52 Ali Husni et al.Jurnal Bioteknologi Pertanian, Vol. 8, No. 2, 2003, pp. 52-59

ABSTRACT

This study was aimed at establishing the method of protoplastregeneration of eggplant. Three eggplant varieties were used,i.e. Kopek, Medan, and Dourga. To isolate protoplast, leaveswere sliced and incubated in CPW solution containing 15%cellulose Onozuka RS + 0.5% macerozym R-10 + 0.05% MES+ 9.1% mannitol for 16 hours in dark condition. The isolatedprotoplasts were then purified with 21% sucrose and washedwith a solution containing 0.5 M mannitol + 0.5 mM CaCl2.The pure protoplasts were cultured in dark condition in KM8Pand VKM media enriched with 0.2 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/lzeatin + 1 mg/l NAA. The cell colonies produced were culturedand then diluted in the same medium + 0.1 mg/l 2,4-D + 0.2mg/l BA. The calli were regenerated in MS medium containingMW vitamin enriched with 2, 4, or 6 mg/l zeatin as treatments.The result showed that the number of protoplast isolated was105 for each cultivar. Protoplast incubation in dark conditioncan promote cell wall formation. Exposing protoplast cultureto the light can increase protoplast cell ability to form cellcolonies. Dilution of cell suspension on the same mediumenriched with 0.1 mg/l 2,4-D + 2 mg/l BA was able to promotethe development of microcallus. The shoot number in MSmedium enriched with MW vitamin + 0.1 mg/l IAA + 1 mg/l zeatin was 5 shoots for Kopek and one shoot for Medan,with regenaration ability ranged from 25 to 33.5%, while inthe basal medium enriched with 0.1 mg/l IAA + 2 mg/l zeatin,it was 13 shoots in Kopek and 2 shoots in Medan withregeneration ability 50-86.67%. The number of regenerantsresulted were 21 regenerants, consisted of 18 regenerants ofKopek and 3 regenerants of Medan. Shoot transplanting inMS medium without growth regulators can promote the shootsto form plantlet.

[Keywords: Solanum melongena, eggplant, cell culture, pro-toplasts, genetic variation]

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan keragamangenetik tanaman terung melalui kultur protoplas. Penelitianmenggunakan tiga kultivar terung yaitu Kopek, Medan, danDourga. Isolasi protoplas dimulai dengan penggoresan bagianbawah daun dan inkubasi dalam larutan enzim 0,5% selulaseOnozuka RS + 0,5% macerozim R-10 + 0,05% MES + 9,1%manitol dalam larutan CPW selama 16 jam dalam keadaan

gelap. Selanjutnya dilakukan pemurnian protoplas denganlarutan 21% sukrosa dan pencucian dengan larutan 0,5 Mmanitol + 0,5 mM CaCl2. Protoplas yang dihasilkan dikulturdalam media KM8P dan VKM + 0,2 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/lzeatin dan 1 mg/l NAA. Setelah terjadi pembelahan danpembentukan koloni sel, media diencerkan dengan mediadasar + 0,1 mg/l 2,4-D + 0,2 mg/l BA. Kalus yang dihasilkandiregenerasikan pada media padat MS + vitamin MW denganpenambahan 2, 4, dan 6 mg/l zeatin sebagai perlakuan. Hasilpenelitian menunjukkan bahwa jumlah protoplas yang dapatdiisolasi mencapai 105 setiap kultivar. Inkubasi tanpa cahayadapat mempercepat pembentukan dinding protoplas danpembelahan sel. Pemberian cahaya pada kultur setelahterbentuk dinding sel dapat mendorong terbentuknya kolonisel. Pengenceran suspensi sel dengan media dasar yangditambah 0,1 mg/l 2,4-D + 2 mg/l BA dapat memacu pem-bentukan mikrokalus. Jumlah kalus yang dihasilkan padamedia MS + vitamin MW + 0,1 mg/l IAA + 1 mg/l zeatinmencapai 5 tunas pada kultivar Kopek dan 1 tunas padakultivar Medan dengan efisiensi keberhasilan 25-33,5%.Kombinasi 0,1 mg/l IAA + 2 mg/l zeatin menghasilkan 13tunas pada kultivar Kopek dan 2 tunas pada kultivar Medandengan efisiensi keberhasilan 50-86,67%. Regeneran yangdihasilkan berjumlah 21 tunas yang terdiri atas 18 regenerankultivar Kopek dan 3 regeneran kultivar Medan. Pemindahantunas pada media MS tanpa zat pengatur tumbuh dapat men-dorong pertumbuhan dan perkembangan tunas membentukplantlet.

