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KLENA SARGES MARRUAZ DA SILVA
AVALIAÇÃO DO TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE CÉLULAS TRONCO
MESENQUIMAIS SOBRE PARKINSONISMO INDUZIDO POR MPTP EM
PRIMATAS Sapajus apella
Tese apresentada ao Curso de Pós-
Graduação da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo para
obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde.
SÃO PAULO
2016
KLENA SARGES MARRUAZ DA SILVA
AVALIAÇÃO DO TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE CÉLULAS TRONCO
MESENQUIMAIS SOBRE PARKINSONISMO INDUZIDO POR MPTP EM
PRIMATAS Sapajus apella
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde
Área de concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Prof. Dr. Francisco Romero Cabral
Co-Orientadora: Profa. Dra. Laila Brito Torres Silva Araújo
SÃO PAULO
2016
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Silva, Klena Sarges Marruaz da
Avaliação do transplante autólogo de células tronco mesenquimais sobre parkinsonismo induzido por MPTP em primatas Sapajus apella./ Klena Sarges Marruaz da Silva . São Paulo, 2016.
Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Francisco Romero Cabral
Co-Orientadora: Laila Brito Torres Silva Araújo
1. Transplante de células-tronco mesenquimais 3. Transplante autólogo 3. Transtornos parkinsonianos/induzidos quimicamente 4. Metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina 5. Primatas 6. Animais
BC-FCMSCSP/08-16
Dedicatória
Aos meus pais, Naná e Kleber.
Aos meus filhos, Bárbara e Henrique.
Ao meu marido Alcyr.
Aos irmãos primatas com os quais convivi em todos os anos de vida
profissional e que doaram suas vidas para que possamos saber mais sobre
nós mesmos.
“A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo menos outros dez”.
(George Bernard Shaw)
Agradecimentos
A Deus. Com Ele tudo posso.
À Nossa Senhora de Nazaré e a São Miguel Arcanjo que me guardam em
todos os lugares e intercedem para o cumprimento de minha missão.
Ao meu orientador Prof. Dr. Francisco Romero Cabral, por ter me apoiado e
aceitado me orientar após todas as tentativas frustradas de realizar o
doutorado em outras instituições paulistas, por acreditar nesse projeto e em
minha capacidade de realizá-lo, pela amizade, pela sua simplicidade em ver a
vida e pela inspiração como exemplo de profissional vitorioso.
À Dra. Laila Brito Torres, pela contribuição na contagem estereológica do
material desse projeto, pela contribuição na discussão dos resultados
advindos da contagem, pelo incentivo desde sempre, pela cama quentinha e
alimento nos dias em que tive que ficar em São Paulo realizando meus
estudos, pelo afeto, por sua generosidade que comove, pela amizade que me
é tão cara.
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
(FCMSCSP), com especial menção às funcionárias da Secretaria de Pós-
graduação Mirtes Dias de Sousa e Sônia Regina Alves por todo apoio
prestado durante a realização do curso.
Ao Instituto Evandro Chagas, pelo apoio à realização do projeto, em
especial aos colegas: Dra. Elisabeth Santos, então gestora do IEC no início
deste projeto e que o apoiou fortemente; Dra. Maria de Fátima Assis, pela
contribuição no cultivo celular e entusiasmo; Dra Edna Franco, pela
contribuição no estudo imunoistoquímico, pela parceria e sugestões
compartilhadas durante a execução do projeto; ao Dr. Edivaldo Herculano
Correa de Oliveira, pela contribuição na análise citogenética dos cultivos,
pela cessão do Laboratório de Cultivo Celular, e ao técnico em investigação
biomédica Michel Platini Caldas, por ter cuidado com todo zelo das nossas
células.
Ao Centro Nacional de Primatas, por ceder a estrutura e os animais
necessários à realização do projeto, especialmente nas pessoas dos médicos
veterinários Aline Imbeloni, Gilmara Abreu e Wellington Silva, dos
servidores técnicos José Miguel dos Santos e Osvaldo Leal, da funcionária
em serviços gerais, Rosa Maria de Lima, e todos os técnicos em manejo de
animais.
Ao Hospital Israelita Albert Einstein e seu Centro de Experimentação e
Treinamento em Cirurgia (CETEC) pelo apoio no desenvolvimento deste
projeto.
Ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Células Tronco e
Terapia Celular (INCTC)/CNPq, pelo apoio financeiro.
Ao Prof. Dr. Olavo de Faria Galvão (UFPA), pela contribuição de sua equipe
no desenho da avaliação comportamental dos animais do projeto.
Às pós-graduandas Amarilis Aragão e Ana Claudia Fonseca e bolsista de
PIBIC/INCTC/CNPq Lygia Elyse Chaves por auxiliarem no estudo
imunoistoquímico e pelas horas mais leves e divertidas deste trabalho.
Ao Dr. Bruno Araujo e Dr. Luiz Caires, pelas contribuições para melhoria do
texto desta tese e por inspirarem os jovens a desbravarem o campo fértil da
ciência.
Ao Sr. Raimundo Bahia e aos meus colegas do biotério do Instituto
Evandro Chagas pelo apoio e compreensão nos momentos em que
necessitei me dedicar ao doutorado.
Aos meus pais, Naná e Kleber, por me apoiarem incondicionalmente em
todos os meus projetos nessa vida. Aos meus filhos, Bárbara e Henrique,
que são meu grande incentivo para evoluir. À minha irmã Keyla, que é
verdadeiramente minha irmã em todos os sentidos do vínculo. Aos meus tios
Paulo e Dida, anjos de guarda materializados da nossa família. Ao meu avô
Raimundo Sarges (in memoriam), que torcia por mim e tanto se orgulhava de
meus feitos profissionais e à minha avó Flávia (in memoriam), que contribuiu
sobremaneira para minha formação humana. Ao meu marido Alcyr, que me
apoia de todas as formas que alguém que ama pode apoiar. Por eles,
acredito valer a pena estudar e contribuir para que a humanidade possa
melhorar sua condição como espécie.
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
53A posição 53 do gene α sinucleína contendo alanina
53T posição 53 do gene α sinucleína contendo treonina
5HT serotonina
6-OHDA 6-hidroxidopamina
ANOVA análise de variância
asf area sampling fraction
Balb/C linhagem isogênica de camundongo
β-C β-carbolina
C57BL/6 linhagem isogênica de camundongo, também chamada BlackC57
Ca+2 cálcio
CD+20 marcador da molécula CD 20 presente na superfície de linfócitos B
CE coeficiente de erro
CENP Centro Nacional de Primatas
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais
CO2 dióxido de carbono
CONCEA Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal
CTM células tronco mesenquimais
CV coeficiente de variação
DA dopamina
DAT transportador de dopamina
DBCA Diretrizes Brasileiras de Prática para o Cuidado e Utilização de Animais para Fins Científicos e Didáticos
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DNA ácido desoxiribonucleico
DOPAC ácido 3,4-diidroxifenilacético
DP Doença de Parkinson
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético
EPM desvio-padrão
GABA ácido gama-aminobutírico
GFP green fluorescent protein/proteína verde fluorescente
GLU glutamato
HVA ácido homovanílico
IC intervalo de confiança
ICMBio Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade
IEC Instituto Evandro Chagas
IM intramuscular
IPSC induced pluripotent stem cells/células-tronco pluripotentes induzidas
IV intravenoso
L-DOPA levodopa
MAO monoamina oxidase
MAO-B monoamina oxidase B
MCH hemoglobina corpuscular média
MCHC concentração de hemoglobina corpuscular média
MCV volume corpuscular médio
MMSE Modified Mini-Mental State Examination
MoCA Montreal Cognitive Assessment
MPDP+ 1-metil-4-fenil-2,3-dihidropiridinium
MPP+ 1-metil-4-fenilpiridinium
MPPP 1-metil-4-propionoxipiridina
MPTP 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
N número total
PBS tampão fosfato-salino
PNH primatas não humanos
SC subcutâneo
SN substância nigra
SNC sistema nervoso central
SNCA gene ᾀ sinucleína
ssf section sampling fraction
TH tirosina hidroxilase
THIQ tetrahidroisoquinolina
tsf thickness sampling fraction
UPDRS Unified Parkinson´s Disease Rating Scale
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 1 1.1. ETIOLOGIA DA DOENÇA DE PARKINSON ....................................................................... 2 1.2. AVALIAÇÃO DOS SINTOMAS DA DOENÇA DE PARKINSON .............................................. 4 1.3. MODELOS ANIMAIS PARA ESTUDOS DA DOENÇA DE PARKINSON ................................... 5
1.3.1. Modelos genéticos ............................................................................................ 6 1.3.2. Modelos neurotóxicos ....................................................................................... 7 1.3.3. O modelo neurotóxico utilizando MPTP ............................................................ 8 1.3.4. Primatas não humanos como modelos de DP .................................................. 9 1.3.5. O macaco prego como modelo biomédico ..................................................... 11
1.4. TERAPIAS PARA DP .................................................................................................. 12 2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 15
2.1. OBJETIVO GERAL ..................................................................................................... 15 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 15
3. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 16 3.1. ANIMAIS E AMBIENTE EXPERIMENTAL ......................................................................... 17 3.2. ASPECTOS ÉTICOS .................................................................................................... 19 3.3. OBTENÇÃO E CULTIVO DAS CÉLULAS-TRONCO ADULTAS OBTIDAS DO TECIDO ADIPOSO 19 3.4. INDUÇÃO DO PARKINSONISMO PELO USO DE MPTP .................................................... 21 3.5. AVALIAÇÃO DOS SINTOMAS ....................................................................................... 21 3.6. CUIDADOS COM OS ANIMAIS TRATADOS ..................................................................... 23 3.7. TRANSPLANTE DOS CULTIVOS ................................................................................... 24 3.8. AVALIAÇÃO DOS ANIMAIS PÓS-TRANSPLANTE ............................................................. 24 3.9. DESTINO DOS ANIMAIS E EUTANÁSIA ......................................................................... 25 3.10. COLHEITA E PREPARAÇÃO DE MATERIAL PARA ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO ................ 26 3.11. CONTAGEM DE NEURÔNIOS TIROSINA HIDROXILASE POSITIVOS / CONTAGEM ESTEREOLÓGICA .................................................................................................................. 28 3.12. ANÁLISE DOS RESULTADOS ...................................................................................... 33
4. RESULTADOS ............................................................................................................... 35 4.1. AVALIAÇÃO DOS CULTIVOS DE CÉLULAS TRONCO ....................................................... 35 4.2. AVALIAÇÃO DOS SINTOMAS ANTES E APÓS O TRANSPLANTE DE CT ............................. 37 4.3. AVALIAÇÃO HEMATOLÓGICA ...................................................................................... 40 4.4. AVALIAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA ................................................................................ 44
5. DISCUSSÃO .................................................................................................................. 46 6. CONCLUSÕES .............................................................................................................. 58
7. ANEXOS ........................................................................................................................ 60 ANEXO I ............................................................................................................................. 60 ANEXO II ............................................................................................................................ 61 ANEXO III ........................................................................................................................... 62 ANEXO V ............................................................................................................................ 77 ANEXO VI ........................................................................................................................... 78 ANEXO VII .......................................................................................................................... 79
8. REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 80
RESUMO .............................................................................................................................. 89
ABSTRACT ............................................................................................................................ 90
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. 91 LISTA DE TABELAS ............................................................................................................. 93
9. APÊNDICES ................................................................................................................... 94 APÊNDICE I ....................................................................................................................... 94 APÊNDICE II ...................................................................................................................... 95
1
1. INTRODUÇÃO
A Doença de Parkinson (DP) foi descrita inicialmente na literatura por James
Parkinson em 1817, como uma patologia crônica neurodegenerativa que acomete
principalmente as projeções dopaminérgicas do núcleo da substância nigra para o
estriado, sendo a perda de neurônios dopaminérgicos na região pars compacta da
substância nigra e o acúmulo de inclusões intraneuronais chamadas de Corpos de
Lewy as principais características neuropatológicas (Dauer, Przedborski, 2003;
Calabresi et al, 2013) A Figura 1 ilustra a cascata de eventos envolvida na
degeneração neuronal que ocorre na DP. A doença tem registrado prevalência de
1% na população acima de 70 anos e atinge cerca de 10 milhões de pessoas no
mundo (Berg et al, 2013; Goodarzi et al, 2015). Os principais sintomas clínicos da
DP são: tremor muscular contínuo e involuntário, redução e lentidão dos movimentos
(acinesia e bradicinesia), dificuldade de locomoção, rigidez muscular e instabilidade
postural, ou seja, essencialmente sintomas motores. Porém, sintomas não motores
como a depressão e outros distúrbios psiquiátricos, como comportamentos
impulsivos-compulsivos e apatia, também são relatados em alguns pacientes com a
doença e resultantes do déficit dopaminérgico (Silberman et al, 2004; Calabresi et al, 2013; Nikitina, Fedorova, 2013).
2
Figura 1. Mecanismo da neurodegeneração ocorrida na Doença de Parkinson. Fonte: Adaptado de Dauer, Przedborski, 2003.
1.1. Etiologia da Doença de Parkinson
A etiologia da DP é desconhecida, o que dificulta a escolha e o
desenvolvimento de métodos e técnicas ideais para estudá-la, embora existam
evidências de que possíveis fatores ambientais, assim como a genética, ação de
toxinas ambientais e estresse oxidativo possam estar implicados na etiologia do
processo (Wolters, Calne, 1989; Nussbaum, Polymeropoulos, 1997; Kitada et al, 1998; Alexander, 2004).
Em relação às implicações genéticas, sabe-se, até o momento, que as causa
genéticas estão relacionadas às mutações no gene referente à α sinucleína e que há
16 loci relacionados à DP, denominados de Park 1 a Park 16 e associados a formas
inerentes da doença. Porém, somente 5 a 10% dos casos de DP que envolvam
essas mutações têm sido confirmados (Corti et al, 2011). As mutações propiciam a
3
formação de Corpos de Lewy e diminuição na dopamina, porém estudos sugerem
que as mutações isoladamente não explicariam o processo neurodegenerativo da
DP, pois invariavelmente as lesões se estendem além do mesencéfalo e afetam também vários tipos de grupos de células não dopaminérgicas (Alexander, 2004).
Dentre os fatores ambientais, o uso de pesticidas e a presença natural de
diversas substâncias químicas em alimentos podem estar relacionadas a etiologia
da doença. A Tetrahidroisoquinolina (THIQ), um composto orgânico presente em
fármacos como anti-hipertensivos e bloqueadores de receptores adrenérgicos, e
derivados de β-carbolina (β-C), também presentes em fármacos, são
estruturalmente relacionados ao 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) e
ocorrem naturalmente em muitos alimentos. Estas substâncias produziram danos
nigroestriatais em animais experimentais e foram detectadas no cérebro e líquido
cerebroespinhal em pacientes com DP. Pesticidas também têm sido sugeridos como
possíveis fatores causais ou contribuindo em alguns casos de DP esporádico (Collins, 2002).
Dentre os pesticidas implicados na etiologia da DP estão o paraquat e a
rotenona. O paraquat é um pesticida não seletivo muito utilizado no combate a ervas
daninhas e induz o estresse oxidativo nas células de pessoas que entram em
contato com o produto, desempenhando um papel neurotóxico e implicado em
doenças neurodegenerativas por intoxicação crônica pelo produto (Martins, 2013).
