34
KARAKTERISASI MOLEKULER PADI TRANSGENIK DENGAN BEBERAPA METODE ISOLASI DNA RIZKI AYU KARTINI DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

KARAKTERISASI MOLEKULER PADI TRANSGENIK …repository.ipb.ac.id/bitstream/handle/123456789/58980/G12rak1.pdf · dan segenap staf di Laboratorium Biologi Molekuler, ... Seminar kesehatan

  • Upload
    leminh

  • View
    235

  • Download
    10

Embed Size (px)

Citation preview

KARAKTERISASI MOLEKULER PADI TRANSGENIK

DENGAN BEBERAPA METODE ISOLASI DNA

RIZKI AYU KARTINI

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

ABSTRAK

RIZKI AYU KARTINI. Karakterisasi Molekuler Padi Transgenik dengan

Beberapa Metode Isolasi DNA. Dibimbing oleh EMAN KUSTAMAN dan

KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO.

Tanaman padi merupakan penghasil beras sehingga menjadi salah satu

komoditas pangan utama. Ukuran butir merupakan kualitas yang sangat penting

dalam beras. Salah satu usaha yang dilakukan dalam penelitian guna

meningkatkan produksi padi adalah melalui perakitan tanaman transgenik yang

disisipkan gen Os-GS3 (Oryza sativa Grain Size 3). Materi yang digunakan dalam

penelitian ini adalah padi varietas T-309. Padi yang telah disisipi gen Os-GS3

ditanam dan dianalisis keberadaan gennya melalui PCR serta karakterisasi

molekulernya melalui hibridisasi Southern. Metode isolasi DNA yang digunakan

dalam penelitian ini adalah skala cepat, skala miniprep, dan skala besar, sehingga

diperoleh metode yang efisien dari segi waktu penyelesaian dan sumberdaya yang

digunakan untuk PCR dan hibridisasi Southern. Analisis PCR dari ketiga metode

menghasilkan ukuran pita yang sama, yaitu 500 bp. Pengujian hibridisasi

Southern menggunakan metode skala besar menghasilkan pita atau salinan gen,

sedangkan pada metode miniprep tidak ada. Metode skala cepat adalah metode

paling efisien untuk analisis PCR, sedangkan metode skala besar paling efisien

untuk hibridisasi Southern. Hasil pengujian pada pembungkaman ekspresi gen Os-

GS3 dengan antisense RNA berhasil ketika 4 transgen yang terintegrasi ke dalam

genom tanaman.

Kata kunci: Padi, Isolasi DNA, Hibridisasi Southern.

ABSTRACT

RIZKI AYU KARTINI. Molecular Characterization of Transgenic Rice Plants

with of DNA Isolated using Multiple Methods. Under the direction of EMAN

KUSTAMAN and KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO.

Rice is a major food commodity for agroindustrial country. Grain size is a

major determinant of grain quality. One attempt that has been made in research to

increase rice production is assembly of transgenic plants inserted with Os-GS3

(Oryza sativa Grain Size 3) gene. The material used in this study is cultivar Taipei

309. Rice plants that have been inserted with Os-GS3 gene were grown and the

presence of the genes was analyzed through molecular characterization by PCR

and Southern hybridization. DNA isolation methods used in this study were the

simple method, miniprep scale, and large scale. They were compared to obtain the

most efficient method in terms of turnaround time and resources used for PCR

and Southern hybridization. PCR analysis of the three methods produced bands of

the same size, in that 500 bp. Southern hybridization test of the DNA isolated

using the large scale method produced bands or copy genes, where as that isolated

using miniprep method did not produce band. The fast scale method is the most

efficient DNA isolation method for PCR analysis, where as the large scale method

is the most efficient DNA isolation method for Southern hybridization. The results

in the silencing of gene expression of Os-GS3 with antisense RNA was successful

when 4 transgenes integrated into the plant genome.

Keyword: Rice, DNA isolation, Hybridization Southern.

KARAKTERISASI MOLEKULER PADI TRANSGENIK

DENGAN BEBERAPA METODE ISOLASI DNA

RIZKI AYU KARTINI

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

Judul Skripsi : Karakterisasi Molekuler Padi Transgenik dengan Beberapa

Metode Isolasi DNA

Nama : Rizki Ayu Kartini

NIM : G84080061

Disetujui

Komisi Pembimbing

Ir. H. Eman Kustaman Dr. Kurniawan Rudi Trijatmiko

Ketua Anggota

Diketahui

Dr. I Made Artika, M. App. Sc

Ketua Departemen Biokimia

Tanggal Lulus :

PRAKATA

Syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah

melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan

penelitian dan penulisan skripsi ini dengan baik yang berjudul “Karakterisasi

Molekuler Padi Transgenik dengan Beberapa Metode Isolasi DNA”. Kegiatan

penelitian yang merupakan salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada

Departemen Biokimia ini dilakukan dari bulan Februari 2012 sampai dengan Juli

2012 di Laboratorium Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi

dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Jalan Tentara Pelajar 3A, Bogor, Jawa

Barat.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah

membantu dalam penyelesaian penelitian ini baik secara langsung maupun tidak

langsung. Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Ir. H. Eman Kustaman

selaku ketua pembimbing dan Dr. Kurniawan Rudi Trijatmiko selaku anggota

pembimbing yang telah memberikan bimbingan, motivasi, dan masukan.

Terimakasih penulis persembahkan kepada kedua orang tua tercinta, kakak,

abang, M. Yuda Ramdani atas segala kasih sayang, perhatian, doa dan

dukungannya dalam setiap langkah penyusunan karya ilmiah ini baik semangat

maupun motivasi untuk selalu berusaha agar menjadi lebih baik. Tidak lupa pula

penulis sampaikan ucapan terima kasih kepada mba Dewi, kak Falin, kak Indra,

dan segenap staf di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian atas peran dan

kerjasamanya yang telah banyak membantu dalam menyelesaikan penelitian ini.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada rekan-rekan selama

penelitian Riris, Ihsan, Naso, Restu, Andi, mas Nazar atas motivasi dan saran

yang diberikan kepada penulis. Selain itu penulis ucapkan terimakasih kepada

teman-teman seperjuangan Biokimia 45, Kenyar, Silvi, Yoan, Titus, Devid, Edo,

dan juga sahabat-sahabat yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu atas

segala bantuan, masukan, kritik, dan motivasi yang diberikan.

Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini jauh dari kesempurnanaan. Untuk

itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun untuk perbaikan di

masa mendatang. Akhir kata penulis berharap agar karya ilmiah ini dapat

bermanfaat bagi semua pihak.

Bogor, Agustus 2012

Rizki Ayu Kartini

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta Timur pada tanggal 21 April 1990 dari ayah

bernama Freddy Latief dan ibu bernama Marni Lusia. Penulis merupakan anak

keempat dari empat bersaudara.

Pendidikan penulis dimulai dari TK At-Taqwa dan Sekolah Dasar di SD

negeri Harapan Jaya XIII kemudian melanjutkan pendidikan ke jenjang Sekolah

Menengah Pertama di SMP Negeri 5 Bekasi. Tahun 2008 penulis menyelesaikan

pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 4 Bekasi dan pada tahun

yang sama lolos seleksi masuk dan melanjutkan studi di Institut Pertanian Bogor

melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Di IPB penulis mengambil

mayor Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Selama mengikuti perkuliahan penulis pernah menjadi asisten praktikum

mata kuliah Biokimia Umum untuk mahasiswa S1 Departemen Biologi tahun

ajaran 2011/2012. Penulis juga aktif dalam kegiatan organisasi kemahasiswaan di

IPB dan organisasi mahasiswa daerah, diantaranya penulis pernah aktif sebagai

staf keilmuan Bioanalisis Community Research and Educatioan of Biochemistry

periode 2010/2011, dan staf Himpunan Keluarga Mahasiswa Bekasi di Bogor

selama dua periode tahun 2009-2011.

Penulis juga pernah aktif dalam beberapa kepanitiaan seperti panitia Green

Festival IPB 2009, Masa perkenalan Kampus Mahasiswa Biokimia tahun 2009,

Pesta Sains Nasional 2009 dan 2010, Biokimia Expo 2010, Seminar kesehatan

2011, dan beberapa kepanitiaan lainnya. Penulis melakukan Praktik Lapang di

Laboratorium Mikrobiologi PT. Frisian Flag Indonesia, Jalan Raya Bogor Km 5,

Pasar Rebo, Jakarta Timur dengan judul Analisis Cemaran Mikroba pada Susu

Bubuk dengan Metode Enumerasi dan Deteksi. Penulis dalam bidang karya ilmiah

pernah mendapat hibah dana bersaing dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi

(DIKTI) dalam Pekan Kreativitas Mahasiswa (PKM) untuk kategori Bidang

Gagasan tertulis pada tahun 2009 dan Bidang Penelitian pada tahun 2010.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ………………………………………………………... x

DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………... xi

DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………... xii

PENDAHULUAN ………………………………………………………... 1

TINJAUAN PUSTAKA ………………………………………………….. 2

Tanaman Padi………………………………………………………… 2

Isolasi DNA…………………………………………………………... 3

Gen Os-GS3…………………………………………………………... 3

Polymerase Chain Reaction (PCR)…………………………………... 4

Hibridisasi Southern………………………………………………….. 4

Elektroforesis Gel Agarosa…………………………………………… 5

BAHAN DAN METODE …………………...……………………………. 6

Bahan dan Alat……………………………………………………….. 6

Metode Penelitian …......…..…………………...…………………….. 6

HASIL DAN PEMBAHASAN ...………………………………….……... 10

DNA Hasil Isolasi Menggunakan Metode Cepat, Miniprep, dan Skala

Besar…………………………………………………………………..

10

DNA Hasil Polymerase Chain Reaction Menggunakan Metode

Cepat, Miniprep, dan Skala Besar…………………………………….

11

Karakterisasi Molekuler Berdasarkan Hibridisasi Southern ……… 12

Karakterisasi Molekuler dengan Fenotipe Tanaman Padi Transgenik

Kultivar Taipei 309 …………………………………………………

14

SIMPULAN DAN SARAN ………………………………………………. 15

Simpulan ……………………………………………………………... 15

Saran …………………………………………………………………. 15

DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………….. 15

LAMPIRAN ……………………………………………………………… 18

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Perbedaan morfologi dan fisiologi tanaman padi subspecies Indica,

Japonica, dan Javanica…………………………………. …………………

3

2 Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA daun padi ………….. 11

3 Hasil analisis dan pola integrasi gen sisipan Os-GS3) pada generasi

pertama (T0) pada kultivar Taipe 309 menggunakan primer hpt untuk

PCR dan pelacak hpt untuk hibridisasi Southern …………………………

13

4 Jumlah salinan gen menggunakan DNA yang diisolasi metode skala besar

dengan fenotipe tanaman padi……………………………………………..

14

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Perbedaan butir padi Indica dan Japonica ……………………………….... 3

2 Proses umum PCR ………………..……………………………………….. 4

3 Susunan perangkat blotting Membran …………………………………… 10

4 Elektroforegram hasil PCR menggunakan primer Hpt……………………. 11

5 Hasil hibridisasi Southern…………………………………………………. 13

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Tahapan penelitian ………………………………………………...…..... 19

2 DNA genom yang telah di potong enzim BamHI ………………………. 20

3 DNA pelacak yang telah diberi label DIG-11-dUTP …………………… 20

4 DNA Genom setelah proses transfer ke membran ….…………………... 20

5 Tabel jumlah salinan gen dengan fenotipe tanaman padi………..……..... 21

6 Tabel jumlah salinan gen dengan fenotipe tanaman padi………………... 22

7 Komposisi larutan hibridisasi Southern………………………………….. 24

1

PENDAHULUAN

Tanaman padi (Oryza sativa L.)

merupakan penghasil beras sehingga menjadi

salah satu komoditas pangan utama dan saat

ini hingga beberapa tahun mendatang, beras

tetap menjadi sumber utama gizi dan energi

bagi lebih dari 90% penduduk Indonesia (BPS

2011). Oleh karena itu, produksi beras

nasional harus ditingkatkan untuk memenuhi

kebutuhan pangan nasional. Beberapa langkah

untuk meningkatkan produksi pangan dapat

diusahakan melalui intensifikasi,

ekstensifikasi, dan diversifikasi (Yuniati

2004). Salah satu cara intensifikasi pertanian

dapat dilakukan melalui perbaikan genetika

tanaman dengan pendekatan bioteknologi atau

teknologi molekuler untuk meningkatkan

produktivitas tanaman padi. Bioteknologi atau

teknologi molekuler memiliki peranan penting

dalam menghasilkan kultivar dengan sifat

unggul baru (Soedarini & Patricia 2006).

Beberapa varietas baru dapat direkayasa

melalui transfer gen dari organisme lain ke

dalam tanaman padi, sehingga dihasilkan padi

transgenik yang memiliki sifat unggul.