[Kata kunci: Solanum mengolena, terung, kultur sel, protoplas,keragaman genetik]

PENDAHULUAN

Terung (Solanum melongena L.) merupakan tanamansayuran yang sangat populer. Di Indonesia, terungdikonsumsi sebagai sayur, lalapan atau dipanggang.Di Jepang, terung biasanya digunakan untuk makanantempura dan terung panggang, sedangkan di Amerikabiasanya terung dipanggang kemudian dimakan ber-sama siraman keju, susu, dan tepung. Selain rasanyaenak, terung mengandung gizi yang memadai, antaralain protein, lemak, karbohidrat, kalsium, fosfor, besi,serta vitamin A, B, dan C (Hardiansyah dan Briawan1990).

Keragaman genetik tanaman terung hasil regenerasi protoplas

Genetic variation of regenerated protoplast of eggplant

Ali Husni1, G.A. Wattimena2, I. Mariska1, dan A. Purwito2

1Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Jalan Tentara Pelajar No. 3A, Bogor 16111, Indonesia2Jurusan Agronomi, Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680, Indonesia

Keragaman genetik tanaman terung hasil regenerasi protoplas 53

Salah satu faktor penghambat dalam pengembangandan peningkatan produksi terung di Indonesia adalahserangan penyakit layu bakteri yang disebabkan olehRalstonia solanacearum. Pemberantasan penyakit inibiasanya dilakukan secara biologis, kimiawi, dankultur teknis, namun cara ini tidak efektif. Salah satuupaya yang dapat dilakukan adalah dengan mencipta-kan varietas/kultivar tahan, namun sifat ketahananyang baik hanya terdapat pada kultivar liarnya. Untukmemasukkan sifat ketahanan tersebut ke dalam varie-tas komersial tidak dapat dilakukan melalui pemuliaankonvensional karena adanya ketidaksesuaian secaragenetik. Persilangan antarspesies atau yang memilikikekerabatan yang jauh juga sangat sulit dilakukan(Gleba dan Shlumukov 1990; Grosser et al. 1990).

Kemajuan di bidang bioteknologi telah membukapeluang untuk mentransformasikan sifat-sifat tertentudari tanaman donor ke tanaman penerima sehinggadapat dihasilkan tanaman dengan sifat-sifat genetikyang diinginkan (Rangahau 1999). Varietas/kultivaryang tahan dapat diperoleh melalui manipulasi genetikseperti penyelamatan embrio, fusi protoplas, keragam-an somaklonal (kultur protoplas, kultur sel), dantransformasi. Salah satu penentu keberhasilan pe-muliaan tanaman secara bioteknologi adalah sistemregenerasi.

Sumber eksplan merupakan salah satu faktor yangsangat mempengaruhi keberhasilan regenerasi ter-utama pada kultur in vitro. Protoplas dapat digunakansebagai sumber eksplan karena protoplas merupakansel tanpa dinding, hanya dilindungi oleh membranplasma, sehingga peluang mendapatkan keragamantanaman cukup tinggi (Margara 1982). Protoplas yangmempunyai daya regenerasi tinggi sangat potensialdigunakan sebagai bahan untuk perbaikan tanamanmelalui hibridisasi somatik, transformasi, dan seleksiin vitro (Karamian dan Ebrahimzadeh 2001).

Peningkatan keragaman genetik melalui variasisomaklonal menggunakan protoplas telah berhasildilakukan pada beberapa tanaman, seperti variasipertumbuhan dan pembentukan umbi pada tanamanubi jalar (Sihachakr et al. 1994), variasi sifat ketahananterhadap penyakit Phytophthora infestan dan Alter-naria solanii pada tanaman kentang (Takebe et al.1971), serta variasi multiploidi (Datta et al. 1992) danketahanan Al pada tanaman padi (Utomo, 1997).Banyak lagi tanaman lain hasil kultur protoplas yangtahan terhadap penyakit dan toleran terhadapherbisida (Evans dan Sharp 1986).

Protoplas juga dapat digunakan untuk mendapatkanhibrida baru dari dua individu yang secara genetiktidak kompatibel melalui hibridisasi somatik dengan

fusi protoplas. Fusi protoplas dapat menggabungkanseluruh genom dari kultivar yang berlainan (intra-specific), atau antarspesies dalam genus yang sama(interspecific), atau antargenus dalam satu famili(intergeneric) (Wattimena 1999). Selain itu, fusi proto-plas juga dapat digunakan untuk mentransfer gen-genyang belum teridentifikasi, serta memodifikasi danmemperbaiki sifat-sifat yang diturunkan secara poli-genik (Milam et al. 1995; Waara dan Glimileus 1995).Melalui teknik ini telah dihasilkan hibrida terung baru,antara lain S. tuberosum dengan L. pimpinellifolim(Tan 1987), S. khasianum dengan S. aculestiasimum(Stattmann et al. 1994), S. khasianum dengan S.laciniatum (Sihachakr et al. 1995), S. melongenadengan S. aetovicum (Sihachakr 1998), S. khasianumdengan S. mammosum (Priyanto 1996), dan S. tube-rosum BF15 dengan S. phureza SVP5 (Purwito 1999).

