiile în mozaic.

Consecutiv unei disjuncţii patologice meiotice, gameţii maturi vor prezenta “dezechilibre cromozomice”, cu alte cuvinte, în garnitura lor haploidă vor prezenta un cromozom în plus sau în minus. Participarea la fecundare a unui asemenea gamet va duce implicit la constituirea unui produs de concepţie cu aberaţie cromozomială în toate celulele sale.

Conceptul de disomie

Individul moşteneşte în cadrul perechii de cromozomi câte un cromozom de la fiecare genitor. Ocazional poate moştenii ambii cromozomi ai unei perechi de la un singur părinte, rezultând un gamet disomic pentru o pereche de cromozomi.

Gametul disomic, după fecundare cu un gamet normal formează un zigot trisomic pentru acea pereche.Supravieţuirea acestui zigot este posibilă prin pierderea timpurie în cursul embriogenezei a cromozomului parental moştenit în copie unică. Se restabileşte astfel numărul normal de cromozomi, dar celula prezintă disomie uniparentală, denumită sub alt termen “trisomie salvată”.

O altă modalitate de apariţie a disomiei uniparentale este prin fecundarea gametului disomic de către un gamet nulisomic (fără nici un cromozom al perechii respective de cromozomi). De la început apare un zigot cu număr normal de cromozomi, dar având cromozomii unei perechi moşteniţi de la un singur genitor. Pe lângă modalităţile descrise mai sus, este disomia uniparentală ca un mecanism compensatoriu a unui zigot monosomic apărut prin fecundarea unui gamet normal cu un gamet nulisomic. Viabilitatea acestui zigot monosomic este posibilă numai prin duplicarea cromozomului aflat în doză unică, rezultând un produs de concepţie cu isodisomie uniparentală.

Raportat la momentul instalării nondisjuncţiei disomia uniparentală poate fi heterodisomie sau isodisomie. Nondisjuncţia în anafaza I a gametogenezei determină starea de heterodisomie uniparentală, deoarece cromozomii omologi din cadrul perechii nu sunt identici. Nondisjuncţia în anafaza II a gametogenezei determină starea de isodisomie uniparentală, structura genică a cromozomilor fiind identică.

Sindroamele Prader-Willi şi Angelman sunt două exemple semnificative la care fenotipul patologic poate fi cauzat şi prin fenomenul de disomie uniparentală. Majoritatea celor afectaţi cu aceste două sindroame (70%) au ca mecanism patogenic microdeleţia15q, localizată juxtacentromeric cu specificarea că pentru sindromul Prader-Willi moştenirea microdeleţiei este paternă, iar pentru sindromul Angelman microdeleţia este maternă, prin fenomenul de amprentare genomică (vezi amprenta genomică). La o parte dintre cei afectaţi nu s-a găsit microdeleţia şi apariţia fenotipului este explicată prin disomia uniparentală, astfel pentru sindromul Prader-Willi isodisomia este maternă, moştenind ambii cromozomi ai perechii 15 de la mamă, iar în sindromul Angelman perechea 15 de cromozomi este de origine paternă.

Mozaicismul este rezultatul unei disjuncţii patologice mitotice în primele faze de proliferare ale blastomerelor ceea ce va determina apariţia

a două sau mai multe clone celulare, cu cariotip normal şi deviat (46/47/45). Această situaţie rezultă prin disjuncţie patologică postzigotică. De

regulă mozaicismul este cu două clone celulare, una patologică şi alta normală (exemplu: 45,X/46,XX). Fenotipul în cadrul cariotipului cu stare de

mozaicism este corelat cu proporţia clonelor celulare patologice faţă de clonele celulare normale, variind astfel de la un tablou clinic complet, la

manifestări reduse.

Triploidia, se caracterizează prin existenţa a trei seturi complete de cromozomi în celula somatică.La om apare de obicei prin dispermie, adică

fecundarea ovulului de către doi spermatozoizi sau prin defectele diviziunii de maturaţie ale ovulului sau spermatozoidului, astfel că apare un

gamet diploid. Celula-ou sau zigotul va avea 69 de cromozomi, iar fătul diploid are 69,XXY (în 60%din cazuri), 69,XXX (în 30% din cazuri) sau

69,XYY (în 10% din cazuri), depinzând de originea setului extracromozomic. În majoritatea cazurilor setul extracromozomic este de origine

paternă. Feţii triploizi sunt avortaţi preponderent, excepţional ajung să supravieţuiască pâna la termen şi au o viabilitate redusă. Tetraploidia (patru seturi complete de cromozomi în celula somatică) se datorează în special defectelor primei diviziuni mitotice a

zigotului, formându-se celule cu număr dublu de cromozomi 92,XXXX sau 92,XXYY.Celulele care au 92,XXXY sau 92,XYYY sunt produse de erori de fertilizare. Feţii tetraploizi nu sunt viabili.

Corelaţii anomalii cromozomiale şi fenotip

Recunoaşterea fenotipică a unei anomalii cromozomiale se bazează pe câteva criterii definitorii: retardul de dezvoltare intrauterin al produsului de concepţie; retardul de creştere postnatal; retardul mental în grade variabile ; un patern facial caracteristic, denumit dismorfie facială, fiind orientative următoarele: creşterea distanţei interpupilare (hipertelorism),

prezenţa unui pliu cutanat în unghiul intern ocular (epicant), modul de orientare al fantelor palpebrale, diverse anomalii oculare (microftalmie, enoftalmie, colobomă, cataractă etc.), rădăcina nasului înfundată, anomalii de formă ale nasului, micro şi retrognaţie, aspecte ca micro sau macrostomie, palat ogival, fisură labială+/- palatină, implantare joasă a urechilor cu anomalii de formă, mărime precum şi alte modificări faciale;

anomalii ale membrelor ; malformaţii viscerale.

Paralelism între anomaliile cromozomiale autozomale şi gonozomale din punct de vedere citogenetic şi clinic:

Citogenetic:

monosomia totală autozomală la oricare dintre perechile autozomale compromite viabilitatea produsului de concepţie determinând avort spontan, oprirea în evoluţie sau naşterea unui făt mort. Postnatal sunt întâlnite numai sindroame cromozomiale cu monosomie parţială, exemplu: sindromul Wolf-Hirschorn (monosomie parţială 4p);

trisomia totală autozomală pentru grupele de cromozomi A,B,C are aceleaşi consecinţe ca şi monosomia totală, fiind viabile numai trisomii în

mozaic, exemplu (trisomia 8 în mozaic), sau mai frecvent ca şi trisomie parţială, exemplu (sindromul de trisomie 4p). De la grupa D de cromozomi se pot întâlni trisomii totale la nou-născuţi, definite ca sindroame cu fenotip caracteristic uşor de diagnosticat, exemplu (trisomia 13, 18, 21);

monosomia totală gonozomală este întâlnită postnatal numai la cromozomul X la sexul feminin, dar este cunoscut că 95-99% dintre produşii de concepţie cu monosomie X sunt sortiţi eşecului de reproducere;

prezenţa în plus a cromozomului X sau a cromozomului Y este compatibilă cu naşterea unui organism viabil (exemplu: 47,XXX, 48,XXXX,49,XXXXX, 47,XXY, 48,XXXY, 49XXXXY, 47,XYY, 48XYYY).

Clinic:

anomaliile cromozomice autozomale prezintă un tablou clinic mai complex şi cu mai mare gravitate decât cele gonozomale. Manifestările în fenotip implică multiple organe şi sisteme, specificând că în unele anomalii autozomale este afectată morfogeneza şi funcţionalitatea aparatului reproducător (exemplu: criptorhidie, hipospadias în sindromul sindromul Wolf-Hirschhorn);

anomaliile cromozomice gonozomale influenţează dezvoltarea gonadelor fiind cauză de hipogonadism, malformaţii genitale, insuficienţă pubertară, sterilitate şi infertilitate. Manifestările fenotipice sunt mai puţin grave, respectând criteriile generale de recunoaştere a unei anomalii

cromozomiale (referitor la creştere, dezvoltare mentală, malformaţii viscerale), exemplu monosomia X, unde retardul de creştere poate fi sever, cu posibile malformaţii cardiace şi/sau renale.

Anomaliile autozomale produc efecte fenotipice mult mai severe decât cele gonozomale, deleţiile sunt mult mai severe decât duplicaţiile. În concluzie anomaliile cromozomice interferează cu formarea şi dezvoltarea produsului de concepţie. Prezenţa aberaţiilor cromozomiale,

inclusiv a celor echilibrate este cauză de: incapacitatea de fecundare a gameţilor (sterilitate); constituirea unui produs de concepţie cu aberaţii cromozomice, consecutiv cărora în funcţie de cromozomul implicat şi tipul anomaliei se

poate produce: avort spontan timpuriu (primele trei săptămâni), avort tardiv, oprirea fătului în evoluţie, naştere de făt mort sau naşterea unui copil cu boală cromozomială.

11.1.2. Anomalii cromozomiale structurale – caracteristici generale

Raportat la consecinţele fenotipice anomaliile structurale sunt împărţite în două mari tipuri. anomalii balansate (echilibrate); anomali nebalansate (dezechilibrate).

Pentru anomaliile balansate nu există pierdere sau câştig de material genetic, aceasta determinând la nivel morfologic schimbarea doar a

poziţiei genelor în cadrul aceluiaşi cromozom sau de pe un cromozom pe altul. În această grupă sunt incluse inversia şi translocaţia. Acestea nu

sunt detectabile în fenotipul purtătorului dar vor determina formarea de gameţi neechilibraţi genetic. Gameţii dezechilibraţi pot cauza sterilitate,

avorturi repetate ale cuplului, oprirea în evoluţie a sarcinii, naşterea unui făt mort sau naşterea unui produs de concepţie cu manifestări fenotipice

patologice variabile. Deci, purtătorul de anomalii structurale echilibrate are riscul ca acestea să se dezechilibreze în gametogeneză.

Inversia este rezultatul unei rupturi duble în cadrul unui cromozom şi reinserţia fragmentului rezultat rotit cu 180°.Inversia poate fi

pericentrică, dacă implică centromerul, sau paracentrică, dacă nu include centromerul.Inversiile, ca şi translocaţiile cauzează în mod

exceptional purtătorului modificări fenotipice.Cu toate acestea, inversia genei ce produce factorul VIII al coagulării determină hemofilia tip A

severă. Inversile pericentrice generează la descendent anomalii cromozomiale de tip deleţie-duplicaţie

Translocaţia este cea mai frecventă aberaţie cromozomială cu o incidenţă de 1/500. Reprezintă schimbul de material genetic între două

segmente cromozomice neomoloage (translocaţie simplă) sau mai mulţi cromozomi neomologi (translocaţie complexă). Este necesar să apară

rupturi în cromozomii implicaţi iar repararea se va face printr-un rearanjament anormal.

Translocaţia poate fi: reciprocă, robertsoniană şi inserţională.

Translocaţia reciprocă presupune schimb de material genetic între doi cromozomi neomologi.În cazul translocaţiilor balansate, aceste

rearanjamente cromozomiale nu dau manifestări fenotipice, dar descendenţii pot prezenta anomlii cromozomiale.

Translocaţia robertsoniană este situaţia în care braţele scurte a doi cromozomi omologi acrocentrici sunt deletate şi braţele lungi fuzionează

pentru a forma un singur cromozom acest tip de translocaţie este specific cromozomilor 13, 14, 15 şi 21, 22 deoarece braţele lor “p” sunt

foarte scurte şi nu conţin material genetic esenţial.Purtătorii de translocaţii robertsoniene nu pierd material genetic esenţial dar prezintă aparent

doar 45 de cromozomi în cariotip.

Una din translocaţiile frecvente este între 14 şi 21. Cromozomul cu translocaţia robertsoniană 14:21 deţine toată informaţia

genetică a celor doi cromozomi luaţi separat iar în fenotipul purtătorului nu apar manifestări

Purtătorul unei translocaţii 14:21 poate genera următoarele tipuri de gameţi: 50% gameţi ploizi (cu n cromozomi) din care doar

jumătate vor moşteni translocaţia 14:21 a genitorului; 50% din gameţi sunt aneuploizi din care jumătate cu n+1 cromozomi, ducând la un

produs de concepţie cu trisomie 21(mai frecvent) sau cu trisomie 14 (de regulă neviabili) iar cealaltă jumătate cu n-1 cromozomi fie pentru

21 fie pentru 14, astfel că după fecundare rezultă un produs de concepţie cu monosomie autozomală care întotdeauna este neviabil.

Translocaţia inserţională (nereciprocă) presupune apariţia a trei rupturi, două într-un cromozom şi una în cromozomul cu care se

realizează schimbul. Fragmentul rupt dintr-un cromozom se inseră la punctul de ruptură al celuilalt. Şi în acest caz, purtătorul este normal

dar descendenţii săi pot avea fie o duplicaţie a unui fragment, fie o deleţie, dar niciodată amândouă.

Anomaliile cromozomiale nebalansate vor avea întotdeauna manifestări în fenotip, severitatea anomaliilor fiind uneori corelată cu

dimensiunea segmentului cromozomial pierdut sau excedentar. În acest grup intră: deleţiile, duplicaţiile şi Izocromozomii.

Deleţiile cromozomiale rezultă prin ruperea şi pierderea materialului genetic. Deleţia terminală reprezintă rupere şi pierdere într-un singur

punct al cromozomului (exemplu deleţie 4p, 5p). Dacă au loc două rupturi şi se pierde materialul intercalar are loc o deleţie interstiţială.Fragmentul

deletat care nu prezintă centromer se pierde în cursul următoarei diviziuni celulare, neputându-se ataşa de filamentele fusului de diviziune.

Deleţiile bitelomerice ale unui cromozom determină apariţia cromozomului „în ring”, sau „în inel”, care va avea dificultăţi în cadrul

disjuncţiei mitotice, cauzând adesea monosomie în mozaic. Cromozomii “în inel” pot apărea atât în cadrul cromo-zomilor autozomi, cât şi la

cromozomul X.

Microdeleţiile sunt reprezentate de deleţii care au dimensiuni sub limita rezoluţiei optice, putând fi detectate prin tehnici de citogenetică

dar sigur utilizând tehnica FISH. Deleţile mai mici de 5Mb sunt de obicei greu de detectat.

Duplicaţia apare atunci când o porţiune a unui cromozom este prezentă în două copii, astfel că genele din acea porţiune se găsesc în extra-doză.

Această parte din cromozom poate fi liberă, sau ataşată cromozomului. Dacă fragmentul duplicat este orientat în poziţia iniţială faţă de centromer,

duplicaţia este directă ;dacă fragmentul este orientat invers faţă de normal duplicaţia este inversă. Duplicaţia se întâlneşte mai frecvent decât deleţia

şi este mai puţin dăunătoare (exemplu: duplicaţie 4p).

Microduplicaţiile sunt reprezentate de duplicaţii care au dimensiuni sub limita rezoluţiei optice, putând fi detectate prin tehnici citogenetice

dar sigur utilizând tehnica FISH.

Izocromozomii apar prin clivarea transversală a centromerului, rezultând separarea braţului p de braţul q, care prin replicare va apare ca o

imagine în oglindă. Izocromozomul prezintă două copii ale unui singur braţ, fie p, fie q.Izocromozomii autozomali au fost întâlniţi în mod

excepţional, deoarece pierzându-se o parte substanţială a informaţiei genetice produsul de concepţie nu este viabil.Mai frecvent sunt

Izocromozomi ai cromozomului X, în special al braţului lung determinând un aspect fenotipic asemănător sindromului Turner. A fost descris şi

Izocromozomul 18q care este responsabil de un fenotip similar sindromului Edwards.

11.2. Sindroame cromozomice autozomale

Sindroamele cromozomice autozomale compatibile cu nasterea sunt bine definite în prezent şi au fost descrise peste 70 de sindroame. În

cadrul acestora, în funcţie de amploarea anomaliei cromozomiale şi de cromozomul implicat, viabilitatea postnatală este variabilă, de exemplu pentru

trisomia 18 supravieţuirea este până la un an, pe când în trisomia 21 se atinge vârsta adultă.

11.2.1. Sindroame cu anomalii numerice la cromozomii autozomi

11.2.1.1. Trisomia 21 (Sindromul Down)

Este boala cromozomială viabilă cea mai frecventă. Sindromul a fost descris în 1861 de Seguin, în 1866 Langdon-Down punctează

caracteristicile clinice şi abia în 1959 Lejeune precizează etiologia cromozomială.

Epidemiologie:

frecvenţa este de 1,5/1000 de nou-născuţi, iar repartiţia pe sexe este 3/2 pentru sexul masculin;

vârsta maternă înaintată este implicată, mai ales peste 35 de ani;

la 28 de ani se înregistrează o frecvenţă crescută, insa aceasta corespunde unui pic maximal al natalităţii;

riscul creşte cu vârsta maternă:<0,1% sub 30 de ani, între 0,1 şi 1% între 30 şi 40 de ani şi peste 1% la mai mult de 40 de ani, 5% la 46 de ani şi

15% la 50 de ani.

Tablou clinic

Sindrom dismorfic,asociind în diverse grade:

facies semnificativ: microcefalie frecventă, gât scurt, ceafă plată, facies rotund, unghiul nazo-frontal şters, hipertelorism sau

pseudohipertelorism, epicant, fante palpebrale oblice, pete Brushfield la nivelul irisului (patognomonice pentru ochii albaştri),

pseudomacroglosie, glosită exfoliativă, limbă scrotală (la ado-lescent şi la adult), gura adesea deschisă, palat ogival şi strâmt, dentiţie deficitară

(anomalii numerice, agenezia incisivilor laterali etc.);

membre: scurte, brahimezofalange la degetele 2 şi 5, clinodactilia degetului 5, scobitura plantară aplatizată, halucele separat de celelalte

degete ale piciorului printr-un şanţ;

tegumente uscate, hiperlaxitate ligamentară;

retard psihomotor constant:hipotonie de la naştere, retardul mental este mai puţin evident la naştere;copii sunt afectuoşi,joviali şi prezintă

dificultăţi în vorbire, le place jocul ,aranjează obiectele în ordine,memoria nu este afectată;

dermatoglifele: plică palmară unică la 75% din cazuri (la populaţia fără trisomie este prezentă la <1%.),dar o plică transversală izolată nu pune

diagnosticul de sindrom Down, pliu unic interfalangial la degetul cinci.

Sindromul Down asociază malformaţii ale unor organe şi sisteme în 45% din cazuri:

cardiace (40%): canal atrio-ventricular, defect septal ventricular, defect septal atrial, persistenţa canalului arterial;

digestive:stenoză duodenală(1/3 din totalul stenozelor duodenale se întâlnesc la cazurile cu trisomie 21), imperforaţie anală;

oculare: cataractă, astigmatism, miopie, strabism, glaucom congenital.

Alte modificări:

hematologice: uneori leucoblastoză tranzitorie ce poate recidiva în leucemie acută limfocitară, sau nonlimfoblastică, leucemiile

megacariocitare sunt mai frecvente;

imunologice: deficienţe imunitare;

metabolice: hiperuricemie, modificări ale glicemiei;

sterilitate la sexul masculin;

demenţă presenilă Alzheimer.

Cauze şi cariotip:

Sindromul Down, citogenetic poate fi: trisomia 21 liberă şi omogennă, trisomia 21 în mozaic, trisomia 21 cu translocaţie, trisomie 21parţială,

trisomie 21 şi alte anomalii cromozomiale.

trisomia 21 liberă şi omogenă (92,5% din cazuri):

cazuri sporadice (de novo);

vârsta maternă este implicată;

cariotip: 47, XX,+21 sau 47,XY,+21 ;

nondsjuncţia meiotică – origine maternă: meioza I: 70%;

meioza II: 20%;

– origine paternă: meioza I: 5%;

meioza II: 5%;

trisomia 21 în mozaic (2,5% din cazuri):

cazuri sporadice;

cariotip: 47,XX ,+21/46,XX sau 47,XY+21/46,XY;

accidental postzigotică (mitotică);

mai frecvent exprimată printr-un fenotip tipic, poate da un sindrom atenuat;

trisomia 21 cu translocaţie (translocaţia robertsoniană)(5% din cazuri):

de novo prin transmiterea unei translocaţii parentale (echilibrată la ascendent);

cariotip: 46,XX sau 46,XY cu translocaţia cromozomului 21 supranumerar cel mai frecvent pe un cromozom al grupei D sau mai puţin

frecvent pe un cromozom al grupei G;

trisomia parţială este rară, regiunea responsabilă de manifstările fenotipice este 21q22.3;

trisomia 21 asociată altor anomalii cromozomiale (rar).

Trisomia 21 parţială

este reprezentată de cazurile în care există excedentar un cromozom trisomic deletat pe braţele “q”;

studiul acestor situaţii a permis identificarea “regiunii critice” pe cromozomul 21 responsabilă de fenotipul specific sindromului

Down,localizată pe banda 21q22.

Diagnostic antenatal

Sindromul Down poate fi depistat antenatal prin analiza citogenetică a lichidului amniotic, sau din biopsia vilozităţilor coriale,analiză care se

efectuează dacă există suspiciune prin vârsta maternă înaintată, modificări ecografice sau la triplul test efectuat în timpul sarcinii (vezi

îndreptarul de lucrări practice).

Consultul genetic

Riscul de recurenţă al sindromului Down variază în funcţie de cariotipul anomaliei. Astfel în cazul trisomiei 21 liberă riscul de recurenţă

este de 1-2% şi creşte în cazul trisomiei cu translocaţie t(Dq;21q) şi t(21q;22q) riscul matern este de 15%, iar cel patern de 5%, pe când în cazul

translocaţiei t(21q;21q) riscul este de 100%.

11.2.1.2. Trisomia 18 (Sindromul Edwards)

Sindromul cu trisomie 18 a fost descris separat de către Edwards şi Smith în 1960. Este a doua trisomie autozomală după sindromul Down.

Epidemiologie

Incidenţa la naştere este de 1/6000-8000 de nou-născuţi vii. Aproximativ 95% dintre produşii de concepţie cu trisomie 18 sunt eliminaţi în

cursul vieţii intrauterine, iar aproximativ 80% dintre nou-născuţii care prezintă sindromul sunt fetiţe. Rata de supravieţuire peste un an este de doar

5-10%.

Tablou clinic

Sindromul cu trisomie 18 este caracterizat fenotipic:

cranian prin microcefalie cu diametrul bifrontal îngust şi occiput proeminent, ceea ce dă craniului aspectul caracteristic de “cap de pasăre”;

facial prezintă: microftalmie, fante palpebrale scurte şi orizontale, hipertelorism, micrognaţie sau retrognaţie, gură mică, despicătură labială sau

palatină, urechi malformate şi jos inserate;

membre: caracteristică este contractura a mâinii, indexul acoperind degetul 3, iar degetul 5 acoperind degetul 4, camptodactilie;

piciorul are o formă caracteristică de „picior în piolet”, calcaneul fiind proe-minent şi plantă excavată;

manifestări neurologice: retard psihomotor, hipertonie, defecte de mielinizare, agenezia corpului calos şi altele;

malformaţii ale unor sisteme şi organe:

malformaţii cardiace în procent de 90%: defect de sept ventricular, defect de sept atrial, persistenţa ductului arterial, coarctaţia de aortă;

malformaţii pulmonare: hipoplazie pulmonară cu lobulaţie anormală;

malformaţii gastro-intestinale: omfalocel, malrotaţie intestinală, atrezie esofagiană şi ileală, imperforaţie anală;

malformaţi genito-urinare: rinichi polichistic, ureter dublu, agenezie renală unilaterală, precum şi criptorhidie şi hipospadias la băieţi şi

hipoplazie labială şi ovariană la fetiţe;

dermatoglifele prezintă un număr crescut al arcurilor simple la nivelul amprentei digitale, plică simiană şi o singură plică de flexiune la

nivelul degetului 5.

Cauze

În 95% din cazuri sindromul Edwards este o trisomie omogenă, mozaicismul şi translocaţiile fiind prezente în procent redus. Cromozomul

18 în plus este responsabil de manifestările fenotipice, mai exact regiunea 18q11-q12.

Incidenţa sindromului creşte cu vârsta maternă, astfel în aproximativ 90% din cazuri cromozomul în exces este de origine maternă,

nondisjuncţia producându-se mai frecvent în meioza II decât în meioza I.Trisomia în mozaic rezultă prin nondisjuncţie postzigotică (mitotică),

aceşti pacienţi prezentând un fenotip variabil în funcţie de gradul de mozaicism. Trisomia cu translocaţie determină sindrom trisomie 18 parţial.

Cariotip:

trisomie omogenă în 95% din cazuri, cariotipul fiind: 47,XX+18 sau 47,XY+18;

trisomie în mozaic în aproximativ 5% din cazuri, cariotipul fiind: 47,XX+18/46,XX sau 47,XY+18/46,XY;

trisomie cu translocaţie - întâlnită foarte rar.

Diagnostic antenatal

Diagnosticul antenatal se poate stabili prin ultrasonografie care va evidenţia polihidroamniosul matern datorită abolirii reflexului de supt şi

înghiţit al fătului, apoi oligohidramnios în evoluţie datorită malformaţiilor renale, arteră ombilicală unică, hipotonie fetală. Pentru confirmare se

face cariotipul prin prelevare de lichid amniotic, vilozităţi coriale, sânge fetal. Pentru diagnosticul rapid se poate folosi tehnica FISH şi PCR.

Consultul genetic

Riscul recurenţei trisomiei 18 este de 1%, însă acest risc creşte substanţial dacă părinţii sunt purtători ai unei translocaţii balansate, astfel

riscul recurenţei trebuie stabilit pentru fiecare caz în parte în conformitate cu rearanjamentele structurale şi modul de segregare.

11.2.1.3. Trisomia 13 (Sindromul Patau)

Trisomia 13 este cea mai puţin comună şi cea mai severă dintre trisomiile autozomole prezentând anomalii multiple dintre care majoritatea

sunt incompatibile cu viaţa. Prezentarea clinică este în 1957 de Bartholini, paternitatea sindromului revine lui Patau care precizează etiologia

cromozomială.

Epidemiologie

Incidenţa este de 1/4000-1/10000 de nou-născuţi. Este mai frecvent intâlnită la fetiţe datorită supravieţuirii reduse a băieţilor. Mortalitatea

este foarte ridicată, 80% decedând în prima lună de viaţă, doar 10% supravieţuiesc vârstei de 1 an.

Tablou clinic

Sindromul este caracterizat fenotipic:

cranial: microcefalie, defecte ale scalpului, urechi malformate şi jos inserate;

facial: frunte teşită, nas lat şi aplatizat, hipertelorism, anomalii oculare precum microoftalmie sau anoftalmie, aniridie, cataractă, coloboma irisului,

despicătură labio-palatină;

manifestări neurologice: holoprosencefalia care este în general semnalată de către malformaţiile etajului mijlociu facial;

membre: polidactilie sau sindactilie, camptodactilie, clinodactilia degetului mic;

malformaţii cardiace (80%): persistenţa canalului arterial, defect septal atrial, defect septal ventricular, dextrocardie;

malformaţii genito-urinare: rinichi polichistic, duplicaţie renală, ureter dublu, agenezie testiculară şi criptorhidie la băieţi iar la fetiţe

hiperplazie clitoridiană şi uter bicorn;

dermatoglife: plică simiană, triradius axial distal;

hemangioame capilare la nivelul feţei, frunţii şi cefei.

Cauze

Există o asociere importantă între sindromul Patau şi vârsta maternă înaintată. Aneuploidia rezultă în principal datorită nondisjuncţiei în

meioza maternă primară.

Cariotip

trisomie omogenă ,cariotipul 47,XX,+13 sau 47,XY,+13;

trisomie în mozaic:47,XX,+13/46,XX sau 47,XY,+13/46,XY;

trisomie cu translocaţie robertsoniană cu un extra cromozom 13 translocat altui cromozom acrocentric, mai rară.

Diagnosticul antenatal

Sindromul Patau este suspectat antenatal datorită modificărilor ecografice depistate (translucenţa nuchală, malformaţii cardi ace,

defecte de tub neural), iar diagnosticul de certitudine poate fi pus prin analiza citogenetică a lichidului amniotic, biopsiei din vilozităţile coriale sau

din sângele fetal. Pentru diagnosticul rapid se poate folosi tehnica FISH şi PCR.

Consultul genetic

Sfatul genetic şi testele genetice se adresează în special părinţilor purtători de traslocaţii care au un copil cu trisomie 13, pentru a preveni

recurenţa acestei anomali cromozomiale, riscul fiind de 1%.

11.2.1.4. Trisomia 8 în mozaicism

Trisomia 8 în mozaicism este o anomalie cromozomială autozomală relativ comună, dar datorită expresivităţii fenotipice şi citogenetice extrem de variabile este frecvent greşit diagnosticată. Pacienţi cu trisomie a unui cromozom al grupei C au fost diagnosticaţi încă din 1963, dar trisomia 8 în mozaicism a fost raportată pentru prima dată în anul 1971. Datorită faptului că acest cromozom implicat are talie mai mare, trisomia 8 omogenă este neviabilă.

Epidemiologie

Frecvenţa estimată este 1:25.000 până la 1:50.000 de naşteri, iar repartiţia pe sexe indică o prevalenţă de 5:1 pentru sexul masculin.Speranţa de viaţă a pacienţilor nu diferă de populaţia generală, iar nou-născuţii prezintă la naştere o greutate normală pentru vârsta gestaţională.

Tablou clinic

Fenotipic particularităţile sindromului sunt o combinaţie între următoarele aspecte: constituţie astenică cu anomalii scheletale multiple: deformări ale coloanei vertebrale, limitarea mişcărilor articulare , absenţa sau

hipoplazia patelei, contractura degetelor mâinii sau picioarelelor capitonarea pliurilor palmare şi plantare,crestături plantare adânci longitudinale;

faciesul prezintă asimetrie, hipertelorism,urechi mari malformate, buza inferioară eversată, gâtul este scurt şi palmat; malformaţii ale diferitelor organe şi sisteme în proporţie variabilă: malformaţii cardiace;

malformaţii renale cu hidronefroză şi reflux ureteral; agenezia corpului calos;

retard mental moderat.

Cauze: nondisjuncţia postzigotică(mitotică).

Cariotip

mozaic cu o linie celulară normală: 47,XX+8/46,XX sau 47,XY+8/46,XY; s-a constatat prin studii citogenetice că liniile celulare anormale au tendinţa de a dispărea cu vârsta din limfocite, astfel că la pacienţii

mai în vârstă aneuploidiile pot fi evidenţiate doar din cultură de fibroblaşti.

Diagnosticul antenatal:

se face prin: ultrasonografie, cariotip efectuat din biopsia vilozităţilor coriale sau amniocenteză, metoda PCR sau FISH din celule în interfază pentru diag-nosticul rapid.

Consult genetic

Trisomia 8 în mozaicism poate fi uşor diagnosticată greşit, astfel tuturor pacien-ţilor care prezintă retard mental cu malformaţii scheletale, în special contractură articulară este necesară efectuarea analizei citogenetice.

11.2.2. Sindroame cu anomalii structurale la cromozomii autozomi

11.2.2.1. Sindromul Wolf-Hirschhorn

Sindromul Wolf-Hirschhorn a fost descris în 1961 de Hirschhorn, care apoi în 1965 împreună cu Wolf a adus sindromul în atenţia

geneticienilor prin publicarea a mai multor cazuri similare.

Epidemiologie

Incidenţa sindromului este estimată a fi 1:50.000 de nou-născuţi,iar prevalenţa pe sexe 1:2 pentru sexul feminin. Mortalitatea este de 34% în

primii doi ani de viaţă.

Tablou clinic:

statură mică;

cranio-facial, dismorfii caracteristice: frunte proeminentă, glabelă proeminentă, hipertelorism, rădăcina nasului lăţită, încadrate sub denumirea

de “cască de războinic grec”; microcefalie, urechi jos implantate, despicătură labio-palatină sau gură de crap;

sistem nervos central: retard mental sever, agenezie de corp calos, hidrocefalie, (alte anomalii SNC), malformaţii cardiace, pulmonare,

gastro-intestinale, genito-urinare (la băieţi: criptorhidie, hipospadias; la fetiţe: agenezie vaginală, de col uterin sau uter, ovare în bandeletă);

dermatoglife modificate.

Cauze: 87% din cazuri apar ca deleţie de novo mai ales a cromozomului de origine paternă, iar 13% sunt datorate translocaţiilor

reciproce parentale.

Cariotip: 46,XX,4p-, sau 46,XY,4p- ;regiunea critică pentru fenotip este 4p16.3.

Deleţia extinsă detectabilă prin analiză citogenetică uzuală este asociată cu exprimare fenotipică severă, dar o microdeleţie detectabilă doar

prin analiză mole-culară se asociază cu un fenotip mai estompat.

Pe baza corelaţiei genotip-fenotip criteriile minime de diagnostic sunt malformaţiile faciale, retardul mental, retardul de creştere,

hipotonie şi convulsii.

Consultul genetic

Riscul de recurenţă este minim dacă părinţii nu sunt purtători de translocaţii balansate. Odată cu avansarea tehnicilor moleculare este

necesară reevaluarea pacienţilor diagnosticaţi anterior cu cariotip normal, datorită impactului asupra reproducerii. Tehnica FISH poate detecta

translocaţiile submicroscopice la părinţii cu fenotip normal ce au descendenţi afectaţi.

11.2.2.2. Sindromul Lejeune (Sindromul Cri du chat)

Sindromul a fost descris de către Lejeune în 1963.

Epidemiologie

Incidenţa sindromului este estimată la 1:50.000 de nou-născuţi, prevalenţa pe sexe fiind sex masculin: sex feminin de 0.72.În prezent

mortalitatea este 6-8%, posibilitatea atingerii vârstei adulte crescând datorită intervenţiei medicinei moderne.

Tablou clinic

În perioada neo-natală se constată:

plânsul asemanător mieunatului pisicii, datorat hipoplaziei laringiene şi asimetriei corzilor vocale, considerat a fi patognomonic;

greutate mică la naştere, microcefalie, retard de creştere,facies rotund cu pomeţi proeminenţi, hipertelorism, rădăcina nasului lăţită,

microganţie, urechi jos implantate;

malformaţii ale unor organe şi sisteme: malformaţii cardiace, malformaţii gastro-intestinale şi genito-urinare (criptorhidie şi hipospadias);

dermatoglifele modificate cu plică transversală şi un număr crescut de arcuri şi bucle la nivelul degetelor.

În perioada copilăriei se constată: retard mental sever, retard de creştere, hipertonie, gură între-deschisă datorită hiperlaxităţii faciale, malocluzia dinţilor,

În perioada adolescenţei: retard mental, arcade supraorbitale proeminente şi ochii înfundaţi în orbite, scolioză; pubertatea se instalează la timp şi caracterele sexuale secundare se dezvoltă, femeile fiind fertile, dar în cazul bărbaţilor spermatogeneza

poate fi afectată.

Cauze

Majoritatea cazurilor(80-85%) sunt datorate deleţiilor sporadice, de novo. Aproximativ 10-15% din cazuri se datorează segregării inegale a unei translocaţii balansate parentale.

Deleţia cromozomului de origine paternă este implicată în 80% din cazuri.

Cariotip: 46,XX,5p-, sau 46,XY,5p-.

Consultul genetic

Riscul recurenţei este mai mic de 1% în cazul deleţilor de novo.În cazul purtătorilor de rearanjamete structurale, riscul este substanţial mai mare, dar corelat cu tipul rearanjamentului şi tipul segregării.Pacientele ce prezintă acest sindrom sunt fertile şi au un risc de recurenţă de 50% pentru un nou-născut afectat.

11.2.2.3. Trisomia 4p

Este o anomalie cromozomială rară, în care braţul scurt al cromozomului 4 sau doar o porţiune a lui este în triplu exemplar (trisomie) în loc de două exemplare în celulele somatice.

Tabloul clinic şi simptomele asociate prezintă diferite grade de severitate de la caz la caz.Această variabilitate este datorată lungimii fragmentului de cromozom implicată în duplicaţie, dar şi altor factori .

anomalii cranio- faciale: microcefalie, facies iniţial rotund care ulterior devine alungit şi uşor triunghiular, hipertelorism, fante palpebrale antimongoloide, strabism, nas de boxer, filtrum lung, macrostomie, urechi mari cu helix cutat, gât scurt;

malformaţii scheletale; malformaţii cardiace şi genitale; retard mental sever.

Cariotip: 46XX,4p+, sau 46XY,4p+ ; regiunea critică este 4p15.2-16.1.

