84
KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK ETANOLTEMPE BERBAHAN BAKU KEDELAI HITAM (Glycine soja), KORO HITAM (Lablab purpureus. L.), DAN KORO KRATOK (Phaseolus lunatus. L.) TESIS Oleh : Heny Rahma S. NIM : S 900208011 PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2010

KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

  • Upload
    others

  • View
    19

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF

ISOVLAVON DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK ETANOLTEMPE BERBAHAN BAKU

KEDELAI HITAM (Glycine soja), KORO HITAM (Lablab purpureus. L.), DAN

KORO KRATOK (Phaseolus lunatus. L.)

TESIS

Oleh :

Heny Rahma S.

NIM : S 900208011

PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA 2010

Page 2: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

2

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Senyawa isoflavon merupakan senyawa metabolit sekunder yang banyak

disintesa oleh tanaman. Namun, tidak sebagai layaknya senyawa metabolit

sekunder karena senyawa ini tidak disintesis oleh mikroorganisme. Dengan

demikian, mikroorganisme tidak mempunyai kandungan senyawa ini. Oleh

karena itu, tanaman merupakan sumber utama senyawa isoflavon di alam. Dari

beberapa jenis tanaman, kandungan isoflavon yang lebih tinggi terdapat pada

tanaman Leguminoceae, khususnya pada tanaman kedelai (Pradana, 2008).

Isoflavon yang terdapat dalam biji kedelai dorman adalah dalam bentuk

isoflavon glikosida yaitu daidzin, genistin dan glisitin. Isoflavon glikosida tersebut

mempunyai aktivitas fisiologis yang rendah. Pawiroharsono (1995) dalam

Restuhadi (2001), menyatakan bahwa 99% isoflavon glikosida yang terdapat

pada biji kedelai, selama proses perendaman (dalam pembuatan tempe) dapat

terhidrolisis menjadi isoflavon aglukan dan glukosa. Isoflavon aglukan yang

mempunyai aktivitas fisiologis tinggi tersebut adalah genistein, daidzein, dan

glisitein, selanjutnya pada proses fermentasi kedelai rendam dengan kapang

Rhizopus oligosporus, daidzein dapat mengalami proses hidroksilasi sehingga

menjadi senyawa faktor-2. Faktor-2 mempunyai aktivitas antioksidan dan

antihemolisis yang lebih baik dari daidzein dan genistein (Gyorgy et al., 1964).

Page 3: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

3

Salah satu aktivitas fisiologis yang menonjol dari isoflavon daidzein,

genestein, glisitein dan faktor-2 adalah aktivitas antioksidan. Antioksidan

didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda, memperlambat dan

mencegah proses oksidasi lipid. Dalam arti khusus, antioksidan adalah zat yang

dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi antioksidasi radikal bebas

(Kochhar dan Rossell, 1990).

Antioksidan pada isoflavon sangat dibutuhkan tubuh untuk menghentikan

reaksi pembentukan radikal bebas, sehingga dapat menghambat proses

penuaan dini, mencegah penyakit degeneratif seperti aterosklerosis, jantung

koroner, diabetes melitus,dan kanker (Horwit, 1980 dalam Sukib, et al., 2002 ).

Selama ini kita ketahui antioksidan yang digunakan sebagai pengawet

pada bahan makanan adalah antioksidan sintetik seperti Butylated

Hydroxyanisole (BHA), Butylated Hydroxytoluene (BHT), Propyl Gallat (PG) dan

Etylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA). Pemanfaatan zat antioksidan sintetik

dapat menimbulkan gangguan kesehatan bagi konsumen antara lain gangguan

fungsi hati, paru, mukosa usus, dan keracunan (Suryo dan Tohari, 1995). Untuk

itu perlu dicari alternatif lain untuk mengatasi permasalahan tersebut. Salah satu

cara adalah dengan mengganti pemanfaatan antioksidan sintetik dengan

antioksidan alami. Mengingat adanya kandungan isoflavon dalam kedelai yang

dapat berfungsi sebagai antioksidan, maka tempe kedelai dapat direferensikan

sebagai bahan baku sumber antioksidan alami. Disamping sebagai antioksidan,

isoflavon daidzein, genistein, glisitein dan faktor-2 juga mempunyai khasiat lain

diantaranya sebagai estrogenik (zat yang mirip estrogen), anti inflamasi, anti

tumor atau anti kanker, anti hemolisis, anti kontriksi (penyempitan) pembuluh

darah, anti kolesterol, menurunkan kadar trigliserida VLDL dan LDL serta

meningkatkan HDL (Pawiroharsono, 2001). Dengan demikian isoflavon dari

tempe kedelai selain berkhasiat sebagai antioksidan juga mempunyai khasiat

ganda seperti yang tertera diatas.

Page 4: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

4

Pada saat ini tengah terjadi dilema dalam memproduksi bahan pangan

berbahan baku kedelai (termasuk tempe), karena harganya yang melambung

yaitu, dari Rp 2.500,00 ( tahun 2004) menjadi Rp 8.000,00 (tahun 2009) / kg.

Penurunan harga kedelai sudah tidak memungkinkan lagi karena saat ini kedelai

selain diperebutkan sebagai bahan pangan (food ), juga untuk pakan (feed).

Untuk itu perlu dicari alternatif lain, yaitu dengan menggali potensi bahan lokal

yang murah dan melimpah di Indonesia sebagai alternatif pengganti kedelai

sebagai sumber antioksidan alami khususnya isoflavon ( Retno, 2001)

Handayani dkk. (1996) menyatakan bahwa Indonesia mempunyai banyak

jenis legume yang beberapa diantaranya belum dimanfaatkan secara optimal.

Salah satu jenis legume yang cocok dibudidayakan di Indonesia dan dapat

berfungsi sebagai bahan pangan tetapi produk olahannya masih jarang

dikonsumsi yaitu koro hitam (Lablab purpureus), koro kratok (Phaseolus lunatus),

dan kedelai hitam (Glycine soja).

Dalam rangka pengembangan senyawa antioksidan alami khususnya

isoflavon maka perlu dilakukan penelitian tentang optimasi produksi senyawa

antioksidan dari koro hitam, koro kratok, dan kedelai hitam dan produk tempenya

serta karakterisasi kandungan isoflavonnya. Dipilihnya koro hitam, koro kratok

dan kedelai hitam sebagai alternatif obyek penelitian sumber isoflavon karena

isoflavon merupakan metabolit sekunder yang banyak disintesis oleh tanaman

namun tidak disintesis oleh mikroorganisme. Koro hitam, koro kratok, dan kedelai

hitam merupakan spesies dari familia leguminoceae sehingga dimungkinkan

juga mengandung isoflavon seperti yang dijumpai pada kedelai.

Selama ini tempe kedelai yang dikonsumsi oleh masyarakat adalah

tempe hasil fermentasi kedelai selama 48 jam. Lama waktu fermentasi tersebut

merupakan lama waktu fermentasi kedelai untuk menghasilkan tempe yang

paling optimum dari sisi cita rasa untuk dikonsumsi, tetapi lama waktu fermentasi

yang optimum untuk menghasilkan ekstrak antioksidan khususnya isoflavon yang

Page 5: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

5

optimum belum diketahui. Kedelai hitam, koro hitam, dan koro kratok mempunyai

ukuran biji yang hampir sama dari ukuran biji kedelai, untuk itu perlu diteliti lama

waktu fermentasi untuk menghasilkan ekstrak antioksidan khususnya isoflavon

yang optimum. Penelitian ini akan difokuskan pada optimasi produksi senyawa

antioksidan khususnya isoflavon dengan variasi lama waktu fermentasi baik

pada biji kedelai dan produk tempenya maupun pada biji koro hitam, koro kratok

serta kedelai hitam dan produk tempenya.

Untuk memperoleh zat antioksidan alami, dapat dilakukan dengan cara

ekstraksi tanaman menggunakan pelarut organik seperti, heksana, benzena, etil

eter, kloroform, etanol atau metanol. Metanol 90 % merupakan pelarut optimum

untuk mengekstrak isoflavon dari kedelai, namun penggunaannya untuk skala

komersial masih perlu dikaji lebih lanjut karena bersifat toksik. Penelitian dengan

menggunakan pelarut etanol untuk ekstraksi diharapkan dapat mengganti

metanol untuk menghasilkan ekstrak antioksidan alami secara komersial, karena

kepolaran etanol mendekati metanol dan relatif tidak beracun (Ariani dan Hastuti,

2009). Untuk selanjutnya pada penelitian ini juga akan difokuskan pada ekstraksi

dengan menggunakan pelarut etanol.

B. Perumusan Masalah

Dari uraian latar belakang di atas permasalahan dapat dirumuskan

sebagai berikut :

1. Berapa lama waktu fermentasi yang optimum untuk menghasilkan ekstrak

etanol tempe berbahan baku Kedelai Hitam, Koro hitam dan Koro kratok

dengan aktivitas antioksidan yang optimum pada perlakuan fermentasi (0,

1, 2, 3, 4 hari) ?

2. Isoflavon jenis apa sajakah yang terkandung dalam tempe berbahan baku

koro hitam, koro kratok serta kedelai hitam dan produk tempenya

berdasarkan variasi lama waktu fermentasi (0, 1, 2, 3, dan 4 hari )?

Page 6: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

6

3. Bagaimana aktivitas antioksidan tempe berbahan baku koro hitam, koro

kratok serta kedelai hitam dan produk tempenya bila dibandingkan

dengan ekstrak etanol dari kedelai dan produk tempenya serta beberapa

antioksidan alami ( α-tokoferol, β-karoten, dan asam askorbat) maupun

antioksidan sintetis (BHT) ?

C. Tujuan Penelitian

Adapun tujuan dari penelitian yang dilakukan adalah :

1. Mengetahui lama waktu fermentasi yang optimum untuk menghasilkan

ekstrak etanol tempe berbahan baku kedelai hitam, koro hitam dan koro

kratok dengan aktivitas antioksidan yang optimum pada perlakuan fermentasi

(0, 1, 2, 3, 4 hari).

2. Mengetahui Isoflavon jenis apa saja yang terkandung dalam tempe berbahan

baku koro hitam, koro kratok serta kedelai hitam dan produk tempenya

berdasarkan variasi lama waktu fermentasi (0, 1, 2, 3, dan 4 hari)

3. Mengetahui aktivitas antioksidan tempe berbahan baku koro hitam, koro

kratok serta kedelai hitam dan produk tempenya bila dibandingkan dengan

ekstrak etanol dari kedelai dan produk tempenya serta beberapa antioksidan

alami (α-tokoferol, β-karoten, dan asam askorbat) maupun antioksidan

sintetis (BHT).

D. Manfaat Penelitian

Adapun manfaat dari penelitian yang dilakukan adalah :

1. Secara teoritis :

a. Mengetahui jenis-jenis kandungan senyawa isoflavon yang terdapat

dalam koro hitam, koro kratok serta kedelai hitam dan produk tempenya

berdasarkan variasi lama waktu fermentasi.

Page 7: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

7

b. Mengetahui sejauh mana manfaat koro hitam, koro kratok serta kedelai

hitam dan produk tempenya sebagai sumber antioksidan alami.

c. Diharapkan dapat dijadikan sebagai referensi bagi penelitian selanjutnya

mengenai aktivitas antioksidan dan kandungan senyawa isoflavon dari

jenis legum lainnya.

2. Secara praktis :

a. Dapat memberikan informasi pada masyarakat mengenai kandungan

isoflavon dan aktivitas antioksidan dalam biji dan tempe koro hitam, koro

kratok serta kedelai hitam yang berguna bagi kesehatan

b. Sebagai bahan alternatif pengganti kedelai dan pengembangan produk

tempe dari biji kacang-kacangan atau leguminoceae.

Page 8: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

8

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. LEGUMINOCEAE

Legume adalah tanaman dikotyl setahun dan tahunan; sebagian besar

legume sayuran dan legume bijian yang dibudidayakan adalah tanaman setahun.

Legum bijian, sering dikenal sebagai tanaman kacang bijian, adalah tanaman

serealia bijian terpenting kedua sebagai sumber pangan utama dunia (Rubatski

dan Yamaguchi, 1997).

1. Kedelai Hitam (Glycine soja)

Berdasarkan warna bijinya dikenal kedelai putih (Glycine max.) dan

kedelai hitam (Glycine soja). Kedelai putih membutuhkan tanah yang lebih subur,

serta memerlukan pengairan dan pemeliharaan lebih baik dari pada kedelai

hitam. Kedelai hitam umunya hanya digunakan untuk bahan baku kecap,

sedangkan kedelai putih untuk bahan baku tempe dan tahu serta makanan

lainnya (tauco dan lain-lain). Biji kedelai adalah hasil yang paling utama untuk

diambil dan dimanfaatkan (Yamaguchi dan Rubatski, 1997).

Kedelai yang dibudidayakan sebenarnya terdiri dari paling tidak dua

spesies: Glycine max (disebut kedelai putih, yang bijinya bisa berwarna kuning,

agak putih, atau hijau) dan Glycine soja (kedelai hitam, berbiji hitam). Glycine

max merupakan tanaman asli daerah Asia subtropik seperti RRC dan Jepang

selatan, sementara Glycine soja merupakan tanaman asli Asia tropis di Asia

Page 9: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

9

tenggara. Tanaman ini telah menyebar ke Jepang, Korea, Asia Tenggara dan

Indonesia.

Menurut Tjitrosoepomo, G. (1996) kedudukan tanaman kedelai dalam

sistematik tumbuhan (taksonomi) diklasifikasikan sebagai berikut :

Kerajaan : Plantae

Filum : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Fabales

Famili : Fabaceae

Genus : Glycine

Spesies : Glycine soja (L.)

( Martin dan Leonardo, 1962 dalam Tjitrosoepomo. G., 1996).

Kedelai termasuk keluarga kacang-kacangan yang berasal dari asia.

Kedelai ditanam lebih dari 5000 ribu tahun yang lalu dinegeri Cina. Dunia barat

baru mengenal kedelai pada tahun 1737. Namun, pada tahun 1905 dunia

mengenal kedelai berbentuk bulat panjang atau pipih dengan tinggi pohon sekitar

30-100cm. Amerika, Brazil, Cina dan Argentina adalah negara terbesar di dunia

penghasil kedelai. Indonesia sudah melakukan penanaman kedelai sejak tahun

1750 terutama di pulau Jawa dan Bali (Lamina, 1989).

Biji kedelai kaya akan protein dan lemak serta beberapa bahan gizi

penting lain, misalnya vitamin dan lesitin. Karena ini jugalah, kedelai banyak

dimanfaatkan sebagai bahan baku pembuatan makanan, seperti tahu, tempe,

kecap, susu kedelai hingga tepung kedelai .

Secara morfologi kedelai hitam merupakan tanaman dikotil semusim

dengan percabangan sedikit, sistem perakaran akar tunggang, dan batang

Page 10: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

10

berkambium. Kedelai dapat berubah penampilan menjadi tumbuhan setengah

merambat dalam keadaan pencahayaan rendah. Kedelai, khususnya kedelai

putih dari daerah subtropik, juga merupakan tanaman hari-pendek dengan waktu

kritis rata-rata 13 jam. Ia akan segera berbunga apabila pada masa siap

berbunga panjang hari kurang dari 13 jam. Ini menjelaskan rendahnya produksi

di daerah tropika, karena tanaman terlalu dini berbunga.

Perilaku pembungaan berbeda-beda, mulai dari sangat tidak terbatas

hingga sangat terbatas. Saat berbunga bergantung pada kultivar dan dapat

beragam dari 80 hari hingga mencapai 150 hari setelah tanam. Bunga berwarna

putih agak ungu pucat, dan dapat menyerbuk sendiri. Polongnya, yang

berkembang dalam kelompok, biasanya mengandung 2-3 biji yang berbentuk

bundar atau pipih, dan sangat kaya akan protein dan minyak. Warna biji berbeda-

beda menurut kultivar (Rubatzky dan Yamaguchi, 1997).

Gambar 1. Tanaman kedelai hitam (www.wikipedia.org.com)

Kegunaan pangan umumnya berkorelasi dengan warna biji. Biji berwarna

hijau dan kuning diproduksi terutama untuk sayuran (biji yang dapat dimakan).

Kultivar berbiji besar warna kuning digunakan untuk membuat tahu. Umumnya,

kultivar berbiji kuning kecil kaya akan minyak dan memiliki kandungan protein

rendah, sedangkan kultivar berbiji hitam memiliki kandungan protein tinggi dan

kandungan minyak rendah. Bergantung pada tipe biji, kandungan karbohidrat

Page 11: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

11

dapat berkisar 15-25%, protein mencapai 50% dan kultivar tertentu mengandung

minyak hingga 25%. Polong kultivar minyak biji umumnya mengandung 1-2 biji,

sedangkan kultivar sayuran biasanya 2-3 biji (Rubatzky dan Yamaguchi, 1997).

Gambar 2. Biji Kedelai Kuning mentah

Kedelai yang berkulit hitam saat ini sedang menjadi incaran peneliti gizi

dan kesehatan. Karena ternyata, di dalam kedelai hitam mengandung antosianin.

Antosianin tersebut sangat potensial mencegah proses oksidasi yang terjadi

secara dini dan menimbulkan penyakit degeneratif. Oksidasi LDL akan memicu

berkembangnya penyakit tekanan darah tinggi dan berkembangnya penyakit

jantung koroner, stroke dan beragam penyakit berbahaya lainnya (Astuti, 1995).

Gambar 3. Biji Kedelai hitam mentah

Page 12: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

12

Antosianin dari kulit kedelai mampu menghambat oksidasi LDL kolesterol,

dengan rajin mengonsumsi tempe dan produk olahan kedelai hitam sebanyak

150 gram/ hari mampu menurunkan kadar kolesterol. Alangkah sayangnya jika

selama ini masyarakat hanya mendengar manfaat antosianin di dalam buah

blueberry. Padahal kenyataannya, kandungan antosianin di dalam kedelai hitam

lebih besar dibandingkan blueberry.

Selain mampu menghambat oksidasi LDL, kandungan flavonoid yang

dimiliki kedelai hitam dapat berfungsi sebagai antikanker. Kandungan

flavonoid,banyak ditemukan dalam buah-buahan, sayur-sayuran, dan biji-bijian.

Tidak hanya berfungsi sebagai antioksidan, kedelai hitam mampu mengurangi

gejala- gejala menopause pada wanita. Karena struktur kedelai mirip dengan

struktur hormon estrogen. Salah satu senyawa yang menyerupai estrogen yang

terdapat di dalam tanaman adalah isoflavon. Di samping itu, kedelai hitam dapat

menghambat penuaan dini pada wanita jika dikonsumsi secara rutin. Olahan

kedelai hitam memang tidak semenarik kedelai kuning. Misalnya, olahan kedelai

hitam menjadi tahu akan berwarna abu-abu. Sehingga tidak jarang produk olahan

kedelai hitam malah dihindari konsumen (http://wikipedia.org)

2. Koro Hitam (Lablab purpureus)

Tanaman yang hampir mirip dengan kedelai hitam ini sering disebut

dengan kacang India atau kacang Mesir. Warna yang mirip dengan kedelai hitam

tetapi lebih legam daripada kedelai hitam dan bentuk yang sedikit lebih besar,

kurang banyak dimanfaatkan oleh para pengguna jenis legume, karena tekstur

yang keras dan berkulit tebal.