Já a rotenona é uma substância orgânica encontrada naturalmente em raízes e
caules de plantas, com ação inseticida, mas muito utilizada na pesca por
comunidades indígenas amazônicas e do sudeste da Ásia que sobrevivem da pesca
artesanal (Ling, 2003). Tanto o paraquat quanto a rotenona são potentes inibidores
do complexo mitocondrial I e ambos são potencialmente neurotóxicos. A toxicidade
neuronal do paraquat geralmente carece de especificidade, mas a rotenona
demonstrou produzir um modelo de DP em roedores, quando administrada
cronicamente em doses baixas. Administrações crônicas de rotenona produzem
degeneração seletiva de neurônios dopaminérgicos nigroestriatais e formação de
Corpos de Lewy, acompanhada de sinais de parkinsonismo (Collins, 2002).
Sinais de estresse oxidativo são abundantes na substância nigra de pacientes
com DP (Jenner, 2003). Os níveis de antioxidantes intrínsecos, como a glutationa,
4
encontram-se reduzidos, enquanto produtos oxidados de proteínas, lipídios e DNA
aumentam significativamente na DP. O aumento nos níveis de estresse oxidativo
pode levar a apoptose devido à liberação citoplasmática de citocromo C, que é pró-
apoptótico e proveniente de mitocôndrias disfuncionais (Sian et al, 1994; Gu et al, 1998).
Assim, neurodegeneração ocorrida na região da substância nigra é causada
pela morte dos neurônios dopaminérgicos que, consequentemente, prejudica a
síntese de dopamina e a transmissão neuronal. Uma hipótese para que isto ocorra é o “enrolamento” e a agregação de proteínas na região (Dauer, Przedborski, 2003).
Embora a DP seja conhecida principalmente como um distúrbio de
movimentos que se origina a partir dos gânglios da base, o processo
neurodegenerativo visa grupos de neurônios distribuídos por todo o sistema
nervoso, incluindo partes específicas do córtex, tálamo, tronco cerebral, medula
espinhal e gânglios simpáticos e parassimpáticos. Entre os neurotransmissores e
neuromoduladores representados nestas perdas de neurônio estão a acetilcolina,
serotonina (5HT), noradrenalina e glutamato. Os déficits motores de DP estão
relacionados a um grupo particular de neurônios dopaminérgicos da substância nigra
(Alexander, 2004).
1.2. Avaliação dos sintomas da Doença de Parkinson
Para avaliação clínica de pacientes parkinsonianos faz-se uso de escalas
preconizadas para avaliação de sintomas. A mais antiga e aplicada desde 1975 é a
Modified Mini-Mental State Examination (MMSE), porém a mais utilizada delas é a Unified Parkinson´s Disease Rating Scale (UPDRS).
A escala MMSE é uma ferramenta que classifica os níveis de déficit cognitivo
em idosos e clinicamente utilizada para avaliar demências. A escala utiliza uma
tabela que pontua em 30 pontos máximos: questões sobre orientação (10 pontos),
tarefas de registros e respostas (6 pontos), atenção (5 pontos), comandos de várias
etapas (3 pontos), tarefas de nomeação (2 pontos), repetição, compreensão da
leitura, escrita e tarefas de construção visual (todas com 1 ponto cada) (Herndon,
2006).
5
A escala UPDRS foi criada por Fahn em 1984 e até hoje é a mais utilizada em
todo o mundo para avaliação de pacientes parkinsonianos. A escala, como as
demais escalas anteriores, centra a avaliação em sintomas motores, mas traz
também a avaliação de elementos do status funcional presentes nos casos mais
avançados (Gancher, 2002). A UPDRS foi dividida em 4 componentes, após revisão
de especialistas, onde temos contempladas: Parte I relacionada à atividade mental,
comportamento e humor; Parte II relacionada a atividades rotineiras; Parte III
relacionada aos sintomas motores e Parte IV relacionada a complicações. Porém, é
uma escala que necessita ser adaptada conforme os hábitos culturais do paciente,
pois a Parte II é baseada em hábitos ocidentais não aplicáveis a várias culturas. A
avaliação de como se utiliza a faca para cortar alimentos, por exemplo, não é usual
para pacientes orientais que costumam utilizar outros utensílios ou as mãos para
alimentarem-se. Outros sintomas que podem estar presentes na DP e não estão
contemplados na avaliação realizada pela UPDRS são a ansiedade, anedonia,
bradifrenia, hipersexualidade, desordens do sono, fadiga, disautonomia,
desregulação e qualidade de vida, sendo necessária avaliação complementar pelo clínico sem utilização da escala (Goetz, 2003).
Mais recentemente, há a proposição de uso da escala MoCa (Montreal
Cognitive Assessment) que avalia habilidades cognitivas e é recomendada pelo The
Parkinson Studies Group Cognition; esta aplica um questionário rápido que avalia
vários parâmetros cognitivos pontuando até o máximo de 30 pontos, incluindo
atenção, concentração, funções executivas, memória, linguagem, habilidades viso espaciais, abstração, cálculo e orientação (Julayanont et al, 2012).
1.3. Modelos animais para estudos da Doença de Parkinson
Modelos animais têm sido fundamentais e amplamente utilizados nas últimas
quatro décadas para o avanço do conhecimento a respeito da fisiopatologia
neurodegenerativa da doença e tratamento da DP. Estes modelos foram,
inicialmente, classificados baseados na administração local ou sistêmica
(intracerebral) de neurotoxinas capazes de replicar a maioria dos sintomas e
características fenotípicas de DP em mamíferos (Pereira et al, 2007; Blandini,
Armentero, 2012). Atualmente, também é possível utilizar modelos geneticamente
6
modificados para a DP, disponíveis para uso em grandes biotérios localizados na
América do Norte e Europa (Jackson Laboratories, 2012).
O modelo ideal de DP deve apresentar as características clínicas e
patológicas da doença e envolver danos neuronais tanto ao sistema dopaminérgico
quanto o não dopaminérgico, sistemas nervoso central e periférico, além de
manifestar sintomas motores e não motores da DP. Além disso, a correlação idade
do individuo / início dos sintomas e a natureza progressiva da DP devem ser
observadas. Infelizmente, nenhum dos atuais modelos exibe todas as características
da DP. Porém, apesar das limitações, os modelos animais continuam contribuindo
significativamente para a compreensão acerca dos processos da doença e alvos terapêuticos (Tieu, 2011).
Desta forma, podemos dividir os modelos animais atuais para a DP em duas
categorias: modelos genéticos e modelos neurotóxicos.
1.3.1. Modelos genéticos
Três tipos de modelos genéticos murinos para DP foram desenvolvidos no
novo século. Os primeiros modelos de ratos desenvolvidos para estudo da DP foram
baseados na deleção de importantes genes para o desenvolvimento ou manutenção
de neurônios dopaminérgicos no seu fenótipo. Estes ratos exibem perda de
neurônios dopaminérgicos em várias fases das suas vidas, reproduzindo assim uma
importante característica da DP. Entretanto, eles falham ao reproduzir a patologia
extra substância nigra e outros marcadores patológicos da doença, como os Corpos
de Lewy. Há ainda que se ressaltar que a relevância dessas mutações genéticas
para DP não estão totalmente estabelecidas (Hwang et al, 2005; Sgado et al, 2006;
Sonnier et al, 2007). Os segundos modelos murinos genéticos criados foram
baseados na expressão ou deleção de genes conhecidos por causar DP de histórico
familiar (Fleming et al, 2005). Embora essas mutações sejam muito raras, elas
apontam para mecanismos certamente relacionados à patogenia da doença. A
expressão de genes específicos para DP de histórico familiar também ainda não
está claramente estabelecida. Sabe-se que mutações pontuais podem causar DP e
que o aumento dos níveis da proteína alfa-sinucleína devido a duplicação ou
triplicação do gene conduz a formas familiares da doença (Chesselet, 2008). E,
finalmente, uma terceira classe de modelos genéticos murinos foi desenvolvida já no
7
século XXI baseada na mutação ou expressão de genes conhecidos como
envolvidos em DP de causa familiar e viralmente mediados. Estes modelos
produzem uma forma mais aguda da doença que modelos transgênicos ou
knockout, sendo estes modelos valiosos pois exibem perda neuronal, uma
característica que não é encontrada neste tipo de modelos geneticamente
modificados (Meredith et al, 2008). As linhagens transgênicas específicas para DP
são disponíveis comercialmente para uso em pesquisas e muitas vezes seu
desenvolvimento é financiado por organizações não governamentais e fundações
que promovem pesquisas para avanços no tratamento da doença (Jackson Laboratories, 2012).
1.3.2. Modelos neurotóxicos
Os modelos que utilizam a indução do parkinsonismo por neurotoxinas
utilizam herbicidas, como paraquat e rotenona e substâncias, como o MPTP e 6-
OHDA. Ao contrário do MPTP e rotenona, a 6-OHDA não atravessa a barreira
hematoencefálica e deve ser injetada unilateralmente e diretamente na região da
substância nigra por meio de procedimento guiado por estereotáxico. A
administração unilateral permite avaliar comparativamente as lesões no hemisfério
danificado e no hemisfério intacto. A 6-OHDA é absorvida pelos neurônios
dopaminérgicos devido sua alta afinidade a transportadores de dopamina. Uma vez
no interior dos neurônios, a substância é facilmente oxidada em espécies reativas de
oxigênio, levando à inibição da cadeia de transporte de elétrons e estresse oxidativo,
mas nenhum Corpo de Lewy ou déficit olfatório são observados nesse modelo,
sendo útil para avaliar o envolvimento da glia no processo neurodegenerativo (Ribeiro et al, 2013).
O modelo de rotenona tem sido utilizado no campo experimental da DP por
trazer esclarecimentos sobre os mecanismos relacionados a modificações
mitocondriais envolvidas no processo neurodegenerativo da doença. Os estudos
demonstram que há uma enorme variabilidade na resposta individual à toxina, com
uma grande oscilação no número de animais que desenvolvem satisfatoriamente a
lesão nigroestriatal, tornando a rotenona um modelo não considerado padrão para
estudos da DP. A mortalidade de animais é outra característica observada no
modelo, pois a rotenona é altamente tóxica para outros órgãos como o coração,
8
fígado, rins e trato gastrointestinal. Outro ponto crítico é que o processo
neurodegenerativo causado pela rotenona envolve outras populações neuronais
dentro dos gânglios basais, causando um parkinsonismo atípico. Ainda assim, o
modelo de rotenona é utilizado para estudos de DP, embora seja necessário
aumentar o índice reprodutibilidade dos experimentos relatados nos laboratórios que o utilizam (Blandini, Armentero, 2012).
Outra toxina ambiental utilizada para modelo de DP em camundongos e
conhecida por interromper a respiração mitocondrial e formação de espécies
reativas de oxigênio é o paraquat. O Paraquat é um herbicida que atravessa a
barreira hematoencefálica e que causa danos nas mitocôndrias pela redução do
Complexo I formando um radical de paraquat capaz de danificá-las indiretamente,
diferentemente dos modelos de rotenona e MPTP. As pesquisas realizadas com
esse modelo demonstram pequena perda de neurônios dopaminérgicos e regulação
e agregação de alfa-sinucleína. Entretanto, observa-se uma progressão na evolução da morte dos neurônios dopaminérgicos e déficits motores (Meredith et al, 2008).
1.3.3. O modelo neurotóxico utilizando MPTP
O modelo original do 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), cuja
estrutura química se assemelha à do herbicida paraquat, é formado pela
desidratação de um composto intermediário necessário à síntese de um composto
narcótico ativo, o 1-metil-4-propionoxipiridina (MPPP), um análogo da meperidina. A
toxicidade do MPTP não havia sido reconhecida até a ocorrência da síndrome
parkinsoniana entre toxicodependentes em 1982, quando australianos viciados em
drogas injetaram intravenosamente meperidina contaminada com MPTP e foram
recebidos no hospital com sintomas similares a DP. Estes foram então tratados com
L-Dopa e demonstraram-se responsivos ao tratamento (Pereira et al, 2007). Outras
ocorrências da síndrome foram identificadas em em indústrias farmacêuticas, onde
manipuladores de medicamentos com grandes quantidades de MPTP
desenvolveram parkinsonismo como consequência da exposição a esta toxina
(Kopin, 1987). Estudos post-mortem confirmaram nesses pacientes a perda neuronal
em estruturas nigroestriatais revelando o modelo pela utilização do MPTP (Davis et
al, 1979; Langston et al, 1983).
9
A intoxicação por MPTP em modelos animais para DP resulta em danos
específicos ao sistema dopaminérgico. Ao administrar MPTP há a transformação do
MPTP no metabólito tóxico 1-metil-4-fenilpiridinium (MPP+), um inibidor do complexo
I mitocondrial que é seletivamente transportado pelo transportador de dopamina
(DAT) e induz danos específicos aos neurônios dopaminérgicos da substância nigra
pars compacta e uma perda de terminais nervosos dopaminérgicos no striatum
(Figura 2), mais pronunciadamente no putamen que no núcleo caudatum (Van der Berge et al, 2013).
Figura 2. Etapas bioquímicas que conduzem à degeneração dos neurônios dopaminérgicos causada pela neurotoxina MPTP. Fonte: Adaptada de Jakowec, Petzinger, 2004.
1.3.4. Primatas não humanos como modelos de DP
Especialmente os primatas não humanos (PNH) têm se revelado melhores
modelos para estudos biomédicos que ratos e camundongos por apresentarem
anatomia e fisiologia próximas aos humanos, particularmente o sistema imunológico.
10
Por estas características, é o modelo animal “ouro” de escolha para testes pré-
clínicos (Haunstein et al, 2008). PNH estão mais proximamente relacionados a
humanos no tronco evolucionário das espécies animais havendo muitas
similaridades genéticas, fisiológicas, anatômicas, de desenvolvimento embrionário,
complexidade social e habilidades cognitivas. Por possuírem um sistema nervoso
central e organização do circuito neural muito parecida são muito utilizados em
estudos de neurociência básica e clínica e estudos relacionados à memória, cognição, comportamento e estudos de visão (Weatheall, 2006; Perreta, 2009).
Neuromelanina é a substância responsável pela pigmentação escura da
substância nigra em cérebros de primatas e de várias outras espécies. É formada a
partir de oxidação da dopamina (ou outras catecolaminas) para quinonas, as quais
polimerizam e são depositados em lipofucsina. A associação entre neuromelanina
contida em primatas e cães e a relativa vulnerabilidade dos neurônios nigroestriatais
ao MPTP, nestas espécies, contrasta com a quase total ausência de neuromelanina em roedores, que são muito menos vulneráveis à toxina (Kopin, 1987).
As espécies de PNH já utilizadas como modelos para DP são as espécies de
primatas do Velho Mundo Chlorocebus aethiops (macaco verde africano), Macaca
mulatta (macaco rhesus) e Macaca fascicularis (Cynomolgus), e também as
espécies de primatas neotropicais Saimiri sciureus (mico de cheiro) e Callithrix
jacchus (sagui do tufo branco) (Porras et al, 2012).
Estudos realizados com primatas da espécie Cercopithecus aethiops
(Chlorocebus aethiops) demonstraram que a administração do MPTP produz
sintomas parkinsonianos, como a bradicinesia, tremores e instabilidade postural, que
muito se aproximam dos sintomas clássicos apresentados por humanos
diagnosticados com a DP (Melega et al, 1996; Taylor et al, 1997; Redmond et al, 2007).
Porém, o modelo de intoxicação por MPTP em PNH não inclui duas
características: 1) A perda neuronal em outros núcleos monaminérgicos, como o
locus coeruleus, 2) Os Corpos de Lewy clássicos não têm sido demonstrados
evidentemente em modelos de PNH MPTP-induzidos, embora ocorram inclusões
intraneuronais que se assemelham a Corpos de Lewy (Dauer, Przedborski, 2003; Porras et al, 2012; Van den Berge et al, 2013).
