ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIBAKTERI EKSTRAK

DAUN LEILEM (Clerodendrum minahassae Teijsm. dan Binn.) SERTA

UJI AKTIVITAS EKSTRAK TERHADAP BEBERAPA BAKTERI

PATOGEN

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF ANTIBACTERIAL COMPOUNDS

FROM LEILEM LEAVES EXTRACT (Clerodendrum minahassae Teijsm.

and Binn.) AND THEIR INHIBITORY ACTIVITY TOWARD SEVERAL

PATHOGENIC BACTERIA

WIWIT ZURIATI UNO

SEKOLAH PASCASARJANA

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2017

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIBAKTERI EKSTRAK

DAUN LEILEM (Clerodendrum minahassae Teijsm. dan Binn.) SERTA

UJI AKTIVITAS EKSTRAK TERHADAP BEBERAPA BAKTERI

PATOGEN

Tesis

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar Magister

Program Studi

Magister Farmasi

Disusun dan diajukan oleh

WIWIT ZURIATI UNO

Kepada

SEKOLAH PASCASARJANA

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2017

PERNYATAAN KEASLIAN TESIS

Yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Wiwit Zuriati Uno

Nomor Mahasiswa : P2500215001

Program Studi : Sains

Fakultas : Farmasi

Menyatakan dengan sebenarnya bahwa tesis yang saya tulis ini benar

benar merupakan hasil karya saya sendiri, bukan merupakan

pengambilan tulisan atau pemilikan orang lain. Apabila dikemudian hari

terbukti atau dapat dibuktikan bahwa sebagian atau keseluruhan tesis ini

hasil karya orang lain, saya sendiri siap menerima sanksi atas perbuatan

tersebut.

Makassar, 20 Oktober 2017

Yang menyatakan

Wiwit Zuriati Uno

PRAKATA

Alhamdulillahirobbil’alamin, puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah

S.W.T atas segala rahmat dan hidayahNya sehingga penulis dapat

merampungkan penyusunan tesis dengan judul “Isolasi dan Identifikasi

Senyawa Antibakteri Ekstrak Daun Leilem (Clerodendrum minahassae

teijsm. Dan binn.) Serta Uji Aktivitas Ekstrak Terhadap Beberapa Bakteri

Patogen”. Penyusunan tesis ini merupakan salah satu syarat untuk

mencapai gelar Magister di Program Studi Farmasi Konsentrasi Farmasi

Sains di Universitas Hasanuddin Makassar.

Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan tesis ini masih

terdapat banyak kelemahan. Oleh karena itu, dengan kerendahan hati

penulis mengharapkan saran dan koreksi untuk melengkapi kelemahan

tersebut. Selain itu, penulis megucapkan terima kasih dan penghargaan

kepada Yth. Ibu Dr. Mufidah, S.Si., M.Si., Apt dan Yth. Ibu Dr. Herlina

Rante, S.Si., M.Si., Apt selaku Tim Komisi Penasehat Tesis yang telah

berkenan meluangkan waktu membimbing, memberikan arahan dan

masukan dalam penyusunan tesis ini hingga layak untuk disajikan. Penulis

juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan kepada:

1. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin.

2. Ketua Program Studi Pascarsarjana Farmasi Universitas Hasanuddin.

3. Ibu Dr. Hj. Sartini, M.Si., Apt., Bapak Subehan, M. Pharm. Sc., Ph. D.,

Apt., dan Ibu Prof. Dr. Hj. Asnah Marzuki, M.Si., Apt. atas masukan

dan saran selama menjadi Komisi Penguji.

4. Bapak/ Ibu dosen program studi Farmasi Pascasarjana Universitas

Hasanuddin Makassar.

5. Seluruh staf pegawai Program Studi Farmasi Program Pascasarjana

Universitas Hasanuddin Makassar.

6. Teman – teman angkatan 2015 Genome Pascasarjana Universitas

Hasanuddin Makassar atas segala bantuan dan semangatnya selama

menjalani pendidikan.

7. Semua pihak yang telah membantu yang tidak bisa penulis sebutkan

satu persatu.

Pada kesempatan ini penulis juga mengucapkan terimakasih yang

tak terhingga kepada Orangtua tercinta papa (Prof. Dr. H. Hamzah Uno,

M.Pd) dan mama (Dr. Hj. Nina Lamatenggo, M.Pd) yang menjadi sumber

inspirasi dan semangat yang senantiasa menyebut nama penulis disetiap

doa-doa beliau dan tak pernah lelah dengan doa dan restunya.

Terimakasih kepada adik-adikku tercinta Djamal Adi Nugroho Uno dan

Muammar Zaqi Uno, atas segala dukungan cinta, pertolongan, dan

motivasinya. Terimakasih untuk keluarga besar yang selalu memberikan

dukungan moril dan materil bagi penyusun selama menempuh

pendidikan. Kak marwah, kak abdi, kak lia, kak yayu dan kak ile atas ilmu

yang telah dibagi selama penelitian di laboratorium. Teman-teman dari

Gorontalo wawan, iya, nur, mamat, tiwi dan rezky atas semangat dan

kebersamaannya selama ini di tanah rantau, kebersamaan selama ini

takkan pernah terlupakan dan akan menjadi kenangan indah di masa

depan.

Penulis menyadari bahwa tesis ini tentunya masih jauh dari

kesempurnaan karena kesempurnaan hanyalah milik Allah AWT. Semoga

Allah SWT senantiasa melimpahkan berkat dan rahmat-Nya. Akhir kata

penulis berharap penelitian ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu

pengetahuan, khususnya dalam bidang mikrobiologi dan bahan alam,

sekarang maupun di masa yang akan datang.

Makassar, 20 Oktober 2017

Wiwit Zuriati Uno

ABSTRAK

WIWIT ZURIATI UNO. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Antibakteri Ekstrak

Daun Leilem (Clerodendrum minahassae Teijsm. dan Binn.) Serta Uji

Aktivitas Ekstrak Terhadap Beberapa Bakteri Patogen (Dibimbing oleh

Mufidah dan Herlina Rante)

Penelitian mengenai isolasi dan identifikasi senyawa antibakteri

ekstrak daun leilem serta uji aktivitas ekstrak terhadap beberapa bakteri

patogen telah dilakukan. Penelitian ini bertujuan mengisolasi senyawa

antibakteri dari ekstrak daun leilem terhadap beberapa bakteri uji.

Penelitian ini berdasarkan bioassay guided isolation dan aktivitas

antibakterinya diamati pada setiap tahap pengerjaannya. Karakterisasi

senyawa aktif antibakteri berdasarkan data spektroskopi UV-VIS, IR, dan

GC-MS.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak n-heksan, ekstrak etil

asetat, dan ekstrak etanol 70% daun leilem memiliki aktivitas antibakteri

terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922 dan Staphylococcus aureus

ATCC 25923. Ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antibakteri paling tinggi

dibandingkan dengan ekstrak lainnya. Ekstrak etil asetat difraksinasi

dengan KCV hasil menunjukkan bahwa fraksi B merupakan fraksi teraktif

sebagai antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922 dan

Staphylococcus aureus ATCC 25923 dengan diameter hambatan masing-

masing 11.83 mm dan 11.80 mm. Fraksi B dimurnikan dengan

kromatografi lapis tipis preparatif kemudian dilanjutkan dengan KLT 2

dimensi dan diperoleh satu isolat senyawa aktif antibakteri yaitu isolat

FB9. Hasil pengujian dengan metode difusi agar terhadap bakteri Isolat

FB9 menghambat bakteri Escherichia coli ATCC 25922 dengan daerah

hambatan 11.85 mm dengan spot Rf 0.8 menunjukkan zona hambatan.

