JORGE VÁZQUEZ SÁNCHEZ

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

“EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA

TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD

PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA”

T E S I S

Q U E P A R A O B T E N E R E L G R A D O D E

DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS

P R E S E N T A :

JORGE VÁZQUEZ SÁNCHEZ

DIRECTORES DE TESIS:

DR. GERMÁN ALBERTO CHAMORRO CEVALLOS

DR. RICARDO PÉREZ PASTÉN BORJA

MÉXICO, D. F. 2009

1

Este trabajo se realizó bajo la dirección de los doctores Germán Chamorro

Cevallos y Ricardo Pérez Pastén Borja, en el Laboratorio de Toxicología

Preclínica, del Departamento de Farmacia, de la Escuela Nacional de

Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, con apoyo del

Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, beca con número de registro

185528.

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EFECTO DE LA Spirulina maxima CONTRA LA TERATOGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD PRODUCIDAS POR HIDROXIUREA

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ÍNDICE GENERAL

ABREVIATURAS v

ÍNDICE DE FIGURAS vii

ÍNDICE DE TABLAS ix

RESUMEN xi

ABSTRACT xii

1. INTRODUCCIÓN 1

1.1 ANTECEDENTES 1

1.2 TERATOGÉNESIS 3

1.2.1 Estudios de teratogénesis 3

1.3 ESTUDIOS DE GENOTOXICIDAD 4

1.4 RELACIÓN ENTRE TERATOGÉNESIS Y GENOTOXICIDAD 5

1.4.1 Mecanismos de teratogenicidad 6

1.4.2 Teratogénesis mediada por ERO 7

1.4.2.1 Especies reactivas de oxígeno (ERO) 7

1.4.2.2 Producción de ERO en organismos vivos 8

1.4.2.3 Daño a macromoléculas causado por ERO 9

1.4.2.3.1 Daño a proteínas 10

1.4.2.3.2 Daño a lípidos 10

1.4.2.3.3 Daño al ADN 11

1.4.3 Inducción de teratogénesis mediada por ERO 12

1.5 HIDROXIUREA 14

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1.5.1 Características generales 14

1.5.2 Inducción de teratogénesis mediada por HU 16

1.6 MECANISMOS DE PROTECCIÓN ANTIOXIDANTE 19

1.6.1 Protección antioxidante contra agentes teratógenos 20

1.7 Spirulina 21

1.7.1 Características 21

1.7.2 Actividad antioxidante del alga Spirulina 25

1.7.3 C-ficocianina 25

1.7.4 Actividad antigenotóxica del alga Spirulina 27

2. JUSTIFICACIÓN 29

3. OBJETIVOS 30

3.1 OBJETIVO GENERAL 30

3.2 OBJETIVOS PARTICULARES 30

4. HIPÓTESIS 31

5. MATERIAL Y MÉTODOS 32

5.1 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO DE C-FICOCIANINA 32

5.2 ANIMALES Y ACOPLAMIENTOS 33

5.3 ESTUDIO DE TERATOGÉNESIS 34

5.4 ESTUDIO DE PEROXIDACIÓN LIPÍDICA Y CUANTIFICACIÓN

DE PROTEÍNAS 35

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5.5 CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS EMBRIONARIAS DE

EMBRIONES COMPLETOS, ENCÉFALO Y PRIMORDIOS DE

EXTREMIDADES ANTERIORES 36

5.5.1 Pruebas de citotoxicidad para S. maxima, el extracto de c-

ficocianina e HU 37

5.5.2 Determinación del efecto protector de S. maxima y el

extracto de c-ficocianina sobre la citotoxicidad producida por

HU 39

5.6 DETERMINACIÓN DEL EFECTO PROTECTOR DE S. maxima

Y EL EXTRACTO DE C-FICOCIANINA SOBRE LA

GENOTOXICIDAD PRODUCIDA POR HU 39

5.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 41

6. RESULTADOS 42

6.1 EXTRACTO DE C-FICOCIANINA 42

6.2 ESTUDIO DE TERATOGÉNESIS 43

6.2.1 Grupo testigo de agua 43

6.2.2 Grupo testigo de tween 80 43

6.2.3 Teratogenicidad in vivo de S. maxima 44

6.2.4 Teratogenicidad in vivo inducida con hidroxiurea 44

6.2.5 Efecto de S. maxima sobre la teratogénesis inducida con

HU 45

6.3 DETERMINACIÓN DE LA PEROXIDACIÓN LIPÍDICA Y

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 50

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6.4 DETERMINACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD DE S. maxima, EL

EXTRACTO DE C-FICOCIANINA E HU EN CULTIVOS

PRIMARIOS DE CÉLULAS EMBRIONARIAS DE EMBRIONES

COMPLETOS, ENCÉFALO Y PRIMORDIOS DE EXTREMIDADES

ANTERIORES 51



CITOTOXICIDAD PRODUCIDA POR HU 51



GENOTOXICIDAD PRODUCIDA POR HU 56

7. DISCUSIÓN 59

8. CONCLUSIONES 69

9. BIBLIOGRAFÍA 71

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ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS

·OH Radical hidroxilo

1O2 Singlete de oxígeno

3O2 Oxígeno molecular en estado de triplete

4-HNE 4-hidroxinonenal

CO2 Dióxido de carbono

COX-2 Ciclooxigenasa-2

CYPs Citocromo P450

DSV Diámetro del saco vitelino

EMN Eritrocitos micronucleados

EPC Eritrocitos policromáticos

EPCMN Eritrocitos policromáticos micronucleados

ERN Especies reactivas del nitrógeno

ERO Especies reactivas del oxígeno

ET Eritrocitos totales

GPx Elutatión peroxidasa

GSH Glutatión reducido

GST Glutatión-S-transferasa

H2O2 Peróxido de hidrógeno

HU Hidroxiurea

KDa Kilo-Daltones

L-arg L-arginina

LC Longitud

LCR Longitud coronilla-grupa

LPO Lipoperoxidasa

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MDA Malondialdehído

NAD(P)H Fosfato de nicotin-adenin-dinucleótido

NADH Nicotin-adenin-dinucleótido

NO- Anión nitroxilo

NO+ Catión nitrosonio

NO· Radical del óxido nítrico

NO2· Radical del dióxido de nitrógeno

NOS Óxido nítrico sintasa

-O2 Anión superóxido

ONOO- Peroxinitrito

p Probabilidad

PBS Solución amortiguadora de fosfatos

PHSs Prostaglandin-H sintetasas

RRND-I Reductasa de ribonucleótidos-difosfato clase I

S. maxima Spirulina maxima

S. platensis Spirulina platensis

SDS-PAGE Electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida

SOD Superóxido dismutasa

TBARS Especies reactivas al ácido tiobarbitúrico

TNF- Factor de necrosis tumoral-alfa

URF Unidades relativas de fluorescencia

UV Ultravioleta

VSV Vascularidad del saco vitelino

2 Prueba de chi-cuadrada

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Vías bioquímicas involucradas en los mecanismos y

determinantes de riesgo de teratogénesis química mediada

por ERO 7

Figura 2 Vías de producción y degradación de ERO 9

Figura 3 Activación de xenobióticos por las vías de la PHS y LPO 13

Figura 4 Mecanismo de acción de la hidroxiurea 15

Figura 5 Formación del NO y sus metabolitos, a partir de HU 16

Figura 6 Fotografías de embriones de 11 días cuyas madres no

tratadas y tratadas con HU 17

Figura 7 Formación de radicales libres hidroxilo a partir de la reacción

química de hidroxiurea con oxígeno en fluidos biológicos 18

Figura 8 Balance entre la producción de ERO y varios tipos de

mecanismos antioxidantes 19

Figura 9 Alga Spirulina 22

Figura 10 C-ficocianina 27

Figura 11 Fotografías de embriones de 11 días en las que se muestran

las partes de los embriones que se utilizaron para el cultivo

primario de células 37

Figura 12 Diseño de la microplaca utilizado para la determinación de la

CL50 y del efecto protector del alga o el extracto sobre la

citotoxicidad producida por HU 38

Figura 13 SDS-PAGE al 12 % 42

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Figura 14 Espectro UV del extracto de c-ficocianina 43

Figura 15 Comparación de los grupos testigo, tween 80, HU, y S.

maxima 48

Figura 16 Comparación de los grupos testigo, HU, S. maxima (1000

mg/kg), y S. maxima (1000 mg/kg), + HU 49

Figura 17 Contenido embrionario de MDA 50

Figura 18 Determinación del efecto citotóxico de Spirulina y el extracto

de c-ficocianina para cultivos primarios de encéfalo 52

Figura 19 Determinación del efecto citotóxico de la HU para cultivos

primarios 53

Figura 20 Determinación del efecto protector del extracto de c-

ficocianina sobre la citotoxicidad producida por HU 54

Figura 21 Determinación del efecto protector del extracto de c-

ficocianina sobre la citotoxicidad producida por HU 55

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Etiología de las malformaciones congénitas humanas 2

Tabla 2 Principales ensayos para la determinación de

genotoxicidad 5

Tabla 3 Actividades farmacológicas reportadas para el alga

Spirulina y algunos de sus componentes 24-5

Tabla 4 Composición del SDS-PAGE al 10 % 33

Tabla 5 Tratamientos a los que se sometió a los diferentes grupos 34

Tabla 6 Tratamientos a los que se sometió a los grupos adicionales

para el estudio de TBARS y la cuantificación de proteínas 35

Tabla 7 Concentraciones de S. maxima, extracto de c-ficocianina e

HU a las que se sometió a las células de los diferentes

cultivos 38

Tabla 8 Tratamientos a los que se sometió a los diferentes grupos

para el estudio de genotoxicidad 40

Tabla 9 Parámetros generales que muestran el efecto de S.

maxima sobre la teratogénesis in vivo inducida por HU en

ratón 46

Tabla 10 Efecto de S. maxima sobre el grado de desarrollo

embrionario in vivo en embriones cuyas madres fueron

tratadas con HU 47

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Tabla 11 Efecto de S. maxima y el extracto de c-ficocianina sobre la

genotoxicidad in vivo en fetos cuyas madres fueron

tratadas con HU 57

Tabla 12 Efecto de S. maxima y el extracto de c-ficocianina sobre la

genotoxicidad in vivo en hembras gestantes tratadas con

HU 58

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RESUMEN

Las malformaciones congénitas son una de las primeras causas de

mortalidad infantil a nivel mundial. Algunos xenobióticos pueden reaccionar en el

embrión y producir intermediarios muy tóxicos como electrófilos y radicales libres,

que al causar alteraciones celulares interfieren con el desarrollo embrionario/fetal.

Spirulina maxima y su extracto proteico, cuyo componente principal es la c-

ficocianina, han sido ampliamente estudiadas por sus propiedades antioxidantes.

La hidroxiurea es un potente teratógeno que causa rápida muerte celular e

inhibición profunda de la síntesis de ADN en mamíferos; algunos antioxidantes

bloquean la primera pero no la inhibición de la síntesis de ADN, por lo que se ha

sugerido que este fármaco reacciona en el embrión, produciendo ERO que son las

responsables de la muerte celular temprana.

El objetivo de este trabajo, fue investigar el posible efecto protector de S.

maxima y el extracto de c-ficocianina sobre la teratogénesis, la citotoxicidad y la

genotoxicidad, inducidas con hidroxiurea, mediante diferentes modelos

experimentales y asociar los resultados obtenidos a las propiedades antioxidantes

de ambas sustancias.

Ratones ICR gestantes, fueron distribuidos para los diferentes estudios. Se

realizaron pruebas de teratogénesis y TBARS en las cuales la evaluación se hizo

en embriones de 11 días de gestación. Un ensayo de citotoxicidad en el que se

utilizaron cultivos primarios de células de primordios, encéfalo y embriones

completos. Para el experimento de genotoxicidad se tomaron muestras de sangre

periférica de hembras de 20 días de gestación y de sus fetos para la prueba de

micronúcleos.

Los resultados indican que el empleo de S. maxima y del extracto de c-

ficocianina, no sólo no han causado alteración alguna en los animales/cultivos

celulares expuestos a ellas, sino que han sido efectivas en la prevención de los

daños causados por la hidroxiurea y los animales que recibieron al fármaco en

combinación con el alga o su extracto proteico, presentaron una reducción de los

efectos tóxicos hasta valores semejantes a los de los testigos negativos, lo cual

fue relacionado principalmente a las propiedades antioxidantes de ambas.

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ABSTRACT

Congenital malformations are one of the major causes of child mortality all

over the world. A number of xenobiotics can react within the embryo to produce

highly toxic electrophilic or free radical reactive intermediates. This could result in

cellular damage and may interfere with embryonic and/or fetal development.

Spirulina maxima and its protein extract, which major component is c-

phycocyanin, have been extensively studied because their antioxidant properties.

Hydroxyurea is a potent mammalian teratogen. It causes fast cellular death

and deep embryonic DNA-synthesis inhibition. Some antioxidants block the former

but DNA-synthesis inhibition, it was suggested that hydroxyurea reacts within

embryos to give hydrogen peroxide and free radicals, which causes early cellular

death.

The aim of this work was to investigate the possible protector effect of

Spirulina maxima and the extract of c-phycocyanin over the hydroxyurea

teratogenicity, citotoxicity and genotoxicity in different experimental tests and to

associate the findings with their antioxidant properties.

Pregnant ICR mice were randomly divided into the different tests.

Teratogenesis and TBARS were evaluated in 11th day old embryos. To the

citotoxicity assay there were used cells from complete embryos, their fore limbs

and encephalons. Finally to the genotoxicity experiment it was used the peripheral

blood of the gestated dams and their 20th day old fetuses for micronucleus test.

Results showed that neither Spirulina maxima nor the extract of c-phycocyanin

caused any alteration in animals/cell cultures exposed to them; nevertheless, they

have been effective in the prevention of damages induced by hydroxyurea. The

animals which received the drug and the alga or its protein extract, presented a

reduction in the toxic effects of hydroxyurea and achieved similar quantities to the

control groups. Results were related to the antioxidant properties of both Spirulina

maxima and the extract of c-phycocyanin.

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1. INTRODUCCIÓN

1.1 ANTECEDENTES

Las malformaciones congénitas representan una de las primeras de causas de

mortalidad infantil a nivel mundial. En países desarrollados ocupan el primer lugar,

en tanto que en los que están en vías de desarrollo se encuentran en el segundo o

tercero (OMS, 2008). En México, se ubican como la segunda causa de mortalidad

infantil a nivel nacional (INEGI, 2009).