Kedudukan tanaman Koro hitam dalam sistematik tumbuhan (taksonomi)

dapat diklasifikasikan sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Page 13: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

13

Division : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Ordo : Fabales

Family : Fabaceae

Genus : Lablab

Species : Lablab purpureus ( Martin dan Leonardo, 1962 dalam

Tjitrosoepomo, 1996).

Secara morfologi tanaman ini adalah tanaman tahunan berumur pendek,

tetapi terutama ditanam sebagai tanaman setahun untuk menghasilkan polong

yang dapat dimakan. Tanaman ini tumbuh baik mulai dari ketinggian permukaan

laut hingga dataran tinggi (2200 m) dan di wilayah dengan curah hujan rendah

dan suhu tinggi, serta toleran terhadap genangan. Tanaman koro hitam memiliki

pola pertumbuhan merambat dengan panjang batang jalar mencapai 6-10 cm jika

dilanjari. Daun trifoliatnya besar (15 cm), berbentuk mirip belah ketupat dan

berperan dalam memproduksi biomassa dalam jumlah besar.

Bunga berwarna putih, merah jambu, atau ungu kebanyakan menyerbuk

sendiri. Polong berwarna hijau atau ungu berbentuk rampin pipih, oblong dan

sering melengkung. Panen dilakukan ketika polong mencapai panjang 5-10 cm,

dan sebelum biji matang. Polong mengandung tiga hingga enam biji kecil bundar

matang sempurna dalam waktu 3-5 bulan.

Gambar 4. Tanaman koro hitam (www.wikipedia.org.com)

Page 14: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

14

Warna biji biasanya putih atau hitam tetapi kadang-kadang ditemukan

juga warna coklat kemerahan dan berbintik-bintik, semuanya memiliki hilum

(pusar biji)putih, panjang dan terlihat jelas. Kultivar berbiji putih mengandung

glukosida sianogenik dan penghambat tripsin dalam jumlah kecil sehingga tidak

beracun sedangkan kultivar berbiji gelap mengandung kedua senyawa tersebut

dalam jumlah besar. Polong tanaman koro hitam mengandung 4-5% protein. Biji

kering memiliki kandungan karbohidrat 50-60% dan protein 20-25% (Rubatzky

dan Yamaguchi, 1997).

Gambar 5. Koro hitam mentah

Tanaman dan biji koro hitam belum begitu banyak ditemukan kegunaan

dan manfaatnya, karena tanaman dan biji koro hitam hanya digunakan sebagai

campuran sayur bagi masyarakat pedesaan.

3. Koro Kratok (Phaseolus lunatus)

Budidaya tanaman ini tersebar luas, mulai dari wilayah utara Brazil hingga

menjadi tanaman kacang pangan pokok penting di beberapa wilayah afrika dan

asia Tenggara. Peninggalan koro kratok berbiji kecil yang ditemukan di Amerika

Tengah telah berumur sekitar 2000 tahun. Tipe liar tanaman ini selanjutnya

ditemukan di Meksiko, Amerika Tengah dan seluruh wilayah Andes.

Kedudukan tanaman Koro hitam dalam sistematik tumbuhan (taksonomi)

dapat diklasifikasikan sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Page 15: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

15

Division : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Ordo : Fabales

Family : Fabaceae

Genus : Phaseolus

Species : Phaseolus lunatus (Tjitrosoepomo, 1996).

Secara morfologi tanaman ini mempunyai biji agak berbentuk bulan,

panjang polong oblong yang agak melengkung berkisar antara 5 hingga 15 cm

dengan lebar 2-3 cm. Sebagian besar kultivar biasanya mengandung 2-4 biji,

walaupun ada yang berisi hingga 6 biji. Polong kultivar tertentu gemuk; yang lain

agak ramping. Biji besar pipih dan oblong pada tipe tanaman tertentu memiliki

panjang hingga 3 cm. Tipe biji yang lain juga pipih, tetapi agak bundar dan

panjangnya sekitar 1 cm; permukaan biji kedua tipe ini rata.

Kultivar yang umum ditanam memilki warna kulit biji hijau muda atau

putih; yang lain dapat berwarna merah, ungu, coklat, atau hitam. Dua kotiledon

daun biji besar merupakan bagia terbesar dari volume biji. Biji tipe liar memiliki

kandungan glukosida sianogenik tinggi dan harus direndam sebelum atau selama

pemasakan (Rubatzky dan Yamaguchi, 1997).

Gambar 6. Koro kratok mentah

Page 16: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

16

Lima

Gambar 7. Biji koro kratok yang masih muda (www.wikipedia.org.com)

Kandungan gizi biji koro kratok dalam 100 gram adalah protein 14,66g;

serat fiber 13,16g; folate 156,23g; zat besi 4,49mg; phosphor 208,68mg;

magnesium 80,84mg dan vitamin B1 (thiamin) 0,30mg ( Larco, 2001).

Kandungan gizi koro kratok dapat dilihat pada tabel 1.

Tabel 1. Kandungan beberapa zat biji koro kratok per 100 gram Zat Gizi Kandungan

Protein 14.66 g Serat pangan 13.16 g Vitamin B1 (thiamin) 0.30 mg Zat besi 4.49 mg Copper 0.44 mg Phosphor 208.68 mg Magnesium 80.84 mg Mangan 0.97 mg Potassium 955.04 mg Folate 156.23 mcg Tryptophan 0.17 g

Sumber : Larco Hoyle, Rafael 2001.

B. TEMPE

Tempe secara luas dikenal sebagai makanan khas Indonesia, dan sangat

digemari oleh masyarakat Jawa. Ada berbagai macam tempe di Indonesia seperti

misalnya tempe gembus dibuat dari ampas tahu, tempe lamtoro dibuat dari biji

lamtoro, tempe benguk dibuat dari biji koro benguk, tempe koro dibuat dari koro,

tempe bongkrek dibuat dari ampas kelapa, tempe gude dibuat dari kacang gude

dan tempe kedelai dibuat dari kedelai. Dari beberapa jenis tempe tersebut yang

Page 17: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

17

paling banyak digemari masyarakat adalah tempe kedelai. Tempe dibuat dengan

proses fermentasi kedelai dengan kapang jenis Rhizopus.

Tempe merupakan makanan bergizi tinggi sehingga makanan ini

mempunyai arti strategis dan sangat penting untuk pemenuhan gizi. Lebih dari

itu, tempe mempunyai keunggulan-keunggulan lain, yaitu mempunyai kandungan

senyawa aktif; teknologi pembuatannya sederhana; harganya murah; mempunyai

citarasa yang enak; dan mudah dimasak

Tempe bermutu tinggi bila kacang terlekat dengan jalinan miselium putih.

Jika proses fermentasi dibiarkan terlalu lama, spora hitam mungkin terbentuk di

permukaan. Spora tersebut tidak berbahaya namun mempengaruhi kenampakan

dan penerimaan konsumen ( Anonima, 2008).

Tempe mempunyai ciri-ciri berwarna putih, tekstur kompak dan flavour

spesifik. Warna putih disebabkan adanya miselia jamur yang tumbuh pada

permukaan biji-bijian. Tekstur yang kompak juga disebabkan oleh miselia-miselia

jamur yang menghubungkan antara biji-biji. Sedangkan flavour yang spesifik

disebabkan oleh terjadinya degradasi komponen-komponen dalam kedelai

selama fermentasi ( Kasmidjo, 1990 dalam Supriyadi, 1998).

1. Tempe Kedelai

Tempe tergolong sebagai makanan hasil fermentasi oleh jamur Rhizopus

s.p. Tempe adalah produk fermentasi yang amat dikenal oleh masyarakat

Indonesia. Tempe dapat dibuat dari berbagai bahan. Tetapi yang biasanya

dikenal sebagai tempe oleh masyarakat pada umumnya ialah tempe yang dibuat

dari kedelai (Astuti, 1995).

Tempe berpotensi untuk digunakan melawan radikal bebas, sehingga

dapat menghambat proses penuaan dan mencegah terjadinya penyakit

degeneratif (aterosklerosis, jantung koroner, diabetes melitus, kanker, dan lain-

lain). Selain itu tempe juga mengandung zat antibakteri penyebab diare, penurun

kolesterol darah, pencegah penyakit jantung, hipertensi, dan lain-lain.

Page 18: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

18

Komposisi gizi tempe baik kadar protein, lemak, dan karbohidratnya tidak

banyak berubah dibandingkan dengan kedelai. Namun, karena adanya enzim

pencernaan yang dihasilkan oleh kapang tempe, maka protein, lemak, dan

karbohidrat pada tempe menjadi lebih mudah dicerna di dalam tubuh

dibandingkan yang terdapat dalam kedelai. Oleh karena itu, tempe sangat baik

untuk diberikan kepada segala kelompok umur (dari bayi hingga lansia),

sehingga bisa disebut sebagai makanan semua umur. Dibandingkan dengan

kedelai, terjadi beberapa hal yang menguntungkan pada tempe.

2. Tempe Non Kedelai

Selain tempe berbahan dasar kacang kedelai, terdapat pula berbagai

jenis makanan berbahan bukan kedelai yang juga disebut tempe. Terdapat 2

golongan besar tempe menurut bahan bahan dasarnya, yaitu tempe berbahan

dasar Legume dan tempe berbahan dasar non-legume (Astawan M, 2003).

Tempe bukan kedelai yang berbahan dasar legume mencakup tempe

koro benguk (dari biji koro benguk (Mucuna pruriens, L.) berasal dari sekitar

Waduk Kedungombo (Handayani, 1992), tempe gude (dari kacang gude/Cajanus

cajan), tempe gembus dari ampas tahu/ampas gude (populer didaerah Lombok

dan Bali), tempe kacang hijau (dari kacang hijau terkenal didaerah Yogyakarta),

tempe kacang kecipir (dari biji kecipir (Psopocaarpus tetragonolobus), tempe

koro pedang (dari biji koro pedang Canavalia ensiformis, tempe lupin dari lupin,

Lupinus Angustifolius), tempe kacang merah (dari kacang merah, Phaseolus

vulgaris), tempe kacang tunggak (dari kacang tunggak, Vigna unguiculata),

tempe koro wedhus (dari biji koro wedhus, Lablab purpureus), tempe koro (dari

koro kratok, Phaseolus lunatus banyak ditemukan di Amerika utara), dan tempe

menjes (dari kacang tanah dan kelapa terkenal disekitar Malang).

Tempe berbahan dasar non-legume mencakup tempe mungur (dari biji

mungur, Entrolobium samon), tempe bongkrek dari bungkil kapuk atau ampas

Page 19: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

19

kelapa yang terkenal didaerah Banyumas, tempe jamur merang (dari jamur

merang) (Astawan, 2003)

Kacang gude, komak, dan koro benguk, dan koro pedang biji

putih/biji merah dapat dibuat tempe. Masyarakat Trenggalek (Jawa Timur)

biasa mengkonsumsi tempe koro pedang. Biji kacang-kacangan tersebut

memiliki kulit yang keras sehingga sebelum dibuat tempe perlu pengupasan kulit

biji secara mekanis.

Komak, koro benguk dan koro pedang mengandung senyawa beracun,

sehingga dalam pembuatan tempe, setelah kulit biji dikupas, direbus dengan

air yang dicampur abu kapus dan selanjutnya biji direndam dalam air dua kali

selama selama dua hari dua malam agar kandungan racun dapat dinetralkan.

Perendaman terbaik bila dilakukan pada air yang mengalir, bila hal tersebut tidak

dapat dilakukan (air tetap), maka air perlu sering diganti agar terhindar dari

aroma kurang sedap. Proses selanjutnya, termasuk jenis ragi yang digunakan

relatif sama dengan pembuatan tempe kedelai (http://id.wikipedia.org).

3. Fermentasi Tempe

Fermentasi adalah proses kimiawi yang komplek sebagai akibat

pertumbuhan maupun metabolisme mikroba yang merubah bahan-bahan mentah

yang murah bahkan tidak berharga menjadi produk-produk yang bernilai ekonomi

tinggi. Proses kimiawi yang terjadi disebabkan oleh enzim dan enzim yang

berperan dihasilkan oleh mikroorganisme atau telah ada dalam bahan pangan.

Fermentasi bahan makanan menyebabkan perubahan fisik dan kimia yang

menguntungkan seperti flavour, aroma, tekstur, daya cerna dan daya simpan

(Astuti, 1995).

Fermentasi merupakan suatu proses oksidasi karbohidrat anaerob

(Samson et al., 1988) dan merupakan hasil kegiatan beberapa jenis organisme,

yaitu beribu-ribu jenis bakteri, khamir, dan kapang yang telah dikenal. Jadi

mikroba yang digunakan dalam proses fermentasi merupakan unsur penentu

Page 20: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

20

terhadap berhasil atau tidaknya proses fermentasi bersangkutan.

Hasil fermentasi merupakan bagian penting dalam menu makanan dunia.

Fermentasi mengakibatkan perubahan karbohidrat dari bahan pangan, tetapi

kerugian ini dapat tertutup oleh keuntungan yang diperoleh. Protein, lemak, dan

polisakarida dapat dihidrolisis sehingga bahan pangan hasil fermentasi dapat

lebih mudah dicerna. Fermentasi menyebabkan perubahan flavour yang

dipertimbangkan lebih disukai daripada bahan bakunya (Sutardi and Bucle,

1985).

Sifat-sifat bahan pangan hasil fermentasi ditentukan oleh mutu dan sifat-sifat asal

bahan pangan, perubahan yang terjadi sebagai hasil fermentasi mikroorganisme

dan interaksi yang terjadi diantara kegiatan-kegiatan tersebut dan zat-zat yang

merupakan pembentuk bahan pangan tersebut (Sutardi and Bucle, 1985).

Proses pengolahan tempe pada umumnya meliputi tahap pencucian,

perendaman bahan mentah, perebusan, pengulitan, pengukusan, penirisan dan

pendinginan, inokulasi, pemanasan, kemudian pemeraman 2-3 hari. Perendaman

mengakibatkan ukuran biji menjadi lebih besar dan stuktur kulit mengalami

perubahan sehingga lebih mudah dikupas. Perebusan dan pengukusan selain

menaikkan biji dimaksud untuk membunuh bakteri kontaminan dan mengurangi

zat antigizi. Penirisan dan pendinginan bertujuan mengurangi kadar air dalam biji

dan menurunkan suhu biji sampai sesuai dengan kondisi pertumbuhan jamur

(Samson, 1987).

Fujimaki (1968) melaporkan selama fermentasi terjadi perubahan

enzimatik yaitu bau dan rasa karena adanya aktivitas enzim protease. Selama

fermentasi miselia jamur yang berwarna putih akan menyelubungi permukaan

tempe. Jamur akan mengeluarkan enzim-enzim yang dapat memecah komponen

dalam bahan yaitu lemak, protein dan karbohidrat menjadi bahan yang lebih

sederhana ( Fujimaki, 1968).

Page 21: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

21

Aktivitas mikroorganisme didalam proses pembuatan tempe secara

tradisional terutama terdapat 2 tahapan proses yaitu pada :

1) Proses Fermentasi Awal (Fermentasi I)

Proses perendaman dilakukan terhadap kedelai yang telah

direbus dan atau dikuliti selama semalaman (12 jam), pada temperatur

kamar (25-300C), dengan menggunakan air tanah atu air kran. Pada

proses ini terjadi proses fermentasi awal oleh bakteri pembentuk asam-

asam organik. Tujuan utama proses ini adalah untuk pengasaman

kedelai. Untuk maksud pengasaman ini, maka pada proses perendaman

dilakukan inokulasi bakteri pembentuk asam yaitu dengan menambahkan

air ke dalam rendaman dari proses perendaman sebelumnya, sehingga

tahapan ini disebut merupakan proses fermentasi I. Dengan kondisi

demikian (12 jam perendaman) terjadi proses pembentukan asam-asam

organik oleh bakteri pembentuk asam/pengasaman. Sedangkan pada

koro proses perendamannya 3 x 24 jam untuk menghilangkan senyawa

sianida (HCN) (Handayani, 1992).

2) Proses Fermentasi Utama (pemeraman)

Mikroorganisme yang berperan utama didalam pembuatan tempe adalah

kapang Rhizopus oligosporus. Aktivitas fisiologis kapang pada proses

fermentasi tempe dimulai sejak diinokulasinya inokulum (ragi tempe) pada

kedelai yang telah siap difermentasikan yaitu kedelai dan berbagai jenis

koro masak yang telah yang telah dikuliti dan ditiriskan. Spora kapang

tersebut mulai tumbuh berkecambah dengan membentuk benang-benang

hifa yang makin tumbuh memanjang membalut dan menembus biji

koteledon kedelai. Apabila benang-benang tersebut telah sedemikian

padat, maka terbentuklah tempe yang kompak, putih dan dengan aroma

khas tempe. Secara keseluruhan tahapan ini disebut sebagai proses

fermentasi II.

Page 22: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

22

4. Kapang Tempe

Mikroorganisme yang berperan utama di dalam pembuatan tempe adalah

kapang Rhizopus sp. Didalam klasifikasi, kapang ini digolongkan ke dalam genus

Rhizopus, familia Mucoraceae, ordo Mucorales, subklass Zygomicotina, dan

klass zygomycetes (Hesseltine, 1985).

Kapang yang tergolong dalam genus Rhizopus sp. ditandai dalam sel

vegetatif yang berupa benang yang disebut hifa/misellium yang membentuk

stolon-stolon (semacam ruas/buku) yang dilengkapi dengan rhizoid (mirip akar)

yang tumbuh bercabang-cabang masuk kedalam substrat. Pada tempat

tumbuhnya rhizoid terdapat sporangiospora yang tumbuh mengarah keudara

(berlawanan arah dengan rhizoid) dan dari tempat inilah terbentuk spora didalam

spora didalam suatu sporangium. Kapang jenis Rhizopus sp. mempunyai sifat

tumbuh cepat dan membentuk koloni yang terdiri dari benang-benang misellia.

Hesseltin (1966 dalam Pawiroharsono, 1995), menambahkan bahwa

aktivitas fisiologis kapang pada proses fermentasi tempe dimulai sejak

diinokulasikanya inokulum (ragi tempe) pada kedelai yang telah siap

difermentasikan yaitu kedelai masak yang telah dikuliti dan ditiriskan. Spora

kapang tersebut mulai tumbuh berkecambah dengan membentuk benang-

benang hifa yang makin tumbuh memanjang membalut dan menembus biji

kotiledone kedelai. Apabila benang-benang tersebut telah sedemikian padat

maka terbentuklah tempe yang kompak, putih dan dengan aroma khas tempe.

