Embed Size (px)
Citation preview
KARAKTERISASI BEBERAPA SENYAWA BIOAKTIF EKSTRAKAMPAS KECAP (SOY SAUCE CAKE) METODE ULTRASOUND
ASSISTED EXTRACTION (KAJIAN RASIO BAHAN:PELARUT DANLAMA WAKTU EKSTRAKSI)
OLEH:RISALIA NUR RAHMAH ANUGRAH
(115100401111014)
Sebagai salah satu syarat untuk memperolehgelar Sarjana Teknologi Pertanian
JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIANFAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYAMALANG
2015
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Kabupaten Lamongan, Provinsi
Jawa Timur pada tanggal 18 April 1993 dari ayah yang
bernama Imron Salim dan Ibu Rita Sri Wariyanti.
Penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Dasar di SD
Negeri Bluluk 1 Lamongan pada tahun 2005, kemudian
melanjutkan ke Sekolah Menengah Pertama di SMP
Negeri 1 Modo Lamongan dengan tahun kelulusan 2008,
dan menyelesaikan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 1 Babat pada tahun
2011. Pada tahun yang sama penulis diterima di Jurusan Teknologi Hasil
Pertanian, Prodi Ilmu dan Teknologi Pangan, minat studi Teknologi Pengolahan
Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Brawijaya Malang melalui
jalur SNMPTN undangan.
Pada tahun 2015 penulis telah berhasil menyelesaikan studinya di jenjang
Starata 1 (S1) Teknologi Pertanian, Universitas Brawijaya Malang. Pada masa
pendidikannya, penulis aktif sebagai Asisten Teknologi Pengolahan Pangan,
Lembaga Kedaulatan Mahasiswa Agritech Research and Study Club pada tahun
2012-2013 dan Agritechno Business Centre pada tahun 2013-2014. Penulis juga
aktif dalam beberapa kepanitiaan seperti Scientific Great Moment 3,
Entrepreneur Generation Event dan National Agritech and Food Technology
Exhibition. Penulis juga mendapatkan beberapa prestasi seperti Juara 1 PKM
Maba UB pada tahun 2011, serta lolos pendanaan Program Kreativitas
Mahasiswa yang diselenggarakan oleh DIKTI pada tahun 2012 dan 2014
Alhamdulillah, Terima Kasih Ya AllahKarya kecil ini saya persembahkankepada kedua Orang Tua saya, adik-adiksaya, dan semua sahabat saya tercintayang telah memberikan doa dansemangat sehingga karya ini bisa selesai.Juga kepada semua pembaca semogatulisan ini dapat memberikan manfaatuntuk kita semuaTerima Kasih-Risalia NR Anugrah-
Risalia Nur Rahmah Anugrah. 115100401111014. Karakterisasi BeberapaSenyawa Biaoktif Ekstrak Ampas Kecap (Soy Sauce Cake) MetodeUltrasound Assisted Extraction (Kajian Rasio Bahan:Pelarut DanLama Waktu Ekstraksi). SKRIPSI. Pembimbing: Dr. Widya Dwi RukmiPutri, STP. MP dan Novita Wijayanti, STP. MP
i
RINGKASAN
Ampas kecap merupakan limbah padat hasil samping proses pengolahankecap. Dari total industri kecap di Indonesia dan produksi kecap per harinya bisadilihat bahwa ampas kecap tersebut sangat melimpah, namun pemanfaatannyaselama ini masih kurang hanya sebatas untuk pakan ternak. Ampas kecapdiduga masih mengandung beberapa senyawa bioaktif yang dapat dikeluarkanmelaui proses ekstraksi salah satunya dengan menggunakan ultrasound assistedextraction. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui rasio bahan:etanol96% dan waktu ekstraksi yang tepat untuk mendapatkan rendemen ekstrak yangoptimal serta mengetahui pengaruh rasio bahan:etanol 96% dan waktu ekstraksiterhadap profil senyawa bioaktif yang terdapat dalam ampas kecap
Penelitian ini menggunakan metode RAK (Rancangan Acak Lengkap)dengan 2 faktor yaitu rasio bahan:pelarut (1:3, 1:5, dan 1:7 b/v) dan waktuekstraksi (15, 20, dan 25 menit). Masing – masing perlakuan diulang sebanyak 3kali sehingga diperoleh 27 satuan percobaan. Data yang diperoleh kemudiandianalisa menggunakan ANOVA (Analysis of Varian) α = 0,05 dan dilakukan ujilanjut dengan DMRT atau BNT. Parameter yang diuji meliputi rendemen, totalflavonoid, total antosianin, dan aktivitas antioksidan. Pemilihan perlakuan terbaikdengan metode Zeleny.
Berdasarkan hasil penelitian rasio bahan:pelarut dan waktu ekstraksimemberikan pengaruh yang nyata terhadap aktivitas antioksidan dan kandungansenyawa bioaktif yang terkandung dalam ampas kecap seperti total flavonoid dantotal antosianin. Seiring dengan semakin tinggi rasio bahan:pelarut dan semakinlama waktu ekstraksi mengakibatkan rendemen ekstrak, total flavonoid, danaktivitas antioksidan semakin meningkat, namun menyebabkan total antosianinekstrak ampas kecap semakin menurun. Rasio bahan:pelarut 1:7 dan waktuekstraksi 25 menit merupakan perlakuan terbaik untuk menghasilkan ekstrakampas kecap dengan kandungan senyawa bioaktif yang paling optimal yaiturendemen yang dihasilkan sebesar 17,04%, total flavonoid sebesar 5,373 mgQE/g sampel, total antosianin sebesar 0,189 mg/g sampel, dan aktivitasantioksidan sebesar 37,49%.
Kata Kunci: Ampas Kecap, Antosianin, Flavonoid, Ultrasonic Bath
Risalia Nur Rahmah Anugrah. 115100401111014. Karakterisasi BeberapaSenyawa Biaoktif Ekstrak Ampas Kecap (Soy Sauce Cake) MetodeUltrasound Assisted Extraction (Kajian Rasio Bahan:Pelarut DanLama Waktu Ekstraksi). SKRIPSI. Pembimbing: Dr. Widya Dwi RukmiPutri, STP. MP dan Novita Wijayanti, STP. MP
ii
SUMMARY
Soy sauce cake is a solid waste from soy sauce processing. Totalindustrial of soy sauce and soy sauce processing per day can be seen that soysauce cakes are very abundant but the soy sauce cake is very minim usage, aslong as its only for feed. Soy sauce cakes expected that still contains of somebioactive compounds which can be exposed by extraction process such asultrasound assisted extraction. The purpose of research is to determine the ratioof material with ethanol 96% and time extraction which both of them must beprecision to get an optimum yield of extract and determine the influence both ofthem in bioactive compounds that soy sauce cakes contains.
The research arranged using Randomized Block Design with 2 factorswhich ratio of material:solvent (1:3, 1:5, 1:7 b/v) and time of extraction (15, 20, 25minutes). Each treatment repeated three times will be 27 experiment units. Thecollected data analyzed by ANOVA (Analysis of Variant ) α=0,05 and followed byDMRT or LSD. The parameter observed are yield, total flavonoids, totalanthocyanins, and antioxidant activities. The best treatment choose by usingZeleny methods.
Based on research, ratio of materials:solvents and extraction time givesignificant effect on antioxidant activities and bioactive compounds in soy saucecake contain such as total flavonoids and anthocyanins. The more increasing ofmaterials ratio:solvents and more time of extraction resulted in extract yield, totalflavonoids and antioxidant activities is increasing, but total anthocyanin will bedecreasing. The best treatment was obtain from (1:7 b/v) ratio ofmaterials:solvent and 25 minutes time extraction with a yield values of 17.04%,total flavonoids of 5,373 mg QE/g sample, total anthocyanin of 0,189 mg/gsample, and the antioxidant activity of 37.49%.
Key words: Antochyanins, Flavonoids, Soy Sauce Cakes, Ultrasonic Bath
iii
KATA PENGANTAR
Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa karena berkat rahmat dan
anugerah-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Karakterisasi
Beberapa Senyawa Bioaktif Ekstrak Ampas Kecap (Soy Sauce Cake) Metode
Ultrasound Assisted Extraction (Kajian Rasio Bahan:Pelarut Dan Lama Waktu
Ekstraksi)”
Penulis menyampaikan terima kasih banyak kepada:
1. Ibu Dr. Teti Estiasih, S.TP.,MP. selaku Ketua Jurusan Ilmu dan Teknologi
Pangan.
2. Ibu Dr. Widya Dwi Rukmi Putri, S.TP. MP. sebagai dosen pembimbing I
3. Ibu Novita Wijayanti, S.TP., MP. sebagai dosen pembimbing II
4. Ibu Erni Sofia Murtini, S.TP., MP., Ph.D. selaku dosen penguji pada seminar
hasil skripsi.
5. Orang tua dan semua keluarga besar yang telah memberikan semangat
serta motivasi untuk menyelesaikan laporan skripsi ini.
6. Teman-teman dan sahabat yang selalu memberikan dukungan dan motivasi
untuk menyelesaikan laporan skripsi ini.
7. Dan semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah
membantu dalam proses penyelesaian laporan ini.
Penulis menyadari bahwa laporan skripsi ini masih memiliki banyak
kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang
bersifat membangun. Semoga laporan skripsi ini dapat bermanfaat bagi para
pembaca.
Malang, Oktober 2015
Penulis
iv
DAFTAR ISI
RINGKASAN ........................................................................................................ iKATA PENGANTAR ............................................................................................ iiiDAFTAR ISI ......................................................................................................... ivDAFTAR TABEL .................................................................................................. vDAFTAR GAMBAR .............................................................................................. viDAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................... vii
I. PENDAHULUAN ................................................................................................ 11. 1 Latar Belakang................................................................................................ 11. 2 Rumusan Masalah.......................................................................................... 31. 3 Tujuan Penelitian ............................................................................................ 31. 4 Manfaat Penelitian .......................................................................................... 31. 5 Hipotesa ......................................................................................................... 3
II. TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................................... 42.1 Kedelai Hitam ............................................................................................... 42.2 Ampas Kecap ............................................................................................... 52.3 Antioksidan................................................................................................... 62.4 Mekanisme Kerja antioksidan ....................................................................... 72.5 Flavonoid...................................................................................................... 82.6 Antosianin..................................................................................................... 112.7 Stabilitas Antosianin ..................................................................................... 142.8 Ekstraksi Antosianin ..................................................................................... 152.9 Bahan Pengekstrak ...................................................................................... 172.10 Ultrasonik ..................................................................................................... 192.11 Pengukuran Aktivitas Antioksidan................................................................. 24
III. METODOLOGI PENELITIAN ........................................................................... 263.1 Tempat dan Waktu Penelitian....................................................................... 263.2 Alat dan Bahan Penelitian............................................................................. 263.3 Metode Penelitian......................................................................................... 263.5 Analisa Data ................................................................................................. 283.6 Diagram Alir Penelitian ................................................................................. 29
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................... 314.1 Karakteristik Bahan Baku.............................................................................. 314.2 Karakteristik Fisik Ekstrak Ampas Kecap...................................................... 324.3 Karakteristik Kimia Ekstrak Ampas Kecap .................................................... 364.4 Pengaruh Total Flavonoid dan Total Antosianin terhadap Aktivitas
Antioksidan................................................................................................... 434.5 Pemilihan Perlakuan Terbaik ........................................................................ 48
V. PENUTUP ......................................................................................................... 515.1 Kesimpulan................................................................................................... 515.2 Saran............................................................................................................ 51
DAFTAR PUSTAKA.............................................................................................. 52LAMPIRAN............................................................................................................ 59
v
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1 Komposisi Zat Gizi dalam 100 gram Kedelai Hitam ............................. 4Tabel 2.2 Komponen Antosianin pada Kedelai Hitam.......................................... 5Tabel 2.3 Gugus Pengganti dalam Struktur Kation Falvium Antosianin ............... 13Tabel 2.4 pH dan Warna Antosianin.................................................................... 13Tabel 2.5 Karakteristik Fisik dan Kimia Etanol..................................................... 18Tabel 2.6 Perbandingan Ekstraksi Metode Soxhletasi dan UAE.......................... 20Tabel 2.7 Aplikasi Ultarsonik pada Berbagai Bidang ........................................... 24Tabel 4.1 Hasil Analisa Bahan Baku Tepung Ampas Kecap................................ 31Tabel 4.2 Rerata Rendemen Ekstrak Ampas Kecap Akibat Pengaruh Perlakuan
Rasio Bahan:Pelarut............................................................................ 33Tabel 4.3 Rerata Rendemen Ekstrak Ampas Kecap Akibat Pengaruh Perlakuan
Waktu Ekstraksi................................................................................... 35Tabel 4.4 Rerata Total Flavonoid Ekstrak Ampas Kecap Akibat Perlakuan Rasio
Bahan:Pelarut dan Waktu Ekstraksi..................................................... 38Tabel 4.5 Rerata Total Antosianin Ekstrak Ampas Kecap Akibat Pengaruh
Perlakuan Rasio Bahan:Pelarut........................................................... 39Tabel 4.6 Rerata Total Antosianin Ekstrak Ampas Kecap Akibat Pengaruh
Perlakuan Rasio Bahan:Pelarut........................................................... 40Tabel 4.7 Rerata Aktivitas Antioksidan Ekstrak Ampas Kecap Akibat Pengaruh
Perlakuan Rasio Bahan:Pelarut........................................................... 42Tabel 4.8 Rerata Aktivitas Antioksidan Ekstrak Ampas Kecap Akibat Pengaruh
Perlakuan Waktu Ekstraksi .................................................................. 42Tabel 4.9 Regresi Multivariate Total Flavonoid dan Total Antosianin terhadapa
Aktivitas Antioksidan Ekstrak Ampas Kecap ........................................ 44Tabel 4.10 Karakteristik Fisik dan Kimia Ekstrak Ampas Kecap Perlakuan
Terbaik (R3T3) .................................................................................... 48
vi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2. 1 Struktur Kimia Isoflavon .................................................................. 9Gambar 2. 2 Reaksi Hidrolisis Glikosida Isoflavon Menjadi Aglukan Isoflavon... 11Gambar 2. 3 Struktur Antosianin dan Penomoran Atom Karbon ........................ 12Gambar 2. 4 Pengkonversian Etanol menjadi Asetaldehida dan Ion Asetat ....... 18Gambar 2. 5 Fenomena Kavitasi ....................................................................... 19Gambar 2. 6 Ultrasonik Bath ............................................................................. 22Gambar 2. 7 Struktur Kimia DPPH..................................................................... 24Gambar 3. 1 Proses Pembuatan Tepung Ampas Kecap.................................... 29Gambar 3. 2 Proses Ekstraksi Tepung Ampas Kecap ....................................... 30Gambar 4. 1 Grafik Rerata Rendemen Ekstrak Ampas Kecap Akibat Pengaruh
Perlakuan Rasio Bahan:Pelarut dan Waktu Ekstraksi ................... 33Gambar 4.2 Grafik Rerata Total Flavonoid Ekstrak Ampas Kecap Akibat
Pengaruh Perlakuan Rasio Bahan:Pelarut dan Waktu Ekstraksi ... 36Gambar 4.3 Grafik Rerata Total Antosianin Ekstrak Ampas Kecap Akibat
Pengaruh Perlakuan Rasio Bahan:Pelarut dan Waktu Ekstraksi ... 39Gambar 4.4 Grafik Rerata Aktivitas Antioksidan Ekstrak Ampas Kecap Akibat
Pengaruh Perlakuan Rasio Bahan:Pelarut dan Waktu Ekstraksi ... 41Gambar 4.5 Grafik Korelasi Aktivitas Antioksidan (%) dengan Rerata Total
Flavonoid (mg/g) Ekstrak Ampas Kecap........................................ 45Gambar 4.6 Grafik Korelasi Aktivitas Antioksidan (%) dan Rerata Total
Antosianin (mg/g) Ekstrak Ampas Kecap ...................................... 46
vii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Persiapan Ekstrak............................................................................... 59Lampiran 2 Prosedur Analisa Sampel.................................................................... 61Lampiran 3 Hasil Analisa Bahan Baku Tepung Ampas Kecap ............................... 65Lampiran 4 Hasil Analisa Rendemen Ekstrak Ampas Kecap ................................. 66Lampiran 5 Hasil Analisa Total Flavonoid Ekstrak Ampas Kecap .......................... 69Lampiran 6 Hasil Analisa Total Antosianin Ekstrak Ampas Kecap ......................... 72Lampiran 7 Hasil Analisa Aktivitas Antioksidan Ekstrak Ampas Kecap .................. 74Lampiran 8. Penentuan Perlakuan Terbaik Metode Zeleny.................................... 76Lampiran 9. Dokumentasi ...................................................................................... 78
1
I. PENDAHULUAN
1. 1 Latar Belakang
Industri pengolahan kecap merupakan salah satu industri berkembang di
Indonesia. Pertumbuhan industri kecap di Indonesia cukup besar setiap tahun
yaitu secara nasional terjadi peningkatan 10% sampai 20%. Hal tersebut
mendorong peningkatan permintaan kedelai hitam sebagai bahan baku produksi
kecap. Menurut Matsuda (1998) satu kali produksi kecap bisa menghabiskan ½
hingga 2 ton kedelai hitam per hari. Dalam proses pembuatan kecap, yang
digunakan adalah ekstrak dari fermentasi kedelai sehingga ampasnya dibuang
menjadi limbah. Limbah industri kecap merupakan limbah padat yang
mengandung 27,26% protein, 10,06% lemak dan 28,83% karbohidrat (Lubis,
1997).
Dari total industri kecap di Indonesia dan produksi kecap per harinya bisa
dilihat bahwa limbah hasil ekstraksi kedelai terfermentasi (soy sauce cake)
tersebut sangat melimpah, namun pemanfaatannya selama ini masih sangat
kurang. Pemanfaatan limbah atau ampas kecap tersebut selama ini masih
terbatas sebagai pakan ternak, sementara ampas kecap yang berasal dari
kedelai hitam tersebut selain masih memiliki kandungan gizi yang tinggi, juga
diduga masih mengandung asam amino, asam organik, isoflavon seperti
daidzein dan genistein mengingat juga ampas kecap sebelumnya telah
mengalami proses fermentasi (Matsuda, 1998). Oleh karena itu ampas kecap
tersebut memIliki potensi untuk dikembangkan lebih jauh. Salah satu potensi
untuk memanfaatkan dan meningkatkan nilai guna ampas kecap adalah
memanfaatkan kandungan antioksidan yang terdapat dalam ampas kecap.
Ampas kecap berasal dari kedelai hitam yang diduga masih memiliki
kadar antioksidan yang tinggi. Antioksidan pada kedelai hitam berupa antosianin
yang didapat dari pigmen hitam pada kedelai hitam. Menurut (Choung, et al.,
2001) kadar antosianin pada kedelai hitam berkisar antara 1,58-20,18 mg/g
dengan jenis antosianin antara lain yaitu Delpinidhin 3- monoglucoside, Cyainidin
3-Monoglucoside, dan Petunidin 3-Monoglucoside. Antosianidin atau aglikon
antosianin adalah salah satu senyawa flavonoid kelompok flavon. Senyawa
antioksidan lain yang terdapat pada ampas kecap adalah isoflavon. Isoflavon
dalam bentuk bebas (aglikon) mempunyai aktivitas antioksidatif. Isoflavon aglikon
2
juga dijumpai pada makanan olahan kedelai, misalnya tempe, tahu, dan kecap
(Hou et al., 2002). Senyawa antioksidan seperti antosianin dan senyawa
golongan flavonoid lainnya berperan sebagai penangkap radikal bebas (radical
scavengers) dan mencegah reaksi berantai sehingga tidak terjadi peroksidasi
lipid yang diharapkan dapat membantu meminimalisir stress oksidatif dan
mencegah komplikasi pada diabetes mellitus tipe II.
Kandungan senyawa-senyawa bioaktif yang terdapat dalam ampas kecap
tersebut dapat dikeluarkan melalui ekstraksi. Ekstraksi konvensional memiliki
kelemahan yaitu membutuhkan waktu yang lama dan suhu ekstraksi yang tinggi
dengan hasil ekstrak rendah namun konsumsi energi tinggi (Hemwimol, 2006).
Pengembangan proses ekstraksi untuk mendapat hasil yang lebih baik dan
waktu yang lebih singkat terus dilakukan. Salah satunya adalah dengan metode
ultrasonik. Ultrasonik merupakan metode ekstraksi non termal yang efektif dan
efisien. Penelitian Mason et al., (1996) menyebutkan pada proses ekstraksi
senyawa dari adas, hops, marigold, daun mint, dan lemon dengan gelombang
ultrasonik dapat meningkatkan 20-40% hasil ekstraksi dibandingkan metode
ekstraksi konvensional.
Proses ekstraksi dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya
adalah jenis pelarut, konsentrasi pelarut, metode ekstraksi yang digunakan, dan
lama waktu ekstraksi (Goli et al., 2004). Kepolaran antosianin hampir sama
dengan etanol 95% sehingga pelarut yang paling baik digunakan untuk ekstraksi
antosianin adalah etanol 95% seperti pada penelitian Saati (2002) tentang
ekstraksi antosianin dari bunga pacar yang menggunakan pelarut etanol 95%.
Menurut Winata (2015) rasio bahan:pelarut 1:7 dan waktu ekstraksi 30 menit
adalah perlakuan terbaik untuk mengekstrak antosianin buah murbei dengan
ultrasonic bath dengan kadar antosianin 3344,62 ppm, aktivitas antioksidan
219,27 ppm, dan rendemen 45,26%. Agar diperoleh hasil yang paling baik dalam
proses ekstraksi, maka proses ekstraksi yang dilakukan harus maksimal dan
efisien. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh rasio
bahan dengan pelarut dan lama waktu ektraksi terhadap karakterisasi senyawa
bioaktif yang terdapat pada ampas kecap. Penelitian ini diharapkan dapat
memberikan informasi tentang senyawa bioaktif yang terdapat dalam ekstrak
ampas kecap (soy sauce cake) sehingga bisa dimanfaatkan lebih lanjut dan
diaplikasikan untuk produk-produk pangan fungsional.
3
1. 2 Rumusan Masalah
1. Bagaimana rasio bahan dengan etanol 96% dan waktu ektraksi yang tepat
untuk mendapatkan rendemen ekstrak ampas kecap (soy sauce cake) yang
optimal?
2. Bagaimana pengaruh rasio bahan dengan etanol 96% dan waktu ektraksi
terhadap profil senyawa bioaktif ekstrak ampas kecap (soy sauce cake)?
1. 3 Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari penelitian ini adalah :
1. Mengetahui rasio bahan dengan etanol 96% dan waktu ektraksi yang tepat
dengan metode ultrasonic bath untuk mendapatkan rendemen ekstrak
ampas kecap (soy sacuce cake) yang optimal
2. Mengetahui pengaruh rasio bahan: etanol 96% dan waktu ektraksi terhadap
profil senyawa bioaktif ekstrak ampas kecap (soy sauce cake).