Ukuran butir merupakan penentu utama

dari bobot biji. Dalam aplikasi pemuliaan,

ukuran butir biasanya dievaluasi oleh bobot

biji, yang berhubungan positif dengan

beberapa karakter termasuk panjang, lebar,

dan ketebalan butiran biji. Ukuran butir juga

merupakan sifat kualitas yang sangat penting

dalam beras. Dengan demikian, pemahaman

dasar genetik dan molekuler ukuran biji

sangat penting bagi program perbaikan beras.

Salah satu usaha yang dilakukan dalam

penelitian guna meningkatkan produksi padi

adalah melalui perakitan tanaman transgenik

yang disisipi gen antisense Os-GS3 (Oryza

sativa Grain Size 3) (Jiang et al. 2005; Fan et

al. 2006).

Gen merupakan salah satu komponen

penting untuk riset biologi molekuler dan

pengembangan bioteknologi. Usaha untuk

memahami ataupun memodifikasi berbagai

proses biologi pada tingkat molekuler,

memerlukan tersedianya gen-gen yang terlibat

di dalam proses tersebut termasuk informasi

yang terkait dengan gen-gen tersebut.

Identifikasi dan karakterisasi gen seringkali

diperlukan dalam berbagai percobaan

molekuler antara lain isolasi ataupun

mempelajari ekspresinya (Santoso 2001).

Identifikasi gen dapat dilakukan antara

lain dengan analisis PCR untuk melihat ada

atau tidaknya gen dan hibridisasi Southern

untuk mengetahui jumlah salinan transgen

pada tanaman transgenik. Dalam analisis gen

menggunakan metode hibridisasi Southern

dibutuhkan DNA dalam jumlah banyak dan

murni. PCR membutuhkan DNA dalam

jumlah sedikit dan tidak perlu murni, metode

ini dapat dilakukan lebih cepat dibandingkan

dengan hibridisasi Southern namun lebih

mudah terkontaminasi oleh DNA lain

(Padmadi 2009).

Materi yang digunakan dalam penelitian

ini adalah padi varietas T-309. Padi yang telah

disisipi gen Os-GS3 ditanam dalam tanah dan

dianalisis keberadaan gennya melalui PCR

serta dikarakterisasi molekulernya melalui

hibridisasi Southern. Metode isolasi DNA

yang digunakan dalam penelitian ini adalah

metode skala cepat, metode skala miniprep,

dan metode skala besar. Permasalahan yang

dihadapi ketika isolasi DNA antara lain

jumlah sumber daya dan efisiensi waktu

pengerjaan sampel. Metode isolasi DNA skala

miniprep memerlukan sekitar 200 mg jaringan

daun dan dalam 1 hari (7 jam) seorang analis

dapat mengerjakan maksimal 24 sampel

karena proses menghancurkan daun dibantu

dengan menggunakan mesin (tissue lyser),

sedangkan metode skala besar memerlukan

sekitar 2 g jaringan daun dan dalam 1 hari (7

jam) seorang analis dapat mengerjakan 8

sampel karena proses menghancurkan daun

harus dikerjakan secara manual menggunakan

mortar. Pada situasi tertentu sejumlah besar

tanaman transgenik harus dianalisis PCR

dalam waktu singkat, sehingga perlu

eksplorasi metode isolasi DNA cepat.

Demikian juga perlu dieksplorasi

kemungkinan penggunaan DNA yang

diisolasi dengan skala miniprep dalam analisis

hibridisasi Southern sehingga dapat

dikerjakan ketika tanaman masih dalam fase

bibit untuk menghemat tempat di rumah kaca.

Dibutuhkan juga analisis lanjutan untuk

mengetahui jumlah salinan gen antisense Os-

GS3 yang efektif untuk menaikkan ukuran

biji.

Penelitian ini bertujuan melakukan isolasi

DNA, perbanyakan DNA, hibridisasi

Southern, dan karakterisasi padi transgenik.

Isolasi DNA dilakukan dengan 3 metode,

yaitu metode skala cepat, miniprep, dan besar.

Perbanyakan DNA dilakukan dengan PCR

menggunakan DNA yang diisolasi dengan

metode skala cepat, miniprep, dan skala besar.

Analisis lebih lanjut dengan hibridisasi

Southern dari sampel DNA yang diisolasi

dengan metode skala besar dan miniprep.

Karakterisasi padi transgenik diamati melalui

2

salinan transgen antisense Os-GS3 dengan

keefektifan dalam menaikkan bobot biji.

Hipotesis yang dikemukakan dalam penelitian

ini yaitu hasil isolasi DNA dan analisis PCR

dalam mengidentifikasi tanaman padi yang

positif transgenik diharapkan sama

menggunakan sampel DNA yang diisolasi

dengan metode cepat, miniprep, dan skala

besar, jumlah salinan transgen yang

tersisipkan di dalam genom tanaman padi

transgenik pada hibridisasi Southern

menggunakan DNA yang diisolasi dengan

metode miniprep sama dengan metode skala

besar, semakin besar jumlah transgen

antisense Os-GS3 maka akan semakin efektif

menaikkan bobot biji. Penelitian ini

diharapkan dapat menganalisis metode isolasi

DNA yang efisien dari segi waktu

penyelesaian dan sumberdaya yang digunakan

untuk PCR dan hibridisasi Southern dari

tanaman padi transgenik. Selain itu,

mengidentifikasi jumlah salinan transgen

antisense Os-GS3 untuk menaikkan ukuran

biji.

TINJAUAN PUSTAKA

Tanaman Padi

Tanaman padi (Oryza sativa L.)

diklasifikasikan dalam divisi Spermathopyta,

subdivisi Angiospermae, kelas

Monocotyledone, bangsa Gramineae

(Poales), genus Oryza, dan jenis Oryza sativa

L (Remelia 2008). Secara umum padi dapat

tumbuh di daerah tropis/subtropis dengan

curah hujan yang baik adalah 200 mm/bulan

atau 1500-2000 mm/tahun. Di dataran rendah

padi tumbuh pada ketinggian 0-650 m di atas

permukaan laut dengan temperatur 22-27

sedangkan di dataran tinggi 650-1500 m di

atas permukaan laut dengan temperatur 19-

23 (Padmadi 2009).

Padi merupakan tanaman semusim yang

berumpun kuat dengan tinggi tanaman 0.5-2

m, akar padi adalah akar serabut yang efektif

dalam penyerapan hara, tetapi peka terhadap

kekeringan. Akar padi terkonsentrasi pada

kedalaman antara 10-20 cm. Padi berumur

pendek yaitu kurang dari satu tahun dan satu

kali berproduksi, helai daun berbentuk garis,

sebagian besar bertepi kasar dan panjangnya

15-80 cm, serta memiliki malai dengan

panjang 14-40 cm yang tumbuh ke atas dan

ujungnya menggantung. Malai padi berupa

bulir yang beraneka ragam, kadang berjarum

pendek atau panjang, licin atau kasar

berwarna hijau atau coklat. Bulir yang masak

akan menghasilkan buah yang kaya akan pati

amilosa dan amilopektin (Departemen

Pertanian Badan Penelitian dan

Pengembangan Pertanian 2003; Remelia

2008).

Pertumbuhan padi dari pembibitan hingga

panen dibagi menjadi 3 fase yaitu vegetatif,

reproduktif, dan pematangan. Fase vegetatif

yaitu awal pertumbuhan sampai pembentukan

malai, fase reproduktif yaitu pembentukkan

malai sampai pembungaan, dan fase

pematangan yaitu pembungaan sampai gabah

matang. Organ tanaman padi secara

keseluruhan dibedakan menjadi vegetatif

meliputi akar, batang, dan daun sedangkan

organ generatif meliputi malai, bunga, dan

gabah (Banasiak 2010).

Tanaman padi yang ditanam di Asia

dikelompokkan menjadi 3 subspesies

berdasarkan pada perbedaan morfologi,

fisiologi, biokimia dan molekuler, yaitu Oryza

sativa Indica, Oryza sativa Japonica dan

Oryza sativa Javanica. Ketiga jenis subspesies

tersebut biasanya memiliki hubungan dari

perbedaan pada habitat tumbuhnya dan

produk yang dihasilkan (Purmaningsih 2006).

Padi kultivar Taipei 309 (T-309) adalah salah

satu varietas padi yang termasuk dalam

subspesies Japonica. Berdasarkan pada

karakteristik morfologi dan fisiologinya, padi

dari subspesies Japonica memiliki daun yang

berwarna hijau pekat dan ukurannya lebih

sempit, butir padi pendek dan membulat

dibandingkan dengan butir padi Indica yang

lebih panjang dan ramping (Gambar 1), pada

lemma dan palea memiliki bulu yang panjang

dan struktur butir yang padat, serta kadar

amilum sekitar 10—20% (Smith & Dilday

2002). Perbedaan morfologi dan fisiologi

antara tanaman padi yang berasal dari

subspesies Indica, Japonica dan Javanica

dapat dilihat pada Tabel 1.

Tanaman padi kultivar T-309 sering

digunakan sebagai padi model penelitian bagi

tanaman monokotil dan mudah ditransformasi.

Dalam bidang kultur in vitro, tanaman padi

kultivar T-309 memiliki beberapa kelebihan

dibandingkan dengan varietas lain dari

subspesies japonica. Menurut Purnamaningsih

(2006), padi T-309 memiliki respon yang

lebih mudah dan responsif dalam induksi

kalus. Padi T-309 juga memiliki regenerasi

kalus yang lebih cepat, hal tersebut

dikarenakan kandungan poliamin pada padi

Japonica lebih tinggi daripada Indica.

Poliamin tersebut akan berperan dalam proses

pembelahan, pemanjangan dan proliferasi sel.

Semakin tinggi kandungan poliamin maka

3

Gambar 1 Perbedaan butir padi Indica dan

Japonica (Sumber IRRI 2010)

Tabel 1 Perbedaan morfologi dan fisiologi

tanaman padi subspesies Indica,

Japonica, dan Javanica (Sumber

Smith & Dilday 2002)

Karakteristik Indica Japonica Javanica

Daun Lebar

hingga

sempit

Sempit Lebar

dan

kaku

Warna daun Hijau

muda

Hijau tua Hijau

muda

Butir padi Panjang

hingga

pendek,

ramping

dan

sedikit

rata

Pendek

dan

membulat

Panjang,

lebar,

dan

tebal

Jaringan Lunak Keras Keras

Kadar

amilum

23-31% 10-20% 20-25%

semakin responsif apabila ditumbuhkan

secara in vitro.

Isolasi DNA

Sel makhluk hidup memiliki dinding sel

pada bagian luarnya, sehingga untuk

mengeluarkan materi DNA dari inti, dinding

sel harus dipecah terlebih dahulu dengan cara

mekanik ataupun enzimatik yang biasa disebut

sebagai proses isolasi DNA. DNA merupakan

bahan penyusun gen dan

makromolekul beruntai ganda berbentuk

heliks yang berfungsi sebagai pewarisan sifat

yang menyimpan beragam materi genetik.

Tiap molekul DNA terdiri atas dua rantai

panjang yang masing-masing tersusun dari

empat jenis penyusun kimiawi yang disebut

nukleotida (Campbell et al.2002).

Masing-masing nukleotida itu sendiri

terdiri atas tiga bagian, yaitu suatu molekul

organik yang disebut basa nitrogen, suatu

pentose (gula berkarbon lima), dan gugus

fosfat. Terdapat dua keluarga basa nitrogen,

yaitu basa purin dan pirimidin (Campbell et

al. 2002). Basa purin meliputi adenin dan

guanin, sedangkan basa pirimidin meliputi

timin dan sitosin (Manz et al. 2004). Masing-

masing basa tersebut tersusun atas basa

nitrogen, molekul gula, dan fosfat (Campbell

et al. 2002). Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan,

yaitu: (1) Isolasi sel; (2) Lisis dinding dan

membran sel; (3) Ekstraksi dalam larutan; (4)

Pemurnian; dan (5) Pemekatan. Prinsip-

prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2,

yaitu sentrifugasi dan pemekatan (Sambrook

& Russell 2001). Isolasi DNA/RNA

merupakan langkah awal yang harus

dikerjakan dalam karakterisasi molekuler

tanaman padi transgenik sebelum melangkah

ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi

total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan

memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut

sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang

terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA.

Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga

dihasilkan pelet sel yang mengandung

DNA/RNA total (Faatih 2009).

Gen Os-GS3

Definisi gen secara umum adalah unit fisik

dan fungsional dari pewarisan sifat yang

mengandung informasi untuk sintesis protein

atau keseluruhan sekuens asam nukleat yang

dapat ditranskripsikan menjadi RNA

fungsional dan protein, pada waktu dan

tempat yang tepat selama pertumbuhan dan

perkembangan organisme. Gen berperan

dalam proses ekspresi gen (Qu et al. 2008).