Page 23: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

23

Rhizopus sebagai kapang pemeran utama dalam proses pembuatan

tempe, jenis kapang ini telah terbukti dapat memfermentasikan kedelai dan

membentuk tempe secara sempurna. Waktu yang dibutuhkan sampai terbentuk

tempe secara sempurna 24-36 jam (Samson et al., dalam Sutardi, 1988)

Selama proses fermentasi berlangsung, kedelai berubah menjadi tempe

dan perubahan tersebut pada dasarnya dapat dibedakan sebagai perubahan

secara fisik dan secara kimia. Perubahan sifat fisik tempe dibandingkan dengan

kedelai antara lain, bertekstur kompak, warna putih dengan aroma khas tempe.

Perubahan secara kimia ditandai dengan terjadinya hidrolisis senyawa-senyawa

komplek (protein, karbohidrat, lemak) menjadi senyawa yang lebih sederhana

dan mudah dicerna.

Disamping itu masih terdapat berbagai senyawa baru yang disintesis

selama fermentasi yang bermanfaat untuk kesehatan seperti asam lemak tidak

jenuh, isoflavon faktor II (Hesseltin, 1966 dalam Pawiroharsono, 1995).

C. ISOFLAVON

Senyawa isoflavon merupakan senyawa metabolit sekunder yang banyak

disintesis oleh tanaman. Namun, tidak sebagai layaknya senyawa metabolit

sekunder karena senyawa ini tidak disintesa oleh mikroorganisme. Dengan

demikian, mikroorganisma tidak mempunyai kandungan senyawa ini. Oleh

karena itu, tanaman merupakan sumber utama senyawa isoflavon di alam. Dari

beberapa jenis tanaman, kandungan isoflavon yang lebih tinggi terdapat pada

tanaman Leguminoceae, khususnya pada tanaman kedelai. Pada tanaman

kedelai, kandungan isoflavon yang lebih tinggi terdapat pada biji kedelai,

khususnya pada bagian hipokotil (germ) yang akan tumbuh menjadi tanaman.

Sebagian lagi terdapat pada kotiledon yang akan menjadi daun pertama dari

tanaman (Pradana, 2008).

1. Isoflavon Pada Kedelai

Page 24: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

24

Mengingat berbagai potensi kedelai sebagai sumber gizi dan senyawa

aktif serta prospeknya untuk dikembangkannya produk-produk baru, kedelai

banyak disebut sebagai “The golden bean, the miracle bean, food for the future”.

(Pradana, 2008).

Kandungan isoflavon pada kedelai berkisar 2--4 mg/g kedelai. Senyawa

isoflavon ini pada umumnya berupa senyawa kompleks atau konjugasi dengan

senyawa gula melalui ikatan glukosida. Jenis senyawa isoflavon ini terutama

adalah genistin, daidzin, dan glisitin (Pradana, 2008).

Sebanyak 99% isoflavon pada kedelai dalam bentuk glikosida (yang

berikatan dengan glikosa), yang terdiri dari 64% genistin, 23% daidzin, dan 13%

glisitin (Naim et al., (1974). Genestein dan deidzin serta konjugat glukosidanya

berada dalam konsentrasi diatas tiga milligram per 1 biji kedelai (Walter, 1941).

Isoflavon yang dominan pada kedelai terdapat dalam bentuk glikosida,

sedangkan yang dominan pada produk kedelai yang mengalami fermentasi

adalah aglikon (Coward et al., 1993). Bentuk glikosida dipertahankan oleh

tanaman sebagai bentuk inaktif sehingga dibutuhkan sebagai antioksidan.

Bentuk aktif glikosida adalah aglukon, yang dihasilkan dari pelepasan glukosa

dan glikosida (Anderson et al., 1998).

Isoflavon kedelai dapat menurunkan resiko penyakit jantung

dengan membantu menurunkan kadar kolesterol darah. Protein kedelai

telah terbukti mempunyai efek menurunkan kolesterol, yang di percaya

karena adanya isoflavon di dalam protein tersebut. Studi epidemologi juga

telah membuktikan bahwa masyarakat yang secara teratur mengkonsumsi

makanan dari kedelai, memiliki kasus kanker payudara, kolon dan prostat

yang lebih rendah. Isoflavon kedelai juga terbukti, melalui penelitian in

vitro dapat menghambat enzim tirosin kinase, oleh karena itu dapat

menghambat perkembangan sel-sel kanker dan angiogenesis. Hal ini

berarti suatu tumor tidak dapat membuat pembuluh darah baru, sehingga

Page 25: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

25

tidak dapat tumbuh (Koswara, 2006).

Peranan isoflavon dalam membantu menurunkan osteoporosis juga

telah diteliti. Konsumsi protein kedelai dengan isoflavon telah terbukti dapat

mencegah kerapuhan tulang pada tikus yang digunakan sebagai model

untuk penelitian osteoporosis. Studi yang lain menunjukkan hasil yang

sama pada saat menggunakan genistein saja. Ipriflavone, obat yang

dimetabolisme menjadi daidzein telah terbukti dapat menghambat kehilangan

kalsium melalui urine pada wanita post monopouse (Koswara, 2006).

Produk kedelai yang mengandung isoflavon dapat membantu

pengobatan simptom monopouse. Pada wanita yang memproduksi

sedikit estrogen, isoflavon (phitoestrogen) dapat menghasilkan cukup

aktivitas estrogen untuk mengatasi symptom akibat monopouse, misalnya

hot flashes. Suatu penelitian menunjukkan bahwa wanita yang

mengkonsumsi 48 gram tepung kedelai per hari mengalami gejala hot flashes 40

% lebih rendah (Koswara, 2006).

Makanan yang terbuat dari kedelai mempunyai jumlah isoflavon yang

bervariasi, tergantung bagaimana mereka diproses. Makanan dari kedelai seperti

tahu, susu kedelai, tepung kedelai dan kedelai utuh mempunyai kandungan

isoflavon berkisar antara 130 –380 mg/100 gram. Kecap dan minyak kedelai

tidak mengandung isoflavon. Produk kedelai yang digunakan sebagai bahan

tambahan pangan, seperti isolat dan konsentrat protein kedelai mempunyai

kandungan isoflavon yang bervariasi, tergantung bagaimana proses

pengolahannya. Misalnya, hasil penelitian menunjukkan bahwa

penggunaan alkohol dalam proses ekstraksi menghasilkan kadar isoflavon yang

rendah (Koswara, 2006).

Page 26: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

26

Tabel 2. Struktur Daidzin, Genistin dan Glisitin

Nama Senyawa Struktur

Genistin

Glisitin

Daidzin

2. Isoflavon Pada Tempe Kedelai

Pada kedelai mengalami berbagai perubahan pada proses pembuatan

tempe baik oleh proses fisik maupun proses enzimatik oleh adanya aktivitas

mikroorganisme. Keterlibatan mikroorganisme pada proses pembuatan tempe

O

OH

OH

O

O

O

OH

HOH

HOH

H

CH2OH

H

OH

O

H3CO

OO

OH

HOH

H

H

OH

H

CH 2OH

O

HOH2C

HH

OHH

OH

OH

OO

OH

O

OH

Page 27: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

27

terutama terjadi pada proses perendaman oleh bakteri-bakteri pembentuk asam

dan proses fermentasi oleh kapang khususnya Rhizopus oligosporus.

Sebagai akibat perubahan-perubahan tersebut tempe menjadi lebih enak,

lebih bergizi, dan lebih mudah dicerna. Salah satu factor penting dalam

perubahan tersebut adalah terbebasnya senyawa-senyawa isoflavon dalam

bentuk bebas (aglukon), dan teristimewa hadirnya Faktor-II, yang terdapat pada

tempe tetapi tidak terdapat pada kedelai, ternyata berpotensi tinggi (dibanding

dengan jenis isoflavon yang lainnya) sebagai antioksidan (Gyorgy dkk., 1964),

antihemolitik (Murata, 1985), penurun tekanan darah, anti kanker (Zilleken,

1986), dan sebagainya

Selama proses pengolahan, baik melaui fermentasi maupun proses non-

fermentasi, senyawa isoflavon dapat mengalami biokonversi, terutama melalui

proses hidrolisis sehingga dapat diperoleh senyawa isoflavon bebas yang disebut

aglukan yang lebih tinggi aktivitasnya. Senyawa aglukan tersebut adalah

genistein, daidzein dan glisitein (Pawiroharsono, 2001). Struktur dan sifat kimia

daidzein, genistein, glisitein dan faktor-2 ditampilkan pada Gambar 8, 9, 10, dan

11.

Nama Kimia : Daidzein, 7,4’-dihidroksi isoflavon

Rumus Molekul : C15H10O4

Kelarutan : Tidak larut dalam air

Gambar 8. Struktur dan Sifat Kimia Daidzein (Ariani, 2009)

OH

OOH

O

Daidzein

Page 28: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

28

Nama Kimia : Genistein, 5,7,4’-trihidroksi isoflavon

Rumus Molekul : C15H10O5

Kelarutan : Larut dalam metanol dan etanol

Gambar 9. Struktur dan Sifat Kimia Genistein (Ariani, 2009)

Nama Kimia : Glisitein, 6-metoksi-7,4’-trihidroksi isoflavon

Rumus Molekul : C16H12O5

Kelarutan : Tidak larut dalam air

Gambar 10. Struktur dan Sifat Kimia Glisitein (Ariani, 2009)

Nama Kimia : Faktor-2 , 6,7,4’-trihidroksi isoflavon

Rumus Molekul : C15H10O5

OH

OH

OOH

O

Genistein

OH

OH O

H3CO

O

Glisitein

OH

OH

OH

O

O

Faktor II

Page 29: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

29

Kelarutan : Tidak larut dalam air

Gambar 11. Struktur dan Sifat Kimia faktor-2 (Ariani, 2009)

3. Metabolisme Isoflavon pada Proses Pengolahan Kedelai menjadi Tempe

Senyawa isoflavon merupakan salah satu komponen yang juga

mengalami metabolisme. Senyawa isoflavon ini pada kedelai berbentuk senyawa

konjugat dengan senyawa gula melalui ikatan -O- glikosidik. Senyawa isoflavon

aglukon ini dapat mengalami transformasi lebih lanjut membentuk senyawa

transforman baru. Hasil transformasi lebih lanjut dari senyawa aglukon ini justru

menghasilkan senyawa-senyawa yang mempunyai aktivitas biologi lebih tinggi.

Hal ini terlihat pada Faktor-II, yang mempunyai aktivitas antioksidan dan

antihemolisis lebih baik dari daidzein dan genistein. Selain itu, telah ditemukan

bahwa senyawa isoflavon lebih aktif 10 kali dari senyawa karboksikroman.

Faktor-II merupakan senyawa yang sangat menarik perhatian, karena

senyawa ini tidak terdapat pada kedelai dan hanya terdapat pada tempe.

Senyawa ini terbentuk selama proses fermentasi oleh aktivitas mikroorganisme.

Senyawa ini mula-mula ditemukan kembali oleh Gyorgy (1964) pada ekstrak

tepung tempe. Perkembangan selanjutnya terbukti bahwa Faktor-II tersebut pada

kedelai jumlahnya sangat kecil.

Setelah fermentasi, Faktor-II akan dibebaskan walaupun jumlahnya

sangat kecil. Faktor-II dipandang sebagai senyawa yang sangat prospektif

sebagai senyawa antioksidan (10 kali aktivitas dari vitamin A atau karboksi

kroman dan sekitar 3 kali dari senyawa isoflavon aglukon lainnya pada tempe)

serta antihemolitik. Dengan demikian, karakterisasi mikroorganisme transforman

Faktor-II perlu diteliti. Menurut penelitian Barz et al. (1993) biosintesis Faktor-II

dihasilkan melalui demetilasi glisitein oleh bakteri Brevibacterium epidermis dan

Micrococcus luteus atau melalui reaksi hidroksilasi daidzein.

Selama proses pengolahan, baik melaui fermentasi maupun proses non-

fermentasi, senyawa isoflavon dapat mengalami biokonversi, terutama melalui

Page 30: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

30

proses hidrolisis sehingga dapat diperoleh senyawa isoflavon bebas yang disebut

aglukan yang lebih tinggi aktivitasnya.

Senyawa isoflavon aglukan daidzein dan genistein dapat mengalami

transformasi lebih lanjut membentuk senyawa baru, yaitu faktor-2

(Pawiroharsono, 2001 ). Senyawa faktor-2 ini tidak dijumpai pada kedelai yang

tidak difermentasi (Ariani, 2001).

4. Manfaat Senyawa Isoflavon Pada Tempe Kedelai

Isoflavon pada tempe dapat mencegah aktivitas sel menjadi sel kanker,

tetapi juga dapat memperbaiki metabolisme hormon steroid, menurunkan

kolesterol dan trigleserida, serta melindungi sel-sel hati dari paparan senyawa

beracun. Selain itu Isoflavon juga dapat berfungsi untuk memperlancar sirkulasi

darah. Isoflavon mempunyai beberapa efek positif dari isoflavon adalah

antiadrenalin, yang membuat jantung bekerja lebih santai, di samping

antiperadangan serta mencegah ketidak teraturan denyut jantung

Khususnya isoflavon pada tempe yang aktif sebagai antioksidan, yaitu

Faktor-2, terbukti berpotensi sebagai anti-kontriksi (penyempitan) pembuluh

darah dan juga berpotensi menghambat pembentukan LDL (low density

lipoprotein). Dengan demikian, isoflavon dapat mengurangi terjadinya

arteriosclerosis pada pembuluh darah.

Zat yang terkandung dalam hasil olahan kedelai ini dapat berfungsi pula

untuk mencegah terjadinya kerusakan permukaan dinding pembuluh darah

jantung (koroner), tetapi sekaligus memperbaikinya. Termasuk pula mengikis

endapan kolesterol pada dinding pembuluh darah koroner. Hasil olahan kedelai

lain seperti minyak kedelai, juga dapat menangkal kolesterol. Menurut Zilliken

(1987), Faktor-II merupakan senyawa isoflavon yang paling besar pengaruhnya,

karena itulah isoflavon menumbuhkan harapan cerah pada pencegahan dan

penurunan kejadian penyakit jantung. Manfaat senyawa isoflavon adalah sebagai

Page 31: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

31

Antitumor atau Antikanker, Antivirus, Antikolesterol, Antialergi, berpengaruh pada

sistem Sirkulasi dan Mencegah Jantung Koroner, Membantu Produksi Hormon

Estrogen dan Mencegah Osteoporosis (Pawiroharsono, 1995)

D. ANTIOKSIDAN

Antioksidan dapat berasal dari dalam tubuh dan luar tubuh. Didalam

tubuh kita memiliki sistem enzym antioksidan yang bekerja secara simultan

mematabolisme radikal bebas sehingga tidak meninggalkan kerusakan pada

jaringan (Hodgson and Levi, 2000). Sementara itu jenis antioksidan yang lainnya

berasal dari luar tubuh, yaitu yang berasal dari makanan, atau komponen bahan

makanan (fitokimia) seperti fenol (Yang, et al dalam Sri Retno DA dan Wiji Astuti,

2009), karotenoid (Nara, et al, 2001), atau alkaloid (Schultz, et al, 1984).

1. Pengertian Tentang Antioksidan

Radikal bebas adalah molekul yang kehilangan elektron, sehingga

molekul tersebut menjadi tidak stabil dan selalu berusaha mengambil elektron

dari molekul atom sel lain. Radikal bebas dapat dihasilkan dari hasil metabolisme

tubuh dan faktor eksternal seperti asap rokok, hasil penyinaran UV, zat kimiawi

dalam makanan dan polutan lain. Penyakit yang disebabkan oleh radikal bebas

bersifat kronis, yaitu dibutuhkan waktu bertahun-tahun untuk penyakit tersebut

menjadi nyata. Contoh penyakit yang sering dihubungkan dengan radikal bebas

adalah serangan jatung dan kanker ( Anonimb, 2008).

Antioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda,

memperlambat, mencegah proses oksidasi lipid. Dalam arti khusus, antioksidan

adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi oksidasi radikal

bebas dalam oksidasi lipid (Pratt, 1992, dalam Ardiansyah, 2007 ) .

Sumber-sumber antioksidan dapat dikelompokkan menjadi dua

kelompok, yaitu antioksidan sintetik (antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesa

reaksi kimia) dan antioksidan alami (antioksidan hasil ekstraksi bahan alami).

Page 32: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

32

Antioksidan alami di dalam makanan dapat berasal dari : (Pratt, 1992, dalam

Ardiansyah, 2007 ).

a. Senyawa antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen

makanan.

b. Senyawa antioksidan yang terbentuk dari reaksi-reaksi selama proses

pengolahan.

c. senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan ditambahkan ke

dalam makanan sebagai bahan tambahan pangan.

Berbagai nutrisi yang mengandung antioksidan di antaranya adalah

semua biji-bijian, kacang-kacangan, buah-buahan, sayuran, hati, tiram, unggas,

kerang, ikan, susu dan daging (Destiutami, 2007 ).

Kumalaningsih (2007) menyatakan bahwa terdapat tiga macam

antioksidan yaitu :

a. Antioksidan yang dibuat oleh tubuh kita sendiri yang berupa enzim antara

lain superoksida dismutase, glutathione peroksidase, perxidasi dan katalase.

b. Antioksidan alami yang diperoleh dari tanaman atau hewan yaitu tokoferol,

vitamin C, betakaroten, flavonoid dan senyawa fenolik.

c. Antioksidan sintetik yang dibuat dari bahan-bahan kimia yaitu Butylated

Hroxyanisole (BHA), BHT, PG dan EDTA yang ditambahkan dalam makanan

untuk mencegah kerusakan lemak.

Atas dasar fungsinya antioksidan dapat dibedakan menjadi lima yaitu :

(Kumalaningsih, 2007)

a. Antioksidan Primer

Antioksidan ini berfungsi untuk mencegah terbentuknya radikal bebas

baru karena ia dapat merubah radikal bebas yang ada menjadi molekul yang

berkurang dampak negatifnya sebelum sempat bereaksi.

b. Antioksidan Sekunder

Page 33: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

33

Antioksidan sekunder merupakan senyawa yang berfungsi menangkap

radikal bebas serta mencegah terjadinya reaksi berantai sehingga tidak terjadi

kerusakan yang lebih besar. Contoh yang popular, antioksidan sekunder adalah

vitamin E, vitamin C, dan betakaroten yang dapat diperoleh dari buah-buahan.

c. Antioksidan Tersier

Antioksidan tersier merupakan senyawa yang memperbaiki sel-sel dan

jaringan yang rusak karena serangan radikal bebas. Biasanya yang termasuk

kelompok ini adalah jenis enzim misalnya metionin sulfoksidan reduktase yang

dapat memperbaiki DNA dalam inti sel. Enzim tersebut bermanfaat untuk

perbaikan DNA dalam inti sel. Enzim tersebut bermanfaat untuk perbaikan DNA

pada penderita kanker.

d. Oxygen scavenger

Antioksidan yang termasuk Oxygen scavenger mengikat oksigen sehingga

tidak mendukung reaksi oksidasi, misalnya vitamin C.

e. Chelators / sequestrants

Mengikat logam yang mampu mengkatalis reaski oksidasi misalnya

asam sitrat dan asam amino.

Mekanisme kerja antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi pertama

merupakan fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen.