1. 4 Manfaat Penelitian
1. Memberikan informasi mengenai rasio bahan dengan etanol 96% dan waktu
ekstraksi yang tepat untuk mengekstraksi senyawa bioaktif yang terdapat
dalam ampas kecap (soy sauce cake) dengan metode ultrasonic bath.
2. Memberikan informasi mengenai aktivitas antioksidan, senyawa bioaktif
(total flavonoid dan kadar antosianin) dari ekstrak ampas kecap yang
didapat.
3. Mendapatkan rendemen ekstrak yang optimal dari proses ekstraksi sehingga
bisa dimanfaatkan dan diaplikasikan lebih lanjut.
4. Memanfaatkan limbah industri pengolahan kecap yang jumlahnya sangat
melimpah sehingga bisa diketahui manfaat lain dari ampas kecap tersebut.
1. 5 Hipotesa
Perbedaan rasio bahan: etanol 96% dan waktu ekstraksi dengan metode
Ultrasonic bath diduga akan berpengaruh nyata terhadap karakteristik fisik, kimia,
dan profil senyawa bioaktif (aktivitas antioksidan, total flavonoid, dan total
antosianin) ekstrak ampas kecap (soy sauce cake) yang dihasilkan.
4
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Kedelai Hitam
Kedelai atau kacang kedelai adalah salah satu tanaman polong-polongan
yang menjadi bahan dasar berbagai macam makanan seperti tempe, tahu, dan
kecap. Di Indonesia kedelai banyak dibudidayakan di dataran rendah yang tidak
banyak mengandung air seperti di Pesisir Utara Jawa Timur, Jawa Tengah, Jawa
Barat, Sulawesi Utara (Gorontalo), Lampung, Sumatera Selatan, dan Bali.
Kedelai termasuk ke dalam famili Leguminoceae. Kedelai diklasifikasikan
menjadi tiga subgenus, yaitu : 1) Glycine (pengganti Leptocyamus), 2) Bracteata
(pengganti Glycine), dan 3) Soja (Hidajat, 1985). Subgenus kedelai yang banyak
dibudidayakan adalah subgenus Soja yang terdiri dari dua jenis, yaitu: Glycine
ussuriensis merupakan kedelai liar yang merambat dengan daun bertangkai tiga,
kecil dan sempit, berbunga ungu serta berbiji kecil keras berwarna hitam hingga
coklat tua dan Glycine max memiliki warna bunga putih atau ungu, memiliki
bentuk daun dan biji yang beragam (Adie dan Krisnawati, 2007).
Kedelai hitam (Glycine soja) merupakan kedelai lokal yang belum dikenal
luas dan belum dikembangkan di Indonesia. Tanaman kedelai hitam termasuk
famili Leguminosae (Yuliana, 2007). Komposisi gizi dalam kedelai hitam dapat
dilihat pada Tabel 2.1 di bawah ini.
Tabel 2. 1 Komposisi Zat Gizi dalam 100 gram Kedelai Hitam
Sumber: Somaatmadja (1985)
Menurut Beninger (2009), kedelai hitam menempati daftar teratas dengan
aktivitas antioksidan tertinggi dibandingkan jenis kedelai lainnya (kedelai merah,
cokelat, kuning, dan putih). Warna yang lebih gelap yang melapisi kulit kedelai
dikaitkan dengan kandungan flavonoid yang lebih tinggi, begitu juga dengan
aktivitas antioksidan yang lebih baik. Kandungan antioksidan pada kedelai hitam
Zat Gizi (Gram)Air 12,3Protein 33,3Lemak 15,0Karbohidrat 35,4Mineral 4,0
5
berupa antosianin yang berasal dari pigmen hitam pada biji kedelai hitam.
Antosianin pada kedelai hitam antara lain adalah sebagai berikut.
Tabel 2. 2 Komponen Antosianin pada Kedelai Hitam
Sumber: Choung et al.(2001)
2.2 Ampas Kecap
Kecap adalah ekstrak dari fermentasi kedelai yang dicampurkan dengan
bahan-bahan lain yang digunakan untuk meningkatkan flavor dari makanan.
Tahap-tahap utama dari produksi kecap yang melibatkan pembentukan flavor
antara lain perlakuan panas terhadap bahan baku, pembentukan koji (fermentasi
kapang), fermentasi moromi (fermentasi bakteri asam laktat dan khamir), aging,
dan pasteurisasi (Nunomura dan Sasaki, 1992). Proses fermentasi dalam larutan
garam (fermentasi moromi) bertujuan agar bakteri-bakteri yang ada secara alami
di dalam larutan garam dapat memecah senyawa-senyawa peptida menjadi
asam-asam amino dan amonia. Menurut Koswara (1992) pada fermentasi ini
kedelai yang telah mengalami proses koji dicampur dengan larutan garam dan
difermentasi selama 1 minggu sampai 4 bulan. Konsentrasi garam yang
digunakan biasanya sekitar 20-25% (Krisno, 1990). Hasil dari fermentasi moromi
kemudian dipisahkan ekstrak dan ampasnya melalui penyaringan atau bisa juga
dengan pressing menggunakan mesin kompresi. Ekstrak tersebut kemudian
diolah dengan penambahan bumbu dan tahapan selanjutnya hingga menjadi
kecap. Sementara ampasnya dibuang menjadi limbah dan sebagian
dimanfaatkan sebagai pakan ternak. Sehingga ampas kecap merupakan limbah
padat hasil penyaringan dan pengepresan dari proses pembuatan kecap
(Sukarini, 2004).
Sitorus (1986) menyatakan bahwa ampas kecap merupakan limbah dari
proses pembuatan kecap yang berbahan dasar kedelai hitam dan memiliki
kandungan protein cukup tinggi dan palatabel. Oleh karena ampas kecap berasal
dari kedelai hitam, maka kandungan gizi yang terkandung dalam ampas kecap
tidak berbeda jauh dari kedelai hitam. Xu dan Chang (2007) menyebutkan bahwa
kedelai hitam mempunyai kandungan fenolik, tanin, antosianin, dan isoflavon
Jenis Antosianin Jumlah (mg/g)Delphinidin-3-Glukosida 0 – 3,71Cyanidin3-Glukosida 0,94 – 15,98Petunidin-3-Glukosida 0 – 1,41Antosianin Total 1,58 – 20,18
6
serta aktivitas antioksidan lebih tinggi dibanding kedelai kuning. Kandungan
asam amino, asam organik, isoflavon seperti daidzein dan genistein diduga
masih ada mengingat juga ampas kecap sebelumnya telah mengalami proses
fermentasi (Matsuda, 1998). Kandungan senyawa bioaktif yang masih ada pada
ampas kecap dapat dikeluarkan pada saat ekstraksi.
2.3 Antioksidan
Antioksidan adalah suatu zat yang diperlukan tubuh untuk menetralisir
radikal bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas
terhadap sel normal. Antioksidan menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi
kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas, dan menghambat terjadinya
reaksi pembentukan radikal bebas yang dapat menimbulkan stress oksidatif
(Holistic, 2011).
Radikal bebas adalah suatu atom, gugus atom, atau molekul yang meiliki
satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbital paling luar,
termasuk diantaranya adalah atom hidrogen, logam-logam transisi dan molekul
oksigen. Radikal bebas merupakan molekul yang tidak stabil karena kehilangan
elektronnya. Untuk menjadi stabil, radikal bebas akan mengambil elektron dari
molekul atau sel lain dalam tubuh kita. Proses pengambilan elektron dari sel-sel
tubuh kita menyebabkan kerusakan sel (Holistic, 2011).
Menurut Kumalaningsih (2006) antioksidan memiliki beragam jenis dan
terdapat tiga macam antioksidan yaitu:
a. Antioksidan yang dibuat sendiri oleh tubuh berupa enzim antara lain
superoksida dismutase, glutathione peroksidase, peroxidasi, dan
katalase.
b. Antioksidan alami yang dapat diperoleh dari tanaman atau hewan, yaitu:
tokoferol, vitamin C, β-karoten, flavonoid, dan senyawa fenolik.
Antioksidan alami dalam makanan dapat berasal dari senyawa
endogenous dari satu atau lebih komponen makanan, substansi yang
terbentuk dari hasil reaksi selama pengolahan dan bahan tambahan
makanan yang diisolasi dari sumber alami. Sebagian besar antioksidan
alami berasal dari tanaman. Beberapa sumber umum antioksidan alami
yang berasal dari tanaman diantaranya adalah alga, serealia, produk
coklat, rempah-rempah, legume, biji-bijian berminyak dan ekstrak
tanaman.
7
c. Antioksidan sintetik merupakan antoksidan yang dibuat dari bahan-bahan
kimia seperti Butil Hidroksi Anisol (BHA), Butil Hidroksi Toluena (BHT)
dan asam askorbat yang ditambahkan ke dalam makanan untuk
mencegah kerusakan lemak.
Menurut Sofia (2007), antioksidan terbagi menjadi antioksidan enzim dan
vitamin. Antioksidan enzim meliputi superoksida dismutase, katalase, dan
glutation peroksidase. Antioksidan vitamin lebih popular sebagai antioksidan
dibandingakn enzim. Antioksidan vitamin mancakup alfa tokoferol (vitamin E),
beta karoten, dan asam askorbat (vitamin C).
Antikosidan alami di dalam makanan dapat berasal dari senyawa
antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen makanan, senyawa
antioksidan yang terbentuk dari reaksi-reaksi selama proses pengolahan dan
ketiga adalah senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan
ditambahkan ke makanan sebagai bahan tambahan pangan (Kumalaningsih,
2006).
Salah satu senyawa antioksidan adalah senyawa golongan flavonoid.
Menurut Zubik and Meydani (2003) flavonoid merupakan senyawa polifenol yang
terdapat pada teh, buah-buahan, sayuran, anggur, bir, kecap, dan kacang-
kacangan. Salah satu senyawa kacang-kacangan yang banyak mengandung
senyawa isoflavon adalah kedelai. Secara alami, isoflavon pada kedelai hampir
seluruhnya terdapat dalam bentuk β-glikosida (glikon). Pada beberapa olahan
kedelai yang mengalami proses fermentasi seperti kecap, isoflavon bentuk
aglikon (bebas) lebih dominan. Ampas kecap seperti yang telah dijelaskan di atas
merupakan salah satu sumber isoflavon yang bisa digunakan sebagai
antioksidan. Selain itu kulit dari kedelai hitam merupakan sumber pigmen
antosianin seperti cyanidin-3-glucoside dan delphinidin-3-glucoside yang dapat
menurunkan kadar kolesterol darah. Kandungan antosianin pada kedelai hitam
jauh lebih banyak dibanding kedelai kuning karena warna hitam pada kulitnya.
2.4 Mekanisme Kerja antioksidan
Mekanisme kerja antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi pertama
merupakan fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen.
Antioksidan (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai
antioksidan primer. Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara cepat
ke radikal lipida (R-, ROO- ) atau mengubahnya ke bentuk lebih stabil, sementara
8
turunan radikal antioksidan (A+) tersbut memiliki keadaan lebih stabil dibanding
radikal lipida. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan, yaitu
memperlambat laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme diluar mekanisme
pemutusan rantai autooksidasi (AH) primer dengan konsentrasi rendah pada
lipida dapat menghambat atau mencegah reaksi autooksidasi lemak dan minyak
(Jati, 2008).
Radikal-radikal antioksidan (A+) yang terbentuk pada reaksi tersebut
relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat bereaksi dengan
molekul lipida lain membentuk radikal lipida baru. Besar antioksidan yang
ditambahkan dapat berpengaruh pada laju oksidasi. Pada konsentrasi tinggi,
aktivitas antioksidan grup fenolik sering lenyap bahkan antioksidan tersebut
menjadi prooksidan. Pengaruh jumlah konsentrasi pada laju oksidasi tergantung
pada struktur antioksidan, kondisi, dan sampel yang akan diuji. Antioksidan
bertindak sebagai prooksidan pada konsentrasi tinggi (Jati, 2008).
AH + O2 ------- A+ + HOO-
AH + ROOH ------- RO + H2O + A
2.5 Flavonoid
Flavonoid adalah senyawa fenol yang terdapat pada seluruh tumbuhan, di
bagian daun, akar, kayu, kulit, bunga, buah dan biji. Flavonoid berupa senyawa
yang terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoid yang terdapat
dalam suatu tumbuhan sebagai campuran. Flavonoid merupakan senyawa polar
seperti etanol, butanol, methanol, aseton, air dan lain-lain. Adanya gula yang
terikat pada flavonoid cenderung menyebabkan flavonoid lebih mudah larut
dalam air (Padmawinata, 1988).
Xu dan Chang (2007) menyebutkan bahwa kedelai hitam mempunyai
kandungan fenolik, tanin, dan isoflavon serta aktivitas antioksidan lebih tinggi
dibanding kedelai kuning. Kedelai hitam kandungan flavonoidnya 6 kali lebih
banyak dibanding kedelai kuning, kandungan total flavonoid kedelai kuning dan
hitam berturut-turut 0,41 dan 2,57 mg ekuivalen dengan katekin per gram, dan
aktivitas antioksidan 15 kali lebih tinggi (DPPH scavenging capacity kedelai
kuning dan hitam berturut-turut yaitu 1,50 dan 17,58 μmol ekuivalen Trolox per
gram).
Isoflavon adalah salah satu senyawa yang termasuk dalam golongan
isoflavonoid. Isoflavonoid mengandung 15 atom C yang menyusun konfigurasi
9
diphenylpropane skeleton sebagai struktur dasarnya termasuk sub-kelas
flavonoid. Penyebaran isoflavon terbatas di alam dan biasanya terdapat dalam
kelompok tanaman kacang-kacangan atau leguminosae dan tidak terdapat pada
mikroorganisme seperti bakteri, alga, jamur, dan lumut (Markham, 1988). Di
dunia tanaman, tidak diketahui secara pasti mengapa kacang-kacangan tertentu
mengandung isoflavon. Fungsi biologi isoflavon di dalam siklus hidup tanaman
juga tidak diketahui secara pasti (Dewick, 1994).
Senyawa isoflavon merupakan senyawa metabolit sekunder yang banyak
disintesis oleh tanaman. Namun, tidak seperti senyawa metabolit sekunder lain,
senyawa ini tidak disintesis oleh mikroorganisme (Prawiroharsono, 2001).
Dengan demikian, mikroorganisme tidak mempunyai kandungan senyawa ini.
Oleh karena itu, tanaman merupakan sumber utama senyawa isoflavon di alam.
Dari beberapa jenis tanaman, kandungan isoflavon yang lebih tinggi terdapat
pada tanaman Leguminoceae, khususnya pada tanaman kedelai.
Kedelai diketahui mengandung antioksidan yang diidentifikasi sebagai
isoflavon (Wu dan Brewer, 1994). Isoflavon terdistribusi secara terbatas pada
bahan-bahan yang terdapat di alam (Hou et al., 2002). Isoflavon dalam bentuk
bebas (aglikon) mempunyai aktivitas antioksidatif. Isoflavon aglikon juga dijumpai
pada makanan olahan kedelai, misalnya tempe, tahu, dan kecap. Kudou et al.
(1991) dan Coward et al. (1993) melaporkan kandungan isoflavon aglikon
(genistein dan daidzein) dalam kedelai dan olahan kedelai adalah 1-3 mg/g berat
kering. Coward et al. (1993) juga melaporkan bahwa kandungan isoflavon
aglikon dalam olahan kedelai terfermentasi lebih besar daripada dalam olahan
kedelai tanpa fermentasi.
Isoflavon mempunyai struktur kimia hampir sama dengan estrogen.
Isoflavon sering disebut fitoestrogen atau estrogen nabati (Pakasi, 2000).
Struktur kimia Isoflavon dapat dilihat pada Gambar 2.2.
Gambar 2. 1 Struktur Kimia Isoflavon (Ariani dan Hastuti, 2009)
10
Kaufman et al. (1997) melaporkan bahwa bagian vegetatif tanaman yaitu
biji, batang, daun, tunas, dan akar kacang-kacangan mengandung genistein dan
daidzein. Tanaman kacang-kacangan tersebut termasuk varietas kacang
panjang, kacang kapri, semanggi, kacang kedelai, kacang hijau, dan buncis.
Kacang kedelai memiliki kandungan isoflavon yang cukup tinggi dibandingkan
dengan jenis kacang-kacangan yang lain. Sementara itu menurut Kim et al.,
(2004) kedelai hitam memiliki kandungan isoflavon lebih tinggi daripada kedelai
kuning. Pada tanaman kedelai, kandungan isoflavon yang lebih tinggi terdapat
pada biji kedelai, khususnya pada bagian hipokotil (germ) yang akan tumbuh
menjadi tanaman. Sebagian lagi terdapat pada kotiledon yang akan menjadi
daun pertama dari tanaman. Senyawa isoflavon ini pada umumnya berupa
senyawa kompleks atau konjugasi dengan senyawa gula melalui ikatan
glukosida. Jenis senyawa isoflavon ini terutama adalah genistin, daidzin, dan
glisitin (Pradana, 2008).
Isoflavon pada kedelai terdapat dalam empat bentuk, yaitu dalam bentuk
aglikon: daidzein, genistein, dan glisitein; bentuk glikosida : daidzin, genistin, dan
glisitin; bentuk asetilglikosida : 6-0-asetildaidzin, 6-0-asetilgenestin, dan 6-
0asetilglisitin; dan bentuk Malonilglikosid: 6-0-malonildaidzin, 6-0malonilgenestin,
dan 6-malonilglisitin (Wang & Murphy, 1994). Gyorgy et al. (1964) telah
mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa isoflavon spesifik pada tempe kedelai,
yaitu faktor-2 (6,7,4’-trihidroksiisoflavon), genistein (5,7,4 trihidroksiisoflavon),
daidzein (7,4’ dihidroksiisoflavon), dan glisitein.
Naim (1973) melaporkan bahwa kedelai dorman mengandung glikosida
isoflavon yang terdiri dari : 65% genistin, 23% daidzin dan 15% glisitin. Isoflavon
yang dominan pada kedelai terdapat dalam bentuk glikosida, sedangkan yang
dominan pada produk kedelai yang mengalami fermentasi adalah aglikon
(Coward et al., 1993). Bentuk glikosida dipertahankan oleh tanaman sebagai
bentuk inaktif sehingga dibutuhkan sebagai antioksidan. Bentuk aktif glikosida
adalah aglikon, yang dihasilkan dari pelepasan glukosa dan glikosida (Anderson
et al., 1998).
Senyawa isoflavon merupakan salah satu komponen yang juga
mengalami metabolisme. Senyawa isoflavon ini pada kedelai berbentuk senyawa
konjugat dengan senyawa gula melalui ikatan -O- glikosidik. Selama proses
fermentasi, ikatan -O- glikosidik terhidrolisis, sehingga dibebaskan senyawa gula
dan isoflavon aglikon yang bebas. Senyawa isoflavon aglikon ini dapat
11
mengalami transformasi lebih lanjut membentuk senyawa transforman baru.
Hasil transformasi lebih lanjut dari senyawa aglikon ini justru menghasilkan
senyawa-senyawa yang mempunyai aktivitas biologi lebih tinggi (Pawiroharsono,
2001).
Gambar 2. 2 Reaksi Hidrolisis Glikosida Isoflavon Menjadi Aglukan
Gambar 2.3 merupakan gambar reaksi hidrolisis glukosida isoflavon
menjadi aglukan. Pratt dan Hudson (1985), melaporkan bahwa daidzin, genistin,
dan glisitein yang terdapat pada biji kedelai dapat dihidrolisis oleh ß-glukosidase
selama proses perendaman menjadi aglikon isoflavon dan glukosanya yaitu
genestein (5,7,4’-trihidroksi isoflavon) dan glukosa, daidzein (7,4’-trihidroksi
isoflavon) dan glukosa, serta glisitein (6-metoksi-7,4’-dihidroksi isoflavon) dan
glukosa.
2.6 Antosianin
Antosianin adalah zat warna alami yang bersifat sebagai antioksidan yang
terdapat dalam tumbuh-tumbuhan. Lebih dari 300 struktur antosianin yang
ditemukan telah diidentifikasi secara alami (Wrolstad, 2001). Antosianin adalah
pigmen dari kelompok flavonoid yang larut dalam air, berwarna merah sampai
12
biru dan tersebar luas pada tanaman. Terutama terdapat pada buah dan bunga,
namun juga terdapat pada daun. Kadar antosianin cukup tinggi terdapat pada
berbagai tumbuh-tumbuhan seperti misalnya: bilberries (Vaccinium myrtillus L),
minuman anggur merah (red wine), dan anggur (Jawi et al., 2007).
Antosianin tersusun dari glikosida dari polyhidroxyl yang larut dalam air
serta merupakan derivat dari polymetoksil dari 2-phenylbenzopytylium atau
garam flavilium (Galvano, 2005). Warna pada antosianin biasanya tidak dibentuk
oleh satu pigmen, seringkali lebih dari satu kombinasi atau sistem dari pigmen.
Struktur utama antosianin tersusun dari rangka karbon dengan gugus hidrogen
hidroksil dan metoksil yang ditemukan dalam enam posisi berbeda.
Dua puluh jenis senyawa antosianin telah ditemukan tetapi terdapat 6
jenis yang memegang peranan penting dalam bahan pangan. Keenam jenis
antosianin tersebut adalah cyanidin, delphinidin, malvidin, pelargonidin, peonidin,
dan petunidin yang mendominasi dalam buah-buahan dan sayuran di mana
keenamnya berbeda pada banyaknya gugus hidroksil pada cincin karbon serta
berbeda pada derajat metilasi dari gugus hidroksil tersebut. Identitas, nomor,
jumlah, dan posisi dari gula dalam rangka karbon juga bisa menjadi penyebab
perbedaan jenis antosianin. Gula yang biasanya berada dalam gugus karbon
dalam struktur antosianin adalah glukosa, arabinosa, galaktosa baik
monoglikosida, diglikosida atau triglikosida. Variabel penting lain yang berperan
pada penyusun struktur kimia dari antosianin adalah asil asam yang biasanya
berupa karbohidrat yaitu asam kafeat, perulat, dan sinamat tetapi asam alifatik
seperti asam amalat, malonat, oksalat, dan suksinat juga sering ikut dalam
penyusun antosianin (Galvano, 2005). Struktur antosianin dapat dilihat di
Gambar 2.4.
Gambar 2. 3 Struktur Antosianin (Mateus, 2009)
Antosianin tersusun oleh sebuah aglikogen yang berupa antosianidin
yang teresterifikasi dengan molekul gula. Seluruh senyawa antosianin
13
merupakan turunan dari kation flavilium. Setiap inti flavilium terdapat sejumlah
molekul yang berfungsi sebagai gugus pengganti. Tabel 2.4 menunjukkan
sejumlah gugus pengganti yang ditemui dalam antosianin.