11.2.2.4. Trisomia 9p

Este cea mai frecvent întâlnită dintre trisomiile parţiale umane. Mortalitatea perinatală este crescută.Prezintă trăsături fenotipice considerate a fi caracteristice:

cranio-faciale: microcefalie, micrognaţie, enoftalmia, fante palpebrale antimon-goloide, hipertelorism, nas bulbos, buză superioară subţire şi

comisură labială căzută, urechi mari, slab lobulate, depărtate de cap; gât scurt şi palmat cu implantare joasă a părului; torace în formă de pâlnie, cu mameloanele distanţate; membre: mâini mici cu clinodactilie, hipoplazie de falange şi unghială, picioare mici cu falanga distală a halucelui scurtă şi triughiulară; malformaţii ale unor organe şi sisteme: cardiace, urogenitale: criptorhidie la sexul masculin; retard psihomotor.

Cauze: aproximativ 50% din cazuri apar ca anomalii de novo, iar jumătatea cealaltă se datorează rearanjamentelor structurale

nebalansate în cariotipul genitorilor.

Cariotip: 46,XX,9p+, sau 46,XY,9p+; regiunea terminală a cromozomului 9 (9pter-p21) este implicată în apariţia sindromului, dar

uneori duplicaţia cuprinde atât braţul scurt cât şi o parte din braţul lung.

11.2.2.5. Monosomia 18p

Este o anomalie cromozomială rară în care braţul p al cromozomului 18, sau doar o parte a lui este deletat (monosomie parţială).

Tabloul clinic:

statură mică; dismorfie cranio-facială: microcefalie, facies rotunjit, hipertelorism, fante antimongoloide, epicantus, ptoza pleoapei superioare, rădăcina

nasului aplatizată, urechi mari jos implantate , micrognaţie, “gură de peşte” cu macrostomie, anomalii dentare; retard mental cu întârzierea limbajului; anomalii scheletice: “mâini ca butucul”, clinodactilie şi sindactilie; alte trăsături: gât scurt şi palmat, torace lăţit, în formă de scut, cu mameloanele distanţate, malformaţii genitale: micropenis şi criptorhidie la

sexul masculin; posibil holoprozencefalia.

Cauze: anomalie de novo în majoritatea cazurilor.

Cariotipul: 46,XX,18p-, sau 46,XY,18p-.

11.2.2.6. Monosomia 18q-

Este o anonalie cromozomială rară în care apare deleţia braţului lung al cromozomului 18.

Trăsăturile fenotipice şi simptomele sunt variate de la caz la caz.

Tablou clinic:

statură mică;

dismorfie cranio-facială: microcefalie, hipoplazia etajului mijlociu al feţei, baza nasului aplatizată, hipertelorism, microoftalmie, epicantus,

enoftalmie, urechi malformate, atrezia conductelor auditive externe cu surditate, “gură de peşte”, palat înalt;

retard mental sever (IQ:30-50);

anomalii scheletice;

malformaţii viscerale: anomalii cardiace, genitale: hipospadias şi criptorhidie la sexul masculin, hipogenezia labiilor la sexul feminin.

Supravieţuirea este mai crescută decât în cazul altor sindroame cromozomiale.

Cauze:

75% din cazuri apar ca deleţie de novo, dintre care la 85% cromozomul ce prezintă deleţie este de origine paternă, făra ca vârsta să prezinte

factor de risc;

25% rezultă prin rearanjamente structurale cromozomiale în cariotipul genitorilor.

Cariotipul: 46,XX,18q-, sau 46,XY,18q-; regiunea critică pentru fenotip este 18q21-18q23.

11.2.2.7. Sindromul “ochi de pisică”(cat eye)

Este o anomalie cromozomială rară, care de obicei este evidentă la naştere. Denumirea sindromului se datorează modificării particulare

prezentă la o parte din cei afectaţi la nivelul ochilor. Aceasta constă în absenţa parţială a ţesutului ocular (colobomă) adesea bilaterală.

Trăsăturile fenotipice asociate prezintă un grad de variabilitate ridicat, chiar şi între membrii unei familii afectate.În timp ce unii pot prezenta

doar puţine malfor-maţii uşoare ce ramân nediagnosticate, alţii prezintă întregul spectru al malformaţiilor.

Tablou clinic:

dismorfii faciale: hipertelorism şi fante palpebrale antimongoloide, coloboma verticală a irisului, coroidei şi/sau a retinei, micrognaţie,

urechi malformate cu fosete sau tuberculi preauriculari;

retard mental uşor;

anomalii viscerale:

cardiace (1/3 din cazuri);

gastro-intestinale: atrezia de canal anal;

renale: agenezie renală, rinichi polichistic.

Cauze şi citogenetică

Este datorat prezenţei în trisomie sau tetrasomie a unei porţiuni a cromozomului 22 şi anume braţul p şi o porţiune a braţului q (22pter-22q11). Lungimea regiunii duplicate poate varia, dar există o regiune critică responsabilă de manifestările caracteristice. Fenotipul nu pare sa fie corelat atât cu mărimea regiunii duplicate, dar prezenţa a patru copii ale regiunii critice determină manifestări fenotipce mai severe decât prezenţa a trei copii.

Majoritatea cazurilor apar “de novo”, dar s-a raportat transmitere familială prin prezenţa la genitori a mozaicismului cromozomial.

Cariotip: 47,XX,+mar, sau 47,XY, +mar.

11.3. Microcitogenetica

O afirmaţie clasică susţinea că afecţiunile determinate genic nu pot fi vizualizate microscopic prin remanieri cromozomice. Progresele geneticii au infirmat în parte acest concept, demonstrând existenţa unor mutaţii genice care antrenează modificări cromozomiale la acel nivel. Astfel, tehnici noi, perfecţionate de studiu cromozomic, (bandarea de înaltă rezoluţie) precum şi tehnici de citogenetică moleculară (FISH) au permis vizualizarea unor anomalii cromozomiale submicroscopice de tipul microdeleţiilor, microduplicaţiilor.

Definită ca pierdere de material genic, respectiv cromozomial, de dimensiuni sub limita rezoluţiei optice (< 4 Mb) – microdeleţia – antrenează abolirea funcţiei genei/genelor şi tulburări fenotipice uşor de recunoscut şi încadrat clinic ca „sindrom cu microdeleţie”. Megabaza (Mb) este o secvenţă de ADN alcătuită dintr-un milion de baze azotate. Mutaţiile genice în cadrul sindroamelor cu microdeleţie sunt apărute, în genere, ”de novo”, în cursul desfăşurării gametogenezei.

Cu o frecvenţă mai rară mutaţia poate fi de tipul microduplicaţiei, cu duplicarea materialului genetic dintr-o genă sau gene alăturate (învecinate, contigui) într-o regiune cromozomică (la unul din omologi). Surplusul de material ereditar determină o creştere a expresiei genei/genelor în fenotip şi concomitent antrenează o stare patologică manifestă, denumită „sindrom cu microduplicaţie”.

Deoarece atât microdeleţia cât şi microduplicaţia pot fi numai uneori observate la nivel cromozomic prin tehnica citogenetică standard, aceste anomalii sunt cert diagnosticate prin metode speciale de tipul: bandare de înaltă rezoluţie a cromozomilor prometafazici şi tehnica de hibridizare fluorescentă în situ (FISH).

In funcţie de mecanismele moleculare care generează remanieri submicroscopice, în patologia umană sunt descrise: 1. sindrome cu microdeleţie cu/sau fără amprentă genomică, din care exemplificăm:

sindromul Prader-Willi şi sindromul Angelman;

sindromul Rubinstein –Taybi;

sindromul Williams;

sindromul Di George şi sindromul velo-cardio-facial;

retinoblastomul;

nefroblastomul;

2. sindroame cu microduplicaţie cu/sau fără amprentă genomică, din care exemplificăm sindromul Beckwith-Wiedemann.

Sindroamele Prader-Willi şi Angelman

Ambele sindroame sunt caracterizate prin aceeaşi regiune cromozomială implicată în microdeleţie, 15q11-13, ştiindu-se că în Prader-Willi deleţia

are origine paternă, în Angelman origine maternă. Există şi posibilitatea etiologică a sindroamelor prin mecanismul de disomie uniparentală.

În sindromul Prader-Willi, aproximativ 70% dintre pacienţi sunt cu microdeleţie paternă, restul cazurilor se datorează disomiei uniparentale

materne. Manifestările constau în: hipotonie, statură mică, hiperfagie cu obezitate, hipogonadism, retard mental.

Sindromul Angelman, etiologic 70-80% din cazuri au microdeleţie maternă, procentul remanent datorându-se disomiei uniparentale paterne.

Fenotipi: dismorfie facială particulară cu zâmbet sau râs nemotivat, asociate cu retard mental sever, absenţa limbajului, convulsii, mişcări

ataxice.

Sindromul Di George

Se datorează microdeleţiei 22q11. Fenotip: cu dismorfie facială caracteristică la copilul mic: micrognaţie, fante palpebrale scurte, telecantus,

urechi mici, jos inserate, filtrum scurt, microstomie, iar mai târziu anomaliile faciale cuprind: trăsături faciale comune sindromulul VCF,

aplazia/hipoplazia glandelor paratirotide manifestată prin hipocalcemie şi a timusului, manifestată prin imunodeficienţă celulară, malformaţii

cardiace (tetralogie Fallot, trunchi arterial comun, coarctaţie de aortă).

Sindromul velo-cardio-facial (VCF)

Este cauzat de microdeleţia 22q11 la fel ca şi sindromul Di George, prezentând unele dismorfii faciale comune cu acesta, dar şi trăsături

particulare: hipertelorism, rădăcina nasului proeminentă, vârful nasului bulbos. Caracteristicile sunt date de palatoschizis, insuficienţa

velofaringeală, voce nazonată şi anomalii cardiace de tip defect septal ventricular şi tetralogie Fallot. Relativ frecvent apar tulburări psihice: depresie,

psihoză bipolară, schizofrenie.

Pacienţii prezintă combinaţii variate de manifestări clinice în cadrul acestor două sindroame care au în comun deleţia 22q11, de aceea s-a

propus ca denumire comună sindromul de deleţie 22q11 sau acronimul CATCH 22 (Cardiac Anomaly/ Abnormal facies, Thymic hypoplasia, Cleft

palate, Hypocalcemia).

Sindromul Rubinstein–Taybi

Datorat unei microdeleţii 16p13, sindrom dominant-autozomal cu expresivitate variabilă, care asociază un model de trăsături caracteristice:

police şi haluce lăţit (sunt posibile şi alte anomalii la mână şi picior), microcefalie, fante palpebrale cu orientare antimongoloidă, maxilar hipoplazic,

palat ogival, aspectul nasului în ”cioc de papagal”, statură mică, retard mental. Poate fi familial sau apărut sporadic.

Sindromul Williams

Este cauzat prin microdeleţie 7q11, o regiune cromozomială în care este localizată şi gena pentru elastină (sindrom prin deleţie de gene

contigui).

O dismorfie facială caracteristică (facies de spiriduş), cu frunte largă, fante palpebrale scurte, filtrum lung, nări anteversate, buze groase,

dinţi mici şi spaţiaţi, la care se asociază stenoza aortică supravalvulară şi alte anomalii vasculare, retardul mental uşor, tulburări de vorbire,

comportament sociabil, hipercalcemie.

Retinoblastomul (tumoră malignă a retinei)

Este una dintre cele mai frecvente tumori embrionare ale copilului. Etiologic, este mutaţia unei gene notate RB1. Mutaţia este o deleţie care poate afecta gena şi care se poate extinde şi la genele învecinate (sindrom cu gene contigui). Gena RB1 este o genă supresoare tumorală, localizată

13q14, care pentru exprimare fenotipică necesită starea de homozigoţie. Mutaţia este moştenită de la un genitor pe linie germinală, iar pentru expresia fenotipică are loc şi mutaţia genei RB1 omoloage la nivelul celulelor retiniene, eveniment care apare în celula somatică retiniană, postnatal.

Tumora poate fi suspicionată în faza incipientă prin aspectul particular al pupilei, ca o reflexie albicioasă a pupilei, leucocoria, cel de-al doilea semn este strabismul. În evoluţie copilul poate avea un ochi dureros, înroşit sau mărit. Dacă deleţia se extinde şi la genele vecine atunci

poate apărea şi dismorfie facială şi retard mental.

Tumora poate fi unilaterală (1/3 din cazuri), bliaterală (2/3 din cazuri) şi excep-ţional ca trei tumori, două oculare şi alta în SNC. Debutul obişnuit este între vârsta de 24 şi 30 de luni.

Retinoblastomul poate apărea în două forme: cea ereditară, genetică, cu transmitere dominant autozomală şi cea non-ereditară, sporadică. Aproximativ 40% dintre copiii afectaţi prezintă forma ereditară. Aceasta include copiii cu RB bilateral şi aprox. 5% din cei cu RB unilateral.

Nefroblastomul (tumoră renală malignă) sinonim tumora Wilms

Este datorat mutaţiei genei supresoare tumorale notată WT1 cu locusul 11p13. Mutaţia genei este o deleţie care poate cuprinde şi genele

adiacente şi astfel se înca-drează în sindroame cu gene contigui. Apariţia tumorii necesită două evenimente mutaţionale, prima mutaţie este

germinală, a doua mutaţie este somatică în celule renale, postnatal. Debutul este până la vârsta de 5 ani. În funcţie de întinderea deleţiei pot fi asociate şi alte manifestări (aniridie, displazie genito-urinară, retard mental) desemnate sub

acronimul WAGR. Există două forme: cea ereditară, genetică cu transmitere dominant autozomală şi cea non-ereditară, sporadică.

Sindromul Beckwith-Wiedemann,

Dominant autozomal cu expresivitate variabilă cu microduplicaţie 11p15 şi amprentă genomică paternă. Prezintă un ansamblu de anomalii unele specifice ca macrosomia, hemihipertrofia, macroglosia, visceromegalie, defecte ale peretelui abdominal (hernie ombilicală, omfalocel).

11.4. Sindroame cromozomice gonozomale

Anomaliile cromozomilor sexuali, ca şi cele ale cromozomilor autozomi, pot fi: numerice sau structurale,

omogene sau în mozaicism.

Frecvenţa anomaliilor cromozomice gonozomale la naştere este de aproximativ 1 la 500 de nou-născuţi. O anomalie a cromozomilor sexuali este diagnosticată în 1 din 250 de amniocenteze efectuate la gravide cu vârsta de peste 35 de ani

(similar cu sindromul Down). Un număr important din aceşti feţi sunt eliminaţi în al doilea trimestru de sarcină, În celulele embrionilor avortaţi:

trisomiile XXY, XXX şi XYY sunt rar întâlnite, monosomia X (sindromul Turner), este cea mai comună anomalie cromozomică, raportată frecvent în avorturile spontane.

Anomaliile structurale ale cromozomilor sexuali sunt ceva mai rare; cea mai frecventă anomalie structurală observată este izocromozomul pentru braţele lungi ale cromozomului X ("izo Xq") în formă omogenă sau în mozaicism.

Starea de mozaicism este mai frecventă la cromozomii sexuali decât la cromo-zomii autozomi. Fenotipul asociat acestor anomalii:

nu este atât de sever afectat; există indivizi care au fenotip în limita "normalului" deşi prezintă în cariotip aberaţii gonozomale.

Principalele semne clinice din sindroamele cu anomalii ale cromozomilor sexuali includ : afectarea sferei genitale, cu disgenezie gonadală; absenţa sau dezvoltarea întârziată a caracterelor sexuale secundare; sterilitate sau infertilitate.

În genere, sindroamele cu anomalii ale cromozomilor sexuali sunt: evenimente izolate; aparent fără factori predispozanţi; vârsta maternă la procreere rămâne totuşi un factor de mare risc; în unele sindroame, eroarea disjuncţiei este de origine paternă.

11.4.1. Abateri de la cariotipul 46, XY la sexul masculin

11.4.1.1. Sindromul Klinefelter (47,XXY) Sinonime: bărbaţii XXY, XXYY, XXXY, XXXXY

Definiţie: grup heterogen de anomalii cromozomiale gonozomale în care exista cel puţin un crs X în plus faţă de cariotipul normal 46,XY, la sexul masculin Simptomatologia şi etiologia sunt heterogene.

Istoric

Fenotipic, sindromul Klinefelter a fost prima anomalie raportată în literatură pentru cromozomii sexuali (1942, dr. Harry Klinefelter raporteaza un grup de 9 bărbaţi cu disgenezie gonadala, gonadotrofine urinare crescute, microorhidism, eunucoism, azoospermie şi ginecomastie). In 1959

Jacobs şi colab. recunoaste etiologia sindromului Klinefelter prin prezenta cariotipului 47, XXY.

Incidenţă

Incidenţa este de 1 la 500 nou născuţi de sex masculin pt 47,XXY şi de 1 la 300 în avorturile spontane., 1/50000 pt 48,XXXY, 1/85000 pentru 49XXXXY.

Sindromul Klinefelter este cauza cea mai frecventă de hipogonadism la sexul masculin.

Etiologie

Studii de citogenetică moleculară prin investigaţii recente cu markeri ADN au arătat că la 50% din cazuri eroarea se produce în meioza primară paternă, la 1/3 în cea maternă, iar pentru rest în meioza secundară sau, sunt erori postzigotice ce conduc la mozaicism.

Trei sferturi din cazurile cu origine maternă provin din erori în meioza primară şi pentru acestea se incriminează vârsta înaintată a mamei. Se presupune că nondisjuncţiile materne meiotice pot fi corelate cu o frecvenţă crescută a recombinărilor din vecinătatea centromerului, sugerându-se o asociere între recombinări şi nondis-juncţiile cromozomiale din aceste situaţii.

Aspecte fenotipice

Înainte de pubertate dezvoltarea fizică este corespunzătoare vârstei; fenotipul fiind normal, arareori se poate suspiciona existenţa sindromului.

In copilarie: hipospadias, micropenie, criptorhidism, sugestive pentru sindrom, conduc la investigarea citogenetica a copilului.

Pacienţii sunt în genere înalţi (creşterea în înălţime e semnificativă între 5 şi 8 ani, inaltimea medie este de 179.26.2 cm). Sunt astenici, prezentând membre superioare şi inferioare mai lungi decât obişnuit (creşterea este realizată prin lungimea mare a membrelor inferioare). Distribuţia ţesutului muscular este de tip ginoid iar la pacienţii constituţional obezi, se remarcă un aspect eunucoid. Se poate observa un diametru biacromial mai redus faţă de cel bitrohanterian

La pubertate devine evident hipogonadismul, semnul cardinal fiind hipoplazia testiculară; testicolele rămân subdezvoltate, caracterele sexuale secundare nu se instalează. Pilozitatea facială, corporală şi în regiunea genitală este redusă. Nivelul de testosteron este normal cu tendinţa de scădere la sfârşitul adolescenţei şi în viaţa adultului tânăr.

Ca regulă generală, sindromul se asociază cu sterilitate prin oligo -sau, azoospermie. Ginecomastia reprezintă un semn clinic aproape constant (56% din cazuri cu variaţii până la 88%), realizată prin hipertrofia glandelor mamare

sau prin dezvoltarea exagerată a ţesutului extraglandular, considerându-se că aceşti pacienţi au un risc de 20 de ori mai mare pentru a dezvolta carcinoame cu punct de plecare la acest nivel, comparativ cu subiecţii normali.

În afara hipogonadismului hipergonadotrop şi a absenţei caracterelor sexuale secundare care marchează fenotipul, intelectul este în genere

aproape normal (dacă există retard mental, este moderat ca intensitate); doar arareori se remarcă unele dificultăţi în şcolarizare; coeficientul inteligenţei (IQ) poate fi cu valori ceva mai reduse; uneori, pacienţii prezintă dislexie şi o scădere a capacităţii de adaptare psiho-socială. Multe din caracteristicile comportamentale şi clinice sunt modificate prin tratamentul constant cu testosteron.

Cariotipuri descrise în sindromul Klinefelter

Dintre toţi pacienţii descrişi cu sindrom Klinefelter, 80-85% prezintă cariotip 47,XXY În sindromul Klinefelter pot exista şi alte variante de cariotip decât cel prezentat, cum ar fi: 48,XXXY 48,XXYY, 49,XXXXY. Clasic, adiţia

cromozomilor X cauzează fenotipuri mai sever afectate, cu dismorfii mai importante, dezvoltare sexuală anormală şi întotdeauna grave tulburări ale intelectului.

Pentru multiplii complemenţi X, numărul corpusculilor Barr creşte odată cu creşterea numărului acestora, totdeauna în celule rămânând activ un

singur cromozom X.. Fiecare comozom X aditionat scade IQ cu 15-16 puncte, limbajul fiind cel mai afectat. Asocieri în cariotip: Cariotipul 47,XXY a fost observat în legătură cu majoritatea aberaţiilor cromozomilor autozomi. Astfel, au fost descrişi indivizi cu

dublă aneuploidie (de exemplu: 48,XXY+21), la alţii asocieri cu sindromul X-fragil, translocaţii reciproce, translocaţii robertsoniene etc. Aproximativ 15% din cazuri prezintă cariotip în mozaic şi au fenotip variabil, uneori cu dezvoltare aproape normală (pot fi chiar şi fertili).

Mozaicismul cel mai frecvent 46,XY/47,XXY, rezultă foarte probabil din pierderea unui cromozom la un produs de concepţie 47,XXY pe parcursul primelor diviziuni postzigotice. Au fost descrise şi alte mozaicisme, întâlnite însă ocazional, ca de exemplu: 46,XX/47,XXY, 46,XX(46,XY/47,XXY etc.

Diagnosticul diferenţial al sindromului Klinefelter, se realizează pe baza efectuării cariotipului.

La un subiect de sex masculin cu: testiculi mici (volum testicular mai mic de 10 ml postpuberal); infertilitate; ginecomastie; membre superioare şi inferioare lungi; deficit de exprimare verbala; dificultati psihosociale; tulburari de comportament.

Este obligatorie investigarea citogenetică.

Şi alte cauze de hipogonadism pot fi luate în considerare, de exemplu, sindromul Kallmann (+ anosmie, cariotip 46,XY), bărbaţii XX sau cei cu X-fragil.

Teste de diagnostic:

cariotip standard; ↑ FSH, LH, estradiol; ↓testosteronul (la 12-14 ani sau la adultii netratati); gonadotrofine urinare ↑↑ = functia celulelor Leydig anormala.

Complicaţii:

risc de carcinom mamar de 20x mai mare ca la indivizii normali; frecvenţa cancerului de sân este de 3.7% la Klinefelterieni; complicaţii endocrine: diabet zaharat, hipotiroidism, hipoparatiroidism; boli autoimune: LES, sindrom Sjogren, artrite reumatoide;

dezvolta frecvent varice, ulcere varicoase.

Management medical

Tratamentul cu testosteron Trebuie să înceapă la pubertate, în jur de 12 ani, creşterea nivelului de testosteron prin terapie conducând la menţinerea estradiolului, FSH şi LH

la valori apropiate de normal. Tratamentul poate armoniza proporţiile corporale, dezvoltarea caracterelor secundare şi preveni ginecomastia. De asemenea creşte performanţa, îmbunătăţeşte dezvoltarea comportamentală, previne depresia, osteoporoza, bolile autoimune şi cancerul de sân.

Sfat genetic Riscul de recurenţă nu e mai mare ca în populaţia generală. Diagnostic antenatal Poate fi detectat prin amniocenteză şi studiul cariotipului fetal, părinţii sunt sfătuiţi privind manifestările clinice ale sindromului

Variante citogenetice ale sindromului Klinefelter

48,XXXY Pacienţii pot prezenta: talie mai înaltă, hipertelorism, nas turtit, sinostoza radioulnară, clinodactilie deget V, hipogenitalism, hipogonadism

hipergonadotrop, IQ= 40-60. În general sunt imaturi, pasivi, cooperanţi, nu sunt agresivi.

49,XXXXY Clinic, aceşti pacienţi sunt mai sever afectaţi prezentând: microcefalie, statura mică, hipertelorism, fante anti-mongoloide, hipogonadism

hipergonadotrop, microgenitalism.. Pot manifesta: despicătură palatină, defecte cardiace, sinostoza radioulnara, genum valgum, hipotonie cu laxitate articulara. Au un IQ= 20-60 şi un comportament prietenos.

48,XXYY Clinic se caracterizează prin talie mai înaltă, habitus eunucoid, hipogonadism hipergonadotrop, IQ= 60-80, comportament agresiv şi

impulsiv.

11.4.1.2. Sindromul 47,XYY

Datele de citogenetică relevă că aproximativ 3% dintre deţinuţi şi/sau pacienţi cu tulburări psihice (care necesită spitalizare), prezintă cariotip 47,XYY. Această constituţie se asociază în proporţie de 20% cu talia înaltă.

În genere, constituţia 47,XYY nu este însoţită de dismorfii; uneori însă au fost descrise cazuri în care faciesul trădează un comportament dur, agresiv; de asemenea au mai fost descrise acnee juvenilă, sinostoză radio-ulnară şi chiar hipogonadism. Fertilitatea este în genere normală, dar s-au descris şi cazuri cu infertilitate şi sterilitate.

Cariotipul 47,XYY rezultă prin nondisjuncţii cromozomiale în meioza paternă, determinând formarea de spermatozoizi cu dubluY. Nu s-a observat nici o corelaţie între asemenea nondisjuncţii şi vârsta paternă. Pierderea unui cromozom Y devreme, postzigotic, ar putea explica formarea cariotipului 46,XY/47,XYY întâlnit ocazional.

Deleţii Yq

Lungimea cromozomului Y prezintă variaţii largi inter-individuale. Acest caracter este moştenit stabil, tatăl şi fiul având cromozomi Y identici. Anomaliile structurale ale cromozomului Y nu pot fi descrise satisfăcător doar prin studii microscopice datorita dimensiunilor acestui cromozom.. Se folosesc astfel markeri ADN, pentru a defini cu precizie existenţa anomaliilor structurale.

Deleţiile Yq nu afectează determinismul testicular, pacienţii având fenotip masculin. Corelaţii fenotip-anomalii structurale Yq au sugerat că segmentul proximal Yq, conţine gene care controlează statura, în timp ce unele gene localizate distal de Yq11 controlează spermatogeneza; au fost descrise astfel cazuri cu hipogonadism, caractere sexuale secundare slab reprezentate şi statură mică.

11.4.2. Abateri de la cariotipul 46,XX la sexul feminin

11.4.2.1. Sindromul Turner (Disgenezia gonadală Bonnevie-Ullrich)

Sinonime: monosomia X şi variantele sale, disgenezia gonadala cu fenotip feminin

Definitie şi criterii de diagnostic

Sindromul Turner definit prin prezenţa unui singur cromozom X, monosomie completă sau parţială prezentă în toate celulele sau numai într-o anumită proporţie, asociază semne fenotipice de tipul nanism, defecte în dezvoltarea ovarelor şi diverse malformaţii viscerale.

Aspect fenotipic

Sindromul Turner prezintă un tablou clinic în care existenţa câtorva dismorfii permite recunoaşterea şi diagnosticarea sindromului chiar de la naştere; fenotipul însă devine evident odată cu vârsta pubertăţii, când disgenezia şi disfuncţia gonadală amplifică tabloul simptomatic.

La naştere câteva semne pot fi considerate patognomonice: limfedeme la nivelul părţii dorsale a mâinilor şi picioarelor gât scurt şi palmat, urechi displazice şi jos implantate, uşoară ptoză palpebrală, mandibulă hipoplazică, unghii distrofice ş.a.

Începând cu vârsta pubertăţii, pacientele turneriene au statură scundă (aproximativ 1,50 m 98% din cazuri) care de altfel se remarcă chiar din copilărie (nanism după vârsta de 2-5 ani), disgenezie gonadală (gonade fibrozate cu foliculi degeneraţi) şi implicit absenţa instalării caracterelor secundare sexuale: amenoree primară, nedezvoltarea glandelor mamare (cu implantarea areolelor mamare mai lateral faţă de linia medio-claviculară), pilozitate axilară şi pubiană slab reprezentată şi sterilitate. Se mai remarcă implantarea joasă a firelor de păr -dorso-cervical- şi aproape constant, anomalii cardio-vasculare (1/3 cazuri), din care cea mai frecventă (în aproximativ 50% din cazuri) este coarctaţia istmului aortei. In copilarie dezvolta frecvent otite care pot conduce la surditate, în evolutie hipo sau hipertiroidie.

Inteligenţa de obicei este mijlocie sau submedie (IQ =70-120). Media IQ verbal nu diferă de cea a grupurilor de control, în timp ce media IQ motor este moderat mai scăzută.

Sindromul Turner, pare a fi o haploinsuficienţă (SHOX short stature HomeoboX containing gene.Fenotipul poate fi datorat unei singure copii genice pentru una sau mai multe gene implicate, situate pe ambele braţe ale cromozomului X.

Cariotip

Sindromul Turner se distinge faţă de celelalte anomalii ale cromozomilor sexuali, în particular de sindromul Klinefelter, printr-o mare varietate a cariotipului.

Pe lângă anomaliile numerice, există şi anomalii de structură a unuia din cei doi cromozomi X, omogene sau în mozaicism, ca de exemplu deleţii de braţ lung sau scurt, cromozom X ring, izocromozom pentru braţul scurt sau pentru braţul lung, toate încadrate ca "variante citogenetice ale sindromului Turner" (tabelul 9).

Tabelul 9. Frecvenţa "variantelor citogenetice" în sindromul Turner

45,X 53%

Mozaicism 45,X/46,XX 15%

46,X,i(Xq) 10%

Mozaicism 45,X/46,X,i(Xq) 8%

Deleţii 46,XXq- sau 46,XXp- 6%

Alte mozaicisme 45,X/? 8%

Etiologie

Nondisjuncţiile mitotice cu pierderea preferenţială a cromozomului X paternal (70% cazuri). Se apreciază că jumătate din pacientele cu sindrom Turner prezintă mozaicuri cu una din liniile celulare 45,X. Alte linii celulare asociate, pot conţine doi cromozomi X, trei cromozomi X, foarte rar chiar şi XY sau, pot conţine anomalii structurale ale cromozomului X sau Y. Anomaliile structurale ale cromozomului X (30% din cazuri) sunt frecvent de origine paternă şi în această situaţie, statistic, vârsta tatălui poate fi considerată factor de risc. Mozaicismul care cuprinde două sau trei clone celulare diferite, poate fi rezultatul unei pierderi cromozomice după fertilizare.

Incidenţa

15/1000 din sarcinile recunoscute sunt cu feti 45,X dar 99% se termină ca avorturi spontane în primul trimestru de sarcină. Cromatina sexuală şi analiza cromozomială indică faptul că la aproximativ 1 din 2500- 3500 de nou născuţi cu sex feminin, există 45,X. Se apreciază că incidenţa monosomiei X raportată la toţi produşii de concepţie este de 1-1,5%, sindromul Turner fiind una din cele mai

frecvente anomalii cromo-zomiale. Cauza pentru care majoritatea produşilor de concepţie (95-99,9%) care prezintă monosomie X sunt avortaţi, nu este cunoscută. Se deduce că monosomia 45,X la fel ca şi alte monosomii de autozomi, ar fi letală şi că pentru supravieţuire, ar fi necesar un anumit grad de

mozaicism. De altfel, 50% din pacientele cu sindrom Turner prezintă cariotip în mozaicism sau cu aberaţii structurale ale celui de al doilea cromozom.

Diagnosticul diferenţial al sindromului Turner

Implică analiza cromozomilor, cariotipul fiind cel care diferenţiază sindromul Turner de sindroamele cu disgenezie gonadală prin alte cauze, cum ar fi sindromul Noonan, boală monogenică cu transmitere dominant autozomală. La acest sindrom cariotipul este normal 46,XX, exista "stigmate turneriene" (de tip nanism, gât scurt şi gros etc), stenoza arterei pulmonare (caracteristică în comparaţie cu sindromul Turner), uneori disgenezie gonadală şi retard mental. Poate fi prezent la ambele sexe.

Terapie

Se administrează: hormonoi de crestere biosintetizati de la vârste cât mai mici, talia ameliorându-se cu 10 cm Administrarea unei terapii hormonale adecvate poate estompa tulburările şi induce instalarea câtorva cicluri menstruale.Tratamentul estro- progestativ secvenţial şi de lungă durată asigură o dezvoltare armonioasă, o pubertate şi o viaţă sexuală normală. El previne: osteoporoza şi reduce riscurile cardio-vasculare Luarea în evidenţă timpurie permite chiar starea de graviditate şi naşterea de copii prin fertilizare artificiala în vitro, cu ovocite de la donatori.

Metode de diagnostic biologic

Cariotip standard din sânge periferic. Biologie moleculara: 5-10% din cazuri au o clona XY indecelabila prin cito-genetica clasică. Astfel de cazuri impun datorita riscului crescut

de gonadoblastom inlaturarea rudimentelor gonadale.

Sfat genetic

Anomalie accidentală, se consideră riscul de recidivă neglijabil. În caz de anomalii structurale ale crs X se impune analiza crzomială la ambii părinţi.

Diagnostic antenatal

Evocat prin markeri biologici sau semne de apel ecografice, particular higroma chistică, din primul sau al 2-lea trimestru, edemele până la anasarcă şi talia redusă a fătului.

Se practică amniocenteza pentru analiza cariotipului fetal.

Variante citogenetice ale sindromului Turner

Aspectul fenotipic al pacientelor cu anomalii structurale X poate fi mai mult sau mai puţin asemănător celui din sindromul Turner în funcţie de tipul aberaţiei cromozomiale X (tabelul 10).

Tabelul 10. Constituţia cariotipurilor non-mozaic întâlnite mai frecvent în sindromul Turner

Cariotip Semnificaţie

45,X 46,Xi(Xq)

46,X,del(Xp) sau 46,XXp- 46,X,del(Xq) sau 46,XXq-

46,Xr(X) 46,Xi(Xp) 46,Xi(Yq)

46,X,t(X;X) sau 46,X,ter rea (X;X) 46,X,t(X;A

*) sau 46,X,t(X;Y)

monosomie X izocromozom de braţ q

deleţie de braţ p deleţie de braţ q

cromozom X ring izocromozom de braţ p

translocaţii X-X

transloc. X-autozomi sau Y

Izocromozomul X q: 46, X,i (Xq)

Este una din cele mai frecvente anomalii structurale X întâlnită postnal. Existenţa unui izocromozom X pentru braţele "q" face ca în perechea gono-zomială, materialul genetic al braţelor "q" să fie prezent în triplu

exemplar, în timp ce încărcătura genică a braţelor "p" să fie doar într-un singur exemplar (haploinsuficienţa genelor de pe braţul "p"). Unii Izocromozomi au un singur centromer şi sunt perfect simetrici, în timp ce alţii sunt simetrici dar au 2 centromere aproape unul de altul, iar alţii prezintă clar o porţiune centrală asimetrică, de unde rezultă posibilitatea unei anomalii mai complexe.

Femeile cu acest cariotip se aseamănă cu cele cu 45,X având un spectru similar de tulburări clinice. Este interesant de observat că acest cariotip este rar întâlnit la avorturile spontane, deşi el este frecvent în sindromele Turner diagnosticate postnatal. Cauza acestui efect feto-protectiv este necunoscută. Incidenţa bolilor autoimune (tiroidită şi diabet zaharat) pare a fi crescută la aceste paciente.

Izocromozomul Xp: 46,Xi(Xp)

Izocromozomul de braţ scurt al cromozomului X este mult mai rar întâlnit în patologie comparativ cu cel de braţ "q". În cariotipul 46,Xi(Xp), izocromozomul Xp constă din două braţe scurte unite printr-un centromer. Citogenetic este greu de diferenţiat faţă de deleţia Xq22. Fenotipic, pacientele prezintă amenoree primară datorită disgeneziei gonadale, cu talie normo-dezvoltată.

Cromozomul X ring: 46,X,r(X)

Ring-cromozomii în cariotipul 46,X,r(X) sau mai frecvent 45,X/46,X,r(X), sunt cazuri speciale de monosomie, lipsind diferite porţiuni ale celui de-al doilea X. Un ring-cromozom se formează când se rup ambele capete ale cromozomului şi părţile proximale se reunesc. Astfel, la femeile 46,X,r(X) un cromozom X are deleţii terminale efective pe ambele braţe.

Asemenea paciente manifestă clinic adesea trăsăturile tipice ale sindromului Turner (în speţă mozaicismele 45,X/46,X,r(X)).

Deleţii Xp: 46, X, del (Xp)

Deleţiile braţului scurt al X pot interesa diferite părţi ale acestuia. Deleţia braţului scurt poate implica diferite regiuni, putând fi terminală sau interstiţială. Fenotipic, pacientele prezintă ovare disgenetice,

statură scundă şi alte stigmate turneriene. Disgenezia gonadală şi statura mică apar în fenotip mai ales când este implicată partea proximală a braţului scurt. Deleţiile proximale ale Xp produc amenoree primară, în timp ce pacientele cu deleţii telomerice ale Xp au adesea amenoree secundară şi infertilitate.

Deleţia Xp21 pter dă naştere la statură scundă. Deleţia interstiţială care include regiunea centrală a Xp nu produce o scădere marcată a staturii. Deleţii care implică pierderi de mai mult material genetic Xp, sunt însoţite invariabil de tablou tipic "turnerian".

