Konventionelle und molekularpathologische Untersuchungen während und nach klinischer Herztransplantation

  • Published on
    10-Jul-2016

  • View
    213

  • Download
    0

Embed Size (px)

Transcript

  • Z. Herz-. Thorax-, Geff, igchir. 11:7-22 (I997) Steinkopff Yerlag 1997 Suppl.

    Ph. A. Schnabel R. Lange K. Amann T. M. Bingold H. Jakob M. Kampmann A. Koch B. Koch A. Magener H. Mehmanesh Z. Niemir E-U. Sack M. Schmid A. Schmiedl R. Waldherr R. Zimmerrnann S. Hagl H. E Otto

    Mit Unterstiitzung durch den ,,Forschungsschwerpunkt Transplantation Heidelberg" des Landes Baden- W/.irttemberg

    Priv.-Doz. Dr. reed. Ph. A. Schnabel ([~) K. Amann T. M. Bingold, M. Kampmann A. Koch B. Koch A. Magener Z. Niemir R. Waldherr H. E Otto Pathologisches Institut der Universit/it Heidelberg Im Neuenheimer Feld 220/221 69120 Heidelberg

    R. Lange ' H. Jakob H. Mehmanesh E-U. Sack - S. Hagl Abteilung Herzchirurgie, Chirurgische Universit/itsklinik, Heidelberg

    R. Zimmermann Abteilung Kardiologie, Medizinische UniversitS.tsklinik, Ruprecht-Karls- Universit/it Heidelberg

    M. Sctimid Institut ftir Virologie, Infektiologie und Epidemiotogie e.V., Medizinisch- diagnostisches Gemeinschaftslabor, Stuttgart

    A. Schmiedl Abteilung Elektronenmikroskopie, Zentrum Anatomie, Georg-August- Universit/it G6ttingen

    Ronventionelle und molekularpathologische Untersuchungen w ihrend und nach klinischer Herztransplantation

    Conventional and molecular pathological investigations of myocardial biopsies taken during and following clinical heart transplantation (HTx)

    Zusammenfassung Die wesentlichen Fragen nach Herztransplantation (HTx) beinhalten Transplantatversagen, akute Abstol3ung, Infektionen und die chronische Rejektion. Im Rahmen der HTx wurden rechtsventrikul~ire Myokardbiopsien zu folgenden Zeitpunkten entnommen: a) vor Kardiople- gie, b) sofort nach Kardioplegie mit Custodiol und Explantation, c) vor Implantation, d) nach 30 und/oder 60 rain Reperfusion, e) im ersten post- operativen Monat w6chentlich und danach in gr613eren Intervallen. Nach Formalinfixierung der Proben und Schnelleinbettung in Paraffin erfolgten histopathologische Begutachtung und immunhistochemische Analysen. Nach Fixierung mit gepuffertem Glutar- und Paraformaldehyd wurde der ultrastrukturelle Erhaltungsgrad des Myokards beurteilt. Schockgefrorene Proben wurden fiir immunhistochemische und molekularpathologische Un- tersuchungen herangezogen. Mittels konventioneller Licht- und Elektronen- mikroskopie wurden Ver/inderungen der Zusammensetzung des Myokards (interstitielle Infiltrate, Fibrose), der Kardiomyozyten (Zellgdem, Hypertro- phie) und Endothelien (Organellenschfiden, Zellgdem) qualitativ und mor- phometrisch charakterisiert. Molekulare Ver/inderungen im Rahmen ent- ztindlicher Prozesse (akuter myozyt/irer und/oder vaskul~irer Rejektionen, Infektionen) oder komplexer Vorgfinge wie der chronischen Rejektion wur- den mittels Immunhistochemie auf Protein-Ebene und Polymerase-Kettenre- aktion (PCR) oder In situ-Hybridisierung auf DNA- oder mRNA-Ebene analysiert.

    Qualitativ und morphometrisch waren lichtmikroskopisch nach vier Stun- den Ischfimie keine Unterschiede zwischen den nach Ex- und Implantation entnommenen Proben auszumachen. Elektronenmikroskopisch zeigten die Kapillarendothelien eine wesentlich hghere Empfindlichkeit gegentiber Isch~imie/Reperfusion als die Kardiomyozyten. Bestimmte quantitative ul- trastrukturelle Parameter der Strukturprotektion zeigten statistisch signifi- kante Korrelationen mit der Isch~imiezeit, andere mit der Anzahl und dem Schweregrad der myozyt/iren oder vaskul~iren Rejektionen im ersten Jahr nach HTx. Infektionen mit dem Zytomegalie-Virus wurden mittels Immun- histochemie und In situ-PCR nachgewiesen, veriinderte Expressionen von Zytokinen und Wachstumsfaktoren mittels Immunhistochemie und In situ- Hybridisierungo Nur durch einen differenzierten Einsatz konventioneller und