Ekspresi gen dipengaruhi oleh lingkungan

internal dan eksternal seperti perkembangan

fisik atau perilaku dari organisme itu. Gen

tersusun atas urutan basa nukleotida, yang

terdiri dari daerah yang mengkode suatu

informasi genetik (ekson), daerah yang tidak

mengkode informasi genetik (intron), dan

bagian yang mengatur ekspresi gen yaitu

sekuens pengontrol ekspresi gen (Campbell et

al. 2002; Nelson & Cox 2008).

Gen antisense Os-GS3 (Oryza sativa-

Grain Size 3) merupakan gen untuk

meningkatkan produktivitas dan salah satunya

adalah pengendali ukuran butir gabah.

Ukuran butir merupakan faktor penentu utama

dari bobot biji. Selain itu, jumlah malai per

tanaman dan jumlah butir padi per malai juga

dapat digunakan sebagai faktor penentu utama

dari ukuran butir. Dalam aplikasi pemuliaan,

ukuran butir biasanya dievaluasi oleh bobot

4

biji, yang berkorelasi positif dengan beberapa

karakter termasuk panjang biji padi, lebar biji

padi, dan ketebalan butiran biji padi (Jiang et

al. 2005; Fan et al. 2006).

Ukuran butir juga merupakan faktor yang

penting terhadap kualitas pada padi. Meskipun

terdapat ukuran karakteristik gabah beragam,

namun mayoritas konsumen di China,

Amerika Serikat, dan sebagian besar negara

Asia lebih menyukai padi yang ramping dan

panjang. Sebagai contoh, rasio panjang atau

lebar 2.8 cm merupakan standar kualitas

nasional padi indica di Cina. Dengan

demikian, pemahaman dasar genetik dan

molekuler dari ukuran butir padi sangat

penting bagi program peningkatan beras

(Jiang et al. 2005; Fan et al. 2006).

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase chain reaction adalah teknik

cepat untuk mengamplifikasi fragmen DNA

spesifik secara in vitro dengan menggunakan

sepasang primer untai tunggal pendek (primer

reverse dan forward). Sejumlah kecil fragmen

DNA yang diinginkan dapat di amplifikasi

secara berulang sampai jutaan kali dalam

beberapa jam menggunakan teknik ini.

Polymerase chain reaction merupakan metode

yang sensitif, selektif, dan cepat dalam

menggandakan DNA target yang diinginkan

(Murray et al. 2003), sehingga dari satu pasag

molekul DNA dapat diperbanyak menjadi

jutaan kali lipat setelah 30-40 siklus PCR

(Campbell et al. 2002). Komponen-komponen

yang dibutuhkan untuk PCR yaitu fragmen

DNA yang akan diamplifikasi (DNA cetakan),

sepasang primer oligonukleotida, enzim DNA

polymerase yang tahan panas, empat macam

nukleotida (dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP),

serta bufer reaksi yang mengandung MgCl2.

Alat ini mampu secara cepat mengubah

temperatur yang dibutuhkan untuk siklus

berulang (Berg et al. 2007; Nelson & Cox

2008).

Siklus PCR dibagi menjadi 3 tahap yaitu

pemisahan utas DNA pada suhu tinggi

(denaturasi), penempelan primer, dan

pemanjangan primer menjadi utas baru DNA

oleh enzim DNA polimerase (Gambar 2).

Tiap-tiap tahapan memerlukan suhu yang

berbeda. Tahap denaturasi merupakan tahap

awal reaksi yang berlangsung pada suhu

tinggi, yaitu 94oC hingga 96

oC, dilakukan

sampai 5 menit untuk memastikan semua utas

DNA terpisah. Tahap denaturasi bertujuan

untuk memisahkan utas ganda DNA menjadi

utas tunggal sebagai DNA cetakan dengan

memutuskan ikatan hidrogen antar pasangan

basa. Semakin panjang untaian rantai DNA,

semakin lama waktu yang diperlukan untuk

tahap denaturasi (Berg et al. 2007; Sambrook

& Russell 2001).

Tahap kedua adalah penempelan primer

atau annealing pada suhu sekitar 42 o

C hingga

65 o

C. Suhu penempelan ini bersifat spesifik

yang merupakan rata-rata dari nilai Tm yang

dimiliki masing-masing primer, yaitu forward

(5’-end) dan reverse (3’-end). Perbanyakan

fragmen DNA dilakukan secara selektif dan

spesifik oleh sepasang oligonukleotida yang

disebut primer. Primer merupakan sekuen

DNA pendek dengan frekuensi 15 hingga 25

panjang basa dan berutas tunggal. Primer

menempel pada bagian DNA cetakan yang

memiliki urutan basa komplementer dengan

urutan basa primer. Tahap ini di dalam

replikasi sel berfungsi sebagai inisiasi sintesis

DNA oleh primase untuk membentuk RNA

primer pada situs ori (Sambrook & Russell

2001).

Tahap ketiga adalah perpanjangan primer

yang bertujuan memberikan kondisi optimum

bagi kerja enzim Taq polimerase dalam

memanjangkan primer guna membentuk utas

DNA baru (Clark & Pazdemik 2009; Handoyo

2001). Enzim polimerase yang digunakan

untuk mengaatalisis penempelan dua buah

primer pada proses PCR salah satu jenisnya

adalah Taq polimerase. Taq DNA polimerase

yang diisolasi dari bakteri Thermus aqutiqus

(Taq) dikembangkan pada tahun 1988. Taq

Gambar 2 Proses umum PCR

(Berg et al. 2007)

Pemisahan utas ganda

DNA pada suhu tinggi

Penempelan primer

Pemanjangan primer

menjadi DNA utas baru

5

polimerase memiliki stabilitas termal yang

tinggi atau tahan terhadap suhu mendidih 100

oC, aktivitas maksimalnya berlangsung pada

suhu 92-95oC (Sambrook & Russell 2001).

Hibridisasi Southern

Hibridisasi merupakan proses identifikasi

gen-gen hasil analisis DNA dengan

menggunakan enzim restriksi yang sesuai dan

diidentifikasi dengan fragmen gen target yang

spesifik yang telah diberi label dengan

radioisotop seperti 32

P, fosfat radioaktif atau

dengan substansi nonradioisotop. Substansi

nonradiosotop yang sering digunakan sebagai

label adalah biotin dan digoksigenin (DIG).

Proses hibridisasi dan visualisasi

diawali dengan transfer DNA dari gel agarosa

ke bahan padat seperti nilon berpori atau

membran nitroselulosa. Transfer DNA disebut

dengan ‘Southern blotting’, mengacu pada

penemu teknik tersebut yaitu E.M. Southern

(1975). Southern transfer dan hibridisasi

DNA digunakan untuk mempelajari

bagaimana peran gen dalam genom dengan

pemetaan titik-titik restriksi dan segmen DNA

genomik (Berg et al. 2007).

Southern blot telah lama dikenal sebagai

salah satu landasan analisis DNA. Transfer

Southern dan teknik hibridisasi yang berkaitan

telah dimanfaatkan untuk memperoleh

informasi tentang organisasi fisik sekuen

tunggal dan ganda pada kompleks genom,

mempercepat suksesnya percobaan kloning

pada gen eukariot (Primrose & Tywman

2006). Teknik Southern blot dapat digunakan

dalam menganalisis keberadaan dan jumlah

salinan dari gen hasil transformasi pada

tanaman transgenik. Apabila jumlah salinan

gen transforman terlalu banyak pada genom

maka kemungkinan akan terjadi proses

membloking pada gen tertentu (Tang et al.

2007), namun apabila gen terkopi antara 1-10

kemungkinan tidak akan menimbulkan gene

silencing pada gen-gen lain (Santoso 2008).

Istilah Southern blot sekarang digunakan

untuk mengambarkan transfer DNA dari gel

ke membran, yang pada mulanya dilakukan

secara kapiler ke membran nitroselulosa

(Kumar et al. 2010). Transfer DNA dalam

Southern blot dapat dilakukan pada beberapa

tipe membran, bufer transfer dan metode

transfer. Membran yang paling populer

digunakan adalah membran nitroselulosa,

nilon bermuatan positif dan nilon tidak

bermuatan. Walaupun ketiga membran ini

mempunyai sifat yang berbeda tetapi

ketiganya dapat digunakan untuk berbagai

macam aplikasi. Keuntungan utama membran

nilon adalah relatif kuat dan dapat digunakan

untuk hibridisasi lebih dari 10X, sedangkan

membran nitroselulosa mudah robek tetapi

memberikan background yang lebih bersih

pada beberapa proses hibridisasi (Sambrook &

Russell 2001).

Transfer DNA dari gel ke membran dapat

dilakukan dengan menggunakan metode

transfer kapiler, elektroforesis dan vakum.

Transfer kapiler seperti yang digunakan oleh

Southern (1975), menggunakan aliran larutan

garam untuk menarik DNA ke membran

dengan adanya gaya kapiler yang ditimbulkan

bahan penyerap seperti kertas dan tisu.

Transfer kapiler hingga saat ini masih populer

digunakan karena selain caranya cukup

mudah, biaya relatif murah, dan efisien.

Metode ini memerlukan waktu transfer yang

relatif lama (12-16 jam). Transfer

elektroforesis pada mulanya dikembangkan

untuk transfer protein, dapat menekan waktu

kerja tetapi tidak berkerja dengan baik pada

konsentrasi bufer garam yang tinggi sehingga

kurang cocok dengan bufer nitroselulosa.

Transfer vakum mungkin merupakan cara

yang paling ideal dengan waktu yang relatif

cukup singkat (1-2 jam) mampu mentransfer

DNA lebih efisien dan memberikan sinyal

hibridisasi dua sampai tiga kali lipat

dibandingkan transfer DNA kapiler (Coleman

& Gregory 2006).

Elektroforesis Gel Agarosa

Elektroforesis gel agarosa digunakan

untuk mengetahui keberadaan dan

membedakan jenis asam nukleat yang didapat

dari hasil ekstraksi serta digunakan untuk

menganalisis produk hasil pemotongan

dengan enzim retriksi. Prinsip dasar

elektroforesis adalah berdasarkan laju

perpindahan suatu molekul oleh gaya gerak

listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan

tersebut bergantung pada ukuran molekulnya,

semakin kecil ukurannya maka molekul akan

semakin cepat lajunya, begitu pula sebaliknya.

Sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur

pada gel yang berada di dalam larutan

penyangga dan dialirkan listrik pada tegangan

tertentu. Molekul-molekul sampel akan

bergerak di dalam matriks gel ke arah salah

satu kutub listrik sesuai muatannya. Arah

pergerakan untuk RNA dan DNA adalah

menuju elektroda positif karena adanya

muatan negatif pada rangka gula-fosfat yang

dimilikinya (Berg et al. 2007).

Gel agarosa umumnya digunakan untuk

menganalisis fragmen-fragmen berukuran

besar (lebih dari 200 bp). Agarosa bersifat

6

tidak toksik, kompleks berupa bubuk yang

terdiri atas campuran dua unit dasar galaktosa,

agarosa, dan agaropektin (Sambrook &

Russell 2001). Konsentrasi dari agarosa di

dalam gel menentukan ukuran pori-pori rata-

rata. Ukuran pori-porinya lebih besar dari

pori-pori pada gel poliakrilamid sehingga

asam nukleat dan protein yang terlalu besar

untuk dipisahkan oleh gel poliakrilamid dapat

dipisahkan menggunakan gel ini. Gel agarosa

mengandung gugus-gugus bermuatan

terutama sulfat dan beberapa gugus

karboksilat. Gugus-gugus ini berinteraksi

dengan gugus-gugus bermuatan pada protein

sehingga menimbulkan efek pertukaran ion

(Manz et al. 2004).

Elektroforesis gel biasanya dilakukan

untuk tujuan analisis, namun dapat digunakan

sebagai teknik preparatif untuk memurnikan

molekul sebelum digunakan untuk teknik

lebih lanjut, seperti kloning. Ukuran DNA

dapat ditentukan dengan menyertakan marka

atau penanda yang digunakan pada proses

elektroforesis. Setelah tahap elektroforesis

selesai, dilakukan metode pewarnaan dan

penghilangan warna. Metode pewarnaan pada

DNA atau RNA merupakan pewarnaan gel

agarosa yang dilakukan dengan menggunakan

larutan etidium bromida selama 15 menit. Hal

ini dilakukan dengan tujuan agar molekul

sampel berpendar dalam sinar ultraviolet.

Penghilangan warna dilakukan dengan cara

gel dimasukkan ke dalam aquades selama 5

hingga 7 menit (Manz et al. 2004).