11
1.3.5. O macaco prego como modelo biomédico
O macaco prego ou capuchin é um primata neotropical da família Cebidae,
conhecido anteriormente como Cebus apella na nomenclatura científica. Porém,
desde 2012, a espécie passou a ser classificada como pertencente ao gênero
Sapajus, após estudos taxonômicos que demonstraram existir macacos prego
participantes dos 2 gêneros: Cebus e Sapajus. Assim, a espécie, anteriormente
classificada como Cebus apella, atualmente é denominada Sapajus apella (Alfaro et
al, 2012).
Os macacos prego são animais de hábitos onívoros e gregários,
desenvolvem-se lentamente, apresentando maturidade sexual entre 5 a 5.8 anos
para fêmeas e 6 a 10 anos para machos, com expectativa de vida de até 55 anos
em cativeiro. Os primatas dessa espécie convergiram evolutivamente com humanos
e outros primatas mais desenvolvidos, possuem extrema inteligência e um dos
maiores cérebros em relação ao tamanho do corpo dentre os PNH. Demonstram
extensa cooperação entre seus indivíduos e apresentam imensa habilidade no aprendizado de tarefas e manipulação de ferramentas (Perry, 2011).
No cérebro dos macacos prego são evidentes as formações de substância
branca (corpo caloso, cápsula interna, cápsula externa, cápsula extrema, comissura
rostral, comissura epitalâmica e fórnix) mais evoluídas que as de primatas menores,
como os calitriquídeos, e muito semelhantes às formações correspondentes
encontradas na espécie humana. Os núcleos da base apresentam características
morfológicas semelhantes às do homem. As estruturas hipotalâmicas (núcleos
mamilar, tracto e quiasma ópticos e túber cinério), as epitalâmicas (o corpo pineal e
trígonos habenulares) e as metatalâmicas (corpos geniculados medial e lateral) são equivalentes àquelas da espécie humana (Watanabe, Madeira, 1982).
O macaco prego, embora seja uma espécie de ampla distribuição geográfica
nas Américas Central e do Sul, não é amplamente utilizado em pesquisas
biomédicas no Brasil, sendo as espécies neotropicais de PNH Aotus infulatus e o
Saimiri sciureus mais utilizadas que Sapajus apella (Torres et al, 2010). Esta baixa
demanda pela espécie pode ser explicada por sua alta resistência a doenças e seu
comportamento agressivo, que requer relativamente um manejo mais elaborado do
que outras espécies de PNH. Atualmente, a espécie é mais utilizada em estudos em
12
neurociência relacionados à cognição, mas também são utilizados em estudos em
odontologia, parasitologia, fisiologia, reprodução e pesquisa comportamental (Fragaszy et al, 2004).
1.4. Terapias para DP
1.4.1. Terapia medicamentosa
Não há atualmente nenhum tratamento que leve à cura da DP, os tratamentos
desenvolvidos têm sido focados na melhora da qualidade de vida e diminuição dos
sintomas. A terapia usual para DP é fundamentada no uso de drogas a base de
levodopa. Entretanto, o uso prolongado da levodopa pode desencadear
complicações motoras como discinesias. Contudo, os dados experimentais e clínicos
disponíveis não são conclusivos em relação à levodopa acelerar o processo neurodegenerativo (Fahn, 1996; Agid et al, 1999).
Os tratamentos atuais incluem o uso de preparações orais L-DOPA e
dopamina agonistas dos receptores, apomorfina nos casos mais graves, infusão
intestinal contínua de L-dopa e estimulação cerebral profunda no núcleo subtalâmico e globus pallidus usando eletrodos implantados (Goodarzi et al, 2015).
1.4.2. A terapia celular como alternativa
Uma alternativa recente e promissora no tratamento de doentes
parkinsonianos é o uso da terapia celular. A terapia celular consiste na utilização de
métodos e abordagens tecnológicas fundamentadas no conhecimento de várias
disciplinas e busca restaurar o funcionamento de tecidos ou órgãos por meio da
proteção celular ou reposição de células danificadas por células sadias (Zago, Covas, 2006; Wu et al, 2010).
O desenvolvimento de terapias baseadas em transplantes celulares na DP,
entretanto, implica necessariamente a superação de algumas barreiras quanto à
obtenção de neurônios dopaminérgicos transplantáveis. Com o avanço nas
pesquisas com células-tronco, fontes alternativas de células humanas saudáveis passam a ser vislumbradas (Pereira et al, 2006; Imaizumi, Okano, 2014).
A terapia celular realizada com células-tronco de diversas linhagens já é uma
realidade para algumas doenças e com resultados positivos. Para tratamento da DP,
13
a terapia celular ainda caminha na pesquisa básica e clínica, pois se trata de doença
neurodegenerativa de etiopatogenia não totalmente conhecida. As terapias celulares
já testadas em humanos incluem neurotransplantes com tecido adrenomedular de
adultos e tecido mesencefálico fetal humano (que é rico em neurônios
dopaminérgicos). As lições aprendidas com estas últimas terapias não devem ser
ignoradas. O transplante com tecido adrenomedular revelou-se um fiasco, com
pouca eficácia e inaceitável morbidade e mortalidade, e os ensaios abertos com
tecido mesencefálico fetal humano demonstraram discinesia nos pacientes (Langston, 2005).
Novas pesquisas realizadas após a utilização dos neurotransplantes
demonstraram que neurônios adequados para transplante podem ser originados de
cultura de células-tronco e que a neurogênese ocorre no cérebro adulto em
condições fisiológicas e patológicas. Portanto, o transplante de células-tronco e a
mobilização de células-tronco endógenas têm sido propostos como terapias potenciais em várias doenças do SNC (Marie, Oba-Shinjo, 2006).
O potencial terapêutico das células-tronco de origem embrionária foi bastante
pesquisado na primeira década do século XXI. Por serem células de origem
embrionária, apresentam a capacidade de se multiplicar em cultura sem perder a
pluripotência, assim como possibilitam induzir sua diferenciação em tipos celulares
específicos. Porém, as células tronco embrionárias revelaram efeito colateral
tumorigênico após a terapia e envolvem sérias questões éticas do uso de embriões
humanos para obtê-las (Pereira, 2006). Assim, a utilização de células-tronco
mesenquimais (CTM) para tratar DP tem sido uma promissora alternativa na terapia
celular. Quer sejam provenientes de medula óssea ou de tecido adiposo, as CTM
têm muitas vantagens quando são autólogas ao paciente tratado, pois evitam o risco
de rejeição, não apresentam problemas éticos no seu uso e podem ser facilmente
expandidas (Pawitan, 2011). Além disso, as terapias que já utilizaram estas células
para tratar DP observaram propriedades imunossupressivas e neuroprotetoras, bem
como habilidade em diferenciar-se em astrócitos e neurônios dopaminérgicos
(Bahat-Stroomza et al, 2009; Chao et al, 2009; Shetty et al, 2009).
Estudos biomédicos voltados à terapêutica possuem uma resposta mais
próxima dos resultados que seriam encontrados em testes com humanos ao
14
utilizarem primatas não humanos como modelos experimentais em testes pré-
clínicos.
O estudo realizado e aqui descrito propôs a utilização de uma espécie de
PNH neotropical, o macaco-prego (Sapajus apella), como modelo para estudos da
DP e pretendeu contribuir com a pesquisa biomédica voltada ao uso da terapia celular para a Doença de Parkinson.
15
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Caracterizar o modelo experimental de espécie de primata não humano neotropical, Sapajus apella, com parkinsonismo induzido por MPTP.
2.2. Objetivos Específicos
Fase 1
► Estabelecer um novo modelo experimental para estudos relacionados à DP em Sapajus apella;
► Estabelecer o quadro sintomático e as alterações comportamentais da DP em Sapajus apella;
► Caracterizar os efeitos fisiológicos do MPTP consequentes do protocolo utilizado por meio de avaliação clínica e comportamental;
► Estabelecer a dose e protocolo de uso de MPTP para a indução de parkinsonismo
induzido por MPTP em Sapajus apella.
Fase 2
► Realizar terapia celular autóloga com células tronco mesenquimais (CTM) em
Sapajus apella com parkinsonismo induzido por MPTP;
► Observar efeitos da terapia celular para tratamento da DP em Sapajus apella através da evolução ou involução sintomática;
► Avaliar os efeitos terapêuticos ou tóxicos decorrentes do transplante de CTM no cérebro dos animais tratados por meio de imunoistoquímica.
16
3. MATERIAL E MÉTODOS
Os procedimentos experimentais foram divididos em duas fases: Fase 1 e
Fase 2, sendo que a Fase 1 compreende a fase de parkinsonismo induzido por
MPTP, contidos nos tópicos 3.1 a 3.6, e a Fase 2 compreende a fase de terapia
celular, referente aos tópicos 3.7 a 3.12. A Figura 3 descreve o fluxograma do estudo.
Figura 3. Fluxograma do estudo “Avaliação do transplante autólogo de células tronco mesenquimais sobre parkinsonismo induzido por MPTP em primatas Sapajus apella”
17
3.1. Animais e ambiente experimental
Foram utilizados 15 exemplares de Sapajus apella, machos, adultos, com
idade acima de 9 anos, mantidos com dieta a base de frutas, legumes, verduras,
ração específica para primatas e água ad libitum. Todos os animais eram
pertencentes ao Centro Nacional de Primatas (CENP) do Instituto Evandro Chagas (IEC).
Os animais foram selecionados e alojados, em sistema “indoor”, em gaiolas
de ambientes duplos medindo 4,0m de comprimento x 4,0m de largura x 2,40m de
altura (cada), com 5 animais por gaiola (Figura 4), para que não fosse alterada a
interação social e não haver alterações fisiológicas decorrentes de depressão por
privação social (Reinhardt, 2004). É importante frisar que cada gaiola continha
animais de todos os grupos do experimento, de forma a permitir a avaliação em “teste cego” dos sintomas manifestados nos animais.
18
Figura 4. Gaiola no Centro Nacional de Primatas (CENP) com exemplares de Sapajus apella utilizados no estudo.
Na primeira fase do experimento (Fase 1) os animais foram divididos em 2 grupos:
Grupo I (MPTP) – Constituído de 10 Sapajus apella, onde foi induzido o parkinsonismo por MPTP.
Grupo II (Controle) - Constituído de 5 Sapajus apella, onde foi aplicada solução fisiológica como placebo.
Na segunda fase (Fase 2) os animais do Grupo I, inoculados com MPTP,
foram divididos em 2 grupos:
19
Grupo MPTP+Terapia Celular – 5 Sapajus apella do Grupo I tratados com
CTM, administradas por via sistêmica.
Grupo MPTP+placebo – 5 Sapajus apella do Grupo I tratados apenas com
a solução utilizada para ressuspensão das CTM, sem a presença destas, também administrada por via sistêmica.
Fase 1
Nesta fase foi realizada a colheita de tecido adiposo para cultivo das células tronco mesenquimais (CTM) e indução de parkinsonismo por MPTP.
3.2. Aspectos éticos
Este estudo foi aprovado pela Comissão de ética no Uso de Animais do
Instituto Evandro Chagas (CEUA/IEC) (Parecer nº 005/2012) (Apêndice I) e Instituto
Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio) (nº 31741-1) (Apêndice
II).
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as
regulamentações do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
(CONCEA) e de acordo com as Diretrizes Brasileiras de Prática e Cuidado e Utilização de Animais para Fins Científicos e Didáticos (DBCA).
3.3. Obtenção e cultivo das células-tronco adultas obtidas do tecido
adiposo
As células-tronco mesenquimais (CTM) foram obtidas de acordo com o
protocolo adaptado de Yamamoto et al (2007) (Anexo I). Para extração destas
células, uma pequena porção de tecido adiposo subcutâneo abdominal foi retirada
do subcutâneo após incisão de 1 cm e retirada com pinça dente de rato, após
sedação dos animais com associação de tiletamina e zolazepam (Zoletil®) (10 mg/kg, via intramuscular) (Figura 5).
20
Figura 5. Fragmento de tecido adiposo coletado de exemplar de Sapajus apella.
O material coletado foi lavado com PBS estéril suplementado com 50 m g/ml de
gentamicina (Sigma®) e incubado com colagenase (Gibco®) por 30-60 minutos em
banho-maria a 37ºC. Passado o período de incubação, a colagenase foi neutralizada
com a adição de meio de cultivo (DMEM) (Gibco®) suplementado com 10% de soro
bovino fetal (Gibco®) e 50 m g/ml de gentamicina. O material foi centrifugado por 10
minutos a 800 x g, o sobrenadante descartado e o precipitado ressuspendido. A
suspensão de células foi cultivada em monocamada a 37 ºC em ambiente com 5%
de CO2 por sete (7) dias. A cultura foi replicada a cada sete (7) dias e o meio foi trocado a cada três (3) dias.
Para o estabelecimento do fenótipo das células transplantadas utilizamos a
técnica de imunocitoquímica para os anticorpos anti-CD45, anti-CD34 e anti-CD79a
(marcadores negativos de superfície, Abcam®), anti-CD90, anti-CD73 e anti-CD-105
(marcadores positivos de superfície, Abcam®), conforme preconizado por Dominici
et al (2006). As CTM foram submetidas à diferenciação in vitro para linhagem
adipogênica, condrogênica e osteogênica utilizando kits de diferenciação celular
21
específicos (InVitrogen®), segundo protocolo sugerido por Zuk et al (2002) (Anexo
II).
Uma amostra das células foi coletada para realização da análise citogenética por
coloração convencional com Giemsa (Sigma®) a fim de verificar o numero diplóide.
Realizou-se também bandeamento G para averiguar possíveis alterações no
cariótipo antes que as células fossem transplantadas. Parte destas células foi
congelada para ser utilizada posteriormente em outros estudos envolvendo esta
espécie.
3.4. Indução do parkinsonismo pelo uso de MPTP
Foi utilizado o protocolo de inoculação sistêmico preconizado por Bankiewicz
et al (2003) (protocolo alternativo I) (Anexo III), onde foram aplicadas nos animais do
Grupo I um total de 10 doses de 0.4 mg/kg de MPTP (Sigma®), sendo 2 doses
semanais, espaçadas em 3 dias uma da outra, via intramuscular, e nos animais do
Grupo II foi utilizado mesmo protocolo com dose equivalente contendo solução
fisiológica.
3.5. Avaliação dos sintomas
Todos os animais da experimentação foram observados diariamente para
avaliação da manifestação dos sintomas seguindo a Escala Unificada da Doença de
Parkinson (Unified Parkinson´s Disease Rating Scale) (UPDRS) (Fanh et al, 1987)
(Anexo IV), a qual foi adaptada para uso em PNH, onde foram avaliadas as partes II
e III da escala: expressão facial, coordenação motora, postura, bradicinesia,
tremores, rigidez de membros, movimentos das mãos e dedos, agilidade, períodos
de “freezing” (congelamento de movimentos), mastigação e salivação, vocalização.
A Tabela 1 demonstra as adpatações realizadas de forma comparativa com a escala UPDRS original.