Isolat FB9 diduga senyawa golongan alkaloid. Karakterisasi dengan

spektrofotometer UV-VIS terhadap isolat FB9 diperoleh serapan

maksimum 274 nm. Karakterisasi dengan spektrofotometer inframerah

terhadap isolat FB9 menunjukkan adanya gugus C-H, N-H, C=C dan C-N.

Karakterisasi dengan GC-MS menunjukkan berat molekul senyawa yang

diisolasi sebesar 83 g/mol.

Kata kunci : Isolasi dan Identifikasi, senyawa antibakteri, Ekstrak Daun

Leilem, Clerodendrum minahassae Teijsm. dan Binn.

ABSTRACT

WIWIT ZURIATI UNO. Isolation and identification of antibacterial

compounds from Leilem leaves extract (Clerodendrum minahassae

Teijsm. And Binn.) and their inhibitory activity toward several pathogenic

bacteria (Supervised by Mufidah and Herlina Rante)

A study about isolation and identification of antibacterial compounds

from Leilem leaves extract and their inhibitory activity toward several

pathogenic bacteria has been conducted. This study aimed to isolate

antibacterial compounds from Leilem leaves extract and to perform

inhibitory activity test against some pathogenic bacteria. The study was

based on the bioassay-guided isolation, while antibacterial potency was

observed in every processing step. The active compound obtained was

characterized using several instruments such as UV-Vis, IR and GC-MS

spectroscopy.

The result showed that n-hexane, ethyl acetate, and ethanol extract

of Leilem leaves inhibited the growth of Escherichia coli ATCC 25922 and

Staphylococcus aureus ATCC 25923 and the best performance was

exhibited by ethyl acetate extract. Further fractionation of ethyl acetate

extract utilizing KCV method obtained an active fraction “fraction B” which

potentially inhibited the growth of both Escherichia coli ATCC 25922 and

Staphylococcus aureus ATCC 25923 with inhibitory zone were 11.83 mm

and 11.80 mm respectively, determined by agar diffusion method.

Subsequently, fraction B was further fractionated by 2-dimentional TLC to

generate isolated compound “FB9”. The isolated compound was likely an

alkaloid that absorbed UV light at 274 nm, consisted of N-H, C-H, C=C

and C-N bonds, and its molecular weight was 83 g/mol. Inhibitory

evaluation toward Escherichia coli ATCC 25922 using agar diffusion

method (diameter of inhibitory zone was 11.85 mm) indicated that the

isolated compound potentially to be used as antibacterial.

Keywords: Isolation and identification, antibacterial compound, Leilem

leave extract, Clerodendrum minahassae Teijsm. and Binn.

DAFTAR ISI

Halaman

SAMPUL i

HALAMAN JUDUL ii

LEMBAR PENGESAHAN iii

PERNYATAAN KEASLIAN TESIS iv

PRAKATA v

ABSTRAK viii

ABSTRACT ix

DAFTAR ISI x

DAFTAR TABEL xiii

DAFTAR GAMBAR xiv

DAFTAR LAMPIRAN xvi

BAB I PENDAHULUAN 1

A. Latar belakang 1

B. Rumusan masalah. 3

C. Tujuan penelitian 4

D. Manfaat penelitian 4

BAB II TINJAUANPUSTAKA 5

A. Uraian Tumbuhan Leilem (Clerodendrum minahassae

Teijsm. Dan Binn.) 5

B. Ekstraksi dan Isolasi Komponen Kimia 11

C. Antimikroba 22

D. Metode Uji Antimikroba 26

E. Uraian bakteri Uji 30

F. Kerangka teori 32

G. Kerangka konsep 33

H. Hipotesis 33

BAB III Metode Penelitian 34

A. Rencana Penelitian 34

B. Lokasi dan Waktu Penelitian 34

C. Alat dan bahan 34

D. Cara Kerja 35

1. Pengambilan dan Pengolahan Sampel 35

2. Penyiapan Ekstrak 35

3. Skrining Komponen Senyawa 36

4. Sterilisasi Alat 37

5. Penyiapan bakteri Uji 38

6. Larutan Standar Mc Farland 0,5 38

7. Pembuatan Suspensi Bakteri 38

8. Pembuatan Medium 38

9. Uji Aktivitas Antibakteri Metode Difusi Agar 39

10. Fraksinasi dengan Kromatografi Cair Vakum 39

11. KLT-Bioautografi 39

12. Pemurnian Senyawa Aktif 40

13. Uji Aktivitas Ekstrak, Fraksi, dan Isolat 41

14. Karakterisasi Senyawa 41

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 44

A. Pengolahan Sampel dan Penyiapan Ekstrak 44

B. Identifikasi Komponen Senyawa pada Ekstrak 47

C. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak dengan Metode Difusi Agar 51

D. Fraksinasi dengan Kromatografi Cair vakum serta Uji Aktivitas Antibakteri pada Fraksi 56 1. Kromatografi Cair Vakum 56

2. Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi dengan Metode Difusi Agar 57