  • 8 Zeitschrift fiir Herz-, Thorax- und Gef:,if3chirurgie, Band 11, Supplement i (1997) Steinkopff Verlag 1997

    molekularer Methoden k6nnen unterschiedliche Fragen nach HTx beant- wortet werden. Voraussetzung darer ist eine adfiquate Entnahme, Fixierung und Aufarbeitung der jeweiligen Proben.

    Summary The most important diagnostic questions following HTx relate to graft failure, acute rejection, infections and chronic rejection. Right ventricu- lar biopsies were taken during and following HTx at different time points: a) before cardioplegia, b) immediately following cardioplegia with Custo- diol and explantation, c) before implantation, d) after 30 and/or 60 rain reperfusion, e) weekly during the first postoperative month and then after longer time intervals. After fixation of the probes in formalin and rapid embedding in paraffin, histopathology of the myocardium was evaluated, immunocytochemical analyses followed. Applying fixation in buffered glut- ar- and paraformaldehyde and embedding in epon-araldite, myocardial ultrastructural preservation was evaluated. Samples rapidly frozen in liquid nitrogen were taken for immunocytochemical and/or molecular investi- gations. By means of conventional light and electron microscopy, alterations of the composition of the myocardium (interstitial infiltrates, fibrosis), of cardiac myocytes (cellular edema, hypertrophy), and of endothelia (damage of cell organelles, cellular edema) were evaluated qualitatively and morpho- metrically. Molecular alterations underlying inflammation (acute myocardial and/or vascular rejections, infections) or complex processes such as chronic rejection were investigated on the protein level by means of immunocyto- chemistry and on the DNA or mRNA level by means of the polymerase chain reaction (PCR) or in situ hybridization.

    Qualitatively and morphometrically, light microscopy could not detect dif- ferences between biopsies taken after explantation and those before im- plantation following 4 hours of ischemia. Ultrastructural stereology was able to demonstrate that during HTx capillary endothelia were more susceptible to ischemiaJreperfusion than cardiac myocytes. Single quantitative ultra- structural parameters for structural protection showed statistically signifi- cant correlations with the duration of ischemia. Different parameters correl- ated with the number and severity of myocardial or vascular rejections dur- ing the first year after HTx. Infections with the cytomegalovirus were de- tected by means of immunocytochemistry and in situ PCR. Altered expres- sion of cytokines and growth factors was demonstrated by means of immu- nocytochemistry and in situ hybridization.

    Thus, different questions following HTx can only be answered by applica- tion of corresponding conventional and/or molecular methods, provided that adaequately fixed samples are prepared.

    Sehliisselw6rter Herztransplantation - Histopathologie - Elektronenmikroskopie - Morphometrie - Immunhistochemie - In situ- Hybridisierung - In situ-Polymerase-Kettenreaktion

    Key words Heart transplantation - histopathology - electron microscopy - morphometry - immunocytochemistry - in situ hybridisation - in situ polymerase chain reaction

    EinleRung

    Die orthotope Herztransplantation ist bei einer terminalen, konservativ und/oder chirurgisch ausbehandelten Herzinsuffizienz als Standard-Thera- pieverfahren fest etabliert (26). In den letzten Jahren nimmt jedoch weltweit das Mil3verh/iltnis zwischen der steigenden Zahl von Patienten auf der Warteliste und dem riicklg_u- figen Angebot an Spenderorganen kontinuierlich zu (9, 12, 17, 18). Mit zunehmender Erfahrung wurden die kurz- und mittelfristigen Ergebnisse verbessert, die Indikationen erwei- tert und die AusschluBkriterien ffir die Akzeptanz von Spenderherzen gelockert (4, 9, 17, 18, 26). Die her- ausragende Ursache fiir die frfih- postoperative Letalitfit ist zuneh- mend das Transplantatversagen (4, 12, 17, 26). Dabei kommt dem Versa- gen des rechten Ventrikels eine be- sondere Bedeutung zu (7). Als stati- stisch hochsignifikanter Risikofaktor ffir einen frfihzeitigen Tod nach HTx wurden Ischfimiezeiten von mehr als vier Stunden ermittelt (4). Somit stellt die Verbesserung der Toleranz kalter Ischfimie im Rahmen der HTx mit der Strukturprotektion der un- terschiedlichen Gewebe und Zellen ein klinisch besonders relevantes Ziel dar. Wesentlich ffir die Beurteilung und Verbesserung von Verfahren zur Konservierung des Herzens ist die Kenntnis der fundamentalen Pro- zesse, die dutch die Perfusion mit un- terschiedlichen kardioplegischen L6- sungen, die anschlieBende Ischfimie und Reperfusion initiiert werden.