22
Tabela 1. Sintomas avaliados nos PNH do estudo que necessitaram de adaptação
na utilização da escala UPDRS
Sintomas Escala UPRDS Adaptação realizada na escala UPDRS
expressão facial
de normal à perda da total de expressão facial
Idem, mas levando em consideração a expressão singular de cada sujeito
coordenação motora
vestir, higiene, cortar alimentos, gira no leito e vestir roupa de cama
Forma como desempenhava as tarefas no grupo ou individualmente (pular na plataforma, catar, subir na grade, etc)
postura em posição ereta à postura curvada
Animal em postura bípede à quadrúpede
rigidez de membros
de ausente a grave com movimentos da articulação só ocorrendo com grande dificuldade
Inclui a avaliação da cauda como 5º membro
movimentos das mãos e
dedos
abrir e fechar as mãos em movimentos rápidos e sucessivos e com a maior amplitude possível, uma mão de cada vez
Capacidade de apreender os alimentos com as mãos
fala compreensão da fala Vocalização menos ou mais intensa
Também foi realizada avaliação comportamental, voltada à interação social e
motivação, vocalização e estereotipia. Para as avaliações de sintomas clínicos e
comportamentais dos animais foi realizada observação diária, de pelo menos 1 hora,
durante o momento do oferecimento da alimentação. A avaliação dos sintomas foi realizada “às cegas”, sem reconhecimento de animais tratados e não tratados.
Após a aplicação do MPTP, foram realizadas 2 colheitas de sangue para
realização de hemogramas, antes e após a inoculação, onde foram colhidas
amostras sanguíneas de 2.0 mL, através de venopunção femural e acondicionadas
em tubos de ensaio de vidro siliconizado com anticoagulante (EDTA). Os vidros
contendo as amostras foram rotulados, contendo a identificação do animal e
encaminhados ao Laboratório de Patologia Clínica do CENP para processamento.
23
Os animais utilizados estavam em jejum líquido e sólido prévio de, pelo menos, 06
horas.
Todos os animais foram sedados para as colheitas de sangue com
associação de tiletamina e zolazepam na dose de 10mg/kg, via intra-muscular, após contenção manual com puçá ou em gaiola de aperto.
3.6. Cuidados com os animais tratados
Foram realizadas, antes das inoculações e após as inoculações, as aferições
de temperatura, frequência cardíaca, frequência respiratória e pressão arterial dos
animais para observação de sinais que pudessem indicar risco de vida aos animais
utilizados (Figura 6). Para tal, foram utilizados termômetros de coluna de vidro,
estetoscópio e esfigmomanômetro apropriados para uso em neonatos humanos.
Figura 6. Avaliação clínica em exemplar de Sapajus apella utilizado no estudo.
Fase 2
Na segunda fase (Fase 2) foi estudado o efeito da terapia autóloga com
células tronco mesenquimais (CTM) em animais do grupo MPTP+Terapia Celular
24
comparados os resultados de avaliação clínica e comportamental com os animais do
Grupo MPTP+Placebo, não tratados com CTM.
3.7. Transplante dos cultivos
Os animais do grupo MPTP+Terapia Celular receberam transplante autólogo
das CTM cultivadas em laboratório, via intra-carotídea, em dose única, após ter sido finalizado o protocolo de indução por MPTP (Figura 7).
Foi preconizado o transplante de células em quinta passagem e com
população entre 1x106 células/kg a 5x106 células/kg, em período correspondente a 24 a 48 horas após a última dose de MPTP.
Figura 7. Transplante de CTM autólogas, via intra-carotídea, em exemplar de Sapajus apella.
3.8. Avaliação dos animais pós-transplante
Após o transplante do cultivo de CTM, foram realizadas as mesmas
avaliações realizadas na Fase 1, pelo período de 1 mês.
25
3.9. Destino dos animais e Eutanásia
Após o período de avaliação pós-transplante na Fase 2, todos os animais dos
grupos MPTP+Terapia Celular e MPTP+Placebo e 2 animais do Grupo II (Controle)
foram eutanasiados para análises histopatológicas e imunoistoquímicas. Os outros 3 animais do Grupo Controle permaneceram no plantel do CENP.
Todos os animais foram anestesiados profundamente com associação de
cloridrato de ketamina (10mg/kg) e cloridrato de xilazina (1mg/kg), via intra-muscular,
e mantidos com isofluorano 5% para realização de perfusão transcardíaca com
solução de PBS (Sigma®), pH 7.4, seguida de paraformaldeído (Sigma®) a 4% em
pH 7.4 (Figura 8) (Anexo V). Após a perfusão, que tem como objetivo fixar o tecido
cerebral, o cérebro foi removido por meio de abertura do crânio com auxílio de
Dremmel® e os encéfalos retirados com auxílio de pinças e tesouras cirúrgicas
(Figura 9) para análises histopatológicas e imunoistoquímicas
Figura 8. Aspecto de perfusão transcardíaca realizada em exemplar de Sapajus apella.
26
Figura 9. Cérebro de Sapajus apella (exemplar AM-ARC) após remoção do crânio (escala= 7cm).
3.10. Colheita e preparação de material para estudo imunoistoquímico
Após a perfusão e retirada dos cérebros, estes foram preservados com
soluções crescentes de sacarose e mantidos em refrigeração (Anexo VI). Terminado
este período de preparação do tecido cerebral, os cérebros foram cortados em
criostato (Leica®) seguindo um padrão já estabelecido para o método estereológico,
que se baseia em uma amostra randômica e sistemática (Figura 10 e 11).
Resumidamente, os dois hemisférios cerebrais de cada animal foram inclusos em
Tissue-Tek®, congelados a -20ºC e, posteriormente, cortados em secções coronais
de 30 µm, onde foram escolhidos 1 corte a cada 5 cortes para fixação em lâmina de
microscopia silanizada (Brain Research Laboratories®) medindo 50 x 75mm, para
27
posterior realização das técnicas de Nissl e imunoistoquímica. Todas as lâminas
foram numeradas em ordem crescente a partir do lobo frontal, identificando também o hemisfério correspondente.
Figura 10. Imagem esquemática do plano de corte coronal dos cérebros de Sapajus apella.
.
Figura 11. Corte dos hemisférios cerebrais inclusos em Tissue-Tek® no criostato.
28
3.10.1. Estudo histopatológico
Uma parte das lâminas montadas foi corada com hematoxilina esoina e outra
parte foi corada com cresil violeta (Sigma®) (técnica de Nissl), que consiste na
desidratação dos cortes em banhos sucessivos de álcool em concentração
decrescente, seguida da imersão em solução de cresil de violeta (0.5%) dissolvida
em solução de acetato (Sigma®) tamponado em pH 3.8. Imediatamente após, os
cortes foram desidratados em diferentes concentrações de álcool (Sigma®),
clarificados com xilol (Sigma®) e montados com lamínula com o auxílio de Entellan para estudo histopatológico.
3.10.2. Estudo imunoistoquímico
Para o estudo qualitativo da distribuição da expressão da enzima tirosina
hidroxilase, utilizamos o anticorpo primário anti-tirosina hidroxilase (Milipore®),
diluído na proporção de 1:500. O protocolo padrão para realização desta
imunoistoquímica está descrito no Anexo VII. Os cortes imuno marcados foram
montados em lâminas silanizadas, desidratadas e cobertas com lamínulas
(Entellam® MERK), para posterior quantificação estereológica dos neurônios imuno marcados.
3.11. Contagem de neurônios tirosina hidroxilase positivos / Contagem
estereológica
A estimativa neuronal dos neurônios tirosina hidroxilase positivos foi realizada
nas regiões do núcleo estriado e substância nigra pars compacta. As análises
estereológicas empregadas neste trabalho foram realizadas por meio do software
Stereoinvestigator® (MicroBrightField, Williston, VT, USA, versão 8.21) instalado a
um computador e integrado a um microscópio óptico Zeiss (Imager M1) com objetiva
de 5x e 63x, e platina motorizada para os eixos X, Y e Z.
Uma marcação referencial para cada lâmina foi cuidadosamente instituída
(Figura 12) e com a utilização do programa, as áreas investigadas da substância
nigra foram devidamente delimitadas em objetiva de 5X, posteriomente, grades
(grid) foram sobrepostas nas regiões de interesse e, em seguida, uma caixa de
29
contagem (optical dissector) foi gerada em cada um dos pontos da intersecção do
grid com o plano onde se situa a região delimitada. A delimitação das regiões de
interesse foi guiada pelo atlas estereotáxico do PNH Sapajus apella (Manocha,
1968).
Apenas os neurônios bem marcados serem estipulados como padrão pelo observador, estes foram contabilizados (Figura 13).
Figura 12. Área da lâmina utilizada como área referencial para a contagem.
Figura 13. Delimitação das áreas investigadas na fatia histológica do cérebro de Sapajus apella corado pela técnica de imunoistoquímica anti-tirosina hidroxilase. Representação esquemática da grade de contagem sobreposta pelo software Stereoinvestigator na região da Sustância Nigra. Barra = 1mm
30
Os parâmetros dimensionais da grade, caixa de contagem e espessura foram
definidos previamente pelo pesquisador.
Para a estimativa dos parâmetros levou-se em consideração os seguintes
fatores: 1) intervalo do número de secções investigadas (section sampling fraction –
ssf); 2) fração de amostragem da área de cada secção (área sampling fraction- asf);
e 3) média da altura da espessura da amostra (thickness sampling fraction – tsf)
(Howard, Reed, 2005).
A estimativa do número total de células (N) foi calculada a partir da equação:
_111 qtsfasfssf
N Σ×××=
Onde _qΣ é a somatória de todas as células contadas em todos os
dissectores da região investigada.
Em cada optical dissector foram marcados os objetos de interesse, neste
caso, neurônios. No entanto, esta contagem seguiu um procedimento padrão,
garantindo que o mesmo objeto de interesse fosse contado uma única vez.
Os neurônios foram contados, apenas quando os mesmos estavam dentro da
delimitação de contagem, e fora de uma zona de guarda. A zona de guarda foi
estipulada, somente após as extremidades da espessura do corte (fundo e topo)
terem sido cautelosamente marcadas pelos observadores, permitindo assim
conhecer o volume em toda a extensão da área de contagem. A zona de guarda foi
equivalente a 10% da espessura do corte, 5% do fundo e 5% do topo de cada
secção. A Figura 14 ilustra como as aferições foram realizadas utilizando a citada
técnica.
31
Figura 14: Esquema de amostragem das aferições do optical dissector na substância
nigra. O intervalo do número de secções investigadas (ssf) foi representada em
amostras fixadas em lâminas e imunomarcadas com anticorpos tirosina hidroxilase
(A). O optical dissector foi posicionado sistematicamente aleatoriamente em cada
uma das seções amostradas (asf) em posições regulares x-y pré-determinadas (B,
C).
Outro requisito para aperfeiçoar o método de contagem foi o estabelecimento
de linhas delimitadoras do opticaldissector. Os objetos de contagem (neurônios) que
estavam dentro da área delimitada e que faziam intersecção com as linhas de
inclusão, de cor verde, foram selecionados. Porém, aqueles neurônios que tocam as
linhas de exclusão, de cor vermelha, não foram considerados para a contagem
(Figura 15).
32
Figura 15. Caixa de contagem no software Stereoinvestigator, posicionada na região da Substância Nigra, caracterizando as linhas de inclusão (verdes) e exclusão (vermelhas).
A partir da informação do número de pontos (neurônios), e das demais
variáveis, o programa estimou o número esperado de neurônios, em toda extensão
da região desejada.
Em nosso protocolo, um cuidado especial foi tomado para evitar contagens
repetidas do mesmo objeto nos diferentes planos de foco. Para isso repetia-se o
procedimento de focalização, visualizando os diferentes planos ao longo do eixo Z,
mais de uma vez em cada caixa de contagem, particularmente quando co-existiam
muitas células no opticaldisector. O corpo celular foi utilizado como unidade de
contagem e o foco escolhido para posicionar o marcador foi o corpo celular do
neurônio.
Os parâmetros estereológicos utilizados neste estudo foram estimados para
evitar a contagem excessiva e assegurar a precisão do método. A Tabela 2 retrata
os parâmetros utilizados durante o presente estudo. Os parâmetros utilizados
durante o primeiro ensaio estereológico obedeceram a um estudo piloto que
assegurou o coeficiente de erro da contagem < 10%.
33
Tabela 2. Parâmetros estereológicos empregados no presente estudo.
Σ= somatória, ssf= secções seriais da amostra, ΣQ= Pontos totais de contagem. (Espessura do tecido=30 µm)
3.12. Análise dos Resultados
Os resultados foram analisados de forma comparativa, onde:
• Animais submetidos ao tratamento com MPTP (Grupo I) X animais
controle (Grupo II)
• Animais submetidos ao tratamento com MPTP (Grupo I) e seus
resultados entre si, antes e após o tratamento com MPTP
• Animais não tratados com CTM (Grupo MPTP+Placebo) X animais
tratados com CTM (Grupo MPTP+Terapia Celular)
Os dados foram expressos como média ± EPM. Comparações entre grupos
experimentais foram feitas por análise de variância (ANOVA), complementada pelo
teste T de Student. O nível de significância P < 0,05 foi adotado para todos os
experimentos.
Os resultados da avaliação hematológica foram comparados utilizando as
médias dos parâmetros hematológicos para a espécie Sapajus apella (em cativeiro) preconizadas por Riviello & Wirz (2001) e Ospina e colaboradores (2009).
Região ssf
Área-Grid
µm2
Σ secções
Área
(counting frame) µm2
Σ dissectores
S N pars compacta 1:5 300 x
300 4 50 x 50 23
S N reticulada 1:5 300 x 300 4 50 x 50 28
34
Para a contagem estereológica, a estimativa do volume da substância nigra
foi calculada segundo o princípio de Cavalieri (West et al., 1990). O volume estimado
foi baseado na contagem de pontos, dado por:
Onde: Volref = volume de referência da SN; t= espessura da amostra após
processamento do tecido; a= área de frame; x= comprimento do grid na direção do
eixo x; y= comprimento do grid na direção do eixo y; ssf= secções seriais da
amostra; ∑P= somatória de todos pontos contados na secção.
O coeficiente de erro (CE) estimado para o número de células da Substância
Nigra foi calculado a partir da fórmula:
( ) ( )222 tCECENCE +=
Onde t é a espessura da amostra após processamento do tecido.
A variabilidade interindividual foi estimada pela soma das medidas de
variações intra e interseccional (CV).
( ) P ssf
y x a t Vol ref Σ × × × = 1 , step -
35
4. RESULTADOS
4.1. Avaliação dos cultivos de células tronco
Os cultivos submetidos à caracterização fenotípica por imunocitoquímica
foram reagentes para todos os anticorpos marcadores negativos e positivos de
superfície e sofreram diferenciação para linhagens adipogênica, condrogênica e
osteogênica, seguindo protocolo sugerido pelos kits de diferenciação utilizados
(Invitrogen®), e confirmados pelas colorações específicas para cada célula. Para
osteoblastos, utilizou-se o corante Alizarina Red S (Fluka Chemie®), para matriz
condrogênica foi utilizado o corante Ocean Blue (Sigma-Aldrich, EUA) e para
adipócitos, o corante Oil Red O (Sigma®). O cultivo controle foi corado com hematoxilina. (Figura 16).
Figura 16. Cultivos diferenciados em linhagens adipogênica (A), condrogênica (B), osteogênica (C) e cultivo controle (D) provenientes de tecido adiposo de um dos animais do Grupo MPTP+Terapia Celular (AM-AOI).
36
A análise citogenética dos cultivos demonstrou que o cariótipo se manteve
estável nas passagens analisadas. As poucas metáfases hipodiplóides encontradas
estavam dentro do intervalo de 10% de metáfases esperadas que rompem e perdem alguns de seus cromossomos (Figura 17).
Figura 17. Cariótipo em bandeamento G do exemplar de Sapajus apella (exemplar AM-AOI) demonstrando integridade cromossômica.
O teste de viabilidade celular e a contagem pré-transplante apresentaram os
resultados citados na Tabela 3, demonstrando que a média da população de células
presentes nos cultivos foi de 7.342 x106 células e que estas apresentaram alta viabilidade (média 75.522% ±3.245).