Las malformaciones congénitas son causadas por diversos factores, tales como:

exposición a fármacos y otros agentes químicos, hipertermia, infecciones, estados

anormales del metabolismo materno e incluso factores físicos (Brent y Beckman,

1990), (Tabla 1). Los mecanismos de la teratogénesis química, comprenden la

interacción del embrión durante la fase de organogénesis con sustancias que

pueden interactuar, de forma directa o indirecta, e interferir una variedad de eventos

celulares que se llevan a cabo en tiempos precisos, como: proliferación, migración,

asociación, diferenciación y apoptosis (Schmid, 1985). Para protegerse, los

organismos vivos han desarrollado diversos mecanismos que los protegen de

factores físicos como: impactos mecánicos, variaciones en la temperatura y algunas

clases de radiaciones; e incluso modulan otros factores de naturaleza química, ya

sea impidiendo que estos lleguen o al menos reduciendo su concentración en el

embrión (Wilson, 1973; Cohen, 1990).

Asimismo, la interferencia química de algunas sustancias con gametos y

embriones o durante el desarrollo fetal, causa infertilidad, pérdida del producto

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durante la concepción o defectos en el mismo. Ciertos compuestos inducen

malformaciones estructurales, disfunciones fisiológicas o metabólicas, alteraciones

en el comportamiento o psicológicas, o déficit en los productos, tanto al nacimiento

como en un determinado período postnatal; por ello se hace necesaria la detección

de sustancias que interfieran o alteren cualquier etapa de la reproducción

(Ecobichon, 1997). Se ha observado que las mutaciones en genes y cromosomas,

no sólo juegan un papel importante en el proceso de carcinogénesis sino también,

pueden estar involucradas en la producción de malformaciones en neonatos y en

otras enfermedades (Gómez-Meda y col., 2004).

Dentro de los estudios que se realizan para determinar si una sustancia es

segura para su uso en humanos se encuentran las pruebas de teratogenicidad y

genotoxicidad; un requerimiento básico de estos estudios es que se realicen en al

menos dos especies, de las cuales una debe ser preferentemente no-roedora

(Ecobichon, 1997).

Tabla 1. Etiología de las malformaciones congénitas humanas.

Causas Porcentaje

Genéticas 15-25

Enfermedades genéticas autosómicas

Citogenéticas (anormalidades cromosómicas)

Desconocidas 65

Poligenéticas

Multifactoriales (interacciones genoma-ambiente)

Alteraciones espontáneas en el desarrollo

Interacciones sinergistas entre teratógenos

Ambientales 9

Condiciones maternas (diabetes, endocrinopatías, deficiencias nutricionales, uso de sustancias de abuso)

Infecciones maternas (rubeola, toxoplasmosis, sífilis, herpes, varicela)

Problemas físicos (constricciones anormales del cordón, disparidad uterina)

Exposición a químicos, fármacos, radiación <1

Modificada de Brent and Beckman, 1990.

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1.2 TERATOGÉNESIS

Teratogénesis deriva del término griego “monstruo”; regularmente se refiere a

defectos estructurales, como los causados por la exposición de un embrión a la

talidomida, que provoca focomeli o amelia. Sin embargo, en un contexto más

amplio, la teratogénesis incluye defectos funcionales y estructurales, los cuales

pueden resultar letales para el infante, antes o poco después del nacimiento (Wells

y col., 2005).

Un agente teratógeno es aquel que induce malformaciones estructurales,

disfunciones metabólicas o fisiológicas, alteraciones psicológicas o en el

comportamiento, o déficit en los productos, ya sea al nacimiento o en un período

postnatal definido (Ecobichon, 1997).

En la actualidad, existe un gran número de nuevos productos químicos y

farmacéuticos que son utilizados en la vida cotidiana y que pueden inducir defectos

de nacimiento; asimismo, hay otros que se encuentran en pruebas para determinar

sus posibles efectos durante el periodo perinatal.

Las pruebas para la realización de estudios de teratogénesis incluyen una

batería de ensayos in vivo e in vitro.

1.2.1 Estudios de teratogénesis

Un requerimiento básico para las pruebas de teratogénesis de una sustancia

es que deben efectuarse en al menos dos especies, una de las cuales tiene que ser

preferentemente no-roedora. Generalmente se administran compuestos de prueba a

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hembras gestantes durante el período de la organogénesis (diferenciación

embrionaria), y se utilizan tres grupos con una dosis diferente cada uno, un testigo

negativo y uno positivo (Wilson, 1977).

Las hembras se sacrifican uno o dos días antes del día del parto, son contados

el número de fetos vivos y muertos, los cuales se pesan y examinan externa e

internamente y se determinan anormalidades en tejido blando y esqueleto. En

algunos casos se permite el nacimiento y maduración para determinar latencia

fisiológica o déficit en la conducta (Coyle y col., 1976; Schmid y col., 1997).

Asimismo, se explantan embriones o partes de ellos (extremidades, órganos,

tejidos), ya sea para ser analizados o para cultivarlos y tratarlos in vitro y estudiar el

desarrollo embrionario bajo condiciones definidas (Schmid, 1985). Las

malformaciones se detectan mediante la observación del esqueleto, vísceras y

partes externas del cuerpo tanto en embriones, fetos y neonatos (Wilson, 1973).

1.3 ESTUDIOS DE GENOTOXICIDAD

Las pruebas para la detección de agentes que dañan al ADN, no sólo nos

proporcionan información sobre la capacidad de dichos agentes para dañar a

material genético de los organismos, sino que están relacionadas a la inducción de

mutaciones, tanto en células somáticas como germinales; al proceso de

envejecimiento, al desarrollo de ciertos tipos de cánceres e inclusive a la presencia

de malformaciones congénitas.

Las pruebas para la determinación de genotoxicidad de un xenobiótico se

dividen en dos etapas, la primera de las cuales sólo considera algunos ensayos que

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sirven como pruebas preliminares y proporcionan información sobre la parte del

material genético que es afectada por los xenobióticos (genes o cromosomas). La

segunda etapa, incluye ensayos que proporcionan extensa información acerca de

los mecanismos y los tipos específicos de mutación que pueden ocurrir, así como

las consecuencias de las mismas. En esta etapa se incluyen pruebas en células y

organismos completos (Preston y Hoffman, 2008), (tabla 2).

Tabla 2. Principales ensayos para la determinación de genotoxicidad.

Ensayos

Ensayos iniciales

Determinación de mutaciones en genes (prueba de Ames)

Determinación de mutaciones en cromosomas (prueba de micronúcleos)

Ensayos que ofrecen información extensa o específica

Mutaciones de genes (reversión de mutaciones, mutaciones en cultivos celulares, dominantes letales en Drosophila)

Análisis citogenético en cultivos celulares de células de hámster o humanas

(aberraciones cromosómicas, micronúcleos y aneuploidias)

Otros indicadores de daño genético (ensayos de daño y reparación de ADN y de

recombinación mitótica)

Pruebas en células germinales de mamíferos (locus-específico, mutaciones

esqueléticas, análisis citogenético, translocaciones de tipo heredable y daño y reparación de ADN).

Modificada de Preston y Hoffman, 2008.

1.4 RELACIÓN ENTRE TERATOGÉNESIS Y GENOTOXICIDAD

Muchos de los compuestos que están clasificados como teratógenos tienen un

potencial genotóxico y varios de los mecanismos relacionados en estos procesos

involucran la producción de micronúcleos.

Los micronúcleos han sido utilizados en diversos estudios para tratar de

relacionar el daño genotóxico con la teratogenicidad de algunos compuestos, por

ejemplo: la frecuencia de micronúcleos ha sido determinada en células de hígado

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fetal de ratas, cricetos y ratones, en sangre fetal de ratón, sangre de ratón neonato

y cultivos de linfocitos humanos de cordón umbilical (Gómez-Meda y col., 2004).

1.4.1 Mecanismos de teratogenicidad

Los mecanismos generales de la teratogénesis incluyen la unión reversible de

los xenobióticos a receptores, provocando respuestas embriopáticas por el

incremento en la concentración de dichos agentes, debido a sobrexposición y

deficiencias en las vías metabólicas o de eliminación maternas. Por otro lado,

algunos xenobióticos, también llamados “proteratógenos”, que son poco o nada

tóxicos al ser enzimáticamente bioactivados y producen sustancias electrofílicas o

radicales libres altamente tóxicos. Las primeras pueden unirse covalentemente a

macromoléculas celulares, como el ADN; en tanto que las segundas reaccionarían

de forma directa o indirecta con el oxígeno molecular e iniciar la formación de

especies reactivas del oxígeno (ERO), o del nitrógeno (ERN), dando como resultado

al anión superóxido (-O2), peróxido de hidrógeno (H2O2), y radicales hidroxilo (·OH);

así como, el radical del óxido nítrico (NO·), el peroxinitrito (ONOO-), el catión

nitrosonio (NO+), el anión nitroxilo (NO-), y el radical del dióxido de nitrógeno (NO2·),

respectivamente, que causan daño celular oxidativo (Figura 1), (Parman y col.,

1999; Deeb y col., 2000; Bath y Madyastha, 2001; Dröge, 2002; Chen y col., 2004;

Touyz, 2004, Wells y col., 2005).

Con frecuencia, diferentes ERO coexisten en un ambiente reactivo, lo que hace

difícil la identificación de qué agente es responsable de un efecto biológico

determinado. Pero, sí el daño a macromoléculas no es reparado, puede interferir

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con el desarrollo embrionario y/o fetal (Parman y col., 1999; Deeb y col., 2000; Chen

y col., 2004; Wells y col., 2005).

Se ha descrito que muchos compuestos químicos causan teratogénesis

mediante el daño por ERO, como: hidroxiurea, fenitoína, benzo-a-pireno, cocaína y

ácido valproico, entre otros (DeSesso y Goeringer, 1990a; DeSesso y col., 1994;

Deeb y col., 2000; Wells y col., 2005). Asimismo, algunos de dichos compuestos

han sido descritos como reconocidos agentes genotóxicos (Tanaka y Shimizu,

2000; Nersesyan y Kaiser, 2002; Avlasevich y col., 2006).

Figura 1. Vías bioquímicas involucradas en los mecanismos y determinantes de riesgo de

teratogénesis química mediada por ERO. El riesgo está determinado por el balance entre la

bioactivación embrionaria y las vías de eliminación materna y la destoxificación de

intermediarios reactivos embrionarios, citoprotección y reparación de daño a

macromoléculas (Wells y col., 2005).

1.4.2 Teratogénesis mediada por ERO

1.4.2.1 Especies reactivas de oxígeno (ERO)

XENOBIÓTICOS INTERMEDIARIOS

REACTIVOS BLANCO

MOLECULAR

•Fárnacos

•Qímicos ambientales

•PHS

•Peroxidación lipídica

•Citocromo P450

•ADN

•Proteínas

•Lípidos

•Aductos

•Oxidación

•UDP-glucorosil-

transferasa •GHS

•GSH S-transferasa

•Epóxido hidrolasa

•p53

•ATM

•Ogg1

•GSH

•GSH peroxidasa

•GSH S-transferasa

•Epóxido reductasa

TERATOGÉNESIS ALTAMENTE TÓXICOS NO-TÓXICOS

PROTERATÓGENOS

•Sustancias

electrofílicas

•Radicales

libres

Especies reactivas

de oxígeno

•SOD

•G6PD

•Catalasa

DAÑO

REPARACIÓN CITOPROTECCIÓN DESTOXIFICACIÓN ELIMINACIÓN

BIOACTIVACIÓN

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Las ERO son entidades químicas extremadamente reactivas que contienen

oxígeno en su composición. Se clasifican en radicales libres y especies reactivas

no radicales. A concentraciones bajas, juegan un papel muy importante como

reguladores en procesos de señalización celular. Sin embargo, a altas

concentraciones, son peligrosas para los organismos, ya que dañan los

constituyentes celulares importantes y se ha observado que están involucrados en

la patogénesis del cáncer, diabetes mellitus, aterosclerosis, enfermedades

neurodegenerativas, artritis reumatoide, isquemia, apnea y otros padecimientos.

Asimismo, los radicales libres están implicados en los mecanismos de

senescencia (Dröge, 2002; Sastre y col., 2003).

1.4.2.2 Producción de ERO en organismos vivos

En las células existen mecanismos enzimáticos cuya función es la producción de

ERO, así como su degradación. El -O2, se forma mediante la reducción del oxígeno

molecular en estado de triplete (3O2). Este proceso se realiza por enzimas como las

NAD(P)H y xantina oxidasas, o vía no-enzimática por compuestos redox reactivos,

como la semi-ubiquinona de la cadena transportadora de electrones en las

mitocondrias. Después, la enzima superóxido dismutasa (SOD), convierte al -O2 en

H2O2. En los tejidos el -O2 puede transformarse de forma no-enzimática en H2O2 ó

en el singlete de oxígeno (1O2). En presencia de metales de transición (como los

iones de hierro y cobre), el H2O2 es convertido en el altamente reactivo ·OH, o en

agua por las enzimas catalasa y glutatión peroxidasa (Figura 2), (Mason y Chignell,

1982; Dröge, 2002; Genova y col., 2003; Sastre y col., 2003; Giordano, 2005).

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Otros de los compuestos que se originan son los que se clasifican dentro de las

especies reactivas del nitrógeno. El NO·, se produce en organismos superiores por

la oxidación de uno de los nitrógenos (guanidino terminal), de la L-arginina (L-arg),

mediante la acción catalítica de la enzima óxido nítrico sintasa (NOS). El NO· puede

reaccionar con ERO y producir el ONOO-, el NO+, el NO-, y el NO2· (Figura 2). El

ONOO- es un intermediario muy reactivo que al comenzar la nitración de lípidos,

proteínas y ADN o producir el ·OH también produciría daño oxidativo (Figura 2),

(Bath y Madyastha, 2001; Dröge, 2002; Touyz, 2004; Wells y col., 2005).

Figura 2. Vías de producción y degradación de ERO. La producción de ERO puede ser a

partir de compuestos de oxígeno o de nitrógeno, en ambos casos el altamente reactivo ·OH

puede ser el producto final (Modificado de Dröge, 2002).

1.4.2.3 Daño a macromoléculas causado por ERO

Como ya se mencionó, las ERO comprenden a los radicales libres y a las

especies no-radicales libres. Los primeros son átomos o moléculas inestables, con

O2 O2

. -

Xantina

oxidasa

NAD(P)H

oxidasas

Hipoxantina

Xantina

Xantina

ácido úrico

Mitocondria

Semi-

ubiquinona

SOD

H2O2

Catalasa

H2O

GSH

peroxidasa

GSH GSSG

Tejidos Fe2+/ Cu

2+

Fe3+/ Cu

3+ .OH 1

O2

L-arginina NOS

NO· NO2

· ONOO

-

NO+

NO-

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un electrón desapareado, que para estabilizarse deben tomar un electrón de otra

molécula estable, causando una reacción en cadena que lleva a la

desestabilización de otras moléculas. Las especies no-radicales tienes sus

electrones pareados, pero su inestabilidad natural, debida principalmente a

átomos muy electronegativos en su composición, hace que se conviertan

fácilmente en radicales libres o se unan covalentemente a sustancias electrofílicas

(Binda y col., 2003; Sastre y col., 2003).