Antioksidan (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai

antioksidan primer. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan, yaitu

memperlambat laju autooksidasi dengan mekanisme pemutusan rantai

autooksidasi dengan pengubahan radikal lipida ke bentuk lebih stabil (Gordon,

1990 dalam Ardiansyah, 2007).

Reaksi oksidasi lemak yang terjadi pada makanan atau bahan makanan

berlemak dapat dihambat dengan pemberian zat antioksidan. Pada umumnya zat

antioksidan yang digunakan adalah zat antioksidan sintetik seperti Butylated

Page 34: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

34

Hydroxyanisole (BHA), Butylated Hydroxytoluene (BHT), Propyl Gallat (PG) dan

Etylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA). Sementara itu penggunaan zat

antioksidan sintetik tertentu misalnya BHT dapat menimbulkan akibat buruk

terhadap kesehatan konsumen seperti gangguan fungsi hati, paru, mukosa usus

dan keracunan. Salah satu usaha untuk mengatasi masalah tersebut adalah

mengganti zat antioksidan sintetik dengan zat antioksidan alami. Zat antioksidan

alami dapat diperoleh dari ekstrak bagian-bagian tanaman tertentu terutama yang

banyak mengandung senyawa-senyawa flavonoid yang tersusun dari gugus-

gugus fenol (Suryo dan Tohari, 1995).

Antioksidan yang dihasilkan oleh tubuh antara lain adalah :

1. Superoksida Dismutase

Antioksidan ini merupakan enzim yang bekerja bila ada pembantunya

yaitu berupa mineral-mineral seperti tembaga, mangan yang bersumber pada

kacang-kacangan, padi-padian. Dengan demikian sangat diperlukan sekali

mengkonsumsi bahan tersebut di atas. Sayangnya kita lebih senang

mengkonsumsi bahan yang enak dimakan. Bagi orang yang mampu, kekurangan

mineral dapat dilakukan dengan meminum multivitamin dan suplemen mineral

tetapi bagi orang yang hidupnya sedang-sedang saja lebih baik mengkonsumsi

mineral dari tanaman karena banyak juga tanaman yang dapat menghasilkan

SOD antara lain brokoli, bayam, sawi dan juga hasil-hasil olahan seperti tempe.

2. Glutathione Peroksidase

Adalah enzim yang berperan aktif dalam menghilangkan H2O2 dalam

tubuh dan mempergunakannya untuk merubah glutathione (GSH) menjadi

glutathine teroksidasi (GSSG). Makanan yang kaya glutahione adalah kubis,

brokoli, asparagus, alpukat dan kenari. Glutathione sangat penting sekali

Page 35: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

35

melindungi selaput-selaput sel. Senyawa ini merupakan tripeptida yang terdiri

dari asam amino glisin, asam glutamat dan sistein.

3. Katalase

Enzim katalase di samping mendukung aktivitas enzim SOD juga dapat

mengkatalisa perubahan berbagai macam peroksida dan radikal bebas menjadi

oksigen dan air. Enzim-enzim tersebut di atas dalam bekerjanya sengat

membutuhkan mineral-mineral penyusun sebagai berikut : Copper (Cu), Zinc

(Zn), Selenium (Se), Manganese (Mn), Besi (Fe) .

Jenis penggolongan antioksidan yang lain adalah berdasarkan sumber

diperoleh senyawa tersebut. Penggolongan ini ada dua yaitu antioksidan sintetik

dan antioksidan alami.

1. Antioksidan sintetik

Antioksidan sintetik efektif dalam mencegah ketengikan pada minyak dan

bahan pangan berlemak (Kikuzaki dan Nakatani, 1993). Contoh antioksidan

sintetik adalah BHA, BHT, propil galat dan lain-lain. Namun menurut Chang et al.

(1977), penggunaan BHT pada tikus percobaan dapat menyebabkan kerusakan

organ tubuh seperti paru-paru dan organ pencernaan. Oleh karena itu

penggunaan food additive (bahan tambahan makanan) lebih baik dibatasi

(Osawa dan Namiki, 1981 dalam Ariani dan Hastuti, 2008).

Penggunaan antioksidan tidak boleh berlebihan karena aktivitas

antioksidan akan hilang pada konsentrasi yang tinggi dan mungkin akan menjadi

prooksidan. Penggunaan antioksidan berlebihan akan menyebabkan senyawa

lebih bersifat sebagai akselerator daripada inhibitor dalam oksidasi lemak. Dalam

keadaan berlebih, antioksidan akan meningkatkan dekomposisi oksidasi lemak

dan pembentukan produk radikal.

2. Antioksidan Alami

Page 36: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

36

Antioksidan alami di dalam makanan dapat berasal dari (a) senyawa

antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen makanan, (b) senyawa

antioksidan yang terbentuk dari reaksi-reaksi selama proses pengolahan, (c)

senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan ditambahkan ke

makanan sebagai bahan tambahan pangan

Kebanyakan senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami

adalah berasal dari tumbuhan. Isolasi antioksidan alami telah dilakukan dari

tumbuhan yang dapat dimakan, tetapi tidak selalu dari bagian yang dapat

dimakan. Antioksidan alami tersebar di beberapa bagian tanaman, seperti pada

kayu, kulit kayu, akar, daun, bunga, biji, dan serbuk sari.

Kira-kira 2 % dari seluruh karbon yang difotosintesis oleh tumbuhan

diubah menjadi flavonoid atau senyawa yang berkaitan erat dengannya,

sehingga flavonoid merupakan salah satu golongan fenol alam terbesar.

Sebenarnya flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan hijau, sehingga pastilah

ditemukan pula pada setiap telaah ekstrak tumbuhan. Golongan flavonoid dan

senyawa yang berkaitan erat dengannya memiliki sifat-sifat antioksidan baik

didalam lipida cair maupun dalam makanan berlipida.

Di samping itu ada banyak bahan pangan yang dapat menjadi sumber

antioksidan alami, seperti rempah-rempah, dedaunan, teh, kokoa, biji-bijian,

serealia, buah-buahan, sayur-sayuran dan tumbuhan/alga laut. Bahan pangan ini

mengandung jenis senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan, seperti asam-

asam amino, asam askorbat, tokoferol, karotenoid, tannin, peptida, melanoidin,

produk-produk reduksi, dan asam-asam organik lain.

2. Antioksidan Pada Kedelai

Dalam suatu sistem biologis terdapat sistem pertahanan tubuh untuk

melawan atau meredam radikal bebas. Sistem pertahanan tubuh tersebut

didukung oleh zat-zat gizi yang berfungsi sebagai antioksidan, yaitu suatu

Page 37: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

37

senyawa yang dapat meredam dampak negatif radikal bebas maupun oksidan.

Dikenal ada empat tipe perlindungan (Mills, 1989), yaitu :

1. Senyawa yang berperanan dalam pencegahan radikal bebas, meliputi

peranannya dalam mempertahankan struktur sel, pencegahan terhadap

terhimpunnya subtansi-subtansi yang kemungkinan membentuk radikal

bebas; pengendalian terhadap distribusi zat besi. Antioksidan yang

termasuk dalam kategori ini adalah katalase dan glutathion peroksidase.

2. senyawa yang berperan sebagai pembersih radikal bebas. Termasuk

dalam golongan ini adalah vitamin E, vitamin C, betha karotin, glutathion

dan enzim superoksida dismutase.

3. Senyawa yang berperan dalam memperbaiki radikal bebas, terutama

dalam mempertahankan efektivitas glutathion.

4. Senyawa yang berperan dalam perbaikan asam nukleat seperti enzim

polimerase.

Kedelai, terkenal sebagai makanan antikanker. Dalam kedelai terdapat

sejumlah zat yang secara bersama-sama saling menguatkan dalam menghabisi

benih kanker. Senyawa inhibitor protease kedelai, yang punya nama khusus

inhibitor Browman-Birk, ampuh melumpuhkan berbagai jenis kanker. Daya bunuh

kanker tersebut dibantu serat kasar kedelai, yang kadarnya lumayan tinggi (2

gram per 100 gram)

Itulah sebabnya mengapa kedelai dipastikan mampu mencegah dan

membantu penyembuhan segala jenis kanker. Dari kanker usus besar, kanker

paru-paru, kanker kulit, kanker payudara, kanker prostat, hingga kanker darah

(leukimia). Namun kemampuannya menumpas kanker akibat membanjirnya

hormon adalah paling top, seperti kanker payudara pada wanita dan kanker

prostat pada pria. Sebab genistein kedelai memiliki khasiat antihormon, terutama

antiestrogen, yang merupakan hormon seks pada wanita (Depkes 2004).

3. Antioksidan Pada Tempe Kedelai

Page 38: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

38

Di dalam tempe juga ditemukan suatu zat antioksidan dalam bentuk

isoflavon. Seperti halnya vitamin C, E, dan karotenoid, isoflavon juga merupakan

antioksidan yang sangat dibutuhkan tubuh untuk menghentikan reaksi

pembentukan radikal bebas (Pawiroharsono, 1996).

Dalam kedelai terdapat tiga jenis isoflavon, yaitu daidzein, glisitein, dan

genistein. Pada tempe, di samping ketiga jenis isoflavon tersebut juga terdapat

antioksidan faktor II yang mempunyai sifat antioksidan paling kuat dibandingkan

dengan isoflavon dalam kedelai. Antioksidan ini disintesis pada saat terjadinya

proses fermentasi kedelai menjadi tempe oleh bakteri Micrococcus luteus dan

Brevisbacterium epidermis. (Pawiroharsono, 1996).

Penuaan (aging) dapat dihambat bila dalam makanan yang dikonsumsi

sehari-hari mengandung antioksidan yang cukup. Karena tempe merupakan

sumber antioksidan yang baik, konsumsinya dalam jumlah cukup secara teratur

dapat mencegah terjadinya proses penuaan dini (Pawiroharsono, 1996).

Murata et.al., 1985 menemukan bahwa kadar ribovlavin, asam nikotinat,

asam pantotenat dan piridoksin dalam tempe jauh lebih tinggi daripada dalam

kedelai yang tidak difermentasikan seperti terlihat dalam tabel 3 (Sumaatmojo,

1985).

Liu et.al, 1997 menemukan peningkatan kadar vitamin B12 , dihasiikan

oleh bakteri clebsiela peneumonae , yang merupakan cemaran selama proses

pembuatan tempe. Kadar vitamin B12 dalam tempe 3,9mcg per 100 gram tempe,

2600 kali kadar dalam kedelai. Vitamin lain yang meningkat jumlahnya adalah

asam folat (300%) dan biotin (50%) , sedangkan jumlah thiamin turun menjadi

58% (Sumaatmojo, 1985).

Fermentasi ternyata dapat menurunkan kadar asam phitat dalam biji

kedelai (54%).asam phitat adalah senyawa fosfor yg dapat mengikat mineral

(kalsium, besi, fosfor, magnesium, seng) sehingga tidak dapat diserap tubuh.

Dengan berurainya asam phitat karena perebusan dan oleh enzin fitase yang

Page 39: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

39

dihasilkan cendawan Rhizophus oligosporus, fosfornya dapat dimanfaatkan

tubuh dan penyerapan mineral lainpun tidak terganggu (Sumaatmojo, 1985).

Tabel 3. kadar vitamin ( mg / g bahan kering) dalam biji kedelai dan tempe

VITAMIN KEDELAI TEMPE

Riboflavin 0,06 0,49

Asam nikotianat 0,90 4,39

Asam pantothenat 0,50 1,00

Piridoksin 0,08 0,35

Sumber : Sumaatmojo, 1985.

Berdasarkan dari tabel diatas, Sumaatmaja (1985) menegaskan bahwa riboflavin

meningkat 8 kali lipat pada tempe dibanding pada kedelai, juga pada asam

nikotianat meningkat 5 kali lipat , sedangkan asam pantothenat meningkat 2 kali

lipat, selain itu juga ditemukan peningkatan hampir 5 kali pada piridoksin.

E. UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

Berbagai metode uji aktivitas antioksidan telah digunakan untuk

mengetahui dan membandingkan aktivitas antioksidan pada makanan. Beberapa

tahun terakhir, pengujian kapasitas absorbansi radikal oksigen telah digunakan

untuk menguji aktivitas antioksidan pada makanan, serum dan cairan biologis.

Metode ini memerlukan peralatan khusus dan keahlian teknis untuk analisanya.

Beberapa metode untuk uji aktivitas antioksidan antara lain Thiobarbituric acid-

reactive-substances (TBARS), 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), 2,2’-azinobis-3-

ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ( ABTS), Oxygen Radical Absorbance

Capacity (ORAC), 2,2;-azobis-amidinopropane-dihydrochloride (AAPH) serta

reagen Folin-Ciocalteau. Berbagai metode yang digunakan untuk mengukur

aktivitas antioksidan pada bahan makanan dapat memberikan hasil yang

berbeda-beda tergantung pada jenis radikal bebas yang digunakan sebagai

reagen (Prakash, 2001 ).

Page 40: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

40

Metode yang cepat, mudah dan tidah mahal untuk mengukur aktivitas

antioksidan pada makanan dan bahan makanan menggunakan senyawa radikal

bebas DPPH. DPPH secara luas digunakan untuk menguji kemampuan

senyawa-senyawa penyerang radikal bebas atau donor hidrogen dan untuk

menilai besarnya aktivitas antioksidan pada makanan. Metode DPPH dapat

digunakan untuk sampel padat ataupun cair dan tidak spesifik untuk senyawa

antioksidan tertentu tetapi pada keseluruhan senyawa antioksidan yang ada

dalam sampel. Uji aktivitas antioksidan secara keseluruhan membantu dalam

memahami fungsi zat-zat yang terkandung dalam makanan (Prakash, 2001 ).

Uji antioksidan dengan metode DPPH telah dikembangkan dalam

memaparkan aktivitas antioksidan menggunakan radikal bebas stabil DPPH.

Elektron bebas dalam radikal bebas DPPH memberikan panjang gelombang

maksimum 517 nm dan berwarna ungu. Peredaman warna ungu menjadi kuning

sebagai absorpsivitas molar radikal bebas DPPH berkurang dari 9660 menjadi

1640 ketika elektron bebas radikal bebas menjadi berpasangan dengan hidrogen

dari antioksidan yang menyerang radikal bebas membentuk DPPH-H tereduksi.

Sehingga peredaman warna DPPH sebanding dengan banyaknya elektron yang

tertangkap (Prakash, 2001 ).

DPPH (difenil pikril hidrazil hidrat) menghasilkan radikal bebas aktif bila

dilarutkan dalam alkohol. Radikal bebas tersebut stabil dengan absorpsi

maksimum pada panjang gelombang 517 nm dan dapat direduksi oleh senyawa

antioksidan (Prakash, 2001). Dalam metode ini larutan sampel ditambah larutan

0,2 mM DPPH (sebagai kontrol) dalam metanol, dibiarkan selama 30 menit pada

suhu kamar dalam keadaan gelap dan diukur absorbansinya pada

spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antiradikal dapat

diperlihatkan pada sistem yang warnanya berubah dari ungu menjadi

kekuningan.

Page 41: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

41

Perubahan warna larutan menunjukkan aktivitas penangkapan radikal

bebas DPPH dan dapat diukur dengan perbedaan absorbansi yang dihasilkan

pada sampel dibandingkan dengan kontrol. Aktivitas antiradikal dinyatakan dalam

bentuk persen penangkapan radikal DPPH dan dihitung dengan persamaan

(Yen dan Chen, 1995).

%100x)kontrol absorbansisampel absorbansi

1(nantioksidaaktivitas%

Nilai 0% berarti tidak mempunyai aktivitas antiradikal bebas atau

antioksidan, sedangkan nilai 100% berarti peredaman total dan pengujian perlu

dilanjutkan dengan pengenceran larutan uji untuk melihat batas konsentrasi

aktivitasnya.

F. KERANGKA BERPIKIR

Tempe kedelai merupakan salah satu bahan makanan berbahan dasar

kedelai yang merupakan hasil fermentasi dengan Rhizopus oligosporus.

Isoflavon yang terkandung dalam kedelai dan hasil olahannya berada dalam

bentuk glukosida isoflavon (daidzin, genistin dan glisitin) dan dalam bentuk

aglukan isoflavon (daizein, genistein, glisitein dan faktor-2). Selama proses

pengolahan dan fermentasi kedelai menjadi tempe terjadi biokonversi isoflavon

dari glukosida isoflavon menjadi aglukan isoflavon. Kandungan isoflavon dalam

tempe kedelai mempunyai aktivitas sebagai antioksidan dan dapat dimanfaatkan

sebagai antioksidan alami.

Salah satu manfaat isoflavon adalah sebagai antioksidan. Kandungan

isoflavon dalam kedelai dan hasil olahannya memiliki aktivitas antioksidan yang

berbeda. Selama fermentasi, terjadi kenaikan aktivitas antioksidan yang

Page 42: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

42

disebabkan terhidrolisanya isoflavon glikosida menjadi aglukan isoflavon.

Aktivitas antioksidatif aglukan isoflavon lebih tinggi karena gugus hidroksi lebih

banyak dijumpai pada aglukan isoflavon. Analisis kandungan daizein, genistein,

glisitein dan faktor-2 dalam tempe kedelai dapat dilakukan dengan metode

HPLC.

Selain Kedelai, jenis legume yang dapat diolah menjadi tempe adalah

kedelai hitam, koro hitam dan koro kratok. Meski kandungan gizi tidak lebih dari

kedelai kuning, ketiga jenis legume tersebut dapat diolah menjadi tempe yang

mempunyai cita rasa seperti halnya tempe dari kedelai kuning.

Kedelai yang berkulit hitam saat ini sedang menjadi incaran peneliti gizi

dan kesehatan. Karena ternyata, di dalam kedelai hitam mengandung antosianin.

Antosianin tersebut sangat potensial mencegah proses oksidasi yang terjadi

secara dini dan menimbulkan penyakit degeneratif, penyakit jantung koroner,

stroke dan beragam penyakit berbahaya lainnya (Astuti , 1995).

Pada koro kratok kultivar yang umum ditanam memilki warna kulit biji

hijau muda atau putih; yang lain dapat berwarna merah, ungu, coklat, atau hitam.

Dua kotiledon daun biji besar merupakan bagia terbesar dari volume biji. Biji tipe

liar memiliki kandungan glukosida sianogenik tinggi dan harus dilindikan

sebelum atau selama pemasakan (Rubatzky dan Yamaguchi, 1997).

Pada koro hitam kultivar berbiji putih mengandung glukosida sianogenik

dan penghambat tripsin dalam jumlah kecil sehingga tidak beracun sedangkan

kultivar berbiji gelap mengandung kedua senyawa tersebut dalam jumlah besar.

Polong tanaman koro hitam mengandung 4-5% protein. Biji kering memiliki

kandungan karbohidrat 50-60% dan protein 20-25% (Rubatzky dan Yamaguchi,

1997).

Page 43: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

43

Tanaman dan biji koro hitam belum begitu banyak ditemukan kegunaan

dan manfaatnya, karena tanaman dan biji koro hitam hanya digunakan sebagai

campuran sayur bagi masyarakat pedesaan.