3. KLT-Bioautografi pada Fraksi 59

E. KLT-Preparatif 60

1. Hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif dan Uji Aktivitas Subfraksi B dengan Metode Difusi agar 61

2. KLT Bio-autografi Isolat FB9 64

F. KLT- 2 Dimensi 64

G. Uji Aktivitas Ekstrak Etil asetat, Fraksi Aktif B, dan isolat Aktif

FB9 65

H. Karakterisasi Isolat FB9 68

1. Spektoskopi UV-VIS 68

2. Spektroskopi IR 69

3. GC-MS 70

4. Reagen Kimia 73

BAB V PENUTUP 74

A. Kesimpulan 74

B. Saran 75

DAFTAR PUSTAKA 76

LAMPIRAN 82

DAFTAR TABEL

Nomor Halaman

1. Senyawa fenolik yang diisolasi dari genus Clerodendrum 8

2. Flavonoid yang diisolasi dari genus Clerodendrum 9

3. Senyawa terpen yang diisolasi dari genus Clerodendrum 10

4. Hasil ekstrak Clerodendrum minahassae 46

5. Hasil Identifikasi Komponen Senyawa Ekstrak n-Heksan ekstrak etil asetat, dan ekstrak etanol 70% Daun

Leilem 48

6. Hasil Uji Aktivitas Ekstrak Clerodendrum minahassae 53

7. Hasil kromatografi kolom cair vakum dari ekstrak etil asetat

Clerodendrum minahassae 56

8. Hasil pengujian antibakteri fraksi dari ekstrak etil asetat

Clerodendrum minahassae 57

9. Hasil KLT-Preparatif subfraksi B ekstrak etil asetat

Clerodendrum minahassae serta pengujian antibakteri 62

10. Hasil pengujian antibakteri ekstrak etil asetat, fraksi B, dan

Isolat FB9 66

11. Data spektrum UV-VIS Isolat FB9 68

12. Data spektrum IR Isolat FB9 Clerodendrum minahassae 69

13. Hasil analisis GC-MS komposisi Isolat FB9 71

DAFTAR GAMBAR

Nomor Halaman

1. Tumbuhan Leilem (Clerodendrum minahassae) 5

2. Clerodendrum inerme 6

3. Clerodendrum phlomidis 6

4. Clerodendrum serratum (L.) Moon 6

5. Visualisasi profil KLT 47

6. Hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak Clerodendrum

minahassae 53

7. Profil KLT vial 1-19 56

8. Profil KLT Fraksi 1-5 (A-E) 57

9. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi 1-5 (A-E) etil

asetat Clerodendrum minahassae 58

10. Hasil Pengujian KLT-Bioautografi Fraksi B 60

11. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Isolat FB Clerodendrum

minahassae Teijsm. dan Binn. terhadap bakteri

Escherichia coli dan Staphylococcus aureus 62

12. Hasil pengujian KLT-Bioautografi isolat FB9 aktif pada bakteri

E.coli 64

13. Hasil KLT 2 Dimensi isolat FB9 Clerodendrum minahassae 65

14. Hasil Pengujian Aktivitas Ekstrak etil asetat, Fraksi B, dan

Isolat FB9 terhadap bakteri Escherichia coli 66

15. Data spektrum UV-VIS isolat FB9 Clerodendrum minahassae 68

16. Data spektrum IR isolat FB9 Clerodendrum minahassae 70

17. Data Kromatogram GC-MS 72

18. Spektrogram peak 23 72

19. Hasil identifikasi Komponen kimia isolat FB9 dengan pereaksi

semprot 73

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Halaman

1. Skema kerja 82

2. Uji Aktivitas Ekstrak Antibakteri Metode Difusi Agar 83

3. Uji Aktivitas Isolat dengan Metode Difusi Agar 84

4. Komposisi Medium NA 85

5. Hasil Determinasi Tumbuhan Leilem 86

6. Morfologi Leilem 89

7. Simplisia & Ekstrak Daun Leilem 90

8. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak menggunakan Metode Difusi agar 91

9. Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi (Clerodendrum minahassae) 92

10. KLT bioautografi fraksi Leilem (Clerodendrum minahassae) pada bakteri Escherichia coli 93

11. KLT bioautografi fraksi Leilem (Clerodendrum minahassae)

pada bakteri Staphylococcus aureus 94

12. KLTP fraksi 2 95

13. Uji Aktivitas Antibakteri Isolat FB 1-9 Clerodendrum minahassae 96

14. Data Spektrum UV-Vis Isolat FB9 97

15. Data Spektrum IR Isolat FB9 98

16. Uji Penegasan Isolat 99

17. Data Kromatogram GC-MS 100

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Penyakit infeksi merupakan salah satu masalah dalam bidang

kesehatan yang banyak diderita oleh masyarakat Indonesia sejak dahulu

yang dari waktu ke waktu terus berkembang. Menurut WHO, sebanyak 25

juta kematian di seluruh dunia pada tahun 2011, sepertiganya disebabkan

oleh penyakit infeksi (Dehgani et al., 2012). Penyakit infeksi yang banyak

diderita masyarakat disebabkan oleh beberapa bakteri diantaranya

Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella

thyphi, Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteriae, Vibrio choler,

Streptococcus mutans.

Pemberian antibiotik merupakan pengobatan yang utama dalam

penatalaksanaan penyakit infeksi. Manfaat penggunaan antibiotik tidak

perlu diragukan lagi, akan tetapi penggunaan yang berlebihan dapat

menyebabkan munculnya kuman yang resisten terhadap antibiotik,

sehingga manfaatnya akan berkurang. Kuman-kuman yang resisten

terhadap antibiotik telah menjadi masalah kesehatan yang sangat besar.

Infeksi oleh kuman yang resisten terhadap antibiotik akan menyebabkan

meningkatnya angka kesakitan dan angka kematian sehingga diperlukan

pencarian sumber molekul bioaktif baru yang berpotensi sebagai

antibakteri (Riana, 2016).

Leilem (Clerodendrum minahassae Teijsm. Dan Binn.) adalah

salah satu spesies dari genus Clerodendrum. Genus Clerodendrum

banyak tersebar diseluruh dunia dan memiliki lebih dari 500 spesies.

Banyak dari genus ini digunakan sebagai obat tradisional dan sebagai

pengobatan secara turun temurun untuk mengobati berbagai macam

penyakit (Patel dan Shrivastava, 2007).

Leilem (Clerodendrum minahassae Teijsm. dan Binn.) merupakan

tumbuhan khas yang banyak tumbuh di daerah Minahasa yang tumbuh di

daerah yang ketinggiannya 0 sampai dengan 800 m di atas permukaan

laut. Masyarakat Minahasa umumnya memanfaatkan daun leilem sebagai

bumbu masakan dan digunakan untuk mengobati penyakit seperti sakit

perut, kecacingan dan penyakit paru-paru. Kandungan kimia yang

terkandung didalam daun leilem antara lain flavonoid, terpenoid dan

steroid, dan alkaloid. (Patel dan Shrivastava, 2007 ; Sangi dkk., 2008).

Berdasarkan pendekatan etnofarmakologi diketahui bahwa genus

Clerodendrum memiliki berbagai peranan penting dalam perkembangan

pengobatan diantaranya sebagai anti inflamasi, antidiabetes dan

antibakteri (Patel & Shrivastava, 2007). Namun penelitian tentang daun

leilem yang merupakan salah satu genus Clerodendrum masih sangat

terbatas. Senyawa fenolik yang ada pada daun leilem merupakan jenis

polifenol dengan aktivitas antioksidan yang berpotensi sebagai terminator

radikal bebas (Emor, 2006). Adam dkk. (2013) melaporkan bahwa ekstrak

metanol daun leilem memiliki aktivitas antioksidan berkisar antara 64,83 -

70,12 %. Bontjura dkk., (2015) meneliti bahwa senyawa fenol dalam

ekstrak daun leilem memiliki efek antibakteri terhadap bakteri

Streptococcus mutans. Daun leilem dapat menghambat pertumbuhan

bakteri Escherichia coli pada konsentrasi 5 %, 10 % dan 15 % karena

flavonoid yang terdapat di dalamnya dapat merusak membran sel bakteri

(Lomboan, 2015).

Berdasarkan hal tersebut perlu dilakukan penelitian tentang isolasi

senyawa aktif antibakteri dari ekstrak Clerodendrum minahassae Teijsm.

dan Binn.

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan diatas, maka

rumusan masalah dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Apakah ekstrak daun Clerodendrum minahassae Teijsm. dan Binn.

memiliki aktivitas antibakteri?

2. Seberapa besar aktivitas antibakteri senyawa yang diisolasi dari

ekstrak daun Clerodendrum minahassae Teijsm. dan Binn. ?

3. Bagaimana karakteristik senyawa aktif antibakteri yang diisolasi dari

ekstrak daun Clerodendrum minahassae Teijsm. dan Binn?

C. Tujuan Penelitian

Berdasarkan rumusan masalah maka tujuan penelitian ini adalah:

1. Mengetahui aktivitas antibakteri dari ekstrak daun Clerodendrum

minahassae Teijsm. dan Binn.

2. Mengetahui aktivitas antibakteri senyawa aktif yang diisolasi dari

ekstrak daun Clerodendrum minahassae Teijsm. dan Binn. terhadap

bakteri

3. Menentukan karakteristik senyawa aktif antimikroba dari ekstrak daun

Clerodendrum minahassae Teijsm. dan Binn. Terhadap beberapa

mikroba uji

D. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetahuan

terutama dibidang mikrobiologi dan eksplorasi bahan obat alami untuk

pengembangan obat tradisional Indonesia menjadi sediaan fitofarmaka,

khususnya obat yang berkhasiat sebagai antibakteri di masa yang akan

datang.

Secara khusus penelitian ini diharapkan diperoleh senyawa yang

memiliki aktivitas antibakteri yang dapat dikembangkan di masa yang akan

datang.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Uraian Tumbuhan

1. Uraian Tumbuhan Leilem (Clerodendrum minahassae Teijsm. dan

Binn.)

Gambar 1. Tumbuhan Leilem (Clerodendrum minahassae)

Leilem (Clerodendrum minahassae) merupakan tanaman yang

banyak tumbuh di Sulawesi Utara. Daun leilem mudah ditemui di

pekarangan rumah karena sangat digemari oleh masyarakat sekitarnya.