1.4.2.3.1 Daño a proteínas

Los aminoácidos de las proteínas que presentan un grupo sulfhidrilo en su

cadena lateral (cisteína, metionina e histidina), son especialmente susceptibles a

ser atacados y oxidados por el ·OH. Los procesos de oxidación por ERO pueden

generar cambios en la estructura tridimensional de las proteínas, dando como

resultado procesos de fragmentación, agregación, entrecruzamiento e inactivación.

Finalmente, la oxidación de la proteína conllevará a un proceso de degradación por

procesos celulares encargados de la eliminación de proteínas dañadas (Deans y

col., 1997; Wu y Canderbaum, 2003).

1.4.2.3.2 Daño a lípidos

Los fosfolípidos son componentes esenciales en las membranas y otras partes

de la célula. Los ácidos grasos poliinsaturados son uno de los constituyentes más

importantes de las membranas fosfolipídicas y son particularmente sensibles al

ataque del ·OH y otros oxidantes, ya que estos, al sustraer hidrógenos de sus

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moléculas inician el proceso de peroxidación de muchos ácidos grasos, debido a

que es una reacción en cadena (Wu y Canderbaum, 2003). Lo anterior permite la

acumulación de hidroperóxidos que finalmente se descomponen en una gran

variedad de productos terminales como el malondialdehído (MDA), el hexanal, y el

4-hidroxinonenal (4-HNE). Sustancias como el MDA se utilizan como marcadores de

peroxidación lipídica ya que fácilmente reaccionan con el ácido tiobarbitúrico, por

ello se les designa como especies reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS), y se

pueden cuantificar mediante métodos espectrofotométricos (Zenteno y Saldaña,

2008).

1.4.2.3.3 Daño al ADN

Si bien es cierto que existen varias formas de daño al ADN, el producido por

ERO y ERN, es el que se presenta en mayor cantidad. Este, puede causar

rompimiento de hebras de la doble hélice, remoción y cambios químicos en las

bases orgánicas de los nucleótidos y entrecruzamientos de las proteínas con el

ADN, entre otros; que tienen consecuencias biológicas serias como mutaciones y

transformaciones carcinogénicas, e incluso la muerte celular (Bath y Madyastha,

2001; Wu y Canderbaum, 2003; Wells y col., 2005).

Las ERO y ERN son capaces también de causar daños de forma indirecta al

ADN al afectar la transducción de señales, la proliferación celular y la

comunicación intercelular (Medeiros, 2008).

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1.4.3 Inducción de teratogénesis mediada por ERO

A pesar de que muchas células eucariontes poseen mecanismos de defensa

antioxidante, que incluyen la neutralización no enzimática y la destoxificación

enzimática de ERO, es de esperarse que esto no sea así en etapas tempranas del

desarrollo embrionario ya que la cantidad de O2 presente en su metabolismo es

muy baja. Consecuentemente, la exposición a ERO, incluso en pequeñas

concentraciones durante dichos períodos, puede ser peligroso para los embriones

(Parman y col., 1999; Ornoy y col., 1999).

La mayoría de las enzimas de la familia de los citocromos P450 (CYPs), no

se han expresado en el período embrionario. Sin embargo, las pocas que existen

parecen ser suficientes para llevar a cabo la bioactivación de los xenobióticos, ya

que, a excepción del NO, las ERO y las ERN no son difusibles y generalmente se

degradan en el sitio en el que se producen. Por otro lado, la familia de las

prostaglandin-H sintetasas (PHSs), está expresada de forma relativamente alta

durante los períodos embrionario y fetal, por lo que se les atribuye la bioactivación

de proteratógenos (Figura 3), (Wells y col., 2005).

En algunos estudios se reduce la teratogenicidad de muchos compuestos

químicos compuestos al utilizar animales sin PHS (como ciclooxigenasa e

hidroperoxidasa), inhibidores de estas enzimas y atrapadores de radicales libres

(Wells y col., 2005).

Investigaciones recientes realizadas en conejos, sobre el mecanismo de

teratogenicidad de la talidomida ([+]--phtalimidoglutarimide), indican que ésta es

bioactivada por una peroxidasa, produciendo oxidación del ADN y el glutatión,

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indicando estrés oxidativo inducido por radicales libres. En contraste, en ratones

no se produce oxidación al ADN, incluso a concentraciones 300 % mayores que

las usadas en conejos, lo que explicaría la resistencia de esta especie a la

teratogénesis mediada por talidomida (Parman y col., 1999).

Figura 3. Activación de xenobióticos por las vías de la PHS y LPO. Durante la síntesis de

eicosanoides, las hidroperoxidasas pueden oxidar compuestos a radicales libres que

reaccionan directa o indirectamente con el O2 para producir ERO (Wells y col., 2005).

Las malformaciones que induce el etanol en las extremidades de varias especies

animales, han sido asociadas con la producción de radicales libres por su vía

metabólica (sistema de oxidación microsomal), así como la excesiva generación de

NADH y los disturbios en la cadena transportadora de electrones que éste provoca

(Chen y col., 2004).

Otros compuestos, también han sido objeto de estudio por inducir teratogénesis

mediante la producción de ERO como: fenitoína, benzo-a-pireno, cocaína, ácido

Prostaglandina H sintasa Lipooxigenasa

5-HPETE -OOH PPG2

PPH2 -OH

PHS

Hidroperoxidasa Hidroperoxidasa

5-HETE

Xenobiótico

Radical libre

intermediario

Estrés oxidativo

TERATOGÉNESIS

Fosfolípidos de membrana

Fosfolipasa A

Ácido araquidónico

Vía LPO Vía PHS

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valproico e hidroxiurea, entre otros (DeSesso y Goeringer, 1990a; DeSesso y

Goeringer, 1990b; DeSesso y col, 1994; Deeb y col., 2000; Wells y col., 2005).

1.5 HIDROXIUREA (HU)

1.5.1 Características generales

La hidroxiurea es un potente teratógeno que causa la muerte de células

embrionarias en proliferación e inhibe la síntesis de ADN. Se ha demostrado que

tiene actividad antineoplásica contra el sarcoma 180; se usa para tratar leucemia

granulocítica crónica, policitemia vera y trombocitosis esencial, además de que se

ha observado que tiene actividad contra el virus de la inmunodeficiencia humana y

el de la viruela. Su sitio de acción es la enzima reductasa de ribonucleótidos-

difosfato clase I (RRND-I), que cataliza la conversión de ribonucleótido a

desoxirribonucleótido necesario para la síntesis de ADN.

El mecanismo de acción de este fármaco consiste en la inhibición de un radical

libre tirosilo en el centro catalítico de la enzima y actúa específicamente en la fase S

del ciclo celular ocasionando la detención en la interfase G1-S (Figura 4), (Gao y

col., 1995; Hendricks y Mathews, 1998; Rodríguez y col., 1998; Hayashi y col.,

2003; Yan y Hales, 2005). Este tipo de enzima se encuentra en células de

mamíferos y se ha visto que el fármaco tiene diferentes efectos sobre los 4

desoxiribonucleótidos afectando más sobre la síntesis de adenina que a los de

citosina y guanina y por último al de timina (Hendricks y Mathews, 1998).

En investigaciones recientes, se ha observado que la HU es transformada

en NO∙. Al entrar en el organismo, la HU sería convertida a la hidroxilamina por

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medio de una ureasa, y en esta forma reaccionaría rápidamente con proteínas de

grupo “hemo” para producir el NO. Esta reacción ocurriría en el intestino, con la

intervención de bacterias, ya que los mamíferos no tienen este tipo de enzima

(Figura 5), (Cokic y col., 2003; King, 2003).

Figura 4. Mecanismo de acción de la hidroxiurea. Éste fármaco inhibe a la RRND-I,

que produce los desoxirribonucleótidos necesarios para la síntesis de ADN. El

fármaco es específico de la fase S del ciclo celular.

In vitro, se sabe que al hacer reaccionar HU con H2O y sulfato de cobre,

peroxidasa y hemoglobina, ésta se descompone a NO. In vivo, se sabe que esta

transformación también sucede, ya que se han detectado aductos como la nitroxil-

hemoglobina y nitroxil-hemoproteínas en hígados de raras tratadas con HU (Figura

5), (Jiang y col., 1997).

Se ha reportado que la HU también puede sufrir un proceso de peroxidación.

Una vez transformada en la hidroxilamina de HU, puede ser oxidada por una

lipoperoxidasa (LPO), por la peroxidasa/H2O y por el grupo tiroxilo de la RRND-1

para formar el correspondiente nitróxido (Figura 5), (Jiang y col., 1997; King, 2004).

Reductasa de

ribonucleótidos-difosfato I

ADN HIDROXIUREA

G1

S

G2

I ó G0

Ribonucleótido Desoxirribonucleótido

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Por último, en recientes investigaciones, se observó que el NO puede ser

producido por la oxidación de HU por la enzima catalasa en hígado de rata (Figura

5), (Huang y col., 2006).

Figura 5. Formación del NO y sus metabolitos, a partir de HU.

1.5.2 Inducción de teratogénesis mediada por HU

La HU es un potente teratógeno, entre 2 h y 4 h después de su administración

a hembras en gestación, causa un episodio rápido de muerte celular y una profunda

inhibición de la síntesis de ADN en los embriones. En estudios efectuados en

conejo la hidroxiurea causa una disminución rápida y pronunciada de la circulación

utero-placental y conduce a cambios cardiovasculares y hemorragia en los

embriones. Asimismo, los fetos presentan una disminución en el peso corporal,

Ureasa

bacteriana

H2N

O

NHOH NHOH

LPO

Peroxidasa/H2O

Tiroxilo de RRND-1

NO

In vivo

In vitro

H20 + CuSO4

Peroxidasa

Hemoglobina NO

∙

NO2∙

ONOO-

Catalasa

(hígado)

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malformaciones en las extremidades y adactilia, labio y paladar hendidos y

micrognatia (DeSesso y col., 1994; DeSesso, 1981).

En ratas se ha observado que incrementa el número de reabsorciones

embrionarias y, los fetos presentan malformaciones como paladar hendido,

ausencia del hueso del martillo, parte trasera del cuerpo mal posicionada, pérdida

de vértebras caudales y anomalías en tejido blando, entre otras (Chahoud y col.,

2002).

Figura 6. Fotografías de embriones de 11 días cuyas madres no tratadas y tratadas con

HU. En a, b, c se observan embriones de 11 días con un desarrollo normal. Los embriones del

grupo de HU (300mg/kg), presentaron defectos en cierre del tubo neural, proceso maxilar, arcos

branquiales y desarrollo de sistemas óptico, ótico y olfativo (d); así como interrupción en el giro

y falta de desarrollo de extremidades anteriores y posteriores (e), y alteraciones en la

circulación de saco vitelino (f). Las regiones mencionadas se señalan con flechas azules.

En estudios realizados en embriones de pollo in ovo, dosis de 800 g de HU

inducen malformaciones a nivel de extremidades (Iwama y col., 1983).

En estudios llevados a cabo in vivo e in vitro en ratón, la hidroxiurea provoca

excencefalia, focomelia, poli y sindactilia, fusión de algunos huesos del cráneo y

a b

d e

c

f

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esternebras, rotación incompleta y disminución de la circulación en vasos del saco

vitelino (Figura 6), (Warner y col., 1983; Herken, 1985; Platzek y Schwave, 1999;

Yan y Hales, 2005; Woo y col., 2006; Vázquez-Sánchez, 2006).

Se han investigado algunos antioxidantes y atrapadores de radicales libres

como: propil-galato, etoxiquina, ácido nordihidroguaiarético y D-manitol, que han

reducido la tasa de muerte y la incidencia de malformaciones en los embriones,

provocados por hidroxiurea. Ninguna de estas sustancias bloquea la inhibición de

la síntesis de ADN, pero sí detienen la muerte de células embrionarias inducida

por hidroxiurea indicando claramente, que ésta no es causada por ello. Esto

sugiere que el mecanismo de muerte celular está basado en la producción de

radicales libres y otras ERO (Figura 7), (Herken, 1985; DeSesso y Goeringer,

1990a; DeSesso y Goeringer, 1990b; DeSesso y col, 1994; Woo y col., 2006).

Figura 7. Formación de radicales libres hidroxilo a partir de la reacción química de

hidroxiurea con oxígeno en fluidos biológicos. a) Una molécula de HU reacciona con

el O2 y produce H2O2, que al reaccionar, b) con una segunda molécula de HU, da

lugar a la formación de radicales libres (DeSesso y col, 1994).

Por otro lado, en cultivos celulares se ha determinado la protección de: -

tocoferol, benzoato de sodio, ácido acetilsalicílico, catalasa, peroxidasa y

H2N

O

NHOH + O2

H2N

O

N=O + H2O2

H2N

O

N=O + H2O2

H2N

O

NHO˙ + ̇ OH +

a)

b) H2O

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superóxido dismutasa contra la toxicidad causada por hidroxiurea y se ha

observado que se presenta un efecto protector durante las primeras horas de

cultivo, sin embargo la mortalidad celular posterior es la misma en grupos tratados

con HU sola o en combinación con los agentes protectores (Przybyszewski y Malec

1982; Przybyszewski y col., 1987).

1.6 MECANISMOS DE PROTECCIÓN ANTIOXIDANTE

Las células y tejidos se encuentran en un estado estable de producción y

destrucción de ERO. En algunos organismos estos eventos son regulados por la

activación de sistemas que generan ERN y ERO. Sin embargo, las mismas

respuestas pueden ser generadas por factores ambientales. Si el incremento inicial

de ERO es relativamente pequeño, la respuesta antioxidante será suficiente para

compensarlo y regresar al estado de equilibrio basal (Figura 8), (Dröge, 2002).

Figura 8. Balance entre la producción de ERO y varios tipos de mecanismos antioxidantes. En

las sustancias antioxidantes se incluyen las enzimas. En un estado normal en el que se

producen cantidades bajas de sustancias oxidantes, los sistemas antioxidantes del organismo

tienen la capacidad de destruirlas y mantener el equilibrio entre su producción-degradación

(Modificado de Dröge, 2002).