La unele subiecte hterozigote pentru gene recesive X-linkate localizate pe Xp, deleţiile se pot asocia cu o varietate de sindroame ale genelor învecinate.

Deleţii Xq: 46,X,del(Xq)

Deleţiile braţului lung al cromosomului X, desemnate şi prin 46,XXq-, nu sunt la fel de frecvente ca cele de braţ scurt. Deleţiile aşa-numitei regiuni critice (Xq13-Xq27) vor determina infertilitate, amenoree primară şi o talie mai puţin afectată. Multe femei cu o del (Xq) suferă de amenoree primară dar comparativ cu femeile 45,X, proporţia celor cu cicluri menstruale este mai mare. Implicit, dezvoltarea normală a gonadelor necesită prezenţa unor gene localizate pe Xq nu însă braţul Xq în întregime. Înălţimea este afectată diferit în funcţie de cât de aproape şi cât de distal este punctul de ruptură faţă de Xq13.

Deleţiile terminale localizate Xq25 sau Xq26, par a fi asociate mai degrabă cu amenoree secundară (insuficienţă prematură ovariană). Alte aberaţii structurale pot fi reprezentate de translocaţii diverse între cromozomul X şi unul din autozomi. Cromozomul X este uneori implicat în tranlocaţii reciproce ce afectează aparent aleator porţiuni ale cromozomilor autozomi sau ale

cromozomului Y. S-a relatat în literatură că toţi cei 22 de autozomi pot fi implicaţi, mai ales cromozomii 1, 2, 9, 11, 15, 21 şi 22. Translocaţiile X;autozomi şi X;Y se comportă în parte ca translocaţii reciproce autozomale. Adică purtătorii de translocaţii echilibrate sunt

clinic normali iar descen-denţii lor, neechilibraţi genetic, exprimă acele semne clinice la care ne-am aştepta din partea unei anume deleţii sau duplicaţii cromozomiale. Va însemna că cei afectaţi vor suferi de disgenezie ovariană, retard de creştere şi alte efecte ale monosomiei parţiale a X. Alte manifestări clinice prezente la aceştia se pot explica prin:

deleţii minore citologic nedetectabile la nivelul punctelor de ruptură şi re-unire; inactivarea preferenţială a cromozomilor translocaţi; răspândirea inactivării spre segmentele autozomale de către gena X-IST; imprinting (expresia diferită a genelor în funcţie de originea parentală); disomie uniparentală, situaţie în care ambii X provin de la acelaşi părinte.

11.4.2.2. Sindromul cu trisomie X- 47, XXX (trisomia X)

Pacientele cu trisomie X prezintă un fenotip mai puţin caracteristic. Incidenţa este de 1 la 1000-1200 de nou născuţi de sex feminin, aceeaşi ca şi cea raportată prin studii efectuate în urma amniocentezei. Mecanismul apariţiei sindromului constă în principal în nondisjuncţiile care au loc în prima etapă a meiozei materne. Studii cu markeri ADN

au relevat că în 90% din cazuri pacientele 47,XXX, provin ca urmare a unei nondisjuncţii cu originea la mamă (în anafaza I sau II), vârsta înaintată la procreere fiind considerată un factor de risc.

În celulele 47,XXX, doi cromozomi X sunt supuşi inactivării, cu apariţia în nucleii interfazici a doi corpusculi Barr. Erorile mitotice nu sunt prea frecvente; ele antrenează mozaicuri de tip 45,X/47,XXX, 46,XX/47,XXX etc. La naştere, nu există semne fenotipice care să poată sugera trisomia X. Dezvoltarea neuromotorie ulterioară este întârziată, pacientele prezentând

deficienţe ale deprinderilor de vorbire şi de învăţare, tulburări psiho-afective şi psiho-sociale, comportament pueril şi adeseori imatur. Din punct de vedere somatic, sunt prezente deficite neuromotorii, talia este mai înaltă faţă de normal, aspectul este astenic cu membre mai lungi.

S-au raportat manifestări ale disgeneziei gonadale în aproximativ 20% din cazuri. Cele mai frecvente manifestări sunt reprezentate de amenoreea primară asociată uneori cu stigmate "turneriene" şi menopauza prematură.

Coeficientul de inteligenţă (IQ) variază de la normal la un deficit sub 70, afec-tarea intelectului fiind mult mai evidentă în tetrasomia X (48,XXXX) şi pentasomia X (49,XXXXX).

Capitolul 12

BAZA GENETICĂ A DETERMINISMULUI SEXUAL LA OM

La om, procesul de sexualizare este iniţiat şi controlat genetic în principal, de genele cromozomilor sexuali la care, în diferite etape interferează şi acţiunea unor gene autozomale.

12.2. Structura genică a cromozomilor sexuali

De-a lungul filogeniei, cromozomii gonozomi s-au diferenţiat dintr-o pereche de autozomi, suferind pe parcursul evoluţiei unele remanieri genice. Cromozomii X şi Y prezintă diferenţe morfo-structurale şi de reglaj genic, deţinând gene cu funcţii diferite.

Cromozomul Y conţine gene de importanţă majoră pentru determinarea sexului masculin. Pe braţul "p" posedă un mic segment omolog unui fragment de pe braţul "p" al cromozomului X, denumit regiune pseudo-autozomală, cu care se realizează un crossing-over limitat între X şi Y.

Dacă alinierea cromozomilor X şi Y în meioză este neparalelă va avea loc un crossing-over greşit (crossing-over nelegitim), în urma căruia este posibilă translocarea uneia sau mai multor gene de pe Y pe X, aceasta ducând la apariţia unor tulburări de sexualizare (de exemplu, bărbaţii XX sau femeile XY).

În evoluţia sa, pe cromozomul Y s-au diferenţiat o serie de gene puternic implicate în masculinizare; alături de acestea au rămas doar câteva gene somatice. De altfel, o parte din braţele "q" prezintă o largă zonă inertă, cu multă heterocromatină (ADN-repetitiv).

Dintre genele localizate pe cromozomul Y notăm:

Pe braţul scurt "p", în imediata vecinătate a regiunii pseudo-autozomale (Yp11.2) se află situată o regiune numită SRY (sex determining region Y gene) echivalent cu TDF (testis determining factor)). SRY, are un rol covârşitor în iniţierea masculinizării, a transformării primordiilor de gonade în testicule embrionare, proces care începe încă din săptămâna 6-7 de dezvoltare intrauterină. Se estimează că proteina specificată de gena SRY acţionează direct asupra moleculelor de ADN din celulele progonadelor.

Gena HYA (gena pentru antigenul H-Y) plasată pe braţul "q" (probabil juxtacen-tromeric), codifică Ag H-Y care acţionează de asemenea asupra celulelor din primordiile de gonade, determinând împreună cu SRY transformarea acestora în testiculi.

Gena (gene) Sp cu rol în desfăşurarea spermatogenezei (sinonime: AZO, AZF- Azoospermia Factor). Regiunea AZF a fost împărţită în 3 domenii notate AZFa, AZFb, AZFc. Deleţiile AZFa sunt rare (1-5%) dar severe, cu absenţa completă a celulelor

Sertoli. Deleţiile AZFb (16%) şi AZFc (60%) sunt frecvente, fiind asociate cu blocarea spermatogenezei. La nivelul AZFc a fost identificată gena DAZ, prezentă în câteva copii care se exprimă numai în celulele germinale testiculare.

Gene notate STA, responsabile pentru dezvoltarea staturală şi foarte probabil şi pentru dezvoltarea psiho-comportamentală, incluse în regiunea cu efect stimulator pentru creşterea staturală (CGY).

Gena TSY ( tooth size) responsabilă de constituirea mărimii dinţilor.

La om, prezenţa cromozomului Y este obligatorie pentru formarea gonadelor masculine. Genele sexualizante de pe cromozomul Y sunt foarte penetrante astfel încât, unul sau mai mulţi cromozomi X în plus nu schimbă sexul gonadic (de exemplu 47,XXY; 48,XXXY), dar va perturba desigur spermatogeneza şi aspectul fenotipic.

Cromozomul X prezintă în zona telomerică a braţelor "p", o regiune pseudo-autozomală, omoloagă celei de pe Y şi cu care se realizează crossing-over parţial între X şi Y.

Cercetările recente de genetică moleculară au descoperit pe braţul "p" existenţa unor gene cu secvenţe codante omoloage dar nu identice cu cele din regiunea SRY, sau din alte zone de pe braţul "q" al cromozomul Y. Notăm astfel pentru exemplificare genele ZFX şi ZFY care codifică proteine implicate în reglajul genic, genele PRKX şi PRKY care codifică protein kinaze şi genele RPS4X (Xq) şi RPS4Y (Yp) care codifică proteine ce intră în constituţia ribozomilor.

Analogia acestor gene de pe cromozomul X şi Y a condus la o ipoteză contro-versată privind existenţa pe cromozomul X a unei gene masculinizante.

Pe braţul "p" al cromozomului X se află situată o genă denumită AR (receptor androgenic) care specifică receptori pentru androgeni.

În procesul de activare a testosteronului în DHT participă enzima 5--reductază specificată de o genă autozomală. Împreună cu DHT, receptorii pentru androgeni constituie un complex care serveşte la pătrunderea hormonului în nucleii celulelor din primordii şi la stimularea transcripţiei în celule, fiind necesar procesului diferenţierii sexuale a căilor genitale masculine .

Mutaţii ale genei "AR" se întâlnesc în sindromul cu insensibilitate la androgeni (testicul feminizant, formă de pseudohermafroditism masculin).

Pe cromozomul X sunt prezente şi o serie de gene somatice care condiţionează formarea unor caractere morfologice, sinteze de proteine (enzime) etc.

Cromozomul X joacă rol în morfogeneza şi funcţia ovarelor; în doză dublă asigură feminizarea normală. Cercetări bazate pe studii clinice şi citogenetice au evidenţiat regiuni "critice" cu importanţă diferită pentru funcţia normală

ovariană: Xp11.2-11.4 respectiv Xq11.3-Xq27 . În primele două săptămâni de viaţă embrionară, la organismele XX unul din cei doi cromozomi X se inactivează parţial

(mecanismul "lyonizării"). La embrionii XX, celulele germinative spre deosebire de cele somatice, conţin doi cromozomi X activi. În celulele germinative

primordiale, în cursul migrării spre creasta gonadală, este activ un singur cromozom X. După colonizarea primordiului gonadal se activează şi cel de-al doilea cromozom X. Prezenţa a doi cromozomi X activi este esenţială şi obligatorie pentru desfăşurarea meiozei în foliculii ovarieni.

12.2. Procesul de sexualizare

Procesul de sexualizare cuprinde două fenomene complexe şi succesive: primul constă în determinismul genetic al sexului, iar al doilea în diferenţierea sexuală.

12.2.1. Determinismul genetic al sexului

Prin determinismul genetic al sexului se înţelege realizarea sexului genetic şi formarea gonadelor. Determinismul sexului are loc în momentul amfimixiei gameţilor; el este dependent de tipul cromozomului gonozom din spermatozoidul care participă la fecundare.

În mod normal consecutiv meiozei, ovulul prezintă un singur tip de cromozom sexual - un cromozom X - deci, ovulele sunt homogametice. Conform spermatogenezei însă, spermatozoizii sunt heterogametici, astfel că 50% dintre ei prezintă un cromozom X, iar 50% cromozom Y. Consecutiv acestui proces se creează premizele pentru un "sex ratio".

În realitate, sexul feminin prevalează uşor, numeric. Dintre cauzele care influenţează această situaţie menţionăm hemizigoţia sexului masculin datorită căreia, eventualele gene letale de pe cromozomul X nefiind contrabalansate vor putea influenţa negativ dezvoltarea embrio-fetală masculină.

Statisticile relevă de altfel că frecvenţa embrionilor XY este mai mare printre avortoni şi că mortalitatea perinatală la nou-născuţii de sex masculin are valori mai ridicate decât la sexul feminin.

La aproximativ 6 săptămâni după fecundare, la embrionii XY se vor dezvolta gonadele, ele preluând din acest moment iniţierea celui de-al doilea proces, diferen-ţierea sexuală. La embrionii XX, morfogeneza ovarelor se încheie târziu, către săptămâna a 20-a din perioada de dezvoltare intrauterină.

Alţi factori organizatori, steroizi gonadali, hormoni peptidici şi receptori tisulari sunt de asemenea implicaţi în determinismul sexual. Formarea gonadelor este cheia evenimentelor care conduc la dezvoltarea fenotipului sexual.

12.2.2. Diferenţierea sexuală

Urmează etapei determinismului genetic al sexului şi al formării gonadelor. Se desfăşoară pe parcursul dezvoltării ontogenetice embrio-fetale, când se formează căile genitale interne şi organele genitale externe. Procesul diferenţierii sexuale se încheie odată cu maturarea pubertară neurocomportamentală, creându-se premisele pentru capacitatea de procreere.

Întreruperea la orice nivel a organizării sexuale va avea ca rezultat tulburări în grade variabile ale dezvoltării sexuale normale. Sexualizarea normală implică deci o serie de procese ordonate: stabilirea sexului genetic în momentul concepţiei, translaţia sexului

genetic spre sexul gonadal şi translaţia sexului gonadal spre sexul somatic. Diferenţierea gonadelor reprezintă cheia eveni-mentelor care conduc la dezvoltarea fenotipului sexual, proces complex, reglat prin mecanisme diferite de cel puţin 30 de gene localizate atât pe cromozomii sexuali cât şi pe autozomi.

Complexitatea procesului de sexualizare, a etapelor sale, cât şi implicarea mai multor gene gonozomale şi autozomale pot perturba fie determinismul genetic în formarea gonadelor, fie diferenţierea sexuală a căilor genitale interne şi a organelor genitale externe, antrenând frecvent în patologia infantilă şi apoi a adultului apariţia diferitelor forme de intersexualităţi.

Dacă cromozomii sexuali şi unele gene autozomale determină sexul gonadal, hormonii sunt cei care vor finaliza restul diferenţierii gonadale, având o perioadă critică de acţiune pentru a-şi exercita efectul specific. De exemplu, depăşirea acestei perioade

poate conduce la tulburări ale diferenţierii sexuale, în prezenţa unui sex genetic şi gonadal concordant şi normal. Hormonii pot exercita efecte asupra ţesuturilor unui organism inclusiv asupra sistemului nervos central, cu repercursiuni privind comportamentul sexual din viaţa adultului.

Tabelul 11. Exemple de gene implicate în determinismul şi diferenţierea sexuală

Denumirea genei

Localizare Observaţii

SRY Yp11 Factor determinant testicular; pierderea

funcţiei determină DG XY

SOX9

CBX2

17q24

17q25

Iniţiază dezvoltarea testiculară, diferenţierea celulelor Sertoli

Haploinsuficienţa determină inversie sexuală XY şi displazie campomelică

WT1 11p13 Pierderea funcţiei sau haploinsuficienţa

determină agenezia gonadelor şi a rinichilor (PHM si DG XY)

SF1 9q33 Receptor nuclear care poate determina

agenezie gonadală şi adrenaliană (DG şi insuficienţă suprarenaliană)

DDS/ DSS / DAX1 (dose-

dependent-sex reversal)

Xp21.3

Receptor nuclear care poate determina inversie sexuală XY în cazul duplicaţiei

genei sau hipoplazie adrenaliană congenitală şi implicit hipogonadism

hipogonadotrop în cazul pierderii funcţiei acesteia

AMH (pentru hormonul

antimullerian) 19p

Necesar regresiei ductelor Müller la embrionii de sex masculin

Întreţinerea ovariană

? locusuriXp

şi Xq

AR Xq Receptor androgenic

5alfa reductază, tip II

2p Necesară activării testosteronului în DHT

21-OH 6p Implicată în etiologia PHF

WNT4 1p32-36 Stimulează activitatea DAX1, rol în represia

diferenţierii celulelor Leydig în gonada feminină, duplicaţia duce la DG XY

Gene "candidate": DMRT1 şi

EMX2

9p24 şi 10q26

Implicate în dezvoltarea şi coordonarea funcţiei gonadale: DG XY si schizencefalie

tip II

Varietatea formelor fenotipice, suprapunerea unor sindroame cât şi etiologia incomplet cunoscută a unora din tulburările de sexualizare, îngreunează clasificarea lor.

12.3. Etapele procesului de sexualizare

Procesul normal de sexualizare la om se desfăşoară pe 7 etape succesive, între ele existând relaţii cauzale şi conexiuni.

12.3.1. Formarea sexului genetic

Are loc în momentul formării zigotului (în timpul fecundării) şi este depen-dentă direct de tipul cromozomului gonozom al spermatozoidului care participă la fecundare (cu alte cuvinte, sexul va fi determinat de "gametul patern"). Un sperma-tozoid 22,Y prin fecundare va da naştere unui zigot 46,XY heterogametic de sex genetic masculin, în timp ce unul 22,X va da naştere unui zigot homogametic 46,XX de sex genetic feminin.

12.3.2. Formarea sexului celular

Se iniţiază în primele două săptămâni, prin inactivarea la embrionii XX a unuia din cei doi cromozomi X. Inactivarea are loc prin heterocromatinizarea interfazică întâmplătoare a unui cromozom X, organismele feminine fiind mozaicuri de celule cu X matern sau patern inactivat.

Formarea sexului celular are drept scop realizarea echilibrului genetic între cele două sexe, compensarea dozajului genic pentru genele somatice de pe cromozomul X.

Inactivarea unui cromozom X este ireversibilă în celulele somatice; evenimentul este moştenit clonal astfel încât, toţi descendenţii unei celule vor avea acelaşi tip de inactivare.

Inactivarea este parţială, unele gene dispersate de-a lungul cromozomului X "scapă" procesului. Mecanismul inactivării nu este pe deplin cunoscut. Studii de genetică moleculară din ultimii ani au relevat existenţa unui centru de inactivare (XIC) pe cromozomul X, localizat la nivelul Xq13. S-a reuşit izolarea genei implicate în acest proces (gena XIST); gena este funcţională doar pe

cromozomul X inactiv, iar transcriptul ei, un ARNm cu rol particular, s-a demonstrat a fi asociat corpuscu-lului Barr din nucleii interfazici.

Sexul celular la organismele XX poate fi evidenţiat în interfază, sub forma corpusculului Barr.

12.3.3. Formarea sexului gonadic

Formarea gonadei nediferenţiate

La aproximativ 3 săptămâni după fecundare se edifică în regiunea mezonefrosului crestele genitale (primordiile de gonade "indiferente"); către săptămânile a 4-a şi a 5-a, în crestele genitale migrează dinspre sacul vitelin gonocite (celule cap de serie pentru gametogeneză), populând cele două zone, corticală la exterior şi medulară la interior; acest moment corespunde formării primordiilor de gonade.

Embriologic, celulele care participă la formarea gonadelor nediferenţiate provin din regiunea mezodermului care va determina şi formarea suprarenalelor, rinichilor şi scheletului axial.Factorii implicaţi în formarea gonadelor nediferenşiate joacă un rol hotărâtor şi pentru organogeneza altor ţesuturi cu aceeaşi origine embriologică.

Semnalele care permit diferenţierea celulelor mezenchimatoase în ţesut gonadic provin de la celule somatice, precursori ai celulelor Sertoli, Leydig, de la celulele thecale şi ale granuloasei. Principalii factori genetici care determină formarea gonadelor nediferenţiate sunt SF1 (Steroidogenic Factor) şi WT1.

Determinismul genetic al formării testiculelor

La om, orientarea gonadelor în testicule debuteayă în săptămâna 6-7 de gestaţie prin diferenţierea în interiorul blastemului gonadic al celulelor Sertoli primitive. Acestea vor forma la început cordoane apoi prin aglomerare tubuli înglobând celulele germinale şi mai apoi primele rudimente de cordoane seminifere.

Originea celulelor somatice care se vor transforma în celule Sertoli sau Leydig nu este clară, dar proliferarea epiteliului celomic va fi primul eveniment . Această proliferare antrenează ruptura membranei bazale şi formarea primelor cordoane sexuale care se vor

individualiza în tubuli. Membrana bazală se va îngroşa formând tunica albugineea. Apoi, succesiv două tipuri de celule vor prolifera sub acţiunea SRY: celule care exprimă SF1 şi care se transformă în celule Sertoli şi celule care nu exprimă SF1.

Primele insule de celule Leydig se individualizează între cordoanele seminifere începând cu săptămâna 8-9 de gestaţie. Formarea testiculelor este terminată în săp-tămâna a 12-a, urmat de coborârea lor progresivă. Testiculele părăsesc abdomenul şi a ating intrarea în canalul inghinal, apoi se localizează în scrot în cursul ultimelor 2 luni de gestaţie.

Orientarea gonadei bipotenţiale (nediferenţiată) în testicule necesită prezenţa a doi factori indispensabili: SRY şi SOX9, urmărind

o cronologie precisă, şi precedând ca timp, cu 3-4 săptămâni formarea ovarelor. Este deci un fenomen activ, stimulat de factori genetici determinanţi.

Toate genele responsabile de formarea testiculelor nu sunt încă cunoscute. Actual, se disting două grupe, pe lângă cele deja amintite (SRY, SOX9 şi SF1):

Genele al căror produşi inhibă acţiunea SRY, fie direct (DAX1) fie indirect (WNT4)

Un ansamblu de alte gene implicate în diferenţierea sexuală la alte specii dar care la om nu au fost precizate. Locusuri suspicionate că ar conţine astfel de gene sunt: 5p13-q13, 10q26, 13q33 şi de pe braţul scurt al cromozomului 9.

La embrionii XY , sub acţiunea genelor de sexualizare, se va hipertrofia zona medulară edificându-se astfel testicolele embrionare (tubii seminiferi şi glanda Leydig); în paralel, gonocitele se vor transforma în spermatogonii. Din săptămâna 8-9, în testiculii embrionari va începe sinteza testosteronului şi a factorului antimüllerian, ambii hormoni jucând un rol direct în continuarea diferenţierii sexuale masculine.

Determinismul genetic al formării ovarelor

Debutul formării ovarelor din gonada nediferenţiată este mai tardiv faţă de sexul masculin. Formarea ovarelor necesită o represie a genelor SOX9 şi activarea genelor WNT4. Gena DAX nu este implicată în transformarea gonadelor în ovare. Activitatea genei SF1 extrem de exprimată pe parcursul formării testiculelor la sexul feminin pare mai diminuată. Rămâne de demonstrate încă dacă există factori specifici care să stimuleze dezvoltarea ovarelor. Până atunci însă. Putem afirma că tranformarea gonadelor nediferenţiate în ovare este un fenomen pasiv, produs în lipsa factorilor determinanţi specifici sexului masculin.

La embrionii XX, în absenţa cromozomului Y, în primordiile de gonade se va hipertrofia corticala din care însă abia către săptămânile a 18-a - a 20-a se vor forma ovarele. Gonocitele provenite din acelaşi sac vitelin ca şi la embrionii XY, vor popula corticala transformându-se în ovogonii; acestea vor suferi foarte curând unele modificări morfologice, trecând în ovocite de ordinul I şi vor intra în profaza meiozei primare (în această fază vor rămâne până la pubertate).

12.3.4. Formarea căilor genitale interne (CGI)

În luna a II-a a dezvoltării intrauterine, în cavitatea abdominală a embrionului se dezvoltă bilateral şi concomitent canale Müller (din care se vor forma ulterior căi genitale feminine) şi canale Wolff (din care se vor forma căi genitale masculine), embrionul parcurgând astfel o a doua perioadă temporară de ambivalenţă sexuală.

Până în luna a III-a la embrionii XY, prezenţa testiculelor embrionare (a hormonilor secretaţi de aceştia) va induce formarea căilor genitale masculine din canalele Wolff şi atrofierea în paralel a canalelor Müller.

La embrionii XX, în aceeaşi perioadă se vor constitui căile genitale feminine din canalele Müller, în timp ce canalele Wolff regresează.

O serie de experimente efectuate pe embrioni de mamifere au demonstrat formarea căilor genitale interne masculine în mod activ, sub acţiunea testosteronului embrio-fetal (a cărui sinteză începe încă din săptămâna a 9-a) şi a factorului antimüllerian secretat de celulele Sertoli. Astfel, castrarea embrionilor XY a determinat invariabil regresarea canalelor Wolff şi implicit, constituirea în mod pasiv, a căilor genitale feminine.

12.3.5. Formarea organelor genitale externe (OGE)

Are loc între lunile a III-a şi a IV-a ale dezvoltării embrio-fetale. OGE se constituie din primordiile (tuberculii) ce apar în dreptul sinusului uro-genital. În edificarea OGE masculine, la fel ca şi

la căile genitale interne, un rol covârşitor îl joacă testosteronul embrio-fetal.

În prezenţa enzimei 5 alfa-reductaza (specificată de o genă autozomală), testosteronul se activează - transformându-se în dihidrotestosteron (DHT). Acesta se leagă de o proteină receptor specificată de gena "AR" de pe cromozomul X, constituind complexul DHT-R şi care va acţiona asupra celulelor ţintă din primordiile de organe genitale externe, virilizându-le.

La embrionii/feţii XX, în mod pasiv, fără intervenţia vreunor factori se vor constitui organele genitale externe conform

modelului feminin.

12.3.6. Etapa diferenţierii sexuale neurocomportamentale şi neurohormonale

Cuprinde modularea structurilor nervoase, în special hipotalamice, conform cariotipului (a încărcăturii cromozomice/genice). Acestora li se adaugă treptat caracteristicile specifice sexului.

La om, controlul sexualităţii trece de la nivel hormonal sub control cortical, astfel că învăţarea socială devine esenţială pentru desfăşurarea unei activităţi sexuale normale. După vârsta de 6 ani, când schema corporală este completă, identitatea sexuală este şi ea complet constituită şi stabilă.

12.3.7. Diferenţierea sexuală pubertară

Este ultima etapă, în care se instituie caracterele secundare sexuale şi consecutiv, maturitatea sexuală, cu producerea de gameţi apţi de fecundare. Vârsta de debut este variabilă pentru cele două sexe fiind influenţată de factori genetici, sociali, climatici, nutriţionali sau psihici.

Orice abatere de la etapele mai sus menţionate va perturba procesul diferenţierii sexuale, cu apariţia unor tulburări ale sexualizării.

La indivizii cu o dezvoltare sexuală normală, sexul genetic, gonadal, somatic (al căilor genitale interne), fenotipic (al organelor genitale externe şi al caracterelor sexuale secundare), social şi psihologic (definit prin criterii comportamentale), coincid.

12.4. Intersexualitatea

Intersexualitatea este starea caracterizată prin prezenţa la un individ a carac-teristicilor ambelor sexe din punct de vedere fizic, al aparatului reproductiv şi al comportamentului sexual. În concluzie, intersexualitatea este reprezentată de starea fenotipică în care indivizii prezintă abateri de la fenotipul sexual ca bărbaţi sau femei.

Starea de intersexualitate este diagnosticată de obicei la naştere în cazul nou-născuţilor cu organe genitale ambigui şi poate scăpa diagnosticului în acest moment dacă fenotipic nou-născutul se încadrează în sexul masculin sau feminin. Evaluarea unui nou-născut cu organe genitale ambigui este complexă şi presupune căutarea unor trăsături fenotipice care pot f i caracteristice şi un istoric familial aprofundat pentru stabilirea cauzelor care pot fi multiple.

Clasificarea didactică a stărilor cu intersexualitate se bazează pe tipul de gonadă prezent şi cuprinde 5 stări nosologice distincte:

1. Hermafroditismul adevărat (HA) – stare intersexuală cu ambele structuri gonadale; 2. Pseudohermafroditismul feminin (PHF) – două ovare; 3. Pseudohermafroditismul masculin (PHM) – două testicole; 4. Disgenezia gonadală mixtă (DGM) – testicol şi bandeletă ovariană fibrozată; 5. Disgenezia gonadală pură (DGP) – bandelete ovariene fibrozate bilateral; 6. Bărbaţii XX.

12.4.1. Hermafroditismul adevărat

Este o cauză destul de rară a intersexualităţii, revenindu-i un procent mai mic de 10% în cadrul acesteia şi se caracterizează prin prezenţa atât a ţesutului testicular cât şi a celui ovarian.

Patogenic: există un exces de producere a androgenilor fetali. În ceea ce priveşte gonadele, acestea pot fi ovar şi testicol, o combinaţie dintre acestea, denumită ovotestis sau ovotestis şi o

gonadă. Căile genitale interne sunt de ambele tipuri existând şi derivate mulleriene şi wolffiene. Organele genitele externe sunt ambigui, aspectul lor variind larg, dar tendinţa este spre masculinizare. Morfotipul este variabil. Majoritatea hermafrodiţilor sunt declaraţi de gen masculin la naştere, dar s-a constatat că la pubertate 90% dezvoltă sâni şi 40% au cicluri menstruale. Cea mai comună formă gonadală este ovotestis-ul fiind prezentă la 2/3 dintre pacienţi, constituit din ţesut testicular şi ovarian aşezate ―cap la cap‖. Acesta este însoţit de o singură trompă uterină şi/sau un singur duct deferent, nefuncţionale. Biopsia gonadală confirmă diagnosticul. Atât ovarul, cât şi testicolul, atunci când sunt prezente, se găsesc în poziţie anatomică normală. Tumorile gonadale sunt rare.

Cariotipul poate fi: 46,XX (60%), 46,XY(15%); 45,X/46 ,XY; 45,X/46 ,XY/47,XYY (25% ), variate forme de mozaicism; 46,XX/46,XY, stare denumită himerism, mai puţin de 1%.

Prezenţa ţesutului testicular la un cariotip 46,XX poate fi explicată uneori prin translocaţia regiunii SRY de pe cromozomul Y pe un cromozom X sau pe un autozom. Este surprinzătoare formarea testicolului când nu există regiunea SRY, în prezenţa cariotipului 46,XX, aceasta sugerează cooperarea cu SRY şi a altor gene situate Y, X şi/sau autozomal, care împreună determină formarea testicolului. Mai rar a fost semnalată prezenţa cariotipului 46,XY ceea ce face greu de explicat existenţa ţesutului ovarian, pentru a cărui dezvoltare sunt necesari doi cromozomi X. Este posibil să existe o proporţie foarte redusă, greu detectabilă de linii celulare XX.

12.4.2. Pseudohermafroditismul feminin (PHF)

Se caracterizează prin prezenţa cariotipului 46,XX, gonadei feminine şi a unui fenotip virilizat. Cauze:

Hiperplazia adrenaliană congenitală prin deficit enzimatic: 3 beta hidroxisteroid dehidrogenaza ( 3-β HSD); 21 hidroxilaza ( 21-OH);

11 beta hidroxilaza ( 11-β OH); Transfer transplacentar de androgeni materni prin: medicamente administrate în sarcină (progestative de sinteză) ; tumori materne secretante de androgeni(ovariene, suprarenaliene); deficienţă placentară de aromatază, enzimă care converteşte testosteronul în estradiol;

Deficienţa de 21 hidroxilază

Enzima 21-OH este o enzimă esenţială în biosinteza hormonilor steroizi, gena care specifică enzima are locusul 6p.23 şi sindromul determinat este cu transmitere recesiv autozomală. Deficitul de enzimă duce la blocaj în sinteza hormonilor steroizi, astfel apare un deficit de mineralocorticoizi şi o supraproducţie de androgeni. Deficienţa de mineralocorticoizi induce pierdere de sodiu, stare denumită ―sindrom cu pierdere de sare‖, manifestată imediat la naştere prin deshidratare masivă. Excesul de androgeni este responsabil de masculinizarea organelor genitale externe (OGE) la un făt feminin. Gradul de virilizare al sinusului uro-genital şi al organelor genitale externe depinde de trei factori: vârsta expunerii la androgeni, cantitatea androgenilor prezenţi şi puterea virilizantă a androgenilor specifici.

Dovada virilizării este dezvoltarea exagerată a clitorisului existând pe baza aspectului OGE 5 tipuri de virilizare, descrise de Prader:

Tipul I : hipertrofie clitoridiană ; Tipul II: hipertrofie clitoridiană cu aspect scrotal al labiilor mari şi mici ; Tipul III: clitorisul este voluminos, orificiile uretral şi vaginal se deschid la nivelul sinusului uro-genital; Tipul IV: sinusul uro-genital se deschide printr-un orificiu punctiform la baza clitorisului peniform; Tipul V: masculinizarea este completă cu pliuri labio-scrotale cudate şi orificiul uretral situate la extremitatea organului

penoclitoridian. Sunt distincte trei forme clinice pentru deficitul de enzimă 21-OH:

Forma severă care asociază virilizare şi pierdere de sare cu posibil deces timpuriu postnatal. Forma cu virilizare şi accentuarea acesteia la pubertate şi cu o creştere accelerată în timpul copilăriei. Forma cu debut mai tardiv, virilizarea apare în copilărie sau adolescenţă, pacientele pot prezenta şi ovare polichistice,

oligomenoree sau amenoree, hirsutism, infertilitate. Această formă este considerată a fi starea heterozigotă a mutaţiei genice.

Criterii de diagnostic: Clinic prezenţa virilizării OGE şi a uterului ; nivel seric scăzut al sodiului, crescut al potasiului şi creşterea 17-OH pregnenolon; creşterea eliminării de 17-cetosteroizi în urină; cariotip XX; evidenţierea mutaţiei genice prin analiza moleculară.

Deficienţa de 3-β steroid dehidrogenaza

Manifestările constau în ambiguitate genitală mai uşoară, pacienţii putând avea şi crize de pierdere de sare.

Deficienţa de 11-β hidroxilază

Această formă prezintă retenţie de sare şi hipertensiune asociate ambiguităţii sexuale.

12.4.3. Pseudohermafroditismul masculin (PHM)

Este caracterizat prin cariotip 46,XY, gonadele fiind testicoli, dar aspectul OGE este contradictoriu, slab masculinizat, cu ambiguitate şi chiar feminin.

Patogenic, în PHM sunt incluse o multitudine de stări patologice dintre care exemplificăm: Deficienţa de Factor Antimullerian Deficienţa de testosteron, prin mutaţii ale genelor ce specifică enzime implicate în biosinteza lui Deficienţa de testosteron, prin hipolazia/aplazia celulelor Leydig datorită lipsei de LH sau a receptorilor pentru LH Deficienţa de enzimă 5-alfa-reductaza, enzima de conversie a testosteronului în DHT Deficit de utilizare a testosteronului (sindrom de insensibilitate la androgeni)

Deficienţa de factor Antimullerian

Incidenţa este redusă, iar depistarea la naştere este dificilă deoarece OGE sunt de sex masculin. Poate fi suspicionată la un băiat cu hernie inghinală unilaterală şi criptorhidie contralaterală. Intervenţia chirurgicală evidenţiază uter şi trompă uterină de partea herniei şi uneori prezenţa unui duct deferent datorită secreţiei de testosteron de către testicolul contralateral. Trebuie intervenit chirurgical în încercarea de a coborî testicolul în scrot datorită riscului crescut de malignizare. Îndepărtarea resturilor mulleriene nu este necesară, deoarece acestea nu produc simptome şi nu există dovada malignizării lor.

PHM datorat deficienţei de factor antimullerian este rareori ereditar, iar datorită expresivităţii la sexul masculin transmiterea poate fi recesiv X-linkată sau dominant autozomală. Consultul genetic este important.

Deficienţe în sinteza testosteronului

Sinteza testosteronului se desfăşoară în 5 etape enzimatice, în fiecare etapă putând apărea defecte. Enzimele (20-α hidroxialza, 3-β hidroxisteroid dehidrogenaza, 17-α hidroxilaza) implicate în trei dintre aceste etape sunt comune cu cele ale sintezei hormonilor adrenalieni şi deficitul lor determină atât ambiguitate sexuală cât şi simptome de hiperplazie adrenaliană congenitală, pe când 17,20 desmolaza şi 17 cetosteroid reductaza sunt implicate doar în sinteza androgenilor şi defectele lor nu determină decât ambiguitate genitală.

În perioada de nou-născut aceşti pacienţi cu cariotip 46,XY prezintă gonade masculine şi OGE cu ambiguitate. OGE răspund la tratamentul cu testosteron, iar copiii cu hiperplazie congenitală adrenaliană necesită şi administrare de hormoni corticosteroizi şi mineralocorticoizi.

Consultul genetic trebuie efectuat deoarece deficienţele se transmit recesiv autozomal.

Deficit de răspuns periferic la testosteron (sindrom de insensibilitate la androgeni)

Citogenetic persoanele cu sindrom de insensibilitate la androgeni au cromozomii sexuali X şi Y. Baza patologică este reprezentată de absenţa sau disfuncţionalitatea receptorilor citozolici care leagă DHT-ul pentru a se forma complexul receptor-DHT, implicat în virilizarea sinusului urogenital şi formarea OGE masculine. Deoarece testicolul a fost prezent în viaţa intrauterină OGI sunt de tip masculin iar OGE sunt feminine sau cu grade variabile de ambiguitate.