Lama waktu fermentasi tempe kedelai di pasaran antara 36-48 jam, tetapi

tempe dengan lama waktu fermentasi 48-72 jam masih ada yang mengkonsumsI

sehingga perlu dilakukan penelitian mengenai kandungan senyawa yang

bermanfaat khususnya isoflavon dalam tempe kedelai yang difermentasi selama

48 dan 72 jam, demikian juga pada tempe kedelai hitam, tempe koro hitam dan

tempe koro kratok. Aktivitas antioksidan isoflavon total yang diperoleh dari tempe

kedelai yang difermentasi selama 0, 1, 2, 3, 4 dapat dihitung dengan metode

DPPH.

G. HIPOTESIS

Berdasarkan kajian teori dan kerangka pemikiran di atas, maka dapat

dikemukakan hipotesis sebagai berikut :

1. Ada perbedaan jenis Isoflavon yang terkandung dalam tempe berbahan

baku Kedelai kuning, koro hitam, koro kratok serta kedelai hitam dan

produk tempenya berdasarkan variasi lama waktu fermentasi (0, 1, 2, 3,

dan 4 hari)

2. Terdapat perbedaan lama waktu fermentasi yang optimum untuk

menghasilkan ekstrak etanol tempe berbahan baku Kedelai kuning,

kedelai hitam, koro hitam dan koro kratok dengan aktivitas antioksidan

yang optimum.

Page 44: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

44

3. Tempe berbahan baku Kedelai kuning, koro hitam, koro kratok serta

kedelai hitam dan produk tempenya mempunyai potensi dalam upaya

pemanfaatannya sebagai antioksidan alami khususnya isoflavon

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

1. Waktu

Penelitian ini dilakukan pada pertengahan bulan Maret sampai Juni 2009.

2. Tempat

Penelitian ini dilakukan di:

a. Laboratorium Program Kimia P.MIPA FKIP UNS, JL. Ir. Sutami No. 36A

Kentingan Surakarta.

Page 45: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

45

b. Sub Laboratorium Biologi Pusat MIPA UNS, JL. Ir. Sutami No. 36A

Kentingan Surakarta.

c. Laboratorium Kimia Organik F.MIPA UGM. d/a, Sekip Utara telp (0274)

902122, Yogyakarta.

B. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah :

a) Alat rotary vacum evaporator (Buchi)

b) Neraca analitik Sartorius

c) Alat HPLC Perkin Elmer LC 295

d) Blender Philip

e) Pipet mikro

f) Alat Spektrofotometer UV - VIS

g) Alat-alat gelas Pyrex

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan adalah :

a). Kedelai kuning Madura, koro hitam dari Wonogiri, kedelai hitam dan koro

kratok dari Solo.

b). Etanol 95 % Merck

c). Metanol p.a Merck

d). Standar Genistein, Standart Daidzein, Standart Glisitein, standart Faktor-2

(Sigma Chemical Co.)

e). DPPH (Sigma Chemical Co.)

f). Metanol gradient grade for liquid chromatography merek Merck

Page 46: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

46

g). Aluminium foil

h). Akuades

i). Kertas saring

j). BHT (Butyl Hidroksi Toluena) merek Sigma Chemical Co

k). Betakaroten (Sigma Chemical Co.)

l). Alfatokoferol (Sigma Chemical Co.)

C. Prosedur Kerja

Cara kerja yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi :

1. Pembuatan Tempe

a. Pembuatan tempe kedelai berbahan baku kedelai kuning Madura sebagai

berikut :

Sebelum difermentasi, kedelai mengalami serangkaian perlakuan yang

meliputi

1. Persiapan bahan dan sortasi

Penyiapan bahan baku berupa kedelai kuning Madura dan kedelai

500 gr dipilih biji-biji yang besar, licin dan mengkilat kulitnya.

2. Perendaman

Perendaman dilakukan dengan merendam 500 gr kedelai kuning

Madura dalam 1000 ml air bersih selama 24 jam, dengan penggantian

air rendaman setiap 8 jam.

3. Pengupasan kulit

Pengupasan kulit dilakukan untuk menghasilkan biji yang bersih

Sekaligus mempermudah penetrasi miselium kapang disaat terjadi

fermentasi.

4. Perebusan

Biji direbus dalam air sebanyak 1000 ml selama 45 menit, kemudian

Page 47: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

47

ditiriskan dan diangin-anginkan sampai biji kedelai dalam keadaan

lembab (tidak terlalu basah).

5. Penambahan inokulum

Setelah sampel dalam keadaan tidak terlalu basah, ditaburi ragi atau

Inokulum sebanyak 0,5 gr untuk 500 gr sampel. Inokulum yang

digunakan produk dari LIPI dengan merek RAPRIMA.

6. Pemeraman

Sampel yang sudah diberi inokulum dicampur dengan rata kemudian

dibungkus dengan menggunakan daun pisang dan diperam selama 24,

48, 72, 96 jam dalam suhu kamar (27oC) dam terbentuklah tempe

kedelai.

b. Pembuatan tempe berbahan baku koro hitam dari Wonogiri, kedelai hitam dan

koro kratok dari Solo sebagai berikut :

1. Persiapan bahan dan Sortasi

Tahap pertama dimulai dengan penyiapan bahan baku yaitu biji

koro hitam (Lablab purpureus), koro kratok (Phaseolus lunatus), kedelai

hitam (Glycine soja) masing-masing 500 gram.

2. Perendaman

Perendaman dilakukan dengan merendam 500 gram biji koro

hitam, koro kratok dan kedelai hitam dalam 1000 ml air bersih selama 3 x

24 jam, dengan penggantian air rendaman sebanyak tiga kali dalam 24

jam, untuk menghilangkan senyawa asam sianida (HCN).

3. Pengupasan kulit

Pengupasan kulit dilakukan untuk menghasilkan biji yang bersih

sekaligus mempermudah penetrasi miselium kapang disaat terjadi

fermentasi.

4. Pemasakan biji koro hitam, koro kratok dan kedelai hitam

Page 48: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

48

Pemasakan dilakukan dengan cara mengukus biji koro hitam, koro

kratok dan kedelai hitam selama satu jam, kemudian ditiriskan dan

diangin-anginkan.

5. Penambahan Inokulum

Setelah sampel dalam keadaan tidak terlalu basah, ditaburi

ragi/inokulum. Bahan inokulum yang digunakan dari produk LIPI dengan

merk RAPRIMA.

6. Pemeraman

Sampel yang sudah diberi inokulum dicampur dengan rata,

kemudian dibungkus dengan menggunakan daun pisang dan diperam

selama 24, 48, 52, 96 jam dalam suhu kamar ( 27oC ) dan terbentuklah

tempe koro hitam, tempe koro kratok dan tempe kedelai hitam.

2. Ekstraksi Isoflavon dengan Metode Maserasi

Sebanyak 100gr sampel diblender hingga terbentuk bubur, kemudian

dimaserasi dalam 250 ml etanol 70 % selama 24 jam, kemudian disaring dan

filtratnya ditampung. Residu ditambah dengan 100 ml etanol 70 %, kemudian

dimaserasi selama 24 jam, kemudian disaring dan filtratnya ditampung.

Residu kedua ditambah dengan100ml etanol 70 %, lalu di saring lagi. Filtrat

hasil maserasi kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator hingga

diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental di oven selama 30 menit dengan

suhu 50oC sehingga diperoleh ekatrak etanol. Ekstrak etanol yang dihasilkan

kemudian diidentifikasi isoflavonnya dengan metode HPLC.

3. Metode Identifikasi Isoflavon

Identifikasi isoflavon dengan menggunakan metode HPLC dilakukan

dengan pengkondisian instrumen HPLC dan pembuatan larutan sampel.

Larutan sampel dibuat dengan mengambil 1 mg ekstrak etanol hasil

ekstraksi, lalu masing-masing dilarutkan dalam etanol 10 mL. Larutan

kemudian disentrifuge lalu diambil 20 µL dengan alat injeksi. Selanjutnya

Page 49: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

49

sampel diinjeksikan ke dalam HPLC setelah pengkondisian HPLC selesai.

Menganalisa kromatogram HPLC dengan menggunakan pembanding

kromatogram isoflavon standar yang terdiri dari daidzein, genistein, glisitein

dan faktor-2. Adapun kondisi HPLC adalah sebagai berikut:

a. Panjang Kolom : 10 cm

b. Jenis Kolom : Lichrosper (R) 100 RP-18 (non polar)

c. Fase Gerak : metanol:asam asetat 0,02 ( 57,5% ; 42,5%)

d. Volume Injeksi : 20 µL

e. Detektor : sinar UV pada panjang gelombang 265 nm

f. Suhu Oven : suhu kamar

4. Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH

a. Pembuatan Larutan DPPH

Pembuatan larutan DPPH dengan menimbang kristal sebanyak 7,88

mg DPPH dan dilarutkan dalam metanol 100 mL sehingga diperoleh

konsentrasi 0,2 mM sebagai larutan kontrol. Pengukuran absorbansi larutan

DPPH dilakukan dengan memipet 600 µL pelarut (metanol) ke dalam kuvet

dan ditambahkan larutan DPPH sampai volume 3 mL kemudian ditutup dan

dikocok sampai homogen warnanya. Selanjutnya diukur absorbansinya pada

panjang gelombang (λ) 400-600 nm dan mencatat absorbansinya pada

puncak panjang gelombang 517nm sebagai absorban kontrol.

b. Pembuatan Larutan Sampel

Pembuatan larutan uji dengan menimbang ekstrak sebanyak 2 mg dan

melarutkan ke dalam etanol 4 mL untuk membuat larutan uji dengan

konsentrasi 100 ppm. Kemudian pengukuran antioksidan bahan uji digunakan

metode yang sama, dimana 600 µL pelarut diganti dengan 600 µL larutan uji

(sampel). Selanjutnya di ukur absrbansinya pada panjang gelombang (λ)

400-600 nm dan mencatat absorbansinya pada puncak panjang gelombang

mendekati 517nm sebagai absorban sampel.

Page 50: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

50

5. Pengukuran Kadar Antioksidan

Aktivitas antiradikal dihitung dengan metode DPPH dimana sampel

direaksikan dengan larutan DPPH. Aktivitas antiradikal diperlihatkan pada

sistem yang warnanya berubah dari ungu menjadi kekuningan.

Perubahan warna larutan menunjukkan aktivitas penangkapan radikal

bebas DPPH dan dapat diukur dengan perbedaan absorbansi yang

dihasilkan pada sampel dibandingkan dengan kontrol. Aktivitas antiradikal

dinyatakan dalam bentuk persen penangkapan radikal DPPH dan dihitung

dengan persamaan ( Yen dan Chen, 1995).

%100x)kontrol absorbansisampel absorbansi

1(nantioksidaaktivitas%

Nilai 0% berarti tidak mempunyai aktivitas antiradikal bebas atau

antioksidan, sedangkan nilai 100% berarti peredaman total dan pengujian

perlu dilanjutkan dengan pengenceran larutan uji untuk melihat batas

konsentrasi aktivitasnya.

6. Teknik Analisa Data

Analisis data dengan dua faktor yaitu jenis bahan dasar pembuat tempe

dan lama fermentasi, menggunakan program SPSS version 15. Analisis data

pada Program SPSS tersebut adalah analisis data berupa General Linear Model

– Univariete.

Analisis data dengan satu faktor yaitu jenis bahan dasar, menggunakan

program SPSS version 15. Analisis data pada Program SPSS tersebut adalah

analisis data berupa Compare Means – One Way Annova.

Page 51: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

51

BAB IV

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Fermentasi Aneka Legume dan produk Tempenya.

Biji kedelai hitam, koro hitam dan koro kratok setelah mengalami

serangkaian perlakuan sebelum terjadi proses fermentasi, antara lain : persiapan

bahan dan sortasi, perendaman, pengupasan kulit, pemasakan biji koro,

penambahan inokulum dan yang terakhir pemeraman, dari proses diatas

didapatkan hasil :

1. Biji kedelai hitam dan produk tempenya

Page 52: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

52

Fermentasi hari ke-0 : Kedelai hitam berupa biji-biji yang sudah lunak, ada

yang terbelah menjadi dua dan ada yang utuh serta ada penambahan

inokulum tetapi tidak difermentasikan lebih lanjut, sehingga bentuknya seperti

kedelai kukus.

Fermentasi hari ke-1 : Pada biji kedelai hitam sudah tumbuh sedikit

miselium meski belum merata pada permukaan, dan belum dapat diiris (akan

terlepas satu persatu), sehingga diperkirakan kandungan isoflavon belum

optimum

Fermentasi hari ke-2 : Miselium jamur yang berwarna putih sudah tumbuh

merata dan kompak sehingga sudah terbentuk tempe seperti halnya tempe

kedelai kuning dan diiris tidak pecah, sehingga diperkirakan kandungan

isoflavon sudah ada

Fermentasi hari ke-3 : Misellium semakin berwarna putih merata menutupi

biji-biji kedelai hitam dan kompak, diiris tidak pecah dan belum terlihat warna

kuning pada tepinya seperti halnya tempe kedelai, sehingga diperkirakan

kandungan isoflavon sudah optimum

Fermentasi hari ke-4 : Miselium mengalami perubahan warna menjadi

kuning pada bagian tepi tempe dan menyusut kekompakannya, diiris tidak

pecah, sehingga diperkirakan kandungan isoflavonnyapun berkurang.

Tabel 4. Hasil Pengamatan Biji Kedelai hitam dan Produk Tempe Kedelai hitam

SAMPEL FOTO WARNA AROMA Biji kedelai hitam

Hitam Khas kedelai

Kedelai hitam kukus (tempe hasil fermentasi hari ke-0

Putih Khas kedelai

Tempe kedelai hitam hasil fermentasi hari ke-1

Putih agak kuning dan ada warna hitam

Khas tempe kedelai

Page 53: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

53

Tempe kedelai hitam hasil fermentasi hari ke-2

Putih kuning kehitaman

Khas tempe kedelai

Tempe kedelai hitam hasil fermentasi hari ke-3

Putih Khas tempe kedelai

Tempe biji kedelai hitam hasil fermentasi hari ke-4

Putih kekuningan

Sedikit berbau amoniak

2. Biji koro hitam dan produk tempenya

Fermentasi hari ke-0 : Pada biji koro hitam sama dengan biji kedelai

hitam yaitu biji-biji yang lunak, ada yang terbelah ada yang utuh, ada

penambahan inokulum dan tidak difermentasikan lebih lanjut dan bentuknya

seperti kedelai kukus.

Fermentasi hari ke-1 : pada biji kro hitam sudah tumbuh sedikit

misellium dan belum merata pada permukaan biji, sehingga tidak dapat diiris

(terlepas satu-persatu), diperkirakan kandungan isoflavon belum optimum

.

Fermentasi hari ke-2 : Misellium berwarna putih dan tumbuh merata,

serta kompak sehingga sudah berbentuk tempe, diiris tidak pecah, dan

diperkirakan kandungan isoflavon sudah ada

Fermentasi hari ke-3 : Misellium makin berwarna putih merata

menutupi biji-biji koro hitam dan kompak, diiris tidak pecah dan belum terlihat

warna kunng pada tepi tempe, dan diperkirakan kandungan isoflavon sudah

optimum

Page 54: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

54

Fermentasi hari ke-4 : Misellium mengalami penyusutan dan perubahan warna

menjadi kuning pada bagian tepi tempe, diiris tidak pecah, dan diperkirakan

kandungan isoflavonnya juga mulai berkurang

Tabel 5. Hasil Pengamatan Biji Koro hitam dan Produk Tempe Koro hitam

3. Biji koro kratok dan produk tempenya

Fermentasi hari ke-0 : Sama seperti kedelai hitam dan koro hitam, biji

koro kratok berupa biji-biji yang lunak, ada yang terbelah dan utuh serta ada

penambahan inokulum dan tidak difermentasikan lebih lanjut.

Fermentasi hari ke-1 : Sudah tumbuh misellium pada permukaan biji

koro meskipun belum merata dan kompak, diiris akan pecah (terlepas satu

persatu), dan diperkirakan kandungan isoflavon belum optimum

SAMPEL FOTO WARNA AROMA

Biji koro hitam mentah

Hitam Tidak beraroma

Koro hitam kukus (tempe hasil fermentasi hari ke-0

Putih Khas kedelai rebus

Tempe biji koro hitam hasil fermentasi hari ke-1

Putih agak hitam

Khas tempe kedelai

tempe biji koro hitam hasil fermentasi hari ke-2

Putih Khas tempe kedelai

Tempe biji koro hitam hasil fermentasi hari ke-3

Putih Khas tempe kedelai

Tempe biji koro hitam hasil fermentasi hari ke-4

Masih berwarna putih

Sedikit berbau amoniak

Page 55: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

55

Fermentasi hari ke-2 : Misellium yang berwarna putih tumbuh merata

dan kompak sehingga sudah berbentuk tempe dan diiris tidak pecah, dan

diperkirakan kandungan isoflavon sudah ada

Fermentasi hari ke-3 : Misellium semakin berwarna putih, merata

menutupi biji koro dan kompak, diiris tidak pecah dan belum terlihat warna

kuning pada tepi tempe, dan diperkirakan kandungan isoflavon sudah

optimum

Fermentasi hari ke-4 : Misellium mengalami penyusutan dan

perubahan warna menjadi kuning pada bagian tepi tempe, diiris tidak pecah,

dan diperkirakan kandungan isoflavonnya juga mulai berkurang

Tabel 6. Hasil Pengamatan Biji Koro kratok dan Produk Tempe Koro kratok

SAMPEL FOTO WARNA AROMA

Biji koro kratok mentah

Warna-warni (hitam, kuning Merah,coklat)

Tidak beraroma

Koro kratok kukus (tempe hasil fermentasi hari ke-0

Putih bersih Khas kedelai rebus

Page 56: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

56

Dari ketiga jenis legume dan produk tempenya, hasil fermentasi yang

optimum untuk menjadi tempe adalah pada fermentasi hari ke-3, karena pada

hari tersebut sudah nampak adanya misellium yang berwarna putih yang tumbuh

merata dan kompak sehingga biji-biji tertutupi dan pada saat tempe diiris tidak

pecah yang disebabkan adanya misellium yang mengikat dan menembus biji-biji

legume yang lunak, selain itu pada fermentasi hari ke-3 pada bagian tepi tempe

belum terlihat adanya warna kuning yang menunjukkan adanya penyusutan

misellium dan dimungkinkan kandungan isoflavonnya paling optimum (Faktor-2)

karena hasil fermentasinya juga optimum

Jadi hasil fermentasi tempe dari jenis legume yang paling optimum adalah

hari ke-3 dimana hasil tersebut sama dengan hasil fermentasi tempe pada

kedelai kuning Madura. Hasil tersebut dapat dilihat pada lampiran 1.