Generación

de ERO Proteínas Aminoácidos

(Baja reactividad pero

alta concentración)

(Alta reactividad pero

baja concentración)

Sustancias

antioxidantes

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La capacidad de los agentes antioxidantes (GSH, ácido cafeico, vitaminas,

ácidos fólico y pantenoico), quelantes de hierro (desferoxamina), atrapadores de

radicales libres (tiourea, D-manitol), y enzimas antioxidantes (catalasa, SOD), para

reducir el daño oxidativo macromolecular y la teratogenicidad causada por diversos

compuestos, les confiere un papel crítico en los mecanismos de teratogénesis

(DeSesso y col., 1994; Deeb y col., 2000; Araújo y col., 2001; Chen y col., 2004;

Dawson y col., 2006). Además de ello, la variación interindividual en los niveles de

los antioxidantes embrionarios y de las actividades de enzimas antioxidantes

particulares son una determinante importante en el riesgo teratogénico (Wells y col.,

2005).

1.6.1 Protección antioxidante contra agentes teratógenos

Entre las enzimas más importantes con función antioxidante se pueden contar

la SOD, la catalasa y la GSH-peroxidasa. La SOD convierte al -O2 en H2O2,

mientras que la catalasa y la GSH-peroxidasa son las encargadas de transformar el

H2O2 en agua (Figura 4), (Mason y Chignell, 1982; Dröge, 2002). Estas enzimas son

la forma de control más importante de las células, ya que su actividad es mucho

mayor en comparación con sistemas no enzimáticos (Figura 8), (Dröge, 2002).

Compuestos como el EUK-134, tienen un mecanismo que mimetiza al de las

enzimas mencionadas, ha sido utilizado para proteger a ratones de las

malformaciones en extremidades producidas por el etanol (Chen y col., 2004). La

catalasa disminuye la mortalidad temprana de células tratadas con hidroxiurea

(Przybyszewiski y col., 1982).

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Los agentes antioxidantes, quelantes y atrapadores de radicales libres aunque

presentan poca actividad se encuentran en grandes cantidades en la células (Figura

8). Muchos agentes atrapadores de radicales libres han sido utilizados para

contrarrestar los daños provocados por sustancias que al entrar en el organismo,

son bioactivados a este tipo de compuestos. La -feni-L-t-butilnitrona, revirtió la

teratogenicidad inducida con talidomida a conejos (Parman y col., 1999). La

vitamina E, uno de los más potentes antioxidantes fisiológicos, ha sido usada para

proteger de las malformaciones provocadas por fármacos como el ácido valproico y

la hidroxiurea (Przybyszewiski y col., 1987; Deeb y col., 2000).

Diversas sustancias que poseen propiedades antioxidantes y atrapadoras de

radicales libres pueden ayudar a proteger a los embriones de daños provocados por

ERO y ERN, una de ellas es la c-ficocianina, una proteína que proviene de diversas

especies de cianobacterias como Spirulina (Romay y col, 1998a; Bhat y Madyastha,

2000; Estrada y col, 2001; Bhat y Madyastha, 2001; Vázquez-Sánchez, 2006).

1.7 Spirulina

1.7.1 Características

Spirulina es una cianobacteria filamentosa multicelular que contiene del 60 % al

71 % de proteína cruda, lo cual la hace una excelente fuente de proteínas, en

comparación con el maíz, el arroz y la soya. Esta cianobacteria crece en aguas

volcánicas con pH alcalino y se tienen registros de su existencia que datan desde

hace aproximadamente 3.5 mil millones de años. Su estructura celular es de forma

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espiral y similar a la de los procariotes simples (Figura 9), (Ciferri, 1983; Becker,

1983; Campanella y col., 1999).

En 1940 el fisiólogo francés Dangeard describió que la población nativa africana,

que vivía en las inmediaciones del lago Chad, consumía un alga microscópica en

forma de panes llamados dihé. Veinticinco años después el botánico J. Leonard,

confirmó que el dihé estaba constituido por masas secas de Spirulina platensis,

colectada de los lagos alcalinos de la zona. Al mismo tiempo, un grupo francés

investigaba otra especie de la cianobacteria, Spirulina maxima, que crecía en el

lago de Texcoco, cerca de la Ciudad de México. La literatura histórica reveló que

ésta era cosechada, secada y consumida por los indígenas con el nombre de

Tecuitlat, costumbre que desapareció después de la conquista española (Ciferri,

1983).

Figura 9. Alga Spirulina. a) Micrografía electrónica del alga Spirulina sp. (Ceferri, 1983), b)

micrografía electrónica coloreada (mx.encarta.msn.com/Algas_verdeazuladas.htmL).

a) b)

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Su consumo como fuente de alimentación es uno de los mejor documentados.

Las especies de Spirulina más utilizadas para consumo humano, son S. platensis y

S. maxima; su producción rebasa las mil toneladas métricas anuales. Esta alga

crece en muchas regiones del mundo incluyendo a México (Ciferri, 1983; Dillon y

col., 1995; Khan y col., 2005).

En diversos estudios relacionados con su composición química y

nutrimental, se ha observado que Spirulina es una fuente importante de proteínas,

vitaminas, aminoácidos y ácidos grasos esenciales, minerales, compuestos

fenólicos y otros constituyentes con beneficios potenciales para la salud como la c-

ficocianina y calcio spirulan. (Campanella y col., 1999; Belay, 2002; Chamorro y

col., 2002; Mendes y col., 2003).

Spirulina spp posee actividades biológicas y farmacológicas que han sido

reportadas por muchos autores y que se encuentran resumidas en revisiones

hechas por: Belay y col., (1993, 2002), Chamorro y col., (1996, 2002, 2008), y

Khan y col., (2005). Muchas de estas propiedades han sido relacionadas o

atribuidas principalmente a su capacidad antioxidante mediante la destrucción de

ERO y ERN (Hayashi y col., 1993; Romay y col., 1998b; Torres-Durán, y col.,

1998; González y col., 1999; Torres-Durán, y col., 1999; Reddy y col., 2000; Hong-

Quan y col., 2001; Bhat y Madyastha, 2001; Pardhasaradhi y col., 2003; Teas y

col., 2004; Torres-Durán, y col., 2006), (Tabla 3).

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Tabla 3. Actividades farmacológicas reportadas para el alga Spirulina y algunos de sus

componentes.

Efecto Referencias

Antialérgico Cingi y col., 2008; Mao y col., 2005; Remirez y col., 2005; Remirez y col.,

2002a

Antiartrítica Remirez y col., 1999

Antibacterial Mendiola y col., 2007; Ozdemir y col., 2004; Varga y col., 2002

Anticancerígeno Chen y col., 2008; Roy y col., 2007; Wang y col., 2007; Li y col., 2006; Li y

col., 2005; Subhashini y col., 2004; Pardhasaradhi y col., 2003; Reddy y

col., 2003; Bobbili y col., 2003; Schwartz y Shklar, 1987

Anticoagulante Hsiao y col., 2005; Yamamoto y col., 2005; Kaji y col., 2002

Antigenotóxica Chamorro y col., 2007; Premkumar y col., 2004; Ruiz y col., 2003;

Prenkumar y col., 2001

Antihipertensivo Mascher y col., 2006; Suetsuna y Chen, 2001

Antiinflamatoria Dartsch., 2008; Cherng y col., 2007; Remirez y col., 2002c; Romay y col.,

2001; Reddy y col., 2000; González y col., 1999; Romay y col., 1998a;

Romay y col., 1998b

Antioxidante Bermejo-Bescós y col., 2008; López-Alarcón, y col., 2007; Mendiola y col.,

2007; Wang col., 2007; Huang y col., 2006; Ge y col., 2006; Wu y col.,

2005; Bhat y Madyastha, 2001; Estrada y col., 2001; Kaushik y col., 2001;

Bhat y Madyastha, 2000; Romay y col., 1998a

Antitóxica

Misbahuddin y col., 2006; Jeyaprakash and Chinnaswamy, 2005; Sharma

y col., 2005; Saxena and Kumar, 2004; Sánchez y col., 2003; Upasani y

Balaraman, 2003

Antiviral Lee y col., 2007; Rahman y col., 2005; Teas y col., 2004; Lee y col., 2001;

Hayashi y col., 1993

Hepatoprotectora Karadeniz y col., 2008; Torres-Durán y col., 2006; Sathyasaikumar y col.,

2007; Wu y col., 2005; Blé-Castillo y col., 2002; Remírez y col., 2002b;

Vadiraja y col., 1998; Bhat y col., 1998

Hipocolesterolemiante Park y col., 2008; Torres-Duran y col., 2007; Riss y col., 2007; Nagaoka y

col., 2005

Inhibe la producción

del TNF- y NO

Romay y col., 2001

Inmunoestimulante Løbner y col., 2008; Del Valle y col., 2008; Watanuki y col., 2006

Nefroprotectora Avdagić y col., 2008; Khan y col., 2006; Sharma y col., 2007; Farooq y

col., 2006; Farooq y col., 2005; Farooq y col., 2004a; Farooq y col.,

2004b; Sharma y col., 2004

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Bermejo-Besc%C3%B3s%20P%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

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Tabla 3. Actividades farmacológicas reportadas para el alga Spirulina y algunos de sus

componentes (continuación).

Efecto Referencias

Neuroprotectora Wang y col., 2005; Stromberg y col., 2005; Gemma y col., 2002; Rimbau y

col., 1999

Nutricional Simsek y col., 2008; Simpore y col., 2006; Simpore y col., 2005

Quimio y

radioprotectora

Hong-Quan, 2001

Otras Voltarelli y col., 2008; Kim y col., 2008; Karaca y Simsek, 2007;

Madhyastha y col., 2006; Ishimi y col., 2006

1.7.2 Actividad antioxidante del alga Spirulina

La actividad antioxidante de diversos componentes de Spirulina ha sido objeto

de numerosas investigaciones. Piñero y col. (2001), observaron que las

ficobiliproteínas que el alga contiene (ficocianina, aloficocianina y ficoeritrina), son

potentes atrapadores de radicales libres e inhiben la peroxidación lipídica y

demostraron que la actividad antioxidante de las proteínas juntas es mayor que

cuando están puras.

Además de estas proteínas, Spirulina cuenta con numerosos componentes

como: flavonoides, fenoles, vitaminas C y E, -caroteno y glutatión en su forma

reducida (GSH), cuyas propiedades antioxidantes ya han sido estudiadas en el alga

(Jeyaprakash y Chinnaswamy, 2005; Saxena y Kumar, 2004; Miranda y col., 1998).

1.7.3 C-ficocianina

La c-ficocianina es una ficobiliproteína, soluble en agua, que se puede obtener

de diferentes especies de algas verde-azules o cianobacterias, como Spirulina sp

(agua dulce), Phormidium sp (agua salada), y Lyngbya sp (agua salada), en las que

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se encuentra en una concentración muy alta en comparación con otros pigmentos

que contienen. La c-ficocianina es una proteína compuesta por dos subunidades:

(~17 KDa) y (~18 KDa). En su estructura se encuentra un cromóforo tetrapirrólico

de cadena abierta (ficocianobilina), unido covalentemente a la apoproteína, una

molécula a la subunidad y dos a la (Figura 10). Esta proteína sirve como fuente

de nitrógeno en condiciones desfavorables para las células y como un transmisor de

la energía luminosa, proveniente del Sol, a los cloroplastos en la célula (Patel y col.,

2005; Yoshida y col, 1996; Zhang y Chen, 1999; Herrera y col, 1989; Boussiba and

Richmond, 1980 y 1979; Berns y col., 1962).

La c-ficocianina posee propiedades antioxidantes (Bermejo-Bescós y col., 2008;

Huang y col., 2006; Estrada y col, 2001; Romay y col, 1998a), como atrapadora de

radicales libres (Bhat y Madyastha, 2001; Bhat y Madyastha, 2000), inhibidora

selectiva de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), (Reddy y col., 2000; González y col.,

1999; Romay y col., 1998b), e inhibidora de la producción del factor de necrosis

tumoral-alfa (TNF-) y del NO (Romay y col., 2000). En realidad, muchos de los

efectos de Spirulina están o han sido relacionados a esta proteína.

La propiedad de atrapador de radicales libres de la c-ficocianina fue establecida

en estudios en los cuales se probó su reactividad con radicales peroxilo, hidroxilo y

superóxido; y se sugirió que el efecto estaba dado por el grupo cromóforo, pero

después se observó que su actividad era mayor que la de la ficocianobilina,

sugiriéndose que algunos residuos de tirosina y triptofano podrían tener

interacciones con los radicales y así aumentar su actividad (Bhat y Madyastha, 2001

y 2000). Asimismo, se ha evidenciado su efecto protector contra los daños al ADN


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(rompimiento de hebras), producidos por el ONOO-, en forma dependiente de la

dosis (Bhat y Madyastha, 2001).

Figura 10. C-ficocianina. a) Estructura tridimensional de la c-ficocianina (Wang y col., 2003), b)

estructura química y tridiensional de los tetrapirroles de cadena abierta de la c-ficocianina

(Kunk, 2003).

1.7.4 Actividad antigenotóxica del alga Spirulina

Se han publicado varios trabajos de investigación en los que se evidencia el

papel de Spirulina en la protección contra el daño genotóxico causado por diversos

agentes como: ciclofosfamida (Chamorro-Cevallos y col., 2007), ciclofosfamida y

mitomicina-c (Premkumar y col., 2001), ciclofosfamida y radiación con 60Co-

(Hong-Quan y col., 2001), y rayos-X (Klingler y col., 2002), y rayos- (Quishen y col.,

1989), hidracida maleica (Ruiz y col., 2003), y cisplatino y uretano (Premkumar y

col., 2004).

b)

a)

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En las investigaciones realizadas por Premkumar y col. (2001 y 2004), se

relacionó la protección del alga contra los efectos genotóxicos de los compuestos

cisplatino, uretano, ciclofosfamida y mitomicina-C, con sus propiedades

antioxidantes por medio de la medición de los niveles de GSH y peróxidos lipídicos

y la actividad de enzimas como: glutatión peroxidasa (GPx), glutatión-S-transferasa

(GST), superóxido dismutasa (SOD), y catalasa.

Por otro lado, Ruiz y col. (2003), propusieron que la protección contra la

hidracida maleica estaba dada por diversos componentes del alga, tales como:

clorofilina, -caroteno, ácido palmítico, glucanos y luteína, conocidos compuestos

antigenotóxicos.

Por último, Hong-Quan y col. (2001), además de relacionar el efecto protector de

Spirulina a sus propiedades antioxidantes, también lo hicieron a su efecto como

estimulador de la proliferación celular, actividad atribuida a un polisacárido

encontrado en la membrana del alga.