Tabela 3. Valores de quantidade de células e viabilidade dos cultivos de células tronco transplantados nos animais do Grupo MPTP+Terapia Celular
Parâmetros/
Identificação
dos
animais*
AXA ANT ANU AOI BAH
Média de células
contadas (nº de céls)
5.43x106 8.94x106 6.19x106 8.68x106 7.47x106
Viabilidade (%)
67.43 73.81 77.2 70.9 73.27
*as letras correspondem à identificação individual / tatuagem peitoral de cada animal
37
4.2. Avaliação dos sintomas antes e após o transplante de CT
A avaliação dos sintomas utilizando a escala UPDRS adaptada observou
apresentação de sintomas de parkinsonismo em 7 dos 10 animais tratados com
MPTP. Nenhum dos animais do Grupo Controle apresentou qualquer sinal
característico da DP. Os sintomas apresentados nos animais tratados com MPTP
foram: alteração da expressão facial, tremores de membros e cabeça, dificuldade
em apreender alimentos com as mãos, rigidez de cauda ou membros, freezing,
alteração na agilidade e coordenação motora (bradicinesia), alteração de postura,
dificuldade na mastigação e deglutição, salivação, modificação na vocalização e
outros como estereotipia e depressão; sendo tremores de membros e cabeça o mais frequente entre todos (Figura 18).
Os animais apresentaram 2 ou mais sintomas simultâneos.
Figura 18. Sintomas observados nos animais inoculados com MPTP (Grupo I; n= 10).
Dentre os animais que desenvolveram sintomas, 4 pertenciam ao Grupo
MPTP+Placebo e 3 pertenciam ao Grupo MPTP+Terapia Celular. Três em 4 animais
38
que apresentaram sintomas no Grupo MPTP+Placebo e 2 em 3 animais que
apresentaram sintomas do Grupo MPTP+Terapia Celular desenvolveram regressão
dos sintomas entre 15 a 30 dias após a administração da última dose de CTM ou Placebo.
Não houve diferença significativa entre o número de animais que apresentou
regressão de sintomas quando comparados animais do Grupo MPTP+Placebo x Grupo MPTP+Terapia Celular (Figura 19).
Nenhum animal dos grupos do experimento apresentou parâmetros de
temperatura, pressão arterial, frequências cardíaca e respiratória fora da
normalidade para a espécie durante as aferições no momento das administrações de MPTP.
39
Figura19. Sintomas observados nos animais dos Grupos MPTP+Placebo e MPTP+Terapia celular antes e após o tratamento com CTM ou DMEM.
40
4.3. Avaliação hematológica
Comparações intraindividuais demonstraram que não houve diferenças
significativas entre a média da maioria dos parâmetros hematológicos
avaliados antes do tratamento (valores de normalidade individuais) e após o
tratamento com MPTP em cada animal, com exceção dos valores para
linfócitos, onde foi observado um significante decréscimo após o tratamento
com MPTP (p<0,05) (Tabela 4) (Figura 20).
41
Tabela 4. Valores hematológicos observados nos animais antes e após tratamento com MPTP.
Valores de referência para a espécie
Antes MPTP
(média ± DP)
Após MPTP
(média ± DP)
Test-t
Hemácias (H) (mm³) 6.27 (±0.44)a 5.885 (± 0.74)
6.221 (±0.84)
N.S.
Hemoglobina Hg (g/dl) 15.01 (±0.78)a 14.577 (± 1.69)
15.323 (±2.12)
N.S.
Hematócrito Ht(%) 45.27 (±3.60)a 43.32 (±4.74)
44.85 (±5.99)
N.S.
MCV(u³) 76.04 (±12.85)b 73.87 (±3.18)
72.13 (±3.02)
N.S.
MCH(uug) 24.84 (±4.49)b 24.83 (±1.15)
24.61 (±1.42)
N.S.
MCHC(%) 32.63 (±1.43)b 33.62 (±0.49)
34.09 (±0.80)
N.S.
Plaquetas (Plaq) (m/mm³)
227 (±28.28)b 207.1 (±37.7)
236.2 (±60.92)
N.S.
Leucócitos (Leuc) (mm³)
7.72 (±1.84)a 7.055 (±1.79)
7.313 (±2.88)
N.S.
Basófilos (Bas) (%) 0a 0 0 N.S.
Eosinófilos (Eos) (%) 0a 0 0 N.S.
Mielócitos (Mie) (%) - 0 0 N.S.
Metamielócitos (Meta) (%)
- 0
0 N.S.
Bastonetes (Bast) (%) - 0 0 N.S.
Segmentados (Seg) (%)
63.16 (±5.98)a 51.97 (±2.54)
47.27 (±2.39)
N.S.
Linfócitos (Linf) (%) 36.78 (±5.96)a 35.24 (±1.35)
16.36 (±0.94)
P<0.005
Monócitos (Mon) (%) 0a 0
0.326 (±0.49)
N.S.
asegundo Riviello & Wirz, 2001; bsegundo Ospina et al, 2009.
42
Figura 20. Comparações entre valores de linfócitos antes e depois do tratamento com MPTP em Sapajus apella (Test T; p<0.05)
4.4. Avaliação Histopatológica
Os cortes de hemisférios cerebrais dos animais modelados com MPTP,
corados com HE e Nissl e analisados em microscopia ótica demonstraram que
a maior parte dos neurônios da substância nigra exibiram cromatólise central e
processo de degeneração axonal. Também foram observados pequenos
agregados de células gliais, os quais indicavam gliose reativa na região do
mesencéfalo. Não foram observados Corpos de Lewy (Figuras 21e 22).
43
Figura 21: Fotomicrografia da região mesencefálica, substância nigra de exemplar do Grupo I (MPTP), apresentando poucos neurônios (setas), alguns demonstram pigmento melânico, característico das respectivas células. Observa-se pequenos agregados de células da glia (*), configurando processo de gliose. HE. Obj. 10x
Figura 22: Fotomicrografia demonstrando neurônios degenerados com palidez (setas), peculiar à cromatólise central (perda dos corpúsculos de Nissl). Cresil violeta. Obj. 20x.
44
4.5. Avaliação Imunoistoquímica
Sob análise microscópica, a substância nigra foi claramente identificada
nos exemplares de Sapajus apella por meio da marcação tirosina hidroxilase
(Figura 23). Esta estimativa do número de neurônios é pioneira na literatura. Os
dados obtidos em nosso estudo estão representados na Tabela 5 com o
respectivo coeficiente de erro (CE) e coeficiente de variância (CV) dos animais
categorizados nos grupos respectivos. Não houve diferença significativa entre
os grupos estudados.
Figura 23. Neurônios tirosina hidroxilase positivos observados durante estereologia (obj 40x) (B) comparados a neurônios tirosina hidroxilase positivos de PNH controle (obj 200x) (A) utilizados em estudo de Ren et al (2013).
45
Tabela 5. Número total de neurônios tirosina hidroxilase + na Substância Nigra de primatas Sapajus apella do estudo (valores em milhões).
Animal Valores individuais de
células tirosina hidroxilase +
CE Média de células tirosina
hidroxilase + / Grupo
MPTP+Terapia AXA 0,550 0.12 0,577
AOI 0,602 0.10 (CE: 0,11; CV: 0.08)
ANT 0,579 0.10
MPTP+Placebo AQR 0,305 0.12 0,313
APP 0,402 0.12 (CE: 0.13; CV: 0.1)
AOC 0,232 0.14
BBN 0,477 0.14
CE= Coeficiente de erro; CV= Coeficiente de variação A média do volume total do cérebro, tronco cerebral e cerebelo nos
animais estudados foi 11.060 mm3. O volume da Substância Nigra corresponde
a 0,09% de todo hemisfério.
46
5. DISCUSSÃO
Três animais do estudo que receberam tratamento com MPTP, mas não
foram tratados com terapia celular (Grupo MPTP+Placebo), apresentaram
recuperação espontânea dos sintomas e um deles não manifestou os sintomas
clássicos da DP, o que demonstra uma sensibilidade diferenciada à intoxicação
por MPTP para cada animal.
Os efeitos neurotóxicos do MPTP têm sido demonstrados em humanos e
em PNH dos gêneros Macaca, Papio, Chlorocebus e das espécies neotropicais
Saimiri sciureus e Callithrix jacchus, bem como em gatos, coelhos e alguns
roedores. Quando aplicado em roedores, somente algumas linhagens
específicas são sensíveis ao MPTP, pois possuem diferentes graus de
depressão do sistema nigroestriatal, perda de neurônios dopaminérgicos e
déficits de comportamento. Com base nessas características, as linhagens de
camundongos utilizadas como modelos são classificadas como sensíveis
(>50% de perda de neurônios) ou resistentes (<25% de perda de neurônios).
Porém, ainda não está bem esclarecido porque algumas linhagens são mais
sensíveis que outras ao MPTP (Hamre et al, 1999, Meredith, Rademarcher,
2011). Idade e gênero também são fatores que podem influenciar na
sensibilidade dos animais ao MPTP (Antzoulatos et al, 2010).
A neurotoxicidade do MPTP é dependente da atividade de MAO-B
(monoamina oxidase B), enzima que catalisa a conversão da pró-toxina MPTP
para MPDP+ (1-methyl-4-phenyl-2,3-dihydropyridinium), sendo esta
subsequentemente oxidada ao metabólito tóxico MPP+ (1-methyl-4-
phenylpyridinium). O MPP+ promove a agregação de ᾀ sinucleina (Dias et al,
2013). Desta forma, propõe-se que as diferenças nos níveis de MAO-B no
cérebro poderiam variar para espécies e diferentes linhagens em relação à
sensibilidade ao MPTP (Meredith, Rademarcher, 2011). Ratos, por exemplo,
são resistentes ao efeito do MPTP e a linhagem de camundongo C57BL/6 é a
linhagem mais sensível ao MPTP já descrita e possui maior atividade de MAO
no cérebro que no fígado, portanto, as diferenças na atividade de MAO-B
poderiam explicar a razão para maior ou menor sensibilidade aos efeitos do
MPTP (Sedelis et al, 2000).
47
Sedelis e colaboradores (2000) concluíram que a sensibilidade ao MPTP
está interligada ao genótipo do animal e pode ser controlada pelas interações
entre alelos susceptíveis e alelos resistentes ao verificarem que camundongos
C57BL/6 são mais sensíveis que camundongos BALB/c, uma vez que
camundongos C57BL/6 possuem o genoma com suscetibilidade a alelos
recessivos.
Sabe-se que o gene SNCA ou gene ᾀ sinucleína está envolvido na
etiologia da DP de origem genética familiar (Polymeropoulos et al, 1997).
Hamilton (2004) sugeriu que PNH neotropicais podem ser menos sensíveis a
intoxicação causada pelo MPTP por motivos genéticos. O pesquisador
observou que mutações nos exons do gene SNCA correspondentes à
substituição de aminoácidos em determinados posições estão implicadas e
propiciam a formação de agregados da proteína. Em seu estudo com humanos
e várias espécies de PNH, identificou que a alanina é o aminoácido
correspondente da posição 53 (53A) em humanos, macacos hominídeos e
macacos do velho mundo, enquanto que em primatas neotropicais está
presente o aminoácido treonina na posição (53T). O pesquisador afirma ainda
que a presença de alanina ao invés de treonina na posição 53 favorece o
aumento na taxa de formação de agregados de ᾀ sinucleina, característica de
sinucleopatias, como a DP. A observação sugere que possuem 53T têm
adaptado mecanismos alternativos para minimizar a acumulação tóxica de
oligômeros de ᾀ sinucleina e indica implicações importantes na expressão de
parkinsonismo e outras ᾀ sinucleopatias nos modelos PNH para DP.
A mutação A53T ᾀ sinucleina em humanos causa severas
anormalidades motoras progressivas, acumulações patológicas de ᾀ sinucleina
e danos mitocondriais ao DNA (Van den Berge et al, 2013).
Há ainda outras teorias que creditam essa variação de sensibilidade ao
MPTP a outros fatores, como: tolerância ao stress oxidativo, a qual varia para
cada espécie; absorção diferencial através do DAT (transportador de
dopamina); diferenças da cinética do DAT; mudanças na função de transporte
de glutamato nos astrócitos; controle do influxo de Ca+2 para dentro dos
48
neurônios e mudanças funcionais no transporte de elétrons nas cadeias de
proteinas (Womer et al, 1994; Kupsch et al, 1995; Swerdlow et al, 1996;
Gainetdinov et al, 1997; Hazell et al, 1997).
Pode-se levantar a discussão de que o protocolo utilizado e dose
acumulativa recebida por animal pode não ter sido eficiente para exemplares
de Sapajus apella, uma vez que há trabalhos que mencionam diferença em
PNH modelados com MPTP com variados protocolos.
Há vários protocolos de indução de parkinsonismo por MPTP utilizados e
que variam conforme a espécie/modelo animal utilizado. Particularmente em
PNH, são utilizados três modelos: o modelo unilateral, induzido por
administração única pela artéria carótida interna; o modelo bilateral, induzido
por administração sistêmica via IV, IM ou SC; modelo combinado de lesão ou
modelo assimétrico bilateral, onde se administra o MPTP pela artéria carótida
interna mais administração via IV (Bankiewicz et al, 2003). Como a maioria dos
PNH não responde aos protocolos de modelo unilateral e combinado,
pesquisadores desenvolveram protocolos sistêmicos com doses específicas
para cada espécie utilizando repetidas doses mínimas por extensivos períodos
(Mounayar et al, 2007).
O projeto inicialmente realizou estudo piloto utilizando o protocolo
unilateral e agudo em um animal e o acompanhou por duas semanas, após a
administração, conforme recomendado por Bankiewicz e colaboradores (2003),
porém o protocolo não se mostrou eficaz e o animal não apresentou nenhuma
sintomatologia associada ao parkinsonismo, sendo assim, optou-se pelo
protocolo de administração bilateral ou sistêmico (Silva et al, 2011).
O protocolo de administração do MPTP em doses crônicas e baixas em
PNH do Velho Mundo resulta em um desempenho pobre com respostas
espaçadas e tardias, atraso em testes de escolha, atraso na alternação e
recuperação de objetos e discriminação de reversão de tarefas, bem como uma
variedade de deficiências específicas de atenção (Le et al, 2014). Mounayar e
colaboradores (2007) utilizaram em Chlorocebus aethiops 2 diferentes
protocolos de inoculação: progressivo e agudo, ambos sistêmicos, com doses
49
variando entre 1,8 mg/kg (protocolo agudo) a 3,2 mg/kg (protocolo crônico), via
IM, e relatou que todos os macacos que receberam protocolo progressivo
desenvolveram sintomas motores e quase todos (com exceção de um animal)
exibiram recuperação espontânea assim que suspensas as administrações de
MPTP (com o ápice da recuperação 28 (±3.9) dias após), enquanto que os
macacos que utilizaram o protocolo agudo também desenvolveram todos os
sintomas motores, mas exibiram uma fraca recuperação, permanecendo
severamente sintomáticos até o sacrifício.
Já quando aplicado a saguis (Callithrix jacchus), o protocolo crônico,
com doses variando entre 0,25 a 12,25 mg/kg, produz efeitos como
bradicinesia, rigidez de membros, anormalidades de postura, vocalização e
habilidade a reagir a estímulos externos alterados e blefarospasmo, porém,
sintomas motores agudos comumente observados quando o MPTP é
administrado, não foram observados (Colosimo et al, 1992).