Masyarakat Minahasa umumnya memanfaatkan daun leilem sebagai

sayuran serta bumbu masakan dan juga digunakan untuk mengobati

penyakit seperti sakit perut, kecacingan dan penyakit paru-paru.

Beberapa spesies lain dari genus Clerodendrum yang bisa ditemui di

berbagai dunia dapat dilihat pada gambar ini.

Gambar 2. Clerodendrum inerme (Patel dan Shrivastava, 2007)

Gambar 3. Clerodendrum phlomidis (Patel dan Shrivastava, 2007)

Gambar 4. Clerodendrum serratum (L.) Moon (Indriani, 2007)

2. Klasifikasi Tanaman (Gembong, 1994)

Kerajaan : Plantae

Kelas : Equisetopsida

Bangsa : Lamiales

Keluarga : Lamiaceae

Marga : Clerodendrum

Jenis : Clerodendrum minahassae Teijsm. dan Binn.

3. Nama Daerah

Leilem (Minahasa-Sulawesi Utara), deilem (Bali) dan silakurung (Sulawesi

Selatan) (Palobo dkk., 2012).

4. Morfologi Tumbuhan

Ketinggian tanaman leilem rata – rata mencapai 2 meter. Bentuk daunnya

bundar telur, berwarna hijau tua mengkilap, rasanya agak sepat dan sedikit pahit.

Kelopak berwarna putih, berjumlah 5. Benang sari berwarna kemerahan,

umumnya tumbuh di semak dan hutan sekunder di pulau Sulawesi, Indonesia

(Jarret, 2003).

5. Kandungan Kimia

Kandungan kimia yang terkandung dalam leilem antara lain fenol,

flavonoid, terpenoid, steroid, alkaloid dan flavonoid (Patel dan Shrivastava, 2007;

Sangi dkk., 2008).

Beberapa kandungan senyawa dari spesies yang berbeda dengan genus

clerodendrum yang diisolasi diantaranya:

Tabel 1. Senyawa fenolik yang diisolasi dari genus Clerodendrum.

Spesies Senyawa Bagian tanaman

C. aculeatum Cistanoside D, acteoside Seluruh tanaman

C. bungei Asam anisat, asam vanilat,

maltol, acteoside,

leucosceptoside A, isoacteoside,

jinoside

Seluruh tanaman

C. calmitosum Senyawa – senyawa kerabat

pheophorbide

Seluruh tanaman

C.

cryptophyllum

Senyawa – senyawa kerabat

pheophorbide

Seluruh tanaman

C. fragrans Acteoside, leucosceptoside A,

isoacteoside, ester metil dan etil

dari asam kafeat, jnoside

Seluruh tanaman

C. grayi Lucumin, prunasin Seluruh tanaman

C. inerme (3-metoksi-4-hidroksil fenil) etil-

O-2”, 3” –diasetil-a-L-

rhanopiranosil-(1-3)-4-O-(E)-

fernloil-β-D-glukuropiranosida,

verbacosida, isoverbacosida,

Neolignans (I - III)

Seluruh tanaman

C. indicum Cleroindicin A-F Bagian yang berada di

udara/di atas tanah

C. infortunatum Acteoside, asam fumarat, ester

metil dan etil dari asam kafeat

Seluruh tanaman, bunga

C. myricoides Myricoide, acteoside Akar

C. trichotomum Kusagenin, indolizino[8,7 –β]

indole 5-asam karboksilat,

acteoside, isomer acteoside,

leucosceptoside A, martynosida,

isomartynosida, isoacteosida,

jinosida, trichotomoside.

Seluruh tanaman

(Sumber: Patel dan Shrivastava, 2007).

Tabel 2. Flavonoid yang diisolasi dari genus Clerodendrum

Spesies Senyawa Bagian tanaman

C. fragrans Kaempferol Daun

C. indicum Hispidulin, scutellarein, scutellarein-

7-O-β-D-glucuronide

Bunga

C. inerme Apigenin, acacetin, cosmosin,

luteolin, cynaroside, salvigenin,

5-hydroxy-4’-7-dimethoxy-6-flavone,

5-hydroxy-4’-7-

dimethoxy flavone, 4’-

methylscutellarein

Bagian yang

berada di atas

tanah (aerial),

batang, daun

C. infortunatum Apigenin, acacetin and methyl esters

of acacetin-7-O-

glucuronide, cabruvin, quercetin,

scutellarein, scutellarein-7-

O, D-glucuronide, Hispidulin

Apigenin, acacetin dan ester metil

dari acacetin-7-O-

glucuronide, cabruvin, quercetin,

scutellarein, scutellarein-7-

O-β-D-glucuronide, Hispidulin

Bunga, akar

C.mandarinoru

m

Cirsimartin, cirsimartin 4’-glucoside,

quercetin-3-methyl ether

Akar

C.nerrifolium Cleroflavone Daun

C. petasites Hispidulin Bunga

C. phlomidis Apigenin, pectolinerngenin,

chalconeglucoside, 2’-4-4’-

trihydroxy-6’-methylchalcone, 7-

hydroxyflavanone, suatu β -D-

glukosida dari 7-hydroxyflavanone,

naringin-4’-O-α-glucopyranoside

Bunga, daun,

seluruh tanaman

C.siphonenthus Pectolinerngenin Bunga

C.tomentosum 5-hydroxy-4’-7-dimethoxy flavone Batang

C. trichotomum Apigenin Seluruh bagian

tanaman

(Sumber: Patel dan Shrivastava, 2007).

Tabel 3. Senyawa terpen yang diisolasi dari genus Clerodendrum Spesies Senyawa Bagian tanaman

C. chinense Monomelittoside, melittoside,

harpagide, 5-O-β-glucopyranosyl-

harpagide, 8-O-acetylharpagide

Bagian yang berada di

atas tanah (aerial)

C.colebrookianum Triacatane, clerodin, clerodendrin A Seluruh bagian tanaman

C. incisum 8-O-foliamenthoyleuphroside, 2’-O,8-

O-difoliameuthoyleuphroside,

plantarenaloside, euphroside

Seluruh bagian tanaman

C. inerme α dan β-amyrin, royleanone

dehydroroyleanone, caryoptin, 3-

epicaryoptin, 14,15-dihydro-15β-

methoxy-3-epicaryoptin, clerodermic

acid, glutinol, gramisterol, senyawa

Iridoid seperti (inerminoside A-1, B,

C,D), clerodendrins (A-H),

clerodendrin B acetate,

monomelittoside, inermes A, B,

sammangaoside A-C,

betulin, clerodermic acid

Daun, bagian yang

berada di atas tanah

C. mandarinorum Friedelanone, lupeol, asam betulinat Akar

C. neriifolium (-)-Hardwickic acid Daun

C. paniculatum Triacatane, clerodin, clerodendrin A,

3β-acetyloleanolic acid, 3 β

acetyloleanolic aldehyde, glutinol

Daun

C. phlomidis Triacatane, clerodin, clerodendrin A Seluruh bagian tanaman

C. serratum Queretaroic acid, serratagenic acid Seluruh bagian tanaman

C. siphonenthus Unicinatone Akar

C. thomsonae Monomelittoside, melittoside,

harpagide, 5-O-β-glucopyranosyl-

harpagide, 8-O-acetylharpagide,

aucubin, reptoside, ajugoside, 8-

O-acetylmioporoside

Bagian yang berada di

atas tanah

C. trichotomum Clerodendrins (A-H) Seluruh bagian tanaman

C. ugandenese Ugandoside Daun

C. uncinatum Unicinatone Akar

C. wildii Mi-saponin A Akar

(Sumber: Patel dan Shrivastava, 2007).