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2. JUSTIFICACIÓN

Las malformaciones congénitas representan una de las primeras de causas de

mortalidad infantil a nivel mundial. En México, se ubican como la segunda causa. Lo

anterior hace necesaria la búsqueda de sustancias que puedan ser incorporadas

como parte de la dieta y que ayuden a la prevención de anormalidades en el

desarrollo al interferir con los mecanismos por los cuales dichas sustancias

provocan sus efectos tóxicos.

Spirulina maxima es una cianobacteria que ha sido utilizada desde épocas

prehispánicas por sus propiedades nutricionales y presenta una actividad

importante como antioxidante, La cual se ha atribuido principalmente a su extracto

proteico, el cual presenta una cantidad importante de la ficobiliproteína c-ficocianina.

Asimismo, ambas sustancias han sido utilizadas para proteger contra los efectos de

varios compuestos y agentes genotóxicos. Por otro lado los mecanismos por los

que la hidroxiurea causa toxicidad son la generación de radicales libres, especies

reactivas de oxígeno y la inhibición de la síntesis de ADN. Por esta razón se desea

determinar si Spirulina maxima y el extracto de c-ficocianina son capaces de

proteger de los efectos teratogénicos, citotóxicos y genotóxicos provocados por la

hidroxiurea.

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3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Estudiar el efecto de Spirulina maxima y del extracto de c-ficocianina contra la

teratogenia y genotoxicidad producidas por hidroxiurea.

3.2 OBJETIVOS PARTICULARES

Obtener e identificar el extracto de c-ficocianina a partir del alga Spirulina

maxima.

Determinar si Spirulina maxima puede proteger contra la teratogénesis producida

por hidroxiurea en un modelo murino in vivo.

Investigar si el efecto protector de Spirulina máxima y el extracto de c-ficocianina

puede deberse a su actividad antioxidante.

Observar si Spirulina maxima y el extracto de c-ficocianina protegen de la muerte

celular inducida con HU a cultivos primarios de fibroblastos de embriones

completos de ratón de 11 días, así como de sus primordios y encéfalo, antes y

después de la 24 h de iniciado el cultivo.

Establecer los efectos de Spirulina máxima y el extracto de c-ficocianina sobre la

genotoxicidad provocada por hidroxiurea en ratones gestantes y sus productos.

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4. HIPÓTESIS

Si S. maxima y el extracto de c-ficocianina son capaces de bloquear los

mecanismos por los cuales la hidroxiurea produce teratogenicidad, citotoxicidad y

genotoxicidad, (inhibición de la síntesis de ADN y producción de radicales libres y

especies reactivas de oxígeno), entonces podrán proteger el desarrollo

embrionario, a las células en cultivo y al ADN de los efectos tóxicos de la

hidroxiurea.

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5. MATERIAL Y METODOS

5.1 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO C-FICOCIANINA

El extracto de c-ficocianina se obtuvo del alga Spirulina maxima mediante el

siguiente procedimiento: un gramo del alga (base seca) se resuspendió en 10 mL

de solución amortiguadora de fosfatos (PBS), pH 7.2 (NaCl, 8.0 g/L; KCl, 0.2 g/L;

Na2HPO4, 2.9 g/L y KH2PO4, 0.8 g/L), y se mantuvo en la oscuridad a 4 °C

durante 16 h. El extracto crudo se centrifugó a 13 000 rpm x 2 y a 35 000 rpm x 2

durante 15 min y 30 min, respectivamente, a 4 °C. En ambos casos se eliminó el

precipitado que contenía los restos celulares (color verde), y se utilizó el

sobrenadante que contenía la c-ficocianina (color azul).

El extracto clarificado, que se obtuvo de la ultracentrifugación, se dializó en

solución de fosfatos 0.01 M a 4 °C, en oscuridad, utilizando una membrana de 12

000 Da de poro durante 5 días, al término de los cuales fue liofilizado.

Alícuotas de 30 μl del extracto clarificado-dializado, sobrenadantes y

precipitados de los extractos clarificado y crudo, c-ficocianina (SIGMA®), y

marcador de peso molecular SIGMAMARKER (SIGMA®), se corrieron en una

electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida al 10 % (SDS-PAGE). El

gel se preparó como se indica en la tabla 4.

Para determinar la concentración de la c-ficocianina en las diferentes muestras,

se hicieron lecturas en un espectrofotómetro de UV a 620 nm, 650 nm y 280 nm y

se calculó el coeficiente “r” (que indica de forma relativa cuanta c-ficocianina hay en

la muestra, es decir, su pureza), utilizando las siguientes fórmulas (Pádula y col.,

1996):

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r = 620 / 280

Cc-ficocianina = (166 x 620) – (108 x 650)

r = índice de pureza de c-ficocianina en la muestra

280 = Absorbancia a una longitud de onda de 280 mn



Tabla 4. Composición del SDS-PAGE al 10 %.

Componentes Gel

concentrador (mL)

Gel

separador (mL)

Acrilamida 2.12 0.50 Amortiguador 1.35 0.41

TEMED 0.005 0.003 Agua milliQ 1.47 2.1

Persulfato de amonio

(PSA) al 10% 0.05 0.03

Nota: SDS-PAGE al 10 % permite caracterizar las proteínas de 10 000 a 100 000 Da de peso molecular que

conforman el extracto clarificado.

Asimismo, se obtuvo el espectro ultravioleta (UV), del extracto, con la finalidad

de corroborar su presencia en el mismo por medio de la máxima longitud de onda

de absorción, que en el caso de la c-ficocianina es de aproximadamente 620 nm.

5.2 ANIMALES Y ACOPLAMIENTOS

Para todos los experimentos se utilizaron ratones machos y hembras de la cepa

ICR, de 25 ± 2 g de peso, los cuales se aclimataron durante un período de 14 días,

bajo condiciones de temperatura y humedad controladas; así como un ciclo de luz-

oscuridad de 12 h (iluminación a las 9 h), alimento y agua ad libitum. Las hembras

se dispusieron a razón de 3/jaula y los machos 1/jaula (por separado).

Una vez concluido el período de aclimatación se procedió a realizar los

acoplamientos, para lo cual se colocaron los machos con las hembras durante dos

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horas, antes del inicio del ciclo de luz, al término de las cuales se regresaron los

machos a sus jaulas y se verificó el acoplamiento mediante la presencia del tapón

espermático en la vagina de las hembras. Las hembras que presentaron el tapón

fueron separadas del resto, se pesaron y distribuyeron aleatoriamente en los

diferentes grupos para los estudios correspondientes.

5.3 ESTUDIO DE TERATOGÉNESIS

Las animales gestantes se distribuyeron aleatoriamente en 7 grupos, de 10

animales cada uno, con diferentes tratamientos (Tabla 5).

Tabla 5. Tratamientos a los que se sometieronlos diferentes grupos.

Grupo Tratamiento Concentración

(mg/kg) Días de

administración Día de

sacrificio 1 Vehículo -------------- 0-10 11

2 HU (SIGMA®) 300 8 11

3 Solución de tween 80 -------------- 0-10 11

4 S. maxima 1000 0-10 11

5 HU* (300mg/kg) + S.

maxima

100 0-10 11

6 500 0-10 11

7 1000 0-10 11

La HU se administró sólo el día 8, una hora después de Spirulina. El agua y la solución de

tween 80 se administraron vía oral del día 0 al 10. El tween 80 se utiliza para suspender

Spirulina en agua. Spirulina y la HU se administraron vía oral e i.p., respectivamente.

Las hembras se sacrificaron el día 10 de la gestación, de acuerdo a Warner y

col. (1983), y se explantaron los embriones de la siguiente manera: se realizó un

corte en “V” en la región abdominal de la hembra, se retiraron los cuernos uterinos

y se obtuvieron los embriones con sus diferentes cubiertas embrionarias. Se

limpiaron del trofoblasto y determinó la frecuencia cardiaca embrionaria y el

diámetro (DSV), y vascularidad del saco vitelino (VSV). Posteriormente, se

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retiraron las membranas vitelina y amniótica, se midieron en los embriones las

longitudes coronilla-grupa (LCG), y cefálica (LC), además se evaluó el desarrollo

morfológico con base en la escala de calificación propuesta por Brown y Fabro en

1981. Únicamente se evaluaron los embriones que presentaron latido cardiaco.

Los que tuvieron 1 ó más diferencias en el desarrollo se consideraron anormales y

se registraron las alteraciones por tipo y localización.

5.4 ESTUDIO DE PEROXIDACIÓN LIPÍDICA Y

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

El estudio de peroxidación lipídica se realizó mediante la cuantificación de

TBARS; para ello, se obtuvieron 6 embriones de cada una de 5 hembras

gestantes de los grupos 1, 2, 3, 4, 5 y de 2 grupos adicionales tratados con el

extracto de c-ficocianina e HU (Tabla 6).

Tabla 6. Tratamientos a los que se sometieron los grupos adicionales para el estudio de

TBARS y la cuantificación de proteínas.

Grupo Tratamiento Concentración

(mg/kg)

Días de

administración

Día de

sacrificio

8 Extracto de c-ficocianina 400 0-10 11

9 HU* (300mg/kg) +

extracto de c-ficocianina 400 0-10 11

La HU sólo se administró i.p. el día 8, una hora después del extracto de c-ficocianina vía oral.

Se limpió a los embriones de sus cubiertas embrionarias y se colocaron a razón

de 6 en 2 mL de solución reguladora de fosfatos (PBS), pH 7.4, se sonicaron y se

realizó la prueba de TBARS en 1 mL de la suspensión. Con la suspensión restante

se realizó la cuantificación de proteínas por el método de Bradford (1976). Con los

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resultados de ambos métodos se cuantificó el contenido de MDA, en los embriones

de acuerdo a Paniagua-Castro y col. (2008).

5.5 CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS EMBRIONARIAS DE

EMBRIONES COMPLETOS, ENCÉFALO Y PRIMORDIOS DE

EXTREMIDADES ANTERIORES

Los cultivos celulares fueron realizados a partir de embriones explantados de

11 días de gestación. Para la explantanción se siguió el mismo procedimiento que

en el estudio de teratogénesis in vivo pero en condiciones asépticas. Los úteros se

colocaron en PBS-antibiótico (100:1), pH de 7.2, se abrieron y sacaron los

embriones con su trofoblasto mismos que se transfirieron a otra caja petri con PBS.

Se les retiraron el trofoblasto y el saco vitelino y nuevamente se transfirieron a otra

caja petri con PBS limpio. Una vez ahí los embriones fueron seccionados de la parte

cefálica, desde el diencéfalo hasta el mielencéfalo, evitando tomar parte de las

vesículas ópticas y óticas (Figura 11). También se utilizaron los primordios de las

extremidades delanteras los cuales fueron cortados desde su base (Figura 11).

Embriones completos, la parte cefálica y primordios fueron transferidos, por

separado, a matraces Erlenmeyer con 10 mL de una solución de PBS-tripsina

(250:1), y se mantuvieron en agitación por 15 min. Pasado ese tiempo, se

adicionaron 3 mL de medio de cultivo Ham F12-DMEM modificado, complementado

con suero y antibiótico (100:10:1.5), (medio Ham F12-DMEM), para neutralizar la

tripsina. La suspensión celular se filtró con tela de nylon de aproximadamente 0.25

m de porosidad y se centrifugó a 800 rpm durante 10 min. El sobrenadante se

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decantó y las células fueron resuspendidas en 3 mL de medio de cultivo Ham F12-

DMEM. La viabilidad y concentración celulares fueron evaluadas mediante la

técnica de exclusión de azul de tripano en una cámara de Neubauer.

Figura 11. Fotografías de embriones de 11 días en las que se muestran las partes de los

embriones que se utilizaron para el cultivo primario de células. a) Parte del encéfalo y b)

primordios de extremidades delanteras.

Con las suspensiones celulares se sembraron microplacas de 96 pozos, con

una concentración celular de 10000 células por pozo, en un volumen final de 100 l,

para determinar el efecto citotóxico de S. máxima, el extracto de c-ficocianina e HU

y el efecto protector de S. máxima y el extracto de c-ficocianina contra la

citotoxicidad producida por HU. De todas las placas se hicieron cultivos simultáneos

para 4 tiempos de medición (2h, 4h, 24h y 48h). Las microplacas fueron incubadas

por 4 h a 37 °C, en atmósfera al 5 % de dióxido de carbono (CO2), y humedad.

5.5.1 Pruebas de citotoxicidad para S. maxima, el extracto de c-

ficocianina e HU

Después de 4 h de incubación, a las microplacas se les retiró el medio de

cultivo Ham F12-DMEM y se reemplazó por medio fresco en todos los pozos,

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excepto en aquellos cuya células fueron tratadas con S. máxima, el extracto de c-

ficocianina o HU, en los que se adicionó el medio con las diferentes

concentraciones de estos (Figura 12, Tabla 7).

Figura 12. Diseño de la microplaca utilizado para la determinación de la a) CL50 y b) del

efecto protector del alga o el extracto sobre la citotoxicidad producida por HU.

Las placas se incubaron por 48 h más, durante las cuales se leyeron en un

espectrofluorómetro a los tiempos de 2 h, 4 h, 24 h y 48 h, para ello, se adicionaron,

30 min antes, 20 l de una solución del colorante resasurina al 0.015%. El estudio

se realizó por cuadruplicado para cada tratamiento.

Tabla 7. Concentraciones de S. maxima, extracto de c-ficocianina e HU a las que se sometió a

las células de los diferentes cultivos.

Concentraciones S. máxima/ extracto de c-

ficocianina (mg/mL)

HU

(mM)

Concentraciones S. máxima/ extracto de c-

ficocianina (mg/mL)

HU

(mM)

1 16 2.0 5 1 0.12

2 8 1.0 6 0.5 0.06

3 4 0.5 7 0.25 0.03

4 2 0.25 8 0.125 0.015

b) a)

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5.5.2 Determinación del efecto protector de S. máxima y el

extracto de c-ficocianina sobre la citotoxicidad producida por HU

Una vez que se cumplieron 4 h de iniciado el cultivo, se retiró el medio y se adicionó

otro fresco a todos los pozos, excepto a los tratados con S. máxima, a los que se

les agregaron suspensiones y soluciones con las diferentes concentraciones del

alga y el extracto, respectivamente, y se incubaron por otras 24 h. Pasado este

tiempo, se retiró el medio y se adicionó nuevo a todos los pozos, excepto a los

tratados con hidroxiurea a los que se les agregó medio con el fármaco a una

concentración de 0.5 mM (Figura 12). La placa se mantuvo en incubación 48 h más,

durante las cuales se tomaron lecturas en un espectrofluorómetro a los tiempos de

2 h, 4 h, 24 h y 48 h, utilizando el colorante resasurina (0.015%). El estudio se

realizó por cuadruplicado para cada tratamiento.