Há três fatores limitantes para os modelos de PNH com MPTP: a
recuperação espontânea relatada em algumas espécies animais, a ampla
gama de síndromes comportamentais expressas e, por último, a síndrome
causada pela intoxicação por MPTP não se manifesta sempre da mesma forma
nos modelos, podendo não ser progressiva e assim não simular as
consequências do parkinsonismo. Vários fatores podem interferir
significantemente na severidade e persistência dos sintomas, como a espécie
animal, idade do sujeito, via de administração e dose do MPTP (Taylor et al,
1997).
Porras, Li e Bezard (2012) afirmam que o modelo de MPTP em PNH
pode produzir a maioria, mas não todas as principais características clínicas e
patológicas da DP e que o primeiro e principal sinal do parkinsonismo, o
tremor, é talvez o único sintoma que raramente é reproduzido por PNH de
forma fiel, pois macacos chegam a reproduzir tremores ao movimentar-se ou
mudar a postura, mas raramente em descanso.
O experimento demonstrou que todos os sintomas clássicos foram
observados nos exemplares de Sapajus apella tratados, onde os tremores de
50
cabeça e membros foram mais evidentes, inclusive em descanso, com a
presença também de rigidez de cauda (considerada um quinto membro para
PNH). Ao utilizarmos a escala UPDRS de forma adaptada constatamos que
esta escala pode ser adaptada para avaliação de PNH modelados para
parkinsonismo, desde que seja adaptada a interpretação nos sintomas motores
refrentes a membros e habilidades não humanas específicas da espécie de
PNH utilizada.
A escala UPDRS também foi utilizada para avaliar macacos induzidos ao
parkinsonismo em outros estudos (Campos-Romo et al, 2009). Mas outros
experimentos com PNH relatam o uso de outras escalas para anotações e
conclusões sobre os sintomas do parkinsonismo, como a de Pastoris e
colaboradores (1995) que utilizaram para avaliação dos sintomas uma escala
de avaliação de sintomas implementada na RBM Antoine Marxer Institute
(Itália) em seu experimento com Macaca fascicularis modelados com MPTP,
onde foram avaliados: postura, tremores, atividade motora e sedação.
Bankiewicz e colaboradores (2003) sugerem em sua publicação acerca
de modelos pré-clínicos para estudos da Doença de Parkinson uma escala
denominada “Rating Scale for Parkinsonian Primates” onde devem ser
avaliados parâmetros como: tremores, freezing, locomoção, coordenação
motora fina de braços, bradicinesia, hipocinesia, equilíbrio, postura, resposta a
estímulos e coordenação motora grossa de braços, em escala de escores
variando de 0 a 3. Nesta escala, propõe-se que um máximo de 5 fatores
avaliados com escore zero indica um animal saudável. Este experimento
utilizou a escala UPDRS com adaptações baseadas nessa escala.
Em relação aos sintomas apresentados pela maioria dos animais, a
bradicinesia, um sintoma característico em pacientes parkinsonianos, foi
observada em somente 4 dos 10 animais que receberam o protocolo crônico de
MPTP, porém os tremores, tanto de membros quanto de cabeça, estavam
presentes em 7 dos animais. Mounayar e colaboradores (2007) relataram em
seu experimento com Chlorocebus aethiops modelados com MPTP que a
bradicinesia é o primeiro sintoma a aparecer, com os tremores aparecendo
51
logo em seguida, sendo os tremores os mais difíceis de obter em modelos de
PNH com MPTP. Sabe-se que Sapajus apella tem predisposição genética à
discinesia tardia por apresentar polimorfismo em gly9 no gene receptor de
Dopamina D3 (Mahmoudi et al, 2014). Assim, esperava-se um número maior
de animais com bradicinesia durante a fase de observação pós-intoxicação por
MPTP.
Em relação aos sintomas comportamentais, são descritos como
característico de pacientes parkinsonianos a apatia e a impulsividade e
desordens de controle de impulsividade em vários graus. Em cerca de um terço
dos pacientes é evidente a apatia, enquanto que as desordens de controle da
impulsividade ocorrem em cerca de 13% dos pacientes e é associada aos
efeitos colaterais da terapia com Levodopa (Antonelli, Strafella, 2014). Embora
não tenhamos descrito na tabela de observação sintomas como apatia e
depressão, foi notória a expressão desses sintomas em todos os animais,
identificada através do desinteresse aos estímulos ruidosos, comportamento
incomum para primatas desta espécie.
Outros sintomas que podem manifestar-se em resposta aos efeitos
tóxicos agudos do MPTP incluem sedação e hipotermia (Le et al, 2014).
É importante ressaltar que a avaliação dos sintomas era realizada por
membros da equipe que não participaram da inoculação dos animais, refletindo
numa maior confiabilidade dos dados anotados. A observação cega de animais
controle e animais experimentais é um fator metodológico necessário e
recomendado por Taylor e colaboradores (1997) para reduzir a subjetividade e
viés na avaliação da estabilidade dos sintomas.
Quanto à recuperação dos sintomas observada em 3 animais do grupo
de animais não tratado com CTMs (Grupo MPTP+Placebo) dentre os 4 animais
do grupo que apresentaram sintomas, podemos atribuir a regressão dos
sintomas a vários fatores que incluem predisposição genética, tipo de protocolo
utilizado, dose total de MPTP administrada e um mecanismo compensatório de
recuperação do sistema dopaminérgico expresso em PNH modelados com
MPTP.
52
Em Callithrix jacchus, a recuperação espontânea em animais modelados
com MPTP ocorre após a descontinuação da administração de forma gradual
em poucos meses e reestabelece quase que completamente os animais
(Colosimo et al, 1992).
Micos de cheiro (Saimiri sciureus) tratados com MPTP também
apresentaram recuperação espontânea 12 semanas após a última
administração em uma série de 6 doses de 2mg/kg espaçadas 2 semanas uma
da outra (Jakowec et al, 2003).
Aumentos nas concentrações de glutamato e GABA têm sido relatados
em humanos, ratos modelados com 6-OHDA e macacos modelados com
MPTP e estes estudos relacionam a recuperação espontânea dos sintomas
motores do parkinsonismo a um aumento da liberação de dopamina no
striatum, entretanto não esclarece as bases desses mecanismos
compensatórios (Boulet et al, 2008).
Mounayar e colaboradores (2007) sugerem que há um mecanismo de
compensação no striatum por meio do aumento da síntese e liberação dos
terminais sadios restantes e brotamento axonal colateral de fibras sadias
restantes. Entretanto os pesquisadores ressaltam que é importante observar
que, uma vez que o striatum é divido em três áreas anatomo-funcionais
(sensoriomotor, associativo e límbico), a maioria dos estudos com animais
modelados com MPTP identificam uma degeneração dopaminérgica
heterogênea no striatum com uma degeneração mais agressiva nas áreas do
sensoriomotor e associativo, enquanto a região límbica tende a ser mais
preservada, fornecendo uma fonte considerável para explicar a recuperação
espontânea em PNH.
Os mecanismos compensatórios das fibras dopaminérgicas envolvem a
atuação do GABA, GLU e serotonina (5HT), porém ainda permanecem não
totalmente explicados (Mounayar et al, 2007). Aumentos na concentração de
GLU e GABA tem sido relatados em humanos parkinsonianos (Hornykiewicz,
2001).
53
Boulet e parceiros (2008) chegaram à conclusão que macacos verdes
africanos modelados com MPTP expressam recuperação espontânea por
alterações neuroquímicas no striatum ocasionadas pelo aumento de DA e seus
metabólitos (HVA e DOPAC), o qual provavelmente se deve a ação da
serotonina por ocasião da hiperenervação serotoninérgica, também observada
em outros modelos para a DP, evidenciando a ação de um mecanismo
compensatório de reposição de fibras dopaminérgicas. Mounayar e
colaboradores (2007) também observaram um aumento nos níveis de
serotonina em três territórios funcionais do striatum de macacos que
apresentaram recuperação espontânea pós MPTP contrastando com a
diminuição destes níveis em macacos que mantiveram sintomas motores, em
comparação ao grupo controle. O experimento de Jakowec e parceiros (2003)
com macacos de cheiro também demonstraram que a parcial recuperação dos
níveis de DAT e tirosina hidroxilase (TH) em conjunção com a recuperação
comportamental estão envolvidos na neuroplasticidade depois dos danos aos
gânglios basais causados pela intoxicação causada pelo MPTP, e que também
envolve a participação do glutamato.
A recuperação da inervação dopaminérgica do striatum ventral e
diminuição da capacidade de recaptação de dopamina no striatum lesionado
têm sido sugeridas como as responsáveis pela plasticidade e recuperação
espontânea nos modelos (Taylor et al, 1997).
O estudo aqui demonstrou que mesmo aumentando o número de doses
e, consequentemente, a quantidade de MPTP inoculado em um protocolo
sistêmico progressivo, em macacos prego há também a incidência de
recuperação espontânea dos sintomas motores. Apenas os tremores não
cessaram totalmente após 30 dias da última administração e antes da
eutanásia dos animais. Mas é importante ressaltar que esses diminuíram.
Outros fatores que podem explicar a recuperação espontânea após o
protocolo de indução sistêmico progressivo são: 1- o MPTP e seus metabólitos
são completamente excretados em um período de até 3 dias após a
administração. Assim, com a administração de MPTP espaçada de 4 a 5 dias,
54
a acumulação da forma tóxica do MPTP (MPP+) poderia ser evitada; já a
administração de doses diárias de MPTP poderia levar a uma subestimação do
impacto da dose diária de MPTP. 2- O espaço de dias entre uma dose e outra
de MPTP pode promover gradualmente os mecanismos compensatórios que
envolvem a recuperação do sistema dopaminérgico (Mounayar et al, 2007).
Quanto ao significante decréscimo de valores de linfócitos totais em
Sapajus apella tratados com MPTP, sugere-se que o mecanismo de relação
sistema neuroendócrino x sistema imune ocorre de forma semelhante a
pacientes parkinsonianos em modelos PNH.
Em pacientes humanos portadores de DP é observada linfopenia (Baba
et al, 2005; Niwa et al, 2012) e aumento da susceptibilidade dos eritrócitos à
peroxidação lipídica (Kilinç et al, 1988). Bas e colaboradores (2001)
documentaram que os baixos níveis de linfócitos B (CD+20 cells) estavam
presentes em pacientes com ou sem tratamento com levodopa, sugerindo que
os danos em neurônios dopaminérgicos estão envolvidos e que o decréscimo
de valores de linfócitos independe do tratamento convencional com Levodopa.
A relação entre o sistema dopaminérgico e o sistema imunológico no
parkinsonismo ainda não está completamente esclarecido. Desde a década de
80, uma relação entre anormalidades do sistema imunológico em pacientes
parkinsonianos foi observada e documentada, como a ocorrência de anticorpos
em oposição a estruturas neurais, diminuição do número de linfócitos
periféricos no sangue, redução da produção de interleucinas-1 (Martilla et al,
1984; Fiszer et al, 1991). A partir da década de 90, foi demonstrado que a
administração de MPTP em modelos murinos reduzia a quantidade e função de
linfócitos T (Renoux et al, 1989; Bieganowska et al, 1993).
Bas e colaboradores (2001), ao analisarem a composição de
subpopulações de linfócitos e a presença de células T ativadas no sangue
periférico de pacientes parkinsonianos e em ratos modelados para a doença
com MPP+, constataram o decréscimo da população de linfócitos nos
pacientes, com redução tanto de linfócitos T quanto linfócitos B. Porém, nos
ratos estudados comparativamente observaram um leve aumento em linfócitos
55
CD4+ e CD25+. Os autores do trabalho sugeriram que mecanismos
relacionados à neurodegeneração conduzem às variações quantitativas e
qualitativas de linfócitos circulantes, semelhante ao observado em doenças
autoimunes. Assim, as mudanças na diferenciação ou recirculação funcional
dos linfócitos causadas pela regulação neuroendócrina do sistema imune, até
mesmo apoptoses seletivas de populações de linfócitos, podem ter um papel
contribuidor.
Neste experimento, a avaliação da recuperação dos animais tratados
com CTM ficou comprometida pela ocorrência de recuperação espontânea em
animais do grupo não tratado com CTM.
A média de células transplantadas (7.342 x106 ±1.366) e a viabilidade
celular alcançada nos cultivos transplantados (75.522 ±3.245) demonstrou ser
viável o cultivo de células tronco mesenquimais provenientes de tecido adiposo
desta espécie de primata com o protocolo de cultivo utilizado (meio de cultivo
DMEM modificado) e também a utilização destas na terapia celular. A média de
células transplantadas corrobora com a população mínima de células tronco a
serem transplantadas considerada na literatura atual (Murphy, 2013) para
realizar os reparos necessários ao sistema dopaminérgico dos animais.
Jin e colaboradores (2002) transplantaram intracerebralmente em
camundongos cultivo de células mesenquimais murinas heterólogas em
quantidade aproximada de 50.000 células e observaram por meio da marcação
com GFP a maior parte das células no sítio de injeção após 4 semanas do
transplante, porém grande parte também havia migrado para outra região do
hipocampo. Li e colaboradores (2005) também utilizaram a mesma população
de células no hipocampo de ratos e estas também estavam presentes no sítio
de injeção 4 semanas após o transplante.
As células tronco mesenquimais são bastante utilizadas em estudos que
envolvem injúrias ao cérebro e demonstram migrar para a área lesionada e
promover efeitos imunomodulatórios e propriedades antiinflamatórias. Possuem
baixa probabilidade de causar tumorigênese e, quando comparadas com outros
tipos de células tronco, possuem a vantagem de poderem ser aplicadas em
56
terapias personalizadas onde se pode utilizar células do próprio indivíduo para
cultivo, evitando rejeições e respostas imunes que causem viés à terapia.
Células mesenquimais provenientes de tecido adiposo e cordão umbilical têm
demonstrado bons resultados na terapia celular para DP. Estudos que
utilizaram transplante alogênico e autólogo por via intracerebral de células
mesenquimais demonstraram eficiência na melhoria dos sintomas motores
refletidos na avaliação da escala UPDRS na maioria, mas não em todos,
pacientes com Parkinson. (Glavaski-Joksimovic, Bohn, 2013; Mochizuki et al,
2014). Especialmente no tecido cerebral de modelos animais, apresentam
efeitos neuroprotetores, principalmente através da secreção de citocinas e
fatores do crescimento, reforçando processos restaurativos endógenos, além
dos efeitos imunomodulatórios e antiinflamatórios (Glavaski-Joksimovic, Bohn,
2013).
Apesar de serem promissores os resultados para terapias utilizando
CTM para tratamento da DP, pesquisadores atualmente recomendam que os
avanços na terapia com células mesenquimais voltem-se ao uso de células
diferenciadas em neurônios dopaminérgicos para alcançar melhores
resultados. Atualmente, destacam-se os estudos para utilização de células
tronco pluripotentes induzidas(IPSC), uma linhagem de células tronco
reprogramadas primeiramente por Takahashi e Yamanaka (2006) a partir de
fibroblastos embrionários de ratos e fibroblastos da cauda de ratos adultos por
transfecção mediada por retrovírus. As IPSC têm a vantagem de possuírem
pluripotência, como as células embrionárias, porém sem causar teratogênese.
A expressão forçada de um grupo de fatores de transcrição, genes
relacionados ao estado pluripotente, representam uma forma extraordinária de
flexibilidade celular, permitindo que ocorra o retorno da célula do tecido de um
mesmo paciente a uma forma mais plástica e diferenciada ou especializada,
por meio de reprogramação genética (Muotri, 2010).