6. Khasiat Daun

Daun Leilem digunakan untuk mengobati sakit perut, cacingan,

antiinflamasi, antimikroba, antioksidan dan antidiabetes (Arini dan Kinho, 2015 ;

Patel dan Shrivastava, 2007).

Beberapa spesis dari genus ini seperti Clerodendrum inderme, C.

thomosonae, C. indicum, dan C. speciosum, merupakan tanaman -tanaman hias

dan dibiakkan dengan tujuan estetik. Bentuk serbuk/pasta dari dan berbagai

ekstrak dari akar, batang, dan daun telah dilaporkan digunakan sebagai obat

untuk terapi asma, piretikosis, katarak, malaria dan penyakit - penyakit darah,

kulit dan paru. Senyawa kimia terbanyak yang dilaporkan dari genus ini adalah

senyawa - senyawa fenolik, steroid, di – dan triterpene, flavonoid, minyak

menguap.

B. Ekstraksi dan Isolasi Komponen Kimia

1. Ekstraksi

Proses untuk mendapatkan ekstrak disebut ekstraksi, merupakan

penyarian zat berkhasiat atau zat aktif dari bagian tanaman obat, hewan

dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut (Dirjen POM, 1986).

Ekstraksi adalah penyarian zat-zat aktif dari bagian tanaman obat.

Proses pengekstraksian komponen kimia dalam sel tanaman yaitu pelarut

organik akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang

mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dalam pelarut organik di luar sel,

maka larutan terpekat akan berdifusi keluar sel dan proses ini akan

berulang terus sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi cairan zat

aktif di dalam dan di luar sel.

a. Tujuan Ekstraksi

Tujuan ekstraksi adalah untuk menarik semua komponen kimia

yang terdapat dalam simplisia. Ekstraksi ini didasarkan pada perpindahan

massa komponen zat padat ke dalam pelarut dimana perpindahan mulai

terjadi pada lapisan antar muka, kemudian berdifusi masuk ke dalam

pelarut (Adrian, 2000).

b. Jenis-Jenis Ekstraksi

Proses ekstraksi dapat dilakukan secara panas dan secara

dingin.Ekstraksi secara dingin yaitu dengan metode maserasi, metode

perkolasi, dan metode sokletasi, sedangkan ekstraksi secara panas yaitu

dengan menggunakan metode infudasi, metode refluks dan destilasi uap

air.

c. Ekstraksi Secara Maserasi

Salah satu metode ekstraksi yang digunakan yaitu maserasi.

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan

dengan cara memasukkan 10 bagian simplisia dengan derajat halus yang

cocok ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan cairan penyari 75

bagian, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil

sesekali diaduk (Dirjen POM, 1986)

Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam

cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk

kedalam rongga sel yang mengandung zat aktif, isi sel akan larut karena

adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel

dengan di luar sel. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang

mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Cairan

penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air dan etanol atau

pelarut lain.

Maserasi memiliki kelebihan dan kekurangan. Kelebihan metode ini

relatif sederhana, yaitu dapat menghindari rusaknya komponen senyawa

akibat panas, tidak memerlukan alat-alat rumit, relatif mudah dan murah.

Kelemahan metode ini diantaranya waktu yang diperlukan relatif lama dan

penggunaan pelarut yang tidak efektif dan efisien (Pebriyanthi dan Nidia,

2010).

d. Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan bentuk kering, kental atau cair yang dibuat

dengan cara mengambil sari (menyari) simplisia menurut cara yang cocok,

diluar pengaruh cahaya matahari langsung. Sebagai cairan penyari

digunakan air, etanol, atau campuran etanol dan air (BPOM RI., 2011).

Ekstrak terbagi atas tiga yakni ekstrak cair, ekstrak kental dan

ekstrak kering. Ekstrak cair biasanya memiliki kadar air lebih dari 30 %,

ekstrak kental memiliki kadar air antara 5-30 % dan ekstrak kering

memiliki kadar air kurang dari 5 % (Voight, 1994).

2. Metode Pemisahan

Pemisahan kandungan tumbuhan dapat dilakukan dengan menggunakan

teknik kromatografi. Pemisahan teknik kromatografi bergantung pada sifat

kelarutan senyawa yang akan dipisah (Sudjadi, 1988).

Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk teknik pemisahan

tertentu. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase yaitu

fase diam dan fase gerak. Pemisahan-pemisahan ini bergantung pada gerakan

relatif dari dua fase ini. Prinsip dari pemisahan adalah adanya perbedaan sifat

fisik dan kimia dari senyawa yaitu kecenderungan dari molekul untuk melarut

dalam cairan (kelarutan), kecenderungan molekul untuk menguap (keatsirian),

kecenderungan mungkin molekul untuk melekat pada permukaan (adsorpsi,

penjerapan) (Sastrohamidjojo, 2007).

a. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode kromatografi cair yang

paling sederhana, pengunannya meluas dan diakui merupakan cara pemisahan

yang baik, khususnya untuk kegunaan analisis kualitatif KLT dapat digunakan

untuk memisahkan berbagai senyawa seperti ion-ion anorganik, kompleks

senyawa-senyawa organik dan anorganik, dan senyawa-senyawa organik baik

yang terdapat di alam dan senyawa-senyawa organik sintetik (Gritter, 1991 ;

Adnan, 1997).

Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis ialah karena dapat

dihasilkan pemisahan yang lebih sempurna, kepekaan yang lebih tinggi, cepat

dan mudah dengan menggunakan peralatan yang sederhana dan dapat

dilaksanakan lebih cepat. Kromatografi ini mengunakan lempeng kaca atau

plastik yang dilapisi dengan adsorben berupa serbuk halus dengan ketebalan

0,1-0,25 mm (Gritter, 1991), (Sastrohamidjojo, 2007). Dalam semua teknik

kromatografi, zat-zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom, dan

tentu saja dasar pemisahan terletak dalam laju perpindahan sebuah zat terlarut

sebagai hasil dua faktor, yang satu cenderung menggerakkan zat terlarut itu, dan

yang lain menahannya (Day dan Underwood, 2002).

Prinsip penampakan noda pada lempeng kromatorafi melalui tiga

cara yaitu: Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan

sampel akan tampak berwarna gelap.Penampakan noda pada lampu UV

254 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan

indikator fluoresensi yang terdapat pada lempeng. Fluoresensi cahaya

yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen

tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke

tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali keadaan semula sambil

melepaskan energi.

Pada UV 366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng akan

berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 366 nm adalah

karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor

yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda tersebut. Fluoresensi

cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh

komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi

dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan

semula sambil melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada

lampu UV 366 nm terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak

berfluororesensi pada sinar UV 366 nm (Sumarno, 2001 ; Qadri, 2010).

Prinsip penampakan noda pereaksi semprot H2SO4 10% adalah

berdasarkan kemampuan asam sulfat yang bersifat reduktor dalam

merusak gugus kromofor dari zat aktif simplisia sehingga panjang

gelombangnya akan bergeser ke arah yang lebih panjang (UV menjadi

VIS) sehingga noda menjadi tampak oleh mata (Sthal, 2001).

Harga Rf ( Retension Factor)

Perpindahan komponen atau senyawa pada kromatografi ini tergantung

pada jenis pelarut, zat penyerap dan sifat daya serapnya terhadap masing-

masing komponen.Komponen yang larut terbawa oleh fase gerak (cairan

pengelusi) melalui adsorben (fase diam) dengan kecepatan perpindahan yang

berbeda. Perbedaan kecepatan ini dinyatakan dengan Rf (faktor retensi), yaitu

perbandingan jarak yang ditempuh oleh senyawa terlarut dan jarak yang

ditempuh oleh pelarut (Hostetmann, 1985), (Sastrohamidjojo, 2001).

Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis

lebih baik dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi warna.

Lazimnya identifikasi menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf

dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas.

Dapat didefenisikan sbb :

Faktor-faktor yang memepengaruhi gerakan noda dalam

kromatografi lapis tipis yang juga mempengaruhi harga Rf :

1). Struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan

2). Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya

3). Tebal keraataan dari lapisan penyerap

4). Pelarut (dan derajat kemurniannya) fasa gerak

5). Derajat kejenuhan dari uap

6). Jumlah cuplikan yang digunakan

7). Suhu

8). Kesetimbangan

9). Teknik percobaan (Hostetmann, 1985).

b. Fraksinasi

Fraksinasi merupakan prosedur pemisahan yang bertujuan

memisahkan golongan utama kandungan yang satu dari kandungan yang

lain. Senyawa yang bersifat polar akan masuk ke pelarut polar dan

senyawa non polar akan masuk ke pelarut non polar (Harborne, 1987)

Metode fraksinasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah

menggunakan kromatografi kolom. Kolom diisi dengan penyerap padat

sebagai fase tetap dan dialiri dengan pelarut sebagai fase gerak. Cuplikan

yang akan difraksi dimasukan ke dalam kolom dan dialiri fase gerak yang

akan membentuk jalur-jalur serapan dari senyawa. Bila pelarut dibiarkan

mengalir melalui kolom, ia akan mengangkut senyawa-senyawa yang

merupakan komponen-komponen dari campuran. Pemisahan komponen

suatu campuran tergantung pada tingkat kepolaran dari fase gerak dan

senyawa yang terkandung dalam campuran tersebut (Sastrohamidjojo,

2004). Kromatografi kolom yang digunakan dalam fraksinasi ini adalah

kromatografi kolom cair vakum (KCV). Metode ini merupakan modifikasi

dari kromatografi kolom gravitasi dengan menambahkan vakum (penarik

udara) pada bawah kolom. Dapat digunakan untuk fraksinasi atau

memurnikan fraksi (Muhtadi, 2008).

Kromatografi cair vakum (KCV) pertama kali diperkenalkan oleh

para ilmuwan dari Australia untuk mengatasi lamanya waktu yang

dibutuhkan untuk separasi menggunakan kolom kromatografi klasik. Pada

dasarnya metode ini adalah kromatografi lapis tipis preparatif yang

berbentuk kolom. Aliran fase gerak dalam metode ini diaktifkan dengan

bantuan kondisi vakum (Coll and Bowden, 1986). Kromatografi cair vakum

pada awalnya digunakan untuk separasi senyawaan steroid dan produk-

produk natural dari laut (Targett et al., 1979).

Kromatografi cair vakum terdiri dari suatu corong Buchner yang

memiliki kaca masir. Corong Buchner ini diiisi dengan fase diam yang

tingkat kehalusannya seperti yang umumnya dipakai dalam kromatografi

lapis tipis (70-230 mesh). Corong Buchner yang berisi fase diam ini

digunakan dalam kondisi vakum/bertekanan, yang berakibat pada

kemampuan yang dihasilkan oleh kromatografi cair vakum akan sama

dengan kromatografi gravitasi namun diperlukan waktu yang lebih singkat

(Targett et al., 1979). Cara asli yang diperkenalkan oleh Coll

menggunakan corong Buchner kaca masir atau kolom pendek, sedangkan

Targett menggunakan kolom yang lebih panjang untuk meningkatkan

daya pisah (Hostettman et al., 1986).

Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar

diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang

kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan

lagi. Kolom dihisap sampai kering dan sekarang siap dipakai. Cuplikan,

dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada bagian

atas kolom atau pada lapisan prapenjerap dan dihisap perlahan-lahan ke

dalam kemasan dengan memvakumkannya. Kolom, dielusi dengan

campuran pelarut yang cocok, mulai dengan pelarut yang kepolarannya

rendah lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan, kolom dihisap sampai

kering pada setiap pengumpulan fraksi. Berbeda dengan metode yang

menggunakan tekanan pada bagian atas kolom untuk meningkatkan laju

aliran, mengotakatik kolom (mengubah pelarut dan sebagainya) mudah

karena kepala kolom berada dalam tekanan atmosfer (Hostettman et al.,

1986).

Fasa diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang digunakan

dalam KCV. Proses penyiapan fasa diam dalam kolom terbagi menjadi

dua macam, yaitu:

a. Cara Basah

Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan

melarutkan fasa diam dalam fase gerak yang akan digunakan. Campuran

kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan dibuat merata. Fase gerak

dibiarkan mengalir hingga terbentuk lapisan fase diam yang tetap dan

rata, kemudian aliran dihentikan (Sarker et al., 2006).

b. Cara kering

Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan cara

memasukkan fase diam yang digunakan ke dalam kolom kromatografi.

Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi dengan pelarut yang akan

digunakan (Sarker et al., 2006).

Preparasi sampel saat akan dielusi dengan KCV juga memiliki

berbagai metode seperti preparasi fasa diam. Metode tersebut yaitu cara

basah dan cara kering (Canell, 1998). Preparasi sampel cara basah

dilakukan dengan melarutkan sampel dalam pelarut yang akan digunakan

sebagai fasa gerak dalam KCV. Larutan dimasukkan dalam kolom

kromatografi yang telah terisi fasa diam. Bagian atas dari sampel ditutupi

kembali dengan fasa diam yang sama. Sedangkan cara kering dilakukan

dengan mencampurkan sampel dengan sebagian kecil fase diam yang

akan digunakan hingga terbentuk serbuk. Campuran tersebut diletakkan

dalam kolom yang telah terisi dengan fasa diam dan ditutup kembali

dengan fase diam yang sama (Canell, 1998; Sarker et al., 2006).

c. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Kromatografi lapis tipis preparatif adalah cara yang ideal untuk

pemisahan cuplikan kecil (50 mg sampai 1 g) dari senyawa. Tebal lapisan

adsorben dibuat sekitar 0,5-2 cm, ukuran pelat kromatografi biasanya 20x20 cm

atau 20x40 cm, setelah adsorben dilapiskan, pelat harus dikeringkan pada suhu

kamar sebelum diaktifkan, untuk mencegah keretakan pada lapisan absorben

(Gritter, 1991 ; Hostetmann, 1985).

Pada KLT preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa

garis pada salah satu sisi pelat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak

lurus pada cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita.

Pita yang kedudukannya telah diketahui melalui KLT, dikerok dari pelat dengan

menggunakan spatula. Hasil kerokan tersebut dikumpulkan diatas corong

dengan kertas filter. Kemudian diekstrak dengan pelarut, yang polaritasnya

cukup untuk melarutkan secara kuantitatif. KLT preparatif harus dikerjakan

secepat mungkin untuk tidak terjadi kerusakan pada masing-masing komponen

penyusun (Gritter, 1991 ; Adnan, 1997).

Penampakan pita yang mengandung cuplikan pada KLT Preparatif dapat

dilakukan dengan menggunakan sinar UV dan pereaksi semprot (Adnan, 1997).

3. Metode Identifikasi

Pada identifikasi suatu kandungan bahan alam, setelah kandungan itu diisolasi

dan dimurnikan, pertama-tama harus ditentukan dahulu golongannya kemudian

barulah ditentukan jenis senyawa dalam golongan tersebut. Golongan senyawa

biasanya dapat ditentukan dengan uji warna, penentuan kelarutan, bilangan Rf,

dan ciri spektrum UV, IR, dan GC-MS. Identifikasi lengkap dalam golongan

senyawa bergantung pada pengukuran sifat atau ciri lain, yang kemudian akan

dibandingkan dengan data dalam pustaka (Harbone, 1987).

