Kar Yo Typing

KARYOTYPING

MUJOSEMEDI

LAB BIOLOGI FK UNS

10/29/2012BLOK 3 BIOLOGI MOLEKULER

2

A. KHROMOSOMStrukt spt benang dlm nukleus sel eukaryote yg td DNA &

prot histoneSitogenetika: studi struktur dan sifat-sifat krom, perilaku

krom selama mitosis dan meiosis, pengaruh krom pd fenotip dan faktor-faktor yg menyebabkan perubahankrom (Hare dan Singh, 1979).

24 Tipe khrom dinomori 1 22, X dan Y.

1 22 : autosom X dan Y : kromosom seks atau

gonosom


3

10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler

4

Gen : suatu segmen molekul DNA yg mengkode sebuah produk fungsional mis.; rantai polipeptide atau molk RNA


5


6

Krom terlihat dg baik saat pembelahan konden.

Krom yg dilekatkan pd slide (karyotyping) dicat

Giemsa krom nampak belang. Giemsa mengecat

bag DNA yg kaya Adenine & Thymine.

Bagaimana Scientists membaca krom?

Gunakan 3 gamb kunci utk mengidentifikasi

kesamaan dan perbedaannya:

Size: mudah dibedakan.

Banding pattern: ukuran & lokasi Giemsa bands pd

krom unik.

Centromere position: sentromer nampak sbg

kontriksi, peran dlm pemisahan krom saat

pembelahan sel.


7

Condensed chromosome


8

Kromosom metafase


9

Juml Krom bbrp organisme :


10

Krom dicat Heterochromatin (gelap: DNA lbh

coiled & lbh banyak seq DNA repetitif) &

Euchromatin (terang : tdp gen-gen mengkode prot).

Karyotipe : Krom diurutkan berdasar ukuran dlm

peta dr yg terbesar sampai yg terkecil. Lengan

pendek (p) diatas dan lengan panjang (q) dibawah.


11

Nomenclature : International System for Human

Cytogenetic Nomenclature (ISCN)

Komponen Karyotipe :

Juml krom, sex, perubahan pertama, perubahan

kedua, dst.

Perubahan krom sex didaftar pertama dan kemudian

yg lain dlm urutan numerik (angka).

Cont : 46, XX, del(5)(p15.3) dg delesi krom no 5

lengan pendek band 15.3 sindrom Cri du Chat.


12

B. KARYOTYPING adl studi krom, proses pairing and ordering semua

krom pd sebuah organisme, hg memberikan potretgenom yg luas dr krom-krom individu Karyotype : profil krom sebuah sel, mis ; juml, ukuran

dan morfologi krom sebuah sel. Karyogram /idiogram : gamb ssn mikrofotograf krom

dlm format standard (dlm pasangan, urut dlm ukurandan posisi sentromer). Manfaat karyotype : Utk studi aberasi krom Fungsi seluler Hubungan taxonomi dan studi evolusi.


13


14

Karyotype dissn dg prosedur pengecatan standard

gamb struktural yg karakteristik utk setiap krom.

Analisis Karyotype utk studi :

mendeteksi perub genetik yg kasar (besar) pd

manusia anomali bbrp megabases DNA atau

lebih

perub juml krom yg diasosiasikan dg aneuploidi,

spt trisomi 21.

perub struktural krom spt delesi, duplikasi,

translokasi, atau inversi krom.

diagnostik cacat lahir yg spesifik, kelainan genetik

SEJARAH Karl Wilhelm von Nageli (1842) mengamati krom

pertama kali (pd sel tnman) Walther Flemming (1882), penemu mitosis pd sel

Salamander. Brp juml krom pd sebuah sel manusia (diploid)

normal? Hans von Winiwarter (1912) : 47 krom pd

spermatogonia & 48 pd oogonia, & menyimpulkanmekanisme determinasi seks XX/XO ?

Painter (1922) tdk pasti krom diploid manusia 46atau 48 (?), pertama setuju 46. Kmd merevisinya48, dan menegaskan manusia memp sistem XX/XY.