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan pada isolasi

DNA terdiri atas daun padi T-309 tipe liar dan

padi transgenik GS3 (T-GS (2), T-GS (5), T-

GS (9), T-GS (12), T-GS (13)) natrium

bisulfit, bufer ekstraksi (10 mL Tris-HCl pH 8

M, 10 mL EDTA0.5 M, 12.5 mL NaCl 4M,

67.5 mL akuades), nitrogen cair, 20% SDS,

natrium asetat, kalium asetat, isopropanol

dingin, etanol 70%, bufer TE (Tris-EDTA),

RNAse, 0.5 M NaOH. Bahan-bahan yang

digunakan pada tahap PCR terdiri atas bufer

PCR, MgCl 25 mM, dNTP set 10 mM, primer

hpt Forward dan Reverse 10 mM, Taq DNA

polymerase (5 U/ L), DNA hasil isolasi 10

ng/ L, dan akuades steril. Bahan-bahan yang

digunakan untuk elektroforesis yaitu loading

dye, bufer TAE 1x, agarosa, DNA hasil PCR,

marker, etidium bromide 2 mg/L, dan

akuades.

Bahan-bahan yang digunakan untuk

hibridisasi southern adalah pelacak hpt, DIG-

11-dUTP, anti-Digoxigenin, enzim restriksi

BamHI, kertas blotting, kertas Whatmann

3MM, membran nilon Hybond N+,

Amersham Hyperfilm (GE Healthcare), dan

substrat CDP-Star. Bahan lain yang digunakan

adalah larutan developer dan larutan fixer,

Tween 20, plasmid (100 pg/ L), LiCl,

heksanukleotida, klenow enzim, reagen

blocking, larutan depurinasi (HCl dan

akuades), larutan denaturasi (NaOH, NaCl,

dan akuades), larutan netralisasi (Tris base,

dan akuades), larutan 20x SSC (NaCl, Tri

natrium sitrat dihidrat, dan akuades), larutan

washing 1 (20x SSC, 10% SDS, dan akuades),

larutan washing 2 (20X SSC, 10% SDS, dan

akuades), larutan bufer 1 (tris hidroksimetil,

NaCl, dan akuades), larutan washing buffer

(larutan bufer 1 dan tween 20), larutan bufer 2

(larutan bufer 1 dan reagen blocking), larutan

antibodi (larutan bufer 2 dan Anti-DIG AP),

larutan bufer 3 (Tris base, NaCl, dan

akuades), larutan stripping buffer (NaOH,

10% SDS, dan akuades), HCl 1N, dan HCl

0.1N.

Alat- alat yang digunakan dalam penelitian

ini terdiri atas timbangan analitik, shaker,

tissue lyser, mortar, gunting, kertas tisu,

pensil, sendok, bak, stopwatch, botol 250 mL,

botol 500 mL, botol 1000 mL, gelas kimia

500 mL, gelas kimia 1000 mL, strirrer, gelas

ukur 500 mL, labu Erlenmeyer 250 mL, oven,

microwave, vortex, gelas piala, tabung

eppendorf (0.2 mL, 1.5 mL, dan 2 mL),

grinding balls, pipet mikro, tip, mortar,

penangas air, bak es, dan mesin sentrifus IEC-

Centra 4B. Selain itu, digunakan pula

elektroforesis Hoefer scientific instruments,

UV cross linker, UV illuminator Chemidoc

EQ Biorad, nanodrop Thermo scientific,

mesin PCR Thermal Cycle Tetrad, kaset, dan

sentrifus mikro.

Metode Penelitian

Isolasi DNA Padi Skala Besar (Modifikasi

Dellaporta et al. 1983; Wang et al. 1993)

Daun tanaman padi tipe liar Taipei 309 (T-

309), Taipei Grain Size-2 (T-GS (2)), T-GS

(5), T-GS (9), T-GS (12), dan T-GS (13)

ditimbang menggunakan timbangan analitik

sebanyak 2 gram dimasukkan ke dalam mortar

dan disiram dengan nitrogen cair, kemudian

digerus hingga menjadi serbuk. Serbuk

tersebut kemudian dimasukkan ke dalam

tabung berukuran 50 mL dan diberi label

7

nama sampel untuk masing-masing tabung.

Tabung yang telah berisi serbuk daun padi

kemudian disimpan ke dalam bak yang berisi

nitrogen cair. Setelah sampel disimpan, dibuat

larutan 1 dengan komposisi 100 mL bufer

ekstraksi yang dimasukkan ke dalam botol

250 mL yang selanjutnya dicampur dengan

0.38 gram natrium bisulfit. Sebelum

digunakan, larutan 1 tersebut diinkubasi di

dalam penangas air pada suhu 650C.

Sampel daun padi masing-masing tersebut

ditambahkan 15 mL larutan 1 dan 1 mL SDS

20%, dikocok hingga homogen, dan

diinkubasi pada suhu 650C selama 15 menit

(setiap 5 menit dikocok) lalu diangkat. Setelah

itu, ditambahkan sebanyak 5 mL kalium asetat

5 M, lalu tabung dibolak-balik hingga

homogen dan diinkubasi di dalam bak es

selama 20 menit. Suspensi tersebut

selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan

4000 rpm selama 20 menit. Kemudian

supernatan (cairan) di saring menggunakan

kertas tisu Kimwipes dan dipindahkan ke

dalam tabung 50 mL yang baru.

Isopropanol dingin ditambahkan sebanyak

10 mL ke dalam cairan dan diinkubasi ke

dalam freezer dengan suhu (-200C) selama 30

menit. Kemudian sampel disentrifugasi pada

kecepatan 4000 rpm selama 20 menit lalu

cairan di buang. Kemudian sampel tersebut

disentrifugasi lagi pada kecepatan 4000 rpm

selama 2 menit dan sisa dari cairan di pipet

menggunakan pipet mikro sehingga cairan

tidak ada sama sekali di dalam tabung

tersebut. Setelah itu, tabung sampel yang

berisi pelet di keringkan ke dalam oven

dengan suhu 65 selama 10 menit.

Pelet yang telah kering dilarutkan ke

dalam 700 akuades dan 5 RNAse dan

diinkubasi pada suhu 65 selama 30 menit

dengan di kocok setiap 10 menit. Suspensi

tersebut dipindahkan ke dalam tabung 1.5 mL

dan disentrifugasi dengan kecepatan 10000

rpm selama 10 menit. Kemudian supernatan

dipindahkan ke dalam tabung dengan ukuran

1.5 mL yang baru. Sebanyak 75 natrium

asetat 3 M dan 500 isopropanol dingin

ditambahkan dan dicampur serta diinkubasi

pada 28 selama 5 menit. Sampel

disentrifugasi dengan kecepatan 10000 selama

5 menit dan supernatan dibuang.

Pelet yang diperoleh dicuci dengan 500 µL

etanol 70%. Campuran disentrifugasi kembali

selama 2 menit pada kecepatan 10000 rpm

dan cairan dibuang. Kemudian disentrifugasi

kembali pada kecepatan 10000 selama 30

detik dan cairan dibuang dengan pipet. Pelet

yang diperoleh dikeringkan dalam oven

selama 10 menit. Pelet yang telah kering

dilarutkan dengan 150 µL larutan TE. Tahap

selanjutnya adalah diukur kemurnian dan

konsentrasinya dengan spektrofotometer.

Isolasi DNA Padi Miniprep (Modifikasi

Dellaporta et al. 1983; Wang et al. 1993)

Daun tanaman padi tipe liar Taipei 309 (T-

309), Taipei Grain Size-2 (T-GS (2)), T-GS

(5), T-GS (9), T-GS (12), dan T-GS (13)

ditimbang menggunakan timbangan analitik

sebanyak 0.1 gram lalu daun padi tersebut

dipotong kecil-kecil dan dimasukkan ke dalam

tabung 1.5 mL serta diberi label untuk

masing-masing sampel. Setelah itu

dimasukkan satu grinding ball ke dalam

tabung 1.5 mL yang sudah berisi potongan

daun padi. Kemudian tabung yang sudah

berisi potongan padi dan grinding ball

tersebut disusun di dalam rak tissue lyser dan

disiram dengan nitrogen cair, kemudian

sampel tersebut dihancurkan oleh alat tissue

lyser tersebut hingga menjadi serbuk. Tabung

yang telah berisi serbuk daun padi kemudian

disimpan ke dalam bak yang berisi nitrogen

cair. Setelah sampel disimpan, larutan 1

dibuat dengan komposisi 10 mL bufer

ekstraksi yang dimasukkan ke dalam tabung

50 mL yang selanjutnya dicampur dengan

0.038 gram natrium bisulfit. Sebelum

digunakan larutan 1 tersebut diinkubasi di

dalam penangas air pada suhu 650C.

Dimasukkan larutan 1 sebanyak 1 mL ke

dalam masing-masing tabung yang berisi

serbuk sampel daun padi. Setelah itu, larutan 1

dipipet ke dalam tabung lalu ditambahkan

1000 L dan 68 L SDS 20% kemudian

diinkubasi selama 15 menit dengan suhu 650C

di dalam penangas air dan setiap 2 menit

tabung dibolak-balikan agar tercampur dengan

rata. Kemudian ditambahkan sebanyak 334

L kalium asetat 5 M, tabung dibolak-balik

kembali hingga tercampur dengan rata, dan

dan diinkubasi di dalam bak es selama 20

menit Tabung-tabung yang telah diinkubasi

kemudian disentrifugasi selama 10 menit

dengan kecepatan 12000 rpm, pindahkan

cairan sebanyak 800 L dipindahkan ke dalam

tabung 1.5 mL baru. Dipipet isopropanol

dingin sebanyak 600 L ke dalam tabung

yang berisi cairan dan tabung dibolak-balik

hingga tercampur rata lalu diinkubasi selama

30 menit ke dalam freezer (-200C).

Setelah diinkubasi selama 30 menit lalu

disentrifugasi selama 10 menit dengan

8

kecepatan 12000 rpm kemudian cairan

dibuang. Untuk memastikan bahwa cairan

sudah tidak ada maka disentrifugasi 30 detik

dengan kecepatan 12000 rpm lalu sisa dari

cairan tersebut dipipet menggunakan pipet

mikro. Kemudian tabung yang berisi pelet

dioven selama 10 menit dengan suhu 65 .

Tabung yang berisi pelet tersebut

ditambahkan 200 L ddH2O dan 2 L RNAse

lalu diinkubasi ke dalam penangas air dengan

suhu 65 selama 30 menit dan tabung

dibolak-balik setiap 10 menit. Tahap

selanjutnya, tabung tersebut disentrifugasi

selama 10 menit dengan kecepatan 12000

rpm. Cairan dipindahkan ke dalam tabung

baru dengan ukuran 1.5 mL. Ditambahkan

natrium asetat 3 M sebanyak 25 dan 150

isopropanol dingin lalu dikocok dan

diinkubasi ke dalam freezer -20 selama 30

menit. Sampel disentrifugasi dengan

kecepatan 12000 selama 5 menit dan

supernatan dibuang.

Pelet yang diperoleh dicuci dengan 500 µL

etanol 70%. Campuran disentrifugasi kembali

selama 10 menit pada kecepatan 12000 rpm

dan cairan dibuang. Kemudian disentrifugasi

kembali pada kecepatan 12000 selama 30

detik. Pelet yang diperoleh dikeringkan dalam

oven selama 10 menit. Pelet yang telah kering

dilarutkan dengan 30 µL larutan TE. Tahap

selanjutnya adalah diukur kemurnian dan

konsentrasinya dengan spektrofotometer.

Isolasi DNA Padi Skala Cepat (Modifikasi

Collard et al. 2007)

Daun tanaman padi tipe liar Taipei 309 (T-

309), Taipei Grain Size-2 (T-GS (2)), T-GS

(5), T-GS (9), T-GS (12), dan T-GS (13)

ditimbang menggunakan timbangan analitik

sebanyak 0.1 gram lalu daun padi tersebut

dipotong kecil-kecil dan dimasukkan ke dalam

tabung 1.5 mL serta diberi label untuk

masing-masing sampel. Setelah itu

dimasukkan satu grinding ball ke dalam

tabung 1.5 mL yang sudah berisi potongan

daun padi. Kemudian tabung yang sudah

berisi potongan padi dan grinding ball

tersebut disusun di dalam rak tissue lyser dan

disiram dengan nitrogen cair, kemudian

sampel tersebut dihacurkan oleh alat tissue

lyser tersebut hingga menjadi serbuk. Tabung

yang telah berisi serbuk daun padi kemudian

disimpan ke dalam bak yang berisi es.

Dimasukkan 0.5 M NaOH sebanyak 50 L

dengan menggunakan pipet mikro ke dalam

tabung yang berisi sampel tetapi perlakuan

tersebut tetap dilakukan di dalam bak es.

Kemudian tabung-tabung sampel yang berada

di dalam bak es tersebut digoyang

menggunakan shaker selama 10 menit.