Etiologia este mutaţia genei AR (receptor androgen) localizată Xq12. Există două forme ale sindromului: – cu insensibilitate completă la androgeni;

– cu insensibilitate incompletă.

Forma cu insensibilitate completă la androgeni

Patogenic în această formă tipurile de mutaţii anihilează gena AR determinând absenţa receptorilor androgenici. Fenotipul de tip feminin, armonios, la un cariotip XY. Gonada este testicol plasat în labii, canalul inghinal sau abdominal, dar acesta este disgenetic. Căile genitale interne derivate din canalul Wolf sunt absente sau rudimentare. OGE sunt tipic feminine, dar vaginul este orb. La pubertate se dezvoltă unele caractere secundare ale sexului feminin (glande mamare) dar cu amenoree primară. Înainte de pubertate diagnosticul poate fi suspicionat prin prezenţa unei structuri la nivel labial, inghinal sau a unei hernii inghinale.

Biopsia acestei structuri evidenţiază o gonadă de tip masculin. Datorită morfotipului feminin sinonimul sindromului cu insensibilitate completă la androgeni este ―testicol feminizant‖. Tratamentul constă în gonadectomie (având risc de malignizare) şi aport estrogenic.

Forma cu insensibilitate incompletă la androgeni

Patogenic există o reducere parţială a funcţiei receptorilor androgenici la un cariotip XY. Această formă poate fi descoperită din copilărie când OGE prezintă semne de masculinizare ca: fuziunea labială posterioară,

clitoromegalia. Variabilitatea fenotipică este de la tentă feminină, la ambiguitate, până la tipic masculin. Astfel pacienţii prezintă clitoris peniform, micropenie, labii cu aspect scrotal cu sau fără prezenţa de testicole, sinus uro-genital comun, hipospadias, iar la

pubertate ginecomastie şi absenţa unei virilizări. În general, datorită aspectului OGE la naştere sunt declaraţi de sex masculin Hormonal în ambele forme există o creştere a testosteronului, dar în forma incompletă apare şi creşterea hormonului

luteinizant.

Deficienţa de enzimă 5-alfa-reductaza, enzima de conversie a testostero-nului în DHT

Etiologic este datorat unei mutaţii recesiv autozomale a genei ce specifică enzima 5-alfa-reductaza, care converteşte testosteronul în forma sa activă DHT. Cariotipul este 46,XY şi testicole funcţionale.

OGE prezintă ambiguitate: fuziune labio-scrotală, sinus uro-genital comun, hipospadias sever şi la pubertate datorită acţiunii testosteronului apare o dezvoltare a penisului fără dezvoltarea prostatei, a pilozităţii faciale care sunt sub controlul DHT.

12.4.4. Disgenezia gonadală mixtă

Cariotipul este de tip mozaic 45,X/46,XY. Gonada este un testicol unilateral situat de obicei intraabdominal şi contralateral o gonadă de tip bandeletă fibroasă (similar

formaţiunii „streak‖ din monosomia X) urmată de structuri mulleriene (trompă uterină şi uter unicorn). OGE variază de la aspectul feminin la cel masculin, care imprimă sindromului combinaţia de trăsături între sindromul Turner şi PHM. Caracteristică este statura mică. Riscul de malignizare crescut impune gonadectomia.

12.4.5. Disgenezia gonadală pură (sindromul Swyer)

Sindrom caracterizat prin morfotip feminin Turner- like, cariotip 46,XY, gonade tip „streak‖, uter, OGE feminine fără instalarea pubertăţii şi în unele cazuri poate apărea o hipertrofie clitoridiană.

Patogenic este datorat unei deleţii sau mutaţii a genei SRY. Deoarece 80% dintre cazuri prezintă gena SRY normală se presupune că intervin mutaţii ale altor gene care influenţează funcţionalitatea regiunii SRY.

Aceste femei pot procrea prin tehnici de inseminare artificială cu ovule de la donator. Pentru a preveni malignizarea vestigiilor gonadale se impune extirparea lor.

12.4.6. Bărbaţii XX

Bărbaţii XX reprezintă o categorie distinctă de hermafroditul XX, având morfotip masculin, testicole mici, azoospermie şi fără prezenţa de uter sau ovar.

Au fost sugerate diferite mecanisme patogenice: cromozom X care a câştigat regiunea SRY pe braţul scurt prin crossing over între X şi Y în afara regiunii pseudoautozomală

(bărbaţii XX, SRY pozitivi); mozaicismul cu linia celulară XY ascunsă şi detectarea numai a liniei celulare XX(bărbaţii XX, SRY pozitivi); mutaţia altor gene care cooperează cu TDF în formarea testicolului ar explica bărbaţii XX fără regiunea SRY (bărbaţii XX, SRY

negativi).

Prin consens multidisciplinar s-a luat hotărârea ca denumirea de „Bărbaţii XX” să fie înlocuită cu „Defect de sexualizare testiculară ,46,XX” ("46,XX testicular disorder of sex development).Totuşi în cadrul acestui sindrom prezenţa genei SRY este adesea asociată cu o dezvoltare normală a OGE, în timp ce absenţa ei determină ambiguitatea OGE. Indivizii SRY pozitivi dezvoltă mult mai rar ginecomastie în comparaţie cu cei SRY negativi.

Indivizii SRY negativi prezintă OGE ambigue de la naştere, cuprinzând hipospadias penoscrotal şi criptorhidie şi dezvoltă ginecomastie la pubertate în lipsa tratamentului adecvat.

Indivizii SRY pozitivi sunt adesea diagnosticaţi la pubertate pe baza staturii mai scunde, subdezvoltării testicolelor şi azoospermiei.

Capitolul 13

BOLI MOLECULARE – METABOLICE

Conceptul de boli moleculare-metabolice traduce modificări calitative sau cantitative ale sintezei unor proteine urmate de o stare

patologică potenţială sau manifestă. Bolile moleculare-metabolice sunt afecţiuni monogenice la care este cunoscut defectul molecular genic şi biochimic. Clasificarea bolilor moleculare este dificilă. Deoarece procesele metabolice celulare sunt catalizate de enzime, mutaţiile genice care vor

modifica structura şi funcţia acestora vor perturba şi metabolismul celular. Reamintim că primele boli enzimatice (alcaptonuria, albinismul, cistinuria şi pentozuria) au fost descrise la începutul secolului XX de către A. E Garrod care a observat caracterul lor familial şi a introdus conceptul de

“erori înnăscute în metabolism”, actual fiind cunoscute peste 350 de boli enzimatice. Majoritatea bolilor enzimatice sunt transmise recesiv autozomal sau X-linkat. Deficienţa enzimatică determină blocarea la un anumit nivel a unei căi metabolice cu una din următoarele consecinţe:

acumularea în amonte a unui metabolit care va determina manifestări clinice sistemice sau localizate; devierea căii metabolice cu formarea de produşi toxici;

lipsa unui metabolit final sau intermediar indispensabil; dereglarea mecanismului de control feed-back negativ al căii metabolice respective.

În concluzie, bolile metabolice sunt un grup larg de afecţiuni ereditare în care există un defect genetic care perturbă metabolismul.

13.1. Erori ereditare ale metabolismului aminoacizilor

13.1.1. Fenilcetonuria (Idioţenia fenilcetonpiruvică)

Boală cu transmitere autozomal recesivă a metabolismului fenilalaninei deter-minată de mutaţii ale genei PAH (fenilalaninhidroxilază)

localizată pe cromozomul 12q24.1, genă care codifică enzima fenilalaninhidroxilază implicată în transformarea fenilalaninei în tirozină. Incidenţă 1 : 5000 nou-născuţi.

Deficitul de PAH determină incapacitatea de transformare a fenilalaninei (FA) în tirozină şi acumularea de produşi toxici (ex- acidul fenil piruvic şi acidul fenil acetic) pentru sistemul nervos central.

Datorită blocării lanţului fenilalaninei se împiedică şi sinteza de melanină, bolnavii prezentând astfel un grad de depigmentare melanică.

Fenilcetonuriei i se descriu o formă clasică şi unele forme atipice determinate de variante alelice care antrenează expresii fenotipice uşor diferite faţă de forma clasică.

Manifestări clinice – apar după primul trimestru de viaţă, nou-născutul este indemn din punct de vedere clinic cu excepţia depigmentării cutanate, asociind păr blond şi ochi albaştri. Boala se manifestă prin tulburări neurologice, retard somatic şi retard mintal, mirosul particular al urinei (de şoarece) şi o dermatită cronică descuamativă.

Diagnosticul de certitudine se stabileşte pe baza următoarelor criterii: fenialanina plasmatică crescută, eliminare urinară crescută de acid fenil piruvic, tirozină plasmatică scăzută.

Este importantă diagnosticarea precoce prin teste de screening, deoarece dieta restrictivă în fenilalanină previne instalarea tulburărilor sistemului nervos central.

13.1.2. Hiperfenilalaninemia benignă

Considerată forma heterozigotă a mutaţiei genice pentru PAH, este starea în care PAH este sintetizată în cantitate mai redusă şi consecutiv nivelul de fenilalanină plasmatică creşte moderat fără a antrena modificări fenotipice.

13.1.3. Alcaptonuria

Este o boală cu transmitere recesiv autozomală. Mutaţia genei pentru specificarea enzimei oxidază, impiedică oxidarea acidului homogentizic rezultat din metabolismul FA; consecutiv se acumulează acid homogentizic şi în funcţie de cantitatea depusă în ţesutul cartilaginos, pot apare unele tulburări articulare. Debutul bolii este tardiv, la vârsta adultă, evoluţia nu este severă.

13.1.4. Cistinuria

Este o boală metabolică de transport a aminoacidului cisteină rezultând cistinuria (exces de cisteină în urină) şi formarea de calculi de cisteină. În genere transmiterea este dominant autozomală cu penetranţă tardivă şi incom-pletă, poate prezenta mai multe variante alelice, tabloul clinic şi

evoluţia fiind variabile. Diagnosticul de certitudine se stabileşte pe baza următoarelor criterii: prezenţa cristalelor de cisteină în urină, creşterea eliminării de lizină,

arginină şi ornitină în urină, hematuric.

13.1.5. Homocistinuria

Se transmite recesiv autozomal. Mutaţia genei blochează sinteza enzimei necesare metabolismului homocisteinei, fiind implicate şi unele tulburări ale absorbţiei vitaminei B6.

Boala poate prezenta mai multe variante alelice astfel tabloul clinic este variat. Evoluţia este severă. Fenotipul imită sindromul Marfan, cu creşterea oaselor lungi, cu ectopie de cristalin dar este asociat cu retard mintal sever.

13.2. Erori ereditare ale metabolismului hidrocarbonatelor

13.2 1. Galactozemia

Este o boală cu transmitere autozomal recesivă determinată de mutaţii ale genei care codifică enzima necesară metabolizării galactozei.

Galactoza este un monozaharid iar sursa cea mai importantă rezultă din metabolismul lactozei.

Lactoza este carbohidratul care predomină în preparatele de lapte atât în cel matern cât şi în celelalte produse. Se recomandă utilizarea

laptelui de soia care nu conţine lactoză. Clinic pacientul prezintă afectare hepatică, hipoglicemie, tulburări neurologice şi gastrointestinale. Alte forme includ şi cataractă şi sindrom

Fanconi renal. Dacă diagnosticarea nu se face în perioada neonatală pot apărea retardul mintal şi ciroza hepatică care poate duce la deces.

Pentru diagnosticarea precoce se folosesc teste screening, putându-se astfel iniţia o dietă adecvată, boala poate fi detectată şi prin diagnostic antenatal.

13.2.2. Intoleranţe ereditare la fructoză, maltoză, zaharoză, lactoză

Constituie un grup de enzimopatii determinate recesiv autozomal sau dominant autozomal cu penetranţă intermediară în care se produc

tulburări ale tranzitului intestinal după ingerarea produşilor mai sus mentionaţi, datorită deficitelor enzimatice. Expresia fenotipică a mutaţiilor genice este variată de la o persoană la alta şi în general blândă, simptomele cedând în urma unei diete

adecvate.

13.2.3. Boli de stocare a glicogenului (glicogenoze)

În metabolismul glicogenului intervin mai multe enzime, mutaţia uneia dintre genele care specifică aceste enzime va antrena blocarea lanţului metabolismului glicogenului, cu stocarea acestuia în diferite ţesuturi. Glicogenozele se caracterizează prin larga heterogenitate alelică; în

funcţie de forma alelică şi de prevalenţa simpto-matologiei, glicogenozele se împart în 7 tipuri. Tabloul clinic este polimorf, simptomul constant este hipoglicemia, sunt afectaţi muşchii scheletici (cele mai frecvente manifestări fiind

hipotonia şi slăbiciunea musculară), ficatul şi splina cu hepatosplenomegalie, miocardul cu cardiomiopatie şi insuficienţă cardiacă. Aceste manifestări pot fi prezente complet sau parţial de la un tip la altul.

În glicogenoza de tip I - von Gierke este prezentă hepatosplenomegalia, şi în cea de tip II - Pompe apare cardiomiopatia şi afectarea muşchilor scheletici.

Majoritatea glicogenozelor se transmit recesiv autozomal, este descrisă şi o formă recesiv X linkată (tipul VI), debutul este neonatal şi au evoluţie severă.

Afecţiunea poate fi dignosticată antenatal prin studii enzimatice şi analiză moleculară din cultură de limfoblaşti.

13.2.4. Boli de stocare a mucopolizaharidelor

Sunt boli ereditare cu evoluţie progresivă, cauzate de acumularea intralizozomală a mucopolizaharidelor, consecutiv deficitului enzimatic specific.

Simptomatologia variază de la un sindrom la altul având heterogenitate dependentă de tipul mutaţiei genice. În prezent sunt descrise mai multe tipuri MPZ, dintre care exemplificăm : MPZ tip I (sindromul Hurler) se transmite recesiv autozomal; MPZ se stochează în muşchiul striat, miocard şi ficat;

MPZ tip II (sindromul Hunter) cu transmitere recesiv X linkată; Simptoma-tologia este cauzată de acumularea tisulară de MPZ determinând trăsături infiltrate ale feţei cu tegumente îngroşate şi aspect grotesc, opacifierea corneei, hepatosple-nomegalie, retard mintal, deficit de creştere, displazie osoasă.

13.3. Boli de stocare a lipidelor complexe

Sunt determinate în mare parte recesiv autozomal prin mutaţia uneia din genele care specifică enzimele hidroxilaze, în absenţa acestora stocându-se lipide complexe în lizozomi ducând la grave disfuncţii celulare şi organice.

Aceste afecţiuni se caraterizează prin heterogenitate genetică şi clinică. Principalele boli în funcţie de lipidul stocat sunt :

13.3.1. Boala Tay-Sachs

Face parte din grupul de boli de stocare a gangliozidozelor, debutează la 4-6 luni după naştere cu tulburări neurologice severe, deteriorare mintală, pierderea abilităţilor motorii şi specific, aspectul maculei cu „cherry-red spot” la examenul fundului de ochi.

13.3.2. Boala Niemann-Pick

Rezultă prin acumularea de sfingolipide, debut neonatal şi evoluţie severă cu deteriorarea funcţiilor hepatice şi sistemului nervos central, deces înaintea vârstei de 3 ani.

13.3.3. Boala Gaucher

Este o boală de stocare a glicolipidelor şi glicocerebrozidelor, debut în copilărie cu tulburări de creştere, hepatosplenomegalie, pancitopenie şi tulburări neurologice.

13.3.4. Hipercolesterolemia ereditară familială

Este o afecţiune a metabolismul lipidic cu transmitere dominantă autozomală şi penetranţă tardivă. În fenotiparea hiperlipidemiilor, hipercolesterolemia familială este tipul II a.

Frecvenţa bolii este de 1/1.000.000 la homozigoţi şi de1/500 la heterozigoţi pentru gena patologică. Afecţiunea este dată de un defect al receptorilor pentru LDL (lipoproteine cu densitate scăzută). Receptorii LDL sunt localizaţi pe suprafaţa

celulelor în ficat şi alte organe şi facilitează endocitoza şi livrarea în lizozomi a LDL-ului unde acesta este degradat şi colesterolul poate fi folosit în metabolism. Când receptorul LDL e deficient, rata îndepărtării LDL-ului din plasmă scade iar nivelul LDL creşte invers proporţional cu numărul de receptori. Defectul receptorilor are drept consecinţă acumularea LDL în ţesuturi.

Receptorul LDL este determinat de o genă plasată pe cromozomul 19p13.1-p13.3. Gena are 18 exoni şi 17 introni şi codifică o proteină cu 860 de aminoacizi. Mutaţiile genei pentru receptorul LDL pot fi :

20% deleţii sau inserţii largi;

80% deleţii mici şi mutaţii punctiforme.

Clinic :

la homozigoţi manifestările apar în copilărie având evoluţie letală încă din prima decadă de viaţă. Nivelul crescut al colesterolului sanguin determină apariţia de xantoame cutanate, tipice în tendonul lui Achile, de xantelasmă şi de leziuni vasculare ateromatoase (predominant la nivelul valvei aortice) cu dezvoltarea aterosclerozei. Leziunile vasculare sunt răspunzătoare de infarctul miocardic şi accidente vasculare cerebrale;

heterozigoţii prezintă mai tardiv manifestări clinice, incluzând arcuri corneene, xantoame tendinoase la sfârşitul decadei a II-a, şi boală coronariană în decada a IV-a.

Diagnostic paraclinic: testele biochimice evidenţiază creşterea trigliceridelor, colesterolul plasmatic este crescut, LDL în ser crescut.

Tratamentul urmăreşte reducerea nivelului colesterolului plasmatic prin :

dietă restrictivă; administrarea unor medicamente care stimulează producerea de receptori pentru lipoproteine (la heterozigoţi) şi care să inhibe sinteza

colesterolului hepatic;

În prezent boala beneficiază şi de transplant hepatic.

13.4. Erori ereditare ale steroizilor

Determinate recesiv autozomal prin deficitul unor enzime: 21 hidroxilaza;11 hidoxilaza; 3 β dehidrogenaza.

13.4.1. Deficitul de 21 hidroxilază

Gena situată pe cromozomul 6 determină incapacitatea organismului de a sintetiza cortizol şi aldosteron, această deficienţă se mai numeşte şi hiperplazie adrenaliană congenitală.

Datorită efectelor androgenice ale precursorilor cortizolului la sexul feminin se instalează tulburări de sexualizare cu tendinţă la virilizare intensă a organelor genitale externe; la sexul masculin datorită exesului androgenic apare o virilizare extremă ducând la o pubertate precoce cu debutul în jurul vârstei de 4 ani.

Sunt descrise 3 forme clinice: forma clasică, însoţită numai de masculinizarea organelor genitale externe; forma însoţită de tulburări electrolitice numită şi forma „cu pierdere de sare” cu debut neonatal şi prognostic infaust; forma criptică cu debut tardiv însoţită de virilizare, amenoree şi infertilitate.

Afecţiunea poate fi diagnosticată antenatal prin determinarea metaboliţilor corticosuprarenalieni în lichidul amniotic.

13.5. Erori ereditare ale pigmenţilor

13.5.1. Tulburări ereditare ale bilirubinei

Hiperbilirubinemia Crigler-Najjar cu transmitere recesivă autozomală, mutaţia genei împiedică sinteza enzimei necesare glucuronoconjugării bilirubinei.

Debut neonatal cu icter din primele zile, ulterior se instalează tulburări neurologice severe (datorită icterului nuclear), decesul survine rapid din primele luni de viaţă.

Starea Gilbert este o formă uşoară de hiperbilirubinemie, se transmite dominant autozomal iar simptomatologia apare de obicei în timpul unor stări infecţioase, febrile, oboseală. Icterul este tranzitor cu evoluţie în puseuri.

13.5.2. Tulburări ereditare ale porfirinelor

Porfiriile sunt erori în sinteza hemului, se caracterizează prin heterogenitate genetică şi clinică. Ca mod de transmitere pot fi : dominant autozomale cu penetranţă tardivă şi incompletă sau recesiv autozomale.

Mutaţii ale genelor implicate în sinteza Hem-ului, determină deficienţe enzimatice la diferite nivele care antrenează o hiperproducţie a unui tip de porfirină cu eliminare crescută urinară.

În funcţie de tabloul clinic se deosebesc 5 tipuri, dintre care amintim : Porfiria eritropoetică congenitală – transmitere recesiv autozomală, datorată sintezei excesive de protoporfirină, apar manifestări cutanate de

tip eritem fotosensibil urmat de vezicule care se vindecă cu cicatrici hiperpigmentate, precum şi eritrodonţie, hematii fluorescente cu tendinţă de hemoliză şi urini roşii.

Porfiria acută intermitentă, transmitere dominant autozomală, cu penetranţă tardivă datorată excesului de porfobilinogen; manifestări digestive de tip colici abdominale, neuropatie periferică.

Porfiriile sunt şi tulburări farmacogenetice, o serie de medicamente ca: barbiturice, anticonvulsivante, tranchilizante, estrogeni precum şi alcoolul şi lumina solară declanşează manifestări patologice. Evoluţia manifestărilor este în puseuri.

13.5.3. Tulburări ereditare cu exces de hemosiderină (Hemocromatoza)

Hemocromatoza este determinată RA sau, în unele forme alelice, DA cu penetranţă variabilă. Este una dintre cele mai frecvente afecţiuni genetice ale rasei albe, frecvenţa bolnavilor fiind de 5:1000, iar a purtătorilor de 1:10.

Manifestările clinice apar datorită creşterii exagerate a absorbţiei duodenale de Fe; acesta se stochează sub formă de hemosiderină la nivelul ficatului, inimii şi pancreasului.

Triada clasică: pigmentarea tegumentară, ciroză, diabet zaharat. Fiind ceva mai frecventă la sexul masculin, se presupune că penetranţa expresiei genice în fenotip este influenţată de interacţiuni nealelice.

13.5.4. Tulburări ereditare ale pigmentului melanic (albinismul)

Albinismul este descris ca fiind absenţa totală sau parţială a pigmentului melanic de la nivelul pielii, părului şi ochilor. Apare datorită insuficienţei enzimei tirozinază necesară pentru formarea melaninei din tirozină.

Albinismul oculo-cutanat - determinat RA. Clinic apar depigmentarea pielii, irisului şi părului, fiind evidente fotosensilbilitatea şi fotofobia. Albinismul ocular – determinat recesiv X linkat în care irisul prezintă pigmentare regională.

13.6. Erori ereditare ale purinelor

13.6.1. Guta

Este determinată DA, gena având penetranţă tardivă şi ceva mai frecvent exprimată la sexul masculin. Clinic: Hiperuricemie, depozite de acid uric la nivelul articular, atacuri recurente de artrită, şi frecvent nefrolitiază renală.

13.6.2. Sindromul Lesch-Nyhan

Este o deficienţă enzimatică cu exces de purine. Determinarea este recesiv X linkată Debut în primele zile de viaţă, prezintă mişcări coreoatetozice, spasticitate cu diplegie, frecvent automutilare, retard mintal.

Prin teste biochimice boala poate fi diagnosticată prenatal.

13.6.3. Deficienţa în adenozin diaminază (ADA)

Este determinată RA. Se caracterizează prin acumularea de produşi intermediari ai purinelor în limfocite, perturbând procesul replicării ADN-

ului.

Consecutiv, apare un deficit sever al numărului şi funcţiilor limfocitelor T şi B, cu imunodeficienţă combinată.

Netratată, boala duce la deces în primii 2 ani de viaţă. În prezent sunt posibile unele scheme terapeutice prin administrarea periodică de

enzimă ADA.

Este prima afecţiune genetică la care s-a efectuat terapie genică.

13.7. Erori ereditare ale sintezei hemoglobinei (hemoglobinopatii, talasemii)

Hemoglobinele patologice reprezintă un grup de maladii cu Hb anormală exprimate prin anemie, a cărui tip de gravitate este variabilă de

la o stare la alta.

Se disting:

Mutaţii responsabile de efectul calitativ al lanţului polipeptidic (HbS, HbC; HbCS; Hb Lepore, etc.);

Mutaţii care afectează cantitatea şi tipul de sinteză al lanţului globinic (talasemiile).

13.7.1. Hemoglobinopatia S

Determină anemia sicklică, în lanţul β, în poziţia-6-a datorită unei mutaţii punctiforme, acidul glutamic este substituit cu valina. În forma

homozigotă, eritrocitele au formă modificată (sicklică) şi tendinţa foarte mare de hemoliză, hematiile sunt rigide şi blochează lumenul vascular în

microcirculaţie ducând la infarcte multiple, consecutiv apare icterul, anemie marcată, hepatosplenomegalie. Evoluţia este severă. În forma

heterozigotă anemia este mai uşoară, eritrocitele devin sicklice numai în anumite condiţii cum este starea de hipoxie. În forma heterozigotă se

decelează 50% Hb A1 şi 50% HbS. Aceasta evidenţiază că genele, normală şi patologică, se află în raport de codominanţă.

13.7.2. Hemoglobinopatia C(Hb C)

Este determinată de o altă mutaţie în lanţul β şi care antrenează substituţia acidului glutamic cu lizina în aceeaşi poziţie, a 6-a.

13.7.3. Hemoglobinopatia Constant-Spring (Hb CS)

În lanţul alfa prin substituţie codonul stop trece în codon sens şi apare o prelungire a translaţiei mesajului până la întâlnirea unui alt codon stop. Rezultă un lanţ polipeptidic elongat conţinând aproximativ 30 AA în plus faţă de lanţul normal.

13.7.4. Hemoglobinopatia Lepore

În Hemoglobinopatia Lepore consecutiv unui crossing-over patologic se produce un transfer al unui fragment din gena ∆ la gena β. În cazul acesta lanţul β prezintă adiţie de AA corespunzător unei părţi din lanţul δ.

13.7.5. Talasemiile

Cuprind anomalii genetice care duc la o diminuare sau absenţă a sintezei unuia sau a mai multor lanţuri ale hemoglobinei fie alfa fie beta. Alfa talasemiile se caracterizează prin absenţa lanţurilor alfa globinice, Hb va fi formată numai din lanţuri beta (HbH), sau numai din

lanţuri gama (Hb Bart). Ambele sunt transportori ineficace de oxigen, generând hipoxie. Gravitatea bolii depinde de numărul de lanţuri alfa deletate. În formele minore (mutaţia unei singure gene) nu există manifestări. În formele severe (mutaţia celor 4 gene alfa), Hb devine nefuncţională

încât încă intrauterin apar stări de hipoxie care duc frecvent la moartea fătului datorită hidropsului fetal. Beta talasemiile se caracterizează prin scăderea producţiei lanţurilor beta globinice excesul de lanţuri alfa precipită, generând anemie

hemolitică. În locul lanţurilor β se sintetizează lanţuri δ şi astfel creşte cantitatea de Hb A2 sau lanţuri γ şi atunci creşte sinteza de Hb F. Indivizii homozigoţi cu două gene Beta mutante prezintă o formă severă de anemie şi boala se numeşte Talasemia Major. Indivizii heterozigoţi cu o singură alelă Beta mutantă au o uşoară anemie microcitară hipocromă. Cercetările de genetică moleculară efectuate în Beta talasemii au evidenţiat existenţa mai multor forme de mutaţii alelice cu subtituţie de un

nucleotid, deleţie de 1-2 nucleotide şi deci transcripţie frame-shift, mutaţie de codon stop, mutaţie a codonului de iniţiere, mutaţie în secvenţializarea nucleotidelor de legătură între exon şi intron.

13.8. Defecte genetice ale hemostazei

13.8.1. Hemofilia A

Este o tulburare a coagulării transmisă recesiv X linkat, determinată de o deficienţă a factorului VIII plasmatic. Manifestările clinice sunt prezente de regulă la indivizii de sex masculin, deşi există şi cazuri rare în care există manifestări clinice la

femei, care au inactivare preferenţială a cromozomului X fără mutaţie. Boala este caracterizată prin hemoragii la traumatisme minime şi care conduc la formarea de hematoame, la nivelul ţesuturilor moi şi al

muşchilor precum şi hemoragii intraarticulare care evoluează spre artroză.

Diagnosticul se bazează pe măsurarea activităţii factorului VIII al coagulării.

În funcţie de nivelul activităţii factorului VIII hemofilia A poate fi clasificată în forma uşoară (activitate restantă de 5-25%), forma moderată

(activitate restantă de 1-5%) şi forma severă (activitate restantă sub 1%).

Tratamentul actual constă în suplimentare intravenoasă a factorului VIII. Transplantul hepatic (locul de sinteză al factorului VIII ) este o

metodă utilizată în situaţii rare.

13.8.2. Hemofilia B

Este determinată recesiv X linkat; mutaţia se află în gena pentru factorul IX al coagulării. Modul de transmitere în generaţii este identic cu

cel al hemofiliei A. Tabloul hemoragipar este ceva mai blând şi dependent de tipul alelei mutante.

13.8.3. Boala von Willebrand

Constă într-un deficit ereditar al factorului Willebrand, determinat de diferite forme alelice, unele cu transmitere recesiv autozomală, altele

dominant autozomală incompletă. Boala se caracterizează prin sângerări excesive după traumatisme.Este cea mai comună stare hemoragipară cu o

frecvenţă de 1:250.

13.9. Defecte genetice de transport membranal

Fibroza chistică

Fibroza chistică sau mucoviscidoza este una din cele mai frecvente boli genetice cu transmitere autozomal recesivă din populaţia caucaziană,

homozigoţii fiind 1:2500, iar hererozigoţii 1:25.

Simptomatologie. Principalele manifestări clinice sunt determinate de afectarea plămânilor şi a pancreasului exocrin. Afectarea acestor organe

este rezultatul secreţiilor vâscoase ale glandelor exocrine care determină obstrucţia structurilor canaliculare. La nivel pulmonar, aceasta determină

infecţii recurente cu evoluţie spre insuficienţă pulmonară, iar obstrucţia canalelor pancreatice are drept consecinţă deficienţa enzimelor

pancreatice, cu afectarea digestiei.Un semn major pentru diagnostic este creşterea concentraţiei de sodiu şi clor în secreţiile sudorale (peste

60mEq/l). Alte manifestări clinice constau în ileusul meconial şi absenţa congenitală bilaterală a vaselor deferente la băieţi.

Gena mucoviscidozei este localizată pe cromozomul 7q31 şi conţine 27 de exoni ce codifică o proteină numită CFTR (Cystic Fibrosis

Transmembrane Conductance Regulator), proteină ce poate media direct transportul ionic transmem-branal. În cadrul afecţiunii s-au descoperit

peste 1000 de mutaţii şi peste 300 de variante polimorfice ale genei.Mutaţiile pot fi de tip : missense, non-sens (cu formare de codoni stop), deleţii de

codoni (∆ F 508), deleţii sau inserţii complexe, splicing. Indiferent de tipul mutaţiei apare disfuncţia CFTR totală sau parţială.

Diagnosticul prenatal este indicat în special în cazul familiilor în care există bolnavi cu fibroză chistică, prin studiul ADN-ului din vilozităţi

coriale, lichid amniotic iar în cadrul fertilizării in vitro, diagnostic preimplantaţional.

Afecţiunea beneficiază şi de screening postnatal.

Tratament. În prezent, circa 50% dintre pacienţi depăşesc vârsta de 26 de ani. Un rol major în prelungirea vieţii îl au tratamentul intensiv

al bolii pulmonare şi suplimentarea enzimelor pancreatice. S-a încercat terapie genică prin introducerea de genă la nivelul epiteliului pulmonar.

13.10. Distrofii musculare genetice

Distrofiile musculare reprezintă un grup de entităţi care au în comun o afectare musculară, condiţionată genetic, cel mai frecvent recesiv X linkat

(distrofia musculară Duchenne şi Becker) dar şi autozomal recesiv sau dominant (distrofia musculară progresivă facio-scapulo-humerală; distrofia

musculară a centurilor).

13.10.1. Distrofia musculară progresivă Duchenne

Este cea mai severă miopatie, cauzată de deficienţa unei proteine citoscheletale, numită distrofină.

Sinteza distrofinei este codificată de o genă al cărui locus este situat pe cromozomul Xp21.2. Este cea mai mare secvenţă

transcripţională din genomul uman (24 megabaze ADN-1,5% din cromozomul X). Gena conţine 79 de exoni, se exprimă nu numai în muşchi ci şi

în creier (aceasta explică dificultăţile de învăţare şi IQ scăzut la bolnavi).

Există 3 tipuri de mutaţii în gena DMD : deleţii, duplicaţii şi mutaţii punctiforme.

Incidenţa bolii în populaţia generală este de 1/3500 de nou născuţi de sex masculin (datorită hemizigoţiei), starea genetică fiind

transmisă de mamele heterozigote.

Boala debutează în copilărie, la vârsta de 3-5 ani, primul semn clinic fiind deficitul de forţă musculară la nivelul membrelor inferioare,

hipotrofii musculare la nivelul centurii pelviene, fiind cuprinse pe parcurs şi alte grupe musculare. Bolnavul prezintă dificultăţi la mers, la alergat şi

la urcatul scărilor, cade frecvent şi prezintă un mod particular de ridicare (căţărându-se pe el însuşi - semnul Gowers). Există o pseudohipertrofie a

moleţilor (creşte diametrul gambelor prin acumulare de colagen).

Distrofia musculară Duchenne are evoluţie progresivă, apar contracturi, scolioză severă şi lordoză compensatorie, netrataţi pierd abilitatea de a

merge după 10 ani, iar imobilizarea bolnavilor survine inevitabil în jurul vârstei de 17-20 de ani, când sunt prezente şi tulburări respiratorii şi de

vorbire. Decesul survine datorită insuficienţei respiratorii prin paralizia muşchilor respiratori.

Tratament patogenic constă în transfer de mioblaste şi terapie genică (prin mini-gene).

13.10.2. Distrofia musculară Becker

Este determinată de o altă variantă alelică a genei care determină distrofia musculară progresivă Duchenne, situată pe acelaşi locus, deci

având aceeaşi transmitere recesivă legată de cromozomul X. În această miopatie tabloul clinic este mai blând iar evoluţia mai lentă.

Debutul este în jurul vârstei de 11 ani, miopatia este evidentă. Simptomul principal este durerea, necesită chirurgie ortopedică pentru

contracturi şi scolioză, supravieţuirea putând fi prelungită până la 35-40 de ani.

Explorări paraclinice la ambele forme: creatinkinază crescută, EMG-ul prezintă modificări de tip miopatic şi biopsie uşor diferită.

13.10.3. Distrofia musculară progresivă facio-scapulo-humerală

Este o miopatie cu transmitere autozomal dominantă, cu penetranţă incompletă a genei şi afectarea ambelor sexe. Boala se caracterizează

printr-o considerabilă variabilitate în ceea ce priveşte vârsta de debut, severitatea simptomatologiei şi modificările la nivel muscular. Ea se

delimitează clinic de celelalte distrofii musculare progresive prin dismorfismul facial tipic (buza de tapir), afectarea centurii scapulo-humerale şi

evoluţia lentă. Debutul acestei forme de miopatie este situat în prima decadă de viaţă sau în adolescenţă, existând şi cazuri cu debut precoce sau

tardiv, după 40 de ani. În cazurile cu debut precoce imobilizarea survine după 15-20 de ani de la debut.

Capitolul 14

FARMACOGENETICA

Maria Puiu

Răspunsul la medicamente este adesea variabil de la un individ la altul, ceea ce determină urmărirea şi adaptarea tratamentului pentru fiecare caz în parte. In Franţa incidenţa spitalizărilor determinate de accidentele medicamentoase este estimată la 3,2 % pe an, pentru un cost global anual de aproximativ 320 milioane de euro.

Factorii genetici afectând farmacocinetica şi farmacodinamia medicamentelor explică în mare parte această variabilitate interindividuală.

Conceptul şi termenul de farmacogenetică, ca domeniu de studiu al variaţiilor individuale la acţiunea medicamentelor, variaţii determinate genetic, a fost introdus de Motulsky (1957) şi Vogel (1959).

Primele observaţii clinice de ―afecţiuni farmacogenetice‖ datează de circa 50 de ani, când a fost descrisă o perturbare a une i reacţii de fază I – hidroliza suc-cinilcolinei de către butirilcolinesteraza (pseudocolinesteraza). Subiecţii cu o formă atipică de enzimă nu pot hidroliza succinilcolina, fapt ce determină o prelungire a paraliziei musculare induse de medicament şi apnee.