15

Teknik baru utk mengetahui juml krom sel diploid manusia :

a. Menggunakan sel kultur yg dipacu untuk masuk fase S dg PHA (phytohemaglutinine)

b. Mitosis ditahan dlm metafase dg larutan colchicine.

c. Pretreating sel dlm larutan hypotonikSel bengkak & krom tersebar.

d. Squashing the preparation on the slide forcing the chromosomes into a single plane.

e. Memotong fotomikrograf & menyusunnya kedlm sebuah karyogram


16

Karakteristik karyotype yg diamati & dibandingkan adl

perbedaan:

1. Ukuran absolut krom

2.Posisi centromer

3.Ukuran relatif khrom (akibat translokasi/

pertukaran segmentalukuran tdk sama)

4.Juml dasar krom

5.Juml dan posisi satelit

6.Derajad dan distribusi region heterokromatin

(lbh gelap drpd eukromatin) Teknik pemitaan?


17

Mempersiapkan Karyotype dr sel mitotik : Sumber sel :

biopsi tumor atau bone marrow diagnosiskanker

spesimen drh tepi, dan biopsi kulit diagnosis lain cairan amnion, atau spesimen villus chorionik

prenatal screening Sel mitotik ditahan dlm metafase atau prometafase dg colchicine

Perlakuan lart hipotonik bengkak & pecah. Nukleus difiksasi diteteskan pd glass slide

dicat gambr strukt krom.


18

POLA PEMITAAN (BANDING PATTERNS)

Sblm perkemb teknik pemitaan, sulit membedakan

krom satu dg yg lain khrom dikelompokkan

berdasarkan ukuran (A - G) dan letak centromer.

Torbjorn Caspersson, dkk. (1970) mendeskripsi teknik

pemitaan pertama Q-banding dg cat fluorescent

quinacrinemengalkilasi DNA.

Skrg sebag besar dicat GIEMSA

o resolusi pita lbh baik, lbh stabil & dpt dianalisis dg

mikroskop bright-field biasa.

oBeda struktur kromatin & komposisi basa DNA

pola band/pita yg beda.


19

Pd G-banding, varian pengecatan Giemsa lazim diNorth America, krom metafase diperlakukan trypsinsebentar, sebelum dicat Giemsa. Trypsin digest bbrpprot khrom me-relaxing strukt kromatin catGiemsa dpt mengakses DNA.

Bag heterokhromatin tendensi pd DNA kaya AT &relatif lbh sedikit gen tercat lbh gelap pd G-banding.Sebaliknya, kromatin yg kurang konden(eukhromatin), tendensi kaya GC & lbh aktifditranskrip lbh sedikit tercat Giemsa nampak sbgpita (band) terang dlm G-banding.


20

a). G-banding. b). Q-banding. c). R-banding. d). C-banding


21


22

Pengecatan Giemsa [Gbr. a)] 400-800 band yg

terdistribusi diantara 23 psg krom manusia (500 band

sel haploid).

R-banding, [Gbr c)] dg Giemsa

o sebag Eropa, hasilkan pola sebaliknya G-banding.

o sebelum dicat Giemsa, krom dipanaskan disrupt

helix DNA pd bag kaya-AT (sebelumnya ikat Giemsa

paling kuat), & meninggalkan bag yg kaya-GC utk

menyerap cat.

o aplikasi utk memberikan critical details bag yg

kaya gen yg terltk di dekat telomer.


23

C-banding [Gbr. d)]

o utk mengecat heterochromatin (tdk aktif scr

genetik) jarang utk diagnostik.

oAdl teknik Giemsa spesial utk mengecat krom pd

centromer, yg memp juml besar AT-rich satellite

DNA.

Q-banding [Gbr. b)]

oMetode pertama yg mengidentifikasi 46 khrom .

o krom dicat quinacrine & diperiksa dg chy UV,

o dpt memeriksa translokasi krom, trtm krom Y.

o Pola pita (band) serupa dg G-banding.

T-banding: utk memvisualisasikan telomer.


24

PENGORGANISASIAN KHROM DLM KARYOGRAM

Utk informasi diagnostik, image krom disusn kedlm

format standard sbg karyotype atau karyogram [Gbr

a) c)].