Setelah itu, ditambahkan 0.1 M Tris-HCl pH

8.0 sebanyak 400 L ke dalam tabung sampel

dan dilanjutkan dengan digoyang-goyangkan

kembali menggunakan shaker agar semua

larutan tercampur dengan rata. Sampel

tersebut disentrifugasi selama 10 menit

dengan kecepatan 12000 rpm dan sebanyak

250 L supernatan di pipet ke dalam tabung

1.5 mL baru. Supernatan disentrifugasi

kembali selama 5 menit dengan kecepatan

12000 rpm. Tahap selanjutnya adalah diukur

kemurnian dan konsentrasinya dengan

spektrofotometer.

Analisis Kuantitatif DNA Genomik dengan

Nanodrop (Thermo Fisher Scientific 2009)

Sebanyak 2 µL larutan TE dimasukkan ke

dalam lubang ukur. Setelah itu, tutup

nanodrop dan tekan tombol read blank pada

komputer. Kertas tissue digunakan untuk

membersihkan sisa buffer TE. Kemudian

sampel DNA dimasukkan sebanyak 2 µL ke

dalam lubang ukur, kemudian pilih menu read

sample. Hasil pengukuran berupa nilai

kemurnian sampel akan muncul dalam satuan

konsentrasi ng/ µL. DNA yang murni dapat

dilihat pada 260/Å280.

Amplifikasi DNA dengan PCR (Trijatmiko

et al. 2011)

Hasil isolasi DNA tanaman T-309 yang

telah disamakan konsentrasinya selanjutnya

diamplifikasi dengan mesin PCR. Amplifikasi

DNA padi mula-mula disiapkan sebanyak 20

buah tabung mikro. Setiap tabung diisi dengan

reaksi amplifikasi yang terdiri 2 µL 10x bufer

PCR, 1.2 µL MgCl2 25 mM, 0.4 µL dNTP

mix 10 mM, 1 µL primer forward hpt 10 µM,

1 µL primer reverse hpt 10 µM, 0.16 µL Taq

DNA polymerase 5 U/µL, 5 µL DNA 10 ng/

µL, dan 9.24 µL ddH2O. Sekuen primer yang

digunakan adalah Forward 5” GAT GCC

TCC GCT CGA AGT AGC G 3” dan Reverse

5” GCA TCT CCC GCC GTG CAC 3”. Total

volume reaksi PCR adalah 20 µL. Kemudian

dijalankan program pada mesin PCR. Profil

PCR yang digunakan adalah pre-denaturasi

94˚C selama 5 menit, denaturasi 94˚C selama

30 detik, penempelan primer 65˚C selama 30

detik, dan pemanjangan primer 72˚C selama

30 detik. Proses tersebut diulang sebanyak 30

siklus.

9

Analisis Kualitas dengan Elektroforesis Gel

Agarosa (Sambrook & Russell 2001)

Disiapkan terlebih dahulu 1% gel agarosa

dengan 1x bufer TAE pada cetakan. Sebanyak

1 g agarosa ditimbang dan dicampur dengan

100 mL TAE. Larutan tersebut dimasukkan ke

dalam microwave selama 2 menit. Larutan

yang sudah tercampur dimasukkan ke dalam

cetakan agar yang sudah diberi cetakan sumur.

Setelah gel agarosa memadat, gel dimasukkan

ke dalam tangki elektroforesis yang berisi 1x

bufer TAE. Sebanyak 10 µL produk PCR

ditambahkan dengan 2 µL loading dye dan

dicampur sempurna, kemudian dimasukkan ke

dalam sumur gel. Disertakan 1 kb ladder

sebagai marker untuk melihat ukuran DNA.

Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus

dengan voltase 80 volt selama 35 menit. Gel

agarosa diwarnai dengan larutan etidium

bromida (20 mg/L) selama 10 menit,

kemudian dihilangkan pewarnaannya dengan

air selama 10 menit. Gel Pita-pita DNA

selanjutnya ditampakkan dengan chemidoc gel

system.

Hibridisasi Southern (Trijatmiko et al.

2011)

Analisis Integrasi gen Os-GS3 (Oryza

sativa Grain Size3) di dalam tanaman padi

transgenik. Hibridisasi Southern yang

mengacu pada prosedur yang telah dilakukan

oleh Trijatmiko et al. (2011) menggunakan

pelabelan Digoxigenin -11-dUTP (DIG-11-

dUTP). Kegiatan tersebut terdiri atas

beberapa tahap, yaitu pemotongan DNA

menggunakan enzim restriksi BamHI,

pelabelan marker, transfer DNA yang sudah

dipotong dengan enzim restriksi ke membran

Hybond N+ (GE Healthcare), pelabelan

pelacak hibridisasi membran dengan pelacak

yang telah di label, dan deteksi sinyal dengan

larutan CDP star.

Lima DNA sampel padi transgenik dan

padi tipe liar generasi T0 dipotong

menggunakan enzim restriksi BamHI.

Pemotongan dilakukan dengan total volume

150 l pada masing-masing DNA. Sebanyak

33 L akuades dan 15 L larutan buffer 10x

dimasukkan ke dalam tabung steril 1.5 mL,

lalu dilanjutkan dengan ditambahkannya

enzim restriksi BamHI (10 U/ L) sebanyak 2

L. Tahap selanjutnya dimasukkan DNA hasil

isolasi sebanyak 100 L ke dalam tabung 1.5

mL. Tabung diinkubasi pada suhu 37 o

C

selama 16 jam. Ditambahkan sebanyak 0.1 x

volume natrium asetat (3M) dan sebanyak 2.5

x volume etanol 96%. Kemudian tabung

diinkubasi pada freezer (-20oC) selama 2 jam.

Tabung disentrifugasi dengan kecepatan

12000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 .

Cairan dibuang kemudian ditambahkan etanol

70% sebanyak 500 L, lalu disentrifugasi

kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama

2 menit. Cairan kembali dibuang

menggunakan pipet 20 L dan tabung

dikeringkan selama 2 menit. Tahap

selanjutnya, sebanyak 15 L 0.1x TE dan 3

L loading dye ditambahkan ke masing-

masing tabung tersebut. Setelah itu, tabung

diinkubasi pada suhu 65 oC selama 15 menit.

Pelabelan marker 1 Kb dilakukan dengan

menyiapkan 10x dNTP mix didalam tabung

0.5 mL dengan komposisi 1 mM dATP

sebanyak 2 L, 1 mM dCTP sebanyak 2 L, 1

mM dGTP sebanyak 2 L, 0.65 mM dTTP

sebanyak 1.3 L, dan 0.35 mM DIG-11-dUTP

sebanyak 7 L. Tahap selanjutnya, sebanyak 3

L 1 Kb, 10x heksanukleotida sebanyak 2 L,

10x dNTP mix sebayak 2 L, klenow enzim

sebanyak 1 L, dan nucleid free water (NF)

sebanyak 12 L dimasukkan ke dalam tabung

1.5 mL. Setelah itu, tabung yang berisi

campuran larutan tersebut dipanaskan pada

suhu 100 oC selama 10 menit lalu dimasukkan

ke dalam es selama 2 menit, kemudian

diinkubasi pada suhu 37 o

C selama 3 jam.

Ditambahkan EDTA 0.2 mol/L sebanyak 2 L

dan 2.5 L LiCl 4 N serta etanol absolut

sebanyak 75 L. Tahap berikutnya, tabung

disimpan pada frezzer selama 1 jam dan

disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm

selama 5 menit. Cairan dibuang lalu pelet

dicuci dengan etanol 70%. Tahap terakhir,

etanol 70% dibuang dan pelet dikeringkan

menggunakan oven dengan suhu 50 o

C atau

dikering anginkan kemudian pelet dilarutkan

pada bufer TE 1x sebanyak 50 L.

Proses transfer DNA tanaman padi

transgenik yang dipotong dengan

menggunkan enzim restriksi BamHI ke

membran Hybond -N+

diawali dengan dibuat

gel agarosa dengan konsentrasi 0.7% dalam

1x buffer TAE (Tris Acetat acid-EDTA) dan

didiamkan hingga memadat. DNA yang telah

di potong kemudian dimasukkan sebanyak 18

L dan dimasukkan sebanyak 5 L marker

yang telah dilabel oleh DIG ke dalam masing-

masing sumur selama 16 jam (semalam) pada

tegangan 20 volt. Di hari berikutnya, tegangan

diubah menjadi 15 volts dan ditunggu hingga

5 jam. Gel kemudian direndam dalam larutan

10

depurinasi selama 10 menit pada suhu ruang,

kemudian dibilas dengan menggunakan

akuades, diikuti dengan perendaman dalam

larutan denturasi selama 2 x 15 menit pada

suhu ruang, dan terakhir direndam dalam

larutan netralisasi selama 2 x 15 menit pada

suhu ruang. Kemudian gel direndam dengan

larutan 20x SSC selama 10 menit pada suhu

ruang. Semua proses dilakukan dengan

menggoyang gel agarose di dalam larutan

tersebut. Transfer DNA ke membran Hybond

–N+ dilakukan dengan proses kapiler

menggunakan 20x bufer SSC selama 20 jam

(Gambar 3). Setelah DNA berpindah ke

membran, DNA pada membran difiksasi

menggunakan UV selama 5 menit pada 302

nm.

Pelabelan pelacak gen dilakukan

menggunakan teknik amplifikasi PCR. Reaksi

PCR dengan total volume 50 L

menggunakan primer forward dan reverse

masing-masing 1 L (5 mM), 5 L 10x buffer

PCR, 3 L MgCl2 (25 mM), 0.5 L dATP (10

mM), 0.5 L dGTP (10 mM), 0.5 L dCTP

(10 mM), 0.44 L dTTP (10 mM), enzim Taq

polymerase (5 U/ L) sebanyak 0.4 L, dan 5

L pelacak Hpt (100 pg/ L). Profil suhu yang

digunakan adalah predenaturasi 95 selama 2

menit, dilanjutkan dengan 30 siklus denaturasi

pada suhu 95 selama 30 detik, penempelan

primer pada suhu 60 selama 30 detik, dan

pemanjangan pada suhu 72 selama 40 detik.

Tahapan akhir PCR dilakukan pemanjangan

akhir pada suhu 72 selama 7 menit. Untuk

mengetahui keberhasilan pelabelan pelacak,

sebanyak 5 L produk PCR labeling dengan

Dig-11-dUTP berdampingan dengan produk

PCR tanpa DIG-11-dUTP dengan teknik

elektroforesis pada gel agarosa 1% (w/v) dan

Gambar 3 Susunan perangkat blotting

membran

hasilnya dianalisis dengan menggunakan

CEMIDOC.

Membran yang mengandung DNA

kemudian dihibridisasi dengan pelacak yang

sudah terlabel. Proses ini dimulai dengan

memanaskan larutan DIG Easy Hyb pada

suhu 42 . Membran direndam dengan larutan

DIG Easy Hyb sebanyak 50 L yang

diletakkan dalam kotak plastik dan

digoyang pada suhu

42 selama 3 jam. Setelah itu larutan DIG

Easy Hyb dimasukkan ke dalam tabung 50

mL dan ditambahkan dengan larutan pelacak

yang telah dilabel setelah itu campuran larutan

tersebut dimasukkan kembali ke dalam kotak

plastik dan digoyang kembali selama 16 jam

pada suhu 42 .

Membran yang sudah dihibridisasi

kemudian dicuci dengan larutan Wash 1 pada

suhu kamar selama 2 x 5 menit, diikuti dengan

pencucian dengan larutan Wash 2 pada suhu

68 selama 2 x 15 menit. Membran

diseimbangkan dengan larutan washing buffer

selama 2 menit, diikuti dengan inkubasi

membran dalam larutan bufer 2 selama 2 jam.

Membran diinkubasi selama 30 menit dalam

40 mL larutan Anti-Digoxigenin-Alkalin

Fosfatase atau Antibody conjugate (Anti-DIG)

(Roche).

Membran dipindahkan ke dalam kotak

plastik baru dan untuk menghilangkan

kelebihan antibody conjugate, membran

diinkubasi selama 2 x 15 menit dalam

washing buffer. Membran direndam dengan

larutan bufer 3 selama 3 menit (Lampiran 8).

Untuk pendeteksian sinyal dilakukan

penambahan substrat CDP-Star ke membran.

Kemudian membran ditutup dengan plastik

wrap dan diletakkan ke dalam kaset. Film X-

Ray diletakkan di atas membran dan

didiamkan hingga 6 jam. Proses selanjutnya

film X-Ray direndam dengan larutan

developer selama 45 detik, air 30 detik, dan

larutan fixer selama 30 detik maka jejak dari

cahaya yang dihasilkan bisa dilihat sebagai

pita-pita pada film X-Ray.