Aproape în aceeaşi perioadă a fost observată şi o variaţie genetică în faza II de metabolizare a medicamentelor prin acetilare. Concentraţia plasmatică a unor medicamente metabolizate de către N-acetil-transferaza (izoniazida, procainamida) prezintă

variaţii individuale la subiecţii cu acetilare lentă sau rapidă, care determină consecinţe clinice. Cele mai importante enzime implicate în faza I de metabolizare a medicamentelor sunt enzimele din superfamilia citocromului P-

450. Dintre acestea, CYP2D6 prezintă un polimorfism genetic ce influenţează metabolizarea multor medicamente şi determină

diferenţe individuale ale efectelor farmacocinetice şi terapeutice. Farmacogenetica studiază ansamblul mecanismelor de origine genetică care intervin în răspunsul la medicamente, relaţiile

dintre variabilitatea genomului şi răspunsul terapeutic şi are drept scop final optimizarea tratamentelor medicamentoase, atât în ceea ce priveşte eficacitatea cât şi securitatea utilizării lor.

Numeroase polimorfisme genetice afectând gene ce codifică enzime, transportori şi receptori au fost descrise şi consecinţele lor asupra biodisponibilităţii şi efectului unui mare număr de medicamente au fost elucidate

O astfel de variabilitate de răspuns la medicamente depinde de factorii de mediu (alimentaţie, interacţiuni medicamentoase, tabagism), de starea bolnavului (severitatea bolii, patologii asociate, vârstă, sex), de erorile terapeutice dar de asemenea de factori genetici.

Încă de la debutul său, farmacogenetica deschide noi orizonturi, care vor aduce numeroase beneficii tuturor celor care intervin în domeniul sănătăţii şi nu în ultimul rând bolnavului.

Evaluarea efectelor terapeutice ale medicamentelor a permis, în timp, constatarea unor diferenţe în acţiunea lor la bolnavi diferiţi, suferind de aceeaşi boală, precum şi a unor reacţii adverse neaşteptate, uneori fatale.

O serie de observaţii clinice au dus la concluzia că factorii genetici (individua-litatea biochimică - Garrod, 1909) influenţează decisiv metabolismul şi deci efica-citatea medicamentului, precum şi producerea unor reacţii adverse.

Treptat, prin noi descoperiri, a devenit din ce în ce mai evident faptul că, foarte probabil, orice cale de metabolizare a medicamentelor poate prezenta variaţii genetice, 20-29% din variabilitatea individuală a răspunsului la acţiunea medicamentelor fiind determinată de ereditate.

14.1. Farmacogenomica şi variabilitatea farmacodinamică

În afara variaţiilor genetice ale metabolismului medicamentelor, descrise anterior, aria farmacogeneticii s-a extins şi la alte etape ale farmacocineticii şi farmacodinamicii drogurilor.

Au fost studiate în mod deosebit proteinele implicate în transportul medica-mentelor în organism, iar mai recent, interacţiunea medicamentelor cu ţinte terapeutice (receptori, enzime etc.).

Cert este că multe medicamente sunt transportate şi metabolizate prin intervenţia unor proteine-enzime multiple, care acţionează în etape şi pe căi multiple, astfel că variaţiile genetice au un determinism poligenic, cu o distribuţie suprapusă, de aspect gaussian, mult mai greu de apreciat în ceea ce priveşte transmiterea familială şi riscul pentru descendenţi.

În aceste condiţii, numai studiile bazate pe polimorfismul ADN-ULUI (SNPs, microsateliţi, inserţiile şi deleţiile mici etc.) ar putea permite obţinerea unor informaţii farmacogenetice despre numeroasele gene ce codifică proteine relevante în biotrans-formarea şi acţiunea unor medicamente.

Se trece astfel de la farmacogenetică la farmacogenomică. Termenii sunt relativ sinonimi ca sens şi numai din raţiuni practice şi didactice deosebim farmacogenetica, ce foloseşte metodele clasice ale geneticii (bazate pe relaţia genotip-fenotip) concentrându-şi preocupările pe metabolismul medicamentelor, faţă de farmacoge-nomică, care foloseşte studiul polimorfismelor ADN-ului din genomul uman pentru analiza variaţiilor în transportul medicamentelor şi ţintele lor de acţiune (receptori, enzime etc.).

Au fost identificate peste 60 000 de SNPs în regiunile codante ale genelor şi unele dintre acestea au fost deja asociate cu modificări substanţiale în metabolismul sau efectele medicamentelor.

14.2. Farmacogenetica şi polimorfismul diferitelor enzime implicate în metabolismul medicamentelor

Cel mai frecvent se discută despre variabilitatea genetică în metabolismul medicamentelor prin citocromul P450 (CYP). Un polimorfism genetic semnifică faptul că pentru o genă dată există în populaţie cel puţin două variante şi deci măcar două genotipuri, fiecare se exprimă cu o frecvenţă de cel puţin 1%. Un polimorfism genetic a fost descris pentru CYP2D6, CYP2C9 şi

CYP2C19. Pentru CYP2D6 de exemplu se disting trei fenotipuri în populaţie: metabolizatorii ultrarapizi («ultrarapid metabolizers», cu mai multe copii ale genei normale), metabolizatorii rapizi («rapid metabolizers», cu gena normală) şi metabolizatorii lenţi («poor metabolizers», cu o genă inactivă sau absentă). Există o variaţie etnică importantă în prevalenţa fenotipurilor. Prevalenţa metabolizatorilor lenţi în populaţia albă este de 5-10% pentru CYP2D6, de 0,2 - 1% pentru CYP2C9 şi de 2 - 4% pentru CYP2C19.

Polimorfismul genetic este descris şi pentru alte enzime care la fel ca şi cito-cromul P450 intervin în metabolismul medicamentelor, de exemplu N-acetiltransferaza şi tiopurin-S-metiltransferaza.

Câteva exemple de polimorfisme genetice la nivelul metabolismului medica-mentelor:

Enzima Medicament Efect farmacogenetic

CYP2D6

Codeina

Efectul mai redus la metabolizatorii lenţi este dat de faptul că prodrogul

codeină este transformat lent în morfină.

Neuroleptice Efect crescut la metabolizatorii lenţi

(risc crescut de efecte extrapiramidale).

CYP2C9

Warfarina, acenocoumarol

Efect accentuat la metabolizatorii lenţi (risc crescut de hemoragieue)

Sulfamidele hipoglicemiante (glibenclamid,

glimepirid şi glipizid)

Efect accentuat la metabolizatorii lenţi (risc crescut de hipoglicemie).

CYP2C19 Omeprazol Eficacitate crescută a

Omeprazolului utilizat în eradicarea H.pilori la la metabolizatorii lenţi.

N-acetiltransferaza

Izoniazida Efect accentuat la metabolizatorii lenţi (risc crescut de neuropatie

periferică).

Tiopurin S-

metiltransferaza Mercaptopurina

Efect accentuat la metabolizatorii lenţi (risc crescut de efecte nedorite

hematologice).

14.3. Polimorfismul proteinelor de transport

Cel mai intens studiate sunt proteinele din familia transportorilor membranari-fixatori de ATP (numiţi şi transportori ABC) şi în special glicoproteina P, codificată de gena ABCB1 (numită şi MDR1 de la Multiple Drug Resistence). Funcţia principală este efluxul celular de substrate (şi deci de numeroase medicamente) sau, mai clar, excreţia de xenobiotice şi metaboliţi în urină, bilă, lumen intestinal). Ea acţionează şi la nivelul barierei creier-sânge din plexurile coroide, limitând acumularea multor droguri în creier.

În structura genei ABCB1 au fost identificate două polimorfisme SNPs, în codonul 21 şi 26, care s-au dovedit a fi asociate cu variaţii în disponibilitatea drogurilor, concentraţiile plasmatice sau efectul lor (spre exemplu, în tratamentul epilepsiei sau în terapia antitumorală).

14.4. Polimorfismul genetic ce influenţează ţintele medicamentelor

Variaţiile genetice în ţintele de acţiune a medicamentelor (de exemplu receptorii) pot avea un efect important asupra eficacităţii lor dintre multiplele exemple studiate recent vom menţiona polimorfismul genei ADRB2 pentru adrenoreceptorul-2, ţinta celor mai frecvent utilizate medicamente în astmul bronşic, dar şi în alte afecţiuni.

Diferite variante (SNPs) ale genei influenţează funcţia receptorului (procesul de transducţie a semnalului) şi răspunsul farmacologic la o serie de medicamente ca:

antagoniştii β2-adrenergici (folosiţi pentru vasodilataţie sau bronhodilataţie în astm) inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei (ACE) sau inhibitori de arahidonat-5-lipooxigenază (ALOX5).

Un polimorfism genetic există de asemenea pentru genele jucând un rol în apariţia unor boli şi astfel efectul unui medicament poate fi influenţat. Polimorfismul genetic la nivelul factorului V este un exemplu. Femeile cu varianta «factor V Leiden» a genei care codifică factorul V au un risc crescut de tromboembolie venoasă. Dacă aceste femei iau contraceptive orale acest risc tromboembolic este mai crescut decât la alte femei.

14.5. Exemple de tulburări farmacogenetice

În tulburările farmacogenetice sunt incluse: deficienţe enzimatice cu reacţii adverse la medicamente boli genetice precipitate şi/sau complicate de unele medicamente

14.5.1. Deficienţe enzimatice cu reacţii adverse la medicamente

14.5.1.1. Deficienţa în glucozo-fosfatdehidrogenază (G-6PD)

Este cea mai comună deficienţă enzimatică umană, estimându-se că 400 milioane de oameni sunt afectaţi de această enzimopatie. Descrisă în 1956, boala prezintă un beneficiu, ea conferă persoanelor cu această deficienţă rezistenţă la malarie.

Gena care codifică G-6PD este localizată pe cromozomul Xq28..Mutaţii ale acestei gene determină diferite forme de boală, mai frecvent la sexul masculin (transmitere recesiv-X-linkată). Sunt cunoscute peste 400 de variante alelice, cu penetranţă diferită, expresie fenotipică diferită, diferite populaţii având diferite tipuri de mutaţii: în Egipt există varianta alelică numită "Mediteraneană" iar în Japonia varianta alelică numită "Japoneză".

Defectul enzimatic antrenează reacţii hemolitice (hemoliză eritrocitară), fie ocazional la administrarea unor medicamente, fie spontan (când gena patologică are penetranţă mai mare). În genere, în defectul enzimatic, hemoliza eritrocitelor se declanşează brusc, după administrarea unor medicamente, ca sulfamide, antipiretice, antimalarice, antalgice, în stări infecţioase, de asemenea, posibil în timpul perioadei de hiperbilirubinemie neonatală. Simptomele dispar însă după întreruperea medicaţiei.

Sunt mai bine conturate patru tipuri de deficienţe în G-6PD, dintre care două sunt forme severe, cu anemie hemolitică cronică; o a treia formă se caracterizează printr-o deficienţă moderată şi hemoliză intermitentă şi o ultimă formă, în care deficienţa se exprimă doar episodic, tranzitor, până la încetarea factorului declanşator.

14.5.1.2. Deficitul în colinesterază

Este una dintre cele mai dramatice reacţii farmacodinamice. Deficitul enzimatic, determinat monogenic dominant autozomal, antrenează brusc după administrarea de relaxante musculare paralizii de tipul „stop respirator‖, necesitând oprirea imediată a administrării medicamentelor respective.

Existenţa în populaţie a mai multor forme alelice patologice, antrenează - în funcţie de expresia genei- diferite moduri de reacţii adverse la medicamentele mai sus notate.

14.5.1.3. Hipertermia malignă

HM este definită ca un sindrom cu caracter ereditar, rar, care afectează în special musculatura scheletică, transmis dominant autozomal şi care se declanşează brusc după administrarea de anestezice sau miorelaxante.

Defectul de bază nu este complet cunoscut, se pare că este legat de echilibrul calciului în sarcoplasma celulei musculare. La foarte scurt timp de la administrarea medicamentelor, se declanşează reacţia adversă, cu hipertermie marcată, rigiditate musculară, tahipnee, hipoxie, acidoză respiratorie şi chiar stop cardiac, dacă administrarea medicamentelor nu este oprită.

14.5.1 4. Carenţa în acetil-transferază

Este un deficit enzimatic determinat recesiv autosomal. Polimorfismul acetilării a fost identificat prima dată la bolnavii cu tuberculoză trataţi cu izoniazidă. Acetilatorii lenţi, homozigoţi

pentru o alelă NAT2 deficientă au o concentraţie plasmatică crescută a medicamentului, la o terapie standard şi dezvoltă o neuropatie periferică, toxică. De asemenea, acetilatorii lenţi expuşi la arilamine cancerigene (de exemplu, benzidina) au o incidenţă crescută a cancerului de vezică iar femeile la postmenopauză, fumătoare au un risc crescut de cancer de sân.

Acetilatorii rapizi au frecvent eşecuri ale terapiei cu izoniazidă administrată o dată pe săptămână. Dacă sunt hipertensivi necesită o doză mai mare de hidralazină pentru controlul tensiunii arteriale

14.5.1.5. Deficitul în alfa-1-antitripsină

Este un deficit enzimatic determinat recesiv autosomal cu expresie clinică variabilă. Enzima alfa-1-antitripsină este o glicoproteină codificată de o genă situată pe cromozomul 14 şi constituie un inhibitor al proteazelor, având rolul de a proteja elastina din ţesuturi faţă de efectul proteazelor. Gena care codifică această enzimă prezintă polimorfism alelic, alelele fiind: normală (N), cu mutaţie (Z, S) sau complet absentă (nulă - n).

Riscul de a dezvolta boala priveşte subiecţii cu genotip n/n, Z/n sau Z/Z şi este variabil chiar între subiecţii cu acelaşi genotip. Se descriu două principale forme de afectare:

Afectarea hepatică, manifestată în principal la copii, cu hepatomegalie şi anomalii biologice hepatice. Aceşti copii pot evolua spre ciroză, necesitând adesea recurgerea la transplant hepatic.

Afectarea pulmonară, tradusă printr-un emfizem generalizat panlobular, survenit la un subiect cu vârstă mai redusă decât vârsta la care ar surveni la un individ fără deficienţă de alfa-1-antitripsină. Riscul de a dezvolta un emfizem este major la persoanele fumătoare şi la cei care lucrează în mediu cu noxe chimice. Severitatea atingerii respiratorii este forte variabilă iar tratamentul emfizemului pulmonar determinat de acest deficit enzimatic beneficiază de administrarea intravenoasă de alfa-1-antitripsină, a cărei eficienţă nu este întotdeauna dovedită.

14.5.2. Boli genetice precipitate şi/sau complicate de unele medicamente

Multiple observaţii clinice confirmă că unele substanţe medicamentoase fără efecte secundare majore pentru cei mai mulţi dintre indivizi, pot declanşa agravarea manifestărilor la pacienţii cu boli genetice.

Diureticele administrate la persoanele cu predispoziţie genetică pentru gută, antrenează o marcată hiperuricemie prin diminuarea excreţiei urinare a acidului uric, agravând starea preexistentă.

În hemocromatoză se accentuează tulburările tabloului clinic după adminis-trarea de medicamente care conţin fier, în alimentaţia cu alimente sau cu apă bogate în fier şi după ingestia de alcool; acesta din urmă, amplificând absorbţia fierului, antrenează leziuni hepatice şi implicit agravarea evoluţiei bolii.

Porfiriile constituie un alt grup de boli în care administrarea unor medicamente ca barbiturice, sulfamide, hormoni estrogeni, tranchilizante, anestezice, sustanţe contraceptive ca şi ingestia de alcool, exacerbează tabloul simptomatic (în porfiriile asimptomatice, substanţele de mai sus pot declanşa debutul bolii).

În anomaliile genetice hemoragipare (hemofilii) administrarea aspirinei poate exacerba starea hemoragipară.

14.6. Perspectivele farmacogeneticii

Una dintre marile probleme ale medicinei moderne este aceea a îmbunătăţirii efectului medicamentelor. Există însă dificultăţi serioase în evaluarea componentei ereditare a răspunsului la medicamente:

cunoştinţe incomplete despre farmacocinetică şi mecanismul de acţiune a unor medicamente; răspunsul organismului la droguri are un determinism poligenic, fapt ce necesită identificarea multiplelor gene implicate şi

stabilirea relaţiei dintre efectele medicamentelor şi anumite polimorfisme ADN ale acestor gene; realizarea dificilă a studiilor familiale; necesitatea unui număr mare de pacienţi expuşi la drog şi urmăriţi à la longue;

relaţiile farmacogenetice trebuie validate pentru fiecare indicaţie terapeutică şi în diferite grupuri etnice, din cauza heterogenităţii populaţiilor (un anumit genotip poate fi important în determinarea efectelor unui medicament într-o anumită populaţie, dar nu şi în altele);

existenţa unei dileme bioetice legate de furnizarea de date prognostice şi alegerea terapiei; dezvoltarea geneticii moleculare şi amplificarea cunoştinţelor despre genomul uman şi acţiunea genelor va avea un impact major

asupra producerii medica-mentelor şi administrării lor, într-un mod care este greu de imaginat astăzi; în mod cert ele vor duce la identificarea unor noi medicamente, precum şi la ameliorarea eficacităţii şi siguranţei

medicamentelor în toate specialităţile medicale.

14.7. Domeniile cercetării farmacogenomice

Domeniile cercetării farmacogenomice sunt reprezentate de: identificarea genelor cauzatoare de boală ce pot fi manipulate prin medicamente; identificarea polimorfismelor genetice implicate în metabolizarea medicamentelor (la cele trei niveluri: enzime de biotransformare şi

conjugare, proteine de transport, receptori); stratificarea medicamentelor în funcţie de polimorfismul mononucleotidic, adică individualizarea terapiei medicamentoase în funcţie

de profilul genetic individual, pentru a evita reacţiile adverse; stratificarea genetică populaţională prin scanarea genomului uman pentru identificarea genelor implicate în răspunsul la

tratament; determinarea tipurilor de expresie genică (proteom) în ţesuturile ţintă, precum şi a interacţiunii dintre medicament şi receptorul ţintă,

prin analiza programului transcripţional al ţesutului ţintă, privind răspunsul la tratament.

Costurile actuale pentru asemenea „screeninguri farmacogenomice‖ sunt mari, dar cu siguranţă tehnologia microcipurilor („microarray‖) se va dezvolta, iar beneficiile reducerii frecvenţei răspunsurilor adverse şi ale creşterii eficienţei terapeutice vor justifica investiţiile.

„Medicina predictivă şi individualizată‖, personalizată în funcţie de genotipul individului afectat şi tratat, este realmente posibilă, dar nu într-un viitor foarte apropiat.

In acest efort sunt implicate cele mai prestigioase foruri medicale: Organizaţia Mondiala a Sănătăţii (OMS), Comisiile de sănătate ale Uniunii europene, dar şi cele mai importante fabrici din industria farmaceutică.

Capitolul 15

IMUNOGENETICĂ

15.1. Structura de bază a imunoglobulinelor

Imunoglobulinele sunt glicoproteine produse de limfocitele B şi prezente în plasmă şi în alte lichide biologice ale organismului. Sunt descrise 5 clase de imuno-globuline: IgG, IgA, IgM, IgD et IgE.

Celulele liniei B sintetizează Ig. Acestea sunt produse fie pe suprafaţa limfo-citelor B, fie sunt secretate de plasmocite.

Imunoglobulinele (Ig) sunt formate din 4 lanţuri polipeptidice: 2 lanţuri uşoare identice (L) denumite κ şi λ şi 2 lanţuri grele (H) de tip: , , , sau μ. Tipul lanţului greu determină izotipul Ig: IgA, Ig D, Ig E, Ig G respectiv Ig M. Lanţurile uşoare constau din domeniile:

Constant (C); Variabil (V); Joncţional (J).

Lanţurile grele au un domeniu adiţional denumit diversitate (D). Lanţurile uşoare sunt formate din 220 aminoacizi, iar cele grele din 450-550 aminoacizi, fiecare lanţ având regiuni constante şi variabile.

Regiunile variabile se află la capătul aminoterminal al lanţului polipeptidic (aminoacizii 1-110). Aceste secvenţe sunt distincte la diferiţi anticorpi. Regiunile constante cuprind aminoacizii 111-220, respectiv 440-550, şi sunt relativ uniforme la diferiţi anticorpi la acelaşi izotip. Cele 4 lanţuri polipeptidice sunt legate prin legături disulfidice. La nivel tridimensional un lanţ al imunoglobulinelor constă dintr-un domeniu variabil (V) la capătul N-terminal şi unul (pentru lanţul L) sau mai multe (pentru lanţul H) domenii constante (C).

Domeniile variabile şi constante ale Ig sunt codificate de gene diferite, dar numărul lor nu este suficient de mare pentru a fi suficient pentru enorma diversitate de Ig produse în cadrul răspunsului imun. Pentru a rezolva această limită aparentă producţia de Ig este determinată de o organizare specială la nivelul genomului şi mecanisme diferite de expresie.

Diversitatea anticorpilor este datorată: prezenţei a multiple gene, notate V, D, J în celula progenitor; modificărilor ADN-ului atunci când celulele B imature se transformă în celule mature; multiplelor posibilităţi de legare între lanţurile uşoare şi grele; mutaţiilor somatice; recombinărilor multiple.

Lanţurile uşoare (κ sau λ)

Lanţul kappa: rearanjamente V-J

Genele pentru lanţurile κ sunt plasate pe cromozomul 2p11. Există:

multiple gene pentru regiunea variabilă V (76 gene, dintre care 31-35 sunt funcţionale);

5 gene pentru regiunea joncţională J;

1 genă pentru regiunea constantă C.

Iniţial ADN-ul este rearanjat, unindu-se o genă V cu o genă J. Secvenţele intermediare sunt deletate. În cadrul genomului uman numai

genele care codifică Ig şi receptorii T suferă rearanjări ale ADN-ului. Pre-ARNm este iniţial copiat prin transcripţie. Urmează procesul de

splicing, cu eliminarea intronilor şi formarea ARNm matur.

Lanţul lambda: rearanjamente V-J

Genele pentru lanţul λ sunt plasate pe cromozomul 22q11. Mecanismul de rearanjare este acelaşi ca şi pentru lanţul κ. Rearanjamentele

au loc între 29-33 gene funcţionale pentru domeniul variabil (V) şi 1 genă J.De asemenea, există 4-5 gene funcţionale C, fiecare fiind precedată de

o genă J.

Lanţurile grele ale Ig sunt specificate de gene plasate pe cromozomul 14q32. Există 11 gene din care 9 sunt funcţionale, determinând 9

izotipuri pentru lanţurile grele (α1, α2, δ, γ1, γ2, γ3, γ4, μ şi ε).

Rearanjările V-D-J au loc şi în cadrul genelor care codifică lanţurile grele, astfel:

1 din cele aproximativ 40 gene funcţionale care codifică regiunea variabilă (V) se combină cu 1 din cele 23 gene funcţionale care codifică

regiunea diversitate (D) şi cu 1 din cele 6 gene funcţionale care codifică regiunea joncţională (J).

15.2. Structura receptorilor celulelor T

Limfocitele T constituie componenta "celulară" a imunităţii specifice. Receptorii celulelor T au o structură similară cu imunoglobulinele, fiind

formaţi din 2 lanţuri polipeptidice, ambele având regiuni constante şi variabile.

Genele care codifică aceşti receptori au şi ele o organizare similară cu cea a genelor care codifică Ig. Genele pentru locusul β sunt plasate

pe cromozomul 7q35, iar pentru locusul α pe cromozomul 14q11. Locusul β al receptorilor celulelor T conţine segmente V, D şi J la fel ca şi locusul

pentru lanţurile grele ale Ig, iar locusul α conţine segmente V şi J, la fel ca locusul pentru lanţurile uşoare ale Ig.

15.3. Tulburări genetice ale sistemului imunitar (Imunodeficienţe)

15.3.1. Imunodeficientele primare (IDP)

Imunodeficienţele pot fi înnăscute (primare) sau dobândite (secundare); se datorează mai multor cauze:

pot fi rezultatul unor defecte genetice intrinsece ale celulelor limfoide, care se manifestă prin erori ale diferitelor trepte de maturare, care se

succed de la celula stem pluripotentă, până la celula T matură şi respectiv, până la plasmocit. Deficienţa poate fi datorată lipsei unor enzime

esenţiale pentru metabolismul celulei (de exemplu, metabolismul purinelor). Consecinţa este absenţa limfocitelor din organele limfoide şi

din circulaţie;

alteori se produc deleţii ale genelor care codifică unele izotipuri de lanţ greu (H). Astfel, apar deficienţele selective ale claselor de

imunoglobuline;

imunodeficienţele se pot datora slabei dezvoltării a mediului necesar diferenţierii şi maturării celulelor limfoide (timus, GALT);

imunodeficienţele pot fi rezultatul perturbării mecanismelor reglatoare ale celulelor Th şi Ts, care controlează răspunsul imun mediat

celular şi humoral;

imunodeficienţele pot surveni ca rezultat al catabolizării imunoglobulinelor cu o rată excesivă, sau chiar datorită pierderii imunoglobulinelor

din sânge şi din secreţii, deşi celulele limfoide şi imunoglobulinele sunt normale sub aspect numeric şi respectiv, cantitativ;

Circa 50% din imunodeficienţe se datorează sintezei deficitare a anticorpilor, 10% sunt imunodeficienţe celulare, 20% sunt imunodeficienţe

combinate, 18% sunt deficienţe ale fagocitelor şi 2% sunt deficienţe ale proteinelor complementului.

Imunodeficientele primare sunt boli genetice ale componentelor sistemului imun, cu debut mai ales în copilărie, în care implicarea

imunologilor asigura desci-frarea patogeniei complexe şi a modificărilor imune pe care le generează.

Imunodeficienţele primare se clasifică în 4 grupuri, în funcţie de componenta sistemului imun care este deficientă:

deficienţe ale limfocitelor B (deficit de anticorpi -Ig- );

deficienţe ale limfocitelor T (deficite ale imunităţii celulare);

deficienţe ale fagocitelor;

deficienţe ale complementului.

Imunodeficienţele înnăscute (primare) au fost descoperite de O. Bruton (1952), odată cu descrierea agamaglobulinemiei şi

hipogamaglobulinemiei infantile sex-lincată. Maladia afectează băieţii şi se transmite prin cromosomul X. Pacienţii rămân asimptomatici în primele

luni de viaţă, deoarece în această perioadă imunoglobulinele materne asigură protecţia antiinfecţioasă. După vârsta de 5-6 luni, pacienţii devin

foarte sensibili la infecţiile tegumentare cu bacterii piogene şi la infecţii ale tractului respirator cu streptococi, meningococi, H. influenzae.

Pacienţii sunt lipsiţi de reactivitatea imunitară mediată humoral. In ţesuturile limfoide lipsesc plasmocitele, iar foliculii limfoizi nu se formează

nici după stimularea antigenică repetată. La electroforeză, serul pacienţilor nu relevă fracţia gamaglobulinică. IgG are concen-traţia de 1/10 (1

mg/ml faţă de 10 mg/ml), iar IgM are concentraţia de 1/100 din valorile normale. Lipseşte IgA, dar lipsesc şi hemaglutininele α şi β. În mod

normal limfocitele B reprezintă 5-18% din totalul limfocitelor circulante, dar la aceşti pacienţi, proporţia lor este foarte mică (mai puţin de

0,1%). Absenţa limfocitelor B mature se datorează defectelor de maturare, determinate de tirozin-kinaza nefunc-ţională, codificată de gena

mutantă.

Pacienţii au reactivitate normală a imunităţii mediate celular: testul hiper-sensibilităţii întârziate la tuberculină este pozitiv, limitează

infecţiile virale, cu excepţia hepatitei B (care evoluează rapid spre ciroză) şi a celor cu enterovirusuri. Limfocitele T au valori numerice normale.

Vaccinurile virale atenuate sunt bine suportate şi nu produc infecţii clinice.

Disgamaglobulinemiile selective se caracterizează prin incapacitatea sintezei unui anumit izotip imunoglobulinic. Se cunosc deficienţe

selective ale IgM, IgA sau ale IgM şi IgA, IgA şi IgG, IgM şi IgG.

Deficienţele IgA se asociază cu o frecvenţă crescută a infecţiilor tractului digestiv şi respirator, iar deficienţele sintezei IgG şi IgM se

însoţesc cu creşterea sensibilităţii faţă de infecţiile tegumentare cu bacterii piogene.

Agama-, hipogama- şi disgamaglobulinemiile selective se ameliorează net, prin administrarea intravenoasă a gamaglobulinelor.

Sindromul Di George este consecinţa hipoplaziei sau ageneziei timice. In cursul vieţii embrionare se produce o perturbare a dezvoltării

structurilor derivate din perechile a 3-a şi a 4-a de pungi faringiene. Agenezia timică este însoţită de absenţa paratiroidelor şi de aceea, pacienţii,

iniţial, prezintă alte simptome: hipo-calcemie, malformaţii cardiace. Timusul este foarte redus ca dimensiuni sau chiar lipseşte la 1/3 dintre

pacienţi. Adeseori, timusul există sub forma glandelor ectopice. Imunitatea mediată humoral este normală, reflectată în valorile normale ale concen-

traţiei imunoglobulinelor.

Dacă supravieţuiesc, la câţiva ani, pacienţii manifestă sensibilitate înaltă faţă de infecţiile virale, faţă de bacteriile intracelulare sau faţă de

infecţia fungică cu Pneumocystis carinii.

Imunodeficienţa severă combinată (SCID) se caracterizează prin deficitul ambelor compartimente ale imunităţii, atât celular, cât şi cel

humoral. Deficienţa se datorează absenţei celulelor stem de origine a limfocitelor. Lipsesc limfocitele T, B şi granulocitele, datorită hipoplaziei

generalizate a ţesutului reticular hematopoetic. Organele limfoide secundare sunt hipoplazice, iar timusul este absent. Lipsesc

imunoglobulinele serice.

Pentru restabilirea funcţiei imunitare se impune transplantul măduvei osoase.

Capitolul 16

STUDIUL GEMELARITĂŢII LA OM

La om, gemelaritatea reprezintă un fenomen necaracteristic (o excepţie), dat fiind caracterul monoovulator al ciclului ovarian

lunar. Cu toate acestea, naşterile gemelare se întâlnesc într-o proporţie de 0,5 % din totalul naşterilor. Gemenii pot fi monozigoţi (MZ), identici, sau dizigoţi (DZ), denumiţi şi fraterni. Excepţional de rar se nasc gemeni multiplii (tripleţi, quadrupleţi)

Incidenţa gemelarităţii este diferită de la MZ la DZ; astfel, gemenii MZ se întâlnesc într-o proporţie de aproximativ 1:260 de naşteri în toate zonele geografice, pe când în cazul gemenilor DZ frecvenţa variază de la un continent la altul. În Asia spre exemplu,

gemenii DZ sunt aproximativ 1:500, pentru ca în Caucaz proporţia să fie de 1:125 de naşteri, iar în Africa să fie mult mai ridicată,

1:20 de naşteri.

16.1. Geneza gemenilor Gemenii MZ rezultă dintr-o fecundare singulară (un singur ovul fecundat de un spermatozoid) după care zigotul, respectiv

blastomerele rezultate, suferă o scindare în două mase embrionare. Aceasta poate avea loc în primele 10-12 zile de la fecundare. Cele două mase embrionare odată separate, se vor dezvolta independent una de cealaltă, reprezentând doi embrioni, respectiv nou-

născuţi identici genotipic şi fenotipic (întotdeauna de acelaşi sex). De regulă ei se dezvoltă într-o placentă unică (mai rar au placente diferite).

Deşi condiţiile care favorizează dezvoltarea sarcinilor gemelare MZ la om nu sunt deplin cunoscute, apariţia lor este într-o

oarecare măsură explicată de experienţele de embriologie, care sugerează că în producerea separării (scindării) masei embrionare ar interveni unii factori fizici, chimici sau infecţioşi. Se incriminează efectul radiaţiilor care prin depolarizarea membranelor celulare ar

scădea tensiunea superficială şi coeziunea intercelulară a blastomerelor. Gemelaritatea cu MZ nu prezintă incidenţă familială, nefiind incriminaţi în producerea sa, factori genetici.

În cazul în care separarea celor două mase embrionare nu se face în întregime, se dezvoltă gemeni monştri, fără

individualitate completă (gemeni conjuncţi), prezentând zone comune: craniu unic (craniopagi), torace comun (toracopagi) etc. Teoria multiimpregnării unui ovul cu doi spermatozoizi nu este acceptată, cunoscându-se bine că mecanismul fecundaţiei

este un proces monopolist, cu pătrunderea numai a unui singur spermatozoid în ovul.

Gemenii DZ rezultă din fertilizarea (fecundarea) a două ovule (maturate în aceeaşi perioadă ovulatorie a ciclului), fiecare de către un spermatozoid.

În genere, poliovulaţia este determinată de hiperfuncţia antehipofizară, cu creşterea nivelului de FSH matern. Spre deosebire de cazul gemenilor MZ, la familiile cu gemeni DZ se remarcă o incidenţă familială crescută, de aproximativ 3

ori mai mare faţă de populaţia generală. Aceasta evidenţiază existenţa unei componente ereditare transmisă pe linie maternă. Astfel,

o femeie rezultată dintr-o pereche de gemeni DZ, are un risc crescut de a avea copii gemeni DZ, spre deosebire de băieţii rezultaţi dintr-o pereche de DZ, la care riscul este practic nul.

Statisticile relevă că frecvenţa sarcinilor dizigote este de 2 ori mai mare la mamele în vârstă de peste 28-30 ani decât la cele

mai tinere şi concordă în acelaşi timp cu paritatea.

Incidenţa gemenilor DZ este dependentă de o trăsătură ereditară şi în acelaşi timp, de funcţia hipofizară maternă. Pe de altă

parte, statisticile relevă că incidenţa gemenilor DZ variază şi în funcţie de rasă şi regiunea geografică.

Gemenii trizigoţi şi tetrazigoţi se întâlnesc excepţional de rar; ei rezultă din fecundarea a trei, respectiv patru ovule (maturate în

acelaşi timp), fiecare de către un spermatozoid. Naşterea de gemeni multipli (prin ovulaţie multiplă) a fost observată mai frecvent în

ultimii ani, ca o consecinţă a utilizării medicamentelor stimulatoare ale ovulaţiei (folosite în ciclurile anovulatorii).

Prin extinderea examinărilor ultrasonografice prenatale, s-a observat că sarcinile gemelare sunt mult mai frecvente decât naşterile

gemelare, aceasta datorită faptului că în primele luni de dezvoltare intrauterină, destul de frecvent, unul din perechea de gemeni

dispare prin resorbţie.

16.2. Importanţa studiului gemenilor în evaluarea cotei de participare a factorilor ereditari în

realizarea caracterelor normale şi patologice

Studiul gemenilor MZ şi DZ oferă date importante privitoare la cota cu care factorii genetici şi cei de mediu participă la

realizarea unui caracter (normal sau patologic).

Cercetarea şi compararea perechilor de gemeni MZ şi DZ permit, cu alte cuvinte, aprecierea implicaţiilor – uneori majore –

ale eredităţii în constituirea fenotipului normal sau patologic.

În scopul aplicării eficiente a acestui studiu, al comparării unui caracter la MZ cu acelaşi caracter la DZ, este deosebit de

important ca gemenii cuprinşi în studiu să fie încadraţi corect în una din cele două categorii.

Când gemenii au sex diferit, diagnosticul de gemeni DZ este cert. Dacă au acelaşi sex, se vor lua în considerare mai mulţi

parametrii: inspecţia placentei (de obicei gemenii DZ au placente diferite), aspectul fenotipic, talia, greutatea, diferite perimetre şi

pentru că acestea sunt doar orientative, se va recurge la studiul dermatoglifelor, evidenţierea grupelor sanguine eritrocitare,

plasmatice şi a altor caractere fiziologice, ştiut fiind că acestea sunt constituite pur genetic.

Gemenii MZ au trăsături fenotipice identice (sau foarte apropiate) şi identitate absolută în ceea ce priveşte grupele sanguine.

Astăzi tehnicile de genetică moleculară permit cu certitudine absolută diagnos-ticarea gemenilor MZ de cei DZ, prin diagnostic

molecular de evidenţiere a markerilor ADN-ului (la gemenii MZ identitatea structurii ADN este absolută).

Studiul perechilor de gemeni MZ şi DZ constă în cercetarea comparativă a unui mare număr de cazuri, stabilindu-se gradul de

concordanţă, respectiv discordanţă al diferitelor caractere somatice şi fiziologice.

Se vorbeşte de concordanţă când caracterul urmărit este prezent la ambii gemeni şi de discordanţă când acesta este prezent

numai la unul dintre gemeni.

În cazul caracterelor determinate pur genetic (grupele sanguine de exemplu), concordanţa la MZ este de 100 %; la DZ

concordanţa prezintă aceleaşi valori ca şi cele existente între fraţii obişnuiţi (vorbindu-se de discordanţă, de fapt).

Discordanţa (diferenţa) unor caractere la gemenii MZ este determinată de mediu sau de unii factori particulari genetici.