Tabel 2. 3 Gugus Pengganti dalam Struktur Kation Falvium Antosianin
Antosianidin Substitusi pada Karbon Nomor3’ 4’ 5’
Pelargonidin H OH HSianidin OH OH HDelfinidin OH OH OHPeonidin OCH3 OH HPetunidin OCH3 OH HMalvidin OCH3 OH OCH3
Sumber: Mateus (2009)
Secara kimia, antosianin merupakan turunan struktur aroma tunggal yaitu
cyanidin dan terbentuk dari pigmen cyanidin dengan penambahan atau
pengurangan gugus hidroksil. Antosianidin adalah aglikon antosianin yang
terbentuk bila antosianin dihidrolisis dengan asam. Antosianidin yang paling
umum dipakai adalah cyanidin. Warna merah dan biru umumnya disebabkan
oleh delfinidin yang gugus hidroksilnya lebih satu dibanding cyanidin. Akibat
pigmen antosianin yang sangat sensitif dengan perubahan pH, antosianin
dikelompokkan dalam empat bentuk struktur. Arthey dan Arthust (2001)
menyebutkan bahwa struktur antosianin yang dipengaruhi oleh pH adalah basa
quioidal (A), kation flavilium (AH+), basa karbinol yang tidak berwarna (B) dan
khalkone tidak berwarna (C). Perubahan pH mengakibatkan perubahan warna
antosianin seperti ditunjukkan pada Tabel 2.5.
Tabel 2. 4 pH dan Warna Antosianin
Warna pHCherry red (merah) 1-2Cerise 3Plum (coklat) 4Royal purple (ungu) 5Blue purple (ungu kebiruan) 6Blue (biru) 7Blue green (hijau kebiruan) 8Emerald green (hijau jamrud) 9-10Grass green (hijau) 10-11Lime green 12-13Yellow (kuning) 14Sumber: Arthey dan Arthust (2001)
14
2.7 Stabilitas Antosianin
Antosianin adalah pigmen yang sangat dipengaruhi pH. Seperti yang
sudah dijelaskan sebelumnya, warna dari antosianin akan berubah sejalan
dengan perubahan nilai pH. Antosianin yang stabil pada pH rendah
kestabilannya akan berubah jika pH meningkat menuju pH netral. Selain pH,
antosianin juga dipengaruhi oleh oksigen, suhu, cahaya, logam, enzim, dan
asam askorbat (Iversen, 1999).
Faktor-faktor yang mempengaruhi stabilitas antosianin adalah:
a. pH
Pigmen antosianin diperoleh dengan ekstraksi menggunakan air atau
alkohol yang telah diasamkan. Dalam media asam akan tampak berwarna
merah dan akan berubah menjadi biru apabila pH meningkat. Warna dari
antosianin biasanya lebih stabil pada pH di bawah 3,5. Pigmen ini cocok untuk
mewarnai makanan yang asam (Maga dan Tu, 1994). Eskin (1990)
menyebutkan bahwa pigmen antosianin stabil pada pH 1-3. Pada pH 4-5
antosianin hampir tidak berwarna.
b. Oksigen
Semua senyawa asing yang membentuk sistem ikatan dengan antosianin
akan menyebabkan kerusakan warna. Adanya ion positif menyebabkan
antosianin rentan terhadap senyawa asing seperti sulfur dioksida atau
hydrogen peroksida. Antosianin dengan SO2 membentuk asam falven 4-
sulfonik yang tidak berwarna.
c. Suhu
Pemanasan dapat mempengaruhi stabilitas pigmen antosianin (James,
1995). Muchsin (2006) menjelaskan bahwa pengalengan jus buah pada suhu
100°C selama 12 menit dapat menyebabkan warna merah turun. Pemanasan
suhu 100°C menyebabkan pigmen antosianin berkurang sebesar 95,25%.
Suhu dapat merusak ion flavilium yang dapat menyebabkan hilangnya warna.
Suhu juga dapat menyebabkan reaksi maillard dimana residu gula dalam
antosianin dapat berpengaruh.
d. Ion Logam
Degradasi antosianin dapat pula disebabkan karena reaksi pengikatan
dengan ion logam, terutama pada konsentrat buah yang kaya akan
antosianin. Antosianin berikatan dengan ion timah membentuk warna biru.
Logam seperti Fe3+ dan Al3+ dapat membentuk kompleks logam antosianin
15
yang menyebabkan rusaknya warna pada beberapa produk pengalengan
buah seperti pear dan persik.
e. Enzim
Enzim antosianase yang terkandung dalam buah dan sayuran juga
menyebabkan kehilangan warna pada antosianin meskipun dapat diinaktifkan
dengan blanching. Sehubungan dengan aktivitasnya, terdapat dua kelompok
enzim yang menyebabkan kehilangan warna pada antosianin di dalam
jaringan tanaman yaitu glikosidase. Enzim glikosidase akan menghidrolisis
ikatan glikosida dari antosianin yang membebaskan gula dari aglikonnya.
Aglikon ini bersifat tidak stabil dan secara spontan berubah menjadi derivate
yang tidak berwarna (Arthey dan Arshurst, 2001) dan dengan asam amino
akan membentuk polimer berwarna cokelat.
f. Penyimpanan
Penyimpanan sangat berpengaruh terhadap stabilitas antosianin, kondisi
penyimpanan dalam kulkas menyebabkan antosianin masih dalam keadaan
baik hingga 106 hari, sedangkan kondisi yang buruk hanya dapat bertahan 19
hari (Budiarto, 1991). Sedangkan hasil yang disampaikan Muchsin (2007)
menunjukkan bahwa penyimpanan dalam lemari pendingin lebih bias
mengurangi kecepatan kerusakan antosianin dibandingkan dengan
penyimpanan dalam suhu ruang, dimana untuk penyimpanan hari ke-10 kadar
antosianin mengalami kerusakan sebesar 50,99% sedangkan pada kondisi
suhu ruang mengalami kerusakan sebesar 81,07% dari kadar antosianin awal.
g. Cahaya
Antosianin tidak stabil dalam larutan netral atau basa bahkan dalam larutan
asam warnanya dapat memudar perlahan-lahan akibat terkena cahaya.
Sehingga larutan sebaiknya disimpan di tempat gelap suhu dingin
(Harbone,1996). Secara umum dapat diketahui cahaya dapat mempercepat
degradasi antosianin. Efek tersebut dapat dilihat pada jus anggur dan red
wine. Pada wine metilasi diglikosida yang terasiliasi dan metilasi
monoglikosida.
2.8 Ekstraksi Antosianin
Menurut Hui (1992) ekstraksi adalah metode pemisahan di mana
komponen terlarut suatu campuran dipisahkan dari komponen yang tidak larut
dengan pelarut. Ekstraksi adalah pemisahan suatu zat dari campurannya dengan
16
pembagian sebuah zat terlarut antara dua pelarut yang tidak dapat tercampur
untuk mengambil zat terlarut tersebut dari satu pelarut ke pelarut yang lain.
Banyak inovasi teknologi yang telah dilakukan di dunia pangan, salah satunya
pada proses ekstraksi. Inovasi teknologi dibutuhkan dalam proses ekstraksi
adalah yang bertujuan untuk memperoleh hasil yang tinggi dengan waktu yang
relatif singkat. Untuk tujuan tersebut, metode yang dijadikan pilihan adalah
metode ultrasonik (Puspita, 2011).
Ekstraksi dapat dilakukan dengan berbagai cara. Ekstraksi menggunakan
pelarut didasarkan pada kelarutan komponen terhadap komponen lain dalam
campuran. Pelarut polar akan melarutkan solut yang polar dan pelarut non polar
akan melarutkan solut yang non polar atau disebut dengan “like disolve like”
(Suyitno, 1989).
Prinsip ekstraksi pelarut berbeda dengan ekstraksi mekanis. Ekstraksi
mekanis dilakukan berdasarkan perbedaan tekanan. Sedangkan ekstraksi
pelarut berdasarkan kelarutan komponen terhadap komponen lain dalam
campuran. Kelarutan suatu komponen tergantung derajat polaritas pelarut yang
ditentukan oleh konstanta dielektrikum (Sax dan Lewis, 1998).
Faktor-faktor yang mempengaruhi ekstraksi antara lain:
a. Ukuran Bahan
Bahan yang akan diekstrak sebaiknya memiliki luas permukaan yang
besar untuk mempermudah kontak antara bahan dengan pelarut sehingga
ekstraksi berlangsung lebih baik (Purgeslove et al., 1981). Kehalusan bubuk
yang sesuai akan menghasilkan ekstraksi yang sempurna dalam waktu yang
singkat, sebaliknya bahan yang digiling terlalu halus dapat menyebabkan
pemampatan (Guenther, 1987).
b. Lama dan Suhu Ekstraksi
Ekstraksi akan lebih cepat dilakukan pada suhu tinggi, tetapi dapat
mengakibatkan beberapa komponen akan mengalami kerusakan (Moestofa,
1981). Menurut Suryandari (1981), semakin lama waktu ekstraksi,
kesempatan untuk bersentuhan makin besar sehingga hasilnya juga
bertambah sampai titik jenuh larutan.
c. Jenis Pelarut
Menurut Somaatmadja (1981), ada dua pertimbangan utama dalam
memilih jenis pelarut, yaitu pelarut harus mempunyai daya pelarut yang
tinggi dan pelarut tidak berbahaya atau beracun. Guenther (1987)
17
menambahkan bahwa dalam pemilihan pelarut, pelarut harus melarutkan
ekstrak yang diinginkan saja, mempunyai kelarutan yang besar dan titik didih
antara zat yang diekstrak dan pelarutnya tidak boleh terlalu dekat. Pelarut
yang sering digunakan dalam proses ekstraksi adalah aseton, etilen klorida,
etanol, heksana, isopropyl alkohol dan metanol (Perry, 1984). Somaatmadja
(1981) menyatakan bahwa etilen klorida merupakan pelarut paling banyak
digunakan tetapi etanol merupakan pelarut paling banyak digunakan tetapi
etanol merupakan pelarut yang paling aman.
Antosianin adalah molekul polar yang bersifat larut dalam air dan lebih
stabil dalam pelarut polar daripada non polar. Antosianin dapat larut dalam asam
dan tidak stabil dalam larutan netral atau basa sehingga metode konvensional
ekstraksi antosianin biasanya menggunakan pelarut asam seperti HCl dalam
etanol (Vargas dan Lopez, 2003).
Budiarto (1991) mengekstrak antosianin dari kulit manggis menggunakan
pelarut air, methanol, dan etanol. Intensitas warna ekstrak dengan air lebih
rendah dibandingkan dengan etanol dan methanol. Hal ini diduga polaritas
senyawa tersebut lebih rendah dibandingkan dengan air sehingga pelarut yang
baik untuk ekstraksi adalah pelarut yang kurang polar. Ekstraksi dilakukan
dengan memakai etanol yang sudah ditambahkan HCl 1%.
Pada penelitian Saati (2002) untuk ekstraksi antosianin dari bunga pacar
air, pelarut yang paling baik digunakan adalah etanol 95%. Begitu juga dengan
penelitian Wijaya et al. (2001) tentang ekstraksi pigmen dari kulit buah rambutan.
Hal ini disebabkan tingkat kepolaran antosianin hampir sama dengan etanol 95%
sehingga dapat larut dengan baik pada etanol 95%.
2.9 Bahan Pengekstrak
Terdapat beberapa pertimbangan dalam memilih jenis pelarut dalam
proses ekstraksi. Menurut Guenther (1987), syarat pelarut yang digunakan
pertama harus bersifat selektif artinya pelarut harus dapat melarutkan semua
senyawa dengan cepat. Syarat kedua harus mempunyai titik didih yang cukup
rendah. Hal ini supaya pelarut mudah dapat diuapkan tanpa menggunakan suhu
tinggi, namun titik didih pelarut tidak boleh terlalu rendah karena akan
mengakibatkan kehilangan akibat penguapan. Syarat ketiga bersifat inert artinya
pelarut tidak bereaksi dengan komponen minyak. Syarat keempat carilah pelarut
yang murah dan mudah didapatkan.
18
Tabel 2. 5 Karakteristik Fisik dan Kimia Etanol
No Karakteristik1. Nama sistematik Etanol2. Nama lain Etil akohol, hidroksietan, EtOH3. Rumus kimia C2H6O4. Berat molekul 46,07 g/mol5. Kenampakan Cairan tidak berwarna6. Densitas dan fase 0,789 g/cm3, cairan7. Kelarutan dalam air Sangat larut8. Titik leleh -114,3°C (158,8 K)9. Titik didih 78,4°C (351,6 K)10. Keasaman (pKa) 15,9 (H+ dari grup OH)11. Viskositas 1200 cP pada 20°C12. Momen dipole 1,69 D (gas)
Tabel 2.6 merupakan tabel karakteristik fisik dan kimia dari etanol. Etilen
diklorida merupakan pelarut yang paling banyak digunakan tetapi etanol
merupakan pelarut yang paling aman (Arif, 2010). Etanol disebut juga etil alkohol
dengan rumus kimia C2H5OH atau CH3CH2OH dengan titik didihnya 78,4° C.
Etanol memiliki sifat tidak berwarna, volatil dan dapat bercampur dengan air
(Kartika et al., 1997). Ada 2 jenis etanol menurut Rama (2008), etanol sintetik
sering disebut metanol atau metil alkohol atau alkohol kayu, terbuat dari etilen,
salah satu derivat minyak bumi atau batu bara. Bahan ini diperoleh dari sintesis
kimia yang disebut hidrasi, sedangkan bioetanol direkayasa dari biomassa
(tanaman) melalui proses biologi (enzimatik dan fermentasi).
O‖
CH3CH2OH CH3 – C – H + 2HEtanol Asetaldehida
O O‖ ‖
CH3 – C – H + 2H CH3 – C – O- + 3HAsetaldehida Ion Asetat
Gambar 2. 4 Pengkonversian Etanol menjadi Asetaldehida dan Ion Asetat
Gambar 2.5 merupakan gambar pengkonversian etanol menjadi
asetaldehid kemudian menjadi ion asetat. Etanol bersifat toksik, tetapi tubuh
akan mengaturnya dengan segera. Lebih dari 90% etanol akan diproses oleh
liver. Di liver, enzim alkohol dehidrogenase mengkonversi etanol menjadi
asetaldehida yang masih bersifat toksik, tetapi asetaldehid akan rusak oleh
enzim aldehida dehidrogenase yang mengkonversi menjadi ion asetat. Menurut
FDA, kadar residu etanol sebagai pelarut dalam suatu ekstraksi adalah 50 ppm.
19
2.10 Ultrasonik
Ultrasonik adalah salah satu bentuk energi yang dihasilkan gelombang
suara dengan frekuensi yang sangat tinggi di atas deteksi telinga manusia, yaitu
antar 20 kHz-2 MHz (Wardiyati, 2004). Hal tersebut menyebabkan ultrasonik
dapat diaplikasikan pada rentang disiplin ilmu yang cukup luas. Pemanfaatan
ultrasonik salah satunya diterapkan pada bidang kimia contohnya pada proses
ekstraksi, kristalisasi, sintesis bahan dan pembuatan katalis (Wardiyati, 2004).
Ultasonik pada intensitas rendah dan frekuensi tinggi, biasanya diaplikasikan
untuk evaluasi non-dekstruktif, sebaliknya pada intensitas tinggi dan frekuensi
rendah merupakan jenis ultrasonik untuk aplikasi sonokimia (Thompson and
Doraiswamy, 1999).
Tenaga ultrasonik pada proses-proses kimia seperti ekstraksi tidak
secara langsung kontak dengan medan yang bersangkutan, akan tetapi melalui
perantara yang berupa cairan. Gelombang bunyi yang dihasilkan oleh tenaga
listrik (lewat transduser) diteruskan oleh media cair ke medan yang dituju melalui
fenomena kavitasi. Fenomena kavitasi merupakan terbentuknya gelembung kecil
pada media perantara yang lama kelamaan gelembung-gelembung akan
bertambah besar dan akhirnya akan pecah atau collapse dan mengeluarkan
tenaga besar, tenaga inilah yang digunakan untuk proses kimia. Fenomena
kavitasi dapat digambarkan seperti Gambar 2.6.
Gambar 2. 5 Fenomena Kavitasi (Wardiyati, 2004)
Terdapat efek ganda yang dihasilkan dari ekstraksi menggunakan
gelombang ultrasonik yaitu pengacuan dinding sel sehingga membebaskan
kandungan senyawa yang ada di dalamnya dan pemanasan lokal pada cairan
20
dan meningkatkan difusi ekstrak. Energi kinetik dilewatkan ke seluruh bagian
cairan, diikuti dengan munculnya gelembung kavitasi pada dinding atau
permukaan sehingga meningkatkan transfer massa antara permukaan padat-
cair. Efek mekanik yang ditimbulkan adalah meningkatkan penetrasi dari cairan
menuju dinding membran sel, mendukung pelepasan komponen sel dan
meningkatkan transfer massa (Keil, 2007). Liu (2010) menyatakan bahwa
kavitasi ultrasonik menghasilkan daya patah yang akan memecah dinding sel
secara mekanis dan meningkatkan transfer material.
Tabel 2. 6 Perbandingan Ekstraksi Metode Soxhletasi dan UAE
Parameter Soxhletasi UAEBerat bahan (gram) 5-10 5-30Volume pelarut (ml) >300 300
Suhu (°C) Titik didih RuangWaktu 16 jam 30 menit
Tekanan (atm) Ruang RuangKonsumsi energi relative 1 0,05Sumber: (Jain et al., 2009)
Ultrasonik merupakan alternatif metode ekstraksi yang efektif dan efisien,
rendah energi, waktu dan material serta rendemen yang dihasilkan lebih tinggi
(Vinatoru, 2001). Ultrasonik memiliki kemampuan yang lebih cepat dan lebih
sempurna dalam proses ekstraksi dibandingkan dengan metode maserasi dan
soxhlet. Menurut Brennan (2006), efek mekanis yang ditimbulkan oleh
gelombang ultrasonik dapat meningkatkan kemampuan penetrasi pelarut ke
dalam sel bahan sehingga meningkatkan jumlah komponen sel yang berdifusi ke
dalam pelarut.
Ultrasonik adalah gelombang akustik dengan frekuensi lebih besar dari
16-20 kHz (Suslick, 1988). Mcclemen (1995) menyatakan bahwa salah satu sifat
dari ultrasonik adalah non-destructive dan non-invasive, sehingga dengan mudah
diadaptasikan ke berbagai aplikasi gelombang ultrasonik dapat merambat dalam
medium padat, cair, dan gas. Cameron (2006) mengungkapan bahwa
pengembangan proses ekstraksi untuk mendapat hasil yang lebih baik dan waktu
yang lebih singkat terus dilakukan. Salah satunya adalah dengan metode
ultrasonik. Penggunaan ultrasonik pada proses ekstraksi dengan menggunakan
pelarut organik dapat lebih cepat, getaran ultrasonik dapat memecahkan dinding
sel sehingga kandungan didalamnya dapat keluar dengan cepat.
21
Gelombang ultrasonik diklasifikasikan menjadi dua definisi yang
dibedakan atas besarnya frekuensi dan aplikasinya (Mason, 1990), yaitu:
1. Frekuensi tinggi atau diagnostic ultrasound (2-10 MHz),
2. Frekuensi rendah atau power ultrasound (20-100 MHz).
Diagnostic ultrasound atau gelombang dengan amplitudo rendah
digunakan untuk mengukur kecepatan dan koefisien penyerapan gelombang
dalam medium dengan jarak 2-10 MHz. Biasanya digunakan untuk aplikasi
medis, analisa kimia, dan studi fenomena relaksasi. Sedangkan power
ultrasound melibatkan gelombang energi yang tinggi (frekuensi rendah),
diaplikasikan untuk pembersihan (cleaning), penyatuan plastik, dan untuk
mengamati pengaruh reaktivitas kimia.
Kecepatan gelombang suara berbeda dengan kecepatan gelombang
elektromagnetik. Perbedaan tersebut disebabkan gelombang elektromagnetik
dapat merambat tanpa medium dan mempunyai kecepatan konstan. Kecepatan
suara dipengaruhi oleh parameter karakteristik medium yang dilewati seperti
suhu, komposisi materi, tekanan, volume, dan kecepatan. Karena kecepatan
suara lebih lambat daripada gelombang elektromagnetik, maka pada frekuensi
yang sama panjang gelombang suara lebih pendek (Anonymous, 2005)
Gelombang suara yang merambat melalui cairan juga menyebabkan
terjadinya perpindahan energi. Perpindahan ini disebabkan oleh tubrukan elastik
antar molekul dengan molekul lain, sehingga meningkatkan intensitas
perpindahan energinya. Pada kenyataannya kehilangan energi terjadi karena
pengaruh (Mason, 1990):
a. Kekentalan atau Viskositas (gerak bergesekan satu molekul relatif dengan
yang lain dalam cairan).
b. Panas (transfer panas dari bagian yang tinggi ke bagian yang rendah).
Hal ini menyebabkan energi gelombang akan menjadi lemah (attenuasi)
saat melalui medium. Koefisien penyerapan tidak hanya tergantung pada fluida
dan suhu, tetapi tergantung pada frekuensi gelombang.
Ketika gelombang merambat ke dalam medium cair menghasilkan
tekanan bolak balik dan siklus ekspansi. Selain siklus ekspansi, gelombang
ultrasonik dengan intensitas tinggi menyebabkan timbulnya gelembung-
gelembung kecil dalam cairan.Ketika gelembung mencapai volume yang tidak
cukup lagi menyerap energi, gelembung tersebut pecah, fenomena ini disebut
22
sebagai “kavitasi”.Intensitas tinggi radiasi akustik yang merambat melalui
medium menyebabkan beberapa perubahan (Kuldiloke, 2002).
2.10.1 Ultrasonic Bath
Menurut Gogate et al. (2006), konfigurasi reaktor gelombang ultarsonik
dikenal beberapa macam diantaranya adalah sistem tanduk getar, sistem bath,
sistem rambatan frekuensi ganda, sistem rambatan frekuensi triple, sistem batch
dengan getaran longitudinal, homogenozer tekanan tinggi, homogenizer
kecepatan tinggi, dan plat oriffice.
Ultrasonik bath termasuk ke dalam jenis power ultrasound, yaitu memiliki
gelombang yang ditransmisikan berkisar 20-100 kHz. Prinsip kerja dari alat
ultrasonik bath ini adalah pengkonversian energi elektrik menjadi gelombang
ultrasonik yang disebut dengan ultasonic tranducers yang terikat pada dasar
tangki air alat ultrasonik (Anonymous, 2011)
Tranducer selalu berada pada bagian dasar tangki air yang dioperasikan
berkisar antara 40 kHz. Cairan atau bahan yang dimasukkan dalam tangki
ultrasonik harus diatur agar seluruh bagian bahan terkena gelombang ultrasonik
sehingga ekstraksinya maksimal (Brennan, 2006). Adapun gambar ultrasonik
bath dapat dilihat pada Gambar 2.7.