Keberhasilan kultur protoplas sangat ditentukanoleh kemampuan regenerasi protoplas. Kemampuanregenerasi protoplas dipengaruhi oleh jenis eksplan(Bajaj 1977; Binding et al. 1978; Tan 1987), jenis dankomposisi media kultur, kondisi fisik media (Gosch etal. 1975), dan zat pengatur tumbuh yang digunakan(Nagata dan Takebe 1971). Penelitian ini bertujuanuntuk meningkatkan keragaan genetik tanaman terungmelalui kultur protoplas.

BAHAN DAN METODE

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur InVitro Balai Penelitian Bioteknologi dan SumberdayaGenetik Pertanian, Bogor pada tahun 2000-2002

Bahan tanaman

Bahan tanaman yang digunakan sebagai sumberprotoplas adalah biakan in vitro tiga varietas terungyaitu Dourga (berbuah putih), Kopek (berbuah ungu),dan Medan (berbuah hijau). Biakan ditanam dalammedia MS (Murashige dan Skoog 1962) dengan pe-nambahan vitamin MW (Morel dan Wetmore 1951), 20g sukrosa, dan 7 g agar. Kultur disimpan dalam ruanginkubasi pada suhu 25-27oC dengan penyinaran lampufluorescen 1.000 lux selama 12 jam/hari. Setelah kulturmenghasilkan 4-5 helai daun (4 minggu), helaian daundiambil dengan gunting sebagai sumber protoplas.

Larutan enzim yang digunakan

Komposisi larutan enzim yang digunakan adalah 0,5%selulase Onozuka RS, 0,5% macerozim R-10 (Yakult

54 Ali Husni et al.

Honsha Co), 0,05% MES, dan 9,1% manitol dalamlarutan CPW (Sihachakr 1998). Larutan enzim diper-tahankan pH-nya sekitar 5,5-5,6 dan disterilisasidengan filter berukuran 0,22 Mm. Selanjutnya, larutandipipet 6 ml dan dimasukkan ke dalam cawan-cawanpetri berukuran 60 mm x 15 mm.

Isolasi protoplas

Daun yang digunakan sebagai sumber protoplasberasal dari biakan in vitro dengan bobot 1 g setiapvarietas. Tahapan isolasi protoplas meliputi peng-goresan bagian bawah daun, inkubasi dalam larutanenzim, pencucian, pemurnian, dan penghitungan jum-lah protoplas.

Penggoresan daun dan inkubasi

Bagian bawah daun terung digores secara meratadengan pisau dengan jarak 2-3 mm di dalam lamianair-flow. Daun yang telah digores dimasukkan ke dalamcawan petri (Iwaki, Japan) yang berisi 6 ml larutanenzim, masing-masing 8-10 lembar daun setiap cawan(Gambar 1). Setiap kultivar terdiri atas empat cawanpetri. Cawan kemudian dimasukkan ke dalam inkubatortanpa cahaya pada suhu 27oC selama 16 jam (overnight).Pada akhir inkubasi, cawan digoyang secara perlahandengan tangan selama 20-30 detik untuk melepaskanprotoplas dari jaringan daun. Selanjutnya protoplasdisaring dan dimurnikan dengan larutan sukrosa 21%.

Pemurnian protoplas

Larutan enzim yang berisi protoplas disaring denganmetallic sieve ukuran 100 mm kemudian dimasukkan kedalam tabung sentrifus ukuran 15 ml. Selanjutnyalarutan disentrifugasi (Hettich, EBA 8S) dengan ke-cepatan 1.800 rpm selama 5 menit untuk mengendapkanprotoplas. Larutan enzim (supernatan) dibuang de-ngan cara memipetnya secara hati-hati agar endapantidak terbawa. Selanjutnya endapan diresuspensi

dengan 10 ml larutan sukrosa 21% untuk pemurnianprotoplas dan disentrifugasi dengan kecepatan 1.800rpm selama 10 menit. Protoplas yang mengapungdiambil dengan pipet steril dan dipindahkan ke dalamtabung sentrifus baru untuk proses pencucian.