Astfel, pentru unele defecte congenitale şi boli genetice, se poate remarca discordanţă între gemenii MZ, în ciuda originii lor

comune. Asemenea discordanţe pot fi induse prin:

anomalii ale vascularizaţiei (regionale spre exemplu) la unul dintre MZ şi care să determine constituirea unei malformaţii

congenitale;

disjuncţii patologice mitotice la unul din MZ care să ducă la anomalii cromozomice (mozaicisme);

inactivarea variată a cromozomului X, patern sau matern, la cele două gemene MZ, atunci când procesul inactivării X se face

după separarea embrionară.

Studiile de genetică moleculară efectuate la MZ de sex feminin, heterozigote pentru gena patologică din miodistrofia Duchenne,

au relevat existenţa unei frecvente discordanţe a expresiei genei în fenotipul celor două gemene, aceasta fiind determinată de inactivarea

variată a cromozomului X patern sau matern din celule; cu alte cuvinte, proporţiile cromozomului X inactivat, de origine paternă şi a celui

de origine maternă, diferă de la un geamăn la celălalt.

Asemenea discordanţă s-a remarcat şi la gemenele MZ purtătoare heterozigote a genei pentru deficienţa în G-6-fosfat-

dehidrogenază, la fel în cazul genelor pentru vizibilitatea cromatică etc.

Prezenţa acestei discordanţe remarcată la nivel de expresie a genelor X - linkate sugerează că evenimentul de separare a masei

embrionare precede momentul inactivării cromozomului X (al lyonizării).

Deosebit de interesante sunt şi cercetările efectuate pe perechi de gemeni MZ crescuţi din anumite motive familiale în medii

diferite, comparativ cu gemenii MZ care au crescut în acelaşi mediu familial, deasemenea, în situaţiile de adopţie. Concordanţa

mai mică a unor caractere la gemenii MZ crescuţi separat sugerează intervenţia semnificativă a factorilor de mediu în constituirea

acestor caractere.

În ceea ce priveşte talia, perimetrele (cranian, toracic), greutatea corporală, concordanţa la gemenii MZ este net superioară

faţă de DZ. Se remarcă faptul că la gemenii MZ crescuţi în medii diferite, valorile concordanţei nu se modifică semnificativ, aceasta,

constituind o dovadă că toate caracterele menţionate mai sus sunt în mare măsură condiţionate genetic (şi influenţate doar parţial de

mediu).

Un studiu recent efectuat în Suedia, privitor la valorile concordanţei greutăţii corporale la MZ şi DZ, cât şi la MZ crescuţi în

medii diferite, relevă că ereditatea influenţează în foarte mare măsură acest caracter (inclusiv tendinţa la supra-alimentaţie şi la modul de

depozitare al ţesutului adipos). Rezultă că obezitatea este în cea mai mare parte condiţionată genetic.

Studiile privitoare la dezvoltarea intelectului, a coeficientului de inteligenţă în general, şi a comportamentului social la gemenii

MZ crescuţi în medii diferite, au relevat că aceste caractere sunt în peste 80 % condiţionate genetic, restul fiind atribuit factorilor de

mediu.

La gemenii MZ faţă de DZ, se relevă o concordanţă mare şi în compoziţia chimică a sucurilor digestive, a sudorii, a valorii

pulsului şi tensiunii arteriale, a EKG, EEG, a momentului instalării pubertăţii, a sensibilităţii la infecţii şi chiar în privinţa longevităţii.

Toate cele menţionate mai sus relevă pregnant ponderea pe care o are ereditatea în definirea acestor caractere morfo-funcţionale, a

reactivităţii biologice a organismului.

Gradul de concordanţă al unui caracter la MZ, respectiv la DZ, se exprimă în valori procentuale pentru fiecare categorie în

parte după formula:

Concordanţa (C) %

=

nr. concordanţi 100

nr. total gemeni

Raportul concordanţei dintre MZ şi DZ poate fi apreciat şi prin calcularea procentuală a coeficientului ereditar (CE):

CE = % concordanţă la MZ - % concordanţă la DZ

100 - % concordanţă la DZ

Studiul gemenilor oferă şi informaţii deosebit de utile în domeniul patologiei, relevând astfel existenţa unei componente

ereditare în foarte multe boli.

Dintre bolile care prezintă concordanţă mare la MZ faţă de DZ menţionăm: hipertensiunea arterială, boala coronariană,

ulcerul peptic, astmul bronşic, starea alergică, unele boli de piele, unele forme de reumatism, diabetul zaharat, bolile psihice etc.

Studiile privitoare la concordanţa diabetului zaharat, au evidenţiat că în diabetul zaharat al adultului (neinsulino - dependent),

concordanţa la MZ atinge valori de peste 95 % faţă de DZ, unde valorile sunt de maximum până la 25 %.

În acelaşi timp, în diabetul zaharat juvenil (insulino-dependent), concordanţa la MZ are valori asemănătoare cu cea observată

la DZ. Aceste fapte relevă că în etiologia diabetului zaharat al adultului, factorii ereditari se implică în proporţie foarte mare. Dar,

aşa cum se cunoaşte astăzi, ereditatea se implică şi în diabetul zaharat insulino-dependent, prin asocierea frecventă a acestuia cu

anumite haplotipuri HLA. Oricum, componenta ereditară în diabetul zaharat al adultului joacă un rol covârşitor în etiologia acestei boli.

În privinţa bolilor psihice (psihoze, schizofrenie), concordanţa bolii la MZ atinge valori de peste 60-70 %, spre deosebire de

gemenii DZ, unde valorile sunt mai mici. De asemenea, în nevroze concordanţa la MZ se dovedeşte a fi foarte mare (90 %), faţă de

DZ unde procentul scade la jumătate.

Aceleaşi cercetări comparative între MZ şi DZ subliniază că ereditatea influenţează într-o mare măsură şi sensibilitatea

(respectiv pragul de rezistenţă) la infecţii şi chiar evoluţia lor. Astfel, efectuându-se studii de acest gen în perioadele epidemiilor de

polimielită, s-a observat că la MZ concordanţa era de 6 ori mai mare decât la DZ.

Rezultate similare s-au obţinut şi în studiile privind sensibilitatea faţă de streptococul beta-hemolitic, dovedindu-se astfel că

la MZ concordanţa apariţiei bolii este mai mare decât la DZ.

Prin aceasta se evidenţiază că răspunsul imun (reactivitatea organismului) este condiţionată genetic.

Pe baza tuturor acestor rezultate, metoda gemenilor (studiul lor comparativ) aduce date preţioase în cunoaşterea componentei

genetice în patologie, în elucidarea etiopatogeniei pentru multiple boli.

Capitolul 17

GENETICA POPULAŢIILOR

Maria Puiu

Genetica populaţiilor este parte a geneticii care studiază distribuţia genelor şi a genotipurilor în populaţie precum şi factorii care pot menţine sau schimba aceste frecvenţe.

Termenul "populaţie" desemnează un grup de indivizi aparţinând aceleiaşi specii şi trăind într-o anumită zonă geografică, în condiţii de mediu asemănătoare, suficient de restrânsă pentru ca între indivizii grupului să poată exista uniuni matrimoniale.

Întrucât populaţiile umane realizează de obicei colectivităţi mai mult sau mai puţin aglomerate, şi nu întotdeauna acestea sunt extrem de mari, pentru scop de cercetare, s-a convenit că o populaţie poate fi considerată suficient de mare dacă numărul de indivizi depăşeşte cifra de 500.

Structura genetică a unei populaţii este caracterizată prin constituţia genetică a indivizilor (frecvenţa genotipurilor) şi prin frecvenţa genelor acestei populaţii (Genetica medicală – Aplicaţii practice).

Incidenţa, frecventa genelor şi a heterozigoţilor pentru unele afecţiuni transmise autozomal recesiv (tabelul 12) sau autozomal dominant (tabelul 13), în diferite popu-laţii, evidenţiază variaţia genelor şi a genotipurilor pe ansamblul populaţiilor umane.

Tabelul 17. 1. Frecvenţa bolii, a genei şi a hereozigoţilor pentru unele afecţiuni transmise recesiv autozomal în diferite populaţii

Boala Populaţia Incidenţa

(q2)

Frecvenţa genică (q)

Frecvenţa hetero-zigoţilor

(2pq)

Def. de alfa1-

antitripsină

Danemarca Negrii din SUA

1 la 2000 1 la 100 000

0,03 0,004

1 la 22 1 la 125

Fibroza chistică Populaţia alba SUA 1 la 2000 0,023 1 la 22

Fenilcetonuria Scoţia,

Finlanda, Japonia, evreii Ashkenazi

1 la 5300

1 la 200 000

0,014

0,002

1 la 30

1 la 250

Tay-Sachs evreii Ashkenazi

pop. caucaz. SUA 1 la 3900

1 la 112 000 0,016 0,003

1 la 30 1 la 170

Tabelul 17. 2. Incidenţa şi frecvenţa genelor pentru unele afecţiuni transmise dominant autozomal

Boala Frecvenţa bolii

(2pq+q2)

Frecvenţa genei

(q)

Acondroplazia 1/20 000 0,000025

Hipercolester. familială 1/500 0,001

Boala Huntington 1/10 000 0,00005

Neurofibromatoza tip 1 1/3000 0,00017

17.1. Populaţiile mari

17.1.1. Panmixia

În populaţiile mari uniunile indivizilor de sex opus se face la întâmplare sau aproape la întâmplare, fără selecţia partenerilor şi

fără intervenţia factorilor care ar putea restrânge posibilitatea alegerii partenerului.

Unirea la întâmplare a indivizilor este sinonimă cu unirea randomizată a gameţilor produşi de aceştia. Fenomenul poartă

numele de panmixie, alogamie, sau împerechere la întâmplare, iar populaţia caracterizată printr-un asemenea tip de uniuni este o

populaţie panmictică, ce se menţine în echilibru (frecvenţa genelor şi a genotipurilor este constantă de-a lungul generaţiilor).

17.2. Populaţiile mici

Echilibrul genetic caracteristic populaţiilor mari, panmictice, nu se poate menţine în cazul populaţiilor mici, deoarece la

acestea, frecvenţa genelor este supusă fluctuaţiilor întâmplătoare, generate în primul rând de numărul mic de indivizi.

Schimbarea întâmplătoare a frecvenţei genelor într-o populaţie mică, de-a lungul generaţiilor, este deci cauzată de mărimea

redusă a probei de gene, consti-tuind deriva genetică (driftul genetic), considerat un proces disruptiv, cu acţiune întâmplătoare.

Schimbările produse de driftul genetic în structura genetică a populaţiei pot fi previzibile cantitativ, dar nu şi direcţional.

La nivelul populaţiilor mici mariajele sunt mai frecvent uniuni neîntâmplătoare:

Asortarea matrimonială;

Consangvinizarea.

17.2.1. Asortarea matrimonială

Populaţiile sunt separate prin bariere care, cel mai adesea, nu sunt insurmon-tabile, bariere pe care unii autori le înlocuiesc cu

termenul de ―cerc sau sferă de căsătorie sau de mariaj―.

Aceste sfere de mariaj realizează homogamia, în care acţionează diferiţi factori limitativi ai căsătoriei:

1. homogamia socială, socio-economică: sfera de mariaj include asemănarea socio-economică, socio-culturală, corespondenţa

dintre profesiunile părinţilor, respectiv ale soţilor;

2. homogamia religioasă: în SUA eficacitatea barierelor religioase atinge 90%;

3. homogamia fenotipică, psihologică, legată de vârstă, de distanţele între re-giunile locuite sau locurile de muncă ale partenerilor

etc.

Legat de mariaj, fiecare epocă şi fiecare societate îşi are normele sale şi fiecare încearcă să se raporteze la acestea, motiv

pentru care alegerea unui soţ va fi limitată, numărul soţilor potenţiali este restrâns.

Indiferent de motivaţie, asortarea matrimonială reprezintă o abatere de la panmixie.

Consecinţele homogamiei sunt variate, puţin importante pentru indivizii indemni genotipic dar dacă se căsătoresc persoane cu tare

genetice incidenţa mutaţiilor specifice creşte şi se menţine la un nivel ridicat.

17.2.2. Consangvinizarea

Concepţia obişnuită că în populaţiile umane prevalează căsătoriile la întâmplare este eronată. Chiar în afara cercului de rude

apropiate, şansa căsătoriilor nu este deloc întâmplătoare (vezi. Asortarea matrimonială). Ea este dependentă de distanţa dintre

locurile de naştere, locurile de muncă, restricţiile datorită rasei, clasei sociale, religiei şi altor factori, prezenţi, împreună sau separaţi,

în toate timpurile şi în toate societăţile, tradiţionale sau moderniste.

17.2.2.1. Principalii parametri măsurabili ai consangvinităţii

Coeficientul de înrudire (R) se refera la membrii cuplului consangvin, indicând proporţia medie de gene pe care aceştia le au în

comun, ca urmare a unui stramos comun (tabelul 14).

Coeficientul de consangvinitate a unui individ (F): probabilitatea copilului provenit dintr-un cuplu de parinti inruditi de a fi

homozigot (afectat) pentru o gena mostenita de la ambii genitori (probabilitatea ca două gene omoloage ale individului I să fie

identice).

Tabelul 17. 3. Coeficientul de înrudire, consangvinitate şi riscul descendenţilor

de a avea o boală recesiv autozomală pentru unele uniuni consangvine.

Tip de uniune Coeficient de

înrudire R Coeficient de

consangvinitat

Risc de apariţie

a bolii rA la

e (F) descendenţi

Frate – soră 1/2 1/4 1/8

Fraţi vitregi 1/4 1/8 1/16

Veri primari 1/8 1/16 1/32

Unchi – nepoată de frate

Mătuşă – nepot de frate 1/4 1/8 1/16

Veri de gr. II 1/32 1/64 1/128

Veri primari dubli 1/4 1/8 1/16

Consangvinitatea nu modifică direct frecvenţa alelică, dar crescând proporţia de homozigoţi în generaţia următoare, în

defavoarea heterozigoţilor, selecţionează astfel fenotipuri neavantajoase. O asemenea selecţie poate determina modificarea

frecventei alelelor în generaţia următoare.

În populaţiile umane, gradul de consangvinizare, frecvenţa căsătoriilor între rude şi gradul de înrudire diferă foarte mult.

În ţările Europei de vest, acest tip de mariaje este în general redus; diferite studii raportează totuşi valori cuprinse între 1%

şi 1‰, existând şi zone în care frecvenţa este mult mai mare, în special în Spania, Elveţia şi Norvegia, unde procentul de

consangvinizare ajunge la 11,5%.

La numeroase populaţii din Brazilia, frecvenţa căsătoriilor între veri ajunge la 13 - 20%, iar în populaţiile musulmane din India,

pe arii restrânse, s-au înregistrat valori substanţial mai mari, chiar 40%.

17.2.2.2. Efectele consangvinizării în populaţiile umane

În acord cu teoria genetică, consangvinitatea parentală, echivalent pentru inbreeding în descendenţă, conduce la creşterea

homozigoţiei pentru fiecare locus genetic, dependent de durata şi nivelul consangvinăizării.

Dintre consecinţele nefaste dovedite ale consangvinizării se menţionează:

creşterea incidenţei bolilor recesiv autozomale şi a celor cu predispoziţie genetică (multifactoriale);

creşterea riscului de morbiditate şi mortalitate infantilă şi generală; creşterea frecvenţei eşecurilor reproductive;

scăderea mediei performanţelor cognitive;

scăderea longevităţii, a capacităţii de adaptare la mediu, a vigorii, robuste-ţii etc.

17.3. Populaţiile izolate

O populaţie se caracterizează prin aceea că ea este separată de alte populaţii prin bariere care pot fi de natură geografică,

etnică, religioasă, socială, economică, culturală sau politică. Este destul de rară situaţia în care una sau mai multe astfel de

bariere să funcţioneze cu o eficacitate maximă, caz în care putem vorbi de izolate.

Izolatul genetic reprezintă o grupare populaţională care are un număr de strămoşi comuni mai mic decât acela al

populaţiei generale, ca urmare a unei anumite izolări în raport cu populaţia învecinată. Acest număr mic de strămoşi comuni se

explică prin căsătorii consangvine repetate, care au favorizat astfel întâlnirea de gene recesive omoloage rare şi manifestarea lor.

Cele mai frecvente izolate sunt cele determinate de condiţiile geografice; ele se întâlnesc în insule sau pe văile masivilor înalţi.

Este mai ales cazul populaţiilor din insulele situate de-a lungul coastelor Norvegiei şi Suediei, insulele Fidji, insulele arctice, al

triburilor de indieni din văile munţilor Anzi, din America de Sud, a popu-laţiilor tribale care împânzesc Sahara etc.

Izolatele pot fi închise, când nu are loc un schimb de gene cu alte populaţii, sau deschise, când se realizează un schimb redus

de gene cu alte populaţii.

Indiferent de particularităţile izolatului un aspect comun îl reprezintă endogamia şi consecinţele sale. Izolatele genetice

prezintă o incidenţă crescută pentru unele boli, adesea rare sau necunoscute în populaţia generală iar patologia acestor grupări

populaţionale prezintă un specific al fiecărui izolat, legat mai ales de deriva genetică şi de efectul de fondator. De exemplu în

populaţii Amish din SUA sindromul Ellis van Creveld, unele boli neurologice degenerative prezintă o incidenţă crescută; în izolatul

de twaregi Kel Kummer din Sudan este foarte frecventă discromatopsia.

17.4. Alti factori care influenţează frecvenţa

genică şi genotipică

17.4.1. Selecţia naturală

Selecţia naturală este un proces biologic orientat şi neîntâmplător care face ordine în natură prin creşterea adaptabilităţii

populaţiei. Dintre forţele evoluţiei, ea este singura care dirijează variabilitatea în direcţia adaptării.

Populaţiile sunt constrânse de factorii de mediu sa trăiască în medii relativ similare. Dacă mediile sunt foarte diferite, selecţia va favoriza divergenţa genetică între populaţii, crescând capacitatea de adaptare a fiecărei populaţii la propriul său mediu de existenţă.

Dacă condiţiile de mediu sunt similare selecţia va împiedica divergenţa genetică a populaţiilor, crescând omogen capacitatea de

adaptare a acestora. Consecinţele acţiunii ei pot fi pozitive (avantaj selectiv) sau negative.

17.4.2. Mutaţiile

Mutaţiile spontane nu reprezintă un răspuns la solicitările mediului şi deci nu orientează evoluţia.

Selecţia naturală elimina mutaţiile dezavantajoase şi fixează pe cele avantajoase, care asigură o mai bună adaptare la mediu.

Mutaţiile neutre sunt reţinute şi fixate de selecţia naturală contribuind la evoluţia speciei.

Se consideră că mutaţia este cauza fundamentală a variabilităţii genetice.

17.4.3. Migraţia şi fluxul genetic

Migraţia reprezintă metoda prin care specia umană s-a distribuit şi redistribuit pe suprafaţa planetei, diferite populaţii

amestecându-se şi făcând schimburi de gene.

Astfel au rezultat populaţii cu un rezervor genetic nou, cu gene avantajoase care s-au fixat, cu genotipuri heterozigote care au

contribuit la diluarea diferenţelor morfologice şi mai ales la creşterea calităţilor indivizilor (adaptabilitate, capacitate de reproducere,

viabilitate, rezistenţă la condiţiile uneori vitrege de mediu).

Fiecare populaţie a contribuit la experienţa evolutivă a speciei, unii specialişti afirmând că procesul de migraţie a contribuit

chiar mai mult decât mutaţiile la diversificarea universului genetic uman.

Populaţiile nou formate vor avea o frecvenţă alelică intermediară între valoarea de origine şi frecvenţa în populaţia în care a migrat.

Acest fenomen este cunoscut sub numele de flux genetic şi explică marea frecvenţă a grupei sangvine B în Asia şi descreşterea

progresivă a acesteia, pe măsură ce ne deplasăm spre vestul Europei.

17.4.4. Deriva genetică

Fluctuaţiile întâmplătoare ale genelor în populaţiile mici, rezultate din recom-binarea gameţilor, poarta numele de genetic drift sau

derivă genetică. Efectele acestor variaţii sunt cu atât mai evidente, cu cât populaţia este mai redusă numeric.Aceste fluctuaţii tind să

determine o diferenţiere netă în structura genetică a unei populaţii. De exemplu triburile de indieni din America de Sud, care au trăit

într-o izolare totală o perioadă lungă de timp sunt izogenice pentru grupa sangvină O.

Un aspect important al derivei genetice îl constituie efectul de fondator.

Membrii fondatori ai izolatului genetic pot fi purtătorii alelelor mutate pentru unele caractere autozomal recesive iar frecvenţa

acestor alele va fi mult mai crescută în acest izolat, decât în populaţia generală.

La acest fenomen contribuie, pe de o parte căsătoriile între parteneri înrudiţi, larg practicate în interiorul acestor comunităţi

populaţionale cu efectiv redus şi pe de altă parte deriva genetică.

Acest tip de specificitate etnică a mutaţiei prezintă importante implicaţii în testele diagnostice şi programele screening de

depistare a bolnavilor şi purtătorilor, prin detectarea mutaţiei specifice.

Studiile acestor populaţii reduse şi a patologiei lor specifice au permis înţelegerea unor probleme majore ale Geneticii

populaţiilor. Astăzi populaţiile sunt tot mai mobile ceea ce va reduce pe viitor efectul derivei genetice.

17.5. Intervenţia medicală şi socială asupra frecvenţei genice

Conform teoriilor darwiniste că selecţia naturală a permis şi determinat evoluţia omului, Galton considera că poate aplica

cu succes principiul selecţiei în scopul ameliorării biologice a omului. El propune termenul de eugenics (eu = bine, genos = rasa)

şi în Germania şi respectiv în Anglia sunt fondate societăţi de eugenie care îşi propun un dublu scop: împiedicarea multiplicării

" inapţilor ", evitându-se apariţia descendenţilor afectaţi (eugenism negativ) şi ameliorarea rasei, favorizând reproducerea celor

consideraţi mai apţi, prin mariaje precoce, în interesul descendenţilor lor (eugenism pozitiv).

Eugenismul negativ îşi propune deci să reducă numărul de gene mutate în populaţie frânând reproducerea purtătorilor de

gene dominante patologice şi redu-când nivelul de reproducere al purtătorilor heterozigoţi de gene recesive patologice (acolo unde

ele pot fi diagnosticate).

Eugenismul pozitiv propune ameliorarea capacităţii de reproducere a indivizilor "superiori" şi deci participarea acestora într-o mai

mare măsură la fondul genetic al generaţiei următoare.

Progresele făcute de medicină în general şi de genetică în particular deschid astăzi noi perspective celor care visează la

ameliorarea speciei umane şi la reducerea genelor care determină sau contribuie la constituirea unor caractere patologice.

Principalele metode prin care se intervine astăzi în modelarea frecvenţelor genice şi a genotipurilor sunt următoarele:

consultul genetic şi diagnosticul antenatal; tratamentul curativ al unor boli genetice; screening-ul neonatal; fertilizarea în vitro şi diagnosticul preimplantatoriu.

Consultul genetic, dublat de teste genetice tot mai performante permite diagnosticul bolilor de cauză genetică, identificarea

purtătorilor de gene patologice, stabileşte riscul de recurenţă la descendenţi. Atunci când suspiciunea de recurenţă este confirmată

prin diagnostic antenatal, iar produsul de concepţie este profund afectat, geneticianul poate sugera întreruperea terapeutică a

sarcinii, contribuind în acest mod la profilaxia bolilor genetice.

Capitolul 18 18. BAZA GENETICĂ A PROCESULUI CANCEROS

Cancerul este o boală genetică. Factorii de mediu mutageni, dintre care radiaţiile sunt cel mai bine cunoscute, joacă rol în carcinogeneză. Exista o predispoziţie ereditare pentru cancer.

În condiţii normale, celulele au abilitatea de a repara modificările apărute în ADN. Cancerele se dezvoltă pornind de la o mutaţie într-o genă celulară care determină proliferare celulară intensă. Aceste mutaţii apar în trei clase de gene celulare: oncogene, gene de supresie tumorală, gene care contribuie la repararea ADN-ului.

Marea majoritate a mutaţiilor sunt somatice, ceea ce înseamnă că sunt prezente numai în celulele tumorale. Există un subset relativ mic de mutaţii în celulele germinale ale indivizilor predispuşi la diferite tipuri de cancer.

Alelele oncogenice

În genomul celular există multiple gene care se exprimă în stadii diferite ale ciclului celular şi sunt implicate: în cascada de evenimente ce asigură diviziunea celulară, în reglarea creşterii şi diferenţierii celulelor normale.

Acestea sunt denumite proto-oncogene. În urma intervenţiei unor factori activatori, protooncogenele se pot transforma în oncogene determinând transformarea malignă.

Oncogenele se definesc ca: gene cu acţiune dominantă determină dereglarea creşterii şi proliferării celulare, responsabile de dezvoltarea tumorală.

Oncogenele reprezintă forme anormale, activate, ale unor proto-oncogene; ele pot rezida în genomul viral, oncogena virală (v-onc), în genomul celular oncogena celulară (c-onc).

Oncogena este caracterizată prin capacitatea de a induce şi/sau promova cancere. Produşii specificaţi de oncogene se numesc oncoproteine. Modalitatea prin care o protooncogenă se activează pentru a deveni

oncogenă este mutaţia. Protooncogenele suferă mutaţii dominante care se manifestă prin câştig de funcţie. Până în prezent au fost identificate peste 30 de oncogene. Oncogenele au fost identificate prin studiul translocaţiilor

cromozomiale. S-a stabilit o corelaţie strînsă între anomalii cromozomiale particulare şi tipul tumorii, sau anumite subtipuri histopatologice. S-a identificat un număr enorm de anomalii cromozomiale specifice în leucemii şi limfoame, şi tumori solide.

Exemplul 1: Cromzomul Ph este generat de t(9;22), şi care poate fi identificat la majoritatea pacienţilor cu leucemia mieloidă cronică şi leucemia acută limfoblastică. În urma t(9;22) fuzionează gena c-abl (cromozomul 9) cu gena bcr (de la break point cluster region) (cromzomul 22). Rezultă gena himeră bcr-abl care generează o proteină hibridă cu funcţie alterată.

Exemplul 2: În limfomul Burkitt t(8;14) fuzionează oncogena c-myc (cr 8) cu gena pentru IgH (cr 14q32). t(2;8) fuzionează oncogena c-myc cu gena pentru lanţul k al IgL (cr 2) t(8;22) fuzionează oncogena c-myc (cr 8) cu gena pentru lanţul al IgL (cr 22).

Exemplul 3: În leucemii sau limfoame cu celule B apare t(14;18) în care apar recombinări între locusul genei pentru IgH (cr 14q) cu gena bcl2 (cr 18q).

Oncogenele virale

Virusurile tumorale cu ARN

Virusurile ARN, cunoscute ca retrovirusuri, au proprietatea de a-şi transcrie ARN-ul în ADN, folosind enzima revers transcriptaza şi de a-l integra în ADN-ul gazdei unde se va putea exprima ulterior.

Retrovirusul se fixează cu ajutorul spiculilor de celula ţintă, pentru a intra în celulă, unde se va putea replica. După intrarea în celulă, retrovirusul îşi elimină învelişul lipidic şi eliberează ARN-ul. Cu ajutorul enzimei revers transcriptaza, codificată de retrovirus, se realizează o transcriere inversă, sintetizându-se astfel molecula de ADN viral, care se integrează în genomul celulei gazdă şi devine un provirus.

Unele dintre virusurile cu ARN sunt defective pentru această genă şi nu se pot reproduce decât graţie prezenţei simultane a unui alt virus, numit virus helper, care furnizează enzima. Genomul celular dispune de aparatul genetic necesar pentru a efectua retranscrierea provirusului în ARN mesager viral. Ulterior componentele virale se vor asambla formând un nou virus care va fi eliminat pentru a infecta alte celule. Virusurile nu au acţiune de citoliză, astfel încât celula gazdă supravieţuieşte şi odată cu diviziunea celulară se multiplică şi virusul. Structura unui retrovirus este relativ simplă.

Retrovirusul este alcătuit din 3 gene: „gag”, codifică proteinele interne ale virusului, „pol” codifică transcriptaza inversă, „env” învelişul glicoproteic.

Forma replicativă provirală are la fiecare extremitate o „secvenţă terminală repetitivă‖ (long terminal repeat - LTR), şi confecţionat printr-un mecanism complex cu ocazia integrării în genomul celulei gazdă.

La animale, cancerele pot fi produse de două tipuri de virusuri tumorale cu ARN, denumite virusuri acut, respectiv cronic transformatoare.

Virusurile „cronic transformatoare” sau virusurile cu „acţiune lentă” nu au un rol direct în procesul de transformare. sunt capabile de a produce tumori numai în gazda în care virusul se poate replica, tumorile apar după o perioadă de latenţă relativ lungă şi doar în anumite ţesuturi. induc transformarea celulelor prin integrarea copiilor de ADN în virus, cunoscute ca provirus, într-un loc specific din

genomul celulei gazdă, de exemplu în vecinătatea oncogenei c-myc (normal implicată în creşterea celulară). Provirusul poate altera genele în regiunea cromozomului gazdă, unde s-a integrat. Dacă această regiune conţine proto-oncogene, integrarea virusului poate altera structura şi expresia proto-oncogenelor contribuind astfel la tumorigeneză.

Virusurile „acut transformatoare” sau cu „acţiune rapidă” au gene omoloage cu cele din celulele umane cunoscute ca oncogene celulare. Aceste gene sunt secvenţe de acid nucleic care au fost achiziţionate sau transduse din celulele gazdă, ca rezultat al recombinărilor genetice. Secvenţele derivate ale gazdei, poartă denumirea de oncogene virale (v-onc) şi sunt direct responsabile de activitatea rapid transformatoare. Oncogenele virale nu sunt gene virale adevărate, ci sunt gene ale gazdei care au fost preluate de un strămoş al virusului, proces numit transducţie.

Virusurile acut transformatoare au un grad mare de infectivitate şi determină o transformare malignă rapidă şi policlonală.

La om, în limfoame au fost identificate virusuri denumite „limfotrope”, responsabile de iniţierea procesului malign, de exemplu virusurile limfocitelor T umane (HTLV I şi II).

Virusurile tumorale cu ADN

Virusurile tumorigene cu ADN conţin ADN bicatenar, sunt capabile de a utiliza sistemele de replicare ale celulei gazdă şi contribuie la tumorigeneză, prin activarea sau inhibarea activităţii proteinelor de supresie tumorală. Dintre virusurile umane incluse în această categorie fac parte:

virusul Epstein Barr care determină limfomul Burkitt; virusul hepatitei B care determină hepatocarcinoame; virusul herpetic care determină cancerele anogenitale şi cancerul nazofaringian; citomegalovirusul. familia papilomavirus

Genele de supresie tumorală

Genele de supresie tumorală sunt gene normale implicate în reglarea creşterii celulare. Dezvoltarea tumorală este determinată de mutaţii recesive. În contrast cu mutaţiile activatoare care generează alele oncogenice din proto-oncogene, mutaţiile genelor supresoare tumorale determină “pierderea funcţiei” acestora, ducand la tumorigeneză.

antioncogenă localizare neoplasm

p53 17p13

carcinoame de sân sarcoame leucemii tumori cerebrale

RB 1 13q14 retinoblastom osteosarcom

WT 1 11p13 tumora Wilms

BRCA 1 17q21 carcinom mamar

APC 5q21 carcinom de colon carcinom de stomac carcinom tiroidian

MCC 5q21 carcinom rectocolonic

DCC 18q21 carcinom rectocolonic

carcinom pancreatic

NF 1 17q11 neurofibromatoza 1 (Boala Recklinghausen)

NF 2 22q neurofibromatoza 2 (tumori maligne ale SNC)

VHL 3p25 hemangioblastom carcinom renal

Tabel Cele mai cunoscute gene de supresie tumorală

Similar proto-oncogenelor, funcţiile normale ale genelor supresoare tumorale sunt diverse, iar proteinele codificate de aceste

gene au fost găsite în numeroase compartimente celulare. Studiile recente au stabilit rolul critic al mutaţiilor pentru cea de a treia clasă de gene implicate în procesul canceros – genele de

reparare a ADN-ului. Asemănător genelor de supresie tumorală, mutaţiile care determină pierderea funcţiei acestor gene reprezintă baza rolului acestora în tumorigeneză.

În timp ce produşii proto-oncogenelor determină creşterea, produşii genelor de supresie tumorală în mod normal blochează creşterea anormală şi se opun transformării maligne. Procesul neoplazic poate avea loc numai dacă este pierdută funcţia ambelor alele (mutaţiile genelor supresoare tumorale sunt recesive). Un exemplu de antioncogenă este gena p53 (cr 17p13) denumită generic “gardianul genomului celular”. Ea codifică fosfoproteina p53, cu rol în trecerea celulelor prin ciclul celular, fiind astfel implicată în diferenţierea celulară, repararea greşelilor intervenite în ADN, apoptoză. O celulă în care doar o singură alelă p53 este pierdută sau modificată printr-o mutaţie germinală sau somatică îşi va pierde abilitatea de supresie tumorală. În fiecare dintre următoarele boli s-a observat pierderea sau alterarea ambelor copii ale genei supresoare tumorale corespunzătoare. Retinoblastomul reprezintă prototipul bolilor cauzate de mutaţii în genele supresoare tumorale. Este o tumoră malignă a retinei care debutează în copilărie Gena RB1 a fost localizată pe cromozomul 13, în banda 13q14. Mutaţia constă în deleţii sau translocaţii ale acestei regiuni cromozomiale. Forma ereditară (40%), în care copiii moştenesc o alelă mutantă a genei RB 1 pe linie germinală şi au o mutaţie somatică (mutaţie de novo) care cauzează pierderea funcţiei alelei normale rămase, declanşând procesul tumoral. Forma sporadică (60%) neereditara, în care ambele alele RB 1 sunt inactivate prin mutaţii somatice în aceeaşi celulă retiniană. Tumora Wilms este tumoră renală embrionară cu incidenţă relativ mare (1:10.000 de copii). În declanşarea bolii este implicată o altă genă de supresie tumorală notată (WT 1). Mutaţia genei este uneori asociată cu o aberaţie vizibilă citogenetic a cromozomului 11 braţul scurt în banda 13 (11p13). Se presupune că pe cromozomul 11 ar exista mai multe locusuri predispozante pentru tumora Wilms.

Polipoza colică familială sau polipoza adematoasă familială, este caracterizată prin apariţia de numeroşi (sute, sau chiar

mii) polipi benigni în mucoasa colonului în timpul primelor două decade de viaţă, la persoanele heterozigote. Dacă nu se practică în mod

profilactic rezecţia chirurgicală a segmentului respectiv al colonului (hemicolectomie), o parte din polipi se malignizează până la

vârsta de 50 de ani. Se consideră că 15% din cazuri au o componentă familială. Dobândirea malignităţii este condiţionată de

acumularea unui număr critic de mutaţii în alte câteva gene. Una dintre genele candidate, responsabilă de polipoza colică familială

(stare benignă) este gena notată APC (cr 5q21), care suferind o mutaţie somatică pe parcursul vieţii, poate determina carcinom

colorectal (acestea sunt cazurile sporadice).

În formele familiale se presupune că a fost moştenită predispoziţia ereditară, reprezentată de starea heterozigotă, respectiv

pierderea unei alele din cele două ale genei supresoare tumorale.

Cancerul glandei mamare De mult timp s-a observat existenţa unei componente genetice puternice în cancerul mamar.

Riscul femeilor de a dezvolta un cancer de sân este de trei ori mai mare dacă este afectată o rudă de gradul I şi de cinci ori mai mare

dacă mai multe rude de gradul I sunt afectate.

Studiile genetice de linkaj în cadrul familiilor cu cancer de sân au identificat o genă care creşte susceptibilitatea pentru cancerul de sân familial, genă notată BRCA (breast cancer) (cr 17q12-21). Studii recente sugerează că gena BRCA şi foarte probabil şi altele ar fi implicate atât în cancerul glandei mamare cât şi în cel ovarian.

Capitolul 19

19. ANOMALII CROMOSOMIALE ÎN UNELE HEMOPATII MALIGNE

Generalităţi Leucemiile, fiind boli neoplazice hematopoietice clonale, au la origine o celuă stem anormală. În cursul evoluţiei biologice,

celulele neoplazice suferă o modificare în trepte a genotipului, rezultând ―celule mutante‖, cele mai favorizante fiind cele cu potenţialul malign cel mai înalt. Prin valoarea informaţiilor pe care le furnizează, analiza citogenetică continuă să reprezinte un instrument major de investigare a biologiei cancerului. Cariotipul este un instrument util de monitorizare a bolnavilor cu hemopatii maligne.