Mnrt konvensi internasional, autosom manusia (krom

non-sex), dinomori dr 1-22, dlm urutan yg makin kecil

dlm ukuran, dg perkecualian krom 21 & 22 (krom 21

adl terkecil). Krom seks ditempatkan pd akhir dr

karyogram.

Dlm karyogram, krom dijajarkan, disusun dg lengan

pendeknya p (petite) di atas & lengan panjangnya

q (queue) di bawah.


25


26

Letak centromer dpt digunakan utk mengidentifikasi

gross morphology, atau bentuk krom. Mis:

Krom metacentric, spt krom 1, 3, & 16 lengan p

dan q panjangnya hampir sama.

Krom submetacentric, spt krom 2, 6, & 10 ltk

centromer tdk ditengah.

Krom acrocentric spt 14, 15 & 21 centromer tltk

dekat ujungnya.

Pola pemitaan (banding pattern) ant 2 kopi krom

(homolog), pd autosom adl hampir sama. Bbrp

perbedaan tak kentara ant homolog pd krom ttt adl

akibat variabilitas struktural natural antar individu.


27


28

Penyusunan krom dlm karyogram mempermudah

identifikasi abnormalitas.

G-band karyograms rutin utk diagnosis

abnormalitas krom.

Perub krom yg dpt dideteksi dg karyotyping adl bbrp

megabase.

Aneuploidi (akibat absen atau penambahan krom),

mudah dideteksi dg analisis karyotype.

Insersi atau delesi yg lebih tak kentara dpt terdeteksi

sbg deviasi dr pola pemitaan normal.

Translokasi jelas kelihatan pd karyotype.


29

Classification of Chromosomes for Karyotyping (rasio p/q)

Group A: chromosomes 1-3 are largest with median

centromere.

Group B: chromosomes 4-5 are large with submedian

centromere

Group C: chromosomes 6-12 are medium sized with

submedian centromere

Group D: chromosomes 13-15 are medium sized with

acrocentric centromere


30


31

Group E: chromosomes 16-18 are short with median

or submedian centromere

Group F: chromosomes 19-20 are short with median

centromere

Group G: chromosomes 21-22 are very short with

acrocentric centromere.

Chromosome X is similar to group C.

Chromosome Y is similar to group G


32

Standarisasi Nomenklatur :a. Konferensi Denver 1960 Nomor diberikan pd tiap

pasang autosom berdasar makin kecilnya ukurankrom, terbesar no 1 & terkecil no 22, krom kelaminXX ( ) dan XY ( ) ada 22 psg autosom + 2 kromkelamin 46 khrom.

b. Konferensi London 1963 : Patau (1960)mengusulkan 7 kelompok krom A G berdsrkemiripan morfologis krom.

c. Konferensi Chicago 1966 : Analisis kariotipepertama dicatat juml khrom, diikuti krom kelamindan yg terakhir adl kelainan tambahan ( 46,XYdan 46,XX).


33

1970: Casperssono krom manusia diidentifikasi dg fluorescent

quinacrine mustard & diperiksa dibwh UV.o Tiap krom memiliki corak pita fluorescent yg

konstan dan unik.oKelemahan teknik fluoresensi :Pita fluoresensi memudar dlm bbrp menit

hrs difoto segera.Mikroskup fluoresensi mahal.

Teknik Giemsa.omenghasilkan sediaan permanenodpt diperiksa dg mikroskup biasa dibakukan

Sept 1971 dlm Konferensi Paris.


34

d. Konferensi Paris 1971o Kariotipe Fluoresen oleh Caspersson, dkk sbg

dasar pemberian nomor setiap krom.o Krom 21 lbh kecil dr krom 22 (perkecualian sist

Denver : besar kecil).

PEMBAGIAN KROMOSOM Dlm pemetaan krom, setiap pita sesuai dg grs

tengahnya & bukan dg grs tepinya. Satu region tssn oleh bbrp pita gelap & terang. Landmark (tapal batas) pd suatu krom ditentukan

sbg satu gambran morfologik yg konsisten & nyata


35


36


37

Satu region tltk diantara 2 tapal batas yg berdekatan. Suatu lengan krom yg tdk memiliki tapal batas yg

nyata hanya terdiri atas 1 region.