Pencucian protoplas

Protoplas murni hasil pengapungan dimasukkan kedalam tabung sentrifus yang berisi 2-5 ml larutanpencuci (0,5 M manitol + 0,5 mM CaCl2) untuk meng-hilangkan pengaruh enzim dan sukrosa. Sentrifugasidilakukan pada kecepatan 1.800 rpm selama 5 menit.Supernatan dibuang dengan cara memipetnya secarahati-hati sehingga tinggal endapan protoplas. Pen-cucian dilakukan dua kali dengan larutan dan carayang sama.

Penghitungan protoplas

Protoplas yang telah dicuci diambil 0,1 ml dan diencer-kan 10 kali (0,9 ml) dengan larutan pencuci, kemudiandimasukkan ke dalam gelas haemositometer untukdilakukan penghitungan protoplas. Haemositimeteryang digunakan (Optik Labour, France) mempunyaibidang pandang volume 1,25 mm3 (10 mm x 0,5 mm x0,25 mm). Protoplas dihitung pada setiap bidangpandang volume tersebut sebanyak 3 kali. Peng-hitungan dilakukan dengan inverted microscope(Olymphus).

Kultur protoplas

Kultur protoplas dilakukan dengan metode Sihachakr(1998). Jumlah protoplas yang dihasilkan (105) masing-masing kultivar diencerkan satu kali sehingga jumlah-nya menjadi 104. Suspensi protoplas selanjutnya di-taburkan pada cawan petri yang berisi 6 ml media cair,masing-masing 0,1 ml setiap cawan. Setiap kultivarterdiri atas 3 cawan petri. Medium awal yang digu-

Gambar 1. Inkubasi daun terung dalam larutan enzim selama 16 jam dalam keadaan gelap.Fig. 1. Incubation of leaf eggplant in enzyme solution at 16-hour dark condition.

Keragaman genetik tanaman terung hasil regenerasi protoplas 55

nakan untuk menumbuhkan protoplas adalah KM8Pdan VKM dengan penambahan ZPT 0,2 mg/l 2,4-D +0,5 mg/l zeatin + 1,0 mg/l NAA dengan pH 5,7-5,8.Selanjutnya media disterilisasi dengan filter ukuran0,22 µm. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah ataupersentase protoplas yang membentuk dinding, selyang membelah, dan koloni sel pada setiap perlakuanmedia.

Pengenceran kultur

Pengenceran media dilakukan untuk mendorong per-tumbuhan dan perkembangan sel membentuk kolonidan mikrokalus. Pengenceran dilakukan dengan caramembagi suspensi protoplas/sel dari tiap cawanmenjadi tiga sehingga untuk setiap kultivar diperoleh9 cawan petri. Suspensi ditempatkan pada cawan petribaru yang berisi 10 ml media KM8P dan VKM denganpenambahan 0,1 mg/l 2,4-D + 2,0 mg/l BA. Selanjutnyakultur disimpan dalam ruang inkubasi yang dibericahaya 1.000 lux selama 12 jam sampai terbentukmikrokalus dan kalus. Pengamatan dilakukan terhadapjumlah atau persentase protoplas yang membentukmikrokalus.

Regenerasi tunas

Mikrokali/kalus yang berukuran 3-5 mm (4 minggudalam media pengenceran) diambil dengan pinset dan

dipindahkan ke dalam cawan petri 90 mm x 15 mm yangberisi medium regenerasi (padat). Media regenerasiyang digunakan adalah MS + vitamin MW + 20 g/lsukrosa + 2 g/l gelrite + 0,1 mg/l IAA dengan penam-bahan 2, 4, dan 6 mg/l zeatin sebagai perlakuan. Kulturdisimpan dalam ruang inkubasi yang diberi cahaya1.000 lux dengan suhu ruang 25-27oC sampai terbentuktunas (selama 12 jam).

Untuk mempercepat pertumbuhan dan perkem-bangan regeneran (klon), setiap tunas diisolasi dandipindahkan ke dalam botol kultur yang berisi mediaMS + vitamin MW + 30 g/l sukrosa + 2 g/l gelrite.Pengamatan dilakukan terhadap jumlah tunas, efisien-si keberhasilan regenerasi, dan penampakan visualtunas.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi protoplas

Penggunaan metode Sihachakr (1998) dalam larutan0,5% selulase Onozuka RS dan 0,5% macerozim R-10dengan inkubasi 16 jam dapat menghasilkan protoplasyang viabel dengan jumlah yang tinggi (105). Hal initerlihat dari bentuk protoplas yang bulat sempurna(Gambar 2a).