    Das unmittelbare Ausmal3 von Verfinderungen bzw. Sch~iden an un- terschiedlichen Zellen, d.h. deren verschiedene Vulnerabilitfit sowie die ReversibilitM der Alterationen k6n- nen nur elektronenmikroskopisch beurteilt und morphometrisch ob- jektiviert werden (38, 40, 47). Eine unabdingbare Voraussetzung ftir derartige stereologische Untersu- chungen ist die Fixierung von Pro-

  • Ph. A. Schnabel et al. 9 Konventionetle und molekuIarpathotogische Untersuchungen

    ben unmittelbar nach Entnahme in einem speziellen Fixativ und die wei- tere gesonderte Aufarbeitung bis zur Einbettung in Kunstharz. Dagegen miissen Proben fiir molekulare Ana- lysen sofort schockgefroren werden, f/Jr besondere Untersuchungen (z. B. die In situ-Hybridisierung) unter Einsatz kryoprotektiver Substanzen.

    Mit diesem Methodenspektrum wurde die besondere Situation der HTx mit einer inhomogenen Vor- schS, digung unterschiedlicher Zellar- ten im Rahmen des Hirntodes (48) und der Vorgeschichte der Herzspen- der (44)jedoch noch nicht analysiert. WS, hrend die Induktion bestimmter Zytokine durch Ischfimie und Reper- fusion bereits experimentell iiber- prfift wurde (22), ist deren Bedeu- tung ffir die humane Situation noch unklar. In der friihen postoperativen Phase kann die rechtzeitige Dia- gnose von Rejektionen und/oder In- fektionen, vor allem mit dem Zyto- megalievirus (10), sowohl die Kom- plikations- als auch die LetalitS, tsrate senken (4, 12, 18). Der Langzeitver- lauf wird vor allem durch die chroni- sche Rejektion mit der Ausbildung der Transplantatvaskulopathie, der Sonderform einer beschleunigt auf- tretenden Arteriosklerose, begrenzt (49). Zusammen mit diesen vaskulfi- ten Prozessen tragen die interstitielle Myokardfibrose (42) und die Myo- kardhypertrophie mit degenerativen Myozytenverfinderungen wesentlich zu dem chronischen Transplantat- versagen bei.

    Im Folgenden sollen unterschied- liche pathologisch-diagnostische Un- tersuchungsmethoden mit logisti- schen und methodisch-technischen Voraussetzungen vorgestellt werden.

    MateriaJ und Methoden

    Probenentnahme und -bearbeitung

    Bei 29 Herztransplantationen wur- den rechtsventrikulfire Proben der

    Spenderherzen zu folgenden Zeit- punkten (2, 40) entnommen: a) vor Explantation, b) sofort nach Kardio- plegie mit Custodiol und Explanta- tion, c) vor Implantation, d) nach 30 und/oder 60 rain Reperfusion, e) im ersten Monat nach HTx w6chentlich und danach in gr613eren Abst/inden. Zur Konservierung der Spender- herzen wurde ausschlieglich die kar- dioplegische L6sung Custodiol ein- gesetzt (Histidin-, Tryptophan-, Ka- lium-a-Ketoglutarat-haltige L6sung nach Bretschneider 1). Die Zusam- mensetzung der L6sung betrug (je- weils in mmol/1): 15 NaC1, 9 KC1, 4 MgC12, 180 Histidin, 18 Histidin- HC1, 30 Mannitol, 2 Tryptophan und 1 K-a-Ketoglutarat (2, 5, 6, 14, 45, 46). Die Herzen wurden mit 2000 bis 4000 ml (2, 44) der L6sung fiber l0 +- 3 min perfundiert. Zu a) und d) wurden transmurale Biopsate (45) mittels Tru-Cut-Biopsienadeln ent- nommen (Tru-Cut needle2)). Zu b) und c) wurden Trabekel mit einer fei- nen Schere an beiden Enden abge- trennt und quetschfrei auf den Bran-