Gambar 2. 6 Ultrasonik Bath (Anonymous, 2011)
2.10.2 Keuntungan Menggunakan Gelombang Ultrasonik
Beberapa keuntungn dari metode Ultrasonik adalah mempermudah
proses ekstraksi, transfer massa, distrupsi sel, meningkatkan efek penetrasi.
Penelitian Mason et al. (1996) menyebutkan pada proses ekstraksi senyawa dari
adas, hops, marigold, daun mint dan lemon dapat meningkatkan 20-40% hasil
23
ekstraksi menggunakan metode ultrasonik dibandingkan dengan metode
ekstraksi konvensional. Menurut penelitian Cameron and Wang (2006) tentang
ekstraksi pati jagung, menyebutkan rendemen pati jagung yang didapat dari
proses ultrasonik selama 2 menit adalah sekitar 55,2-67,8% hampir sama
dengan rendemen yang didapat dari pemanasan dengan air selama 1 jam yaitu
53,4%. Penelitian lain tentang ekstraksi pati beras oleh Wang et al., (2004)
menyebutkan kombinasi 0,5% sodium dedocyl sulface dengan ultrasonik dapat
meningkatkan rendemennya hingga 84,9% dengan residu protein yang rendah.
Kuldiloke (2002) menyebutkan salah satu manfaat metode ultrasonik
adalah untuk mempercepat proses ekstraksi. Dengan penggunaan ultrasonik
proses ekstraksi senyawa organik pada tanaman dan biji-bijian dengan
menggunakan pelarut organik dapat berlangsung lebih cepat. Efek mekanik dari
metode ultrasonik adalah meningkatkan penetrasi pelarut ke dalam sel bahan
serta meningkatkan transfer massa. Dinding sel dari bahan dipecah dengan
getaran ultrasonik sehingga kandungan yang ada didalamnya dapat keluar
dengan mudah. Metode ini telah digunakan pada proses ekstraksi gula bit
(Mason et al., 1996).
Penelitian Linda et al. (2002) menyebutkan bahwa dengan viskositas
yang tinggi pada konsentrasi rendah yaitu 1% menunjukkan perubahan
viskositas yang drastis setelah menggunakan metode ultrasonik. Perubahan
viskositas yang sama ditunjukkan pula pada beberapa jenis pati. Penurunan
viskositas suatu larutan juga berpengaruh pada penurunan berat molekulnya.
Kecepatan penurunan berat molekul suspensi pati jagung berkurang secara
cepat setelah 30 menit, setelah itu penurunan berat molekul berjalan lebih lambat
setelah 60 menit dan lebih bertambah lambat setelah 120 menit.
Selama ini gelombang ultrasonik telah diaplikasikan di berbagai
bidang.Diantaranya adalah di bidang biologi, biokimia, industri, kedokteran,
plastik, dan polimer. Adapun beberapa aplikasi dari penggunaan gelombang
ultrasonik tersebut dapat dilihat pada Tabel 2.8 berikut ini.
24
Tabel 2. 7 Aplikasi Ultarsonik pada Berbagai Bidang
No Bidang Aplikasi1 Biologi, biokimia Aplikasi ultrasonik digunakan untuk memecah dinding
sel biologis. Dinding sel dari bahan dipecah dengangetaran ultrasonik keluar dengan mudah.
2 Industri Dapat digunakan untuk membersihkan (sterilisasi alat) diindustri. Alat-alat teknis industri dapat dibersihkandengan cara mencelupkan alat dalam ultrasonik bath.
3 Kedokteran Aplikasi utama ultrasonik adalah dalam bidang obat-obatan yaitu ultrasonik pada frekuensi 2-10 MHz,terutama dalam ilmu kebidanan. Ultrasonik telah banyakdigunakan pada fisioterapi sebagai bantuan dalampemijatan dan terutama untuk urat tegang.
4 Plastik danpolimer
Pengelasan termoplastik mencapai tingkat efisiendengan menggunakan metode ultarsonik. Hal ini jugadimungkinkan untuk melalui radical polymerization danmenurunkan bentuk polimer.
Sumber: Mason (1990)
2.11 Pengukuran Aktivitas Antioksidan
Stabilitas antioksidan dapat diartikan sebagai kemampuan lemak, minyak
atau makanan berlemak dalam mempertahankan kesegaran rasa dan baunya
selama penyimpanan dan penggunaannya. Stabilitas ini berkaitan dengan
komposisi bagian lipid, sifat, dan derajat perlakuan terhadap sistem, ada tidaknya
prooksidan atau antioksidan dan efektifitas kemasan. Lemak dengan derajat
ketidakjenuhan tinggi biasanya tidak stabil (Tranggono et al., 1990).
Berbagai metode pengujian aktivitas antioksidan telah digunakan untuk
meneliti dan membandingkan aktivitas antioksidan dalam makanan. Aktivitas
antioksidan menggunakan metode penangkapan radikal bebas dapat dilakukan
dengan cepat, mudah, dan sederhana. Metode DPPH (1,1-Diphenyl-2-
Picrylhydrazyl) digunakan untuk mengetahui kemampuan zat antioksidan untuk
menangkap radikal bebas (Pokorny, 2001). Adapun gambar struktur DPPH
adalah sebagai berikut.
Gambar 2. 7 Struktur Kimia DPPH (Pokorny, 2001)
25
2,2-Diphenyl-2-1-picrylhydrazyl (DPPH) dan dikenal sebagai 1,1-
Diphenyl-2-picrylhydrazyl atau α,α-Dyphenyl-β-picrylhydrazyl merupakan radikal
bebas yang biasa digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan. Reduksi
terhadap DPPH oleh antioksidan akan menghasilkan penurunan absorbansi
pada panjang gelombang 515-520 nm. Tingkat kehilangan warna dari larutan
menunjukkan tingkat efisiensi penangkapan radikal bebas oleh substansi yang
ditambahkan (Martinez et al., 2002).
Menurut Prakash et al. (2001), elektron yang tidak berpasangan pada
DPPH memiliki kemampuan penyerapan yang kuat pada panjang gelombang
517 nm dengan warna ungu. Perubahan warna ungu menjadi kuning seiring
dengan menurunnya absorbtivitas molar dari radikal DPPH, karena elektron yang
tidak berpasangan dengan adanya pemberian atom hidrogen dari antioksidan
membentuk DPPH-H tereduksi. Penurunan warna secara stoikiometri
berdasarkan jumlah elektron yang tertangkap. Aktivitas penangkapan radikal
bebas ditunjukkan dengan berkurangnya presentase warna ungu dari DPPH.
Mekanisme reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan sebagai
berikut:
DPPH° + AH DPPH – H + A°
Reaksi yang cepat dari radikal DPPH terjadi dengan beberapa fenol
misalnya α-tokoferol, akan tetapi reaksi sekunder berjalan lambat. Hal ini
menyebabkan penurunan absorbansi yang progesif sehingga keadaan steady
state tidak akan dicapai untuk beberapa jam. Kebanyakan penelitian yang
menggunakan metode DPPH melaporkan aktivitas antioksidannya setelah waktu
reaksi 15 atau 30 menit (Pokorny, 2001).
Aktivitas antioksidan bahan pangan dapat berbeda bila diuji dengan
metode yang berbeda. Tidak seperti DPPH yang mengukur aktivitas total
antioksidan, beberapa metode lain terbatas mengukur komponen yang larut pada
pelarut yang digunakan dalam analisa. Metode DPPH mengukur semua
komponen antioksidan, baik larut lemak ataupun air (Prakash et al., 2001).
26
III. METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Pengolahan dan Rekayasa
Proses Pangan dan Hasil Pertanian THP FTP UB, Laboratorium Kimia dan
Biokimia Pangan dan Hasil Pertanian THP FTP UB, dan Laboratorium Kimia
Organik Fakultas MIPA Universitas Brawijaya Malang, Jawa Timur, pada bulan
Maret 2015 sampai Juni 2015.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian
3.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat untuk pembuatan
tepung ampas kecap, alat untuk ekstraksi dan alat untuk analisa ekstrak. Alat
untuk pembuatan tepung ampas kecap meliputi pengering kabinet (cabinet
dryer), blender kering, dan ayakan 80 mesh.
Alat yang digunakan dalam ekstraksi meliputi ultrasonik bath, pengering
vakum, rotary evaporator, freezer, beaker glass, kertas saring halus, timbangan
analitik, dan botol gelap.
Alat yang digunakan dalam analisis ekstrak meliputi beaker glass,
timbangan analitik, spatula besi, rak tabung kayu, aluminium foil, dan kuvet.
3.2.2 BahanBahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ampas kecap yang
didapat dari hasil samping produksi kecap di PT. Aneka Food Tatarasa Industri,
Probolinggo, etanol 96%, NaNO3, Kuersetin, AlCl3, NaNO2, NaOH 1M, DPPH.
3.3 Metode Penelitian
3.3.1 Rancangan Percobaan
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah percobaan
laboratorium dengan menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan
dua faktor yaitu rasio bahan dengan pelarut dan lama waktu ekstraksi sebanyak
tiga kali ulangan.
27
- Faktor 1 rasio bahan dengan pelarut :
1:3 b/v (R1)
1:5 b/v (R2)
1:7 b/v (R3)
- Faktor 2 lama waktu ekstraksi:
15 menit (T1)
20 menit (T2)
25 menit (T3)
15 menit (T1) 20 menit (T2) 25 menit (T3)
1:3 b/v (R1) R1T1 R1T2 R1T3
1:5 b/v (R2) R2T1 R2T2 R2T3
1:7 b/v (R3) R3T1 R3T2 R3T3
3.4 Pelaksanaan Penelitian
a. Prosedur Pembuatan Tepung Ampas Kecap- Ampas kecap hasil pemisahan filtrat dan ampas pada proses
pembuatan kecap dikumpulkan
- Ampas kecap yang telah terkumpul kemudian dicuci dengan air
mengalir sebanyak 5 kali
- Ampas kecap kemudian ditiriskan
- Ampas kecap dikeringkan dalam pengering kabinet selama 8 jam ± 5
menit dengan suhu 50 ± 2 °C
- Ampas kecap yang telah kering kemudian dihaluskan menggunakan
blender kering
- Ampas kecap yang telah halus kemudian diayak menggunakan
ayakan 80 mesh hingga menjadi tepung ampas kecap.
b. Prosedur Ekstraksi Tepung Ampas Kecap Metode Ultrasonic Bath- Tepung ampas kecap ditimbang sebanyak 20 gram
- Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan ditambahkan pelarut etanol
96% dengan rasio bahan:pelarut 1:3 (b/v), 1:5 (b/v), dan 1:7 (b/v)
WaktuEkstraksiRasio
Bahan:Pelarut
28
- Setelah itu diekstrak menggunakan ultrasonic bath 50 kHz dengan
variasi lama waktu 15 menit, 20 menit, dan 25 menit
- Hasil ekstraksi kemudian dilakukan penyaringan menggunakan
penyaring vakum sehingga diperoleh filtrat yang bebas ampas
- Filtrat diuapkan dengan rotary evaporator suhu 40°C sampai
diperoleh volume ekstrak yang diinginkan
- Hasil ekstraksi disemprot gas nitrogen sampai sisa pelarut habis.
c. Analisa Profil Senyawa Bioaktif Ekstrak Ampas Kecap- Rendemen (Yuwono dan Susanto, 1998)
- Aktivitas Antioksidan metode DPPH (Tang et al., 2002)
- Total Antosianin (Giusti dan Wrolstad, 2000)
- Total Flavonoid (Zhinshen et al., 1999)
3.5 Analisa Data
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan 2
faktor. Faktor yang pertama yaitu rasio bahan:pelarut 1:3 (b/v), 1:5 (b/v), dan 1:7
(b/v). Faktor yang kedua yaitu lama waktu ekstraksi 15 menit, 20 menit, dan 25
menit. Dari kedua faktor tersebut kemudian dilakukan kombinasi dan didapatkan
9 satuan percobaan yang akan diulang sebanyak 3 kali sehingga didapatkan
data sebanyak 27 satuan percobaan. Data hasil penelitian yang diperoleh
kemudian dianalisa dengan analisa keragaman ANOVA (Analysis of Varians)
untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan perlakuan pada tingkat α=0,05.
Apabila terdapat beda nyata pada interaksi antar perlakuan dilakukan uji lanjut
dengan DMRT (Duncan’s Multiple Range Test) pada tingkat α yang sama. Dan
apabila tidak terdapat interaksi maka dilakukan uji beda BNT dengan taraf nyata
5%. Sedangkan untuk pemilihan perlakuan terbaik dengan metode Zeleny.
29
3.6 Diagram Alir Penelitian
3.6.1 Proses Pembuatan Tepung Ampas Kecap
Dicuci dengan air mengalir (5x)
Ditiriskan
Dikeringkan di pengering kabinet
(Suhu 50 ± 2°C, 8 Jam ± 5 menit)
Dihaluskan dengan blender
Diayak dengan ayakan 80 mesh
Gambar 3. 1 Proses Pembuatan Tepung Ampas Kecap
Ampas Kecap
Tepung Ampas Kecap
Analisa :
- Kadar air- Aktivitas
Antioksidan- Total
Flavonoid- Total
Antosianin
30
3.6.2 Proses Ekstraksi Tepung Ampas Kecap
Ekstraksi menggunakan Ultrasonic Bath
dengan frekuensi 50 kHz
Disaring menggunakan penyaring vakum
Filtrat
Dievaporasi menggunakan Rotary Evaporator
(Suhu 40°C, 200 mBar)
Gambar 3. 2 Proses Ekstraksi Tepung Ampas Kecap
20 gram Tepung AmpasKecap
Faktor I:Tepung AmpasKecap : Etanol 96%1:3 b/v1:5 b/v1:7 b/v
Faktor II:Lama WaktuEkstraksi
15 menit20 menit25 menit
Ekstrak Ampas Kecap
Analisa:- Rendemen- Aktivitas Antioksidan- Total Flavonoid-Total Antosianin
31
IV.HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Karakteristik Bahan Baku
Bahan baku utama yang akan digunakan dalam proses ekstraksi adalah
ampas kecap. Ampas kecap diperoleh dari hasil samping pengolahan kecap di
PT. Aneka Food Tatarasa Industri, Probolinggo, Jawa Timur. Ampas kecap yang
diperoleh kemudian dicuci hingga sebanyak 5 kali pencucian untuk mengurangi
kadar garam yang tersisa dari proses moromi dan menghilangkan kotoran-
kotoran yang ada. Kemudian ampas kecap yang telah bersih dilakukan penirisan
dan dilanjutkan untuk proses pengeringan dalam cabinet dryer selama 8 jam
dengan suhu 50°C. Ampas kecap yang telah kering kemudian dihaluskan
menggunakan blender dan diayak menggunakan ayakan 80 mesh sehingga
menjadi tepung ampas kecap yang kemudian digunakan untuk analisa bahan
baku sebelum proses ekstraksi dilakukan. Parameter bahan baku yang dianalisa
meliputi kadar air, aktivitas antioksidan (% inhibibisi), total flavonoid, dan total
antosianin. Data hasil analisa disajikan pada Tabel 4.1.
Tabel 4. 1 Hasil Analisa Bahan Baku Tepung Ampas Kecap
Parameter Tepung Ampas KecapKadar Air (%) 9,256Aktivitas Antioksidan (% Inhibibisi) 18,511Total Flavonoid (mg QE/g sampel) 0,805Total Antosianin (mg/g sampel) 0,098
Berdasarkan Tabel 4.1 dapat diketahui bahwa kadar air tepung ampas
kecap hasil analisa yaitu sebesar 9,25 %. Pengujian kadar air pada bahan baku
yaitu tepung ampas kecap bertujuan sebagai standar untuk dapat
membandingkan dengan hasil analisa senyawa bioaktif ekstrak ampas kecap
yang didapat.
Hasil analisa aktivitas antioksidan menunjukkan bahwa tepung ampas
kecap memiliki aktivitas antioksidan sebesar 18,511%. Sedangkan hasil analisa
total flavonoid dan total antosianin tepung ampas kecap berturut-turut yaitu
sebesar 805,695 mg QE/Kg dan 98,84 mg/Kg sampel. Menurut Sitorus (1986)
ampas kecap merupakan limbah dari proses pembuatan kecap yang berbahan
dasar kedelai hitam dan memiliki kandungan protein cukup tinggi dan palatabel.
32
Oleh karena ampas kecap berasal dari kedelai hitam, sehingga diduga masih
mengandung beberapa senyawa bioaktif yang sebelumnya terdapat dalam
kedelai hitam.
Xu dan Chang (2007) menyebutkan bahwa kedelai hitam mempunyai
kandungan fenolik, tanin, antosianin, dan isoflavon serta aktivitas antioksidan
lebih tinggi dibanding kedelai kuning. Kedelai hitam kandungan flavonoidnya 6
kali lebih banyak dibanding kedelai kuning, kandungan total flavonoid kedelai
kuning dan hitam berturut-turut 0,41 dan 2,57 mg ekuivalen dengan katekin per
gram, dan aktivitas antioksidan 15 kali lebih tinggi (DPPH scavenging capacity
kedelai kuning dan hitam berturut-turut yaitu 1,50 dan 17,58 μmol ekuivalen
Trolox per gram) (Xu dan Chang, 2007). Sementara itu, menurut Astadi et al.
(2009) kulit kedelai hitam varietas Mallika memiliki kandungan antosianin 1,36
g/100g dan senyawa fenolik 6,46 g/100 g. Kandungan senyawa bioaktif pada
tepung ampas kecap memiliki perbedaan dengan kandungan senyawa bioaktif
pada kedelai hitam. Perbedaan tersebut dikarenakan karena ampas kecap telah
mengalami proses pengolahan seperti proses fermentasi dan kemudian
dilakukan pressing untuk memisahkan filtrat yang digunakan untuk diproses lebih
lanjut menjadi kecap dan ampas kecap yang selama ini pemanfaatannya hanya
sebatas pakan ternak atau dibuang sebagai limbah, sehingga kandungan
senyawa bioaktifnya banyak yang terikut dalam filtrat. Meskipun demikian ampas
kecap diduga masih mengandung senyawa bioaktif dikarenakan sebelumnya
telah mengalami fermentasi sehingga kandungan senyawa bioaktifnya meningkat
dibanding dengan kedelai hitam yang belum mengalami proses pengolahan. Hal
tersebut sesuai dengan pernyataan Matsuda (1998) yang menerangkan oleh
karena asal ampas kecap adalah kedelai hitam, maka kandungan asam amino,
asam organik, isoflavon seperti daidzein dan genistein diduga masih ada
mengingat juga ampas kecap sebelumnya telah mengalami fermentasi.
4.2 Karakteristik Fisik Ekstrak Ampas Kecap
4.2.1 Rendemen
Hasil analisa rerata rendemen ekstrak ampas kecap akibat pengaruh
perlakuan rasio bahan:pelarut dan waktu ekstraksi berkisar antara 11,31%
sampai 17,04%. Grafik rerata rendemen ekstrak ampas kecap dapat dilihat pada
Gambar 4.1.
33
Gambar 4. 1 Grafik Rerata Rendemen Ekstrak Ampas Kecap Akibat PengaruhPerlakuan Rasio Bahan:Pelarut dan Waktu Ekstraksi
Gambar 4.1 menunjukkan bahwa semakin lama waktu ekstraksi hasil
rerata rendemen semakin meningkat, sedangkan rasio bahan:pelarut yang
semakin besar juga akan menghasilkan rerata rendemen yang semakin besar.
Rerata rendemen tertinggi diperoleh dari perlakuan rasio bahan:pelarut 1:7 dan
waktu ekstraksi 25 menit (b.v), sedangkan rerata rendemen terendah diperoleh
dari perlakuan rasio bahan:pelarut 1:3 dan waktu ekstraksi 15 menit.
Hasil analisa ragam terhadap rerata rendemen (Lampiran 4)
menunjukkan bahwa perlakuan rasio bahan:pelarut dan waktu ekstraksi
memberikan pengaruh nyata (α=0,05) terhadap rendemen ekstrak ampas kecap,
namun tidak terdapat interaksi antara kedua perlakuan tersebut. Nilai rerata
rendemen ekstrak ampas kecap akibat pengaruh perlakuan yang diberikan
disajikan pada Tabel 4.2 dan Tabel 4.3.
Tabel 4. 2 Rerata Rendemen Ekstrak Ampas Kecap Akibat Pengaruh PerlakuanRasio Bahan:Pelarut
Rasio Bahan:Pelarut Rerata (%) BNT (95%)
1:3 12,28 a
1,121:5 15,21 b
1:7 16,39 c
Keterangan: - Data merupakan rerata 3 ulangan- Angka yang didampingi huruf yang berbeda menunjukkan
berbeda nyata (α=0,05)
11,31 11,9413,6114,41 14,97
16,2615,95 16,19 17,04
0,002,004,006,008,00
10,0012,0014,0016,0018,0020,00
15 20 25
Rer
ata
Ren
dem
en (%
)
Waktu Ekstraksi (menit)
RasioBahan:Pelarut1:3
RasioBahan:Pelarut1:5
RasioBahan:Pelarut1:7
34
Dari Tabel 4.2 diketahui bahwa semakin tinggi rasio bahan:pelarut maka
rendemen ekstrak ampas kecap yang dihasilkan cenderung semakin meningkat.
Rendemen tertinggi adalah adalah rasio bahan:pelarut 1:7 yaitu sebesar 16,39%,
sedangkan rendemen terendah adalah perlakuan rasio bahan:pelarut 1:3 yaitu
sebesar 12,28%. Rendemen ekstrak tersebut sudah tergolong tinggi karena
rendemen yang didapat hampir tidak ada zat pengotor lain seperti sisa air atau
sisa pelarut yang masih tertinggal dalam ekstrak. Hal tersebut dikarenakan
proses ekstraksi menggunakan pelarut 96% dimana volatilitas etanol 96% sangat
tinggi sehingga dapat dengan mudah menguap saat proses evaporasi
berlangsung, dengan demikian dapat diduga bahwa kecil kemungkinan adanya
sisa pelarut yang masih tersisa dalam ekstrak ampas kecap tersebut. Selain itu,
ekstrak ampas kecap juga diduga hampir tidak memiliki kandungan air, hal
tersebut dikarenakan penggunaan etanol 96% yang hampir mendekati absolut
sehingga air yang terkandung dalam pelarut sangat sedikit dan sudah terikut
menguap saat proses evaporasi berlangsung. Jika pun masih ada kandungan air
dalam ekstrak ampas kecap di duga sangat sedikit dan hampir tidak memberikan
pengaruh yang nyata antar perlakuan.