Jumlah protoplas paling banyak dihasilkan olehkultivar Kopek (14,27 x 105 protoplas/g daun), diikuti

Gambar 2. Tahapan pertumbuhan protoplas terung sampai terbentuk mikrokalus; a = protoplas hasil isolasi, b = protoplas yangtelah membelah, c = mikrokalus, dan d = mikrokalus pada media regenerasi.Fig. 2. Growth and development of eggplant protoplast to microcalli; a = freshly isolated protoplast, b = cell division, c =microcalli, and d = microcalli in regeneration medium.

a b

c d

56 Ali Husni et al.

oleh kultivar Dourga (14,07 x 105) dan Medan (12,91 x105) (Tabel 1). Jumlah protoplas yang dihasilkankultivar Kopek dan Dourga tidak terlalu berbeda,sedangkan rata-rata jumlah protoplas kultivar Medanlebih sedikit dibanding kultivar Kopek dan Dourga.Perbedaan tersebut diduga karena daya tumbuhkultivar Medan dalam media perbanyakan lebih lambatdibanding kultivar Kopek dan Dourga, serta luasdaunnya juga lebih kecil. Hal ini sesuai dengan hasilpenelitian Purwito (1999) pada tanaman kentang;tanaman yang mempunyai daya tumbuh cepat danberdaun lebar menghasilkan protoplas yang lebihbanyak dibanding tanaman yang daya tumbuhnyalemah. Sihachakr (1998) dapat mengisolasi protoplasS. melongena cv Dourga dan S. aethiopicum graculeatum dengan jumlah yang tinggi menggunakanmetode dan komposisi enzim yang sama.

Kultur protoplas

Protoplas hanya dapat membentuk dinding sel padamedia yang diinkubasi dalam keadaan tanpa cahaya,baik pada media KM8P maupun VKM dengan pe-nambahan 0,2 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l zeatin + 1 mg/lNAA. Kultur protoplas yang disimpan dengan pem-berian cahaya 1.000 lux selama 12 jam/hari tidak dapatmembentuk dinding sel (Tabel 2).

Perkembangan protoplas semua kultivar pada mediadasar KM8P lebih baik dibanding pada media VKM.Persentase protoplas yang dapat membentuk dindingsel dan melakukan pembelahan tertinggi pada kultivarKopek, diikuti oleh kultivar Medan dan Dourga.

Dinding sel mulai terbentuk setelah 24 jam padamedia penaburan yang ditandai dengan bentuk proto-plas yang tidak bulat lagi. Menurut Sihachakr (1998),pemberian cahaya pada sel protoplas yang telahmembentuk dinding sel dapat mempercepat penebalandinding sel dan pembelahan sel. Pada minggu pertamasetelah penaburan, sudah terlihat beberapa koloni seldengan bentuk sel yang lebih panjang. Pada protoplastanaman Crocus caucellatus, pembelahan sel dimulaipada hari ke-5 sampai ke-6 setelah kultur (Karamiandan Ebrahimzadeh 2001).

Pada tahap ini dapat dilihat perbedaan antara selyang viabel dan yang tidak viabel. Sel yang viabelditandai dengan semakin banyaknya jumlah sel mudaberwarna bening pada setiap koloni dengan inti yangbesar (Gambar 2b). Sel atau koloni yang tidak viabelberwarna cokelat kehitaman. Pada minggu kedua se-telah penaburan, warna media berubah dari jernihmenjadi keruh karena jumlah sel yang bertambahbanyak akibat pembelahan sel yang terus-menerus.Sihachakr (1998) menyatakan bahwa jumlah sel yangterlalu banyak dalam medium akan menurunkankemampuan sel untuk melakukan pembelahan. Untukmempertahankan kemampuan sel terus tumbuh danberkembang, media perlu diencerkan. Hal yang samajuga dilakukan Purwito (1999) pada studi regenerasiprotoplas tanaman kentang. Kemampuan protoplasmembentuk koloni sel setelah 2 minggu penaburandapat dilihat pada Tabel 3. Dari tabel tersebut dapatdilihat bahwa media KM8P menghasilkan koloni sellebih banyak dibanding media VKM. Hal ini sesuaidengan hasil penelitan Purwito (1999) pada tanamankentang. Penggunaan komposisi zat pengatur tumbuh

Tabel 1. Rata-rata jumlah protoplas terung yangdihasilkan dari setiap gram daun setelah inkubasi 16jam dalam larutan 0,5% selulase dan 0,5% macerozim.Table 1. Average number of eggplant protoplast at 16-hourincubation in 0.5% cellulase and 0.5% macerozyme solution.