C. Antimikroba

1. Pengertian Antimikroba

Bahan-bahan atau obat-obatan yang digunakan untuk

memberantas infeksi mikroba pada manusia termasuk diantaranya

antibiotika, antiseptika, desinfektan, dan preservatif.

Obat-obat yang digunakan untuk membasmi mikroorganisme yang

menyebabkan infeksi pada manusia, hewan, ataupun tumbuhan harus

bersifat toksisitas selektif artinya obat atau zat tersebut harus bersifat

toksik terhadap mikroorganisme penyebab penyakit tetapi relatif tidak

toksik terhadap jasad inang atau hospes (Djide dan Sartini, 2008).

2. Sifat Antimikroba

Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antimikroba yang bersifat

menghambat pertumbuhan mikroba, dikenal sebagai aktivitas

bakteriostatik dan ada yang bersifat membunuh mikroba, dikenal sebagai

aktivitas bakterisid.

a. Bakteriostatik

Zat atau bahan yang dapat menghambat atau menghentikan

pertumbuhan mikroorganusme (bakteri). Dalam keadaan seperti ini jumlah

mikroorganisme menjadi stasioner, tidak dapat lagi bermultiplikasi dan

berkembang biak. Contoh sulfonamida, tetrasiklin, kloramfenikol, dan

eritromisin.

b. Bakterisid

Zat atau bahan yang dapat membunuh mikroorganisme (bakteri).

Dalam hal ini jumlah mikroorganisme (bakteri) akan berkurang atau

bahkan akan habis, tidak dapat lagi melakukan multiplikasi atau

berkembang biak. Contoh penisilin, sefalosporin, dan neomisin (Djide dan

Sartini, 2008).

3. Prinsip Kerja Antimikroba

Antimikroba memperlihatkan toksisitas yang selektif, dimana

obatnya lebih toksik terhadap mikroorganismenya dibandingkan pada sel

hospes. Hal ini dapat terjadi karena pengaruh obat yang selektif terhadap

mikroorganisme atau karena obat pada reaksi-reaksi biokimia yang

penting dalam sel parasit lebih unggul dari pada pengaruhnya terhadap

hospes. Disamping itu struktur sel mikroorganisme berbeda dengan

struktur sel manusia (hospes, inang) (Djide dan sartini, 2008).

2. Mekanisme Antimikroba

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antimikroba dibagi dalam lima

kelompok, yaitu:

a. Mengganggu metabolisme sel mikroba.

Pada umumnya bakteri memerlukan para amino benzoic acid

(PABA) untuk mensintesis purin dan piriidin (prekursor DNA dan RNA),

bila asam folat tidak ada, sel-sel tidak dapat tumbuh atau membelah

(Mycek, 2001).

Antimikroba bekerja memblok terhadap metabolit spesifik mikroba,

seperti sulfonamida. Sulfonamida menghambat pertumbuhan sel dengan

menghambat sintesis asam folat, para amino benzoic acid (PABA), dan

bekerja secara kompetitif untuk enzim-enzim yang langsung

mempersatukan PABA dan sebagian pteridin menjadi asam dihidraptroat

(Djide dan Sartini, 2008).

b. Menghambat sintesis dinding sel mikroba.

Dinding sel mikroba secara kimia adalah peptidoglikan yaitu suatu

kompleks polimer mukopeptida (glikopeptida). Struktur dinding sel dapat

rusak dengan cara menghambat reaksi pembentukannya atau

mengubahnya setelah dinding sel tersebut selesai dibentuk.

Antimikroba ini dapat menghambat sintesis atau menghambat

aktivitas enzim seperti enzim transpeptidase yang dapat menimbulkan

kerusakan dinding sel yang berakibat sel mengalami lisis. Contohnya:

Basitrasin, Sefalosporin, Sikloserin, Penisilin, Vankomisin (Ganiswarna,

1995 dan Jawetz dkk., 2008).

c. Mengganggu permeabilitas membran sel mikroba.

Membran sitoplasma mempertahankan bahan-bahan tertentu

didalam sel dan mengatur aliran keluar masuknya bahan-bahan lain.

Membran sel memelihara integritas komponen-komponen seluler.

Kerusakan pada membran ini akan mengakibatkan menghambatnya

pertumbuhan sel atau matinya sel, akibatnya mikroba akan mati. Jika

fungsi integritas membran sitoplasma dirusak, dalam hal ini antimikroba

dapat berinteraksi dengan sterol sitoplasma pada jamur, dan merusak

membran sel bakteri gram negatif. Contohnya: Amfoterisin β, kolistin,

imidasol, polien, polimiksin (Ganiswarna, 1995 dan Jawetz dkk., 2008).

d. Menghambat sintesis protein sel mikroba.

Hidupnya suatu sel tergantung pada terpeliharanya molekul-

molekul dalam keadaan alamiah. Suatu kondisi atau substansi mengubah

keadaan ini yaitu mendenaturasi protein dengan merusak sel tanpa dapat

diperbaiki kembali. Suhu tinggi atau konsentrasi beberapa zat dapat

mengakibatkan koagulasi irreversibel komponen-komponen seluler yang

vital ini.

Antimikroba mempunyai fungsi pada ribosom pada mikroorganisme

yang menyebabkan sintesis protein terlambat. Dimana dapat berikatan

dengan ribosom 30S yang dapat menyebabkan akumulasi sintesis protein

awal yang kompleks, sehingga salah dalam menerjemahkan tanda mRNA

dan menghasilkan polipeptida yang abnormal. Selain itu juga dapat

berikatan dengan ribosom 50S yang dapat menghambat ikatan asam

amino baru pada rantai peptida yang memanjang. Contohnya:

aminoglikosida, kloramfenikol, tetrasiklin, eritromisin, dan linkomisin

(Ganiswarna, 1995).

e. Menghambat sintesis atau merusak asam nukleat sel mikroba.

DNA dan RNA merupakan suatu proses kehidupan sel yang sangat

penting. Hal ini berarti bahwa gangguan apapun yang terjadi pada

pembentukan atau pada fungsi zat-zat tersebut dapat mengakibatkan

kerusakan total pada sel. Dalam hal ini mempengaruhi metabolisme asam

nukleat, seperti berikatan dengan enzim DNA dependen RNA-polymerase

bakteri, memblokir helix DNA. Contoh: quinolon, pyrimethamin,

sulfonamida, trimethoprim, dan trimetrexat (Pelczar et al., 2008).

D. Metode Uji Antimikroba

Pengujian antimikroba merupakan teknik yang penting dalam ilmu

biologi modern. Hal ini dilakukan untuk menentukan resistensi strain

mikroba terhadap agen antimikroba yang berbeda, dalam penelitian

farmakologi dapat digunakan untuk menentukan sensitivitas antimikroba

baru dari ekstrak biologis terhadap mikroorganisme. Pengujia kerentanan

antimikroba juga digunakan untuk menyaring ekstrak tanaman yang

memiliki aktivitas antimikroba (Das dkk., 2010). Menurut pratiwi 2008,

terdapat beberapa metode pengujian antimikroba, yaitu:

a. Metode Difusi

Metode difusi agar merupakan uji antimikroba yang banyak

digunakan hingga saat ini, metode ini telah dijelaskan oleh Bauer, Kirby,

Sherris dan Truck umumnya dikenal dengan tes Kirby-Bauer.