Y EL EXTRACTO DE C-FICOCIANINA SOBRE LA GENOTOXICIDAD

PRODUCIDA POR HU

Para la determinación del efecto de S. máxima y el extracto de c-ficocianina

sobre la genotoxicidad inducida con hidroxiurea se utilizaron hembras acopladas,

las cuales fueron distribuidas en 11 grupos de 2 animales cada uno (Tabla 8). Las

hembras se pesaron y sacrificaron el día 19 de la gestación y se explantaron los

fetos de la siguiente manera: se realizó un corte en “V” a la hembra en la región

abdominal, se retiraron los cuernos uterinos y se obtuvieron los fetos con su

placenta y saco vitelino. Se retiraron la placenta y el saco vitelino; se limpiaron,

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sexaron, midieron, pesaron y verificaron malformaciones externas en los fetos. La

placenta también se limpió, midió y pesó.

A 3 fetos machos y 3 hembras de cada madre, se les realizó un corte en el

cuello para preparar dos frotis sanguíneos de cada uno. A la madre se le realizó un

corte en la cola para hacer frotis. Todos fueron fijados en metanol, durante 10 min, y

teñidos con el colorante de Giemsa para el recuento de micronúcleos.

Se contaron los eritrocitos micronucleados (EMN), en un total de 10000

eritrocitos totales (ET), los eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN), en

1000 eritrocitos policromáticos (EPC), y finalmente los EPC en 1000 ET.

Tabla 8. Tratamientos a los que se sometieron los diferentes grupos para el estudio de

genotoxicidad.

Grupo Tratamiento Agua Agua + Tween

80

Spirulina (mg/kg)

Extracto de c-ficocianina

(mg/kg) HU

(300 mg/kg)

100 500 1000 100 200 400

1 Testigo X

2 Tween 80

X

3 Hidroxiurea

X

4 Spirulina

X

5

Spirulina + HU

X

X

6

X

X

7

X X

8 Extracto de c-ficocianina

X

9

Extracto de c-ficocianina + HU

X X

10

X X

11

X X

La HU se administró i.p., sólo el día 16, una hora después de Spirulina y del extracto. El agua y

la solución de tween 80 se administraron vía oral del día 10 al 18. El tween 80 se utiliza para

suspender Spirulina en agua. Spirulina y el extracto se administraron del día 10 al 18, vía oral.

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5.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El análisis estadístico de las variables DSV, LCG, LC del número de somitas y

calificación morfológica, se realizó con ANOVA de una vía y se utilizó la prueba de

Tukey en los casos en los que se observó diferencia significativa. Las

anormalidades y su frecuencia se analizaron por medio de las pruebas de chi-

cuadrada (2), y exacta de Fisher. Asimismo, el análisis estadístico de TBARS,

proteínas y micronúcleos se realizó con ANOVA de una vía y se utilizó la prueba de

Tukey, cuando se presentó diferencia significativa. Para el análisis de los resultados

de los cultivos celulares las lecturas de unidades relativas de fluorescencia (URF),

fueron transformadas en porcentajes y después en valores paramétricos por medio

del arco-seno de la razón del porcentaje en fracciones de uno. La variación entre las

concentraciones fue determinada por una ANOVA bifactorial de una vía y se aplicó

la prueba de Tukey cuando se encontró diferencia significativa.

En todos los casos la diferencia significativa se determinó con una probabilidad

menor al 0.05 (p < 0.05), y todo el análisis se realizó con los programas Microsoft

Excel 2003® y Sigma Stat® Statistical Software versión 2.03.

42


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O

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6. RESULTADOS

6.1 EXTRACTO DE C-FICOCIANINA

Una vez que se obtuvo el extracto, se procedió a realizar los cálculos para

determinar la concentración de c-ficocianina y su pureza, las cuales fueron de 172.9

± 0.013 g/mL y 2.21, respectivamente.

Mediante la SDS-PAGE al 10 %, se comprobó la presencia de la c-ficocianina

en las muestras del extracto clarificado-dializado. En la figura 13 sólo se muestra la

SDS-PAGE para la c-ficocianina (SIGMA®), el extracto clarificado y el extracto

clarificado dializado, con un marcador de peso molecular (Sigmamarker-Sigma®).

Figura 13. SDS-PAGE al 12 %. En los círculos se observan las áreas en las que se encontraba la

c-ficocianina.

El espectro de UV del extracto de c-ficocianina, también confirmó su presencia,

obteniéndose un pico máximo de absorción de 620.74 (Figura 14).

C-ficocianina

(SIGMA)Extracto de c-ficocianinaMarcador de peso

molecular (Kda)

C-FICOCIANINA

43


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Figura 14. Espectro UV del extracto de c-ficocianina. Señalado con la línea verde se observa el

pico máximo de absorción del extracto, el cual corresponde al reportado para c-ficocianina.

6.2 ESTUDIO DE TERATOGÉNESIS

6.2.1 Grupo testigo de agua

De los 152 embriones procedentes de 10 hembras, 150 fueron viables y se

analizaron, encontrándose que 4 presentaban anormalidades como: retraso en el

desarrollo de extremidades, falta de cierre del tubo neural e interrupción en el giro,

mientras que los otros tenían un desarrollo normal. Se observó que de las 10

camadas evaluadas, en 2 se presentaron defectos en el desarrollo y los promedios

de DSV, CR y LC fueron parecidos a los de otros grupos (Tablas 9, 10 y figuras 15 y

16).

6.2.2 Grupo testigo de tween 80

El tween 80 se utilizó para poder suspender S. maxima en agua, por lo que se

consideró necesario tener un grupo testigo de este agente tensoactivo. De los 161

449.7 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 701.6

0.06

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

2.6

2.8

3.06

nm

A

620.74

44


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embriones, procedentes de 10 hembras, 158 fueron viables y se analizaron,

encontrándose que 3 presentaban anormalidades en el desarrollo parecidas a las

del grupo testigo y los promedios de DSV, LCG y LC fueron parecidos a los de otros

grupos (Tablas 9 y 10 y figura 15).

6.2.3 Teratogenicidad in vivo de S. maxima

En las tablas 9 y 10 se observa que S. maxima no produjo alteraciones en el

desarrollo embrionario a la concentración utilizada para el estudio. Al comparar

parámetros como el DSV, LCG y LC, no se observan diferencias, tampoco en la

viabilidad y mortalidad embrionarias, ni en el número de camadas afectadas con

respecto al testigo. Solo los sacos vitelinos de los embriones cuyas madres

recibieron S. maxima presentaron mayor vascularización con vasos de mayor

diámetro (Figuras 15 y 16).

6.2.4 Teratogenicidad in vivo inducida con hidroxiurea

En el grupo tratado con HU se observó una disminución en la viabilidad y

calificación morfológica. Hubo aumento en el número y tipo de alteraciones en el

desarrollo embrionario, en el DSV, LCG, LC y en las camadas afectadas. De los 159

embriones explantados, 85 no eran viables y 53 presentaban defectos (Tablas 9 y

10). Entre las alteraciones observadas se encuentran falta de cierre de tubo neural y

de los procesos nasal y mandibular, falta de desarrollo en las extremidades,

interrupción en el giro. En la mayoría de los casos el tubo neural caudal estaba

cerrado pero no había fusión de pliegues. En su parte posterior (metencéfalo), el

45


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S

cerebro presentaba un neuroporo abierto y en las partes media y posterior

(mesencéfalo y telencéfalo), los pliegues neurales estaban formados pero no se

habían cerrado. También los procesos nasal y maxilar estaban separados y el

mandibular presentaba barras branquiales sin fusionar. En los primordios de

extremidades anteriores no se observaba la parte distal diferente y en algunos casos

no se formaba la paleta, mientras que en las posteriores solo se presentaban las

yemas. Por último se observaron diferencias significativas en el puntaje morfológico

y en el contenido de proteína (Figuras 15 y 16).

6.2.5 Efecto de S. maxima sobre la teratogénesis inducida con

HU

En los grupos tratados simultáneamente con S. maxima e HU se observó una

disminución en la mortalidad embrionaria y en el número de camadas afectadas

(Tabla 9). Asimismo, se presentaron defectos en el desarrollo en 23, 9 y 7 embriones

de los grupos tratados con HU y 100 mg/kg, 500 mg/kg y 1000 mg/kg de S. maxima

respectivamente. La vascularización del SV y su circulación se incrementaron. Los

vasos del SV de estos embriones fueron más gruesos, similar a los del grupo que

sólo recibió S. maxima. El número de embriones afectados disminuyó con respecto

al grupo de HU. Sin embargo, en el grupo de 100 mg/kg de S. maxima + HU se

observaron algunos de los defectos encontrados en el grupo tratado con HU, y al

realizar el análisis estadístico se observaron diferencias significativas con respecto al

testigo. Asimismo se observó que los valores de puntaje morfológico y contenido

46


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proteico no presentaron diferencia con respecto a los del testigo negativo (Tablas 9 y

10 y figuras 15 y 16).

Tabla 9.- Parámetros generales que muestran el efecto de S. maxima sobre la teratogénesis in

vivo inducida por HU en ratón.

Grupo Tratamiento

(mg/kg)

Hembras (madres)

Embriones

Total Con

embriones anormales

Total Implantes muertos

No viables

Viables Anormales

1 Agua 10 4b 152 3 10b 142b 5b

2 Tween 80 (0.005%)

10 2b 161 3 3b 158b 3b

3 HU 300 10 8 152 4 74 78 53

4 Spirulina 1000

10 1b 148 2 0b 148b 2b

5 Spirulina 100 + HU

10 4b 150 3 3b 147b 23


10 2b 149 5 4b 145b 9b


10 1b 157 3 5b 152b 7b

a diferencia estadística con los grupos 1 and 2.

b diferencia estadística con el grupo 3.

p ≤ 0.05. HU: Hidroxiurea (300mg/kg).

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Tabla 10.- Efecto de S. maxima sobre el grado de desarrollo embrionario in vivo en embriones

cuyas madres fueron tratadas con HU.

Grupo Tratamiento

(mg/kg)

Parámetros embrionarios

DSV LCG LC Puntaje morfológico

Número de

somitas

Contenido de

proteínas (mg)

1 Agua 4.69 ± 0.03

4.38 ± 0.03

2.19 ± 0.03

60.11 ± 0.03b

39.78 ± 0.16

291.77 ± 0.43b

2 Tween 80 (0.005%)

4.67 ± 0.04

4.36 ± 0.05

2.14 ± 0.04

60.29 ± 0.21b

39.75 ± 0.12

290.87 ± 0.52b

3 HU 300 4.57 ± 0.03

4.32 ± 0.03

2.18 ± 0.03

55.15 ± 0.75

39.68 ± 0.13

261.26 ± 0.87

4 Spirulina 1000 4.68 ± 0.03

4.34 ± 0.03

2.25 ± 0.03

60.42 ± 0.04b

39.76 ± 0.11

285.96 ± 0.64b


4.61 ± 0.03

4.34 ± 0.04

2.23 ± 0.03

60.23 ± 0.02b

39.79 ± 0.10

288.25 ± 0.43b


4.65 ± 0.03

4.29 ± 0.03

2.19 ± 0.02

60.22 ± 0.03b

39.75 ± 0.12

293.72 ± 0.32b


4.72 ± 0.03

4.36 ± 0.03

2.24 ± 0.03

60.37 ± 0.04b

39.78 ± 0.09

311.04 ± 0.15a, b

a diferencia estadística con los grupos 1 and 2.

b diferencia estadística con el grupo 3.


DSV: diámetro del saco vitelino; LCG: longitud coronilla-grupa; LC: longitud cefálica.

El puntaje morfológico se evaluó de acuerdo a la escala de calificación de Brown y Fabro

(1981).

48


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Figura 15. Comparación de los grupos testigo (fila a), tween 80 (fila b), HU (fila c), y S. maxima

(fila d). Los grupos testigo, tween 80 y S. maxima presentaron un desarrollo normal, mientras

que en el de HU se pudieron observar varios tipos de alteraciones en el desarrollo. En la fila c se

observan las alteraciones que ocasionó la HU, la figura de la izquierda corresponde al saco

vitelino en el cual se observa una disminución de la vascularidad del SV, en las 2 siguientes, la

falta de cierre del tubo neural, y en la última, el retraso en el desarrollo de los procesos

mandibular y maxilar. Las flechas señalan las partes en las que la HU indujo defectos en el

desarrollo.

a)

b)

c)

d)

49


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Figura 16. Comparación de los grupos testigo (fila a), HU (fila b), S. maxima (1000 mg/kg), (fila

c), y S. maxima (1000 mg/kg), + HU (fila d). Los grupos testigo y S. maxima presentaron un

desarrollo normal, mientras que en el de HU se pudieron observar varios tipos de afecciones. En

la fila b se observan las alteraciones que ocasionó la HU, la figura de la izquierda corresponde a

la falta de cierre del tubo neural y de desarrollo en las extremidades delanteras, la segunda a la

interrupción en el giro y la última al retraso en el desarrollo de los procesos mandibular y

maxilar. Al administrar S. maxima a grupos tratados con hidroxiurea, se observó que ésta

previno sus efectos teratogénicos. Las flechas señalan las partes en las que la HU indujo defectos

en el desarrollo.

a)

b)

c)

d)

50


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O

S

6.3 DETERMINACIÓN DE LA PEROXIDACIÓN LIPÍDICA Y

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

El contenido de proteínas en los embriones cuyas madres fueron tratadas con

HU fue menor que en el resto de los grupos. Por otro lado, se observó que en los

animales tratados con la dosis más alta de Spirulina (1000 mg/kg), así como con el

extracto de c-ficocianina (400 mg/kg), el contenido de proteína fue mayor incluso al

de los testigos (Tabla 10). En la figura 17 se observa el contenido embrionario de

MDA. Los niveles de la peroxidación lipídica fueron mayores en el grupo de HU, con

respecto a todos los demás. Los grupos tratados solamente con Spirulina y el

extracto de c-ficocianina, presentaron un contenido de MDA mayor que los testigos.

Finalmente, los animales tratados con el alga y el extracto más la HU tuvieron

concentraciones menores incluso que los testigos.

Figura 17. Contenido embrionario de malondialdehído. a Diferencia significativa con el grupo HU;

b Diferencia significativa con los grupos testigos de agua y de tween 80;

c Diferencia significativa con los grupos Spirulina y extracto de c-ficocianina. p ≤ 0.05.