Penomoran Pita : Region dan pita dinomori berturut-turut mulai dr

sentromer ke ujung lengan krom. Satu pita yg dipakai sbg tapal batas dianggap

seluruhnya milik region disebelah distal tapal batas, disetujui sbg no 1 dlm region itu.

Pita yg dibagi 2 oleh sentromer dianggap sbg 2 pita, diberi label sbg pita 1 pd region 1 dr lengan krom yg berkaitan.


38

Lengan panjang = q dan lengan pendek = p.


39

Utk menyatakan suatu pita ttt, dibutuhkan 4 bag (item):

a) Nomor kromb) Simbul lenganc) Nomor region dand) Nomor pita dlm region itu.

Item-item diberikan tanpa spasi atau punctuasi, mis1p33 krom no 1, lengan pendek, region 3, pita 3. Jikapita dibagi menjd pita kecil (sub-band), angka pita diikuti ttk desimal dan sub band diberi nomorberurutan dr sentromer ke ujung, mis 1p33.1; 1p33.2; 1p33.3, menyatakan pita 3 region 3 lengan pendekkrom no 1 dibagi menjd 3 sub-band, 33.1 bag proximal dan 33.3 bag distal

ARMREGIONBANDSub-BAND, numbering from the centromere progressing distance


41

Krom memp pola-pola band yg kharakteristik yg ditimbulkan oleh trypsin dan Giemsa.

METHODOLOGY (SIDDIQUE)

Tindakan Aseptik Penyiapan medium RPMI 1640 Pengambilan 10ml darah dg heparin Setting of culture

8 ml of medium

0.1 ml of PHA-M

0.5 ml of blood/plasma

2 ml of autologus plasma/FCS

Inkubasikan pd 37 C selama 72 jam

METHODOLOGY

Pemanenan kultur Tambahkan spindle inhibitors Colchicine/

colcemed (0.1 g/ml)

Perlakuan larutan hypotonic 0.075M KCl

Fiksasi (3:1 methanol : acetic acid)

Penyiapan slides

Slides dicat dg 4% Giemsa selama 20-25min

Screening of slides utk studi morfologi krom

Konstruksi/penyusunan karyotype

PREPARATION OF CHROMOSOMES

(Siddique)


45

Karyotyping


46Fotomikrografi dan identikasi kromosom

Karyotype manusia:

Karyotype normal : 46,XY


48

IDENTIFIKASI KHROMOSOM :FISH (fluorescence in situ hybridization)

o a cytogenetic technique developed by ChristophLengauer that is used to detect and localize thepresence or absence of specific DNA sequenceson chromosomes.o uses fluorescent probes (fluorescent labelled

DNA fragments, ~10.000 bp) that bind to onlythose parts of the chromosome with which theyshow a high degree of sequence similarity.

Fluorescence microscopy can be used to find outwhere the fluorescent probe bound to thechromosomes.


49

FISHo used in genetic counselling, medicine, and species

identification.o to detect and localize specific mRNAs within tissue

samples.odefine the patterns of gene expression within cells

and tissues.


50

Hibridisasi kromosom dg pelacak fluorescence


51

FISH dpt mendeteksi:

Mikrodelesi yg halus

Translokasi yg kompleks

Perubahan telomer

TRIPLE KROMOSOM #20 dlm Nukleus

DELESI pd KROMOSOM #22


53

Hibridisasi kromosom dg probe DNA


54


55

Labelling


56

Karyogram from a human male lymphocyte probed for the Alu sequence using FISH


57

Spectral Karyotype (SKY Technique) Adl teknik sitogenetik molekuler utk

memvisualisasikan scr simultan semua pasang krompd sebuah organisme dlm warna yg berbeda.

Probe (pelacak) melabel DNA spesifik dg fluorescentpd setiap krom dg fluorophore.

Krn jumlah fluorophores yg terbatas, sebuahmethode pelabelan kombinasi digunakan utkmenghasilkan banyak warna yg berbeda.

Perbedaan spectral yg dihasilkan oleh pelabelankombinasi dianalisis dg interferometer yg dilekatkanpd mikroskup fluorescence.


58

Spectral human karyotype


59

Spectral karyogram of a human female


60

TES PRENATAL : KARYOTYPING


61

QUESTIONS?

Documents

Kar Yo Typing