Analisis fenotipe tanaman padi kultivar

Taipei-309

Analisis fenotipe tanaman padi kultivar

Taipei-309 dilakukan dengan cara mengamati

tinggi tanaman padi dan jumlah anakan

tanaman padi. Setelah itu dilakukan

pemanenan dan diamati panjang malai, jumlah

cabang malai dalam satu malai, jumlah gabah

hampa dalam satu malai, jumlah gabah isi

11

dalam satu malai, dan berat 100 bulir padi isi

dari setiap sampel (Jiang et al. 2005).

Tinggi tanaman padi dan panjang malai

diamati menggunakan penggaris. Berat 100

bulir padi isi dari setiap sampel ditimbang

menggunakan timbangan analitik. Tahap

selanjutnya dilakukan analisis antara jumlah

salinan gen dari masing-masing sampel padi

baik tansgenik maupun tipe liar dengan hasil

data fenotipe.

HASIL DAN PEMBAHASAN

DNA Hasil Isolasi Menggunakan Metode

Cepat, Miniprep, dan Skala Besar Isolasi DNA merupakan tahap yang

penting dalam analisis gen dengan PCR.

Isolasi DNA dilakukan melalui empat tahap

yang meliputi pemanenan sampel padi, lisis,

pemurnian atau penghilangan dari komponen

selain DNA, dan pemekatan DNA (Sambrook

& Russell 2001). Daun padi yang digunakan

adalah daun yang masih muda (Ardiana 2009)

dikarenakan teksturnya yang masih lunak dan

sedikit mengandung serat sehingga mudah

dalam proses penggerusan. Selain itu daun

muda banyak mengandung DNA karena aktif

dalam proses pembelahan dan pertumbuhan

sel.

Metode isolasi yang digunakan pada

penelitian ini adalah metode skala cepat,

miniprep, dan skala besar. Masing-masing

metode tersebut memiliki kelebihan dan

kekurangan. Pada penelitian ini akan dipilih

metode yang paling efisien dari segi waktu

pengerjaan tetapi tetap memenuhi syarat untuk

digunakan dalam analisis PCR. Kelebihan

metode cepat dan miniprep adalah

penggunaan sampel daun padi dalam jumlah

sedikit (0.5-1 gram), sedangkan pada metode

skala besar memerlukan sampel dalam jumlah

banyak (2 gram). Kekurangan dari isolasi

DNA miniprep adalah tahapan prosedur yang

digunakan harus mengikuti 20 langkah

sehingga seorang analis dapat mengerjakan

maksimal 24 sampel dalam 1 hari (7 jam)

dengan menggunakan mesin penggerus

jaringan daun padi (tissue lyser). Demikian

halnya pada tahapan isolasi DNA skala besar,

seorang analis hanya mampu menyelesaikan 8

sampel karena proses pelembutan daun harus

dikerjakan secara manual tanpa dibantu mesin

penggerus (mortar). Pada tahapan isolasi

DNA skala cepat hanya mengikuti 8 langkah

sehingga seorang analis dapat mengerjakan

100 sampel dalam 1 hari (7 jam).

Parameter keberhasilan isolasi DNA dapat

dilihat secara kuantitatif. Uji kuantitatif DNA

dilakukan melalui penentuan konsentrasi dan

kemurnian DNA dengan menggunakan

nanodrop. Metode isolasi skala miniprep dan

skala besar menghasilkan kemurnian yang

baik jika dibandingkan dengan metode skala

cepat. Hal ini terlihat dari hasil nanodrop

sampel DNA (Tabel 2). Kemurnian DNA padi

menggunakan isolasi DNA miniprep dan skala

besar yang diperoleh berkisar antara 1.81-

1.93. Namun kemurnian DNA padi

menggunakan isolasi DNA skala cepat

berkisar antara 1.12-1.64 yang

mengindikasikan masih terkandungnya

protein, kemungkinan karena pada isolasi

skala cepat tidak digunakan larutan untuk

mengendapkan protein dan hanya

menggunakan larutan NaOH sebagai bufer

ekstraksinya.

Menurut Brown (2001) DNA yang murni

mempunyai nilai absorbansi 260 dibagi

dengan nilai absorbansi 280 ( 260/Å280)

berkisar 1,8 hingga 2,0. Apabila nilainya

kurang dari 1,8 maka sampel DNA masih

mengandung kontaminan protein dan untuk

menghilangkannya ditambahkan proteinase.

Apabila nilainya lebih dari 2,0 maka sampel

DNA masih mengandung kontaminan RNA,

dan untuk menghilangkannya ditambahkan

ribonuklease.

DNA Hasil Polymerase Chain Reaction

Menggunakan Metode Cepat, Miniprep

dan Skala Besar Sampel DNA padi yang telah diisolasi dan

di analisis kuantitatif selanjutnya dianalisis

lebih lanjut untuk mengetahui secara tepat

suatu tanaman mengandung gen target yang

diintroduksikan ke dalam jaringan tanaman,

dapat dilakukan analisis menggunakan PCR.

Teknik PCR adalah suatu teknik untuk

mengamplifikasi sekuen DNA tertentu dengan

menggunakan primer spesifik secara in vitro

(Apriana 2008) . Sampel yang digunakan

adalah 5 tanaman transgenik dan 1 tanaman

tipe liar sebagai kontrol negatif. Analisis

molekuler dengan PCR dilakukan

menggunakan primer hpt. Suhu annealing

yang digunakan adalah 65 . Plasmid

pCAMBIA 1301 35S Os-GS3 digunakan

sebagai kontrol positif .

Analisis elektroforesis dari produk PCR

dari 5 tanaman transgenik yang masing-

masing diisolasi dengan ketiga metode

menunjukkan hasil yang sama (Gambar 4).

Semua sampel transgenik menghasilkan pita

yang ukurannya sama dengan kontrol positif

plasmid, yaitu 500 pb (pasangan basa).

Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh

12

Tabel 2 Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA daun padi

Sampel Isolasi Konsentrasi ( g/mL) A260/280

Taipei-309 (kontrol

negatif) Skala cepat 70.1 1.31

T-GS (2)* Skala cepat 82.3 1.22

T-GS (5)* Skala cepat 139 1.42

T-GS (9)* Skala cepat 119 1.64

T-GS (12)* Skala cepat 31 1.12

T-GS (13)* Skala cepat 93.3 1.47

Taipei-309 (kontrol

negatif) Miniprep 347.0 1.88

T-GS (2)* Miniprep 108.0 1.90

T-GS (5)* Miniprep 399.6 1.87

T-GS (9)* Miniprep 368.2 1.93

T-GS (12)* Miniprep 534.7 1.84

T-GS (13)* Miniprep 681.2 1.90

Taipei-309 (kontrol

negatif) Skala besar 771.3 1.89

T-GS (2)* Skala besar 2084.7 1.83

T-GS (5)* Skala besar 1007.1 1.82

T-GS (9)* Skala besar 2741 2.87

T-GS (12)* Skala besar 675.9 1.88

T-GS (13)* Skala besar 1934.7 1.81

Gambar 4 Elektroforegram hasil PCR menggunakan primer hpt. M=marker, A=air, 1=kontrol negatif

skala cepat, 2-6=sampel, 7=kontrol negatif miniprep, 8-12=sampel, 13=kontrol negatif

skala besar, 14-18=sampel, P=plasmid

Mulyaningsih (2011) juga menunjukkan bahwa

pita yang dihasilkan dengan menggunakan

primer hpt adalah 500 pb. Hasil ini

menunjukkan bahwa dalam 5 tanaman

transgenik telah mengandung transgen.

Ketiadaan perbedaan hasil PCR antara DNA

yang diisolasi dengan ketiga metode dan

menunjukkan bahwa metode skala cepat

merupakan metode yang paling efisien apabila

hanya digunakan dalam tahap mengidentifikasi

keberadaan gen target pada tanaman padi

transgenik. Padmadi (2009) menyebutkan

bahwa sampel DNA yang digunakan pada

analisis PCR tidak harus merupakan DNA

murni.

Karakterisasi Molekuler menggunakan

Hibridisasi Southern

Persiapan DNA genom merupakan hal yang

utama sebelum melakukan hibridisasi Southern.

Sampel DNA genom yang diisolasi harus

memiliki kualitas yang baik yaitu murni dan

utuh (tidak mengalami degradasi) (Nafari

2006). Pada penelitian ini persiapan DNA

genom tanaman dilakukan menggunakan dua

metode yaitu skala besar dan skala miniprep.

Metode skala cepat tidak digunakan untuk

hibridisasi Southern karena dalam isolasi DNA

M A 1 2 3 4 5 6

6

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M P

500pb

300pb

100pb

1000pb

12000pb

500pb

Keterangan: (*)= nomor tanaman

13

hanya menggunakan larutan NaOH sebagai

bufernya, sehingga kemurnian sampel yang

dihasilkan sangat buruk apabila digunakan

dalam analisis ini. Hasil analisis DNA

menggunakan PCR dan hasil analisis salinan

gen yang dihasilkan pada metode isolasi

miniprep dan skala besar dapat dilihat pada

Tabel 3.

Analisis Southern dimulai dengan

pemotongan sampel DNA genom menggunakan

enzim restriksi BamHI. Ezim ini akan

memotong satu kali pada daerah T-DNA

sehingga pita DNA yang dihasilkan akan

menggambarkan jumlah salinan transgen yang

terintegrasi (Berg et al. 2007). Hasil

pemotongan DNA genom dengan enzim

restriksi menghasilkan jutaan fragmen yang

rapat dan ukurannya yang bervariasi baik berat

molekul yang tinggi maupun berat molekul

rendah, sehingga fragmen-fragmen ini tidak

dapat dilihat secara visual sebagai pita yang

terpisah. Oleh karena itu, dihasilkan smear

merata dari atas ke bawah yang menunjukkan

bahwa pemotongan telah sempurna (Lampiran

2).

Pelacak yang digunakan dalam analisis

Southern adalah gen hpt. Pelacak hpt dilabel

dengan digoxigenin menggunakan metode

amplifikasi PCR dengan pCAMBIA 1301 35S

Os-GS3 sebagai cetakan. Analisis elektroforesis

menunjukkan bahwa produk PCR yang telah di

label memiliki laju migrasinya lebih lambat jika

dibandingkan dengan produk amplifikasi tanpa

senyawa label (kontrol), karena DIG memiliki

berat molekul yang tinggi dari hasil amplifikasi

yang mengandung DIG, sehingga akan

memiliki berat molekul yang lebih tinggi dari

hasil amplifikasi kontrol yang tidak

mengandung DIG. Hal ini menunjukkan bahwa

proses label sudah berhasil (Lampiran 3).

Proses transfer DNA ke membran juga

merupakan hal penting dalam menentukan

keberhasilan hibridisasi Southern. Hal yang

perlu diperhatikan dinataranya harus terjadi

penempelan sempurna antara gel dan membran

tanpa adanya gelembung udara diantara

kedunya. Dalam penelitian ini setelah proses

transfer, gel direndam dalam Et-Br dan

divisulalisasi menggunakan sinar UV. Hasil

pengecekan menunjukkan bahwa transfer DNA

ke membran terjadi secara sempurna karena

tidak ada DNA yang tertinggal di gel agarosa

(Lampiran 4). Hal ini sesuai dengan penelitian

Nafari (2006) yang menggambarkan

keberhasilan transfer DNA dari gel ke

membran.

Proses hibridisasi juga merupakan hal

penting dalam melakukan hibridisasi Southern.

Hibridisasi merupakan pembentukan utas ganda

antara DNA genom dengan utas tunggal dengan

DNA pelacak utas tunggal yang telah diberi

label DIG-11-dUTP (Coleman & Gregory 2006;

Roche 2009). Pre-hibridisasi sangat diperlukan

sebelum dilakukannya hibridisasi untuk

memblok bagian membran yang tidak

mengandung fragmen-fragmen DNA agar dapat

meminimalisir background pada hasil foto,

sehingga diharapkan hanya DNA sampel yang

berpasangan dengan pelacak yang muncul saat

deteksi.

Tabel 3 Hasil analisis dan pola integrasi gen sisipan (Os-GS3) pada generasi pertama (T0) pada

kultivar Taipei 309 menggunakan primer hpt untuk PCR dan pelacak hpt untuk hibridisasi

Southern

Sampel

PCR Salinan gen

Metode skala

cepat

Metode skala

miniprep

Metode skala

besar

Metode

skala besar

Metode

skala

miniprep

Taipei 309 tipe

liar

- - - 0 0

T-GS (2)*

+ + + 2 0

T-GS (5)* + + + 4 0

T-GS (9)* + + + 1 0

T-GS (12)* + + + 0 0

T-GS (13)* + + + 1 0

Keterangan: (*)= nomor sampel tanaman

14

Analisis hibridisasi Southern

menggunakan sampel DNA yang diisolasi

dengan metode skala besar menunujukkan 2

tanaman transgenik yang memiliki 1 salinan

transgen, 1 tanaman transgenik memiliki 2

salinan transgen, dan 1 tanaman transgenik

memiliki 4 salinan transgen (Gambar 5). Pita

yang dihasilkan berbeda setiap sampelnya, hal

ini disebabkan oleh banyaknya T-DNA yang

masuk ke dalam genom tanaman transegenik.