A análise histopatológica indicou neurodegeneração dos neurônios
dopaminérgicos da substância nigra, similar ao observado em pacientes
humanos com DP. Apesar de não terem sido encontrados os Corpos de Lewy,
patognomônicos da DP, a investigação histopatológica demonstrou gliose
57
reativa e processo de degeneração neuronal, os quais são manifestação
celular da neuroinflamação que ocorre na substância nigra pars compacta de
pacientes parkinsonianos e em animais expostos ao MPTP (Bolin et al, 2002).
A avaliação imunoistoquímica demonstrou que a marcação com
anticorpos tirosina hidroxilase com afinidade para tecidos humanos pode ser
eficiente para demonstrar lesão ou integridade de neurônios dopaminérgicos
em cérebros de Sapajus apella. Embora não tenha sido encontrada nenhuma
diferença significativa na comparação entre o número de células tirosina
58
6. CONCLUSÕES
Após analisarmos os resultados e comparamos com resultados de
pesquisa anteriores, pudemos concluir que:
• A espécie de PNH neotropical Sapajus apella modelada com
MPTP manifesta os sintomas clássicos da DP, tais como: alteração da
expressão facial, tremores de membros e cabeça, dificuldade em
apreender alimentos com as mãos, rigidez de cauda ou membros,
freezing, alteração na agilidade e coordenação motora, alteração de
postura, dificuldade na mastigação e deglutição, salivação, modificação
na vocalização e outros, como estereotipia e depressão;
• O protocolo crônico de 10 doses de 4mg/kg de MPTP, espaçadas
em 3 dias, induz à manifestação de sintomas parkinsonianos, mas não
os estabiliza em Sapajus apella;
• Assim como relatado para outras espécies de PNH do velho
mundo e neotropicais, há recuperação espontânea dos sintomas de
parkinsonismo na maioria dos Sapajus apella tratados com MPTP,
após sustada a administração, havendo remissão ou redução dos
sintomas após 15 a 30 dias terminada a administração de MPTP;
• Os tremores de membros e cabeça são o sintoma mais frequente
observado no modelo de MPTP em Sapajus apella e é também o
sintoma que permanece, porém de forma reduzida, não havendo
recuperação, após sustada a administração de MPTP;
• A frequência de doses de MPTP empregada neste experimento
não foi eficaz na manutenção dos sintomas nos exemplares de Sapajus
apella. O Protocolo utilizado precisa ser revisto de forma a ajustar a
frequência das doses objetivando a manutenção dos sintomas;
• A administração crônica de MPTP em Sapajus apella causa um
significante decréscimo de linfócitos circulantes no sangue;
59
• O protocolo utilizado de colheita e cultivo de tecido adiposo de
Sapajus apella é eficiente o para cultivo e expansão de células tronco
mesenquimais viáveis desta espécie de primata;
60
7. ANEXOS
ANEXO I
Protocolo para obtenção das CTM adaptado de Yamamoto et al (2007):
1. Lavagem do material colhido (tecido adiposo) com PBS estéril suplementado com 50 µg/ml de gentamicina;
2. Incubação com colagenase por 30-60 minutos em banho-maria a 37 ºC;
3. Após incubação, neutralização da colagenase com adição de meio de cultivo (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal e 50 µg/ml de gentamicina;
4. Centrifugação do material por 10 minutos a 800 x g;
5. Descarte do sobrenadante descartado
6. Ressuspenção do precipitado;
7. Cultivo das células suspensas em monocamada a 37 ºC em ambiente com 5% de CO2 por 7 dias;
8. Repique da cultura a cada 7 dias e troca a cada 3 dias;
9. Utilização para terapia celular a partir da 5a passagem.
61
ANEXO II
Protocolo para diferenciação celular das CTM nas linhagens adipogênica, osteogênica e condrogência segundo Zuk et al (2002):
62
ANEXO III
Protocolo de inoculação sistêmico preconizado por Bankiewicz et al (2003):
63
ANEXO IV
ESCALA UNIFICADA DE AVALIAÇÃO PARA DOENÇA DE PARKINSON
UPDRS
I.ESTADO MENTAL/COMPORTAMENTO/ESTADO EMOCIONAL
1. Comportamento intelectual
0= NENHUM
1= MÍNIMO. Esquecimento consistente com lembrança parcial de
eventos, sem outras dificuldades
2= MODERADO. Perda moderada da memória, com desorientação.
Dificuldade moderada para resolver problemas complexos. Mínimo, mas
definitivo comprometimento das atividades em casa, com necessidade
de ajuda ocasional.
3= GRAVE. Perda grave de memória com desorientação temporal e,
freqüentemente de lugar. Grande dificuldade de resolver problemas.
4= GRAVE. Perda grave da memória com orientação preservada
apenas para sua pessoa. Incapaz de fazer julgamentos ou resolver
problemas. Necessita de muita ajuda para cuidados pessoais. Não pode
ficar sozinho em nenhuma situação.
2. Desordem do pensamento (devido à demência ou intoxicação por
drogas)
0= nenhum
1= sonhos vívidos
2= alucinações “benignas” com julgamento (insight) mantido
3= ocasionais a frequentes alucinações sem julgamento, podendo
interferir com as atividades diárias.
4= alucinações frequentes ou psicose evidente. Incapaz de cuidar-se.
64
3. Depressão
1= ausente
2= períodos de tristeza ou culpa acima do normal. Nunca permanece por
dias ou semanas.
3= depressão permanente com sintomas vegetativos (insônia, anorexia,
perda de peso, desinteresse).
4= depressão permanente com sintomas vegetativos. Pensamento ou
tentativa de suicídio.
4. Motivação/iniciativa
0= normal
1= mais passivo, menos interessado que o habitual
2= perda da iniciativa ou desinteresse por atividades fora do dia-a-dia
II.ATIVIDADES DA VIDA DIÁRIA
5. Fala
0= normal
1= comprometimento superficial. Nenhuma dificuldade em ser
entendido.
2= comprometimento moderado. Solicitado a repetir frases, às vezes.
3= comprometimento grave. Solicitado freqüentemente a repetir frases.
4= retraído, perda completa da motivação.
65
6. Salivação
0= normal
1= excesso mínimo de saliva, mas perceptível. Pode babar à noite.
2= excesso moderado de saliva. Pode apresentar alguma baba
(drooling).
3= excesso acentuado de saliva. Baba frequentemente.
4= baba continuamente. Precisa de lenço constantemente.
7. Deglutição
0= normal
1= engasgos raros
2= engasgos ocasionais
3= deglute apenas alimentos moles.
4= necessita de sonda nasogástrica ou gastrostomia.
8. Escrita
0= normal
1= um pouco lenta ou pequena.
2= menor e mais lenta, mas as palavras são legíveis.
3= gravemente comprometida. Nem todas as palavras são
comprometidas.
4= a maioria das palavras não são legíveis.
9. Cortar alimentos ou manipular
0= normal
1= lento e desajeitado, mas não precisa de ajuda.
2= capaz de cortar os alimentos, embora desajeitado e lento. Pode
precisar de ajuda.
66
3= alimento cortado por outros, ainda pode alimentar-se, embora
lentamente.
4= precisa ser alimentado por outros.
10. Vestir
0= normal.
1= lento mas não precisa de ajuda.
2= necessita de ajuda para abotoar e colocar os braços em mangas de
camisa.
3= necessita de bastante ajuda, mas consegue fazer algumas coisas
sozinho.
4= não consegue vestir-se (nenhuma peça) sem ajuda.
11. Higiene
0= normal.
1= lento mas não precisa de ajuda.
2= precisa de ajuda no chuveiro ou banheira, ou muito lento nos
cuidados de higiene.
3= necessita de assistência para se lavar, escovar os dentes, pentear-
se, ir ao banheiro.
4= sonda vesical ou outra ajuda mecânica.
67
12. Girar no leito e colocar roupas de cama.
0= normal.
1= lento e desajeitado mas não precisa de ajuda.
2= pode girar sozinho na cama ou colocar os lençóis, mas com grande
dificuldade.
3= pode iniciar, mas não consegue rolar na cama ou colocar lençóis.
4= não consegue fazer nada.
13. Quedas (não relacionadas ao freezing)
0= nenhuma
1= quedas raras.
2= cai ocasionalmente, menos de uma vez por dia.
3= cai, em média, uma vez por dia.
4= cai mais de uma vez por dia.
14. Freezing quando anda
0= nenhum
1= raro freezing quando anda, pode ter hesitação no início da marcha.
2= freezing ocasional, enquanto anda.
3= freezing frequente, pode cair devido ao freezing.
4= quedas frequentes devido ao freezing.
68
15. Marcha
0= normal.
1= pequena dificuldade. Pode não balançar os braços ou tende a
arrastar as pernas.
2= dificuldade moderada, mas necessita de pouca ajuda ou nenhuma.
3= dificuldade grave na marcha, necessita de assistência.
4= não consegue andar, mesmo com ajuda.
16. Tremor
0= ausente.
1= presente, mas infrequente.
2= moderado, mas incomoda o paciente.
3= grave, interfere com muitas atividades.
4= marcante, interfere na maioria das atividades.
17. Queixas sensitivas relacionadas ao parkinsonismo
0= nenhuma.
1= dormência e formigamento ocasional, alguma dor.
2= dormência, formigamento e dor freqüente, mas suportável.
3= sensações dolorosas frequentes.
4= dor insuportável.
69
III. EXAME MOTOR
18. Fala
0= normal.
1= perda discreta da expressão, volume ou dicção.
2= comprometimento moderado. Arrastado, monótono mas
compreensível.
3= comprometimento grave, difícil de ser entendido.
4= incompreensível.
19. Expressão facial
0= normal.
1= hipomimia mínima.
2= diminuição pequena, mas anormal, da expressão facial.
3= hipomimia moderada, lábios caídos/afastados por algm tempo.
4= fácies em máscara ou fixa, com pedra grave ou total da expressão
facial. Lábios afastados ¼ de polegada ou mais.
20. Tremor de repouso
0= ausente.
1= presente mas infrequente ou leve.
2= persistente mas de pouca amplitude, ou moderado em amplitude mas
presente de maneira intermitente.
3= moderado em amplitude mas presente a maior parte do tempo.
4= com grande amplitude e presente a maior parte do tempo.
70
21. Tremor postural ou de ação nas mãos
0= ausente
1= leve, presente com a ação.
2= moderado em amplitude, presente com a ação.
3= moderado em amplitude tanto na ação quanto mantendo a postura.
4= grande amplitude, interferindo com a alimentação.
22. Rigidez (movimento passivo das grandes articulações, com paciente
sentado e relaxado, ignorar roda denteada)
0= ausente
1= pequena ou detectável somente quando ativado por movimentos em
espelho de outros.
2= leve e moderado.
3= marcante, mas pode realizar o movimento completo da articulação.
4= grave e o movimento completo da articulação só ocorre com grande
dificuldade.
23. Bater dedos continuamente – polegar no indicador em sequências
rápidas com a maior amplitude possível, uma mão de cada vez.
0= normal
1= leve lentidão e/ou redução da amplitude.
2= comprometimento moderado. Fadiga precoce e bem clara. Pode
apresentar parada ocasional durante o movimento.
3= comprometimento grave. Hesitação frequente para iniciar o
movimento ou paradas durante o movimento que está realizando.
4= realiza o teste com grande dificuldade, quase não conseguindo.
71
24. Movimentos das mãos (abrir e fechar as mãos em movimentos rápidos e
sucessivos e com a maior amplitude possível, uma mão de cada vez).
0= normal
1= leve lentidão e/ou redução da amplitude.
2= comprometimento moderado. Fadiga precoce e bem clara. Pode
apresentar parada ocasional durante o movimento.
3= comprometimento grave. Hesitação freqüente para iniciar o
movimento ou paradas durante o movimento que está realizando.
4= realiza o teste com grande dificuldade, quase não conseguindo.
25. Movimentos rápidos alternados das mãos (pronação e supinação das
mãos, horizontal ou verticalmente, com a maior amplitude possível, as
duas mãos simultaneamente).
0= normal
1= leve lentidão e/ou redução da amplitude.
2= comprometimento moderado. Fadiga precoce e bem clara. Pode
apresentar parada ocasional durante o movimento.
3= comprometimento grave. Hesitação freqüente para iniciar o
movimento ou paradas durante o movimento que está realizando.
4= realiza o teste com grande dificuldade, quase não conseguindo.
72
26. Agilidade da perna (bater o calcanhar no chão em sucessões rápidas,
levantando toda a perna, a amplitude do movimento deve ser de cerca
de 3 polegadas/ ±7,5 cm).
0= normal
1= leve lentidão e/ou redução da amplitude.
2= comprometimento moderado. Fadiga precoce e bem clara. Pode
apresentar parada ocasional durante o movimento.
3= comprometimento grave. Hesitação freqüente para iniciar o
movimento ou paradas durante o movimento que está realizando.
4= realiza o teste com grande dificuldade, quase não conseguindo.
27. Levantar da cadeira (de espaldo reto, madeira ou ferro, com braços
cruzados em frente ao peito).
0= normal
1= lento ou pode precisar de mais de uma tentativa
2= levanta-se apoiando nos braços da cadeira.
3= tende a cair para trás, pode tentar se levantar mais de uma vez, mas
consegue levantar
4= incapaz de levantar-se sem ajuda.
73
28. Postura
0= normal em posição ereta.
1= não bem ereto, levemente curvado para frente, pode ser normal para
pessoas mais velhas.
2= moderadamente curvado para frente, definitivamente anormal, pode
inclinar-se um pouco para os lados.
3= acentuadamente curvado para frente com cifose, inclinação
moderada para um dos lados.
4= bem fletido com anormalidade acentuada da postura.
29. Marcha
0= normal
1= anda lentamente, pode arrastar os pés com pequenas passadas,
mas não há festinação ou propulsão.
2= anda com dificuldade, mas precisa de pouca ajuda ou nenhuma,
pode apresentar alguma festinação, passos curtos, ou propulsão.
3= comprometimento grave da marcha, necessitando de ajuda.
4= não consegue andar sozinho, mesmo com ajuda.
30. Estabilidade postural (respostas ao deslocamento súbito para trás,
puxando os ombros, com paciente ereto, de olhos abertos, pés
separados, informado a respeito do teste)
0= normal
1= retropulsão, mas se recupera sem ajuda.
2= ausência de respostas posturais, cairia se não fosse auxiliado pelo
examinador.
3= muito instável, perde o equilíbrio espontaneamente.
4= incapaz de ficar ereto sem ajuda.
74
31. Bradicinesia e hipocinesia corporal (combinação de hesitação,
diminuição do balançar dos braços, pobreza e pequena amplitude de
movimentos em geral)
0= nenhum.
1= lentidão mínima. Podia ser normal em algumas pessoas. Possível
redução na amplitude.
2= movimento definitivamente anormal. Pobreza de movimento e um
certo grau de lentidão.
3= lentidão moderada. Pobreza de movimento ou com pequena
amplitude.
4= lentidão acentuada. Pobreza de movimento ou com pequena
amplitude.
IV. COMPLICAÇÕES DA TERAPIA (NA SEMANA QUE PASSOU)
A . DISCINESIAS
32. Duração. Que percentual do dia acordado apresenta discinesias?
0= nenhum
1= 25% do dia.
2= 26 - 50% do dia.
3= 51 – 75% do dia.
4= 76 – 100% do dia.
75
33. Incapacidade. Quão incapacitante é a discinesia?
0= não incapacitante.
1= incapacidade leve.
2= incapacidade moderada.
3= incapacidade grave.
4= completamente incapaz.
34. Discinesias dolorosas. Quão dolorosas são as discinesias?
0= não dolorosas.
1= leve.
2= moderada.
3= grave.
4= extrema.