Semakin banyak jumlah pelarut yang digunakan akan menyebabkan
kontak bahan dengan pelarut juga semakin besar sehingga berpotensi
memaksimalkan proses ekstraksi dan diperoleh rendemen ekstrak ampas kecap
yang lebih besar. Menurut Susanto (1999), jumlah pelarut berpengaruh terhadap
efisiensi ekstraksi tetapi jumlah berlebihan tidak akan mengekstrak lebih banyak.
Efek suhu pada sampel akan dipengaruhi oleh massa larutan yang diekstrak.
Semakin banyak massa larutan, maka kenaikan suhunya semakin kecil dengan
energi panas yang sama. Adanya kenaikan suhu yang lebih kecil tersebut, maka
kemungkinan terjadinya penguapan pelarut semakin kecil pula, sehingga
semakin banyak pelarut yang digunakan akan menghasilkan rendemen hasil
ekstrak semakin tinggi.
Zhang et al. (2009) menyebutkan bahwa kenaikan rendemen hasil
ekstraksi di setiap perlakuan bahan:pelarut disebabkan karena kontak antara
matriks bahan dan pelarut akan lebih besar ketika volume pelarut yang lebih
besar digunakan, sehingga memudahkan pelarut untuk melakukan penetrasi ke
dalam sel matriks bahan dan melarutkan senyawa target. Namun penggunaan
volume pelarut yang berlebihan perlu dihindari karena menyebabkan
terhambatnya transfer energi gelombang ultrasonik akibat diserap oleh pelarut
35
sebelum sampai ke matriks bahan (Chan et al., 2011). Dari literatur tersebut
dapat dikatakan bahwa perlakuan rasio bahan:pelarut 1:7 adalah rasio ekstraksi
yang paling maksimal. Sedangkan pada rasio bahan:pelarut 1:3 yang memiliki
volume pelarut lebih sedikit menyebabkan kontak antara bahan dengan pelarut
belum maksimal sehingga rendemen ekstrak yang dihasilkan rendah.
Tabel 4. 3 Rerata Rendemen Ekstrak Ampas Kecap Akibat Pengaruh PerlakuanWaktu Ekstraksi
Waktu Ekstraksi Rerata (%) BNT 95%
15 Menit 13,89 a
1,12220 Menit 14,36 a
25 Menit 15,63 b
Keterangan: - Data merupakan rerata 3 ulangan
- Angka yang didampingi huruf yang tidak sama menunjukkan
berbeda nyata (α=0,05)
Dari Tabel 4.3 dapat diketahui bahwa semakin lama waktu ekstraksi
maka rendemen ekstrak yang dihasilkan akan semakin meningkat. Rendemen
ekstrak tertinggi adalah waktu ekstraksi 25 menit yaitu sebesar 15,63%.
Sedangkan rendemen ekstrak terendah adalah waktu ekstraksi 15 menit yaitu
sebesar 13,89%. Menurut Mandal et al. (2007) secara umum semakin lama
waktu ekstraksi pada ultrasonic sistem bath kuantitas bahan yang terekstrak juga
akan semakin meningkat. Routray dan Orsat (2012) menyebutkan bahwa
umumnya rendemen hasil ekstraksi berbanding lurus dengan waktu iradiasi
dengan gelombang ultrasonik sampai taraf tertentu. Fenomena ini terjadi karena
difusi senyawa target dari matriks bahan ke dalam pelarut akan meningkat
dengan semakin meningkatnya waktu ekstraksi hingga level tertentu.
Beberapa keuntungan dari metode ultrasonik dibandingkan dengan
metode lain adalah mempermudah proses ekstraksi, transfer massa, distrupsi
sel, dan meningkatkan efek penetrasi. Menurut penelitian Cameron dan Wang
(2006) tentang ekstraksi pati jagung, menyebutkan bahwa rendemen pati jagung
yang didapat dari proses ultrasonik selama 2 menit hampir sama dengan
rendemen yang didapat dari pemanasan dengan air selama 1 jam.
36
4.3 Karakteristik Kimia Ekstrak Ampas Kecap
4.3.1 Total Flavonoid
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa rerata total flavonoid ekstrak
ampas kecap akibat pengaruh rasio bahan:pelarut dan waktu ekstraksi berkisar
antara 0,450 mg QE/Kg sampai 5,373 mg QE/Kg. Grafik rerata total flavonoid
ekstrak ampas kecap akibat pengaruh rasio bahan:pelarut dan waktu eksraksti
disajikan pada Gambar 4.2.
Gambar 4. 2 Grafik Rerata Total Flavonoid Ekstrak Ampas Kecap Akibat PengaruhPerlakuan Rasio Bahan:Pelarut dan Waktu Ekstraksi
Gambar 4.2 menunjukkan bahwa rasio bahan:pelarut yang semakin
banyak dan waktu ekstraksi yang semakin lama mengakibatkan total flavonoid
ekstrak ampas kecap yang dihasilkan semakin tinggi. Rerata total flavonoid
ekstrak ampas yang yang tertinggi ditunjukkan pada perlakuan rasio
bahan:pelarut 1:7 dan waktu ekstraksi 25 menit yaitu sebesar 5,373 mgQE/Kg.
Pelarut yang semakin banyak dengan jumlah zat terlarut sama akan
memberikan kesempatan lebih banyak kontak langsung antara pelarut dan
bahan. Suryandari (1981) menyatakan bahwa semakin besar kemampuan
pelarut untuk melarutkan bahan sehingga semakin banyak komponen bahan
yang dapat terekstrak oleh pelarut. Komponen bahan yang terekstrak akan terus
meningkat hingga larutan menjadi jenuh, setelah melewati titik jenuh larutan tidak
akan terjadi peningkatan hasil ekstraksi dengan penambahan pelarut. Hal
tersebut juga dapat dipengaruhi dengan adanya gelombang ultrasonik yang
membantu perusakan pada dinding sel sehingga senyawa flavonoid dalam
ampas kecap akan keluar secara optimal.
0,548 0,5931,063
0,450
1,193
2,749
0,777
2,952
5,373
0,000
1,000
2,000
3,000
4,000
5,000
6,000
15 20 25Rer
ata
Tota
l Fla
vono
id (m
gQ
E/g
sam
pel)
Waktu (Menit)
1:03
1:05
1:07
RasioBahan:Pelarut
37
Navas et al. (2012) menyebutkan bahwa waktu ekstraksi yang semakin
lama akan memberikan kesempatan bahan terpapar oleh gelombang ultrasonik
juga semakin lama sehingga dapat mengakibatkan dinding sel pada bahan
pecah dan mengeluarkan zat terlarut (solute) ke dalam pelarut (solvent). Dinding
sel dari bahan dipecah dengan getaran ultrasonik sehingga kandungan yang ada
didalamnya dapat keluar dengan mudah.
Menurut Keil (2007) gelombang ultrasonik terbentuk dari pembangkitan
ultrason secara lokal dari kavitasi mikro pada sekeliling bahan yang akan
diekstraksi sehingga terjadi pemanasan pada bahan tersebut, sehingga akan
melepaskan senyawa ekstrak. Terdapat efek ganda yang dihasilkan, yaitu
pengacuan dinding sel sehingga membebaskan kandungan senyawa yang ada
di dalamnya dan pemanasan lokal pada cairan dan meningkatkan difusi ekstrak.
Kavitasi terjadi akibat gelombang ultrasonik yang dirambatkan pada cairan
sehingga menimbulkan suara, dimana tekanan cairan akan meningkat saat
amplitude positif dirambatkan dan tekanan menurun pada saat amplitude negatif.
Perubahan tekanan secara stimulan dengan frekuensi tinggi dan dinding
ultrasonik direaksi lamba oleh cairan sehingga timbul gelombang mikro.
Gelembung mikro tersebut mengembang dan mengempis tidak stabil dengan laju
pengembangan lebih besar dibandingkan dengan laju pengempisan sehingga
diameter gelembung tumbuh membesar hingga pecah dan merusak dinding sel
(Susilo, 2007). Namun waktu paparan yang terlalu lama harus dihindari agar
mencegah terjadinya degradasi senyawa hasil ekstraksi (Chan et al., 2011).
Tabel 4.4 merupakan Tabel Rerata total flavonoid ekstrak ampas kecap
akibat perlakuan rasio bahan:pelarut dan waktu ekstraksi. Hasil analisa ragam
(Lampiran 5) menunjukkan bahwa perlakuan rasio bahan:pelarut dan waktu
ekstraksi memberikan pengaruh yang nyata (α=0,05) terhadap total flavonoid
ekstrak ampas kecap yang dihasilkan. Interaksi antara kedua perlakuan tersebut
juga memberikan pengaruh nyata (α=0,05).
38
Tabel 4. 4 Rerata Total Flavonoid Ekstrak Ampas Kecap Akibat Perlakuan RasioBahan:Pelarut dan Waktu Ekstraksi
RasioBahan:Pelarut
WaktuEkstraksi
(Menit)
Rerata TotalFlavonoid (mgQE/Kg sampel)
Nilai DMRT(α=0,05)
Notasi
1:3 (b/v)
15 0,548 1,774 a20 0,593 1,860 a25 1,063 1,914 ab
1:5 (b/v)
15 0,450 1,951 a20 1,193 1,978 ab25 2,749 1,997 b
1:7 (b/v)
15 0,777 2,013 a20 2,952 2,025 b25 5,373 2,033 c
Keterangan: - Data merupakan rerata 3 ulangan
- Angka yang didampingi huruf yang tidak sama menunjukkan
berbeda nyata (α=0,05)
Dari hasil uji lanjut DMRT (α=0,05) dapat diketahui pada perlakuan rasio
bahan:pelarut 1:3 (b/v) memberikan nilai rerata total flavonoid yang berbeda
nyata pada waktu ekstraksi 25 menit, namun pada perlakuan waktu ekstraksi 15
menit dan 20 menit tidak memberikan pengaruh nyata. Pada perlakuan rasio
bahan:pelarut 1:5 (b/v) dan 1:7 (b/v) memberikan nilai rerata total flavonoid yang
berbeda nyata pada semua perlakuan waktu ekstraksi 15 menit, 20 menit, dan
25 menit.
4.3.2 Total Antosianin
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa rerata total antosianin akibat
pengaruh rasio bahan:pelarut dan waktu ekstraksi berkisar antara 0,148 mg/g
sampel hingga 0,255 mg/g sampel. Grafik rerata total antosianin akibat pengaruh
rasio bahan:pelarut dan waktu ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 4.3.
39
Gambar 4. 3 Grafik Rerata Total Antosianin Ekstrak Ampas Kecap Akibat PengaruhPerlakuan Rasio Bahan:Pelarut dan Waktu Ekstraksi
Gambar 4.3 menunjukkan bahwa rerata total antosianin ekstrak ampas
akibat rasio bahan:pelarut 1:3 dan 1:5 cenderung sama pada waktu ekstraksi 15
menit dan 20 menit kemudian meningkat pada waktu ekstraksi 25 menit.
Sedangkan rerata total antosianin akibat pengaruh rasio bahan:pelarut 1:7 terus
meningkat akibat semakin lama waktu ekstraksi. Rerata total antosianin tertinggi
ditunjukkan pada perlakuan rasio bahan:pelarut 1:3 dan waktu ekstraksi 25 menit
yaitu sebesar 0,255 mg/g sampel. Nilai rerata total antosianin ekstrak ampas
kecap akibat pengaruh perlakuan yang diberikan disajikan pada Table 4.5 dan
Tabel 4.6.
Tabel 4. 5 Rerata Total Antosianin Ekstrak Ampas Kecap Akibat PengaruhPerlakuan Rasio Bahan:Pelarut
Faktor RRerata Total
Antosianin (mg/Kg)BNT 95%
1:3 224,02 a
40,0511:5 181,28 b
1:7 154,73 b
Keterangan: - Data merupakan rerata 3 ulangan
- Angka yang didampingi huruf yang tidak sama menunjukkan
berbeda nyata (α=0,05)
0,211 0,205
0,256
0,161 0,163
0,219
0,152 0,148
0,189
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
15 20 25
Rer
ata
Tota
l Ant
osia
nin
(mg/
gsa
mpe
l)
Waktu Ekstraksi (menit)
1:03
1:05
1:07
RasioBahan:Pelarut
40
Tabel 4. 6 Rerata Total Antosianin Ekstrak Ampas Kecap Akibat PengaruhPerlakuan Rasio Bahan:Pelarut
Faktor TRerata Total
Antosianin (mg/Kg)BNT 95%
15 Menit 166,44 b
40,05120 Menit 172,19 b
25 Menit 221,34 a
Keterangan: - Data merupakan rerata 3 ulangan
- Angka yang didampingi huruf yang tidak sama menunjukkan
berbeda nyata (α=0,05)
Tabel 4.6 menunjukkan bahwa semakin lama waktu ekstraksi maka
kadar antosianin yang dihasilkan dari ekstrak ampas kecap akan semakin
mengalami peningkatan. Kadar antosianin tertinggi adalah perlakuan waktu
ekstraksi 25 menit yaitu sebesar 0,221 mg/g sampel. Menurut Navas et al.,
(2012), semakin lama waktu ekstraksi semakin lama pula bahan akan terpapar
oleh gelombang ultrasonik dari ultrasonic sistem bath, mengakibatkan pecahnya
dinding sel pada bahan sehingga mengeluarkan zat terlarut (solute) ke dalam
pelarut (sovent). Secara umum, semakin lama waktu ekstraksi kuantitas bahan
yang terekstrak juga akan semakin meningkat, hal tersebut dikarenakan
kesempatan untuk bersentuhan antara bahan dengan pelarut semakin besar
sehingga hasilnya akan bertambah sampai titk jenuh larutan (Mandal, et al.,
2007). Kurniati (2011) menjelaskan bahwa penambahan waktu tidak memberikan
konsentrasi yang nyata dengan lama ekstraksi terhadap proses ekstraksi saat
larutan menjadi jenuh.
Trisnobudi (2001) menyatakan bahwa ekstraksi menggunakan
gelombang ultrasonik merupakan ekstraksi dengan perambatan energi melalui
gelombang dengan menggunakan cairan sebagai media perambatan yang dapat
meningkatkan intensitas perpindahan energi sehingga proses ekstraksi lebih
maksimal. Penggunaan ultrasonik ini dapat menimbulkan efek kavitasi yang
dapat memecah dinding sel bahan sehingga antosianin dalam sel dapat keluar
dengan mudah, didapatkan hasil ekstrak yang maksimal (Susilo, 2007).
Kavitasi ini terjadi akibat dari gelombang ultrasonik yang dirambatkan
pada cairan sehingga menimbulkan suara, dimana tekanan cairan akan
meningkat saat amplitude positif dirambatkan dan tekanan menurun pada saat
41
amplitude negatif disalurkan. Perubahan tekanan secara stimulan dengan
frekuensi tinggi dari dinding ultrasonik direaksi lamba oleh cairan sehingga timbul
gelembung mikro. Gelembung tersebut mengembang dan mengempis tidak stabil
dengan laju pengembangan lebih besar dibandingkan dengan laju pengempisan
sehingga diameter gelembung tumbuh membesar hingga pecah dan merusak
dinding sel (Susilo, 2007). Namun waktu ekstraksi yang terlalu lama juga dapat
merusak senyawa hasil ekstraksi yang ada pada bahan, dikarenakan
penggunaan ultrasonik yang lama mengakibatkan cairan pada ultrasonik panas
sehingga dapat mendegradasi senyawa antosianin (Chan et al., 2011).
4.3.3 Aktivitas Antioksidan
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa rerata aktivitas antioksidan
ekstrak ampas kecap akibat pengaruh rasio bahan:pelarut dan waktu ekstraksi
berkisar antara 33,50% sampai 37,49%. Grafik rerata aktivitas antioksidan
ekstrak ampas kecap akibat pengaruh rasio bahan:pelarut dan waktu ekstraksi
disajikan pada Gambar 4.4.
Gambar 4. 4 Grafik Rerata Aktivitas Antioksidan Ekstrak Ampas Kecap AkibatPengaruh Perlakuan Rasio Bahan:Pelarut dan Waktu Ekstraksi
Dari Gambar 4.4 tersebut dapat ditunjukkan bahwa aktivitas antioksidan
ekstrak ampas kecap cenderung mengalami peningkatan akibat pengaruh rasio
bahan:pelarut dan waktu ekstraksi yang semakin meningkat. Aktivitas
antioksidan tertinggi dari ekstrak ampas kecap adalah perlakuan rasio
bahan:pelarut 1:7 dan waktu ekstraksi 25 menit. Sedangkan untuk aktivitas
33,5034,86 35,37
33,8134,82
36,87
34,7936,18
37,49
27,00
30,00
33,00
36,00
39,00
15 20 25
Aktiv
itas
Antio
ksid
an (%
)
Waktu Ekstraksi (menit)
RasioBahan:Pelarut1:3
RasioBahan:Pelarut1:5
RasioBahan:Pelarut1:7
42
antioksidan terendah dari ekstrak ampas kecap ditunjukkan oleh perlakuan rasio
bahan:pelarut 1:3 dan waktu ekstraksi 15 menit.
Hasil analisa ragam (Lampiran 4) menunjukkan bahwa perlakuan rasio
bahan:pelarut dan waktu ekstraksi memberikan pengaruh yang nyata (α=0,05)
terhadap aktivitas antioksidan ekstrak ampas kecap yang dihasilkan. Sedangkan
interaksi antara kedua perlakuan tersebut tidak berpengaruh nyata (α=0,05).
Rerata aktivitas antioksidan ekstrak ampas kecap pada berbagai perlakuan rasio
bahan:pelarut dan waktu ekstraksi disajikan pada Tabel 4.7 dan Tabel 4.8.
Tabel 4. 7 Rerata Aktivitas Antioksidan Ekstrak Ampas Kecap Akibat PengaruhPerlakuan Rasio Bahan:Pelarut
Rasio Bahan:PelarutRerata Aktivitas
Antioksidan (%)BNT (95%)
1:3 34,57 a
0,961:5 35,16 a
1:7 36,15 b
Keterangan: - Data merupakan rerata 3 ulangan
- Angka yang didampingi huruf yang tidak sama menunjukkan
berbeda nyata (α=0,05)
Tabel 4. 8 Rerata Aktivitas Antioksidan Ekstrak Ampas Kecap Akibat PengaruhPerlakuan Waktu Ekstraksi
Waktu EkstraksiRerata Aktivitas
Antioksidan (%)BNT 95%
15 Menit 34,035 a
0,9620 Menit 35,286 b
25 Menit 36,577 c
Keterangan: - Data merupakan rerata 3 ulangan
- Angka yang didampingi huruf yang tidak sama menunjukkan
berbeda nyata (α=0,05)
Dari Tabel 4.7 diketahui bahwa terjadi peningkatan aktivitas antioksidan
ekstrak ampas kecap dengan semakin meningkatnya jumlah pelarut yang
ditambahkan sampai perlakuan rasio bahan:pelarut 1:7. Aktivitas antioksidan
tertinggi adalah perlakuan rasio bahan:pelarut 1:7 yaitu sebesar 36,15%
43
sedangkan aktivitas antioksdian terendah adalah perlakuan rasio bahan:pelarut
1:3 yaitu sebesar 34,57%. Peningkatan aktivitas antioksidan dapat dikarenakan
kadar senyawa bioaktif seperti antosianin dan isoflavon dalam ekstrak ampas
kecap cukup tinggi. Antosianin dan isoflavon merupakan senyawa golongan
flavonoid yang berfungsi sebagai antioksidan. Peningkatan rasio bahan:pelarut
yang digunakan menyebabkan kadar senyawa bioaktif yang terekstrak semakin
banyak, sehingga aktivitas antioksidan semakin meningkat.
Dari Tabel 4.8 dapat diketahui bahwa terjadi peningkatan aktivitas
antioksidan ekstrak ampas kecap yang dihasilkan dengan semakin lama waktu
ekstraksi yang diberikan. Aktivitas antioksidan tertinggi adalah perlakuan waktu
ekstraksi 25 menit yaitu sebesar 36,577% sedangkan aktivitas terendah adalah
perlakuan waktu ekstraksi 15 menit yaitu sebesar 34,035%. Waktu ekstraksi
yang kurang menyebabkan kurang optimalnya proses kavitasi atau pemecahan
dinding sel saat diberi pelakuan gelombang ultrasonik sehingga aktivitas
antioksidan yang dihasilkan dari ekstrak ampas kecap juga kurang maksimal.
Sedangkan aktivitas antioksidan tertinggi dapat disebabkan oleh waktu ekstraksi
yang lama sehingga kontak antara pelarut dan bahan sudah cukup untuk
mengekstraksi senyawa bioaktif yang terdapat dalam ampas kecap. Menurut
Mason (1999) efek mekanik dari metode ultrasonik adalah meningkatkan
penetrasi pelarut ke dalam sel bahan serta meningkatkan transfer massa.
Selain itu, menurut Acherman et al. (1998), bagian dinding sel di dekat
gelembung akan mengalami perpindahan besar nisbi terhadap bagian dinding
sel yang lain. Tegangan geser yang dihasilkan akan dengan mudah merobek
dinding sel. Di dekat kaviti yang menghilang terdapat juga turbulensi yang
mengaduk dengan hebat. Dinding sel dapat dirusak oleh tegangan geser yang
ditimbulkan oleh turbulensi ini. Apabila proses pemecahan telah sempurna dan
proses ekstraksi masih berlanjut, maka akan terjadi perusakan senyawa hasil
ekstraksi. Berdasarkan penjelasan tersebut, dapat dikatakan proses ekstraksi
menggunakan ultrasonik akan dapat berpengaruh terhadap aktivitas antioksidan
yang dihasilkan.
4.4 Pengaruh Total Flavonoid dan Total Antosianin terhadap AktivitasAntioksidan
Aktivitas antioksidan (%Inhibisi) pada ekstrak ampas kecap dipengaruhi
oleh banyak faktor, total flavonoid dan total antosianin merupakan contoh yang
44
menentukan aktivitas antioksidan pada ekstrak ampas kecap. Berdasarkan hasil
analisa yang sudah diperoleh, dilakukan uji regresi multivariate untuk mengetahui
bagaimana pengaruh senyawa bioaktif seperti total flavonoid dan total antosianin
terhadap aktivitas antioksidan pada ekstrak ampas kecap. Hasil uji regresi
multivariate dapat dilihat pada Tabel 4.9.
Tabel 4. 9 Regresi Multivariate Total Flavonoid dan Total Antosianin terhadapaAktivitas Antioksidan Ekstrak Ampas Kecap
Parameter NilaiMultiple R 0,91R – Square 0,84Adjusted R - Square 0,78Koefisien RegresiIntercept (constant) 32,95Flavonoid 0,00073Antosianin 0,00562
Berdasarkan Tabel 4.9 dapat diketahui bahwa nilai R regresi
multivariate antara total flavonoid dan total antosianin terhadap aktivitas
antioksidan sebesar 0,91 yang berarti total flavonoid dan total antosianin
mempunyai korelasi yang sangat kuat karena nilai multiple R mendekati 1.