B. Hasil Ekstraksi Aneka Legume dan Produk Tempenya

Tempe hasil fermentasi hari ke-0, 1, 2, 3, 4 diekstraksi dengan cara

maserasi menggunakan pelarut etanol 70%. Etanol 70% diketahui mampu

Tempe biji koro kratok hasil fermentasi hari ke-1

Putih bersih Khas tempe kedelai

tempe biji koro kratok hasil fermentasi hari ke-2

Putih Khas tempe kedelai

Tempe biji koro kratok hasil fermentasi hari ke-3

Putih Khas tempe kedelai

Tempe biji koro kratok hasil fermentasi hari ke ke-4

Masih berwarna putih

Sedikit berbau amoniak

Page 57: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

57

mengekstrak isoflavon secara optimal (Kudou et al., 1991), sedangkan maserasi

merupakan cara ekstraksi senyawa organik yang mudah dan sederhana. Bahan

yang akan diekstrak dipotong dengan ukuran tipis, kemudian diblender hingga

berbentuk bubur tempe dan dimaserasi dalam pelarut etanol selama 24 jam, dan

diperoleh hasil berupa filtrat yang berwarna kuning dari senyawa protein

termasuk senyawa isoflavon yang masih kompleks, selanjutnya filtrat dipisahkan

dari residu untuk diproses lebih lanjut menjadi ekstrak yang murni. Filtrat yang

diperoleh selanjutnya diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 500 C

sampai didapatkan ekstrak yang pekat atau hampir semua etanol teruapkan.

Ekstrak ini selanjutnya disimpan dalam oven suhu 400C (untuk menguapkan

pelarut yang masih tersisa) dan ditimbang sehingga diperoleh massa hasil

ekstraksi. Hasil ekstraksi seperti yang tercantum dalam tabel 7 dibawah berikut

ini.

Tabel 7. Hasil ekstraksi biji Legume dan produk tempenya

Sampel Kedelai Madura Kedelai Hitam Koro Kratok Koro Hitam

Massa (gram)

Warna Massa (gram)

Warna Massa (gram)

Warna Massa (gram)

Warna

Biji mentah 3,422 Kuning muda

4,541 Hitam 3,293 Hitam 4,215 Hitam

Tempe hasil fermentasi ke-

0 hari

0,677 Kuning muda

1,113 Kuning 0,584 Coklat 0,354 Coklat

1 hari

2,933 Kuning coklat

4,386 Coklat 1,340 Coklat 1,650 Coklat

2 hari

4,982 Kuning coklat

8,492 Coklat 0,768 Coklat tua

1,904 Coklat Tua

Page 58: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

58

3 hari

3,421 Coklat tua

8,43 Coklat tua

2,423 Coklat hitam

2,666 Coklat Hitam

4 hari

5,192 Coklat tua

9,658 Coklat hitam

2,513 Coklat hitam

3,172 Coklat Hitam

Dari tabel diatas dapat diketahui bahwa semakin lama waktu fermentasi

semakin banyak massa ekstrak etanol yang dihasilkan. Massa ekstrak etanol

terbanyak pada tempe kedelai hitam, koro kratok, koro hitam dan kedelai kuning

terjadi fermentasi hari ke-4, yaitu 9,658 gr/100gr tempe; 3,172 gr/100gr tempe;

2,513 gr/100gr tempe; dan 5,192 gr/100gr tempe yang menunjukkan massa

ekstrak pada kedelai hitam lebih banyak daripada koro kratok, koro hitam dan

kedelai kuning. Demikian juga pada massa hasil ekstraksi dari biji kedelai hitam

mentah lebih banyak dibanding biji koro hitam, biji koro kratok dan kedelai kuning

mentah yaitu 4,541 gram; 3,93 gram; 4,215 gram; dan 3,422 gram. Hal ini

disebabkan spesies tanaman yang diekstraksi memiliki kandungan materi yang

tidak sama meski dalam 1 jenis legume, ini terlihat pada warna hasil ekstraksi

yang dihasilkan biji mentah. Pada kedelai, koro kratok, dan koro hitam hasil

ekstraksi berwarna hitam karena masih mengandung senyawa sianida

sedangkan hasil ekstraksi kedelai kuning mentah berwarna coklat tua, karena

kemungkinan kandungan sianidanya relative lebih sedikit dan hilang pada saat

perendaman selama 24 jam dan pengukusan. Hasil ekstraksi biji yang sudah

difermentasikan berwarna kuning muda sampai coklat tua karena senyawa

sianidanya sudah hilang pada saat perendaman selama 3 x 24 jam sehingga

aman untuk dikonsumsi.

Berdasarkan tabel diatas dapat disimpulkan bahwa massa hasil ekstraksi

dari beberapa legume ternyata bervariasi, yang dapat disebabkan karena

perbedaan sifat kekerasan atau kelunakan biji, kepadatan komponen zat, serta

kandungan zat yang ada dalam biji. Menurut Handayani dan Atmaka (1993),

bahwa faktor varietas, faktor daerah tempat tumbuh, musim tanam dan musim

Page 59: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

59

panen ternyata memberikan pengaruh yang cukup bervariasi terhadap sifat fisis

dan khemis dari biji kacang-kacangan.U

C. Hasil Identifikasi Isoflavon dengan Metode HPLC

Analisis dengan HPLC bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan

senyawa isoflavon daidzein, glisitein, genistein dan faktor-2 dalam sampel tempe

kedelai hitam, koro hitam dan koro kratok pada berbagai waktu fermentasi.

Seperti metode kromatografi yang lain, analisis HPLC dilakukan dengan

membandingkan waktu retensi dari senyawa isoflavon standar dengan waktu

retensi dari masing-masing sampel. Adanya puncak-puncak yang memiliki waktu

retensi relatif sama dengan senyawa isoflavon daidzein, glisitein, genistein dan

faktor-2 standar menunjukkan bahwa dalam sampel tersebut terdapat kandungan

isoflavon daidzein, glisitein, genistein dan faktor-2.

Penentuan waktu retensi senyawa daidzein, glisitein, genistein dan faktor-

2 standar dilakukan pada hari yang sama dengan penentuan waktu retensi dari

masing-masing sampel untuk meminimalkan perbedaan kondisi.

Analisis kuantitatif senyawa isoflavon dilakukan dengan cara menghitung

area di bawah puncak luas. Konsentrasi senyawa isoflavon daidzein, glisitein,

genistein dan faktor-2 dapat diketahui dengan mengalikan persentase luas

masing-masing senyawa isoflavon dalam kromatogram dengan massa ekstrak

etanol yang dihasilkan. Hasil kromatogram dari tiap-tiap legume dapat dilihat

pada halaman Lampiran dan berdasarkan data tersebut dapat diidentifikasi

kandungan senyawa isoflavon pada masing-masing legume. Hasil identifikasi

senyawa isoflavon berdasarkan kromatogram pada kedelai hitam, koro hitam,

koro kratok dan kedelai kuning dapat dilihat pada Tabel 8 berikut ini.

Tabel 8. Hasil identifikasi Isoflavon total beberapa legume (100 gr sampel)

Jenis Lama Kandungan Isoflavon (gr) Isoflavon

Page 60: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

60

sample waktu fermentasi (hari)

Faktor-2 Daidzein Glisitein Genistein total (gram)

Kedelai Hitam

Mentah - - - 0,1130 0,1130 0 0,0321 0,0915 0,1325 0,2159 0,4722 1 0,0097 0,8069 0,3051 1,2042 2,3259 2 0,0161 1,2947 0,9670 2,3424 4,6202 3 0,2250 0,2234 0,6562 0,2415 1,3461 4 - - - - -

Koro Hitam

Mentah - 0,0937 0,0937 0 0,0239 0,0105 0,0165 0,0344 0,0853 1 0,0149 0,0401 0,1145 0,4404 0,6099 2 - 0,0177 - - 0,0177 3 0,0085 0,0235 0,0251 - 0,0571 4 0,0038 0,0884 0,2254 0,1043 0,4219

Koro Kratok

Mentah - 0,1237 - - 0,1237 0 - 0,0140 0,0202 0,0597 0,0939 1 - 0,0151 - 0,0532 0,0683 2 0,0089 0,0122 0,0090 - 0,0301 3 0,0036 - - 1,7252 1,7288 4 0,0178 - - 0,0241 0,0419

Kedelai Kuning

Mentah - 0,034 0,0092 0,1398 0,183 0 0,0009 0,0752 0,0128 0,1057 0,1937 1 0,083 0,4414 0,0838 0,6769 1,2021 2 0,0637 0,5853 0,3058 0,8556 1,8104 3 0,0246 0,4994 0,0909 0,5682 1,1585 4 0,0575 0,6318 0,232 0,7549 1,6187

Berdasarkan Tabel 8. diatas dapat diketahui bahwa :

Tempe kedelai hitam mentah memiliki kandungan isoflavon genistein saja.

Hasil fermentasi hari ke-0, 1, 2 memiliki kandungan isoflavon Faktor-2, Daidzein,

Glisitein dan Genistein. Hasil fermentasi hari ke-3 mengandung isoflavon

Daidzein, Glisitein dan Genistein sementara hasil fermentasi hari ke-4 tidak

mengandung isoflavon Faktor-2, Daidzein, Glisitein dan Genistein.

Tempe koro hitam mentah memiliki kandungan isoflavon genistein saja. Hasil

fermentasi hari ke-0, 1, 4 mempunyai kandungan isoflavon Faktor-2, Daidzein,

Glisitein dan Genistein. Hasil fermentasi hari ke-2 hanya mengandung isoflavon

Page 61: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

61

Daidzein saja dan hasil fermentasi hari ke-4 kandungan isoflavonnya adalah

Faktor-2, Daidzein, dan Glisitein

Tempe koro kratok mentah memiliki kandungan isoflavon daidzein saja. Hasil

fermentasi hari ke-0 mempunyai kandungan isoflavon Daidzein, Glisitein, dan

Genistein. Hasil fermentasi hari ke-1 mengandung isoflavon Daidzein dan

Glisitein. Hasil fermentasi hari ke-3 mengandung isoflavon Faktor-2 dan

Genistein. Sementara itu, hasil fermentasi hari ke-4 mengandung isoflavon

Gilsitein dan Genistein.

Tempe kedelai kuning mentah memiliki kandungan isoflavon daidzein,

glisitein, dan genistein. Hasil fermentasi hari ke-0 sampai dengan hasil fermentasi

hari ke-4 kandungan isoflavonnya optimum yaitu terdiri dari Faktor-2, Daidzein,

Glisitein dan Genistein.

Dari data hasil identifikasi isoflavon total pada tabel 8. dapat dijelaskan

bahwa pada kedelai hitam dan koro hitam mentah hanya memiliki kandungan

genistein, pada koro kratok mentah hanya memiliki kandungan daidzein dan

pada kedelai kuning mentah memiliki kandungan daidzein, glisitein dan

genistein. Dari keempat sampel legume (kedelai kuning, kedelai hitam, koro

kratok dan koro hitam) mentah tidak ditemukan faktor-2, hal tersebut

dimungkinkan karena pada biji mentah tidak terjadi proses fermentasi sehingga

faktor-2 belum terbentuk. Menurut Barz dan Papendorf (1991) faktor-2 dapat

terbentuk selama proses fermentasii dengan Rhizopus oligosporus terjadi

biokonversi lebih lanjut dari daidzein dan glisitein menjadi faktor-2. Biosintesa

faktor-2 juga dapat terjadi melalui demetilasi glisitein oleh bakteri Brevibakterium

epidermis dan Micrococcus luteus, dan melalui reaksi hidroksilasi daidzein oleh

bakteri microbacterium arbosresccens (Barz et al., 1993), dan berdasarkan Tabel

diatas dapat dijelaskan pula bahwa :

Kedelai hitam, meskipun mempunyai massa ekstrak etanol yang optimum

pada fermentasi hari ke-4, tetapi jumlah kandungan isoflavon yang optimum

Page 62: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

62

terdapat pada fermentasi 0, 1, 2, 3 hari sedangkan pada fermentasi hari ke-4

kandungan isoflavon (Faktor-2, Daidzein, Genistein dan Glisitein) menghilang

atau tidak muncul, hal tersebut kemungkinan dapat terjadi karena pada

fermentasi hari ke-4 pertumbuhan kapang sudah mengalami penurunan dan

sudah terjadi pembusukkan pada tempe sehingga kandungan isoflavonnyapun

menurun atau menghilang karena isoflavon sebagai antioksidan memiliki sifat

mudah teroksidasi dan mudah bereaksi dengan radikal bebas sehingga

kandungan isoflavon tidak dapat muncul karena sudah terurai menjadi senyawa

lain yang belum diketahui.

Koro Hitam, seperti halnya kedelai hitam massa ekstrak etanol koro hitam

yang tertinggi pada fermentasi hari ke-4, tetapi jumlah kandungan isoflavon yang

optimum terdapat pada hasil fermentasi hari ke-0, 1, 3, 4, hari. Kandungan

isoflavon Faktor-2, Glisitein dan Genistein tidak ditemukan pada hasil fermentasi

hari ke-2, hal tersebut dapat terjadi karena pada Faktor-2 fermentasi hari ke-1

kadarnya sudah menurun dibanding hari ke-0, sampai pada fermentasi hari ke-3

dan 4, dan pada fermentasi hari ke-2 kemungkinan tidak muncul dapat

disebabkan karena dalam proses pengolahannya menjadi tempe yaitu senyawa

isoflavon glukosidanya sudah larut pada saat proses perendaman karena

perendaman biji koro hitam untuk dibuat tempe harus direndam 3 x 24 jam

(selama 3 hari) dengan pergantian air 3 kali dalam 1 hari sampai air menjadi

jernih sedangkan pada kedelai hitam (sama seperti kedelai kuning) hanya

direndam 1 x 24 jam (selama 1 hari), sehingga dengan perendaman yang lama

menyebabkan isoflavon glukosidanya banyak yang hilang, demikian juga pada

Genistein tidak muncul pada fermentasi hari ke-2 dan 3, pada fermentasi hari ke-

4 dapat ditemukan atau muncul kembali dengan kadar mengalami penurunan,

hal tersebut dapat juga disebabkan karena faktor perendaman yang lama seperti

diatas atau faktor lain yaitu ekstrak etanolnya sudah teroksidasi atau terurai

menjadi senyawa lain.

Page 63: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

63

Koro kratok mempunyai massa ekstrak etanol yang terbanyak pada hasil

fermentasi hari ke-4, tetapi jumlah kandungan isoflavon yang optimum (Daidzein,

Glisitein, Genistein) terdapat pada hasil fermentasi hari ke-0 yang mempunyai

kadar konsentrasi faktor-2 yang kecil sehingga tidak muncul sampai pada

fermentasi hari ke-1, kemudian dengan bertambahnya jumlah kapang pada

fermentasi hari ke-2, faktor-2 dapat terlihat atau muncul dengan kadar

konsentrasi yang kecil pula dan mengalami penurunan pada fermentasi hari ke-3

dan hari ke-4. Demikian pula pada kandungan isoflavon Glisitein dan Genistein,

pada fermentasi hari ke-0, 1, 2 nampak terlihat dengan kadar yang kecil

kemudian pada fermentasi hari ke-3 dan hari ke-4 mengalami penurunan

sehingga tidak nampak atau menghilang, hal tersebut dapat disebabkan karena

kadarnya kecil atau sedikit pada awal fermentasi yang disebabkan karena faktor

perendaman yang lama sehingga isoflavon glukosidanya banyak yang hilang dan

pada saat dibuat menjadi tempe meskipun dipengaruhi pertumbuhan kapang

akan menghasilkan isoflavon aglukon yaitu daidzein, glisitein, genistein dan

terutama faktor-2 tidak dapat muncul.

Pada kedelai kuning sebagai kontrol/pembanding dalam penelitian ini,

mempunyai massa ekstrak etanol optimum pada hasil fermentasi hari ke-4, dan

memiliki kandungan isoflavon optimum (faktor-2, daidzein, glisitein, genistein)

pada fermentasi hari ke-0, 1, 2, 3, 4 karena pada biji kedelai kuning dan produk

tempenya memang sudah diketahui adanya kandungan senyawa isoflavon yang

berkhasiat sebagai antioksidan.

Berdasarkan data hasil identifikasi senyawa isoflavon total pada tabel 8.

dapat dijelaskan bahwa kedelai hitam memiliki kandungan jenis-jenis isoflavon

rata-rata yang lebih tinggi dibandingkan dengan koro hitam dan koro kratok serta

kedelai kuning sebagai kontrolnya. Kandungan isoflavon total pada kedelai hitam

fermentasi hari ke-2 (4,6202mg/100 gr sampel) lebih tinggi dibanding kedelai

kuning hasil fermentasi hari ke-2 yaitu 1,8104mg/100gr sampel, sedangkan koro

Page 64: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

64

0

0,5

1

1,5

2

2,5

mentah 0 1 2 3 4

Kand

unga

n iso

flavo

n (gr

am)

Lama waktu fermentasi

Faktor-2

Daidzein

Glisitein

Genistein

kratok paling tinggi pada fermentasi hari ke-3 yaitu 1,7252mg/100gr sampel dan

koro hitam yang paling tinggi pada fermentasi hari ke-1 yaitu 0,6099mg/100gr

sampel. Dari data tersebut dapat diartikan bahwa kedelai hitam dan kedelai

kuning sama dalam menghasilkan jenis isoflavon dan sama terjadi dalam

fermentasi hari ke-2 tetapi berbeda kadar isoflavon totalnya, dimana kedelai

kuning dan produk tempenya sudah diketahui banyak mengandung jenis

isoflavon dibandingkan kedelai hitam. Kandungan isoflavon pada jenis

legume/kacang-kacangan dipengaruhi varietas, waktu tanam dan lokasi

penanaman (Mazur et al., 1995). Kondisi pertumbuhan, varietas, lokasi dan

waktu tanam membedakan jumlah jenis senyawa isoflavon (Harbone, 1996). Dari

berbagai tanaman, kandungan isoflavon yang lebih tinggi terdapat pada

kelompok Leguminoceae dan tidak terdapat pada organisme seperti bakteri, alga,

jamur, lumut (Markham, 1998).

Banyaknya kandungan jenis isoflavon pada masing-masing sampel yaitu kedelai

hitam, kedelai kuning, koro hitam dan koro kratok ditampilkan pada gambar 12,

13, 14, 15 dibawah ini

Gambar 12. Kandungan isoflavon tempe kedelai hitam

Page 65: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

65

0

0,5

1

1,5

2

2,5

mentah 0 1 2 3 4

Kand

unga

n is

ofla

von

(gra

m)

Lama waktu fermentasi

Faktor-2

Daidzein

Glisitein

Genistein

Gambar 13. Kandungan isoflavon tempe kedelai kuning

Gambar 14. Kandungan isoflavon tempe koro hitam

0

0,5

1

1,5

2

2,5

mentah 0 1 2 3 4Lama waktu fermentasi

Faktor-2DaidzeinGlisiteinGenistein

Kan

dung

an is

ofla

von

(gra

m)

Page 66: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

66

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Kand

unga

n is

ofla

von

(gra

m)

Lama waktu fermentasi

Faktor-2

Daidzein

Glisitein

Genistein

Gambar 15. Kandungan isoflavon tempe koro kratok

Dari gambar grafik diatas dapat disimpulkan bahwa kadar isoflavon faktor-

2, daidzein, glisitein dan genistein yang paling tinggi berturut-turut adalah Kedelai

hitam, kedelai kuning, koro hitam dan koro kratok.