35. Presença de distonia ao amanhecer.
0= não 1= sim
B. FLUTUAÇÕES CLÍNICAS
36. Algum período off previsível em relação ao tempo após a dose do
medicamento?
0= não 1= sim
37. Algum período off imprevisível em relação ao tempo após a dose do
medicamento?
0= não 1= sim
38. Algum período off se instala subitamente? Em poucos segundos?
0= não 1= sim
76
39. Qual o percentual de tempo acordado, em um dia, o paciente está
em off, em média?
0= nenhum
1= 25% do dia.
2= 26 - 50% do dia.
3= 51 – 75% do dia.
4= 76 – 100% do dia.
C. OUTRAS COMPLICAÇÕES
40. O paciente apresenta anorexia, náusea ou vômito?
0= não 1= sim
41. O paciente apresenta algum distúrbio do sono? Insônia ou
hipersonolência.
0= não 1= sim
42. O paciente apresenta hipotensão ortostática sintomática?
0= não 1= sim.
77
ANEXO V
Protocolo para perfusão transcardíaca em primatas não humanos:
1. Colocar as soluções tampão e formol em beckers de 1000mL devidamente identificados;
2. Ajustar a bomba peristáltica para infundir 16-18 mL/minuto;
3. Anestesiar o animal
-Indução: cloridrato de ketamina (10mg/kg) e cloridrato de xilazina (3mg/kg)
- Manutenção: Isoflurano 4% (manutenção)
4. Realizar a toracotomia;
5. Posicionar a agulha da mangueira da bomba na aorta descendente
através do ventrículo esquerdo;
6. Ligar a bomba peristáltica;
7. Fazer uma incisão no átrio com auxílio de tesoura cirúrgica para dar
vazão à solução;
8. Perfundir 400 a 500mL de tampão fosfato;
9. Antes de terminar toda quantidade de tampão, desligar a bomba e, após,
conectar a mangueira ao Becker com paraformaldeído;
10. Religar a bomba peristáltica e continuar a perfusão até que acabe o
conteúdo do Becker.
78
ANEXO VI
Protocolo de criopreservação dos cérebros com soluções crescentes de
sacarose:
• Realizar a imersão dos cérebros nas soluções Crio I, Crio II e Crio III,
respectivamente nessa ordem, até que os cérebros fiquem submersos
no fundo dos frascos com as soluções.
• Os frascos com solução de sacarose e cérebros devem ser mantidos
sob refrigeração (2 a 8oC) e protegidos com parafilm.
• Após o processamento dos cérebros nas soluções de sacarose, realizar
o procedimento de cortes em criostato.
Solução Crio I
- 40 mL de glicerina (Sigma®)
- 50 g de sacarose (Sigma®)
- 450 mL solução tampão fosfato – 01 molar (PB01)
Solução Crio II
- 40 mL de glicerina (Sigma®)
- 100 g de sacarose (Sigma®)
- 450 mL solução tampão fosfato – 01 molar (PB01)
Solução Crio III
- 40 mL de glicerina (Sigma®)
- 150 g de sacarose (Sigma®)
- 450 mL solução tampão fosfato – 01 molar (PB01)
79
ANEXO VII
Protocolo para imunoistoquímica de anticorpo primário anti-tirosina hidroxilase:
1. Utilizar anticorpo primário anti-tirosina hidroxilase (Milipore®), diluído na
proporção de 1:500;
2. Fatias do cérebro dos primatas devem ser lavadas (3x10min) com
tampão fosfato salina (PBS) (pH=7,4);
3. Posteriormente tratadas com H2O2 a 0,5% durante 60 minutos;
4. As lâminas são lavadas novamente (3x10min) em PBS (pH 7,4);
5. Realizar pré incubação em soro normal de cabra (VECTOR®) (NGS) 3%
em PBS com Triton X-100 (Sigma®) 0,5% por 60 minutos;
6. Incubar em anticorpo primário durante 48h (anti-tirosina hidroxilase -
Milipore®) a 4ºC;
7. Nova lavagem (3x10min) em PBS com Triton X-100 (Sigma®) 0,3%
(PBS-X);
8. Incubação à temperatura ambiente com imunoblobulina G (IgG)
biotinilada (VECTOR®) anti-coelho (1:200 em NGS 1%) por uma hora e
meia;
9. Lavagem com PBS-X (3x10min);
10. Incubação em complexo avidina-biotina peroxidase (ABC) por uma hora
e meia;
11. Revelação com diaminobenzidina (DAB) (Sigma®) 0,075% em H2O2
0,002%;
12. Última lavagem em PBS (pH 7,4) (3x10min).
80
8. REFERÊNCIAS
Agid Y, Ahlskog E, Albanese A, Calne D, Chase T, De Yebenes J et al. Levodopa in the Treatment of Parkinson’s Disease: A Consensus Meeting. Mov Disord. 1999; 14 (6):911–3.
Alexander GE. Biology of Parkinson’s disease: pathogenesis and pathophysiology of a multisystem neurodegenerative disorder. Dialogues in Clinical Neuroscience. 2004; 6(3):259-80.
Alfaro JWL, Sousa e Silva JR J, Rylands AB. How Different Are Robust and Gracile Capuchin Monkeys? An Argument for the Use of Sapajus and Cebus. American Journal of Primatology. 2012; 74:273–86. Antonelli A, Strafella AP. Behavioral disorders in Parkinson´s disease: The role of dopamine. Parkinsonism and Related Disorders. 2014; 20S1:S10-S12.
Antzoulatos E, Jakowec MW, Petzinger GM, Wood RI. Sex differ-ences in motor behavior in the MPTP mouse model of Parkinson’s disease. Pharmacol Biochem Behav. 2010; 95:466-72.
Baba Y, Kuroiwa A, Uitti RJ, Wszolek ZK., Yamada T. Alterations of T-lymphocyte populations in Parkinson disease. Parkinsonism and Related Disorders. 2005; 11:493–8.
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Resumo
A doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa progressiva que resulta em déficits motores e caracterizada pela degeneração do sistema dopaminérgico nigroestriatal, não possuindo etiologia esclarecida. Modelos animais têm sido fundamentais e amplamente utilizados para estudo da doença. Primatas não humanos possuem sistema nervoso central e organização do circuito neural análoga a humanos, por isso algumas espécies são utilizadas como modelos para estudo da DP, sendo animais extremamente uteis para elucidação da doença. As terapias atuais para DP são paliativas, portanto a utilização de células-tronco mesenquimais (CTM) tem sido uma promissora alternativa, necessitando ainda de maior investigação científica para validação. O projeto pretendeu caracterizar o modelo experimental da DP em uma espécie de primata não humano neotropical, Sapajus apella, e avaliar o efeito terapêutico do transplante autólogo de células-tronco mesenquimais em parkinsonimo induzido por MPTP. Foram utilizados exemplares de Sapajus apella, machos, adultos, divididos em 3 grupos experimentais: Grupo Controle (n=5), Grupo MPTP (n=5) - animais que foram induzidos ao parkinsonismo por MPTP e Grupo MPTP + Terapia Celular (n=5) - animais que foram induzidos ao parkinsonismo por MPTP e, após 30 dias, submetidos à terapia celular com CTM autólogas extraídas de tecido adiposo. Foram avaliados os sintomas nos animais durante e após a inoculação de MPTP e por 30 dias após o transplante de CTM. Após esse período foi realizada eutanásia dos animais por perfusão transcardíaca e estudo dos cérebros. Secções coronais de 30 μm foram obtidas em criostato e foram fixadas em lâminas silanizadas para realização de imunoistoquímica para anticorpos tirosina hidroxilase e contagem das células positivas com auxílio do software StereoInvestigator®. Os resultados da avaliação de sintomas e contagem de células foram analisados de forma comparativa entre grupos experimentais por análise de variância (ANOVA) e teste T, com nível de significância p < 0,05. Quatro (4) animais do Grupo MPTP+Placebo e três (3) do Grupo MPTP+Terapia Celular desenvolveram dois (2) ou mais sintomas característicos de DP, sendo os tremores os mais frequentes. Entre 15 a 30 dias após a administração da última dose de CTM ou Placebo, três (3) dos quatro (4) animais que apresentaram sintomas no Grupo MPTP+Placebo e dois (2) animais dos três (3) animais que apresentaram sintomas do Grupo MPTP+Terapia Celular desenvolveram regressão destes. A avaliação hematológica demonstrou significante decréscimo de linfócitos após o tratamento com MPTP (p<0,05). A análise dos cultivos demonstrou que o cariótipo das células se manteve estável e a diferenciação para as três (3) linhagens celulares. A substância nigra foi claramente identificada nos exemplares de Sapajus apella através da marcação tirosina hidroxilase. Não foi encontrada diferença estatística significativa na comparação entre o número de células tirosina hidroxilase positivas para os Grupos MPTP+Placebo e MPTP+Terapia. Conclui-se que Sapajus apella é um modelo viável para o estudo da DP, mas necessita adequar o protocolo de indução por MPTP. O protocolo utilizado de colheita e cultivo de tecido adiposo de Sapajus apella é eficiente.
Palavras chaves: Doença de Parkinson, modelos animais, terapia celular
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Abstract
Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder that results in motor deficits and characterized by degeneration of the dopaminergic nigroestriatal system, there is no etiology clarified. Animal models have been fundamental and widely used to study the disease. Non-human primates have central nervous system and neural circuit analogous to humans, so some species are used as models for study of DP, being animals extremely useful for elucidation of disease. Current therapies are curative, therefore the use of mesenchymal stem cells (CTM) to treat PD has been a promising alternative, but still requires more scientific investigation to be validated. The study intended to characterize an experimental model of DP in Sapajus apella, a neotropical nonhuman primate species, and assess the therapeutic effect of mesenchymal stem cells autologous transplantation in parkinsonism induced by MPTP. Specimens of Sapajus apella, males and adults were divided into 3 experimental groups: Control Group (n=5), MPTP Group (n=5) - parkinsonism induced by MPTP and MPTP+Cell Therapy Group (n=5) -animals that were induced to parkinsonism by MPTP and, after 30 days, undergoing autologous cell therapy with CTM extracted from adipocytes. The symptoms were evaluated in animals during and after inoculation of MPTP and during 30 days after the transplant of CTM. After this period was performed euthanasia by transcardiac perfusion and study of the brains. 30 μm coronal sections was obtained in cryostat and were fixed in silanized blades to perform immunohistochemistry for tyrosine hydroxylase antibody and positive cell count with StereoInvestigator® software. The results from symptons avaliation and cell count were analyzed in comparisson between experimental groups by analysis of variance (ANOVA) and T Test with significance level p < 0.05. Four (4) animals from Group MPTP+Placebo and 3 animals from Group MPTP + Cell therapy developed two (2) or more characteristic symptoms of DP, being tremors the most frequent. Between 15 to 30 days after administration of the last dose of CTM or Placebo, three (3) of four (4) animals who have symptoms in the Group MPTP+Placebo and two (2) of three (3) animals that showed symptoms of the Group MPTP+cell therapy developed regression. The hematologic evaluation demonstrated significant decrease of lymphocytes after treatment with MPTP (p < 0.05). The analysis of the cells had shown that the karyotype remained stable and differentiation for three (3) cell lines. The substance nigra was clearly identified by tyrosine hydroxylase marker in Sapajus apella. No significant statistical difference was found in the comparison between the number of tyrosine hydroxylase positive cell to the groups MPTP+ Placebo and MPTP+Cell Therapy. It is concluded that Sapajus apella is a viable model for the study of DP, but requires to adequate the protocol for induction by MPTP. The protocol used in harvesting and cultivation of Sapajus apella´s adipose tissue is efficient.
Key words: Parkinson’s disease, animal models, cell therapy
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Etapas bioquímicas que conduzem à degeneração dos neurônios dopaminérgicos causada pela neurotoxina MPTP. Fonte: Jakowec, Petzinger, 2004. ............................................................................................ 9
Figura 2. Fluxograma do estudo ....................................................................... 16
Figura 3. Gaiola no Centro Nacional de Primatas (CENP) com exemplares de Sapajus apella utilizados no estudo. .......................................................... 18
Figura 4. Fragmento de tecido adiposo coletado de exemplar de Sapajus apella. ........................................................................................................ 19
Figura 5. Fragmento de tecido adiposo coletado de exemplar de Sapajus apella. ......................................................................................................... 23
Figura 6. Transplante de CTM autólogas, via intra-carotídea, em exemplar de Sapajus apella. .......................................................................................... 24
Figura 7. Aspecto de perfusão transcardíaca realizada em exemplar de Sapajus apella. ......................................................................................................... 25
Figura 8. Cérebro de Sapajus apella (exemplar AM-ARC) após remoção do crânio (escala= 7cm). ................................................................................. 26
Figura 9. Imagem esquemática do plano de corte coronal dos cérebros de Sapajus apella. ........................................................................................... 27
Figura 10. Corte dos hemisférios cerebrais inclusos em Tissue-Tek® no criostato. ..................................................................................................... 28
Figura 11. Área da lâmina utilizada como área referencial para a contagem. .. 29
Figura 12. Delimitação das áreas investigadas na fatia histológica do cérebro de Sapajus apella corado pela técnica de imuno-histoquímica anti-tirosina hidroxilase. Representação esquemática da grade de contagem sobreposta pelo software Stereoinvestigator na região da Sustância Nigra. Barra = 1mm ............................................................................................................ 29
Figura 13. Caixa de contagem no software Stereoinvestigator, posicionada na região da Substância Nigra, caracterizando as linhas de inclusão (verdes) e exclusão (vermelhas). ................................................................................. 31
Figura 14. Cultivos diferenciados em linhagens adipogênica (A), condrogênica (B), osteogênica (C) e cultivo controle (D) provenientes de tecido adiposo de um dos animais do Grupo MPTP+Terapia Celular (AM-AOI). ............... 35
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Figura 15. Cultivos diferenciados em linhagens adipogênica (a), condrogênica (b), osteogênica (c) e cultivo controle (d) provenientes de tecido adiposo de um dos animais do Grupo MPTP+Terapia Celular (AM-AOI). .................... 36
Figura 16. Sintomas observados nos animais inoculados com MPTP (Grupo I; n= 10). ......................................................................................................... 37
Figura17. Sintomas observados nos animais dos Grupos MPTP+Placebo e MPTP+Terapia celular antes e após o tratamento com CTM ou DMEM. ... 39
Figura 18. Comparações entre valores de linfócitos antes e depois do tratamento com MPTP em Sapajus apella (Test T; p<0.05) ....................... 42
Figura 19. Neurônios tirosina hidroxilase positivos observados durante estereologia (obj 40x). ................................................................................ 43
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Parâmetros estereológicos empregados utilizados no presente estudo. ........................................................................................................ 33
Tabela 2 - Valores de quantidade de células e viabilidade dos cultivos de células tronco transplantados nos animais do Grupo MPTP+Terapia Celular .................................................................................................................... 36
Tabela 3 - Valores hematológicos observados nos animais antes e após tratamento com MPTP. ............................................................................... 41
Tabela 4 - Número total de neurônios tirosina hidroxilase + na Substância Nigra de primatas Sapajus apella do estudo (valores em milhões). .................... 45
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9. APÊNDICES
APÊNDICE I
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APÊNDICE II
![AVALIAÇÃO DO TESTE DE SORO AUTÓLOGO E DO TESTE · PDF filemuito superior ao TSA usando plasma ao invés de soro através do Teste de Plasma Autólogo (TPA) [7]. Dessa forma, existe](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/5a9bb72a7f8b9adb5c8e0501/avaliao-do-teste-de-soro-autlogo-e-do-teste-superior-ao-tsa-usando-plasma-ao.jpg)