Selanjutnya untuk nilai adjusted R Square dari regresi multivariate yaitu 0,78 atau
0,78% dimana hal tersebut menunjukan bahwa aktivitas antioksidan pada
ekstrak ampas kecap dipengaruhi oleh total flavonoid dan total antosianin dan
sisanya 22% dipengaruhi oleh faktor lain. Dari tabel Regresi multivariate
diperoleh koefisien regresi dari semua variabel yaitu total fenol dan total
flavonoid. Berikut persamaan regresi linier yang diperoleh:
Keterangan:
Y = Nilai aktivitas antioksidan (%)
X1 = Total flavonoid (mg QE/Kg sampel)
X2 = Total antosianin (mg/Kg sampel)
Nilai Intercept (konstanta) 32,95 menunjukan bahwa apabila tidak ada
kedua variabel bebas (total flavonoid dan toal antosianin), maka nilai aktivitas
antioksidan pada ekstrak daun kersen adalah sebesar 32,95%. Nilai koefisien
X1= 0,00073 menunjukan bahwa adanya hubungan positif atau pengaruh searah
antara total flavonoid terhadap aktivitas antioksidan pada ekstrak ampas kecap
artinya apabila total flavonoid yang terukur tinggi maka nilai antioksidan yang
45
diperoleh diprediksi meningkat dengan asumsi bahwa variable lain tetap atau
konstan. Pada nilai koefisien X2 = 0,00562menunjukan bahwa adanya hubungan
positif atau pengaruh searah antara total antosianin terhadap aktivitas
antioksidan pada ekstrak ampas kecap artinya apabila total antosianin yang
terukur tinggi maka nilai antioksidan yang diperoleh diprediksi meningkat dengan
asumsi bahwa variable lain tetap atau konstan. Selanjutnya dilakukan analisa
pengujian korelasi antara total flavonoid, total antosianin dan aktivitas
antioksidan. Korelasi antara aktivitas antioksidan dan total flavonoid dapat dilihat
pada Gambar 4.5.
Gambar 4. 5 Grafik Korelasi Aktivitas Antioksidan (%) dengan Rerata TotalFlavonoid (mg QE/Kg) Ekstrak Ampas Kecap
Gambar 4.5 menunjukkan grafik korelasi antara aktivitas antioksidan dan
total flavonoid. Dapat dilihat korelasi antara aktivitas antioksdian dan total
flavonoid sebesar 0,8163 atau 82% hal ini menunjukkan korelasi antara 2
parameter memiliki nilai yang positif dan saling mempengaruhi dengan
keterkaitan sebesar 82%. Nilai yang ditunjukkan positif, dimana keterkaitan
parameter total flavonoid terhadap aktivitas antioksidan berbanding lurus yang
artinya apabila total flavonoid meningkat maka aktivitas antioksidan juga
meningkat, begitu pula sebaliknya apabila total flavonoid menurun, maka
aktivitas antioksidan juga turun.
Korelasi total flavonoid dan aktivitas antioksidan yang tinggi dan hampir
mendekati 1 dikarenakan kandungan isoflavon yang terdapat pada kedelai hitam
yang tinggi pula. Hal tersebut ditambah dengan proses fermentasi koji dan
y = 0,0007x + 34,03R² = 0,8163
33,000
34,000
35,000
36,000
37,000
38,000
39,000
0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000
Aktiv
itas
Antio
ksid
an (%
)
Rerata Total Flavonoid (mg QE/Kg)
46
moromi yang dapat meningkatkan kandungan isoflavon pada kedelai hitam,
sehingga meskipun telah mengalami pemisahan filtrat dan ampas, masih ada
kandungan isoflavon yang tersisa dalam ampas kecap. Hal tersebut diperkuat
dengan pernyataan Matsuda (1998) yang menyebutkan bahwa ampas kecap
yang berasal dari kedelai hitam masih memiliki kandungan gizi yang tinggi dan
diduga masih mengandung asam amino, asam orgnaik, isoflavon seperti
daidzein dan genistein mengingat juga ampas kecap sebelumnya telah
mengalami proses fermentasi. Isoflavon merupakan flavonoid yang dijumpai
dalam kedelai. Flavonoid sering merupakan senyawa pereduksi yang baik yang
dapat menghambat banyak reaksi oksidasi, baik secara enzimatik maupun non
enzimatik (Robinson, 1991). Menurut Ralston (2005) proses ferrmentasi juga
dapat menghidrolisis senyawa-senyawa flavon glikosida menjadi aglikonnya,
yang menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih tinggi. Isoflavon yang
dominan pada kedelai terdapat dalam bentuk glikosida, sedangkan yang
dominan pada produk kedelai yang mengalami fermentasi adalah aglikon
(Coward et al., 1993).
Sedangkan nilai korelasi antara total antosianin dan aktivitas antioksidan
disajikan pada Gambr 4.6.
Gambar 4. 6 Grafik Korelasi Aktivitas Antioksidan (%) dan Rerata Total Antosianin(mg/Kg) Ekstrak Ampas Kecap
Dapat dilihat pada Gambar 4.6 bahwa nilai korelasi antara total antosianin
dan aktivitas antioksidan cukup rendah yaitu hanya 0,012 atau 1,2%. Hal
tersebut dikarenakan pigmen antosianin yang terkandung dalam ampas kecap
y = 0,004x + 34,54R² = 0,012
33,000
34,000
35,000
36,000
37,000
38,000
100,000 150,000 200,000 250,000 300,000
Aktiv
itas
Antio
ksid
an (%
)
Rerata Total Antosianin (mg/Kg)
47
banyak mengalami degradasi selama proses ekstraksi berlangsung. Sebelumnya
ampas kecap mendapat perlakuan pengeringan untuk dijadikan tepung ampas
kecap. Pengeringan terjadi pada suhu 50°C selama 8 jam. Selama proses
tersebut antosianin dapat terdegradasi akibat panas yang diberikan. Menurut
Brat (2008) temperatur dapat menggeser kesetimbangan antosianin. perlakuan
panas dapat menyebabkan kesetimbangan anosianin cenderung menuju bentuk
yang tidak berwarna yaitu basa karbinol dan khalkone. Kerusakan akibat
pemanasan ini dapat terjadi melalui dua tahap. Pertama hidrolisis terjadi pada
ikatan glikosidik antosianin sehingga menghasilkan aglikon-aglikon yang tidak
stabil. Kedua, cincin aglikon terbuka membentuk gugus karbinol dan khalkone.
Degaradasi ini dapat terjadi lebih lanjut jika terdapat oksidator sehingga
terbentuk senyawa berwarna coklat .
Selain itu antosianin juga dapat terdegradasi akibat waktu ekstraksi yang
terlalu lama. Menurut Chan et al. (2011) waktu ekstraksi yang terlalu lama juga
dapat merusak senyawa hasil ekstraksi yang ada pada bahan, dikarenakan
penggunaan ultrasonik yang lama mengakibatkan cairan pada ultrasonik panas
sehingga dapat mendegradasi senyawa antosianin.
Hal lain yang dapat menyebabkan antosianin terdegradasi sehingga
peranannya dalam menyumbang aktivitas antioksidan pada ampas kecap kurang
yaitu kestabilan antosianin. Antosianin stabil pada kondisi asam sedangkan pada
penelitian ini kondisi proses ekstraksi tidak terjadi kondisi asam. Pelarut yang
digunakan dalam proses ekstraksi ampas kecap ini adalah etanol 96%.
Kepolaran antosianin dengan etanol memang hampir sama sehingga sehingga
cocok untuk proses ekstraksi. Seperti pada penelitian Saati (2002) untuk
ekstraksi antosianin dari bunga pacar air, pelarut yang paling baik digunakan
adalah etanol 95%. Begitu juga dengan penelitian Wijaya dkk (2001) tentang
ekstraksi pigmen dari kulit buah rambutan. Hal ini disebabkan tingkat kepolaran
antosianin hampir sama dengan etanol 95% sehingga dapat larut dengan baik
pada etanol 95%. Namun pelarut etanol saja tidak cukup untuk mengekstrak
antosianin, perlu adanya kondisi asam dalam proses ekstraksi. Seperti pada
penelitian Budiarto (1991) mengekstrak antosianin dari kulit manggis dengan
pelarut etanol yang telah ditambahkan HCl 1% yang memiliki intensitas warna
ekstrak lebih tinggi dibandingkan dengan menggunakan pelarut air atau metanol.
Sifat antosianin yang hidrofilik menyebabkannya sering diekstrak dengan
48
menggunakan pelarut alkohol atau air. Pelarut alkohol menghasilkan warna
antosianin yang lebih biru dibandingkan dengan pelarut air (Rein, 2005).
4.5 Pemilihan Perlakuan Terbaik
Perlakuan terbaik akibat pengaruh rasio bahan:pelarut dan waktu
ekstraksi dipilih menggunakan metode Multiple Attribute (Zeleny, 1982).
Penilaian meliputi parameter fisik dan kimia dari ekstrak ampas kecap yaitu
rendemen, aktivitas antioksidan, total flavonoid, dan total antosianin. Perlakuan
terbaik dipilih berdasarkan tingkat kerapatannya, dimana perlakuan yang memiliki
tingkat kerapatan paling kecil dinyatakan sebagai perlakuan terbaik. Perhitungan
perlakuan terbaik dapat dilihat pada Lampiran 7
Perlakuan terbaik berdasarkan parameter yang sudah dijelaskan
diperoleh pada perlakuan dengan rasio bahan:pelarut 1:7 (b/v) dan waktu
ekstraksi 25 menit (R3T3). Parameter pada ekstrak ampas kecap hasil perlakuan
terbaik kemudian dibandingkan dengan analisa bahan baku tepung ampas kecap
yang sudah dianalisa pada awal penelitian. Nilai parameter uji pada perlakuan
terbaik dari ekstrak ampas kecap dan bahan baku tepung ampas kecap dapat
dilihat pada Lampiran 7.
Tabel 4. 10 Karakteristik Fisik dan Kimia Ekstrak Ampas Kecap Perlakuan Terbaik(R3T3)
ParameterTepung Ampas
Kecap Hasil Analisa
Ekstrak Ampas
Kecap
Rendemen (%) - 17,042
Total Flavonoid (mg QE/g
sampel) 0,805 5,373
Total Antosianin (mg/g sampel) 0,098 0,189
Aktivitas Antioksidan (%) 18,510 37,494
Tabel 4.10 menunjukkan perbandingan hasil analisa tepung ampas kecap
yang digunakan sebagai bahan baku penelitian dengan ekstrak ampas kecap
perlakuan terbaik. Berdasarkan tabel tersebut tepung ampas kecap tidak
dilakukan analisa rendemen karena sebagai bahan baku tepung ampas kecap
masih memiliki rendemen 100%. Rendemen ekstrak ampas kecap hasil analisa
perlakuan terbaik yaitu sebesar 17,042%. Hasil tersebut merupakan hasil dari
49
proses ekstraksi dimana senyawa-senyawa murni yang diinginkan terekstrak
sehingga diusahakan kecil kemungkinan adanya residu yang tertinggal seperti
sisa pelarut etanol dan zat pengotor lainnya. Rendemen ekstrak ampas kecap
yang diukur hanya rendemen ekstrak kasar dengan kondisi optimum karena
umumnya, seiring meningkatnya rasio bahan:pelarut dan waktu ekstraksi maka
jumlah senyawa target dan rendemen akan meningkat, walaupun terdapat resiko
terjadinya degradasi senyawa target itu sendiri (Mandal, 2007).
Sitorus (1986) menyatakan bahwa ampas kecap merupakan limbah dari
proses pembuatan kecap yang berbahan dasar kedelai hitam dan memiliki
kandungan protein cukup tinggi dan palatabel. Oleh karena ampas kecap berasal
dari kedelai hitam, maka kandungan gizi yang terkandung dalam ampas kecap
tidak berbeda jauh dari kedelai hitam. Xu dan Chang (2007) menyebutkan bahwa
kedelai hitam mempunyai kandungan fenolik, tanin, antosianin, dan isoflavon
serta aktivitas antioksidan lebih tinggi dibanding kedelai kuning. Kandungan
senyawa bioaktif yang masih ada pada ampas kecap akan dikeluarkan pada saat
ekstraksi. Kandungan senyawa bioaktif tersebut cenderung akan mengalami
peningkatan pada waktu ekstraksi sampai pada titik optimal, kemudian
peningkatan waktu ekstraksi dapat menyebabkan menurunnya kandungan
senyawa bioaktif yang terkandung dalam bahan. Hal ini dikarenakan pada awal
proses ekstraksi seluruh senyawa dalam bahan akan terekstrak keluar dan
bercampur dengan pelarut etanol dan setelah mencapai titik optimal beberapa
senyawa yang terdapat pada bahan akan mengalami penurunan (Sukardi, 2007).
Proses ekstraksi dapat diartikan sebagai proses pemisahan satu atau
lebih bahan dari suatu padatan atau cairan. Proses ekstraksi diawali dengan
terjadinya penggumpalan ekstrak dalam pelarut sehingga pada bidang antar
muka bahan dan pelarut terjadi pengendapan massa bahan (Cowan, 1999). Hal
ini jelas terihat pada Tabel 4.9 dimana terjadi peningkatan aktivitas antioksidan,
kadar total flavonoid, dan kadar total antosianin antara bahan baku tepung
ampas kecap dengan hasil ekstrak ampas kecap menggunakan metode
ultrasonik. Flavonoid dan antosianin merupakan senyawa yang bersifat larut
dalam air sehingga kelarutannya paling tinggi dalam pelarut yang bersifat polar.
Penelitian Yang dan Zhang (2009) menyebutkan ekstraksi flavonoid dari daun
Eunymus Alatus menggunakan ultrasonik menghasilkan kadar flavonoid yang
lebih tinggi, waktu ekstraksi yang lebih singkat dan volume pelarut yang lebih
sedikit daripada ekstraksi dengan maserasi.
50
Aktivitas antioksidan antara tepung ampas kecap dengan ekstrak ampas
kecap perlakuan terbaik menunjukkan hasil yang cukup berbeda, yaitu sebesar
18,51 % pada tepung ampas kecap dan meningkat dua kali lipat sebesar 37,49%
pada ekstrak ampas kecap. Aktivitas antioksidan ekstrak ampas kecap
mengalami peningkatan akibat penambahan pelarut etanol yang akan
menyebabkan penetrasi ke dalam sel-sel ampas kecap dan mengeluarkan
senyawa-senyawa bioaktif yang masih terkandung dalam ampas kecap. Pada
tepung ampas kecap tidak ada penambahan pelarut etanol sehingga
pengeluaran senyawa-senyawa bioaktif dari ampas kecap menjadi kurang
maksimal. Perlakuan terbaik menunjukkan penambahan pelarut etanol dan waktu
yang paling optimal untuk mengekstrak senyawa-senyawa bioaktif yang
terkandung dalam ampas kecap adalah perlakuan rasio bahan:pelarut 1:7
dengan waktu ekstraksi 25 menit. Hal tersebut menyebabkan kontak antara
pelarut dan bahan yang diekstrak semakin lama sehingga memungkinkan
adanya pengeluaran senyawa-senyawa dalam ampas kecap semakin banyak.
Dengan adanya gelombang ultrasonik maka transfer massa, disturpsi sel, dan
efek penetrasi akan meningkat. Gelombang ultrasonik dapat memfasilitasi
pembengkakan (swelling) dan hidrasi sehingga dapat memperluas pori-pori
dinding sel. Hal ini akan meningkatkan proses difusi dan transfer massa
(Vinatoru, 2001).
51
V. PENUTUP
5.1 KesimpulanPada penelitian ini dapat disimpulkan antara lain sebagai berikut.
a. Rasio bahan:pelarut dan waktu ekstraksi memberikan pengaruh yang nyata
terhadap aktivitas antioksidan dan kandungan senyawa bioaktif yang
terkandung dalam ampas kecap seperti total flavonoid dan total antosianin
yang diekstrak menggunakan ultrasonic bath.
b. Rasio bahan:pelarut 1:7 dan waktu ekstraksi 25 menit merupakan perlakuan
terbaik untuk menghasilkan ekstrak ampas kecap dengan kandungan
senyawa bioaktif yang paling optimal yaitu rendemen yang dihasilkan
sebesar 17,04%, total flavonoid sebesar 5,373 mgQE/g sampel, total
antosianin sebesar 0,189 mg/g sampel, dan aktivitas antioksidan sebesar
37,49% .
5.2 SaranAmpas kecap yang diekstrak menggunakan ultrasonic bath dapat
diaplikasikan lebih lanjut. Oleh karena itu perlu adanya penelitian lanjutan
mengenai ampas kecap. Adapun saran yang diberikan antara lain sebagai
berikut.
1. Perlu adanya penelitian lebih lanjut mengenai senyawa bioaktif lain yang
terkandung dalam ekstrak ampas kecap seperti asam asam amino organik
dan profil senyawa isoflavon dengan menggunakan HPLC (High
Performance Liquid Chromatography).
2. Perlu adanya penelitian mengenai kandungan garam yang terkandung
dalam ekstrak ampas kecap mengingat sebelumnya ampas kecap
mengalami proses fermentasi garam (moromi).
3. Dapat diaplikasikan sebagai suplemen atau alternatif pangan fungsional,
namun pemanfaatan tersebut perlu adanya penelitian lebih lanjut mengenai
efektivitas senyawa bioaktif yang terkandung dalam ampas kecap melalui uji
in vivo.
52
DAFTAR PUSTAKA
Adie, M. M. dan A. Krisnawati. 2007. Biologi Tanaman Kedelai dalam KedelaiTeknik Produksi dan Pengembangan, disunting oleh Sumarno, Suyamto,Adi Widjono, Hermanto, dan Husni Kasim. Bogor. Badan Penelitian danPengembangan Pertanian. 521.
Anderson J.W., V.A. Diwadkar, and S.R. Bridges. 1998. Selective Effect OfDifferent Antioxidants on Oxidation of Lipoprotein from Rats.Proceeding Biology. Medical. 218: 376 – 381.
Ariani, S.R.D 2001. Identifikasi Senyawa Faktor-2 (Suatu Senyawa Isoflavon)dari Tempe Selama Proses Fermentasi Hari ke-0,1,2,3,4, dan 5.Paedagogia, 4 (1).
Ariani, S.R.D. 2003. Pembuatan Keju Kedelai yang Mengandung SenyawaFaktor-2 Hasil Biokonversi Isoflavon Pada Tahu Oleh Rhizopusoligosporus , BioSMART 5(1) : 8–12.
Ariani, S.R.D. dan Hastuti, W. 2009. Analisis Isoflavon dan Uji AktivitasAntioksidan pada Tempe dengan Variasi Lama Waktu Fermentasidan Metode Ekstraksi. Prosiding Kimia Organik, Bahan Alam, danBiokimia. FKIP UNS Surakarta.
Astadi, I.R., M. Astuti, U. Santoso and P.S. Nugraheni. 2009. In VitroAntioxidant Activity of Anthocyanins of Black Soybean Seed Coat inHuman Low Density Lipoprotein (LDL). Food Chemistry. 122: 659-663
Barz, W., Heskamp, Klus, K., Rehms, H. and Steinkamp, R. 1993. RecentAspect of Protein, Phytate and Isoflavone Metabolism byMicroorganisms Isolated from Tempe-Fermentation. Jakarta. TempoWorkshop.
Beninger, Clifford W and George L. Hosfield. 2003. Antioxidant Activity ofExtract, Condensed Tannin fraction, and Pure Flavonoids fromPhaseolus vulgaris L. Seed Coat Color Genotypes. Journal ofAgriculture and Food Chemistry. 51: 7879-7883.
Brat, P., Tournaire, F., Amiot Carlin, MJ. 2008. Stability and Analysist ofPhenolic Pigments. Dalam Food Colorants Chemical and FunctionalProperties. Boca Raton: CRC Press.
Brennan, J. G. 2006. Food Processing Handbook. Wiley-VCH Verlag GmBH &Co. KgaA Weinheim. Germany.
Budiarto, H. 1991. Stabilitas Antosianin Buah Manggis (Garciniamangostana) dalam Minuman Berkarbonasi. Skripsi. FakultasTeknologi Pertanian Universitas Brawijaya. Malang.
53
Cameron, D. K. And Wang. 2006. Appilcation of Protease and High- IntensityUltrasound in Corn Starch Isolation from Degermed Corn Flour.Journal Food Science University of Arkansas. 83 (5) : 505-509
Chan, C., Yusoff, R., Ngoh G., and Kung, F. W. 2011. Microwave AssistedExtractions of Active Ingredients from Plants. Journal ofChromatography A, 1218:6213-6225
Choung, M. G., Baek, I. Y., Kang, S. T., Han, W. Y., Shin, D. C., Moon, H. P. andKang, K. H. 2001. Isolation and determination of anthocyanins inseed coats of black soybean Glycine max (L.) Merrill. Journal ofAgriculture and Food Chemistry. 49:5848-5851.
Cowan, M.M. 1999. Plant Product as Antimicrobial Activity of Flavonoids.International Journal of Antimicrobial Agents. 26. 343-356
Coward, L., Barnes, N., Setchell, K.D.R., Barnes, S. 1993. Genestein andDeidzein and their ß Gliciside Conjugates anti-Tumor Isoflavones inSoybeans Foods from American and asian Diets. Journal ofAgriculture and Food Chemistry. 41: 1961-1967.
Gogate, P. R., R. K. tayal dan A. B. Pandit., 2006. Cavitation: A Technology onThe Horizon Current Science. 91 (1).
Goli AH, Baregar M, Sahari MA. 2004. Antioxidant Activity and Total PhenolicCompunds of Pistachio (Pistachia vera) Hull Extract. Food Chemistry92: 521-525
Guenther, E. 1987. Minyak Atsiri I. Diterjemahkan Oleh S. Ketaren. Penerbit UI.Jakarta
Gyorgy, P., K. Murata, and H. Ikehata. 1964. Antioxidants Isolated fromFermented Soybeans Tempeh. Nature. 203: 872-875.
Hemwimol., P. Pasavant and A. Shotiruk. 2012. Ultrasonic Sonochemistry. 13,543.
Hidajat, O.O. 1985. Morfologi Tanaman Kedelai. Hal 73-86. Dalam : S.Somaatmaja, M. Ismunadji dkk (Eds). Kedelai. Pusat Penelitian danPengembangan Tanaman Pangan, Bogor.
Hui, Y.H. 1992. Encyclopedia of Food Science and Technology. Volume 2.John Wiley and Sons Inc. New York.
Holistic Health Solution. 2011. Khasiat Fantastis Kulit Manggis. Grasindo.Jakarta: 17-71
Hou, H.J., Chang, K.C. 2002. Interconvertion of Isoflavone in Soybean asAffected by Storage. Journal of Food Science. 67 : 2083 – 2089.