    i) Dr. F. K6hler Chemie GmbH, Alsbach- Hfihnlein, Deutschland

    2) Travenol Laboratories, Inc., Deerfield, Ill., USA

    chen der Schere in das jeweilige Fi- xativ fiberffihrt. Zu e) wurden En- domyokardbiopsate mittels Konno- Bioptomen gewonnen (3). Die unter- schiedlichen Entnahmezeitpunkte und Fixierungen sind mit dem Pro- tokoll ftir die Jahre 1993 bis 1996 in Tabelle 1 zusammengestellt. Je nach Gr6ge der Proben nahm die Schnell- einbettung (von Hand) mit Anferti- gung der Paraffinschnitte (3-5 gm) in Stufen und Schnittserien (3) und F~rben der Schnitte 4 bis 5 Stunden in Anspruch. Die Paraffinschnitte wurden mit H/imatoxilin-Eosin und nach Ladewig (Bindewebsf~irbung) gef~irbt, histochemisch wurde die PAS-Reaktion (Perjods/iure-Schiff- Reaktion) eingesetzt. Parallel wur- den immer Leerschnitte ftir eventu- elle zus~itzliche histochemische oder immunhistochemische Untersu- chungen angefertigt.

    Die mit flfissigem Stickstoff in ei- nem Kryoprotektans (Tissue-Tec , Miles Inc., Diagnostics Division, Elkhart, IN 46515 USA) schockge- frorenen Proben wurden bei -24 C mit einem Kryostaten geschnitten (Frigocut E, Reichert-Jung, Nul3- loch, Deutschland). Die Kryostat- schnitte (5-10 gm) wurden konven- tionell wie die Paraffinschnitte ge- f~irbt und ffir die Immunhistochemie

    Tab. 1 Protokoll der Probenentnahme und -fixierung bei Herztransplantation in Heidel- berg (Form. = Formalin; EM-Fix. = Fixativ f~r Elektronenmikroskopie)

    Zeitpunkt Lokalisation Instrument Art der Fixierung

    Form. Kryo EM-Fix.

    Vor Kardioplegie Re. Ventrikel Biopsienadel - - + transmural

    Sofort nach Re. Ventrikel Schere + - + Explantation Trabekel Unmittelbar vor Re. Ventrikel Schere + + + Implantation Trabekel

    Re. Atrium Schere + + + transmural

    Nach 30/60 min Re. Ventrikel Biopsienadel - - + Reperfusio n transmural 1/2 Wochen Re. Ventriket Biopsiezange + + + postoperativ endomyokard.

    Pathologisches Institut, Abt. Herzchirurgie, Universitiit Heidelberg, 1993-1996

  • 10 Zeitschrift f~r Herz-, Thorax- und GeF, iBchirurgie, Band l l , Supplement 1 (1997) Steinkopff Verlag 1997

    (mit nicht Paraffin-gfingigen Anti- k6rpern) und die In situ-Hybridisie- rung eingesetzt.

    Ffir die Elektronenmikroskopie wurden die Proben in einem Ge- misch aus jeweils 1,5% Glutaralde- hyd und Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (2) fiber mehrere Stunden bei Raumtemperatur pri- m/irfixiert. AnschlieBend wurden die B16ckchen in Phosphatpuffer (mit Zusatz von 7,5%iger Saccharose) mehrfach gewaschen und in Phos- phat-gepuffertem Osmiumtetroxyd (mit Kaliumhexacyanoferrat, 1:1) postfixiert. Nach Entwfisserung in einer aufsteigenden Alkoholreihe er- folgte die Durchtr/inkung der Proben mit Propylenoxyd und einer aufstei- genden Harz-Propylenoxyd-Reihe bis zur Einbettung in reinem Epon- Araldit. F/Jr die Polymerisation des Harzes wurden tiblicherweise 24 Stunden bei 70C ben6tigt. Die Routineeinbettung nahm 2 bis 3 Ar- beitstage (von Hand) in Anspruch, mit Einsatz eines Automaten (Histo- mat, bio-med, Theres, Deutschland) wurde sie auf einen Tag verkfirzt. Eine Schnelleinbettung ffir die Elek- tronenmikroskopie konnte ein- schlieBlich forcierter Polymerisation innerhalb 24 Stunden abgeschlossen werden. Semid/innschnitte (1 ~m) und Ultradfinnschnitte (60-80 nm) wurden mit Ultramikrotomen (U1- tracut, Reichert, Wien) angefertigt. Die Semidfinnschnitte wurden mit basischem Fuchsin und Methylen- blau geF~irbt, die Ultradfinnschnitte mit Uranylacetat und Bleiz...

Recommended

View more >