Pada penelitian hibridisasi Southern

menggunakan DNA yang diisolasi dengan

skala besar dapat dikatakan berhasil karena

ukuran pita mendekati dengan kontrol positif

(13 kb) atau lebih dari 10 kb. Satu tanaman

transgenik tidak menghasilkan pita DNA,

kemungkinan transgennya masuk ke dalam sel

sehingga positif ketika di deteksi dengan PCR

tetapi tidak terintegrasi ke dalam genom

tanaman dan tidak menghasilkan pita saat di

deteksi dengan analisis Southern. Seperti

diharapkan tanaman yang tidak di

transformasi tidak menghasilkan pita DNA,

yang menunjukkan bahwa pelacak dan kondisi

hibridisasi yang digunakan benar-benar

mampu mendeteksi secara spesifik

keberadaan transgen.

Analisis hibridisasi Southern

menggunakan sampel DNA yang di isolasi

dengan skala miniprep tidak menghasilkan

pita DNA pada semua sampel yang di uji.

Hal ini mungkin disebabkan oleh DNA yang

diisolasi dengan metode miniprep meemiliki

berat molekul yang rendah. Hibridisasi

Southern membutuhkan DNA dalam bentuk

utuh dan memiliki berat moleul yang tinggi

(Trijatmiko et al. 2011).

Karakterisasi Molekuler Tanaman Padi

Transgenik Kultivar Taipei 309

Keberhasilan teknik transformasi genetik

ditandai dengan keberhasilan menyisipkan

rangkaian gen yang diintroduksikan ke dalam

genom tanaman sehingga dapat diekspresikan

dan tetap terpelihara dalam seluruh

pembelahan sel berikutnya. Oleh karena itu,

diperlukan upaya mengkonfirmasikan

integritas gen yang diintroduksikan dan

menentukan jumlah salinan gen tersebut di

dalam genom tanaman serta menentukan gen

tersebut dapat berfungsi dengan benar yang

dapat dilihat dari fenotipe tanaman padi

tersebut (Santoso 2008). Gen yang disisipkan

ke dalam genom tanaman harus dapat

diekspresikan sehingga menghasilkan protein

yang diinginkan. Gen-gen yang diekspresikan

pada tanaman pada awalnya adalah gen-gen

asli dari sumbernya (bakteri, jamur, hewan

Gambar 5 Hasil hibridisasi Southern. M=

marker, (metode isolasi DNA

skala besar) 1=T-309, 2=T-GS

(2), 3=T-GS (5), 4=T-GS (9),

5=T-GS (12), 6=T-GS (13);

(metode isolasi DNA skala

miniprep) 7=T-309, 8= T-GS

(2), 9=T-GS (5), 10=T-GS (9),

11=T-GS (12), 12=T-GS (13),

P=plasmid

tanaman), namun kebanyakan ekspresi dari

gen tersebut di dalam tanaman sangat rendah

(Rahmawati 2006). Keberhasilan program

transformasi genetik dapat dilihat dari

fenotipe tanaman transgenik yang

dibandingkan dengan fenotipe tanaman tipe

liar, sehingga pada penelitian ini akan

dibandingkan fenotipe tanaman transgenik

dengan jumlah salinan gen setiap sampel dan

fenotipe tanaman tipe liar

sebagai kontrol.

Gen Os-GS3 merupakan regulator negatif

dari pertumbuhan ukuran biji. Bahan yang

digunakan dalam penelitian ini adalah

antisense RNA dari gen Os-GS3 yang

dimasukkan ke dalam varietas padi T-309

dengan harapan dapat membungkam ekspresi

gen Os-GS3 sehingga ukuran biji bisa lebih

besar. Antisense adalah utas asam nukleat

DNA yang tidak diranskripsikan, merupakan

utas pasangan dari utas yang ditranskripsikan

(utas sense) (Fan 2006). Pengamatan fenotipe

menunjukkan 1 tanaman transgenik (T-GS

(5)) yang memiliki 4 salinan transgen yang

bobot 100 butir lebih tinggi dari tanaman tipe

liar, yaitu 2.669 g dibandingkan dengan 2.469

g (Tabel 4).

Tanaman transgenik lain dengan jumlah

salinan transgen 1 atau 2 memiliki bobot 100

butir padi tidak melebihi tanaman padi tipe

liar. Hal ini menunjukkan bahwa

pembungkaman ekspresi gen Os-GS3 bisa

13kb 15kb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P

12kb

15

Tabel 4 Jumlah salinan gen menggunakan DNA yang diisolasi metode skala besar dengan fenotipe

tanaman padi

Berhasil ketika 4 salinan transgen terintegrasi

ke dalam tanaman. Pada penelitian ini dapat

dikatakan bahwa sampel yang memiliki

jumlah salinan gen 4 mengalami

pembungkaman gen yang akan

mengakibatkan ukuran butir padi menjadi

lebih besar sehingga bobot bulir padi akan

semakin berat. Sedangkan sampel dengan

jumlah salinan gen 1-2 kecil kemungkinan

atau tidak mengalami pembungkaman gen

sehingga ukuran butir padi menjadi lebih

kecil.

Penelitian sebelumnya menununjukkan

bahwa semakin banyak jumlah salinan

transgen pada genom tanaman maka akan

semakin tinggi presentase pembungkaman gen

(Tang et al. 2007). Tang et al. (2007) juga

memperoleh data

presentase pem bahwa siRNA tidak terdeteksi

pada individu transgenik yang memiliki 1-3

salinan gen, tetapi siRNA terdeteksi pada

individu transgenik yang memiliki 4-7 salinan

gen. Terbentuknya small interfering RNA

(siRNA) pada sekuen transgenik yang

merupakan tanda terjadinya pembungkaman

gen. Pembungkaman gen adalah salah satu

fenomena yang menyebabkan terjadinya

kegagalan dalam mengekspresikan gen dan

terbentuknya dupleks RNA yang

mengakibatkan terhalangnya proses translasi

sehingga pembentukan protein terganggu

(Malik 2005).

Meskipun gen Os-GS3 ditargetkan untuk

rekayasa ukuran biji padi,

kemungkinan

pembungkaman ekspresinya juga berpengaruh

pada karakter fenotipe yang lain. Tanaman

transgenik T-GS (5) (5.500) menunjukkan

jumlah anakan yang lebih banyak dari

tanaman tipe liar (3.250). Hal ini

mengindikasikan bahwa gen Os-GS3 yang

menyandi protein transmembran juga

memiliki pengaruh terhadap jumlah anakan

(Fan 2006). Penelitian sebelumnya

menunjukkan bahwa gen sd-1 yang menyandi

enzim GA-20 oksidasi detektif selain

menyebabkan tanaman memiliki postur kerdil

juga berpengarug pada ukuran biji dan

panjang malai (Baoensen et al. 1993;

Spielmeyer et al. 2002).

Panjang malai, jumlah cabang malai,

gabah hampa, gabah isi tanaman transgenik

tidak ada yang lebih unggul dibandingkan

dengan T-309, sehinga dapat dikatakan bahwa

tidak semua fenotipe dapat dibandingkan

dengan jumlah salinan gen yang terintegrasi

dalam genom tanaman padi transgenik.

Menurut Kolensik et al. (2004) penentuan

Sampel Jumlah

salinan

gen

Berat

100

butir

padi (g)

Tinggi

tanaman

(cm)

Jumlah

anakan

Panjang

malai

(cm)

Jumlah

cabang

malai

Gabah

hampa

Gabah

isi

T-309 0 2.469 111.825 3.250 22.171 12.353 40.294 107.294

T-GS

(2)

2 1.888 127.750 3.250 19.680 9.850 81.650 21.750

T-GS

(5)

4 2.669 104.050 5.500 21.567 8.667 23.667 106.167

T-GS

(9)

1 1.740 106.729 2.857 12.300 8.000 42.000 13

T-GS

(12)

0 * 88.768 1 * * * *

T-GS

(13)

1 2.168 125.250 2.000 15.175 10.000 64.500 16.25

Keterangan: *= tanaman mati sebelum dilakukan analisis fenotipe selanjutnya

16

fungsi gen dari fenotipe yang diekspresikan

akan menjadi sulit apabila ada dua atau lebih

posisi T-DNA dalam satu genom. Gen tidak

hanya elemen-elemen yang memisah dan

menghasilkan pengaruh individu yang jelas,

tetapi interaksi gen satu dengan yang lainnya

memberikan fenotipe yang berbeda secara

menyeluruh (Sudharmawan 2009).

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Penelitian mengenai isolasi DNA dengan

menggunakan metode skala cepat, miniprep,

dan skala besar telah berhasil dilakukan. Pada

hasil PCR diperoleh ukuran pita yang sama

(500 pb) setiap metode isolasi yang

digunakan. Metode isolasi skala cepat

merupakn metode yang paling efisien pada

PCR. Metode Hibridisasi Southern mutlak

memerlukan DNA yang diisolasi dengan

metode skala besar. Hasil pembungkaman

ekspresi gen Os-GS3 dengan antisense RNA

berhasil ketika ada 4 transgen yang

terintegrasi ke dalam genom tanaman.

Saran

Diperlukan analisis lanjutan pada tahap

ekspresi level RNA yaitu dengan

menggunakan reverse transcriptase

Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) dan

Northern blot untuk membuktikan terjadinya

pembungkaman ekspresi gen Os-GS3.

DAFTAR PUSTAKA

Apriana A. 2008. Over-ekspresi gen

OsWRKY76 untuk ketahanan terhdapat

cendawan blas (Pyricularia grisea Sacc.)

pada padi [Tesis]. Bogor: Program

Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Ardiana DW. 2009. Teknik isolasi DNA

genom tanaman papaya dan jeruk dengan

menggunakan modifikasi bufer CTAB.

Buletin Teknik Pertanian. 1: 12-16.

Banasiak A. 2010. Putative dual pathway of

auxin transport in organogenesis of

Arabidopsis. Planta 1: 49-61.

Baoensen X, Shinya O, Fumio K, Kastsu I.

1993. Character expression of the

semidwarfing sd-1 in rice (Oryza sativa

L.). J. Genet Genomic 20: 522-560.

Berg MJ, JL Tymoczko, L Stryer. 2002.

Biochemstry. Fifth Ed. San Fransisco: WH

Freeman.

Berg MJ, JL, Tymoczko, L Stryer. 2007.

Biochemistry. Sixth Ed. San Fransisco:

WH Freeman.

[BPS] Badan Pusat Statistik. 2011. Berita

Resmi Statistik. Jakarta: BPS

Campbell NA, JB Reece, LG Mitchell. 2002.

Biologi. Ed ke-5. Lestari R, EIM Adil, N

Anita, Andri, Wibowo WF, W Manulu,

penerjemah; Safitri A, L simarmata, HW

Hardani, editor. Jakarta: Erlangga.

Terjemahan dari: Biology Fifth Edition.

Clark DP, Pazdermik NJ. 2009. Biotechnology

Applying the Genetic Revolution. London:

Elsevier Academic Press.

Colard BCY, A Das, PS Virk, DJ Mackill.

2006. Evaluation of quick and dirty DNA

extraction methodes for marker-assisted

selection in rice (Oryza sativa L.). Plant

Breedings. 126: 47-50.

Coleman WB, Gregory JT. 2006. Molecular

Diagnostic: for the Clinical Laboratorium.

Totowa: Humana Press.

Dellaporta Sl, Jonathan W, James BH. 1983.

A plant DNA minipreapration: version II.

Plant molecular Biology Reporter 1: 19-

21.

Faatih M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA

Kromosom. J. Penelitian Sains &

Teknologi. 10: 61 – 67.

Fan C, Yongzhong X, Hailiang M, Tingting L,

Bin H, Caiguo X, Xianghua L, Qifa Z.

2006. GS3, a major QTL for grain lenght

and weight and minor QTL for grain

width and thickness in rice, encodes a

putative transmembran protein. Theor

Appl gene 112: 1164-1171.

Handoyo D, Ari R. 2001. Prinsip umum dan

pelaksanaan polymerase chain reaction

(PCR). Unitas 9:17-29.

17

[IRRI]. 2010. Morfologi dan pertumbuhan

padi. [terhubung berkala] http:// www.

Knowledgebank. Irri. Org/ morph/

morphology.htm [13 Maret 2012].

Jiang GH, Xue YH, Cai GH, Xiang HL, Yu

QH. 2005. Identification of quantitative

loci for grain appearance and miling

quality using a doubled-haploid rice

population. Journal of Integrative Plant

Biology 47: 1391-1403.