KultivarJumlah protoplas

CultivarProtoplast number

(105)

Kopek 14,27 + 6,34Medan 12,91 + 2,04Dourga 14.07 + 3,89

Tabel 2. Persentase protoplas terung membentuk dinding dan membelah pada satu minggu setelah penaburan padakondisi lingkungan kultur dan jenis media yang berbeda.Table 2. Percentage of eggplant protoplast forming cell wall and dividing at a week after incubation at different culture condition andmedia.

KondisiKopek Medan Dourga

lingkungan Jenis

kultur media Protoplas dengan Sel Protoplas dengan Sel Protoplas dengan SelCulture Basal dinding sel membelah dinding sel membelah dinding sel membelahcondition medium Cell wall Cell division Cell wall Cell division Cell wall Cell division

Gelap/Dark KM8P 50,67 29 39 14 ,67 25 ,67 6,33VKM 41 18 20 ,67 9 17 ,67 0

Terang/Bright KM8P 0 0 0 0 0 0VKM 0 0 0 0 0 0

Keragaman genetik tanaman terung hasil regenerasi protoplas 57

yang sama memberikan hasil yang terbaik untukpembentukan mikrokalus dengan efisiensi 59,3% padakultivar BF15 dan 47,2% pada kultivar SPV10.

Pengenceran kultur

Pengenceran kultur dimaksudkan untuk memper-tahankan viabilitas sel serta memacu pertumbuhandan perkembangan koloni sel membentuk mikrokalusdan kalus. Suspensi koloni sel diencerkan denganmedia dasar yang sama setelah kultur berumur 2minggu. Namun ZPT yang digunakan diganti dengan0,1 mg/l 2,4-D + 2 mg/l BAP (Sihachakr 1998).

Mikrokalus dapat terlihat dengan kasat mata padasatu minggu setelah pengenceran dengan warna putihkekuningan (Gambar 2c). Kecepatan pertumbuhan danperkembangan sel membentuk mikrokalus dipengaruhioleh jenis media dasar yang digunakan (Gambar 2d).Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Purwito (1999)pada tanaman kentang di mana pembelahan selsemakin cepat setelah media diencerkan. Semakin lamawaktu inkubasi, semakin banyak mikrokalus yangterbentuk. Mikrokalus yang terbentuk setelah peng-enceran pada umur 1 dan 3 minggu disajikan padaTabel 4. Jumlah mikrokalus yang dihasilkan padamedia KM8P dan VKM sebanyak 64 mikrokalus, yangterdiri atas 52 mikrokalus kultivar Kopek dan 12mikrokalus kultivar Medan.

Regenerasi tunas

Penambahan zeatin 1 dan 2 mg/l pada media regenerasimasing-masing dapat menghasilkan 5 dan 13 tunaspada kultivar Kopek, sedangkan pada kultivar Medanmasing-masing hanya 1 dan 2 tunas (Tabel 5). Kalusyang dapat beregenerasi membentuk tunas berasaldari kalus embriogenik, yang ditandai dengan adanyanodul yang mengkilap berwarna hijau kekuningan(Gambar 3a) dan kemudian membentuk bakal tunas(Gambar 3b) dan tunas (Gambar 3c). Kalus yang tidak

dapat beregenerasi umumnya berbentuk kompak dankering dengan warna keputihan atau kuning ke-cokelatan. Berdasarkan penampakan visual tunas, 2tunas memiliki warna daun putih kehijauan yangberasal dari perlakuan zeatin 2 mg/l, sedangkan tunaslainnya berwarna hijau (Gambar 4).

Tunas yang dihasilkan diisolasi dan dipindahkan kedalam media regenerasi baru tanpa penambahan ZPT.Pada media tersebut terjadi pemanjangan tunas danpembentukan akar yang sangat menentukan keber-hasilan regeneran dalam aklimatisasi. Jumlah re-generan yang dihasilkan mencapai 21 tunas, terdiriatas 18 regeneran kultivar Kopek dan 3 regenerankultivar Medan. Regeneran yang dihasilkan selanjut-nya diperbanyak secara in vitro untuk keperluanaklimatisasi serta pengamatan dan pengujian selanjut-nya.

KESIMPULAN

Kombinasi enzim 0,5% selulase Onozuka RS + 0,5%macerozim R-10 + 0,05% MES + 9,1% manitol dalamlarutan CPW pada pH 5,5-5,6 dapat mengisolasiprotoplas terung varietas Kopek, Medan, dan Dourgadengan jumlah mencapai 105. Inkubasi kultur tanpacahaya pada media KM8P dan VKM + 0,2 mg/l 2,4-D+ 0,5 mg/l zeatin + 1 mg/l IAA dapat mendorongpembentukan dinding sel dan pembelahan protoplas

Tabel 4. Jumlah mikrokalus terung pada 1 dan 3 minggusetelah pengenceran pada 10 ml media KM8P dan VKM.Table 4. Microcallus initiation of eggplant at 1 and 2 weeksafter dilution at 10 ml basal medium KM8P and VKM.