Importanţa evaluării periodice a cariotipului în hemopatiile maligne este redată sintetic în cele ce urmează:

confirmarea diagnosticului în LMC şi în LMA subtipul M3;

confirmarea şi anticiparea crizei blastice în LMC;

elaborarea diagnosticului şi evaluarea prognosticului în LA;

confirmarea, aprecierea gradului remisiunii şi a recăderii în LA;

elaborarea diagnosticului/evaluarea prognosticului în SMD;

identificarea genelor implicate în etiopatogenia neoplaziilor sistemului hematoformator. Clasificare

1. Boli mieloproliferative: A. S indroame mie lod isp laz ice (SMD) ; B. Leucemia mieloidă cronică (LMC); C. Leucemia acută mieloblastică (LAM).

2. Boli limfoproliferative: A. Leucemia acută limfoblastică (LAL); B. Leucemia limfatică cronică (LLC);

3. Limfoame maligne: A. Limfomul Hodgkin (LH); B. Limfoame nonHodgkin (LNH):

a. Limfomul Burkitt (LB); b. Alte limfoame nonHodgkin (LNH).

Boli mieloproliferative

Sindroame mielodisplazice (SMD)

Sunt considerate stări preneoplazice sau sindroame preleucemice găsindu-se la graniţa dintre anemia refractară la tratament şi leucemia acută mieloblastică. Mai frecvent apare la adulţi după vârsta de 50 de ani.

Anomaliile cromosomiale clonale (monosomii, trisomii sau anomalii structurale) pot fi observate la analiza iniţială a măduvei sau ca rezultat al evoluţiei cariotipului de-a lungul progresiunii bolii.

Principala modificare cariotipică se referă la pierderea de material genetic: deleţie de braţ sau monosomie parţială 5q- sau 7q- monosomie totală -5, -7

Cromosomii 5 şi 7 sunt cunoscuţi ca fiind purtători de diferite oncogene, iar deleţiile duc probabil la alterarea acestora şi consecutiv apar factori de creştere neoplazică ce vor conduce la proliferarea unei clone anormale.

Anomaliile cromosomiale nu sunt specific asociate cu vreun grup din clasificarea FAB (Franco-Americano-Britanic), cu excepţia del(5q) care se asociază cu anemia refractară.

Evoluţia pacienţilor cu SMD spre leucemie mieloblastică acută, se produce cu precadere în cazurile cu -5, -7 sau în cazul existenţei anomaliilor cariotipice multiple. Creşterea complexităţii genetice a fost corelată cu supravieţuirea scurtă şi reflectă probabil expansiunea unei clone instabile genetic.

La copiii cu SMD cel mai frecvent se întâlnesc trisomia 8 (+8), monosomia 7 (-7) şi deleţii de tipul (20q- şi Xq-). Monosomia totală 7 la copiii cu SMD este tipică şi indică un prognostic nefavorabil.

Supravieţuirea pacienţilor cu SMD este mai bună la cei cu cariotip normal. Evidenţierea unui cariotip instabil indică un prognostic nefavorabil.

Leucemia mieloidă cronică (LMC)

LMC este rezultatul transformării maligne a unei celule stem pluripotente, ai cărei descendenţi ajung să domine hematopoieza. LMC este deci o boală clonală.

Cromosomul Ph1 a fost primul cromosom aberant descris într-o tulburare malignă de către Nowel şi Hungerford în 1960. După 10 ani, Rowley a descoperit că anomalia Ph1, nu este rezultatul unei pierderi de material genetic (22q-) ci a unei translocaţii reciproce între cromosomii 9 şi 22, t(9,22)(q34;q11). După alţi 10 ani, s-a demonstrat că în urma acestei modificări cromosomiale structurale, oncogena abl (denumirea provine de la numele protooncogenei Abelson) de pe cromosomul 9 se translocă pe cromosomul 22 la nivelul genei bcr (break point cluster region) şi se formează o nouă genă hibridă bcr/abl care codifică o proteinkinază cu rol în leucemogeneză.

Punctul de rupere (breakpoint) la nivelul genei bcr se află pe o porţiune scurtă spre deosebire de cea a genei abl care se întinde pe o porţiune lungă din genă şi adeseori în zone diferite ale genei; dovada indirectă este reprezentată de existenţa a două tipuri diferite de ARNm şi respectiv de proteine (p190 şi p210) identificate în celulele pacienţilor cu Ph1 pozitiv.

Deoarece cromosomul Ph1 s-a identificat atât în LMC cât şi în leucemiile acute (LA), unii autori propun ca în cazurile în care la debutul bolii pacienţii prezintă cromosomul Ph1 să fie mai curând încadraţi în LA decât în LMC, urmând ca explorările viitoare să decidă în privinţa diagnosticului de certitudine.

Deşi prin metodele citogenetice clasice, Ph1 este absent la aproximativ 10% din cazuri, metodele moderne de genetică moleculară, mai ales reacţia de polimerizare a catenelor (PCR) şi metoda Southern blot pun în evidenţă gena hibridă bcr/abl în 30-50% din acestea. Proporţia mare de 95-97% din cazurile de LMC în care se poate dovedi prezenţa inserţiei genei abl în gena bcr evidenţiază implicarea acestei gene hibride în leucemogeneză.

Aproximativ 3-5% din toate cazurile de LMC sunt considerate bcr/abl negative şi au un tablou clinico-evolutiv particular (supravieţuire scurtă, de aproximativ 1 an după dignostic), reprezentând probabil o altă entitate. În accepţiunea modernă aceşti pacienţi ar putea fi încadraţi în mielodisplazie sau mai exact într-unul din subtipurile acesteia, denumită anemia refractară cu exces de blaşti (AREB).

Prezenţa cromosomului Ph1 are semnificaţia unui prognostic favorabil, respectiv pacienţii supravieţuiesc aproximativ 3-4 ani după diagnostic dacă se administrează terapia clasică sau chiar dublu (7-8 ani) în cazul administrării tratamentului cu alfa-interferon.

În unele cazuri, au fost constatate translocaţii variabile, unele simple, interesând cromosomul 22 şi cromosomul 17 (mai rar alţii)

sau chiar complexe interesând cel puţin 3 cromozomi. La aproximativ 5% din cazuri, pe lângă populaţia celulară Ph1 pozitivă, există şi celule cu cariotip normal. Acest mozaicism, nu pare

să aibă semnificaţie prognostică. Studiile clinico-citogenetice au evidenţiat scăderea procentului de metafaze cu cromosom Ph1 după tratamentul cu alfa-

interferon recombinat, ceea ce indică un prognostic mai bun. Evoluţia LMC este bifazică, cu o fază cronică cu durata medie de 2-4 ani, în care se întâlneşte cromosomul Ph1, urmată

obligatoriu de o fază acută, terminală. Trecerea spre faza acută poate fi bruscă, sau se poate face treptat printr-o aşa numită fază acelerată. Apropierea fazei accelerate poate fi anunţată de apariţia unor modificări cromosomiale adiţionale: duplicaţia Ph1 (Ph1, Ph1), trisomia 8 (+8), izocromosomul braţului lung al cromosomului 17 i(17q), trisomia 19 (+19).

În faza acută (puseul blastic) se pot observa diverse clone celulare cu variate anomalii cromosomiale, caracterizate în special prin aneuploidie.

Existenţa unor corelaţii între modificările cromosomiale şi efectul lor în fenotip dă indicaţii privind prognosticul.

Leucemia acută mieloblastică (LAM)

Majoritatea bolnavilor prezintă anomalii cromosomiale clonale alături de celule cu cariotip normal. Anomaliile cromosomiale observate la debutul bolii dispar în remisiunile complete şi reapar cu puţin timp înainte de producerea recăderilor.

Pacienţii cu LAM, au fost clasificaţi în 8 grupe după criterii morfologice, enzimatice şi imunologice. Aceasta este clasificarea FAB

(grupul Franco-Americano-Britanic). Datorită asocierii lor constante şi specifice cu anumite subtipuri morfoclinice, unora dintre anomaliile cromosomiale li se atribue calitatea de criteriu complementar de clasificare a leucemiilor acute.

Subtipul Mo (mieloblaşti cu diferenţiere minimă): La majoritatea pacienţilor există anomalii citogenetice, de obicei singulare, dintre care mai frecvente sunt trisomia totală 8 (+8) sau monosomia totală 7 (–7). Prognosticul acestor pacienţi este mai rezervat în comparaţie cu alte subtipuri FAB.

Subtipul M1 (mieloblaşti fără maturaţie): Majoritatea sunt leucemii secundare, cu prognostic foarte nefavorabil şi în care cel mai frecvent se întâlnesc pierderi de material genetic de tipul monosomiei totale a cromosomului 7 (-7). Cromosomul Ph1 poate fi identificat în unele cazuri de M1 şi are semnificaţia unui prognostic deosebit de sever.

Subtipul M2 (mieloblaşti cu maturaţie): Cei mai mulţi pacienţi prezintă în blaştii leucemici translocaţia t(8;21). La nivelul

punctului de rupere de pe cromosomul 21 este situată gena AML1 (acute myeloblastic leukemia), iar la nivelul 8q22 este gena

MTG8 (myeloid translocation gene on 8). Funcţiile produşilor proteici ai acestor gene nu sunt cunoscute; formarea transcriptului

himeric AML1/MTG8 pare să constitue evenimentul critic în transformarea leucemică. Dintre anomaliile cromosomiale numerice

întâlnite în LAM, cea mai frecventă este trisomia totală 8 (+8) care se corelează cel mai mult cu acest subtip; ea indică un

prognostic mai bun. Remisiunea completă se obţine în 90% din cazuri, iar supravieţuirea medie la adulţi este de 2 ani.

Subtipul M3 (leucemie promielocitară): Translocaţia t(15;17) este considerată cea mai specifică dintre toate anomaliile

cromosomiale întâlnite în bolile maligne hematologice. Ea se asociază exclusiv cu subtipul M3 şi este prezentă la aproape 100% din bolnavi. Genele izolate de la nivelul punctelor de rupere sunt PML (promyelocytic leukemia) pe cromosomul 15 şi RARA

(retinoic acid receptor alpha) pe cromosomul 17. Proteina hibridă codificată de gena de fuziune PML/RARA de pe cromosomul 15 inhibă diferenţierea celulară. Translocaţia t(15;17) indică un prognostic mai bun pentru că s-a identificat o terapie strict

specifică cu acid retinoic care induce procesul de diferenţiere, depăşindu-se astfel stadiul de blaşti.

Subtipul M4 (leucemia mielomonocitară): Se întâlnesc diferite anomalii structurale la cromosomul 16, de tipul inv(16), del(16),

t(16;16). Bolnavii cu aberaţii ale cromosomului 16 au prognostic mai bun decât cei la care cromosomul 16 apare citogenetic normal.

Subtipul M5 (leucemia monocitară): Dintre anomaliile citogenetice întâlnite în acest subtip cel mai frecvent se observă modificări la nivelul 11q23 (translocaţii diverse care implică 11q23 şi un alt cromosom, urmate de deleţii interstiţiale sau terminale). Studiile moleculare au izolat din regiunea 11q23 gena MLL (myeloid-lymphoid leukemia) care codifică domenii ―zinc

finger‖ de legare la ADN ceea ce a determinat includerea ei în categoria genelor reglatoare. În ordinea frecvenţei, translocaţiile care implică regiunea 11q23 sunt: t(9;11), t(11;19), t(6;11) şi t(1;11). Prezenţa rearanjărilor la 11q23 se asociază cu un prognostic rezervat.

Subtipul M6 (eritroleucemie): Este o formă rară de LAM, caracterizată de prezenţa în măduva osoasă a unui exces de

eritroblaşti frecvent displazici. Citogenetic acest subtip se caracterizează prin prezenţa anomaliilor cromosomiale complexe şi instabilitate cariotipică.

Subtipul M7 (leucemia megacariocitară): La adulţi anomaliile cromosomiale sunt nespecifice totuşi, aberaţiile la nivelul cromosomului 3, inv(3) sau del(3), au o incidenţă crescută când există anomalii ale megacariocitopoiezei.

Boli limfoproliferative

Leucemia acută limfoblastică (LAL)

Este cea mai frecventă leucemie care apare în copilărie. Anomaliile cromosomiale sunt prezente la majoritatea bolnavilor cu

LAL. Una din caracteristicile leucemiilor acute limfoblastice la copii este incidenţa înaltă a hiperdiploidiei, care include de obicei

trisomii ale cromosomilor 4, 6, 10, 17, 18, 20 şi 21. Hiperdiploidia cu mai mult de 50 de cromosomi se asociază cu o evoluţie favorabilă (speranţa de vindecare fiind de până la 90%, prin terapie convenţională), în timp ce numerele modale sub 50 de

cromosomi conferă bolii un prognostic sever. Hipodiploidia este rară în LAL, totuşi, pierderile masive de cromosomi care conduc la numere modale de până la 24 de

cromosomi sunt aproape exclusiv întâlnite în LAL şi în forma limfoidă a crizei blastice din LMC. Aproximativ 30% din celulele leucemice ale adulţilor cu LAL au o constituţie pseudodiploiă (46 de cromosomi dar cu

rearanjamente). Instabilitatea cariotipică este un fenomen care se produce foarte frecvent în LAL. În timpul recăderilor, 30-80% dintre bolnavi

prezintă o mare varietate de modificări adiţionale numerice sau structurale, suprapuse sau derivate din cele iniţiale. Cele mai frecvente rearanjamente structurale sunt translocaţiile. La pacienţii cu LAL cu celule B se întâlnesc mai frecvent translocaţiile

t(9;22),

t(4;11) şi

t(1;19). Cromosomul Ph1 apare la 17% din cazurile de LAL la adulţi şi la numai 5% din LAL la copii, şi are acelaşi aspect morfologic ca

în LMC. Analiza moleculară a translocaţiei t(9;22) a relevat că punctul de rupere de pe cromosomul 22 este situat mai proximal decât cel implicat în formarea cromosomului Ph1 din LMC. S-a putut evidenţia la nivel molecular fuziunea genelor BCR/ABL la aproximativ 30% dintre pacienţii cu LAL. Translocaţia t(9;22) se asociază cu hiperleucocitoză şi indică un prognostic sumbru (durata medie de viaţă este 15 luni).

La pacienţii cu LAL cu celule T se observă rearanjamente cromosomiale în care sunt implicate gene care codifică receptorii

celulelor T:

TCRA şi TCRD de pe 14q11

TCRB de pe 7q35

TRCG de pe 7p15

Până în prezent au fost descrise următoarele translocaţii considerate specifice: t(8;14), t(11;14), t(10;14), t(1;14) şi t(7;19).

Leucemia limfatică cronică (LLC)

LLC este cel mai frecvent tip de leucemie, reprezentând 30% din totalul leucemiilor. Apare mai frecvent la bărbaţi în vârstă de peste 60 de ani.

Deşi etiologia este necunoscută, implicarea factorilor genetici este dovedită de:

incidenţa familială crescută

coexistenţa LLC cu boli autoimune sau alte tumori maligne

existenţa - în anumite zone de pe glob - a unei endemii de leucemie/limfom cu celule T produsă de infecţia cu un retrovirus cu ARN limfotrop, HTLV 1 (Human T Leukemia/Lymphoma Virus 1)

În peste 95% din cazuri este vorba de expansiunea clonală a liniei B, iar în mai puţin de 5% din cazuri, celulele tumorale au fenotip T.

La 50% dintre pacienţii cu LLC se pot identifica anomalii cromosomiale. La debut, anomalia cromosomială cea mai frecventă este trisomia totală 12 (+12), situaţie când şi prognosticul este favorabil, remisiunea fiind lungă.

În stadiile avansate apar şi alte anomalii cromosomiale mai frecvente fiind rearanjamentele cromosomului 14, respectiv 14q+ şi t(11;14). La nivelul cromosomului 14 este localizată gena pentru sinteza lanţurilor grele ale imunoglobulinelor şi pentru sinteza lanţului α al receptorului T. În urma translocaţiei t(11;14), se activează oncogena bcl1 (b cell lymphoma/leukemia1), localizată pe cromosomul 14, care codifică proteina BCGF (factor de creştere al celulelor B).

Bolnavii cu anomalii cromosomiale au o durată de supravieţuire mai redusă. Un tip special de LLC este cel asociat cu ataxia-teleangiectazia situaţie în care apare translocaţia t(14;14).

Limfoame maligne

Limfomul Hodgkin (LH)

LH este primul limfom malign descris ştiinţific, de către medicul englez Thomas Hodgkin în anul 1832. Deşi etiologia este necunoscută există ipoteza unei stimulări antigenice continue legate de infecţia cu virusul Epstein Barr. Rolul factorului genetic este sugerat de incidenţa familială crescută precum şi de frecvenţa crescută a profilului HLA A1, B5, B8. Tabloul citogenetic al acestei boli este dominat de anomaliile numerice (hiperdiploidie până la tetraploidie). Anomaliile sunt

multiple şi complexe incluzând adesea markeri neidentificabili. Nu au fost descrise anomalii specifice.

Limfoame nonHodgkin (LNH)

a. Limfomul Burkitt (LB) Indiferent de caracterul endemic sau sporadic al bolii şi de prezenţa sau absenţa infecţiei cu virus Epstein Barr, la 80% din

pacienţii cu LB, analiza cromosomială evidenţiază translocaţia t(8;14). Au fost descrise şi variante ale acestei translocaţii respectiv t(2;8) sau t(8;22). Tehnicile de clonare au permis evidenţierea

genelor care sunt implicate în patogenia limfoamelor. La nivelul punctului de rupere de la 8q24, se află proto-oncogena c-myc care se alătură prin translocaţie genelor pentru lanţul greu al imunoglobulinelor (IgH) de pe cromosomul 14. Ca urmare a noilor raporturi spaţiale, gena c-myc este activată, dobândind proprietăţi oncogenice.

b. Alte limfoame nonHodgkin (LNH) Analiza citogenetică poate releva şi alte anomalii citogenetice, unele cu importanţă patogenetică. În tabelul 15 se

prezintă principalele anomalii citogenetice întâlnite în LNH, tipurile histologice în care apar, genele implicate şi semnificaţia lor biologică.

În limfoamele cu celule B, s-a identificat translocaţia t(14;18) la care participă gena BCL-2 (B cell lymphoma/leukemia) de pe cromosomul 18. Gena BCL-2 este implicată în programul morţii celulare (apoptoză). În urma translocaţiei are loc o pierdere a funcţiei genei, determinând creşterea numărului de limfocite B, care se exteriorizează clinic prin apariţia de noduli limfatici şi splenomegalie.

În LNH au fost detectate anomalii şi ale altor oncogene din familia BCL (BCL-1, BCL-2, BCL-3, BCL-6) ai căror produşi intervin deasemenea în procesul de proliferare şi diferenţiere.

Deleţiile del(6q) se asociază cu supraexpresia protooncogenei c-myb şi apar mai ales în LNH agresive. Recent au fost descrise deleţii la nivelul genei supresoare tumorale p53, de pe cromosomul 17 braţul p (17p).

Tabelul . Anomalii citogenetice mai frecvent întâlnite în LNH.

ANOMALIA CROMOSOMIALĂ

ONCOGENA IMPLICATĂ

FUNCTIA BIOLOGICĂ A ONCOGENEI

TIPUL HISTOLOGIC DE

LNH

t(14;18) BCL-2 Inhibă apoptoza LNH foliculare:

Un subtip de LNH B cu celule mari

t(11;14) BCL-1

Factor de transcripţie

Reglator al ciclului celular (ciclina D)

LNH cu celule din ‗manta‖

t(3;?) BCL-6 Factor de transcripţie LNH B cu celule

mari, difuz

t(8;14) c-MYC Factor de transcripţie LNH Burkitt

LNH din SIDA

t(2;5) NPM/ALK

NPM-proteină

nucleară ALK-tirozin kinază

LNH anaplastic cu

celule mari, CD30 pozitiv

SINDROAMELE CU “INSTABILITATE” CROMOSOMIALĂ

Sindroamele cu instabilitate cromosomială, reprezintă un grup de boli determinate monogenic recesiv autosomal care se

caracterizează prin alterări ale morfologiei cromosomilor datorate unor mutaţii genice (proprii fiecărui sindrom); aceste mutaţii sunt baza tulburărilor procesului de reparare al ADN-ului. Adiţional, în aceste sindroame se remarcă un evident potenţial malign, sugerând

existenţa unor corelaţii între mutaţiile genice, anomaliile cromosomice şi oncogeneză. Incapacitatea de reparare a ADN-ului, se datorează:

1. defectului în sinteza enzimelor necesare reparării,

2. blocării accesului enzimelor din citoplasmă spre nucleu sau 3. asocierii celor două mecanisme.

Defectul în repararea ADN-ului, fragilitatea cromosomială şi incidenţa crescută a cancerului sugerează conexiunea între aceste fenomene.

În acest grup sunt cuprinse următoarele sindroame: Anemia Fanconi; Sindromul Bloom;

Ataxia-telangiectazia (Sindromul Louis Bar); Xeroderma pigmentosum.

Anemia (pancitopenia) Fanconi

Anemia Fanconi este un sindrom de instabilitate cromosomială asociată cu insuficienţă medulară progresivă şi risc crescut de cancer. Boala are transmitere recesiv autosomală.

Mutaţia genică determină deficienţe ale replicării şi reparării ADN şi consecutiv anomalii cromosomiale structurale. Citogenetic se evidenţiază:

incidenţă crescută a aberaţiilor cromosomiale spontane: rupturi ale cromatidelor sau cromosomilor, deleţii, translocaţii, remanieri structurale, configuraţii de tip triradial sau cvadriradial precum şi schimburi intercromosomiale între cromosomii neomologi.

hipersensibilitate la acţiunea unor substanţe chimice care produc rupturi cromosomiale. Pentru diagnostic se folosesc diepoxibutane, mitomicina C.

Clinic se remarcă anomalii multisistemice (piele, schelet, sistem nervos, sistem imun) datorate pleiotropismului genei patologice şi heterogenităţii genetice. Pacienţii au subdezvoltare staturo-ponderală, retard mental, anomalii tegumentare de tipul hiperpigmentare şi pete ―café au lait‖, malformaţii scheletice, în particular aplazia sau hipoplazia policelui sau radiusului, scolioză, osteoporoză. Mai rar se pot consemna: hipogonadism, malformaţii cardiace sau renale, diabet zaharat.

Hematologic se constată insuficienţă medulară progresivă cu pancitopenie, respectiv anemie, leucopenie şi trombocitopenie; debutul anemiei este în jurul vârstei de 8 ani, însă diagnosticul poate fi pus şi anterior manifestărilor hematologice. Nu se observă un deficit imun în contrast cu celelalte sindroame cu instabilităţi cromosomiale.

Diagnosticul clinic poate fi în unele cazuri foarte dificil şi este necesară efectuarea cariotipului, însă şi diagnosticul citogenetic poate fi nesigur mai ales datorită pancitopeniei pacienţilor cu insuficienţă medulară.

Există riscul de a dezvolta o neoplazie. Mai frecvent se dezvoltă mielodisplazia (SMD) sau leucemia acută mieloblastică (LAM) în care se pot evidenţia anomalii citogenetice clonale, cum ar fi: -5/del(5q), şi -7/del(7q). Terapia antineoplazică specifică poate induce dezvoltarea unei a doua neoplazii, de exemplu hepatocarcinomul.

Cercetări recente au evidenţiat perturbări ale fazelor ciclului celular cu o prelungire a tranziţiei G2/M, care are drept consecinţă acumularea celulelor în faza G2, de asemenea defecte ale genei p53 (gena este cunoscută ca genă supresoare tumorală).

Evoluţia este cronică, iar decesul survine timpuriu prin aplazie medulară.

Ataxia telangiectazia (Sindromul Louis Bar)

Boala are transmitere recesiv autosomală. Gena patologică, notată AT, a fost clonată; ea este localizată pe cromosomul 11 (11q22-q23) şi în mod normal codifică o

proteină care intervine în reglarea ciclului celular, fiind considerată drept senzor al aberaţiilor ADN-ului, deoarece se leagă de gena de supresie tumorală p53, care încetineşte progresiunea celulelor în ciclul celular pentru a avea timp să se repare ADN-ul înainte de o nouă diviziune. Activitatea anormală a genei p53 mediază apoptoza, reprezentând principala cauză a morţii celulelor AT iradiate în cultură.

Cele mai multe mutaţii ale genei AT constau în mici deleţii sau inserţii. Recombinările ADN, care au un rol important în repararea ADN-ului şi stabilitatea genetică, sunt de 100 de ori mai frecvente în AT

faţă de subiecţii normali.

Mutaţi ile genei AT sunt responsabile de instabili tatea cromosomială şi frecvenţa înaltă a fuziunii telomerelor.

Citogenetic se evidenţiază:

anomalii cromosomiale spontane: o incidenţă crescută a rupturilor cromatidiene, deleţiilor intercalare (zone gaps) şi cromosomilor dicentrici o rearanjamente cromosomiale specifice, ce implică cromosomii 7 şi 14; se notează t(14;14) în tandem, del(14q12),

inv(14) sau t(7;14). În punctele de rupere sunt localizate genele sistemului imun şi genele pentru receptorii celulelor T. Evidenţierea cromosomului 14 remaniat are aceeaşi semnificaţie cu cromosomul 22 în LMC.

anomalii cromosomiale induse

o culturile din sânge periferic iradiate în faza G2 au o mare incidenţă a aberaţiilor de tip cromatidian

schimburi între cromosomii omologi sau între cromatidele surori după expunerea la diferiţi agenţi mutageni.

Metodele de genetică moleculară permit identificarea heterozigoţilor, a purtătorilor de mutaţii ale genei AT fiind astfel posibilă

identificarea astfel sarcinilor cu risc pentru AT. Persoanale sănătoase dar purtătoare ale mutaţiei AT au un risc crescut de a dezvolta cancer de sân sau carcinoame pulmonare, comparativ cu pacienţii din familiile neafectate.

Ataxia telangiectazia (AT) este o boală genetică complexă caracterizată prin degenerare cerebeloasă progresivă până la ataxie, mişcări oculare anormale şi deteriorarea vorbirii (disartrie).

Ataxia este primul simptom şi devine aparent în momentul cînd copilul începe să meargă, în timp ce teleangiectazii oculare

(dilataţii ale vaselor de sînge), considerate patognomonice, apar la expunerea la lumină cîţiva ani mai tîrziu, moment când se precizează diagnosticul.

Examenul neurologic evidenţiază: ataxie progresivă, dezvoltată în timpul copilăriei, coreoatetoză, apraxie, vorbire disritmică şi retard mental la mai mult de jumătate dintre copiii cu AT.

Examenul oftalmologic evidenţiază: telangiectazii ale vaselor conjunctivei, semne oculomotorii, de exemplu nistagmus disociat

şi strabism convergent. Se mai notează creşterea susceptibilităţii la infecţii, deficit de creştere şi îmbătrânire prematură.

Analizele de laborator evidenţiază creşterea nivelului seric de AFP (alfa-fetoproteină) şi deficinţă imunitară mixtă, selectivă

pentru imunoglobuline ( IgA, IgE, IgG2 şi IgG4) şi deficienţa imunităţii celulare T, consecutivă aplaziei sau hipoplaziei timusului.

Există predispoziţie crescută pentru boli maligne, astfel, aproximativ 10% din copiii diagnosticaţi cu AT dezvoltă o malignitate.

Majoritatea tumorilor sunt leucemii cu celule T (leucemie acută limfoblastică) sau limfoame. Sensibilitatea la radiaţiile ionizante determină o mare rată a translocaţiilor cromosomiale specifice, care implică recombinările genelor pentru receptorii celulelor T.

Boala este caracterizată de o mare heterogenitate genetică alelică. Formele clinice de AT, sunt determinate de diferitele mutaţii alelice (au fost identificate 25-30 mutaţii ale genei AT).

Copiii afectaţi de AT evoluează spre neurodegenerare, infecţii recurente determinate de imunodeficienţă sau dezvoltă cancere (tumori limfoide, epiteliale, limfosarcoame, leucemie limfocitară) ca o consecinţă a radiosensibilităţii şi a instabilităţii genomice.

Decesul bolnavilor survine înainte de adolescenţă.

Xeroderma pigmentosum

Boala are transmitere recesiv autosomală. Defectul genetic de bază este constă în deficienţa endonucleazei implicată în repararea ADN-ului din celulele cutanate expuse

la lumina soarelui. Citogenetic se evidenţiază: sunt prezente clone de celule cu anomalii cromosomiale clonale; expunerea la radiaţii UV induce rupturi cromosomiale şi schimburi între cromatidele surori. Nu sunt prezente rearanjamente cromosomiale. Clinic se constată o mare heterogenitate genetică, fiind descrise 8 forme clinice şi biochimice, notate de la A la G plus forma

―variantă‖. Separarea în cadrul acestor subgrupe este dată de diferenţele existente în inabilitatea de a repara ADN-ul. Forma clinică ―varianta‖ a XP, se caracterizează prin capacitatea de a repara rupturile de cromosomi provocate de razele UV.

Prima manifestare a boolii este fotosensibilitatea cutanată, ce apare la expunerea de scurtă durată la UV, observată încă din perioada de sugar. În evoluţie pot apare zone de eritem, atrofie, cruste, cheratoză şi teleangiectazii. Leziunile cutanate premaligne, de tipul keratoză sau angioame, au tendinţa spre transformare malignă, dezvoltându-se mai ales melanoame sau carcinoame încă din prima sau a doua decadă de viaţă.

Adiţional apar manifestări oculare de tipul blefarită, cheratită, lăcrimare, opacifiere corneană, fotofobie şi manifestări neurologice care includ retard mental areflexie sau hiperreflexie, vorbire anormală, deteriorare mentală, surditate de transmitere.

Cei mai mulţi pacienţi decedează din cauza metastazelor.

Sindromul Bloom

Boala are transmitere recesiv autosomală şi este considerată un model pentru iniţierea şi promoţia în cancer precum şi de predispoziţie genetică la cancer.

Gena patologică, notată BLM, este localizată pe cromosomul 15, braţul lung, banda 26 (15q26.1) şi codifică o proteină nucleară care are rol de ADN-helicază, implicată probabil în replicarea sau repararea ADN-ului lezat de diferiţi agenţi ca razele UV.

Mutaţia este germinală. Mutaţia somatică apărută întâmplător este cauza iniţierii tumorale, urmează apoi progresiunea tumorală.

Citogenetic se evidenţiază: rupturi cromatidiene/cromosomice; rearanjamente specifice de tipul figurilor triradiale sau qvadriradiale. Configuraţiile qvadriradiale simetrice care implică

cromosomii omologi sunt considerate patognomonice şi apar probabil în urma unui crossing-over mitotic; schimburi între cromatidele surori (sister chromatid exchange – SCE) sau între cromosomii omologi; aceste modificări sunt

găsite cu o rată de 90%, fiind considerate patognomonice. Spectrul fenotipic este variabil, ca o consecinţă a pleiotropismului genei patologice. Se constată subdezvoltare staturo-ponderală

atât prenatal cât şi postnatal, hiperpigmentare cutanată de tipul petelor ―café au lait‖, eritem facial teleangiectazic în formă de ―aripi de fluture‖ precum şi fotosensibilitate. Intelectul este normal, dar se evidenţiază unele dismorfii de tipul microcefalie, dolicocefalie, faţă îngustă, proeminenţa nasului şi a urechilor şi mai rar hipogonadism la pacienţii de sex masculin.

Există deficienţă imună ( Ig A, IgM) şi consecutiv infecţii frecvente Alte cercetări au consemnat o înaintare lentă a celulelor prin ciclul celular, mai ales de la G1 spre faza S şi deficienţa ligazei I a

ADN-ului. Pacienţii dezvoltă cel puţin un tip de cancer (10% dezvoltă două neoplazii) de tipul leucemie acută, limfoame sau carcinoame,

mai ales după vârsta de 20 de ani. Evoluţia este cronică cu complicaţii majore, astfel încât decesul pacienţilor survine înaintea vârstei de 25 de ani.

Capitolul 20

TERATOLOGIA

20.1. Anomalii congenitale

Anomaliile congenitale sunt defecte morfologice prezente la naştere, datorate unor tulburări în embriogeneză. Termenul congenital nu este însă sinonim cu ereditar.

Teratologia se ocupă cu studiul anomaliilor congenitale (terato = monstru). Incidenţa malformaţiilor congenitale variază cu momentul ontogenetic analizat de la concepţie până la vârsta de adult. Se

estimează că : 80-85% din avorturile spontane de prim trimestru şi 25% din al doilea trimestru sunt efectul unor anomalii congenitale prezente la produsul de concepţie; 2-3% dintre nou-născuţi au malformaţii majore aparente la naştere; după vârsta de 2 ani pot deveni manifeste şi alte malformaţii, astfel frecvenţa anomaliilor congenitale ajunge la 8% în copilărie şi la 10-15% în perioada adultă.

Agenţii teratogeni sunt factori nongenetici care perturbă procesul de diferenţiere embrionară/fetală normală şi morfogeneza. Deoarece efectele agenţilor teratogeni sunt cel mai frecvent evidente de la naştere, anomaliile congenitale sunt de cele mai multe ori considerate eronat a fi determinate genetic, mimând afecţiuni genetice, fiind denumite fenocopii.

Etiologia anomaliilor congenitale cuprinde: Factori ereditari (cromozomiali, genici); Factori de mediu; Factori ereditari şi factori de mediu (multifactorilal); Cauze necunoscute.

Efectele produse de un agent teratogen sunt condiţionate de următorii factori: 1. Vârsta gestaţională a produsului de concepţie în momentul expunerii la factorul teratogen. Deoarece fiecare organ are o perioadă

critică ce corespunde perioadei lui de formare ce se extinde de-a lungul mai multor săptămâni sau luni se poate vorbi de un „orar embriologic‖. Astfel, sistemul nervos prezintă cea mai lungă perioadă de formare, între săptămânile 3-20, inima între săptămânile 3-6, iar membrele între săptămânile 4-7, perioada critică a membrelor inferioare începe după cea a membrelor superioare. În primele două săptămâni de sarcină efectul este de tipul „totul sau nimic‖, acţiunea agenților teratogeni în această perioadă determinând avort spontan.

2. Doza în care acționează factorii teratogeni. 3. Genotipul fătului (susceptibilitatea genetică). 4. Genotipul mamei (susceptibilitatea genetică), existând diferenţe determinate genetic a capacităţii de detoxifiere a substanţelor cu

efect teratogen.

Anomaliile congenitale prezintă mai multe clasificări în funcţie de:

extidenderea anomaliilor; cauza determinantă; momentul intervenţiei factorilor cauzali.

După extinderea anomaliilor sunt clasificate în: 1. Defecte primare unice ale dezvoltării , în care de obicei este implicată o singură structură, iar etiologia pare a fi poligenică,

multifactorială. 2. Sindroame plurimalformative, care implică existenţa mai multor defecte congenitale, toate având însă aceeaşi etiologie (cromozomială,

monogenică, factori teratogeni exogeni): Anomalii cromozomiale care afectează o mare parte din cromozomi: trisomiile 21, 13, 18, deleţia 5p, deleţia 4p; Microdeleţii cromozomiale: sindromul Di George-velocardiofacial; Mutaţii monogenice: sindromul Marfan; Factori teratogeni exogeni: biologici (virusul rubeolic), chimici (sindromul de alcoolism fetal, sindromul de hidantoin fetal).

3. Secvenţe de anomalii multiple implicând defecte multiple care apar prin iniţierea unor erori secundare sau terţiare în morfogeneză şi ca o consecinţă a defectului iniţial. Exemplu: secvenţa Potter (agenezie renală, oligohidramnios, dismorfie facială caracteristică, picior strâmb congenital), secvenţa Pierre-Robin (micrognaţie, glosoptoză, palat despicat).

4. Asociaţiile cuprind malformaţii care apar împreună mai frecvent decât s-ar aştepta să apară izolate. Denumirile folosite pentru recunoaşterea malformaţiilor asociate sunt adeseori acronime ale anomaliilor componente. Exemplificăm cu asociaţia VATER , acronim de la anomaliile prezente: anomalii vertebrale, agenezie anus, fistulă traheo- esofagiană, displazie de radius.

După cauză şi mecanism de producere, defectele primare unice sunt clasificate în: Malformaţia: defectul structural a apărut printr-o eroare intrinsecă în morfogenza unui organ sau ţesut, prezentă de la debutul

embriogenezei (mugure embrionar sau primordium anormal), exemplu: fisura labială, fisura palatină, malformaţia cardiacă. Majoritatea malformaţiilor izolate sunt moştenite ca trăsătură poligenică cu un risc mic de recurenţă.

Disrupţia implică distrugerea unei părţi a fătului care anterior s-a dezvoltat normal. Factorii care determină disrupţii pot fi teratogeni cunoscuţi sau factori necunoscuţi. O entitate specifică este disrupţia datorată benzilor amniotice constrictive care determină amputarea degetelor şi membrelor, iar uneori despi-cături faciale şi defecte SNC. Fătul fiind genetic normal şi defectele fiind cauzate de o anomalie extrinsecă riscul de recurenţă este mic, iar prognosticul depinde de severitatea defectului fizic.