Kolensik et al. 2004. Establishing and

efficient Ac/Ds tagging system in rice:

Large scale analysis of Ds flanking

sequences. The Plant Journal 37: 301-314.

Kumar S, L Arul, D Talwar. 2010. Generation

of market-free Bt transgenic indica rice

and evaluation of its yellow stem borer

resistance. J.Appl Genet 5: 243-257.

[Departemen Pertanian Badan Penelitian dan

Pengembangan Pertanian]. 2003. Panduan

Sistem Karaterisasi dan Evaluasi Tanaman

Padi. Bogor: Komisi Nasional Plasma

Nutfah.

Malik A. 2005. RNA therapeutic, pendekatan

baru dalam terapi gen [ulasan]. Majalah

Ilmu Kefarmasian 2: 51-61.

Manz A, Nicole P, Dimitri I. 2004.

Bioanalytical Chemistry. London: Imperial

College Press.

Mulyaningsih ES. 2011. Pengembangan padi

gogo indica toleran kekeringan melalui

transformasi genetik gen regulator HD-Zip

OSHOX6 dan seleksi populasi padi

mengandung marka genetic QTL 12.1

[Disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana,

Institut Pertanian Bogor.

Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell

VW. 2003. Harper’s Illustrated

Biochemistry. New York: McGraw Hill.

Nafari IB. 2006. Kestabilan pewarisan gen

entC dan pmsB pada paditransgenik

generasi ketiga (T2) [Skripsi]. Bogor:

Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Institut Pertanian

Bogor.

Nelson DL, MM Cox. 2008. Lehninger

Priciples of Biochemistry. Fifth ed. New

York: WH Freeman.

Padmadi B. 2009. Identifikasi sifat aroma

tanaman padi menggunakan marka

berbasis gen aromatik [Skripsi]. Bogor:

Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Institut Pertanian

Bogor.

Primrose SB, RM Twyman. Principle of Gene

Manipulation and Genomics. Seventh Ed.

Cornwall: Blackwell publishing.

Purmaningsih, R. 2006. Induksi Kalus dan

Optimasi Regenerasi Empat Varietas Padi

Melalui Kultur In Vitro. Jurnal

Agrobiogen 2: 74-80.

Qu S, A Desai, R Wing, V Sundaresan. 2008.

A versatile transposon-based activation tag

vector system for functional genomics in

cereals and other monocot plants. Plant

Physiology 146: 189-199.

Rahmawati S. 2006. Status perkembangan

perbaikan sifat genetik padi menggunakan

transformasi Agrobacterium. Jurnal

AgroBiogen 2: 36-44.

Remelia M. 2008. Analisis T-DNA pembawa

transposon AC/Ds pada T0 dan aktivitas

Ds pada T1 tanaman padi (Oryza sativa L)

kultivar nipponbare [Skripsi]. Jakarta:

Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia.

Roche. 2008. DIG Application Manual for

Filter Hybridization. Menheim:Roche

Diagnostic GmbH.

Sambrook J, DW Russell. 2001. Molecular

Cloning: A Laboratory Manual. Edisi 3.

New York: Coldspring Harbor Laboratory

Press.

Santoso D. 2001. Pengembangan pelacak

DNA spesifik gen melalui bioinformatika:

identifikasi gen penyandi protein biji 21

kDa pada kakao UAH Indonesia. Menara

Perkebunan 69: 10-17.

18

Santoso TJ. 2008. Identifikasi begomovirus

Indonesia pada tomat dan analisis

diversitas genetik gen AV1 serta

pemanfaatannyauntuk pengembangan

tanaman tahan virus [disertasi]. Bogor:

Program Pascasarjana, Institut Pertanian

Bogor.

Smith CW, RH Dilday. 2002. Rice: Origin,

History, Technology and Production. New

Jersey: Willey & Sons.

Soedarini B, Patricia N. 2006. Pangan

transgenik: suatu pilihan yang dilematis.

Renai 2: 129-144.

Spielmeyer W, March HE, Peter MC. 2002.

Semidwarf (sd-1), “green revolution” rice,

contains a defective gibberellins 20-

oxidase gene. Plant Biology 13: 9043-

9048.

Sudharmawan AAK. 2009. Analisis segregasi

persilangan varietas padi tahan dan rentan

terhadap cekaman kekeringan. Agroteksos

19: 109-114.

Tang W, Ronald J. Newton, Douglas A.

Weidner. 2007. Genetic transformation

and gene silencing mediated by multiple

copies of a transgene in eastern white pine.

Experimental Botany 58: 545–554.

Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop

2000/200c Spectrpphotometer V1.0 User

Manual. Wilmington: Thermo Fischer

Scientific.

Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH,

Kohli A. 2011. Molecular Analysis of

Transgenic Plants. NewYork: Springer.

Wang H, Meiqing Q, Adrian JC. 1993. A

simple method of preparing plant samples

for PCR. Nucleid Acids Research 21:

4153-4154.

Yuniati R. 2004. Penapisan galur kedelai

Glycine max (L.) merril toleran terhadap

NaCl untuk penanaman di lahan salin.

Makara SAins 1: 21-24.

Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop

2000/200c Spectrpphotometer V1.0 User

Manual. Wilmington: Thermo Fischer

Scientific.

Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH,

Kohli A. 2011. Molecular Analysis of

Transgenic Plants. NewYork: Springer.

Wang H, Meiqing Q, Adrian JC. 1993. A

simple method of preparing plant samples

for PCR. Nucleid Acids Research 21:

4153-4154.

Yuniati R. 2004. Penapisan galur kedelai

Glycine max (L.) merril toleran terhadap

NaCl untuk penanaman di lahan salin.

Makara SAins 1: 21-24.

Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop

2000/200c Spectrpphotometer V1.0 User

Manual. Wilmington: Thermo Fischer

Scientific.

Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH,

Kohli A. 2011. Molecular Analysis of

Transgenic Plants. NewYork: Springer.

Wang H, Meiqing Q, Adrian JC. 1993. A

simple method of preparing plant samples

for PCR. Nucleid Acids Research 21:

4153-4154.

Yuniati R. 2004. Penapisan galur kedelai

Glycine max (L.) merril toleran terhadap

NaCl untuk penanaman di lahan salin.

Makara SAins 1: 21-24.

Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop

2000/200c Spectrpphotometer V1.0 User

Manual. Wilmington: Thermo Fischer

Scientific.

Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH,

Kohli A. 2011. Molecular Analysis of

Transgenic Plants. NewYork: Springer.

Wang H, Meiqing Q, Adrian JC. 1993. A

simple method of preparing plant samples

for PCR. Nucleid Acids Research 21:

4153-4154.

Yuniati R. 2004. Penapisan galur kedelai

Glycine max (L.) merril toleran terhadap

NaCl untuk penanaman di lahan salin.

Makara SAins 1: 21-24.

19

LAMPIRAN

20

Lampiran 1 Tahapan penelitian

Isolasi DNA metode cepat, miniprep, skala besar

Analisis kuantitatif DNA

Amplifikasi DNA dengan PCR

Uji dengan elektroforsesis

Uji hibridisasi Southern

Uji fenotipe padi

Karakterisasi molekuler antara jumlah salinan gen

dengan fenotipe padi

21

Lampiran 2 Elektroforegram DNA genom yang di potong enzim BamHI

Lampiran 3 Elektroforegram DNA pelacak yang di beri label DIG-11-dUTP

Lampiran 4 Elektroforegram DNA Genom setelah proses transfer ke membran

DNA pelacak yang telah di label DIG-11-dUTP

DNA pelacak yang tidak di label DIG-11-dUTP

22

Lampiran 5 Tabel jumlah salinan gen dengan fenotipe tanaman padi

Sampel Jumlah salinanan gen Tinggi tanaman padi

(cm)

Jumlah anakan

T-309 0 117.1 4

99.3 2

119 4

111.9 3

Rata-rata 111.825 3.250

T-GS (2) 2 121 4

120 2

134.5 4

135.5 3

Rata-rata 127.750 3.250

T-GS (5) 4 119.6 5

88.5 6

Rata-rata 104.050 5.50

T-GS (9) 1 126 3

104 2

127.4 1

96 2

66 3

124 7

103.7 2

Rata-rata 106.786 2.857

T-GS (12) 0 95 2

94.8 0

76.5 1

Rata-rata 88.767 1

T-GS (13) 1 135 3

124.5 2

116.5 1

125 2

Rata-rata 125.25 2

23

Lampiran 6 Tabel jumlah salinan gen dengan fenotipe tanaman padi

Sampel Jumlah

salinan gen

Panjang

malai (cm)

Jumlah

cabang

malai

Gabah

hampa

Gabah isi Berat 100

butir padi

T-309 0 22.5 14 9 144 2.469

2 18.2 9 62 30

3 23.5 12 10 141

4 18.1 9 15 63

5 19.5 11 51 81

6 28.5 13 16 127

7 22 14 42 129

8 20.8 11 23 79

9 20 13 59 149

10 21.5 14 33 96

11 23.9 13 24 119

12 24.1 14 37 147

13 36 13 20 42

14 20.5 14 47 86

15 24 15 47 151

16 22 14 59 114

17 22.5 15 39 124

18 23.5 16 41 159

19 23.5 12 21 148

20 20 13 52 115

21 23.9 14 80 100

22 19.6 12 16 120

23 23.5 13 42 140

24 18 7 32 36

25 24.5 13 33 118

26 26.8 11 17 165

27 18.9 10 32 66

28 21 15 112 58

29 22 9 39 104

30 23.5 12 106 42

31 20 11 34 116

32 16.5 8 42 30

33 23.5 14 43 139

34 17.5 12 35 170

Rata-rata 22.171 12.353 40.294 107.294 2.469

T-GS (2) 2 22.3 11 102 38 1.888

17 7 74 15

21.9 11 127 17

17.4 9 59 22

22 12 79 27

20 11 84 21

18.7 11 90 28

22.1 10 82 31

20 11 83 35

22.1 12 85 57

19.1 11 69 22

20 9 74 28

18.5 11 84 19

18.9 8 76 9

17 6 54 16

17.6 6 42 12

19.9 9 64 6

24

Lanjutan

Sampel Jumlah

salinan gen

Panjang

malai (cm)

Jumlah

cabang

malai

Gabah

hampa

Gabah isi Berat 100

butir padi

19.9 11 106 8

20 11 103 18

19.2 10 96 6

Rata-rata 19.680 9.850 81.650 21.75 1.888

T-GS (5) 4 23.5 10 13 120 2.669

24.1 11 23 177

24.9 9 24 126

17.2 7 27 65

21 8 28 87

18.7 7 27 62

Rata-rata 21.567 8.667 23.667 106.167 2.669

T-GS (9) 1 12.3 8 42 13 1.740

Rata-rata 12.3 8 42 13 1.740

T-GS (12) 0 * * * * *

T-GS (13) 1 15.5 10 51 37 2.168

13.6 10 88 8

18.1 12 76 12

13.5 8 43 8

Rata-rata 15.175 10 64.5 16.25 2.168

Keterangan: *= tanaman mati sebelum dilakukan analisis lanjut fenotipe

25

Lampiran 7 Komposisi larutan hibridisasi Southern

Larutan Komposisi

Larutan depurinasi Sebanyak 400 mL akuades dan 20.8 mL

HCl dimasukkan ke dalam gelas kmia

500 mL kemudian di stirrer.

Larutan denaturasi Sebanyak 400 mL akuades, 10 g

NaOH, dan 43.83 g NaCl dimasukkan

ke dalam gelas kimia 500 mL.

Larutan netralisasi Sebanyak 800 mL, 60.57 tris base, dan

87.66 g NaCl dimasukkan ke dalam

gelas kimia 1000 mL lalu di strirrer

20x SSC Sebanyak 800 mL akuades, 175.32 g

NaCl, dan 88.23 g tri-natrium sitrat

dimasukkan ke dalam gelas kimia lalu

di stirrer

Wash buffer 1 800 mL akuades dimasukkan ke dalam

gelas kimia dan ditambahkan 100 mL

20x SSC dan 10 mL 10% SDS lalu di

stirrer.

Wash buffer 2 800 mL akuades dimasukkan ke dalam

gelas kimia dan ditambahkan 5 mL 20x

SSC dan 10 mL 10% SDS lalu di

stirrer.

Washing buffer Sebanyak 600 mL 25ncuba asam

maleat dimasukkan ke dalam gelas

kimia dan ditambah 1.8 mL Tween 20.

Blocking solution Ditambahkan 250 mL bufer asam

maleat dan 2.5 g blocking reagent

dimasukkan ke dalam botol lalu di

inkubator pada suhu 68 kemudian di

diaduk.

Antibody solution Dimasukkan 40 mL blocking solution

ke dalam tabung 50 mL dan

ditambahkan 4 L Anti-Digoxigenin-

AP lalu diaduk.