Difusi adalah proses perpindahan molekul secara acak dari satu

posisi ke posisi lain. Pada pengujian potensi suatu antibiotik dengan difusi

agar menggunakan media padat yang pada permukaanya telah

diinokulasikan mikroorganisme uji yang sensitif terhadap antibiotik yang

secara merata. Paper disk diletakkan pada permukaan media tersebut

yang sebelumnya telah direndam dalam larutan antibiotika atau sampel

yang akan diuji (Djide dan Sartini, 2008).

Metode ini menggunakan cakram uji untuk menyerap konsentrasi

ekstrak tumbuhan yang diinginkan. Cakram tersebut kemudian diletakkan

pada permukaan media agar padat yang cocok seperti Mueller Hinton

Agar, Tryptone Soy Agar atau Nutrient Agar setelah media diinokulasi

dengan mikoorganisme uji. Cakram kemudian diinkubasi selama 24 jam

pada suhu 37ο C untuk bakteri dan 48 jam pada suhu 25ο C untuk fungi,

setelah diinkubasi diameter zona hambat yang ada disekitar cakram

diukur (Das dkk., 2010).

b. Metode Dilusi

Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution)

dan dilusi padat (solid dilution). Metode ini digunakan untuk mengukur

Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum (KBM). Prinsip

dari metode ini adalah dengan membuat seri pengenceran antimikroba

pada medium cair yang telah ditambahkan mikroba uji. Ekstrak dikatakan

aktif jika pada konsentrasi ≤ 1000 µg/ml mampu membunuh/ menghambat

pertumbuhan mikroba uji dengan tidak adanya pertumbuhan mikroba

pada permukaan media pertumbuhan (Hoffmann et al., 1993).

1. Metode dilusi cair (broth dilution)

Metode ini mengukur MIC (minimum inhibitory concentration atau

kadar bunuh minimum, KBM). Cara yang dilakukan adalah dengan

membuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang

ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar

terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji

ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut

selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji

ataupun agen antimikroba dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair

yang tetap terihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai KBM.

2. Metode dilusi padat (solid dilution)

Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan

media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen

antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba

uji (Pratiwi, 2008).

c. Metode Turbidimetri (Dilusi)

Prinsip pengujian dengan metode ini adalah membandingkan

derajat hambatan pertumbuhan mikroorganisme uji oleh dosis antibiotika

yang diuji terhadap hambatan yang sama oleh dosis antibiotika baku

pembanding dalam media cair. Salah satu hal yang mempengaruhi

keberhasilan metode ini adalah lama waktu inkubasi dan keseragaman

suhu selama waktu inkubasi (Djide, 2008).

d. Metode KLT-Bioautografi

Metode KLT-Bioautografi dapat digunakan untuk mengisolasi

senyawa aktif yang telah diuji. KLT bioautografi memiliki keuntungan

antara lain cepat, mudah disiapkan, relatif murah, tidak memerlukan

peralatan yang rumit, hanya diperlukan beberapa mikrogram senyawa uji,

dan hasilnya mudah untuk diinterpretasikan. Pemisahan senyawa dalam

ekstrak tanaman dengan KLT yang dipadukan dengan bioautografi dapat

digunakan sebagai metedo isolasi yang mengacu pada pengujian hayati

(bioassay-guided isolation method) untuk mengamati dan mengidentifikasi

senyawa dengan memanfaatkan aktivitas biologis pada ekstrak sampel

yang diuji. Pada bioautografi ini didasarkan atas efek biologi berupa

antibakteri, anti protozoa, antitumor, dan lain-lain dari substansi yang

diteliti.

Ciri khas dari prosedur bioautografi adalah didasarkan atas teknik

difusi agar, dimana senyawa antimikrobanya dipindahkan dari lapisan KLT

ke medium agar yang telah diinokulasikan dengan merata bakteri uji yang

peka. Dari hasil inkubasi pada suhu dan waktu tertentu akan terlihat zona

hambatan di sekeliling dari spot dari KLT yang telah ditempelkan pada

media agar. Zona hambatan ditampakkan oleh aktivitas senyawa aktif

yang terdapat di dalam bahan yang diperiksa terhadap pertumbuhan

mikroorganisme uji (Hamburger, 1987; Djide dan Sartini, 2008).

E. Uraian Bakteri Uji

1. Escherichia coli (Garrity et al., 2004)

a. Klasifikasi

Domain : Bacteria

Phylum : Proteobacteria

Class : Gammaproteobacteria

Ordo : Enterobacteriales

Familia : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

b. Sifat dan Morfologi

Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang lurus,

1,1 -1,5 µm, motil dengan flagellum peritrikum atau non motil dan tidak

mempunyai kapsul. E. Coli tumbuh optimal pada suhu 22οC dan 37οC

membentuk koloni yang sirkular, konveks dan halus dengan tepi yang

tegas. Tumbuh dengan mudah pada medium nutrien sederhana. Laktosa

difermentasi oleh sebagian besar galur dengan produksi asam dan gas

(Pelczar et al., 2008).

2. Staphylococcus aureus (Garrity et al., 2004)

a. Klasifikasi

Domain : Bacteria

Phylum : Firmicutes

Class : Bacilli

Ordo : Bacillales

Familia : Staphylococcaceae

Genus : Staphylococcus

Spesies : Staphylococcus aureus

b. Sifat dan Morfologi

Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulat

seperti bola, berdiameter 0,5 – 1,5 µm, terdapat dalam tunggal dan

berpasangan dan secara khas membelah diri pada lebih dari satu bidang

sehinggan membentuk gerombolan yang tak teratur. Non motil. Bakteri ini

hidup dalam saluran pengeluaran lendir dari tubuh matidak diketahui

adanya stadium istirahat. Manusia dan hewan seperti hidung, mulut

tenggorokan dan dapat dikeluarkan pada waktu batuk atau bersin. Dinding

sel mengandung dua komponen utama yaitu peptidoglikan dan asam

teikoat yang berkaitan dengannya. Kemoorganotrof. Metabolisme dengan

respirasi dan fermentatif. Anaerob fakultatif, tumbuh lebih cepat dan lebih

banyak dalam keadaan aerobik. Suhu optimum 35 – 40οC. Kisaran

inangnya luas, dan banyak galur merupakan patogen potensial (Pelczar et

al., 2008). S. aureus memiliki kemampuan untuk mensintesis lipase yang

dapat mengubah sebum trigliserida menjadi asam lemak bebas yang

dapat merangsang inflamasi (Sukatta dkk, 2008 ; Aziz, 2

F. Kerangka Teori

G. Kerangka konsep

(Clerodendrum minahassae Teijsm. dan Binn.)

Metabolit primer Metabolit sekunder

Alkaloid Flavonoid

Fenol Terpenoid Steroid

Senyawa antibakteri dari Clerodendrum minahassae Teijsm. dan Binn.

G. Kerangka Konsep

Keterangan: = Variabel bebas

= Variabel antara

= Variabel terikat

= Variabel terkendali

= Hubungan variabel bebas

= hubungan variabel terikat

= Hubungan variabel kendali

H. Hipotesis

1. Ekstrak Clerodendrum minahassae memiliki aktivitas sebagai

antibakteri.

2. Senyawa Clerodendrum minahassae memiliki aktivitas antibakteri

terhadap beberapa bakteri uji.

Lokasi Pengambilan

Sampel

Pembuatan

simplisia

Metode ekstraksi

Aktivitas Antibakteri

Bakteri uji:

Escherichia coli

Staphylococcus

aureus

Komposisi medium

Suhu dan lama

inkubasi

pH medium

Clerodendrum minahassae

Teijsm. Dan Binn.

Metabolit Primer

dan Sekunder