Deformaţia este o anomalie de formă sau poziţie datorată unor factori mecanici intrinseci (ex. piciorul strâmb congenital prin miopatie) sau factori extrinseci (ex. piciorul strâmb congenital prin constrângere uterină, oligohidramnios).

Displazia poate fi localizată sau generalizată şi reprezintă organizarea anormală a celulelor în ţesuturi, exemplu localizată: hemangiomul, generalizată: neurofibromatoza.

După momentul intervenţiei factorilor cauzali în timpul dezvoltării intra-uterine se disting: gametopatii, determinate de modificări ale celulei sexuale participante la fecundare; sunt singurele anomalii congenitale

ereditare; blastopatii, determinate de agenţi nocivi care acţionează în perioada de blastogeneză şi anume primele 10-15 zile de la

fecundare; embriopatii , determinate de agenţi teratogeni în primele 3 luni ale dezvoltării ontogenetice; fetopatii, determinate de factori nocivi care acţionază între lunile 4-9 de sarcină.

Agenţii teratogeni pot fi:

1. Chimici: mercur, substanţe organice volatile, alcool, medicamente; 2. Biologici: virusul rubeolic, citomegalic, herpetic, varicelo-zosterian, toxoplasma gondii, treponema pallidum; 3. Fizici: radiaţii ionizante, hipertermia, factori mecanici (malformaţii ale uterului).

Au fost bine studiate anumite efecte datorate acţiunii celor mai cunoscuţi agenţi teratogeni: alcoolul etilic determină sindromul de alcoolism fetal (SAF); fumatul produce: avort spontan, retard de creştere intrauterin, prematuritate, retard mental; diabetul zaharat neechilibrat determină: regresie caudală, defecte cardiace, defecte de tub neural; isotretinoin: avort, anomalii ale urechilor şi SNC; rubeola: surditate; fenilcetonuria: retard mental; anticonvulsivantele: sindromul hidantoin fetal; thalidomida: defecte ale membrelor.

Medicamentele constituie o clasă a agenţilor chimici teratogeni ale căror efecte nocive asupra produsului de concepţie au fost atent studiate, observându-se faptul că o paletă largă produc malformaţii. De referinţă este efectul administrării Thalidomidei la gravide între anii 1959-1962, responsabilă de naşterea a peste 10.000.000 de cazuri cu embriopatie thalidomidică (sindrom dismelic) prezentând anomalii ale membrelor: micromelie, focomelie, amelie.

S-a constatat că este importantă clasa de medicamente din care acesta face parte, precum şi durata administrării medicamentului. Cele mai nocive medicamente sunt:

Anticonvulsivantele

Este dificil managementul epilepsiei la o femeie însărcinată, deoarece majo-ritatea anticonvulsivantelor sunt cunoscute a avea efect teratogen, determină malformaţii diverse, uneori patognomonice. Apar fisuri labio-palatine, anomalii ale extremităţilor, defecte de tub neural, malformaţii cardiace. Exemplificăm cu două sindroame patognomonice. Fenitoina este recunoscută ca fiind cauza sindromului hidantoin fetal care are un tablou clinic bine definit, cuprinzând: facies

dismorfic cu hipotelorism, fante mongoloide, filtrum lung, urechi malformate, unghii hipoplazice, retard de creştere intrauterin şi retard mental.

Acidul valproic determină sindromul de valproat fetal ce include dismorfie facială, defecte ale membrelor, cordului, tubului neural şi întârzieri ale dezvoltării. Riscul de apariţie a spinei bifida la un nou-născut dintr-o mamă tratată în timpul sarcinii cu acid valproic este de 1-2 %.

Medicaţia psihotropă, este incriminată ca posibil malformativă.

Litiu determină defecte cardiace în 1-5 % din cazuri (ex. anomalia Ebstein).

Citostaticele care inhibă dezvoltarea embrionară produc defecte scheletice, despicătură palatină, de tub neural.

Aminopterina, utilizată şi pentru provocarea avortului determină: microcefalie, hipoplazia oaselor craniene, sinostoză coronară/lambdoidă, mezomelie

Anticoagulantele: warfarina are o perioadă critică de acţiune între săptămânile 6-7 de sarcină , iar efectele ce le produce cuprind: retard de creştere, nas hipoplazic, epifize punctate.

Antibioticele:

Aminoglicozidele determină ototoxicitate; Tetraciclina de la 4 luni de gestaţie determină anomalii dentare;

Antihipertensive: IECA (inhibitorii enzimei de conversie a anginotensinei) prezintă un efect teratogen manifestat clinic prin două elemente

principale: a) Anomalii renale incluzând oligohidramnios, blocaj renal, anemie şi deseori moarte neonatală cauzată de insuficienţă renală. În

unele cazuri de moarte infantilă autopsia relevând disgenezie renală. b) Defecte de osificare craniului, dacă acţiunea IAEC este între trimestrul II şi III de sarcină, craniul fiind subosificat şi moale la

palpare.

Anticoncepţionalele administrate la începutul sarcinii determină sindrom VACTERAL (vertebral, anal, tracheo-esophageal, limb malformations , retard mental).

Diethylstilbestrolul are risc crescut adenocarcinom vaginal şi tumori testiculare maligne; Progestativele produc masculinizarea organelor genitale la feţii de sex feminin sau feminizarea feţilor de sex masculin, risc

crescut de hipospadias;

Vitamina A administrată în doze mari în timpul sarcinii determină embriopatie retinoidă cuprinzând anomalii craniofaciale (hipoplazia sau aplazia urechii externe), ale SNC (microcefalie, hidrocefalie, cecitate corticală), defecte cardiace.

Medicamentele antitiroidiene generează hipotiroidism fetal şi retard mental.

Toluenul este un solvent organic activ ce afectează dezvoltarea normală a fătu-lui, anomaliile determinate de acesta fiind:de creştere şi dezvoltare, cranio-faciale, ale membrelor, renale şi disfuncţii ale SNC. Mortalitatea perinatală a feţilor care ajung la termen este ridicată, fenotipul acestora fiind similar celor cu sindrom de alcoolism fetal.

Alcoolul: este bine cunoscut faptul că aportul cronic de alcool în timpul sarcinii poate afecta produsul de concepţie manifestările putând fi severe (Sindromul de alcoolism fetal) sau parţiale (efecte alcoolice parţiale). Etanolul acţionează în principal asupra celulelor sistemului nervos central, afectând neuronii în curs de dezvoltare şi crescând mortalitatea celulelor progenitoare ale SNC.

Sindromul de alcoolism fetal are o incidenţă de 1-2/1000 de nou-născuţi, manifestările fenotipice cuprinzând: disfuncţii ale SNC: microcefalie, surditate, tulburări de coordonare motorie, tulburări de vorbire tulburări de comportament; anomalii faciale: fante palpebrale scurte, etajul mijlociu al feţei aplatizat, filtrum sters, buza superioară subţire; anomalii cardiace; anomalii scheletale; retard de creştere: statură mică, greutate mică, creştere lentă a creierului.

Criteriile minime pentru diagnosticul SAF cuprind: retard de creştere intrauterin şi/sau postnatal, disfuncţii ale SNC, dismorfie facială caracteristică.

Radiaţiile ionizante au efect mutagen, carcinogen şi teratogen: perioada preimplantării, între zilele 8-9 intervenind efectul „totul sau nimic‖; perioada organogenezei, între ziua 10 – săptămâna 9, determinând malformaţii;

perioada fetală, între săptămâna 9 – termen, determină microcefalie, retrd mental, defect de tub neural şi risc crescut de leucemie. Factori mecanici intrauterini sunt factori care determină diferite defecte, cei mai frecvenţi fiind oligohidramniosul şi bridele

amniotice. Oligohidramniosul determină compresiune fetală cu dismorfie facială, picior strâmb congenital, luxaţie coxo-femurală.

Bolile materne Câteva boli ale mamei au fost identificate ca fiind cu risc malformativ pentru făt. Diabet: complex de regresie caudală (defect specific embriopatiei diabetice, dar nu foarte des întâlnit), macrosomie, defecte

cardiace, defect de tub neural, malformaţii renale. Lupusul eritematos sistemic: avort, bloc cardiac congenital. Fenilcetonuria: retard mental, retard de creştere, microcefalie, defecte cardiace. Hipertermia: anomalii de SNC, defect septal atrial, ventricul stâng hipoplazic, defecte de tub neural. Infecţii materne: retard de creştere, microcefalie, anomalii oculare, retard mental.

Infecţii virale

Rubeola responsabilă de embriopatia rubeolică (sindrom Greeg), exemplifică faptul că fiecare organ are o perioadă maximă de sensibilitate la agentul teratogen, perioadă care coincide cu momentul formării sale. Infecţia rubeolică în primele 4 săptămâni induce anomalii oculare, între săptămânile 5-7, anomalii cardiace, între săptămânile 8-9 afectează mugurii dentari şi între săptămânile 9-12 determină surditate.

Virusul citomegalic determină o infecţie primară la 1-4% dintre femei în timpul sarcinii. Riscul infecţiei congenitale pare să fie mai ridicat când infecţia apare în prima jumătate a perioadei de sarcină. Dintre feţii afectaţi, 10-15% au o boală clinică vizibilă la naştere, incluzând în mod tipic: microcefalie, hepatosplenomegalie şi corioretinită. Mortalitatea la nou-născuţii simptomatici este de 20-30%.Nou-născuţii fără boală manifestă de la naştere ramân totuşi în procent de 5-15% cu sechele pe termen lung, incluzând surditate.

Virusul herpex simplex generează embrio-fetopatie cu anomalii de creştere şi oculare, când infecţia survine în prima jumătate a sarcinii. La 80% dintre nou-născuţii afectaţi infecţia apare în timpul travaliului şi poate cauza leziuni cutanate, encefalită şi boală diseminată la diferite organe şi sisteme.

Varicela este asociată cu un risc mai scăzut de 10% pentru embriopatia fetală. Efectele includ microcefalie, anomalii oculare, defecte ale membrelor cu piele cicatricială dacă mama a fost infectată în prima jumătate a sarcinii.

SIDA , rata de transmitere perinatală este de aproximativ 30%, nou-născutul asociind statură mică, microcefalie, dismorfie facială, malabsorbţie, limfadenopatii şi infecţii recurente.

Alte infecţii

Toxoplasmoza congenitală, rata de transmisibilitate la făt este de 15-12% în primul trimestru, dar creşte la 60% în al treilea trimestru. Sechelele sunt mai severe în cazul infecţiilor de prim trimestru şi cuprind: retard de creştere, hidrocefalie, microcefalie, cataractă, corioretinită, tulburări auditive.

Sifilis congenital: retard de creştere, microcefalie, triada Hutchinson, incisivi semilunari, molarii Hutchinson în formă de mură, cheratită interstiţială, surditate.

Capitolul 21

POSIBILITĂŢI DE TERAPIE ÎN BOLILE GENETICE

În ultimul deceniu, studiile de genetică moleculară şi citogenetică, au creat premize încurajatoare pentru corectarea şi

tratamentul bolilor genetice. Sunt cunoscute în prezent peste 5000 boli genetice, fiind deja identificate foarte multe dintre mutaţiile

care determină afecţiunile monogenice. Un pas decisiv în corectarea bolilor genetice îl va reprezenta transferul de gene. Un loc important îl deţine în continuare consultul genetic, pe baza căruia se stabileşte diagnosticul, conduita terapeutică,

informând în acelaşi timp familia asupra riscului recurenţei bolii în generaţii. În paralel, se va continua îmbunătăţirea testelor pentru diagnosticul prenatal, care prin rezultatele lor asigură o bună profilaxie

genetică. Tehnicile de genetică moleculară îşi găsesc aplicabilitatea în tratamentul diferitelor afecţiuni datorită posibilităţii sintezei unor

proteine sau vaccinuri prin inginerie genetică. Metodele utilizate sunt: Exprimarea genelor cu structură normală, clonate, în vederea sintezei unor cantităţi mari de produşi genici Producerea de anticorpi care pot fi utilizaţi ca agenţi terapeutici Producerea de vaccinuri, inclusiv vaccinuri noi pentru anumite forme de cancere.

Clasele majore de afecţiuni care pot beneficia de aceste modalităţi terapeutice: Bolile infecţioase Bolile neoplazice Bolile ereditare monogenice Bolile sistemului imunitar (inclusiv alergii, inflamaţii, boli autoimune)

Date actuale privind tratamentul în bolile multifactoriale

În bolile multifactoriale, factorii genetici se intrică cu cei de mediu, intervenind fiecare cu o cotă mai mare sau mai mică. În general, factorii cunoscuţi ca nocivi pot fi evitaţi. Aşa de exemplu, evitarea fumului de nicotină de către persoanele cu deficit de alfa-1- antitripsină, scade riscul tulburărilor respiratorii şi al complicaţiilor hepatice.

În unele anomalii congenitale multifactoriale cum ar fi defectele congenitale de cord, despicăturile labio-palatine, stenoza pilorică ş.a., tratamentul chirurgical rezolvă defectul; în peste 50% din cazuri, corectarea chirurgicală este salutară printr-o unică intervenţie.

În alte boli multifactoriale ca: hipertensiunea arterială, boala coronariană, diabetul zaharat, schizofrenia, psihozele majore, posibilităţile terapeutice sunt încă departe de un tratament salutar, existând până în momentul de faţă doar terapii de ameliorare.

Date actuale privind tratamentul în bolile monogenice

În bolile monogenice, recuperarea şi readucerea la starea normală este posibilă în aproximativ 15% din totalul acestora. Cât priveşte adaptarea socială, procentul este chiar mai mic, de până la 6%. Rezultate bune sunt consemnate însă în bolile în care defectul biochimic este cunoscut.

Obiectivele tratamentului: Identificarea mutaţiei genice, pentru efectuarea tratamentului etiologic

În boli ca fibroza chistică şi miodistrofia Duchenne, abia de curând au fost identificate genele patologice şi proteinele

deficiente, motiv pentru care sunt necesare în continuare studii ample care să conducă la corectarea lor. Ident i f icarea pro te ine lor def ic iente ş i a mecan ismelor care determină insta larea

s imptomato log ie i c l in ice În fenilcetonurie, - deşi mutaţia genică este cunoscută -, lipseşte încă explicaţia acţiunii nocive a hiperconcentraţiei de fenilalanină

asupra dezvoltării encefalului. Efectuarea tratamentului pe termen lung, chiar permanent

Pentru cea mai mare parte a bolilor monogenice, conduita terapeutică trebuie să fie pe termen lung. Aşa de exemplu, în galactozemie, trebuie evitată acumularea galactozei, pentru că aceasta poate duce permanent la instalarea tulburărilor. În cistinoză (acumularea de cisteină în lizozomi), de asemenea, neinstituirea sau oprirea tratamentului, poate duce la instalarea tulburărilor renale. O conduită terapeutică permanentă este necesară şi în hemofilie, având însă în acelaşi timp în vedere că după o anumită perioadă se pot produce anticorpi antifactor hemofilic. În talasemie sunt necesare transfuzii periodice de sânge; pacienţii trebuie urmăriţi permanent pentru a se evita supraîncărcarea cu fier.

Diferenţierea terapiei în raport cu heterogenitatea genetică a bolii Tratamentul trebuie diferenţiat, astfel, deşi în talasemie şi anemia sicklică (hemoglobinopatia S) mutaţia interesează aceeaşi

pereche alelică, tratamentul este diferenţiat, în funcţie de tipul mutaţiei şi al expresiei genice. Urmărirea în timp a pacienţilor

În retinoblastom, tratamentul chirurgical este salutar, dar pacienţii trebuie urmăriţi în timp, existând riscul dezvoltării ulterioare a altor tumori maligne.

Prevenirea instalării bolii prin diagnostic precoce şi iniţierea timpurie a terapiei În fenilcetonurie stabilirea diagnosticului imediat după naştere previne instalarea manifestărilor clinice severe. Pe timpul sarcinii

fătul este protejat de prezenţa enzimei materne, de aceea la naştere, nou-născutul nu prezintă încă tulburări. Diagnosticul trebuie pus însă prompt pentru că fără dietă, tulburările (oligofrenia) se instalează încă din prima lună de viaţă şi sunt ireversibile.

Conduite terapeutice Dieta: O primă conduită în bolile metabolice o constituie dieta restrictivă. Uneori este dificil a se institui o dietă completă,

dar respectarea riguroasă a dietei împiedică instalarea tulburărilor, având, efecte benefice. În fenilcetonurie (forma clasică), dieta instituită imediat după naştere previne instalarea tulburărilor neurologice. Dieta trebuie respectată toată viaţa. În

alte afecţiuni poate fi necesară administrarea unui anumit produs: de exemplu administrarea de colesterol în sindromul Smith-Lemli-Opitz previne demielinizarea.

Administrarea unor vitamine poate îmbunătăţi prognosticul unor bolnavi. Astfel, în homocistinurie (deficienţă a enzimei cistation-sintetază), administrarea vitaminei B6, face ca nivelul concentraţiei plasmatice a homocisteinei să scadă (baza moleculară a acestor acţiuni nu este pe deplin cunoscută). Vitamina E este benefică în unele afecţiuni neurologice, ca de exemplu ataxia pseudo-Friedrich.

Electrostimularea: se utilizează în bolile neuromusculare cu scopul de a creşte gradul de mobilitate şi de a reduce spasmele musculare şi durerea.

O altă formă de tratament este administrarea produsului deficitar. În hipotiroidismul congenital (aproximativ 15% sunt forme genetice) este necesară administrarea încă din perioada neonatală a preparatelor de tiroidă. Frecvenţa ridicată a hipotiroidismului congenital a determinat instituirea unui program screening neonatal pentru depistarea precoce a bolii. În hemofilie, administrarea periodică de perfuzii cu fracţiuni de plasmă bogată în factorii VIII sau IX ai coagulării (în

funcţie de tipul hemofiliei), reduce starea hemoragipară.

În deficienţa pentru alfa-1-antitripsină, administrarea periodică a enzimei, împiedică efectul distructiv al elastazei asupra epiteliului alveolar pulmonar. Deficitul de alfa-1-antitripsină este o cauză majoră a morţii premature, prin insuficienţă pulmonară.

În deficienţa enzimatică a adenozin diaminazei (ADA), absenţa enzimei perturbă limfocitele B şi limfocitele T prin blocări ale replicării ADN-ului şi ale proliferării mitotice, determinând o gravă imunodeficienţă. Administrarea de extract de enzimă ADA provenită de la bovine, corectează deficitul imunitar. Netratată, boala duce la deces prin infecţii în primii doi ani din viaţă.

În boala Gaucher - deficit enzimatic cu stocare de cerebrozide în lizozomii SRE - se administrează enzima deficitară,

împiedicându-se astfel stocarea lipidelor complexe şi consecinţele acesteia. Metode le fa rmaco log ice convenţ iona le au ca scop:

Înlocuirea unei funcţii: de exemplu, administrarea de melatonină în sindroame cu tulburări ale ritmului circadian Protejarea unei funcţii: de exemplu în ataxia Friedrich (boală mitocondrială degenerativă care afectează SNC şi inima)

administrarea de anti-oxidanţi (coenzima Q 10) a ameliorat funcţia cardiacă, dar nu a avut efect asupra SNC. Reexprimarea unei funcţii: în hemoglobinopatia S se administrează hidroxiuree care stimulează expresia genei pentru

specificarea globinei gama în scopul producerii HbF ca supleant al absenţei globinei beta; prin aceasta se ameliorează simţitor procesul hemolitic.

Inhibarea unei funcţii: de exemplu biofosfonaţii se administrează în osteogeneza imperfectă Rectificarea procesului de translaţie: de exemplu în fibroza chistică administrarea unui anumit antibiotic determină

corectarea splicing-ului aberant Administrarea unor medicamente care reduc nivelul plasmatic al produsului nemetabolizat reprezintă o altă modalitate

terapeutică. Hipercolesterolemia familială (mai ales forma heterozigotă) se tratează cu succes. Astfel, administrarea

unor medicamente stimulează producerea de receptori pentru lipoproteine, în scopul legării colesterolului liber. În paralel, se administrează şi medicamente care să inhibe sinteza colesterolului hepatic (endogen).

Transplantul Terapia genică

Terapia prin modificarea genomului somatic

Transplantul. Celulele transplantate păstrează genomul donorului, astfel că transplantul poate fi socotit drept o formă de terapie prin transfer de gene.

Pentru bolile genetice, metoda transplantului se indică în scopul: de a transfera gene funcţionale în vederea sintezei de proteine care sunt deficitare sau lipsesc; aşa de exemplu,

transplantul de celule hepatice, ectopic, în hipercolesterolemie, forma homozigotă; de a înlocui un organ întreg nefuncţional; de exemplu, transplantul de ficat în stadiul de ciroză al deficienţei de alfa-1-

antitripsină. Primul transplant de ficat a fost efectuat în 1988. La aproximativ 2/3 din cazuri (dintre primitori) efectul este bun şi durează 4 - 5 ani.

Transplantul de măduvă hematopoetică are efecte benefice şi se efectuează în imunodeficienţe, dintre care amintim deficienţe ale enzimei ADA, precum şi în boli de stocare ale lipidelor complexe, talasemie ş.a.

De câţiva ani s-a încercat implementarea de mioblaste în miodistrofia Duchenne, cu rezultate încurajatoare.

Terapia prin transfer de gene

Metodele utilizate pentru terapia genică: terapia genică clasică: constă în introducerea genelor în celulele ţintă cu scopul de a obţine o expresie optimă a genelor introduce. Genele astfel exprimate vor determina:

sinteza unui produs care lipseşte

distrugerea directă a celulelor afectate, de ex. prin producerea unor toxine

activarea celulelor sistemului imunitar care vor ajuta la distrugerea celulelor afectate terapia genică non-clasică: cu scopul de a inhiba expresia unor gene asociate cu patogenia bolii, sau de a restaura expresia normală a genei.

Pentru corectarea genelor cu mutaţii se pot utiliza mai multe modalităţi:

Inserarea unei gene cu structură normală într-o locaţie nespecifică, reprezintă metoda mai frecvent folosită

Gena defectivă poate fi înlocuită cu gena normală, prin recombinare omoloagă.

Gena defectivă poate fi reparată prin mutaţie inversă selectivă, care întoarce gena la funcţia sa normală.

Alterarea reglării unei anumite gene (gradul în care o genă este activată sau inhibată)

Pentru transferul de gene este necesară o anumită strategie, cu îndeplinirea următoarelor condiţii: locusul să fie identificat;

gena să fie cunoscută din punct de vedere biochimic;

să fie posibilă clonarea ADN-ului;

să se ia toate măsurile de prevedere ca introducerea genei în genomul bolnavului să nu producă risc pentru o nouă

mutaţie;

să se poată păstra expresia genei transferate;

să se găsească un vector adecvat şi desigur, nepatogen;

să se dezvolte şi perfecţioneze şi tehnologia pentru transfer de gene lung codante.

Genele pot fi transferate fie în celulele germinale, fie în celulele somatice. Transferul în celulele liniei germinale implică inserarea

genei normale în aceste celule, astfel încât defectul genic va fi corectat şi va fi transmis în manieră mendeliană de la o generaţie la

alta. Terapia prin transfer de gene în celule somatice se referă la inserarea genelor normale numai în aceste celule, fără posibilitatea

transmiterii la generaţiile viitoare, fiind modificat astfel doar genomul pacientului respectiv.

Terapia genică în celulele germinale la şoareci: Deşi terapia genică în celulele liniei germinale la om este interzisă din

raţionamente morale, ştiinţifice şi practice, a fost permisă efectuarea unor asemenea experimente pe şoareci, demonstrând

fesabilitatea inserării unor gene funcţionale în celulele germinale, care au condus la vindecarea bolii la şoareci.

La ora actuală, tehnica inserării unei gene străine, sau a unui fragment de ADN (de exemplu, o transgenă) în celulele

germinale la şoarece este efectuată în mod curent. Imediat după fecundare se colectează embrionul de şoarece care este format

dintr-o singură celulă. În acest stadiu pronucleul masculin este încă vizibil, iar ADN-ul străin poate fi inserat în nucleu printr-o

microinjecţie. După injectare, embrionii sunt plasaţi în uterul unei femele pregătită hormonal (―pseudoînsărcinată‖). Prezenţa transgenei

poate fi determinată după naştere, la şoarecii nou-născuţi, fie prin metoda Southern, fie prin reacţia de polimerizare a catenelor

(PCR). Deoarece aceşti şoareci pot exprima genele străine, ei au fost denumiţi transgenici.

Posibilitatea inserării genelor străine în celulele liniei germinale la şoarece a făcut posibilă testarea fesabilităţii terapiei genice.

Gene cu structură normală au fost introduse la şoareci care prezentau anumite afecţiuni genetice, iar încorporarea lor în genomul

acestora a determinat vindecarea efectivă a şoarecilor. Un exemplu în acest sens îl reprezintă transferul genei umane care specifică

lanţul beta-globinic, la şoareci bolnavi cu beta-talasemie (datorată unei deleţii a genei care specifică acest lanţ globinic la şoarece). În

urma acestui transfer s-a observat reglarea expresiei moleculelor beta-globinice la şoareci şi respectiv corectarea bolii. Terapia genică în celulele somatice: Această modalitate de terapie genică implică inserarea unei gene normale în celulele

somatice, transferul de genă determinând sinteza unei cantităţi suficiente de proteine terapeutice, pentru a se corecta defectul

metabolic. Spre deosebire de terapia genică în celulele liniei germinale, numai anumite celule somatice ale unui individ afectat sunt ţinta transferului genic, dar materialul genetic nou rezultat nu va fi transmis la descendenţii pacientului.

Pentru introducerea genelor în celulele somatice sunt utilizate două modalităţi: ―ex vivo‖ şi ―in vivo‖. Terapia genică ―ex vivo‖ implică extragerea celulelor de la pacient, introducerea genelor terapeutice folosind anumiţi vectori virali

sau nonvirali şi transplantul autolog al celulelor corectate din punct de vedere genic, la pacientul respectiv.

Terapia genică “in vivo” se realizează prin introducerea directă a genei terapeutice la nivelul siturilor ţintă pentru patologia

unui anumit individ (de exemplu, infuzii intravenoase, intraarteriale etc.), fără a fi necesară extragerea şi cultivarea celulelor pentru a

se realiza inserarea genelor, într-un laborator. Gena cu structură normală este inserată în genom, pentru a înlocui gena cu mutaţie. In vederea introducerii genei terapeutice

în celulele ţintă ale pacientului este necesară legarea acesteia de un vector. Cel mai frecvent se utilizează ca vector un virus care a fost modificat genetic pentru a transporta ADN-ul uman normal.

După ce pătrunde în celulele ţintă ale pacientului (de ex. ficat, plămân), vectorul va lăsa materialul genetic conţinând gena umană terapeutică în aceste celule. Generarea unei proteine funcţionale de către gena terapeutică restaurează statusul normal al celulei ţintă.

Până în prezent, majoritatea modalităţilor de terapie genică au la bază transferul genic ―ex vivo‖, folosind ca vectori, retrovirusuri. Aceşti vectori au fost utilizaţi pentru transferul de ADN complementar într-o varietate de tipuri de celule, inclusiv celule hematopoetice, fibroblaşti, hepatocite şi celule endoteliale.

Celulele hematopoetice au reprezentat o ţintă majoră a studiilor de transfer genic mediat prin retrovirusuri, având în vedere faptul că transplantul de măduvă hematogenă s-a dovedit a fi curativ la pacienţii care au prezentat anumite afecţiuni genetice.

Sistemele cele mai importante de vectori virali şi nonvirali care se utilizează la ora actuală în terapia genică sunt: vectori virali:

retrovirusuri; adenovirusuri; virusuri adeno-asociate; virusul herpetic

vectori nonvirali:

plasmide; liposomi; vectori conjugaţi proteină-ADN.

Cele mai folosite clase de vectori pentru transfer de gene sunt derivatele din retrovirusuri şi plasmidele.

Sistemele de vectori virali

Vectorii retrovirali reprezintă primul sistem de vectori folosit, dar şi cel mai frecvent utilizat pentru terapia genică. Retrovirusurile sunt adecvate transferului de gene în celulele somatice deoarece integrarea genomului retroviral în cromozomul unei celule gazdă este o parte obligatorie a ciclului lor de viaţă. În general, integrarea unui virus într-un cromozom gazdă şi expresia genelor sale din provirusul integrat nu are efecte detrimentale asupra viabilităţii şi funcţiei celulei gazdă infectate.

Avantajul vectorilor virali este de a avea genom scurt şi de a pătrunde în genomul tuturor celulelor primitorului. Oricum, vectorii trebuie să fie în prealabil ―prelucraţi‖ pentru a deveni incapabili de replicare şi să fie verificaţi pentru a nu avea efecte toxice, patogene.

Virusul se leagă de un receptor de membrană al celulei gazdă, eliberând ARN-ul viral în citoplasmă. Enzima revers-transcriptază converteşte genomul viral monocatenar într-un ADN bicatenar care formează un ―complex de integrare‖ cu proteinele celulei gazdă. Acest complex este transportat prin membrana nucleară şi va determina integrarea genomului viral în genomul gazdă sub forma unui provirus. Provirusul are capacitatea de a transcrie şi translaţiona genomul viral în celula gazdă şi de a produce copii ale proteinelor virale. Aceşti vectori au fost utilizaţi cu succes în transferul genic în diferite tipuri de celule.

Vectorii adenovirali sunt virusuri care au ca material genetic ADN dublu catenar şi infectează o mare varietate de tipuri de celule. Virusul nu se integrează în cromozomii umani, astfel încât nu există riscul mutagenezei sau activării unor oncogene în cazul folosirii lor. Metoda uzuală constă în realizarea unui vector format dintr-un adenovirus recombinat. Experimentele de transfer genic efectuate cu aceste tipuri de vectori au demonstrat o expresie eficientă, dar de scurtă durată, fie a produşilor genei marker (de exemplu, beta-galactozidaza în galactozemie), fie a proteinelor reglatoare (de exemplu, în fibroza chistică).

Virusurile adeno-asociate reprezintă o clasă de virusuri mici, cu ADN monocatenar, care îşi inseră materialul genetic într-un anumit loc de pe cromozomul 19.

Virusul herpetic este un virus cu ADN dublu catenar care infectează neuronii.

În decursul anilor şi alte virusuri au fost testate ca posibili vectori, inclusiv virusul poliomielitei, virusuri gripale, etc. Aceste sisteme prezintă însă unele dezavantaje. Dintre acestea, probabil cel mai semnificativ este reprezentat de faptul că sunt necesare mai multe injectări, deci administrare repetată pentru menţinerea efectului terapeutic.

Sistemele de vectori non-virali

Cea mai simplă metodă este reprezentată de introducerea directă a ADN-ului terapeutic în celulele ţintă. Este însă limitată ca aplicabilitate, deoarece poate fi folosită numai la anumite ţesuturi şi necesită cantităţi mari de ADN.

Liposomii sunt vezicule compuse dintr-o membrană lipidică ce înconjoară un volum apos, având diametrul de câteva zeci de microni. Liposomii prezintă un avantaj asupra vectorilor virali pentru terapia genică ―in vivo‖, deoarece sunt relativ nontoxici şi determină mai puţine reacţii imunologice. Dar, înainte ca liposomii să poată fi utilizaţi pe scară largă în terapia genică trebuie depăşite câteva obstacole. De exemplu, după introducerea liposomilor în organism, ei devin adesea instabili şi numai o mică parte din ei au acces la nucleu pentru exprimare. În plus, introducerea liposomilor în anumite celule in vivo este dificilă, iar după ce gena codantă a fost introdusă în celulă, o mare parte se degradează rapid în lizozomi. Pentru corectarea acestor două neajunsuri au fost realizaţi liposomi modificaţi, numiţi ―imuno-liposomi‖, care conţin anticorpi specifici pentru anumite antigene celulare. Această

îmbunătăţire oferă un avantaj pentru afecţiunile genetice în care se doreşte ca genele să fie îndreptate înspre sistemul reticulo-endotelial (de exemplu, în bolile de stocare a lipidelor, cum ar fi boala Gaucher sau Niemann-Pick).

Utilizarea liposomilor pare totuşi promiţătoare pentru terapia genică, reprezentând o alternativă importantă a vectorilor virali. Plasmidele şi vectorii conjugaţi. Recent au fost puse la punct câteva strategii pentru injectarea sau infuzia unor plasmide

folosite ca vectori direct în celule, fără introducerea lor într-o particulă virală sau într-un liposom. Plasmidul reprezintă o moleculă circulară, extracromozomială de ADN care se replică independent. Eforturile au fost concentrate asupra introducerii lor prin legarea de anumiţi receptori, pentru a ajunge în modul cel mai eficient la anumite situsuri patologice.

Vectorii conjugaţi au fost utilizaţi pentru a se realiza transferul genic la hepatocite şi celulele epiteliului respirator.

ADN-ul terapeutic poate fi introdus în celulele ţintă prin legarea chimică a ADN-ului de o moleculă care se va lega de receptori celulari speciali. Aceştia vor internaliza ADN-ul în celulele ţintă.

La ora actuală se fac cercetări pentru introducerea celui de-al 47-lea cromozom uman artificial în celulele ţintă. Acest cromozom ar exista în mod autonom, alături de cei 46 cromozomi standard, fără a afecta funcţionalitatea lor şi fără a determina mutaţii. Dificultatea metodei constă însă în introducerea unei structuri atât de mari în nucleul celulei ţintă.

Limitele terapiei genice

Natura de scurtă durată a terapiei genice – ADN-ul terapeutic introdus în celulele ţintă trebuie să rămână funcţional şi stabil, pentru ca terapia genică să fie o modalitate eficientă de tratament. Problemele legate de introducerea ADN-ului terapeutic în genom, precum şi diviziunea rapidă a unor celule împiedică obţinerea efectului terapeutic pe durată lungă de timp. De aceea este necesară introducerea ADN-ului terapeutic de mai multe ori pe parcursul vieţii.

Răspunsul imun - ADN-ului terapeutic introdus în organism este perceput ca o structură non-self, determinând apariţia unui răspuns imun. Riscul stimulării acestui răspuns reduce eficacitatea terapiei genice.

Probleme legate de vectorii virali – Utilizarea virusurilor poate determina toxicitate, răspuns imun şi/sau inflamator, precum şi probleme legate de controlul genic. De asemenea, virusul introdus în organism ar putea să redevină patogen.

În 1990 s-a efectuat pentru prima dată terapia cu transplant de gene la 5 pacienţi cu melanom (cancer al pielii). Metoda a constat în prelevarea de limfocite de la bolnav, cultivarea acestora şi introducerea prin transfecţie (prin intermediul retrovirusurilor) a genelor antitumorale. După această ―prelucrare‖, limfocitele au fost infiltrate în tumoră, observându-se retrocedarea tumorii pentru o perioadă de câteva luni.

Tot limfocite au fost folosite pentru transfer de genă în deficienţa enzimatică ADA, cu rezultate bune, efectul durând câteva luni,

după care operaţiunea se poate repeta.

Până în prezent majoritatea cercetătorilor s-au concentrat asupra transferului de gene cu ajutorul retrovirusurilor în celulele stem pluripotente din măduva hematogenă. Acestea sunt accesibile şi oferă oportunitatea generării unei varietăţi de elemente sanguine sau macrofage pulmonare, în care se exprimă genele transferate.

Celulele stem infectate pot fi reintroduse la pacient prin transplant autolog. Celulele transplantate vor migra de la locul injectării

şi vor exprima produşii genei nou introduse.

Alte experimente s-au concentrat asupra terapiei genice în ficat. Bolile candidate pentru această modalitate de terapie sunt cele

în care defectul metabolic primar se găseşte la nivel hepatic (de exemplu, hipercolesterolemia, fenilcetonuria). Hepatocitele pot fi

obţinute prin hepatectomie parţială, după care sunt cultivate timp de câteva săptămâni, modificate genetic prin intermediul vectorilor

virali sau nonvirali şi apoi transplantate la animale. În urma unui astfel de experiment s-a observat că o parte din hepatocitele

modificate şi introduse la şoareci prin injectare intra-splenică, au migrat în parenchimul hepatic şi au continuat să exprime produşi

genici specifici acestuia timp de un an. În fibroza chistică s-a reuşit cu succes transferul de genă, prin intermediul unui vector retroviral, în pereţii unei artere. Se speră

ca în viitorul apropiat să se poată introduce gena chiar în epiteliul alveolar pulmonar, pentru a împiedica tulburările pulmonare din cadrul bolii.

În miodistrofia Duchenne, transferul de gene este deocamdată doar parţial rezolvat, pentru că gena pentru miodistrofină este foarte lungă şi deci, greu, deocamdată, de inserat într-un vector.

Deşi metodologia de tratament a bolilor genetice necesită încă perfecţionări, rezultatele actuale sunt încurajatoare, oferind speranţa că în următorii ani să putem asista la corectarea tuturor bolilor ereditare.