Jumlah mikrokalusMicrocallus number

Kultivar/media 1 minggu setelah 3 minggu setelahCultivar/medium pengenceran pengenceran

1 week after 3 weeks afterdilution dilution

KopekKM8P 1,56 (14 mk/9 cp) 5,71 (40 mk/7 cp)VKM 0,56 (5 mk/9 cp) 2,4 (12 mk/5 cp)

MedanKM8P 0,78 (7 mk/9 cp) 1,8 (9 mk/5 cp)VKM 0,44 (4 mk/9 cp) 0,6 (3 mk/5 cp)

DourgaKM8P 0,22 (2 mk/9 cp) Terkontaminasi

ContaminatedVKM 0 Terkontaminasi

Contaminated

Keterangan/Notes:mk = mikrokalus/microcallus; cw = cawan petri/petridish.

Tabel 3. Jumlah koloni sel terung hasil kultur protoplaspada 2 minggu setelah penaburan dalam media KM8Pdan VKM.Table 3. Cell colony number of regenerated eggplant protoplasat 2 weeks after cultured in KM8P and VKM media.

Jumlah koloni selKultivar Cell colony numberCultivar

KM8P VKM

Kopek 17 14Medan 7,67 6Dourga 2 1,67

58 Ali Husni et al.

Gambar 3. Tahapan pertumbuhan dan perkembangan kalus terung membentuk tunas; a = kalus embriogenik, b = bakal tunas, c= tunas.Fig. 3. Growth and development of eggplant calli to shoots; a = embriogenic calli, b = embryo like-shoot, c = shoot.

Gambar 4. Penampakan tunas terung dengan daun berwarnaputih kehijauan.Fig. 4. Greenish white shoot of eggplant.

membentuk koloni sel. Pengenceran media penaburandengan media dasar yang sama dengan penambahan0,1 mg/l 2,4-D + 2 mg/l BAP dapat mendorong per-tumbuhan sel membentuk mikrokalus.

Penambahan 2 mg/l zeatin pada media regenerasi(VKM dan KM8P) menghasilkan 13 tunas pada varie-tas Kopek dan 2 tunas pada varietas Medan denganefisiensi keberhasilan masing-masing 86,67% dan50%. Total regeneran yang dihasilkan mencapai 21tunas, terdiri atas 18 regeneran kultivar Kopek dan 3regeneran kultivar Medan.

DAFTAR PUSTAKA

Bajaj, Y.P.S. 1977. Protoplast isolation, culture and somatichybridization. p. 467-496. In J. Reinert and Y.P.S. Bajaj(Eds.). Applied and Fundamental Aspect of Plant Cell,Tissue and Organ Culture. Springer-Verlag, Berlin.

Tabel 5. Kemampuan regenerasi tunas dari kalus terung varietas Kopek dan Medan pada konsentrasi zeatin yangberbeda.Table 5. Shoot initiation from callus of Kopek and Medan eggplant varieties at different zeatin concentration.

Kultivar/konsentrasi zeatin (mg/l) Jumlah tunasEfisiensi

Penampakan biakan (warna daun)EfficiencyCultivar/zeatin concentration Shoot number

(%)Culture visual (leaf color)

Kopek1 5 33,33 (5 tunas/15 kalus) Hijau/Green2 13 86,67 (13 tunas/15 kalus) Putih kehijauan (2 tunas)

Greenish white shoot (2 shoots)3 0 0 -

Medan1 1 25 (1 tunas/4 kalus) Hijau/Green2 2 50 (2 tunas/4 kalus) Hijau/Green3 0 0 -

a cb

Keragaman genetik tanaman terung hasil regenerasi protoplas 59

Binding, H., R. Nehls, O. Schieder, K. Sopory, and G. Wenzel.1978. Regeneration of mesophyl protoplasts isolated fromdihaploid clones of Solanum tuberosum. Physiol. Plant.43: 52-54.

Datta K., I. Potrykus, and S.K. Datta. 1992. Efficient fertileplant regeneration protoplast of indica rice breeding lineIR72 (Oryza sativa L.). Plant Cell Report 11: 229-233.

Evans, D.A. and W.R. Sharp. 1986. Somaclonal and gametoclonal.p. 97-132. In D.A. Dian, W.R. Sharp, V.P. Ammirato, andY. Yamada (Eds.). Hand Book of Plant Cell Culture I. McMillan Pub. Co., New York.