HU: hidroxiurea (300mg/kg); Spirulina (1000mg/kg); extracto de c-ficocianina (400mg/kg)

0

50

100

150

200

250

300

nM

MD

A/m

g p

rote

ína

a, b, c

a a

a, b

a, ba, b, c

Testigo agua

Testigo tween

HU Spirulina Extracto de c-ficocianina

Spirulina+ HU

Extracto de c-ficocianina

+ HUTratamientos

51


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S

6.4 DETERMINACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD DE S. maxima, EL

EXTRACTO DE C-FICOCIANINA E HU EN CULTIVOS PRIMARIOS DE

CÉLULAS EMBRIONARIAS DE EMBRIONES COMPLETOS,

ENCÉFALO Y PRIMORDIOS DE EXTREMIDADES ANTERIORES

Para determinar la citotoxicidad de Spirulina y del extracto de c-ficocianina, se

utilizaron 8 diluciones geométricas a partir de 16 mg/mL y hasta 0.125 mg/mL. Se

observó que ninguna de las 8 concentraciones probadas fue tóxica para las células

del cultivo primario en ninguno de los tiempos de medición e incluso que las células

a las que se les adicionaron las concentraciones más altas del alga y el extracto

presentaron un incremento en su proliferación y viabilidad (Figura 18).

En la determinación de la citoxicidad para la HU se utilizaron 8 diluciones

geométricas a partir de 2.0 mM y hasta 0.015 mM. Se observó que las 8

concentraciones utilizadas de HU fueron tóxicas para los tres tipos de células de

los cultivos primarios, en todos de los tiempos de medición. A las 48 h de

exposición sólo las células de encéfalo expuestas a concentraciones menores a

0.25 mM de HU, presentaron un incremento en la viabilidad, llegando a alcanzar

porcentajes como los del testigo sin HU (Figura 19).

6.5 DETERMINACIÓN DEL EFECTO PROTECTOR DE S.

maxima Y EL EXTRACTO DE C-FICOCIANINA SOBRE LA

CITOTOXICIDAD PRODUCIDA POR HU

52


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Para el estudio se seleccionó una concentración de 0.25 mM de HU, la cual fue

probada contra las 8 concentraciones de Spirulina y el extracto de c-ficocianina.

Como se observa en las figuras 20 y 21, tanto Spirulina como el extracto de

ficocianina presentaron un efecto protector en forma dependiente de la

concentración para todos los cultivos primarios. Sin embargo, dicha protección fue

más evidente en las células de los primordios. Asimismo, las concentraciones que

mejores efectos tuvieron, fueron las mayores a 1 mg/mL en tiempos de 24 h y 48 h.

Figura 18. Determinación del efecto citotóxico de Spirulina y el extracto de c-ficocianina para

cultivos primarios de encéfalo. En la figura superior a), se observa el efecto que tuvo Spirulina

sobre la viabilidad celular, a las 2 h, 4 h, 24 h y 48 h, de exposición. En la figura inferior b), se

presentan los resultados para el extracto de c-ficocianina. ECF.- Extracto de c-ficocianina.

80.00

90.00

100.00

110.00

120.00

130.00

140.00

2h

4h

24h

48h

0 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0 Spirulina (mg/ml)

Viab

ilida

d (%

)

a)

80.00

90.00

100.00

110.00

120.00

130.00

140.00

2h

4h

24h

48h

0 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0 ECF (mg/ml)

Viab

ilida

d (%

)

b)

53


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O

S

Figura 19. Determinación del efecto citotóxico de la HU para cultivos primarios. En las figuras

superior a), central b), e inferior c), se observa el efecto que tuvo la HU sobre la viabilidad

celular, a las 2 h, 4 h, 24 h y 48 h, de exposición, para los cultivos de células de embriones

completos, encéfalos y primordios, respectivamente.

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

2h

4h

24h

48h

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

2h

4h

24h

48h

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

2h

4h

24h

48h

0 0.015 0.03 0.06 0.12 0.25 0.50 1.00 2.00

0 0.015 0.03 0.06 0.12 0.25 0.50 1.00 2.00

0 0.015 0.03 0.06 0.12 0.25 0.50 1.00 2.00

HU (Mm)

HU (Mm)

HU (Mm)

Via

bili

dad

(%

)V

iab

ilid

ad (

%)

Via

bili

dad

(%

)

a)

b)

c)

54


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Figura 20. Determinación del efecto protector del extracto de c-ficocianina sobre la

citotoxicidad producida por HU. En las figuras superior a), central b), e inferior c), se observa

el efecto que tuvo el extracto de c-ficocianina sobre la citotoxicidad producida por HU, a las 2

h, 4 h, 24 h y 48 h, de exposición, para los cultivos de células de embriones completos, de

primordios y encéfalos, respectivamente. Spirulina (mg/mL). HU.- hidroxiurea (0.25mM).

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

140.00

160.00

180.00

200.00

2h

4h

24h

48h

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

140.00

160.00

180.00

200.00

2h

4h

24h

48h

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

140.00

160.00

180.00

200.00

2h

4h

24h

48h

Via

bili

dad

(%

)V

iab

ilid

ad (

%)

Via

bili

dad

(%

)

T HU Spirulina 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0Spirulina + HU

T HU Spirulina 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0Spirulina+ HU

T HU Spirulina 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0Spirulina + HU

a)

b)

c)

55


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Figura 21. Determinación del efecto protector del extracto de c-ficocianina sobre la

citotoxicidad producida por HU. En las figuras superior a), central b), e inferior c), se observa

el efecto que tuvo el extracto de c-ficocianina sobre la citotoxicidad producida por HU, a las 2

h, 4 h, 24 h y 48 h, de exposición, para los cultivos de células de embriones completos, de

primordios y encéfalos, respectivamente. ECF.- Extracto de c-ficocianina (mg/mL). HU.- hidroxiurea (0.25mM).

a)

b)

c)

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

140.00

160.00

180.00

200.00

2h

4h

24h

48h

Via

bili

dad

(%

)

T HU ECF 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0ECF + HU

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

2h

4h

24h

48h

Via

bili

dad

(%

)

T HU ECF 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0ECF+ HU

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

140.00

160.00

180.00

200.00

2h

4h

24h

48h

Via

bili

dad

(%

)

T HU ECF 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0ECF + HU

a)

b)

c)

56


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Y EL EXTRACTO DE C-FICOCIANINA SOBRE LA GENOTOXICIDAD

PRODUCIDA POR HU

Los resultados de este estudio muestran que tanto las madres como los fetos

de los grupos testigos de agua, tween 80, Spirulina y el extracto de c-ficocianina,

presentan una cantidad relativamente baja de EMN comparados con el número de

ET, así como de los EPCMN en un total de 1000 EPC. Por otro lado, la cantidad de

EPC en 1000 ET, si varió de las madres a los fetos, encóntrandose que en las

primeras el promedio de EPC era de 100-120, y en los fetos se encontraba en

valores de 700-800 EPC, aproximadamente, en un total de 1000 ET.

En general, todos los grupos tratados con HU presentaron un aumento en la

cantidad de EMN y EPCMN y una disminución, que sólo fue significativa en el caso

de las madres, de los niveles de EPC. Sin embargo, en los grupos que recibieron

Spirulina y el extracto de c-ficocianina, además de la HU, se observó una

disminución de los EMN y los EPCMN, y un aumento en los EPC, en una forma

dependiente de las dosis (Tablas 11 y 12).

57


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Tabla 11.- Efecto de S. maxima y del extracto de c-ficocianina sobre la genotoxicidad in vivo en

fetos cuyas madres fueron tratadas con HU.

GRUPO TRATAMIENTOS

PROMEDIO ± EE

EMN/

10000 ET

EPCMN/

1000 EPC

EPC/

1000 ET

1 Agua 29.39 ± 7.3 7.1 ± 1.3 825.48 ± 70.2

2 Tween 80 (0.005%) 30.45 ± 10.11 6.3 ± 0.95 837.4 ± 100.5

3 HU 300 349.3 ± 37.4 34 ± 7.4 705.43 ± 103.1

4 Spirulina 1000 24.6 ± 6.7 5.2 ± 1.23 840.62 ± 74.89

5 Spirulina 1000 + HU 217.94 ± 48.1 28.2 ± 7.3 760 ± 56.8

6 Spirulina 500 + HU 250.33 ± 40.8 27.3 ± 5.43 758.1 ± 48.9

7 Spirulina 100 + HU 275.4 ± 50.4 22.1 ± 6.32 765.3 ± 45.67

8 C-ficocianina (400) 27.83 ± 8.4 4.5 ± 1.42 832.3 ± 57.93

9 C-ficocianina (100) +

HU 207.9 ± 50.43 25.89 ± 7.4 743.17 ± 62.5


HU 235.2 ± 30.82 27.32 ± 6.24 758.7 ± 54.7


HU 250.22 ± 60.31 24.6 ± 9.25 779.34 ± 57.34

n=6 a

diferencia estadística con los grupos 1 and 2. b

diferencia estadística con el grupo 3.


EMN: eritrocitos micronucleados; EPCMN: eritrocitos policromáticos micronucleados; EPC:

eritrocitos policromáticos; ET: eritrocitos totales.

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Tabla 12.- Efecto de S. maxima y el extracto de c-ficocianina sobre la genotoxicidad in vivo en

hembras gestantes tratadas con HU.

GRUPO TRATAMIENTOS

PROMEDIO ± EE

EMN/

10000 ET

EPCMN/

1000 EPC

EPC/

1000 ET

1 Agua 77.8 ± 3.83 12.6 ± 1.34 124.2 ± 3.98

2 Tween 80

(0.005%) 83.3 ± 5.42 10.4 ± 2.07 122.5 ± 4.52

3 HU 300 322.2 ± 21.04 29 ± 2.78 85.2 ± 7.38

4 Spirulina 1000 67.6 ± 5.4 8.8 ± 1.85 129.2 ± 6.44

5 Spirulina 100 +

HU 283.4 ± 25.3 26.4 ± 4.5 98.71 ± 10.2

6 Spirulina 500 +

HU 244.9 ± 35.6 20.3 ± 4.38 105.8 ± 8.44

7 Spirulina 1000 +

HU 198.24 ± 28.9 13.5 ± 6.3 118.4 ± 6.34

8 C-ficocianina

(400) 72.5 ± 9.1 9.3 ± 2.14 128.5 ± 5.33

9 C-ficocianina

(100) + HU 205.3 ± 34.6 15.3 ± 6.43 117.9 ± 7.95

10 C-ficocianina

(200) + HU 267.4 ± 42.7 25.2 ± 7.22 102.8 ± 11.7

11 C-ficocianina

(400) + HU 298.42 ± 34.86 21.8 ± 3.9 118.3 ± 5.49

n=5 a

diferencia estadística con los grupos 1 and 2. b

diferencia estadística con el grupo 3.

p ≤ 0.05. HU: Hidroxiurea (300mg/kg). EMN: eritrocitos micronucleados; EPCMN:

eritrocitos policromáticos micronucleados; EPC: eritrocitos policromáticos; ET: eritrocitos

totales.

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7. DISCUSIÓN

Spirulina es una cianobacteria que ha sido utilizada en México desde tiempos

prehispánicos como alimento o como suplemento alimenticio (Ciferri., 1983). Se

sabe que tiene un contenido importante de proteínas, vitaminas, minerales,

aminoácidos y ácidos grasos esenciales que la hacen una excelente fuente

nutricional (Campanella y col., 1999; Mendes y col., 2003). Asimismo, se le han

atribuido diversas propiedades farmacológicas, la mayoría de las cuales están

dadas o se relacionan a la actividad antioxidante de algunos de sus componentes,

como las ficobiliproteínas (Pardhasaradhi y col., 2003; Reddy y col., 2003;

Madhyastha y col., 2006). Al respecto, Piñero y col. (2001), y Bermejo y col.,

(2008), demostraron que la actividad antioxidante del extracto proteico de Spirulina

está dada principalmente por la c-ficocianina, pero que dicha actividad no mejora

significativamente si la proteína se encuentra pura.

En el presente estudio se obtuvo un extracto proteico que contiene c-

ficocianina, cuyo coeficiente r es muy similar al que describieron Piñero y col.

(2001), para la fracción proteica que presenta la misma actividad antioxidante que

la c-ficocianina pura (2.22 vs 2.16 de Piñero y col., 2001). Por medio de la SDS-

PAGE y del espectro UV se demostró que la c-ficocianina es la principal proteína

en el extracto.

Las dosis utilizadas para los estudios in vivo con Spirulina se eligieron en

base a diversos trabajos en los que se reporta que dosis de 100 mg/kg, 500 mg/kg

y 1000 mg/kg, del alga presentan actividad antioxidante (Kaushik y col., 2001;

Upasani y Balaraman, 2003; Dartsch., 2008). Para el extracto de c-ficocianina se

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utilizaron las dosis de 100 mg/kg, 200 mg/kg y 400 mg/kg, mismas que ya habían

sido probadas con anterioridad (Vázquez-Sánchez, 2006). Asimismo, se ha

demostrado que, tanto Spirulina como el extracto de c-ficocianina son agentes que

tiene mayor efecto cuando se utilizan como profilácticos que cuando se

administran al mismo tiempo o después del agente tóxico (Rimbau y col., 1999;

Gemma y col., 2002; Farooq y col, 2004a; Farooq y col, 2004b; Stromberg y col.,

2005; Farooq y col, 2006), por esta razón, ambos se administraron durante varios

días antes a la exposición a HU.

Para evaluar el efecto protector de Spirulina sobre el desarrollo embrionario,

la viabilidad de cultivos primarios y la genotoxicidad, se eligió el agente

teratogénico y genotóxico HU, ya que uno de sus mecanismos de acción se asocia

a la producción de radicales libres y especies reactivas del oxígeno.

Las malformaciones congénitas están ubicadas entre las principales causas

de mortalidad infantil a nivel mundial (OMS, 2008), por los que se hace necesario

evaluar diversas sustancias que puedan ser incorporadas como parte de la dieta,

con el conocimiento de que su consumo puede prevenir o proteger contra el daño

causado por una gran variedad de xenobióticos.

La HU es un fármaco que ha sido utilizado para diversos tipos de

padecimientos, entre los que se pueden destacar: cáncer, enfermedades virales,

anemia falciforme y policitemia vera (Gao y col., 1995; Hendricks y Mathews,

1998; Rodríguez y col., 1998; Hayashi y col., 2003; Yan y Hales, 2005). Sin

embargo, a pesar de ser tan útil, es un reconocido agente teratogénico y

genotóxico (Warner y col., 1983; Herken, 1985; DeSesso y Goeringer, 1990a;

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DeSesso y Goeringer, 1990b; DeSesso y col, 1994; Platzek y Schwave, 1999;

Valovicová y Gávelová, 2004; Yan y Hales, 2005; Woo y col., 2006).