Jadi, hasil identifikasi senyawa isoflavon dengan metode HPLC

berdasarkan dari ketiga macam legume diatas, jumlah kandungan isoflavon yang

muncul berbeda pada tiap hasil fermentasi (perlakuan) dan pada tiap jenis

legume (sampel), hal ini dapat disebabkan karena beberapa faktor diantaranya

kadar isoflavon yang kecil atau sedikit pada awal fermentasi sehingga tidak

nampak pada fermentasi berikutnya, dan seiring dengan bertambahnya

misellium pada fermentasi berikutnya dapat terlihat meski dengan kadar yang

kecil atau sedikit; atau dapat juga disebabkan karena proses perendaman yang

lama pada pembuatan tempe pada koro; faktor lain dari ketidak nampakkan

isoflavon pada akhir fermentasi dapat juga terjadi karena sudah terurai menjadi

zat lain, atau disebabkan karena pada spesies tanaman tersebut tidak memiliki

kandungan isoflavon seperti yang dijumpai pada kedelai kuning, sehingga perlu

penelitian lebih lanjut mengenai hal tersebut.

Dan berdasarkan gambar grafik diatas ternyata kedelai hitam mempunyai

kandungan isoflavon faktor-2, daidzein, glisitein dan genistein yang lebih tinggi

Page 67: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

67

dibanding kedelai kuning sehingga kedelai hitam dapat digunakan sebagai

referensi sumber isoflavon yang berkhasiat antioksidan.

D. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH

Pada pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH

(2,2 difenil 1 picril hidrazil). Metode yang dipilih adalah metode DPPH karena

sederhana, mudah, cepat dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel.

Metode aktivitas antiradikal bebas DPPH merupakan metode terpilih untuk

menapis aktivitas antioksidan bahan alam (Molyneux, 2004; Luo et al., 2002;

Leong dan Shui, 2002; Okawa et al., 2001; Santosa et al., 1998 dalam Amrun

dan Umayah, 2007). Senyawa antioksidan akan bereaksi dengan radikal DPPH

melalui mekanisme donasi atom hidrogen dan menyebabkan terjadinya

peluruhan warna DPPH dari ungu ke kuning.

Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan melakukan 3 kali pengulangan,

kemudian dari 3 kali pengulangan tersebut diambil rata-rata aktivitas antioksidan

sampel. Hasil uji aktivitas antioksidan dapat dilihat dalam Lampiran, dan dari

hasil pengukuran rata-rata diperoleh data yang disajikan dalam Tabel dan grafik

berikut ini.

Tabel 9. Aktivitas antioksidan aneka legume dan produk tempenya dengan variasi lama waktu fermentasi

Sampel Perlakuan (Fermentasi hari) Mentah 0 hari 1 hari 2 hari 3 hari 4 hari

Kedelai Kuning

67,4500hi 76,0600kl 72,0833j 76,0567kl 81,4300m 77,1400l

Koro Hitam

60,8000e 81,4400m 69,3000i 67,1900h 77,9033l 69,3400i

Kedelai Hitam

30,0000a 48,1033c 68,2867hi 77,3267l 82,4867m 74,8133k

Koro kratok

76,4900kl 62,0367f 43,4067b 56,4400d 65,1200g 59,0900e

superskrip yang berbeda menunjukkan perbedaan signifikan pada 0,05%

80

100 tempe kedelai hitam

Aktiv

itas a

ntiok

sidan

(%)

Page 68: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

68

Gambar 16. Grafik aktivitas antioksidan (%) beberapa jenis tempe

Dari tabel dan grafik diatas dapat dijelaskan, bahwa ;

Dari 3 kali pengulangan, hasil uji aktivitas antioksidan diperoleh rata-rata

aktivitas antioksidan sampel tempe kedelai hitam, tempe koro hitam, tempe koro

kratok dan tempe kedelai kuning hasil fermentasi 0, 1, 2, 3, 4 hari.

Pada kedelai hitam, dari 3 kali pengulangan diperoleh hasil fermentasi

hari ke-0, 1, 2, 3, 4 berturut-turut adalah 48,10%; 68,29%; 77,33%; 82,49%;

74,81% yang berarti menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan yang optimum

terjadi pada fermentasi hari ke-3 setelah mengalami penurunan pada fermentasi

hari ke-4.

Pada koro hitam, dari 3 kali pengulangan diperoleh hasil fermentasi hari

ke-0, 1, 2,3, 4 berturut-turut adalah 81,44%; 69,30%; 67,19%; 77,90%; 69,34%

yang berarti juga menunjukkan aktivitas antioksidan yang optimum terjadi pada

fermentasi hari ke-3 yang kemudian mengalami penurunan juga pada fermentasi

hari ke-4

Pada koro kratok, dari 3 kali pengulangan diperoleh hasil fermentasi hari

ke-0, 1, 2, 3, 4 berturut-turut adalah 62,04%; 56,25%; 56,44%; 65,12%; 59,09%

yang berarti juga menunjukkan aktivitas antioksidan yang optimum terjadi pada

Page 69: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

69

fermentasi pada hari ke-3 dan mengalami penurunan pada fermentasi pada hari

ke-4.

Dari Tabel 9. diketahui bahwa aktivitas antioksidan biji mentah pada koro

kratok lebih tinggi dibanding kedelai kuning yaitu 76,49%; sedangkan aktivitas

antioksidan kedelai hitam lebih rendah dibanding kedelai kuning yaitu 30,0%, hal

ini kemungkinan disebabkan terhidrolisisnya senyawa isoflavon glukosida

menjadi isoflavon bebas yang disebut aglukon oleh enzym -glukosidase yang

terdapat pada jenis legume yang dihasilkan oleh mikroorganisme selama

fermentasi. Dari Tabel diatas juga menunjukkan bahwa rata-rata tempe hasil

fermentasi 3 hari memiliki aktivitas antioksidan yang tertinggi, yaitu 81,43% pada

tempe kedelai kuning, 82,49% pada tempe kedelai hitam, 77,90% pada tempe

koro hitam dan 65,12% pada tempe koro kratok kemudian menurun pada

fermentasi hari ke-4, hal ini dapat disebabkan karena adanya hidrolisis pada saat

fermentasi atau kemungkinan disebabkan oleh reaksi lebih lanjut senyawa

isoflavon menjadi senyawa lain yang aktivitasnya belum diketahui dan perlu dikaji

lebih mendalam.

Dari Tabel 9. dapat juga diuraikan bahwa tingkat aktivitas antioksidan

rata-rata kedelai hitam mentah menunjukkan hasil yang paling rendah

dibandingkan dengan kedelai kuning, koro kratok dan koro hitam mentah, tetapi

pada hasil fermentasi hari ke-3 kedelai hitam mempunyai tingkat aktivitas

antioksidan yang paling tinggi dibandingkan kedelai kuning, koro hitam dan koro

kratok, hal ini disebabkan kemungkinan karena reaksi enzimatis yang mengubah

senyawa isoflavon glukosida menjadi isoflavon aglukan terjadi secara optimum

pada lama fermentasi hari ke-3 tersebut. Seperti telah diketahui, senyawa

aglukan isoflavon memiliki aktivitas fisiologis yang lebih tinggi dibanding isoflavon

glukosida.

Lama waktu fermentasi berpengaruh terhadap aktivitas antioksidan

senyawa isoflavon. Hal ini dapat dilihat dari hasil uji aktivitas antioksidan yang

Page 70: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

70

dilakukan. Terjadi kenaikan aktivitas antioksidan seiring bertambahnya waktu

fermentasi, hingga mencapai maksimum pada hari ketiga.

Hasil uji aktivitas antioksidan optimum pada tempe kedelai hitam, koro hitam dan

koro kratok berdasarkan lama waktu fermentasi dapat dianalisis dengan statistik

program SPSS version 15, untuk mencari perbedaan yang nyata dari pengaruh

lama waktu fermentasi terhadap aktivitas antioksidan yang dapat dilihat pada

lampiran.

Dari Tabel 9. diatas menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan kedelai

kuning, kedelai hitam, koro hitam dan koro kratok dipengaruhi lama waktu

fermentasi.

Berdasarkan perbedaan antar perlakuan, biji mentah koro kratok menunjukkan

aktivitas antioksidan yang tertinggi diantara biji kedelai kuning mentah, biji kedelai

hitam mentah dan biji koro hitam mentah. Pada hasil fermentasi hari ke-0 dan

hasil fermentasi hari ke-2 aktivitas antioksidan kedelai kuning tidak menunjukkan

beda nyata dibanding hasil fermentasi hari ke-1, 3 dan ke-4. Untuk koro hitam

hasil fermentasi hari ke-1 dan fermentasi hari ke-4 aktivitas antioksidannya tidak

menunjukkan beda nyata bila dibandingkan dengan hasil fermentasi biji mentah,

fermentasi hari ke-0, 2, dan ke-3. Untuk kedelai hitam dan koro kratok pada biji

mentah hingga fermentasi hari ke-4 memiliki aktivitas antioksidan yang

menunjukkan perbedaan secara signifikan.

Berdasarkan perbedaan antar perlakuan, fermentasi hari ke-3 merupakan

fermentasi yang optimum untuk menghasilkan aktivitas antioksidan tertinggi

diantara fermentasi hari ke-0, 1, 2, 4. Pada fermentasi hari ke-3 tersebut tempe

kedelai hitam memiliki aktivitas antioksidan yang tertinggi diikuti tempe kedelai

kuning, tempe koro hitam dan tempe koro kratok, tetapi hasil aktivitas antioksidan

antara tempe kedelai hitam dan tempe kedelai kuning menunjukkan beda nyata.

Berdasarkan tabel diatas, juga dapat diketahui bahwa pada fermentasi hari ke-0

kedelai kuning, kedelai hitam, koro hitam dan koro kratok aktivitas antioksidannya

Page 71: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

71

mengalami kenaikkan dibanding pada saat belum difermentasikan (mentah)

kemudian menurun pada fermentasi hari ke-1 sampai fermentasi hari ke-2,

setelah itu mengalami kenaikkan pada fermentasi hari ke-3, kemudian menurun

lagi pada fermentasi hari ke-4, kecuali pada kedelai hitam hasil uji aktivitas

antioksidannya pada biji mentah sampai fermentasi hari ke-3 terus mengalami

kenaikan kemudian menurun pada fermentasi hari ke-4 yang dimungkinkan

sudah mulai terjadi pembusukkan yang ditandai dengan munculnya warna hitam

misellium pada bagian tepi dan aroma busuk yang menyengat.

Hubungan antara aktivitas antioksidan yang tinggi pada beberapa jenis

legume diatas tidak dipengaruhi oleh kadar kandungan senyawa isoflavon yang

optimum. Pada kedelai hitam, koro hitam, koro kratok serta kedelai kuning

sebagai kontrol memiliki rata-rata aktivitas antioksidan yang tinggi pada

fermentasi hari ke-3 tetapi kandungan isoflavon optimumnya tidak terjadi pada

fermentasi hari ke-3. Pada kedelai hitam dan kedelai kuning kadar kandungan

isoflavon optimum terjadi pada fermentasi hari ke-2, pada koro hitam kadar

kandungan isoflavon optimum terjadi pada fermentasi hari ke-1, dan pada koro

kratok kadar kandungan isoflavon optimum terjadi pada fermentasi hari ke-3. Ini

menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan yang tinggi tidak selalu mempunyai

kandungan isoflavon yang optimum pula, hal ini kemungkinan dapat disebabkan

adanya senyawa-senyawa lain misalnya fenolik lain yang bukan dalam golongan

flavonoid yang terdapat dalam ekstrak etanol yang memiliki aktivitas seperti

antioksidan atau dapat juga disebabkan adanya senyawa yang bukan isoflavon

tetapi memiliki kemampuan seperti antioksidan atau kemungkinan karena faktor

lain yaitu terjadi pada saat berlangsungnya proses fermentasi dimana enzym -

glukosidase cepat memecah glukosida menjadi aglukon sehingga juga dapat

menambah jumlah senyawa isoflavon. Sebaliknya, ada beberapa jenis

kandungan isoflavon yang tinggi tetapi memiliki aktivitas antioksidan yang

rendah, hal ini dapat dimungkinkan pada waktu proses ekstraksi, pengemasan

Page 72: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

72

hasil ekstraksi dan penyimpanan hasil ekstraksi sudah teroksidasi atau bereaksi

dengan senyawa lain yang bersifat radikal bebas.

E. Hasil uji aktivitas antioksidan dengan pembanding antioksidan alami dan

antioksidan sintetik

Aktivitas antioksidan tempe kedelai hitam, tempe koro hitam, dan tempe

koro kratok dapat kita uji dan dibandingkan dengan aktivitas antioksidan lain yang

sudah ada yaitu -tokoferol, -karoten dan vitamin C sebagai antioksidan alami

maupun BHT yang merupakan antioksidan sintetis, yang dapat dilihat pada Tabel

10. dan Gambar 17. dibawah ini.

Tabel 10. Perbandingan aktivitas antioksidan tempe beberapa legume dan sumber lainnya (%)

Sampel Aktivitas Antioksidan (%) -karoten 43,2533a Tempe koro kratok (3hari) 65,1200b Vitamin C 75,6200c -tokoferol 76,4100d Tempe koro hitam (3 hari) 77,9033e BHT 81,1567f Tempe kedelai kuning (3 hari) 81,4300f Tempe kedelai hitam (3hari) 82,4867g

Berdasarkan Tabel 10. dapat diketahui bahwa aktivitas antioksidan tempe

beberapa legume dan sumber lainnya menunjukkan tempe kedelai hitam 3 hari

memiliki aktivitas antioksidan tertinggi (82,49%) dan menunjukkan beda nyata

dibanding tempe koro hitam (77,90%), tempe koro kratok (65,12%) dan tempe

kedelai kuning (81,43%) sebagai kontrol serta antioksidan sumber lainnya.

Dan dari tabel diatas juga dapat diketahui bahwa antara tempe kedelai kuning

dengan BHT (81,16%) sebagai antioksidan sintetis menunjukkan beda tidak

nyata, dengan aktivitas antioksidannya cenderung sedikit lebih rendah dibanding

tempe kedelai hitam. Pada tempe koro hitam memiliki aktivitas antioksidan yang

sedikit lebih tinggi dan menunjukkan beda nyata dengan -tokoferol (76,41%)

dan vitamin C (75,62%) sebagai antioksidan alami, sedangkan tempe koro kratok

Page 73: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

73

(65,12%) memiliki aktivitas antioksidan yang sedikit lebih tinggi dan menunjukkan

beda nyata dengan -karoten (43,25%) sebagai antioksidan sintetis.

Sehingga, dapat disimpulkan bahwa aktivitas antioksidan dapat dipengaruhi oleh

jenis sampel.

Berdasarkan Tabel 10. dapat dibuat grafik Perbandingan aktivitas antioksidan

(%) antara beberapa legume (kedelai kuning, kedelai hitam, koro hitam dan koro

kratok) dengan senyawa antioksidan alami dan sintetik berikut ini.

Gambar 17. Perbandingan aktivitas antioksidan (%) antara beberapa legume dengan senyawa antioksidan lainnya

Dari Gambar 17. diatas dapat diketahui bahwa aktivitas antioksidan

beberapa senyawa dari yang terendah ke yang tertinggi berturut-turut adalah -

caroten, Tempe koro kratok (3hari), Vitamin C, -Tokoferol, Tempe Koro hitam (3

hari), BHT, Tempe Kedelai kuning (3 hari), dan Tempe Kedelai hitam (3 hari).

Dari hasil perbandingan aktivitas antioksidan tersebut dapat juga disimpulkan

bahwa kedelai hitam dengan fermentasi 3 hari didapatkan hasil aktivitas

antioksidan yang optimum yang dapat digunakan sebagai sumber isoflavon yang

berkhasiat antioksidan.

0

20

40

60

80

100

A B C D E F G H

Aktivitas antioksidan

Jenis senyawa antioksidan

B-karoten

T.koro kratokVitamin C

A-tokoferol

T.koro hitam

BHT

T.kdl kuning

T.kdl hitam

Page 74: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

74

Dari perbandingan 4 jenis legume diatas dapat disimpulkan bahwa Tempe

kedelai hitam memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan

aktivitas senyawa antioksidan tempe kedelai kuning sebagai kontrolnya. Aktivitas

antioksidan tempe kedelai hitam lebih baik bila dibandingkan BHT yang

merupakan antioksidan sintetis. Sedangkan tempe koro hitam memiliki aktivitas

antioksidan yang sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan -tokoferol, dan

vitamin C, meskipun dibandingkan dengan tempe kedelai kuning hasil uji aktivitas

antioksidan koro hitam cenderung tidak terpaut jauh.

Menurut Suryo dan Tohari (1995), penggunaan zat antioksidan sintetik tertentu

misalnya BHT dapat menimbulkan akibat buruk terhadap kesehatan konsumen

seperti gangguan fungsi hati, paru, mukosa usus dan keracunan. Dan dari hasil

tersebut diatas, maka tempe kedelai hitam hasil fermentasi hari ke-3 potensial

untuk dimanfaatkan sebagai antioksidan alami pengganti BHT (sebagai

antioksidan sintetik) yang dapat digunakan sebagai sumber isoflavon yang

berkhasiat antioksidan, sehingga dapat memberikan manfaat yang baik bagi

kesehatan tubuh apabila dikonsumsi, dan mengkonsumsi tempe yang paling baik

bagi kesehatan adalah tempe hasil fermentasi hari ke-3 karena memiliki aktivitas

antioksidan yang optimum dan disarankan mengkonsumsi tempe koro dengan

fermentasi lebih dari 2 hari dengan cara dipanaskan terlebih dahulu untuk

menghindari keracunan tempe.

Page 75: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

75

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Jenis-jenis senyawa isoflavon berkhasiat antioksidan selama fermentasi

optimum adalah :

a. Tempe kedelai hitam dengan lama fermentasi 2 hari mengandung faktor-2

(0,0161 g), daidzein (1,2947g), glisitein (0,9670 g), genistein (2,3424 g)

dengan isoflavon total 4,6202 g

b.Tempe koro hitam dengan lama fermentai 1 hari mengandung faktor-2

(0,0149 g), daidzein (0,0401 g), glisitein (0,1145 g), genistein (0,4404 g)

dengan isoflavon total 0,0699 g

c.Tempe koro kratok dengan lam fermentai 3 hari mengandung faktor-2

(0,0036 g), genistein (1,7252 g) dengan isoflavon total 1,7288 g

2. Lama fermentasi optimum menghasilkan senyawa antioksidan tinggi adalah

fermentasi 3 hari, untuk kedelai hitam, koro hitam dan koro kratok masing-

masing adalah 82,49%; 77,90%; 65,12%

3. Bahwa kedelai hitam, koro hitam dan koro kratok serta produk tempenya

Page 76: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

76

berpotensi ddalam upaya pemanfaatn sebagai antioksidan alami khususnya

isoflavon bila dibandingkan dengan ekstrak etanol dari kedelai kuning dan

produk tempenya serta beberapa antioksidan alami (-tokoferol, -karoten,

dan asam askorbat) maupun antoksidan sintetik (BHT).

A. Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, penulis memberikan saran

bahwa:

1. Senyawa isoflavon tempe kedelai hitam, koro hitam dan koro kratok

memiliki aktivitas fisiologis selain aktivitas antioksidan, sehingga perlu

penelitian lebih lanjut mengenai aktivitas fisiologis isoflavon yang lain.

2. Tempe hasil fermentasi 3 hari memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi,

sehingga sangat baik untuk dikonsumsi karena dapat digunakan sebagai

sumber isoflavon yang berkhasiat antioksidan.

3. Perlu penelitian lebih lanjut tentang pembuatan tempe koro yang bagus

dengan waktu yang singkat.

Page 77: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

77

DAFTAR PUSTAKA

Afriansyah, N. 1996. Radikal Bebas Dikenal Untuk Dikendalikan, Sadar Pangan dan Gizi, Vol (1):6-7

Amrun, H. M; Umiyah; dan Umayah E. U. 2007. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak

Air dan Ekstrak Metanol Beberapa Varian Buah Kenitu (Chrysopylum cainito L.) dari Daerah Jember . Berkala Penelitian Hayati 13. Jember : Jurusan Biologi Uiversitas Jember.

Anderson J., W., Diwadkar, V., A., dan Bridges, S., R. 1998. Selective Effect Of

Different Antioxidants on Oxidation of Lipoprotein frm rats. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 218: 376 – 381.

Anonima. 2008. Impor Kedelai.dalam

http : // www.antara.co.id/are/2008/1/15/kelangkaan-kedelai-berpotensi-dorong-inflasi.-Januari/ diakses Januari, 2008, 21.00 WIB.

Ardiansyah, 2007, Antioksidan dan peranannya Bagi Kesehatan,

www.chaptereislamicspace.wordpress.com/2007/01/24 Ariani,S.R.D. 1997. Pembuatan Keju Kedelai yang Mengandung Faktor2 sebagai Alternatif Pengembangan Hasil Olahan Pangan dari Tahu. Tesis. Magister Kimia ITB. Bandung

Astuti, Mary. 1995. Tempe dan Antioksidan Prospek Pencegahan Penyakit Degenaratif. Yayasan Tempe Indonesia.

Atmosukarto K, Rahmawati M. 2003. Mencegah penyakit degeneratif dengan makanan. Cermin Dunia Kedokteran 140:41-49.

Page 78: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

78

Bambang Purwono, Chairil A, D. Fitriani, I. Anggrraini, 2003, Sintesis Antioksidan dari Eugenol dan Isoeugenol Melalui Reaksi Mannich, Gama Sains 5 (1):40-50

Barz, W. Ang G.B. Papendorf. 1991. Metabolism of isoflavones and formation of factor-2 by tempeh producing microorganism Tempeh Workshop, Cologne. 20 May 1991.

Barz, W., Heskamp, Klus, K., Rehms, H. dan Steinkamp, R. Recent Aspect of Protein, Phytate and Isoflavone Metabolism by Microorganisms Isolated from Tempe-Fermentation. Tempo Workshop, Jakarta, 15 February 1993.

Barz, W.H., Borger-papendof, G., and Rehms, H. 1990. “Characterization of Glycochydrolases, phospatases and isoflavone Metabolism in Tempe Forming Rhizophus-Strains” In Hennana, Mahmud, M. & Karyadi, D (eds) Second Asian Symposium Non-Salted Soybean Fermentation. Jakarta. Hal.20-32.

Budi Widianarko, Rika Pratiwi, Soedarini, Rossana Dewi, Sri Wahyuningsih dan Nunik Sulistiyani, 2003, Menuai Polong, Sebuah pengalaman Advokasi Keragaman Hayati, Gramedia Widiasarana, Jakarta

Campbell, 2003, Biologi, Penerbit Erlangga, Jakarta

Chang, S.S., Bostric-Matijasevic, O.A.L.Hsieh, dan C.L.Huang, 1977, Natural Antioxidants from Rosemary and Sage, J.Food.Sci. Vol (42):574

Chan. W.M., and Ma C.Y., 1999. “modification of Proteins from Soymilk residu (Okara) by Trypsin”. Journal of Food Science, Vol. (64): 5

Chen H.M., Koji M, Fumio Y, Kiyoshi N. 1996. Antioxidant activity of designed peptides based on the antioxidative peptide isolated from digets of a soybeab protein. J. Agric Food Chem 44:2619-23

Coward, L., Barnes, N., Setchell, K.D.R., Barnes, S. Genistein and Daidzein and their -Gliciside Conjugates anti-tumor Isoflavons in Soybeans Foods from american and Asian Diets. J. Agric. Food. Chem. 41; 1961-1967.

Dian Sri Pramita. 2008. Pengaruh Teknik Pemanasan Terhadap Kadar Asam Fitat dan Aktivitas Antioksidan Koro Benguk (Mucuna pruriens), Koro Glinding (Phaseolus lunatus) dan Koro Pedang (Canavalia ensiformis). Skripsi. Surakarta : Jurusan Teknologi Pertanian FP UNS.

Desti Utami. 2007. Antioksidan. www.halalguide.info.destiutami.wordpress.com/2007/02/27/14.00 Djien, K.S., 1985, Some Microbiological aspects of tempe Starter, Asian

Symposium Non-salted Soybean Fermentation, Tsukuba, Japan, July 14-16, 1985.

Early, R.L., 1969, Satuan Operasi dalam Pengolahan Pangan, Sastra Budaya,

Bogor

Page 79: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

79

Eisen, B. Unggar, Y., Dan Shimonu, E., 2003, Stability of Isoflavon in Soymilk Stored at Elevated and Ambient Temperature, J. Agric. Food. Chem, Volume 51 no.8

Esaki,H., H. Onosaki,S. Kawasaki dan T.Osawa. 1996. New Antioksidan Isolated

From Tempeh. J Agric Food.

Eridani, S.N. 2006. Potensi Antioksidan Beberapa Ekstrak Senyawa Bahan Alam yang Berkhasiat Sebagai Anti Kanker. Skripsi. Bogor. Prodi Biokimia FPMIPA IPB.

Fujimaki. 1968. fundamental Investigation of Proteolytic Enzim Aplication to

Soybean Protein inrelation Flavour. Tokyo University. Tokyo. Hal 343. Gandjar I. Slamet D.S., and Kartosuwondo D. 1979. Tempe from non-soybean

leguminous seeds. Paper in the 4th. Seminar of Food Technol. Bogor, Indonesia, May 16-17.

Girindra, A., 1979. faktor Anti Tripik Kedelai. IPB Press. Bogor

Gordon, M.H. 1990. “The Mechanism of Antioxidant Action In Vitro”. Food Antioxidant. Elsevier Applied Science London and New York. 1:9-10.

Gyorgy, P., K. Murata, and H. Ikehata. 1964. Antiokxidants isolated from fermented soybeans tempeh. Nature. 203: 872-875.

Handajani S. 1991. Beberapa metode untuk mengatasi masalah flavor dan kekerasan biji kecipir. Laporan Penelitian DP3M.

Handajani S. 1991. Quality characteristic of winged bean (Psophocarpus tetragonolobus L DC.) seeds. PhD Thesis, Univ. of New South Wales, Kensington, Australia.

Handajani S. dan Bukle. 1991. Charateristic of Winged Bean (Psophocarpus tetragonolobus (L) DC) Seeds during Soaking and Boiling.

Handajani S. dan Atmaka W. 1993. Analisa sifat fisis khemis beberapa biji kacang-kacangan, kekerasan, kualitas tanak, protein, dan mineralnya. Laporan Penelitian ARMP, Lembaga Penelitian Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

Harris R. Dan Endel Karmas. 1989. Evaluasi Gizi pada Pengolahan Bahan Pangan. Penerbit ITB Bandung.

Haryoto. 1996. Susu dan Yogurt Kecipir. Kanisius. Yogyakarta. Hermana dan Mien Karmini. Pengembangan Teknologi Pembuatan Tempe

dalam Bunga Rampai Tempe Indonesia: Tempe Aspek Teknologi Mikrobiologi.

Hesseltine, C.W., 1985, Genus Rhizopus and Tempeh Microorganism, Asian

Symposium Non-salted Soybean Fermentation, Tsukuba, Japan, July 14-16, 1985

Page 80: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

80

Heyne K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid 3. Badan Penelitian dan

Pengembangan Kehutanan. Departemen Kehutanan, penerjemah; Jakarta: Yayasan sarana Wana Jaya. Terjemahan dari: De Nuttige Planten Van Indonesie.

Hodgson, E and P.E. Levi. 2000. A Textbook of Modern Toxicology. Elsevier.

New York Imam Suryo dan Imam Tohari. 1995. Aktivitas Antioksidan Buah jambu Mete dan

Penerapannya pada Abon. Biosain.1(7). 50-61 Kikuzaki, H dan Nakatani, N., 1993, Antioxidant Effect of Some Ginger

Constituents, J.Food.Sci. Vol. (58) : 1047 Kanetro, B. 2001. Ragam Produk Olahan Kacang-Kacangan. CV Debut Wahana

Sinerge. Yogyakarta.

Kanetro B., Hastuti S. 2006. Ragam Produk Olahan Kacang-Kacangan. Universitas Wagsa Manggala Press. Yogyakarta.

Kasmidjo, R.B. 1990. Tempe: Mikrobiologi dan Biokimia, Pengolahan Serta Pemanfaatannya. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. UGM Yogyakarta.

Ketaren, S. 1986. Pengantar Teknologi Minyak dan Lemak pangan. Jakarta: UI

Press. 13-179 Koensoemardiyah. 1992. Biosintesis Produk Alami, IKIP Semarang Press.

Semarang. Terjemahan : Biosynthesis of Natural Product. Manitto, F. 1981. John Willey and Sons. New York.

Koswara, S. 2006. Isovlavon,Senyawa Multi-Manfaat Dalam Kedelai.

Ebookpangan.com, Bogor. Kudou, S., Fleury, Y., Welti d., Magnolato D. Uchida T., Kitamura K., and

Okubo K. 1001. “Malowd Isoflavone Glycoside in Soybean Seeds (Glycine max Merr)”. Agric. Biol. Chem. 55:2227-2233

Lamina, 1989, Kedelai dan Pengembangannya, Simplex. Jakarta Leafleat Hari Kesehatan Nasional ke 40 - Indonesia Sehat 2010, Depkes 2004. Larco Hoyle, Rafael. Los Mochicas. Museo Arqueologico Rafael Larco Herrera. Lima 2001. ISBN 9972-934-10-1 Made Astawan, MS,. 2003. Menguak Manfaat Tempe. Bogor : IPB

Maradjo, M. 1976. Kacang-kacangan. PT. Karya Nusantara. Jakarta.

Murata, K., 1985. Formation of antioxidant and nutrient in tempe. Asian Symposium on Non-salted Soybean Fermentation, Tsukuba, Japan, July 14-16, 1985.

Page 81: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

81

Mien, M.K. 1987. Peranan makanan bagi formula tempe dalam penganggulangan masalah diare pada anak balita. Disertasi Doktor. IPB. Bogor

Mien, M.K. and Hermana. 1989. The influence of Faktor-2 and tempe on growth and hypocholecteremic of rabbits. Tempe Workshop, coleogne, Germany, November 13, 1989

Naim, M., Gestetner, B., bondi, A., dan Birk, Y., 1974. Soybean Isoflavones, Characterization, Determination, and Antifungal Activy. J. Agric. Food. Chem. 22: 806-810.

Nara, EX, Kushiro M, Zhang H, Sugawara T, Miyashita N, Nagao A. 2001. Carotenoids effect proliferation of human prostate cancer cells. Research Communication. J.Nutr., 131:3303-3306

National Academy of Science. 1984. The winged bean. A high protein crop for the tropic. Report of Ad Hoc. Panel of the Advisory Committee on the Technology Innovation, 2nd ed. BOSTID, Washington DC.

Padmawinata, K, 1988. Cara Mengidentifikasi Flavanoid, ITB Press, Bandung, Terjemahan : Techniques of Flavonoid Identification, Markham, 1988, Academic Press, London.

Pawiroharsono, S. 1995. Metabolisma Isoflavon dan Faktor-ll Pada Proses Pembuatan Tempe. Prosiding Simposium Nasional Pengembangan Tempe Dalam Industri Pangan Modem, April 1995. UGM. Yogyakarta.

Pradana, S. 2008. Prospek dan Manfaat Isoflavon sebagai Fitoestrogen Bagi Kesehatan. Jakarta

Prakash A. 2001. Antioxidant Activity. Medalion Laboratories Analytical Progress.

19(2).

Pratt, D.E dan Birac. 1979. Source of Antioxidants Activity of Soybeans and Soy Products. Journal of Food Sciece. Vol. (44):25-27.

Purseglove j.w. 1969 Tropical Crops Vol (II):30-31

Purwoko. T., S. Pawiroharsono dan Ginandjar. 2001. Biotransformasi Isoflavon oleh Rhizopus oryzae. UICC 524. Biosmart.3 (2): 36-39.

Restuhadi, F. 1993. Studi Pendahuluan Biokonversi Isoflavon pada Proses Fermentasi Kedelai Menggunakan Rhizopus spp. L.4l. Tesis. Bandung : Magister Kimia ITB.

Rubatzky V.E, Yamaguchi M. 1997. Sayuran Dunia : Prinsip, Produksi dan Gizi Jilid II. ITB Bandung.

Salunkhe D.K dan Kadam S. 1990. Handbook of world food legumes: Nutritional chemistry, Processing Tecnology, and Utilization. Vol. 1. CRC press, BOCARATON.

Page 82: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

82

Samson, R.A, Van Koorth, J.A and De Boer, E.S. 1987. Microbiological quality of commercial tempeh in the nederlands, J.Food protection, 50 (2), 92-94

Schlutz, J.E, R. Hansel and V.E. Tayler. 1984. Rational Phytotherapy. A physician’s guide to Herbal Medicine. 3 . Springer Verlag, Heidelberg.

Shurtleff and Aoyagi. 1979. The Book of Tempe. Harper Ang Row Publisher. New York.

Snyder, H.E. dan Kwon, T.W., 1987, Soybean Utilization, Van Nostrand Reinhold

Co., New York Somaatmojo, S. Ismunadji, M. Sumarno. Syam, Mahyuddin. Manurung, S.O.

Yuswadi. 1985. Kedelai. Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. Bogor.

Sunarno, w. Dan Ariam, S., 2001. Identifikasi awal senyawa faktor-2 pada tempe

selama proses fermentasi hari ke-0, 1, 2, 3, 4 dan 5. Paedagogic. Vol. (4): 1-2

Sri Retno Dwi Ariani, 2001, Identifikasi Senyawa Faktor-2 (Suatu Senyawa Isoflavon) dari Tempe Selama Proses Fermentasi Hari ke-0,1,2,3,4, dan 5, Paedagogia, Jilid 4 No.1, 2001.

Sri Retno Dwi Ariani, 2003, Pembuatan Keju Kedelai yang Mengandung

Senyawa Faktor-2 Hasil Biokonversi Isoflavon Pada Tahu Oleh Rhizopus oligosporus (L.41), Biosmart, Vol. 5, (1):1411-1434, April 2003,

Sri Retno Dwi Ariani dan Wiji Hastuti, 2009, Analisis Isoflavon dan Uji Aktivitas

Antioksidan Pada Tempe Kedelai (Glycine max L. Merril) dengan Variasi Lama Waktu Fermentasi Dan Metode Ekstraksi, Prosiding Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia dengan Tema : Teknologi Informasi dalam Mendukung Perkembangan Riset dan Pembelajaran Kimia, Surakarta 18 Maret 2009.

Sukib, Mahrus, dan Mutiah, 2002, Aktifitas Antioksidan Isolat Kepiting Laut dari Perairan Lombok, Jurnal Penelitian Universitas Mataram, 2(1)

Supriyanti, Siti Atikoh. 1997. Perlakuan Perendaman, Pemutusan, perebusan,

serta Kombinasinya terhadap Kandungan asam Fitat dan anti Kemotripsin pada Kacang Tholo dan Gude. Skripsi S1. UGM. Yogyakarta.

Susanto, T., Zubaidah, e., dan Wijanarko, S.B. 1998. Studi tentang aktivitas

antioksidan pada tempe; tinjauan terhadap lama fermentasi, jenis pelarut, dan ketahanan terhadap proses pemanasan, Prosiding seminar teknologi Pangan dan Gizi. Yogyakarta. 15 desember. 317-326

Sutardi and Buckle, K.A. 1988. Phytic acid changes in soybeans fermented by

traditional inoculum and six strains of Rhizopus oligosporus, J. Applied Bacterial 53 (6): 539-543

Taher A. 2003. Peran fitoestrogen kedelai sebagai antioksidan dalam

penangulanan aterosklerosis (tesis) Bogor. Program Pascasarjana. IPB.

Page 83: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

83

Tjahjadi Purwoko, Nurkhayati dan Retno arumsari. 2003. Aktivitas Antioksidan ampas tahu terfermentasi terhadap oksidasi minyak kedelai. Biosmart. 5(I): 11-12

Tjitrosoepomo, G. 1996. Taksonomi Tumbuhan spermetophyta, cetakan kelima.

Gadjah Mada University press, Yogyakarta. Tri Susanto, Elok Z dan Simon B.W. 1998. Studi Aktivitas Antioksidan pada

Tempe. Jakarta. Perhimpunan Ahli Teknologi Pangan Indonesia. Walter, E., D., 1941. Genestein ( an isoflavone glucocide ) and its aglycone,

genestein, from soybeans. J.Am. Chem. Soc. 63 : 3273-3276. Wang,. H.L. and Hesseltine. C.W. 1966. Wheat tempe Cereal Chem., vol. (5):

563. Wang, C., Ma, Q., Pagadala, S., Serrard, M.S., and Krishnan, P.G. 1998.

Changes of during processing of sy protein isolates. J. Am. Oil Chem. Soc. 75: 337-341

Winarno, F.G. 1974. Protein, Sumber dan Perannya. Departemen Teknologi

Hasil Pertanian IPB. Bogor. Winarsi, H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Kanisius. Yogyakarta Yang, C.S. et al. 2000. Tea ant tea polypenols in cancer prevention. J. Nurt., 130:

472S-478S

Yooseef M.M., Bushuk W., Murray E.D., Zillman A., and Shehata A.M.E. 1982. Relationship between cookability ang some chemical and physical properties of faba beans ( Ficia Vaba L.). J.Food Sci. 47, 1695-1697.

Zilleken, F., 1986. First draft meeting on biotechnology, BPP Teknologi, 11 Maret 1986, Jakarta.

Zilliken, F.I 1987. Production of Novel Isoflavans. Material Meeting, BMBF, Bonn, Germany.

Zuheid, Noor. 1989. Senyawa Antigizi. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

Page 84: KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI …

84