Gleba, Y.Y. and L.R. Shlumukov. 1990. Somatic hybridizationand cybridization. p. 316-345. In S.S. Bhojwani (Ed.). PlantTissue Culture: Application and limitation, Developmentin Crop Science 19. Elsevier, Amsterdam.

Gosch, G., Y.P.S. Bajaj, and J. Reinert. 1975. Isolation, cultureand fusion studies from different species. Protoplasma 85:327-336.

Grosser, J.W., F.G. Gmitter, J.R.N. Tusa, and T.L. Chandler.1990. Somatic hybrid plants from sexually incompatiblewoody species: Citrus reticulata and Citropsii gilletiana.Plant Cell Reports. 8: 658-659.

Hardiansyah dan D. Briawan. 1990. Penilaian dan perencana-an konsumsi pangan. Skripsi Jurusan Gizi Masyarakat danSekeluarga. Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Karamian, R. and H. Ebrahimzadeh. 2001. Plantlet regenera-tion from protoplast-derived embriogenic calli of Crocuscanellatus. Plant Cell, Tissue Organ Culture 65: 115-121.

Margara, J. 1982. Gonslagen van Vegetative Vermerdering.Nederlands Vereninging van Plantecel en Weefselkweek(NVPM), Wageningen. p. 23-26.

Milam, S., L.A. Payne, and G.R. Mackay. 1995. The integra-tion of protoplast fusion-derived material into a potatobreeding programme: A review of progress and problems.Euphytica 85: 451-455.

Morel, G. and R.H. Wetmore. 1951. Fern callus tissue culture.Am. J. Bot. 38: 141-143.

Murashige, T. and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapidgrowth an bioassay with tobacco tissue cultur as. Physiol.Plant 15: 473-497.

Nagata, T. and I. Takebe. 1971. Plating of isolated tobaccomesophyl protoplasts on agar medium. Planta 99: 12-20.

Priyanto, B. 1996. Studi Fusi Protoplas S. khasianum Clarkedengan S. mammosum L. Disertasi Pascasarjana, InstitutPertanian Bogor.

Purwito, A. 1999. Fusi Protoplas Intra dan Interspesies padaTanaman Kentang. Disertasi Pascasarjana, Institut Per-tanian Bogor.

Rangahau, M.K. 1999. Biotechnology in Potatoes. Crop andFood Research, The New Zealand Institute, New Zealand.

Sihachakr, D., M.C. Daunay, I. Serraf, M.H. Chaput, I. Mussio,R. Haicour, L. Rossignol, and G. Ducreux. 1994. Somatichybridization of eggplant (Solanum melongena L.) with itsclose and wild relatives. p. 255-278. In Y.P.S. Bajaj (Ed.).Somatic Hybridization in Crop Improvement I. Bio-technology in Agriculture and Forestry Vol. 27. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg.

Sihachakr, D., I. Serraf, M.H. Chaput, I. Mussio, L. Rossignol,and G. Ducreux. 1995. Regeneration of plants from proto-plasts of S. khasianum C.B. Clark and S. laciniatum Ait.Biotechnol. Agric. Forestry 34: 109-120.

Sihachakr, D. 1998. Culture Media and Protocols for Isolationand Fusion of Protoplast of Eggplant. MorphogeneseVegetale Experimentale, Bat.360. Universite Paris Sud,France (unpublish).

Stattmann, M., E. Gericck, and G. Wenzel. 1994. Interspecificsomatic hybrids between S. khasianum and S. aculeatissimumproduced by electrofussion. Plant Cell Reports. 13: 193-196.

Takebe, I., G. Labib, and G. Malchers. 1971. Regeneration ofwhole plants from isolated mesophyll protoplas of tobacco.Naturwissenschaften 58: 318-320.

Tan, M.M.C. 1987. Somatic Hybridization and Cybridisationin Some Solanaceae. Academisch Proefschrift Vrije Uni-versiteit te Amsterdam, The Netherlands.

Utomo, H.S. 1997. Penapisan protoplas padi (Oryza sativa L.)secara in vitro untuk ketahanan terhadap aluminium. AktaAgrosia 1(2): 41-47.

Waara, S. and K. Glimileus. 1995. The potential of somatichybridization in crop breeding. Euphytica 85: 217-233.

Wattimena, G.A. 1999. Application of biotechnology onhorticultural crops production. In Proceeding of Seminaron Biotechnology: Application of Biotechnology onHorticultural Production, Bogor, 14 April 1999. BogorAgricultural University-DFID British Council, Bogor.