Se ha observado que, después de 2 h de haber sido administrada, la HU

causa episodios rápidos de muerte celular en tejidos en proliferación o en

embriones de animales como ratones, ratas y conejos (Scott y col., 1971;

DeSesso, 1981; DeSesso y col., 1994; Yan y Hales, 2005; Woo y col., 2006).

Dependiendo de la edad gestacional de los productos se pueden presentar

alteraciones en el desarrollo de diversos órganos.

En el presente estudio se observaron todas las alteraciones en el desarrollo

reportadas por Warner y col. (1983), en casi el 50% de los embriones de ratón de

11 días, cuyas madres fueron administradas con HU i.p. el día 8 de la gestación.

Ellos incluyeron: falta de cierre del tubo neural, retardo en el desarrollo de

extremidades, rotación incompleta y retraso en el desarrollo de los procesos

mandibular, maxilar y branquial y de las vesículas óticas y ópticas. Cabe

mencionar que no todos los productos presentaron el mismo tipo, número y grado

de daño, y no todas las camadas fueron afectadas. Asimismo, en este grupo se

presentó el mayor número de productos muertos, lo que pudiera ser interpretado

como algo normal, ya que la HU provoca una profunda inhibición de la síntesis de

ADN en los embriones que los lleva a la muerte.

Al administrar Spirulina a las hembras gestantes, que también recibieron una

dosis de HU, se observó que disminuyó la mortalidad embrionaria y se previnieron

las alteraciones en el desarrollo provocadas por HU. En los grupos de 500 mg/kg y

1000 mg/kg del alga, que fueron administrados además con HU, se encontró que

el número de embriones muertos y con alteraciones fue prácticamente igual al del

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grupo testigo. Sin embargo, en el grupo que sólo recibió Spirulina a una

concentración de 100 mg/kg, la mortalidad no mostró diferencias significativas con

respecto al testigo, pero el número de embriones con alteraciones en el desarrollo

fue estadísticamente mayor, igual al grupo tratado únicamente con HU. Lo anterior

podría indicar que el efecto protector del extracto de Spirulina está en función de la

dosis empleada. El diámetro del saco vitelino en los tres grupos fue menor que en

el grupo de HU y la vascularización que presentaban era muy parecida al de los

grupos tratados sólo con el extracto (vasos con mayor diámetro).

Con la finalidad de elucidar el mecanismo de protección, se realizó la prueba

de TBARS, para la determinación del grado de peroxidación lipídica por medio de

la cuantificación de MDA. Lo anterior, con base en algunos estudios en los que se

ha demostrado que la inhibición de la síntesis del ADN no explica la rápida muerte

celular inducida por HU, por ello se ha planteado, como un mecanismo alternativo,

que el grupo hidroxilamina (-NHOH), en la HU, es capaz de reaccionar con el O2

para producir H2O2 que después es transformado en ∙OH, para así producir el

efecto tóxico (Herken, 1985; DeSesso y col. 1994; Woo y col., 2006). Así, la

muerte celular temprana provocada por HU, podría ser prevenida por el efecto

antioxidante de Spirulina. Esta hipótesis, además sería soportada por los trabajos

en los que sustancias como el propil-galato, la etoxiquina, el ácido

nordihidroguaiarético y el D-manitol, han reducido la tasa de muerte y la incidencia

de alteraciones en el desarrollo en los embriones expuestos a hidroxiurea. Hasta

donde se sabe, ninguna de estas sustancias bloquea la inhibición de la síntesis de

ADN, pero sí detienen la muerte de células embrionarias inducida por hidroxiurea

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indicando claramente que ésta no es causada por ello (DeSesso y Goeringer,

1990a; DeSesso y Goeringer, 1990b; DeSesso y col, 1994).

El contenido de MDA en los embriones expuestos a HU y Spirulina, hace

suponer que algunos de los componentes antioxidantes del alga como: fenoles,

vitaminas C y E, -caroteno, glutatión reducido y las ficobiliproteínas (Miranda y

col., 1998; Saxena and Kumar, 2004; Jeyaprakash and Chinnaswamy, 2005),

podrían estar involucrados en la disminución del MDA; sin embargo, en el grupo

expuesto al extracto de c-ficocianina se observa un mejor efecto antioxidante, lo

que indicaría que es esta proteína la que más participación tiene en el mismo.

Esto podría deberse a que el contenido de c-ficocianina en el extracto es mucho

mayor que en Spirulina, ya que está concentrada. La ficocianina, una proteína

formada por dos subunidades con varios tetrapirroles de cadena abierta y gran

cantidad de residuos de tirosina y triptófano en su superficie, que poseen una

actividad muy grande como atrapadores de radicales libres (Bhat y Madyastha,

2000 y 2001), estaría en la posibilidad de reaccionar con radicales peroxinirito y

otras ERN y ERO, que son generadas por el metabolismo de la HU en el

organismo (Jiang y col., 1997; Cokic y col., 2003; King, 2003). Sumado a esto,

Romay y col. (1998), observaron que la c-ficocianina actúa como un atrapador de

radicales lipídicos como el MDA.

Por otro lado, se observó que el contenido de MDA en el grupo que sólo

recibió Spirulina, fue significativamente mayor que en los grupos testigos, este

efecto nunca había sido reportado para Spirulina. El mecanismo involucrado en

dicho efecto no es claro; sin embargo, podría ser que la especie de Spirulina

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utilizada (S. máxima), tuviera algunas sustancias que pudieran reaccionar con el

ácido tiobarbitúrico de forma inespecífica y dar como resultado un incremento en

la cantidad de MDA cuantificado (Thomas y col., 1997). Lo anterior, ya que

Spirulina no indujo ninguna alteración en el desarrollo embrionario ni en los

parámetros de las hembras gestantes y si redujo el contenido de MDA en los

embriones de las madres expuestas a la HU. Por otro lado, el extracto de c-

ficocianina presentó una disminución significativa de los niveles de MDA con

respecto a los grupos testigos, tanto sólo como en combinación con HU.

Los cultivos celulares se hicieron de embriones completos, encéfalos y

primordios de extremidades anteriores debido a que en la mayoría de los trabajos

publicados sobre teratogénesis provocada por HU, tanto la parte cefálica del tubo

neural, como las extremidades anteriores son las más afectadas (Scott y col.,

1971; DeSesso, 1981; DeSesso y col., 1994; Yan y Hales, 2005; Woo y col.,

2006). Asimismo, los tiempos de lectura se establecieron en base a los reportes

que indican que entre las 2 y las 4 horas, después de una administración única por

vía intraperitoneal a animales gestantes, la HU causa un episodio rápido de

muerte celular embrionaria (DeSesso y col., 1994), durante las primeras 24 h, en

células expuestas al fármaco, se presenta un deceso de cerca del 20 % de la

población y que pasadas las 24 h de cultivo muere más del 80 % de las células en

cultivo (Przybyszewski y Malec 1982; Przybyszewski y col., 1987).

Como se pudo observar ni Spirulina, ni el extracto de c-ficocianina,

produjeron efectos tóxicos en las células de ninguno de los tres tipos de cultivos

primarios y, por el contrario, en las concentraciones más altas (>1 mg/mL), hubo

un incremento en la proliferación y la viabilidad celulares, el cual fue mayor en el

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extracto que en el alga. Lo anterior puede ser explicado por las propiedades

nutricionales de Spirulina (Cases y col., 2002; Planes y col., 2002; Simpore y col.,

2006) y por el alto contenido de proteína del extracto, comparado con el alga

completa.

Por otro lado, los cultivos que fueron expuestos a HU presentaron

sensibilidades diferentes al fármaco, las cuales podrían ser atribuidas a la tasa de

proliferación celular de cada cultivo, ya que la HU tiene mayores efectos tóxicos

sobre las células en proliferación (DeSesso y col., 1994), y a los 11 días de edad

los primordios se encuentran en proliferación más que en diferenciación y por el

contrario las células del encéfalo se encuentran en período de diferenciación al

igual que muchas otras células del embrión completo (Brown y Fabro, 1981).

DeSesso y Goeringer (1990), demostraron que la muerte celular no era causada

por la inhibición de la síntesis de ADN. El mecanismo de muerte celular en este

caso incluiría la reacción de la HU al interior de las células para producir ERO

como el ∙OH, el cual sería responsable de la muerte celular. Algunos reportes

indican que la muerte de las células puede ser prevenida por la presencia de

antioxidantes hasta las 24 h pos-exposición (Przybyszewski y Malec, 1982;

Przybyszewski y col., 1987).

En el estudio del efecto protector de Spirulina y el extracto de c-ficocianina se

observó que concentraciones de ambos, mayores a 1 mg/mL, continuaron

protegiendo hasta las 48 h de exposición a HU. Esto se podría explicar por

algunas interacciones entre la HU o sus metabolitos, como el NO, con los residuos

de tirosina y triptófano que la c-ficocianina tiene en su superficie (Bhat y

Madyastha, 2001).

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En los resultados del estudio de genotoxicidad se observó que tanto las madres

como los fetos de los grupos testigos de agua, tween 80, Spirulina y el extracto de c-

ficocianina, presentaron valores normales en las cantidades de EMN, EPCMN y EPC

(Gómez-Meda y col., 2004). Lo que confirma, lo reportado en la bibliografía, que ni

Spirulina completa, ni su extracto proteico, son genotóxicos (Hong-Quan y col., 2001;

Premkumar y col., 2001; Klingler y col., 2002; Ruiz y col., 2003; Premkumar y col.,

2004; Chamorro-Cevallos y col., 2007).

Asimismo, el efecto genotóxico de la HU se observó en todos los grupos cuyas

madres recibieron el fármaco, comparados con los grupos testigos. Se ha reportado

que la HU es un agente genotóxico que induce la formación de micronúcleos

(Shimizu y col., 1998; Tanaka y Shimizu, 2000), dicho efecto se observó con el

aumento en la cantidad de EMN y EPCMN, en madres y fetos. En cuanto al efecto

citotóxico del fármaco, sólo se encontró una disminución de los niveles de EPC en

las madres tratadas con el fármaco. En lo general, tanto en fetos como en las

madres se encontraron los mismos resultados, lo que nos indicaría que la HU puede

atravesar libremente la barrera placentaria y que el mecanismo por el cual ejerce sus

efectos podría ser el mismo para ambos. En los grupos que recibieron Spirulina y el

extracto de c-ficocianina, además de la HU, se observó un efecto protector por parte

de ambas y, al igual que en los estudios antes mencionados, la protección fue en

forma dependiente de la dosis. El daño al material genético, así como en general el

daño celular, podría deberse a la inhibición de la RRND-I y a la formación de

radicales libres, vía el metabolismo enzimático o no enzimático que tiene el fármaco

en el organismo (Herken, 1985; DeSesso y col. 1994; Woo y col., 2006), que

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estarían involucrados directamente en el daño al ADN (Medeiros, 2008), y la

formación de micronúcleos.

Así, la HU es uno de los teratógenos y genotóxicos más estudiados, ya que los

mecanismos por los que provoca el daño al material genético, e incluso la muerte

celular, implican una relación muy grande con la generación de estrés oxidativo en

las células. Cuando esto ocurre, se dan una serie de reacciones que llevan a la

oxidación de diversas macromoléculas como los ácidos grasos poliinsaturados

ubicados en las membranas celulares. Uno de los productos de estos procesos de

oxidación es el 4-HNE, un aldehído insaturado derivado de ácidos grasos de 6

carbonos. El 4-HNE tiene la característica de ser más estable que la mayoría de los

radicales libres, de esta forma, su paso a través de los compartimientos celulares es

relativamente fácil, una vez ahí, puede reaccionar con los grupos tioles y aminos de

una gran variedad de macromoléculas (Wu y Canderbaum, 2003; Schaur, 2003;

Zenteno y Saldaña, 2008). Una vez formados los aductos de proteínas, el 4-HNE,

interfiere con la activación de varias vías de señalización que pueden llevar a la

interrupción de los diferentes procesos celulares e incluso a la apoptosis

(Leonarduzzi y col., 2004). En el presente trabajo, se ha demostrado como la HU

puede, por medio de la generación de ERO, producir desde daño al material

genético, mediante la formación de micronúcleos, hasta la muerte célular, con las

consecuencias consiguientes en el desarrollo embrionario.

Por otro lado, también ha quedado demostrado como el uso de Spirulina

maxima y de su extracto proteico, que contiene a la c-ficocianina como principal

componente, no sólo no han causado alteración alguna en los animales/cultivos

celulares expuestos a ellas, sino que han sido efectivas en la prevención de los

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daños causados por la HU hasta el punto de que los animales que recibieron al

fármaco en combinación con el alga o su extracto proteico, presentaron una

reducción hasta valores semejantes a los de los testigos negativos de dichos

efectos.

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8. CONCLUSIONES

El componente principal del extracto proteico clarificado-dializado de Spirulina

maxima es la proteína c-ficocianina.

Spirulina maxima no produjo efectos tóxicos sobre el desarrollo embrionario

de ratones ICR a dosis de 100 mg/kg, 500 mg/kg y 1000 mg/kg y por el contrario,

los embriones de las madres tratadas con la cianobacteria presentaron un

incremento en tamaño y mayor vascularización del saco vitelino.

Spirulina maxima y el extracto de c-ficocianina no provocaron ni materno-

toxicidad, efectos citotóxicos, ni genotóxicos sobre los cultivos celulares y fetos

expuestos a ellas.

Las alteraciones encontradas en los embriones del grupo tratado con

hidroxiurea (falta de cierre del tubo neural, retardo en el desarrollo de

extremidades, rotación incompleta, retraso en el desarrollo de los procesos

mandibular, maxilar y branquial y disminución de la vascularidad del SV), y los

efectos citotóxicos en cultivos primarios, coinciden con los reportados en la

bibliografía, para una dosis de 300 mg/kg y una concentración de 0.25 mM,

respectivamente.

Los efectos genotóxicos de la HU se observaron con el aumento en la

cantidad de EMN y EPCMN, en hembras gestantes y sus productos, para una

dosis de 300 mg/kg.

Tanto Spirulina maxima como su extracto proteico, que contiene a la c-

ficocianina como principal componente, fueron efectivas en la prevención de los

daños causados por la HU, en los modelos de teratogénesis, genotoxicidad y

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citotoxicidad realizados en el presente esudio, en forma dependiente de la

dosis/concentración.

Con base en los resultados de la prueba de TBARS y la evidencia

bibliográfica se presume que el mecanismo de protección de Spirulina maxima

y su extracto proteico, sobre los efectos tóxicos causados por la HU en los

diferentes modelos, se deben principalmente a sus propiedades como

antioxidantes. Asimismo, se evidenció que la c-ficocianina fue el responsable

mayoritario de dicha actividad.

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JORGE VÁZQUEZ SÁNCHEZ