Jain, T., V. Jain, R. Pandey, A. Vyas and S. S. Shukla. 2009. MicrovaweAssisted extraction for Phytoconstituents. An Overview. Asian JournalResearch Chemistry, 1 (2):19-25.
54
Jati, S. Handoko. 2008. Efek Antioksidan Ekstrak Etanol 70% Daun Salam(Syzygium polyanthum [Wight.] Walp) Pada Hati Tikus Putih JantanGalur Wistar Yang Diinduksi Karbon Tetraklorida (CCl4). FakultasFarmasi Univerisitas Muhammadiyah Surakarta.
Jawi, S. dan Sutirtayasa. 2007. Efek Antioksidan Ekstrak Umbi Jalar Ungu(Ipomoea batatas L) Terhadap Hati Setelah Aktivitas Fisik Maksimaldengan Melihat Kadar AST dan ALT Darah pada Mencit. JurnalFarmasi. Dexa Media Vegetarian Phythochemical : Guardian of our Health,Continuing, Education article, hal 103-105.
Jha, H.C. 1985. Novel Isoflavanoids and It’s Derivates, New AntioxydantDerived from Fermented Soybean (Tempeh). Asian Symposium Non-salted Soybean Fermentation. Tsukaba. Japan. 14-16.
Kartika, B., Guritno, A.D dan Ismoyowati, 1997. Petunjuk Evaluasi ProdukIndustry Hasil Pertanian. PAU-Pangan dan Gizi. UGM. Yogyakarta.
Keil, F. J. 2007. Ultrasonic Vs. Microwave Extraction Intensification of ActivePrinciples From Medicinal Plants. AIDIC Conference Series, 9 : 1-8.
Koswara, S. 1992. Teknologi Pengolahan Kedelai. Pustaka Sinar Harapan.Jakarta.
Krisno, 1990. Fermentasi Moromi dan Fermentasi Koji dalam MeillyKusmdewi. 2012. Karakterisasi Sifat Fisikokimia Kecap Manis Komersi.Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Kuldiloke, J. 2002. Effect of Ultrasound, temperature and ProssuseTreatments on Enzyme activity and Quality Indicators of Fruit andVegetable Juices. Dissertation der Technischen Universitat Berlin.Berlin.
Kumalaningsih S. 2006. Antioksidan Sumber danManfaatnya. Antioxidant centre 12:112-123
Kurniati, S. 2011. Ekstraksi Antosianin Ubi Jalar Ungu (Ipomea batatas varAyamurasaki) Menggunakan Ultrasonic Bath. Skripsi. UniversitasBrawijaya, Malang.
Liu, Q. M. 2010. Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraxtion ofChlorogenic acid from Maria van Lersel, M. Sensible Sonochemistry.
Lubis, Hayati. 1997. Pengolahan Limbah Pabrik Kecap Menjadi Etanol. Tesis.Pascasarjana USU, PSL Medan.
Mandal, V., Y. Yogesh Mohan and S. Hemalatha, 2007. Microwave-AssistedExtraction-As Inovative and Promising Extraction Toil for MedicalPlant Research. Pharmacognosy Reviews. 1(1):7-18.
55
Markham. 1988. Techniques of Flavonoid Identification. Academic Press,London.
Martinez, A. C., Pina, G. L. and B. D., Oomah., 2001. Antioxidant Activity inCommon Beans (Phaseolus Vulgaris L.). Journal Agriculture FoodChemistry 50(24): 6975-6980.
Mason T. J., 1990. Introduction, Chemistry with Ultrasound. Edited by T. JMason. Elsevier Applied Science. London.
Mason T.J, Paniwynk, L. and Lorimer, J.P. 1996.The Use of Ultrasound inFood Technology.Ultrasonic Sonochemistry. 3:253-260.
Matsuda, S. 1998. Study on Antioxidant Subtance of Soy Sauce Lee (inJapaness). Journal of Brewing society of Japan. 93. 263-269.
Moestofa, A. 1981. Isolasi Oleoresin dari Lada Hitam. Proceeding Minyak AtsiriII. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Industri Hasil Pertanian.Bogor.
Mueller. 2012. Soy intake and risk of type 2 diabetes mellitus in ChineseSingaporeans: Soy intake and risk of type 2 diabetes. Europe Journalof Nutrition. 51(8):1022-40.
Naim, M. 1973. A new isoflavone from soybeans. Phytochemistry 12: 169-171.
Navas, M. J., Jiménez-Moreno, A. M., Bueno, J. M., Sáez-Plaza, P., and A. G.Asuero. 2012. Analysis and Antioxidant Capacity of AnthocyaninPigments. Part IV: Extraction of Anthocyanins. Critical Reviews inAnalytical Chemistry. 42:313-342.
Nunomura, N. dan Sasaki, M. 1992. Japanese Soy Sauce Flavour withEmphasis on Off Flavours. Dalam : Charalambous, G. (ed.). OffFlavours in Foods and Beverages. Elsevier Science Pub. B. V.,Amsterdam.
Padmawinata, K, 1988. Cara Mengidentifikasi Flavanoid, ITB Press. Bandung.
Pawiroharsono, S. 2001. Prospek dan Manfaat Isoflavon untuk Kesehatan.Direktorat Teknologi Bioindustri, Badan Pengkajian dan PenerapanTeknologi.
Perry. 1984 dalam M. Syaflan dan Hastuti, S. 2002. Ekstraksi Oleoresin SuatuAlternatif untuk Memberikan Nilai Tambah Bagi Penili. SeminarNasional PATPI. Malang.
Pokorny, J., 2001. Antioxidant in Food: Practical Application. CRC Press.Boca Raton.
Pradana, S. 2008. Prospek dan Manfaat Isoflavon sebagai Fitoestrogen BagiKesehatan. http://one.indoskripsi.com/judul-skripsi-tugas-makalah/biologi-umum/prospek-dan-manfaat-isoflavon-sebagai-fitoestrogen-bagi-kesehatan. Diakses 16 Januari 2015.
56
Prakash, A., 2001, Antioxidant Activity. Medallion Laboratories AnalyticalProgress, 9 (2).
Purgeslove, J.W., Brown, E.G., Green, C.L and Robinson, S. R. 1981. Spices 2.Longman. New York.
Puspita, M. 2011. Ultrasonikasi Suatu Langkah Efisiensi Proses Produksi.http://artikelpanganhmppi.wordpress.com/juni-2011/ultrasonikasi-suatu-langkahefisiensi-proses-produksi/ artikel pangan hmppi. Diakses tanggal10 Desember 2014
Rahmat, H. (2009). Identifikasi Senyawa Flavonoid Pada Sayuran IndigenousJawa Barat. Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian. Institut PertanianBogor. Bogor
Rama. P. 2008. Bioetanol Ubi Kayu Bahan Bakar Masa Depan. Penerbit AgroMedia. Jakarta.
Ralston, L. 2005. Partial Reconstruction of Flavonoid and IsoflavonoidBiosynthesis in Yeast using Soybean type I and II ChaconeIsomerase. Plant physiology. 137.
Rein, M. 2005. Copigmentation Reactions and Color Stability of BerryAntochyianins. Dissertation. Food Chemistry Division. Universitas ofHelsinky.
Robinson, T. 1991. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi Edisi Keenam.Penerbit ITB. Bandung.
Routry, W. And V. Orsat. 2012. Microwave-Assisted Extraction of Flavonoids:A Review. Food Bioprocess Technol, 5:409-424.
Siagian A. 2002. Bahan Tambahan Makanan. Sumatera: Fakultas KesehatanMasyarakat, Universitas Sumatera Utara
Sitorus, S., 1986. Pemberian Urea dan Ampas Kecap pada Domba yangDiberi Makan Jerami Padi dan Molase. Balai Penelitian Ternak. Bogor.
Sofia D. 2007. Antioksidan dan Radikal Bebas. www.chemistry.org. Akses:Juni 2015
Somaatmadja, D. 1981. Prospek Pengembangan Industri Oleoresin diIndonesia. Komunikasi No. 201. BBIHIP. Bogor.
Somaatmadja, S. 1985. Kedelai. Badan Penelitian dan PengembanganPertanian Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. Bogor.
Sukarini, N. E., L. D. Mahfudz., dan A. M. Legowo. 2004. PengaruhPenggunaan Ampas Kecap yang Diproses dengan Asam Asetatuntuk Pakan terhadap Komposisi Kimia Daging Dada Ayam Broiler.Jurnal of Indonesia Tropical Animal and Agriculture 29 (3).
57
Suryandari, S. 1981. Pengambilan Oleoresin Jahe dengan Cara SolventEkstruksi. BUL IHP (2) BBIHP. Bogor.
Susanto, W.H. 1999. Teknologi Lemak dan Minyak Makan. Fakultas TeknologiPertanian Universitas Brawijaya, Malang.
Susilo, N. 2007. Studi Penggunaan Ultrasonik untuk TransesterifikasiMinyak Pengembangan Industri Intregatednya. Hotel Senayan Jakarta. SBRC LPPM IPB. Bogor.
Suyitno. 1989. Petunjuk Laboratorium Pangan Proyek Pengembangan.Pusat Fasilitas Bersama Antar Universitas (Bank Dunia XVII). PAUPangan dan Gizi UGM. Yogyakarta.
Thompson, L. H. And L. K. Doraiswamy. 1999. Sonochemistry: Science andEngineering. Industrial and Engineering Chemistry Research 38: 1215-1249.
Tranggono, S. Sutardi, Haryadi, Suparno, A. Murdiyati, S. Sudarmadji, K.Rahayu, S. Naruki, dan M. Astuti. 1990. Bahan Tambahan Pangan. PAUPangan dan Gizi. UGM. Yogyakarta.
Trisnobudi, A. 2001. Aplikasi Ultrasonik. Departemen fisika Teknik. PenerbitITB. Bandung.
Vargas, F.C and O.P, Lopez. 2003. Natural Colorant and Nutraceutical Uses.CRC Press. London.
Vinatoru, M. 2001. An Overview of The Ultrasonically Assisted Extraction ofBioactive Principle from Herbs. Ultrason. Sonochem. 8: 303-313
Wardiyati, S. 2004. Pemanfaatan Ultrasonik dalam Bidang Kimia. Puslitbang.IPTEK Bahan (P3IB). Batan.
Wijaya, L.S, S.B Widjanarko, T. Susanto. 2001. Ekstraksi dan KarakterisasiPigmen dari Kulit Buah Rambutan (Nephelium lappaceum) var.Binjai. Biosain (Jurnal Ilmu-ilmu Hayati 1 (2)). Pasca Sarjana UniversitasBrawijaya. Malang.
Wrolstad, R. 2001. The Possible Health Benefits of Anthocyanin Pigmentsand Polyphenolics. http://lpi.oregonstate.edu/ss01/anthocyanin.html.Diakses tanggal 07 April 2011.
Wu, S.Y. dan Brewer, M.S. 1994. “Soy Protein Isolate Antioxidant Effect onLipid Peroxidation of Ground Beef and Microsomal Lipids”. JournalFood Science. 59 (4).
Xu, B.J. and S.K.S. Chang. 2007. A Comparative Study on Phenolic Profilsand Antioxidant of Legums as Affected by Extraction Solvents. JornalFood Science. 75 (2):159-166.
Yuliana, Tri. 2007. Pengaruh Inokulasi Silang Bakteri Nodul dari BerbagaiTanaman Leguminosae pada Tanaman Kedelai Hitam {Glycine soja
58
(Moench) F.J. Herm)}.http://digilib.itb.ac.id/gdl.php?mod=browse&op=read&id=jbptitbppgdltriyuliana31689. (abstr.). Diakses pada 08 Januari 2015
Zhang, L., Shan, Y., Tang, K., and Putheti, R. (2009). Ultrasound-AssistedExtraction Flavonoid from Lotus (Nelumbo nuficera Gaertin) Leaf.International Journal of Physical Sciences. 4 (8):418-422.
Zubik, L. and M. Meydani. 2003. Bioavability of Soybean Isoflavon fromAglycone and Glucoside form in American Wsomen. Jornal of Clinicaland Nutrition. 77: 1459-1465.
59
LAMPIRAN
LAMPIRAN 1 PERSIAPAN EKSTRAK
1. Persiapan Bahan Baku dan Pembuatan Tepung Ampas Kecap
Bahan baku berupa ampas kecap diperoleh dari PT. Aneka Food Tatarasa
Industri, Probolinggo, Jawa Timur.
Ampas kecap hasil pemisahan filtrat pengolahan kecap dikumpulkan
Kemudian dilakukan pencucian sebanyak kurang lebih 5x untuk
menghilangkan kotoran dan garam sisa proses fermentasi moromi
Ampas kecap yang telah bersih kemudian ditiriskan untuk
mengurangi kandungan air setelah pencucian
Setelah itu, ampas kecap dikeringkan dalam pengering kabinet
selama ± 8 jam dengan suhu ± 50°C
Ampas kecap yang telah kering kemudian dihaluskan menggunakan
blender
Setelah itu, ampas kecap diayak menggunakan ayakan 80 mesh
untuk menjadikan tepung ampas kecap yang siap digunakan proses
ekstraksi.
2. Ekstraksi Ampas Kecap Metode Ultrasonic Bath
Tepung ampas kecap ditimbang sebanyak 20 gram
Kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 250 mL
Ditambahkan pelarut etanol 96% dengan rasio bahan:pelarut 1:3, 1:5,
dan 1:7 yaitu etanol 96% sebanyak 60 mL, 100 mL, dan 140 mL
kemudian ditutup dengan alumunium foil
Setelah itu diekstrak menggunakan ultrasonic bath50 kHz dengan
variasi lama waktu 15 menit, 20 menit, dan 25 menit
Hasil ekstraksi kemudian disaring menggunakan kertas saring halus
dengan pengulangan 2x penyaringan sehingga diperoleh filtrat yang
bebas ampas
Filtrat kemudian dipisahkan pelarutnya dengan penguapan
menggunakan rotary evaporator suhu 35°C sampai diperoleh ekstrak
pekat yang telah bebas pelarut
60
Hasil ekstrak pekat kemudian siap untuk dianalisa senyawa
bioaktifnya
61
LAMPIRAN 2 PROSEDUR ANALISA SAMPEL
1. Analisa Rendemen (Yuwono dan Susanto, 1998)
Hasil ekstraksi ditimbang dalam wadah yang sudah diketahui
beratnya
Rendemen dihitung berdasarkan berat kering bahan
Rendemen = Berat Akhir Sampel X 100 %
Berat awal sampel
2. Prosedur Analisa Penentuan Kadar Air (Sudarmadji dkk, 1997)
Botol timbang dimasukkan ke dalam oven 105°C selama 24 jam
kemudian dimasukkan ke dalam desikator selama 30 menit, setelah
itu ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik (x gram)
Sampel yang sudah dihaluskan ditimbang (y gram), kemudian
dimasukkan ke dalam botol timbang yang sudah diketahui beratnya
Sampel dalam botol timbang dimasukkan oven 105°C selam 5 jam,
kemudian didinginkan dalam desikator selama 0,5 jam, sampel yang
sudah dingin ditimbang. perlakuan ini diulang-ulang sampai tercapai
berat konstan (z gram), yaitu selisih penimbangan berat sampel
berturut-turt kurang dari 0,2 gram
Kadar air dihitung dengan rumus:
kadar air = (x+y) – z X 100%
Y
3. Prosedur Analisa Total Antosianin (Giusti dan Wrolstad, 2000)
Persiapan Bahan:
- Dibuat larutan buffer pH 1 dengan cara mencampurkan KCl 0,2 M
14,9 gram diencerkan dalam 1000 mL dalam labu ukur (Larutan
A) dan HCl 0,2 M(larutan B), buffer pH 1 (50 ml larutan A + 97 ml
larutan B diencerkan sampai 200 ml) diukur pH sampai mencapai
pH 1.
- Dibuat larutan buffer pH 4,5 dengan cara mencampurkan asam
asetat 0,2 M 11,55 ml asetat dalam 1000 ml (larutan A), dan
larutan Na-Asetat 0,2 M 14,49 gram dalam 1000 ml (larutan B),
62
buffer pH 4,5 (28 ml larutan A + 22 ml larutan B diencerkan
sampai 100 ml) diukur pH sampai mencapai pH 4,5.
Preparasi Sampel Padat
- Sampel dihancurkan kemudian ditimbang sebanyak 20 g
- Dimasukkan dalam labu ukur 100 ml, kemudian diekstrak dengan
menambahkan pelarut HCl 1% dalam metanol sampai tanda
batas
- Diekstrak dan dihomogenkan, kemudian didiamkan selama 4 jam
dan disaring dengan menggunakan kertas waring wathmant no 1
- Filtrat disentrifuse selama 10 menit pada putaran angka 7 (3850
rpm)
Preparasi Sampel Cair
- Hasil preparasi sampel (filtrat) dipipet sebanyak 1 ml dan
dimasukkan dalam labu ukur 10 ml, kemudian diencerkan dengan
menggunakan larutan buffer pH 1 sampai tanda batas
- Diambil 1 ml larutan hasil preparasi dan dimasukkan dalam labu
ukur 10 ml, kemudian diencerkan dengan menggunakan larutan
buffer pH 4,5 sampai tanda batas
- Diukur absorbansi tiap sampel pada λ maks dan λ 700 nm
- Dihitung absorbansi sampel dengan rumus:
A = (A λmax pH 1 – A λ700 nm pH 1 ) - (A λmax pH 4,5 – A λ700 nm pH 4,5)
- Dihitung total antosianin:
Total antosianin (ppm) = (A x BM x FP x 1000) / ɛ x 1
Keterangan:
ɛ = koefisien absorbsivitas = 26900 L/mol dinyatakan
sebagai Cyanidin-3-glukoside
BM (Berat Molekul) Cyanidin-3-glukoside= 449,2
FP = Faktor Pengenceran
λmax = menunjukkan serapan paling tinggi pada sampel
λ700 nm = menunjukkan serapan Cyanidin-3-glukoside
63
4. Prosedur Analisa Aktivitas Antioksidan Metode DPPH (Tang et al,
2000)
- Pembuatan blanko dibuat dengan cara etanol diambil sebanyak 4 ml
kemudian dimasukkan dalam tabung rekaksi, kemudian ditambah
dengan 1 ml 0,2 mM larutan 1,1-diphenyl-2-pycrilhidrazil (DPPH),
kemudian diukur absorbansinya
- Sebanyak 4 ml sampel dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian
ditambahkan 1 ml DPPH 0,2 mM (tingkat berkurangnya warna dari
larutan menunjukkan efisinsi penangkapan radikal bebas)
- Didiamkan 30 menit dalam ruang tertutup, kemudian diukur
absorbansinya pada λ=517 nm
- Aktivitas scavenger radikal bebas dhitung sebagai persem inhibibisi
(berkurangnya warna DPPH dengan menggunakan persamaan:
Aktivitas penangkapan radikal bebas (%) = [ (A0 – A1/ A0) x
100]
Keterangan: A0 = Absorbansi kontrol
A1= Absorbansi sampel
5. Prosedur Analisa Total Flavonoid (Zhinshen et al., 1999)
Pembuatan Larutan Stock
- 10 mg Quercetin dilarutkan dengan etanol dalam labu ukur 10 ml
sampai tanda batas
- Diperoleh larutan quercetin konsentrasi 1000 ppm
- Dipipet masing-masing sebanyak 0: 2: 4: 6: 8: dan 10 ml ke
dalam labu ukur 10 ml
- Diencerkan dengan etanol hingga batas
- Diperoleh larutan stock konsentrasi 0: 200: 400: 600: 800: dan
1000 ppm
Pembuatan Kurva Standar
- Larutan stock konsentrasi 0: 200: 400: 600: 800: dan 1000 ppm
dipipet 1 ml ke dalam tabung reaksi
- Ditambahkan 4 ml etanol dan 0,3 ml NaNO2 5%
- Diinkubasi 5 menit pada suhu ruang
- Kemudian ditambahkan 0,3 ml AlCl3 10%
64
- Diinkubasi 6 menit pada suhu ruang
- Ditambahkan 2 ml NaOH 1 M dan 2,4 ml etanol
- Divortex dan diukur absorbansinya pada λ = 510 nm
- Diperoleh kurva hubungan absorbansi dengan konsentrasi
Pengujian Total Flavonoid pada Sampel
- Sampel masing-masing perlakuan dipipet 1 ml kemudian
dimasukkan ke dalam tabung reaksi
- Ditambahkan 4 ml etanol dan 0,3 ml NaNO2 5%
- Diinkubasi 5 menit pada suhu ruang
- Ditambahkan 0,3 ml AlCl3 10% kemudian diinkubasi 6 menit pada
suu ruang
- Ditambahkan 2 ml NaOH 1 M dan 2,4 ml etanol
- Kemudian masing-masing sampel divortex dan diukur
absorbansinya pada λ = 510 nm
- Diperoleh kurva hubungan absorbansi dengan konsentrasi
65
LAMPIRAN 3 HASIL ANALISA BAHAN BAKU TEPUNG AMPAS KECAP
1. Hasil Analisa Kadar Air Tepung Ampas Kecap
SampelBerat
CawanKosong
(g)
Berat Cawan+ Sampel
(awal)(Gram)
BeratSampel
Awal(gram)
BeratSampelAkhir
(gram)
BeratCawanAkhir
KadarAir(%)
TAK 1 41,425 46,432 5,007 4,532 45,957 9,49TAK 2 42,534 47,541 5,006 4,598 47,132 8,16TAK 3 35,422 40,427 5,004 4,498 39,921 10,11
Rerata 9,25
2. Hasil Analisa Total Flavonoid Tepung Ampas Kecap
Sampel
Ulangan
RerataRerataTotal
Flavonoid(ppm)
RerataTotal
Flavonoid(mg QE/Kg
sampel)I II II
Tepung AmpasKecap 1 0,276 0,285 0,279 0,28 6691,43 805,313
Tepung AmpasKecap 2 0,275 0,269 0,265 0,27 6396,19 769,782
Tepung AmpasKecap 3 0,284 0,297 0,291 0,29 6996,19 841,992
Rerata 15,15
3. Hasil Analisa Aktivitas Total Antosianin Tepung Ampas Kecap
Sampel AbsorbansipH 1
AbsorbansipH 4,5
Absorbansiakhir
Antosianinppm
Antosianin(mg/Kg)
TAK 1 0,090 0,039 0,051 851,64 102,49TAK 2 0,101 0,047 0,054 901,74 98,90TAK 3 0,099 0,047 0,052 868,34 95,14
Rerata 98,84
4. Hasil Analisa Aktivitas Antioksidan Tepung Ampas Kecap
Sampel Absorbansi Blanko Rerata % InhibisiTAK 1 0,391 0,398 0,397 0,482 0,395 17,98TAK 2 0,389 0,387 0,388 0,482 0,388 19,50TAK 3 0,394 0,396 0,395 0,482 0,395 18,05
Rerata 18,51
66
LAMPIRAN 4 HASIL ANALISA RENDEMEN EKSTRAK AMPAS KECAP
- Ulangan I
Sampel BeratLabu
BeratSetelah
EvapBerat
EkstrakBeratAwal
SampelRendemen
(%)
R1T1 166,201 168,608 2,407 20 12,035R1T2 166,201 168,395 2,194 20 10,968R1T3 166,190 168,986 2,796 20 13,981R2T1 166,201 168,759 2,557 20 12,787R2T2 166,201 169,355 3,154 20 15,771R2T3 166,190 169,226 3,036 20 15,181R3T1 166,201 169,557 3,355 20 16,777R3T2 166,201 169,572 3,371 20 16,855R3T3 166,190 169,447 3,256 20 16,282
- Ulangan II
Sampel BeratLabu
BeratSetelah
EvapBerat
EkstrakBeratAwal
SampelRendemen
(%)
R1T1 166,181 168,542 2,361 20 11,807R1T2 166,181 168,480 2,299 20 11,496R1T3 166,181 168,851 2,670 20 13,352R2T1 166,181 169,473 3,292 20 16,462R2T2 166,181 169,306 3,125 20 15,626R2T3 166,194 169,551 3,357 20 16,785R3T1 166,194 169,323 3,130 20 15,648R3T2 166,194 169,241 3,047 20 15,237R3T3 166,194 169,764 3,571 20 17,853
- Ulangan III
Sampel BeratLabu
BeratSetelah
EvapBerat
EkstrakBeratAwal
SampelRendemen
R1T1 166,188 168,205 2,017 20 10,085R1T2 166,188 168,857 2,669 20 13,345R1T3 166,188 168,888 2,700 20 13,501R2T1 166,188 168,983 2,795 20 13,973R2T2 166,188 168,889 2,701 20 13,506R2T3 166,188 169,551 3,364 20 16,818R3T1 166,188 169,274 3,086 20 15,432R3T2 166,188 169,481 3,293 20 16,466R3T3 166,188 169,587 3,399 20 16,994
67
- Rumus Perhitungan Rendemena. Berat Ekstrak = Berat Setelah Evap – Berat Labu
= 168,608 – 166,201
= 2,407
b. Rendemen = (Berat Ekstrak/ Berat Sampel) x 100%
= (2,407/ 20 gram) x 100%
= 12,035 %
- Perhitungan Rendemen Ulangan I, II, dan III
SampelUlangan
Total Rerata (%)I II III
R1T1 12,035 11,807 10,084 33,92 11,30
R1T2 10,968 11,496 13,345 35,81 11,93
R1T3 13,980 13,352 13,501 40,83 13,61
R2T1 12,787 16,462 13,973 43,22 14,40
R2T2 15,771 15,626 13,505 44,90 14,96
R2T3 15,181 16,784 16,818 48,78 16,26
R3T1 16,777 15,647 15,431 47,85 15,95
R3T2 16,854 15,236 16,466 48,55 16,18
R3T3 16,282 17,852 16,993 51,12 17,04
- Tabel Dua Arah
Perlakuan 15 Menit 20 Menit 25 Menit R
1:3 (b/v0 33,926 35,809 40,833 110,57
1:5 (b/v) 43,222 44,902 48,783 136,90
1:7 (b/v) 47,856 48,557 51,128 147,54
T 125,00 129,27 140,74
68
- Analisa Ragam
SumberVariasi
db JK KT F HitungF Tabel
Notasi5% 1%
Rata-Rata 1 5779,29 5779,29
Kelompok 2 1,133 0,567 0,45 3,63 6,22 TN
Perlakuan 8 96,412 12,051 9,55 2,59 3,89 **
R 2 80,510 40,255 31,91 3,63 6,22 **
T 2 14,728 7,364 5,83 3,63 6,22 **
RxT 4 1,174 0,293 0,23 3,01 4,77 TN
Galat 16 20,184 1,262
Total 27 117,730
- Uji BNT Faktor Rasio Bahan:Pelarut
FAKTOR R Data BNT (α=0,05) Notasi
Rasio Bahan:Pelarut 1:3 12,28
1,12
a
Rasio Bahan:Pelarut 1:5 15,21 b
Rasio Bahan:Pelarut 1:7 16,39 c
- Uji BNT Faktor Waktu Ekstraksi
FAKTOR T Data BNT (α=0,05) Notasi
15 Menit 13,89
1,12
a
20 Menit 14,36 a
25 Menit 15,63 b
69
LAMPIRAN 5 HASIL ANALISA TOTAL FLAVONOID EKSTRAK AMPASKECAP
- Penetapan Kurva Standar
Konsentrasi (ppm) Absorbansi
1. 0 0,0192. 200 0,1973. 400 0,3414. 600 0,5225. 800 0,6526. 1000 0,730
- Hasil Analisa Total Flavonoid (ppm)
SampelKadar Flavonoid (ppm) Total Flavonoid (ppm)I II III I II III
R1T1 246,952 246,952 230,762 4939,048 4939,048 4615,238R1T2 156,476 293,619 284,571 3129,524 5872,381 5691,429R1T3 273,619 436,952 466,000 5472,381 8739,048 9320,000R2T1 286,952 93,619 110,286 5739,048 1872,381 2205,714R2T2 457,905 439,333 281,714 9158,095 8786,667 5634,286R2T3 828,381 817,429 888,381 16567,619 16348,571 17767,619R3T1 189,333 197,429 349,333 3786,667 3948,571 6986,667R3T2 748,381 946,476 1047,429 14967,619 18929,524 20948,571R3T3 1580,762 1565,048 1584,095 31615,238 31300,952 31681,905
- Rumus Perhitungan Total Flavonoid (ppm)Kadar Flavonoid:
Y= 0,0007x + 0,0458 Y= hasil absorbansi
X= (Y-0,0458)/ 0,0007
69
LAMPIRAN 5 HASIL ANALISA TOTAL FLAVONOID EKSTRAK AMPASKECAP
- Penetapan Kurva Standar
Konsentrasi (ppm) Absorbansi
1. 0 0,0192. 200 0,1973. 400 0,3414. 600 0,5225. 800 0,6526. 1000 0,730
- Hasil Analisa Total Flavonoid (ppm)
SampelKadar Flavonoid (ppm) Total Flavonoid (ppm)I II III I II III
R1T1 246,952 246,952 230,762 4939,048 4939,048 4615,238R1T2 156,476 293,619 284,571 3129,524 5872,381 5691,429R1T3 273,619 436,952 466,000 5472,381 8739,048 9320,000R2T1 286,952 93,619 110,286 5739,048 1872,381 2205,714R2T2 457,905 439,333 281,714 9158,095 8786,667 5634,286R2T3 828,381 817,429 888,381 16567,619 16348,571 17767,619R3T1 189,333 197,429 349,333 3786,667 3948,571 6986,667R3T2 748,381 946,476 1047,429 14967,619 18929,524 20948,571R3T3 1580,762 1565,048 1584,095 31615,238 31300,952 31681,905
- Rumus Perhitungan Total Flavonoid (ppm)Kadar Flavonoid:
Y= 0,0007x + 0,0458 Y= hasil absorbansi
X= (Y-0,0458)/ 0,0007
69
LAMPIRAN 5 HASIL ANALISA TOTAL FLAVONOID EKSTRAK AMPASKECAP
- Penetapan Kurva Standar
Konsentrasi (ppm) Absorbansi
1. 0 0,0192. 200 0,1973. 400 0,3414. 600 0,5225. 800 0,6526. 1000 0,730
- Hasil Analisa Total Flavonoid (ppm)
SampelKadar Flavonoid (ppm) Total Flavonoid (ppm)I II III I II III
R1T1 246,952 246,952 230,762 4939,048 4939,048 4615,238R1T2 156,476 293,619 284,571 3129,524 5872,381 5691,429R1T3 273,619 436,952 466,000 5472,381 8739,048 9320,000R2T1 286,952 93,619 110,286 5739,048 1872,381 2205,714R2T2 457,905 439,333 281,714 9158,095 8786,667 5634,286R2T3 828,381 817,429 888,381 16567,619 16348,571 17767,619R3T1 189,333 197,429 349,333 3786,667 3948,571 6986,667R3T2 748,381 946,476 1047,429 14967,619 18929,524 20948,571R3T3 1580,762 1565,048 1584,095 31615,238 31300,952 31681,905
- Rumus Perhitungan Total Flavonoid (ppm)Kadar Flavonoid:
Y= 0,0007x + 0,0458 Y= hasil absorbansi
X= (Y-0,0458)/ 0,0007
70
= (0,219-0,0458)/0,0007
= 246,952 ppm
Total Flavonoid:
Faktor Pengenceran= 50000 ppm
= 50000 mg/L
= 50 mg/mL
= 0,05 gram/mL = 1/20
Jadi Faktor Pengenceran yang digunakan adalah 20X
Total Flavonoid (dalam ekstrak) = Kadar Falvonoid x Faktor Pengenceran
= 246,952 x 20
= 4939,048 ppm = 4939,048 mg QE/Kg
- Hasil Analisa Total Flavonoid (mg QE/Kg sampel)
Sampel Ulangan I Ulangan II UlanganIII
Rerata TotalFlavonoid(mg QE/Kg
sampel)
Rerata TotalFlavonoid(mg QE/gsampel)
R1T1 594,414 583,055 465,447 547,639 0,548R1T2 343,309 675,030 759,521 592,620 0,593R1T3 765,039 1166,663 1258,200 1063,301 1,063R2T1 733,737 308,194 308,249 450,060 0,450R2T2 1444,232 1372,917 760,910 1192,686 1,193R2T3 2514,965 2744,108 2988,514 2749,195 2,749R3T1 635,213 617,951 1078,043 777,069 0,777R3T2 2522,792 2883,913 3449,182 2951,962 2,952R3T3 5146,961 5588,785 5384,340 5373,362 5,373
- Rumus Perhitungan Total Flavonoid (mg QE/Kg sampel)Rendemen ekstrak R1T1 = 2,407 gram
Sampel yang diekstrak = 20 gram
Total Flavonoid (dalam sampel) = (Total Flavonoid dalam ekstrak) x
Rendemen Ekstrak) / Berat Sampel
= (4939,0448 mg QE/Kg x 2,407 gram) / 20
Gram
= 594,414 mg QE/Kg sampel
= 0,594 mg QE/gram sampel
71
- Tabel Dua Arah
Perlakuan 15 menit 20 menit 25 menit R1:3 (b/v) 1642,916 1777,860 3189,902 6610,6781:5 (b/v) 1350,180 3578,059 8247,586 13175,8241:7 (b/v) 2331,207 8855,887 16120,086 27307,180
T 5324,303 14211,806 27557,573
- Analisa Ragam
SumberVariasi db JK KT F HITUNG
F TabelKet5% 1%
Rata-Rata 1 82141292,01 82141292,01
Kelompok 2 180296,96 90148,48 1,15 3,63 6,226 TNPerlakuan 8 65326047,69 8165755,96 104,58 2,59 3,89 *
R 2 24857096,68 12428548,34 159,18 3,63 6,226 *T 2 27830204,17 13915102,09 178,22 3,63 6,226 *
RxT 4 691778076 x10^6
172944519 x10^6 2215015359,72 3,01 4,773 *
Galat 16 1249251,97 78078,25Total 27 66755596,63
- Uji Lanjut DMRT
RasioBahan:Pelarut
WaktuEkstraksi
(Menit)
Rerata TotalFlavonoid (mgQE/Kg sampel)
Nilai DMRT(α=0,05)
Notasi
1:3 (b/v)
15 0,548 1,774 a20 0,593 1,860 a25 1,063 1,914 ab
1:5 (b/v)
15 0,450 1,951 a20 1,193 1,978 ab25 2,749 1,997 b
1:7 (b/v)
15 0,777 2,013 a20 2,952 2,025 b25 5,373 2,033 c
72
LAMPIRAN 6 HASIL ANALISA TOTAL ANTOSIANIN EKSTRAK AMPASKECAP
- Hasil Analisa Total Antosianin (dalam pengujian 1000 ppm)
SampelUlangan I
(ppm)Ulangan II
(ppm)Ulangan III
(ppm)Rerata(ppm)
R1T1 1886,974 1848,010 1864,709 1758,949
R1T2 1809,046 1836,877 1541,864 1751,527
R1T3 1942,637 2087,361 1608,659 1621,647
R2T1 1436,104 1118,825 834,944 1250,561
R2T2 1213,452 873,908 1196,753 1152,223
R2T3 1558,563 1135,524 1369,309 1113,259
R3T1 1141,090 1063,162 645,690 1052,030
R3T2 1241,284 517,665 951,836 983,379
R3T3 1296,947 862,776 1191,187 1079,861
- Hasil Analisa Total Antosianin (mg/Kg sampel)
SampelUlangan Rerata
(mg/Kg)Rerata(mg/g
sampel)I (mg/Kg) II (mg/Kg) III (mg/Kg)R1T1 227,097 218,195 188,047 211,11 0,211
R1T2 198,416 211,167 205,769 205,11 0,205
R1T3 271,590 278,704 217,185 255,82 0,255
R2T1 183,635 184,181 116,671 161,49 0,161
R2T2 191,374 136,557 161,628 163,18 0,163
R2T3 236,605 190,592 230,290 219,16 0,219
R3T1 191,441 166,358 22,333 126,71 0,126
R3T2 209,212 78,874 156,734 148,27 0,148
R3T3 211,175 154,027 202,424 189,21 0,189
- Rumus Perhitungan Total Antosianin (ppm)Faktor Pengenceran = 1000 ppm
= 1000 mg/L
= 1 mg/mL
= 0,001 gram/mL = 1/1000
Jadi, faktor pengenceran yang digunakan adalah 1000 x
73
Keterangan:
ɛ = koefisien absorbsivitas
= 26900 L/mol dinyatakan sebagai Cyanidin-3-glukoside
BM (Berat Molekul) Cyanidin-3-glukoside = 449,2
FP = Faktor Pengenceran
λmax = menunjukkan serapan paling tinggi pada sampel
λ700 nm = menunjukkan serapan Cyanidin-3-glukoside
A = (A λmax pH 1 – A λ700 nm pH 1 ) - (A λmax pH 4,5 – A λ700 nm pH 4,5)
= 0,113 (pada perlakuan R1T1 ulangan I)
Total antosianin (dalam ekstrak) = (A x BM x FP x 1000) / ɛ x 1
= (0,113 x 449,2 x 1000 x 1000) / 26900 x 1
= 1886,974 ppm = 1886,974 mg/Kg
- Rumus Perhitungan Total Antosianin (mg/Kg sampel)Rendemen ekstrak R1T1 ulangan I = 2,407 gram
Berat sampel yang diekstrak = 20 gram
Total antosianin (dalam sampel) = (Total antosianin (ekstrak)) x Rendemen
Ekstrak) / Berat Sampel Yang diekstrak
= (1886,974 mg/Kg x 2,407 gram) / 20 gram
= 227,097 mg/Kg sampel
= 0,227 mg/g sampel
- Tabel Dua Arah
Perlakuan 15 menit 20 menit 25 menit R
1:3 (b/v) 633,338 615,353 767,480 2016,17
1:5 (b/v) 484,487 489,558 657,488 1631,53
1:7 (b/v) 380,132 444,820 567,627 1392,58
T 1497,95 1549,73 1992,59
74
- Analisa Ragam
SumberVariasi
Db JK KTF
HitungF Tabel
Notasi5% 1%
Rata-Rata 1 940905,594 940905,594
Kelompok 2 10404,130 5202,065 3,23 3,63 6,22 TN
Perlakuan 8 39111,841 4888,980 3,043 2,59 3,89 *
R 2 21996,761 10998,380 6,84 3,63 6,22 *
T 2 16424,969 8212,485 5,11 3,63 6,22 *
RxT 4 690,111 172,528 0,10 3,01 4,77 TN
Galat 16 25697,942 1606,121
Total 27 75213,913
- Uji BNT Faktor Rasio Bahan:Pelarut
Faktor R Data BNT (α=0,05) Notasi
1:03 224,01
40,05
a
1:05 181,28 b
1:07 154,73 B
- Uji BNT Faktor Waktu Ekstraksi
Faktor T Data BNT(α=0,05) Notasi
15 Menit 166,44
40,05
B
20 Menit 172,19 B
25 Menit 221,40 A
75
LAMPIRAN 7 HASIL ANALISA AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK AMPASKECAP
SampelUlangan
Total Rerata (%)I II III
R1T1 32,496 33,572 34,433 100,50 33,50
R1T2 36,155 35,007 33,429 104,59 34,86
R1T3 36,801 33,859 35,438 106,09 35,36
R2T1 34,577 33,429 33,429 101,43 33,81
R2T2 34,505 34,720 35,222 104,44 34,81
R2T3 37,231 36,442 36,944 110,61 36,87
R3T1 33,572 35,294 35,509 104,37 34,79
R3T2 35,438 36,585 36,514 108,53 36,17
R3T3 36,944 37,805 37,733 112,48 37,49
- Tabel Dua Arah
Perlakuan 15 menit 20 menit 25 menit R
1:3 (b/v) 100,502 104,591 106,098 311,19
1:5 (b/v) 101,435 104,448 110,617 316,50
1:7 (b/v) 104,376 108,537 112,482 325,39
T 306,31 317,57 329,19
- Analisa Ragam
SumberVariasi
Db JK KTF
HitungF Tabel
Notasi5% 1%
Rata-Rata 1 33643,346 33643,346
Kelompok 2 0,209 0,104 0,11 3,63 6,22 TN
Perlakuan 8 42,595 5,324 5,77 2,59 3,89 *
R 2 11,446 5,723 6,20 3,63 6,22 *
T 2 29,095 14,548 15,77 3,63 6,22 *
RxT 4 2,053 0,513 0,55 3,01 4,77 TN
Galat 16 14,760 0,922
Total 27 57,563
76
- Uji BNT Faktor Rasio Bahan:Pelarut
FAKTOR R Data BNT (α = 0,05) Notasi
1:3 (b/v) 34,57
0,96
a
1:5 (b/v) 35,16 a
1:7 (b/v) 36,15 b
- Uji BNT Faktor Waktu Ekstraksi
FAKTOR T Data BNT (α = 0,05) Notasi
15 menit 34,03
0,96
a
20 menit 35,28 b
25 menit 36,57 c
77
LAMPIRAN 8. PENENTUAN PERLAKUAN TERBAIK METODE ZELENY
ParameterKelompok
R1T1 R1T2 R1T3 R2T1 R2T2 R2T3 R3T1 R3T2 R3T3
Antosianin 633,338 615,353 767,480 484,487 489,558 657,488 457,439 444,820 567,627Flavonoid 1642,916 1777,860 3189,902 1350,180 3578,059 8247,586 2331,207 8855,887 16120,090%inhibisi 112,482 108,537 101,076 106,528 101,435 100,502 104,663 104,376 950,215Rendemen 33,927 35,810 40,834 43,223 44,903 48,784 47,856 48,558 51,129DK antosianin 0,825 0,802 1,000 0,631 0,638 0,857 0,596 0,580 0,740DKFlavonoid 0,102 0,110 0,198 0,084 0,222 0,512 0,145 0,549 1,000DK %inhibisi 0,118 0,114 0,106 0,112 0,107 0,106 0,110 0,110 1,000DK Rendemen 0,664 0,700 0,799 0,845 0,878 0,954 0,936 0,950 1,0001-DK antosianin 0,175 0,198 0,000 0,369 0,362 0,143 0,404 0,420 0,2601-DK Flavonoid 0,898 0,890 0,802 0,916 0,778 0,488 0,855 0,451 0,0001-DK %inhibisi 0,882 0,886 0,894 0,888 0,893 0,894 0,890 0,890 0,0001-DK Rendemen 0,336 0,300 0,201 0,155 0,122 0,046 0,064 0,050 0,000(1-DK)^2 antosianin 0,031 0,039 0,000 0,136 0,131 0,021 0,163 0,177 0,068(1-DK)^2 Flavonoid 0,807 0,792 0,643 0,840 0,605 0,239 0,732 0,203 0,000(1-DK)^2 %inhibisi 0,777 0,785 0,799 0,788 0,798 0,800 0,792 0,792 0,000(1-DK)^2 Rendemen 0,113 0,090 0,041 0,024 0,015 0,002 0,004 0,003 0,000DK*lamda antosianin 0,206 0,200 0,250 0,158 0,159 0,214 0,149 0,145 0,185DK*lamda Flavonoid 0,025 0,028 0,049 0,021 0,055 0,036 0,036 0,137 0,250DK*lamda %inhibisi 0,030 0,029 0,027 0,028 0,027 0,026 0,028 0,027 0,250DK*lamda Rendemen 0,166 0,175 0,200 0,211 0,220 0,239 0,234 0,237 0,250lamda^2*((1-DK)^2)antosianin 0,002 0,002 0,000 0,008 0,008 0,001 0,010 0,011 0,004
lamda^2*((1-DK)^2) 0,050 0,049 0,040 0,052 0,038 0,015 0,046 0,013 0,000
78
Flavonoidlamda^2*((1-DK)^2)%inhibisi 0,049 0,049 0,050 0,049 0,050 0,050 0,049 0,050 0,000
lamda^2*((1-DK)^2)Rendemen 0,007 0,006 0,003 0,001 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000
lamda*(1-DK) antosianin 0,044 0,050 0,000 0,092 0,091 0,036 0,101 0,105 0,065lamda*(1-DK) Flavonoid 0,000 0,222 0,201 0,229 0,195 0,122 0,214 0,113 0,000lamda*(1-DK) Inhibisi 0,000 0,221 0,223 0,222 0,223 0,224 0,222 0,223 0,000lamda*(1-DK) Rendemen 0,000 0,075 0,050 0,039 0,030 0,011 0,016 0,013 0,000
0,427 0,432 0,526 0,418 0,461 0,515 0,447 0,547 0,935L1 0,573 0,568 0,474 0,582 0,539 0,485 0,553 0,453 0,065L2 0,108 0,107 0,093 0,112 0,097 0,066 0,106 0,073 0,004Lmaksimal 0,044 0,568 0,474 0,582 0,539 0,393 0,553 0,453 0,065
0,724 1,243 1,041 1,275 1,174 0,944 1,212 0,979 0,134
79
LAMPIRAN 9. DOKUMENTASI KEGIATAN
Ampas Kecap Kering Penghalusan Ampas Kecap Pengayakan Ampas Kecap
Ekstraksi denganUltrasonic Bath
Penyaringan HasilEkstraksi
Evaporasi HasilEkstrak
Hasil Ekstrak AmpasKecap Pekat
Uji Total FlavonoidEkstrak Ampas Kecap
Reagen untuk Analisa
Uji AktivitasAntioksidan
