Upload
ezhno
View
37
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
KÜL- ÉS BELTENYÉSZTETT, TRANSZGENIKUS ÉS GÉNKIÜTÖTT ÁLLATOK. KLÓNOZÁS. Dr. Jánossy Tamás SZTE, ÁOK, Sebészeti Műtéttani Intézet. Modellválasztás az orvostudományi és a biológiai kutatásokban 1. A megfelelő állatfaj kiválasztása: Leggyakrabban használt állatfajok: - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
KÜL- ÉS BELTENYÉSZTETT,
TRANSZGENIKUS ÉS GÉNKIÜTÖTT ÁLLATOK.
KLÓNOZÁS
Dr. Jánossy TamásSZTE, ÁOK, Sebészeti
Műtéttani Intézet
Modellválasztás az orvostudományi és a biológiai kutatásokban
1. A megfelelő állatfaj kiválasztása:
Leggyakrabban használt állatfajok:
Háziállatok: szarvasmarha, sertés, baromfi, kutya, macska
Nem ember főemlősök: majom, csimpánz, cerkófmajom, selyemmajmok
Kis laboratóriumi emlősök: egér, patkány, tengerimalac, hörcsög, nyúl
Ezek a leggyakoribbak: kis helyigény, szaporaság, rövid tenyészidő
2. A megfelelő genetikai tényezők, tulajdonságok kiválasztása: pl. változatos v. azonos állatok
Kültenyésztés: a rokontenyésztés elkerülése genetikailag változatos állomány
<100 tenyészpár: a rokontenyésztés maximális elkerülése
>100 tenyészpár: rotációs v. találomra történő (random tenyésztés)
A beltenyésztési együttható (a homozigóta
génhelyek gyakoriságának) növekedése: <1%
A kültenyésztett (outbred) állomány egyedei heterozigóták: az apai (A) és az anyai gének (B) alléljei a génhelyek túlnyomó részében különbözőek (AB).
A populáció anizogén: egyedei genetikailag különböznek (változatos genotípusúak).
Zárt kültenyészetben is megfigyelhető a növekvő homozigótaság. Egyensúlyban lévő zárt tenyészetben az egyedek fele heterozigóta (AB), másik fele homozigóta (25% AA, ill. 25% BB)
Rokontenyésztés: 4 nemzedéken belüli közös ős a családfában
Beltenyésztés: szigorú rokontenyésztés: sorozatos testvér-testvér, gyermek-szülő pároztatás növekvő homozigótaság (genetikai sodródás) (AB helyett AA v. BB)
Beltenyésztett törzsek létrehozása: >20 nemzedéken át végzett testvér-testvér (szülő-utód) pároztatás az összes génlokusz 98,4%-a homozigóta (F=98,4%)
A beltenyésztett (inbred) törzs egyedei homozigóták és izogének (azonos genotípusúak).
A törzs bármely tagja elfogadja a bármelyik másik azonos nemű tagjából átültetett szöveteket (graft) az izogenitás ellenőrzése bőrtranszplantációval (Silvers-féle körtranszplantáció)
Fenntartása: a ritka mutációk miatt testvér-testvér pároztatással.
A beltenyésztett rágcsálótörzsek története:
Jensen, Loeb, Ehrlich, Tyzzer: spontán egértumorok sorozatos transzplantációval történő fenntartása többnyire sikertelen (nem eredt meg v. visszafejlődött)
Jensen (1903), Loeb (1908): sikeres sorozatos tumorátoltások viszonylagosan beltenyésztett egerekben a tumorokkal szembeni fogékonyság örökletes
Little (1914): a tumorrejekció, ill. a fogékonyság több dominánsan öröklődő génen alapul a hisztokompatibilitási gének, a celluláris immunválasz tanulmányozása
Rommel, Wright (1906): beltenyésztett tengerimalacok (2-es és 13-as törzs)
King (1909): beltenyésztett patkányok (PA, WKA törzsek)
Little (1909): beltenyésztett egerek (DBA/1, DBA/2 törzsek)
Bagg (1913): BALB/c egértörzs
Strong (1920): A, C3H, CBA egértörzsek
Little (1921): C57 egértörzsek családja
1920-1930: a leggyakrabban használt egér- és patkánytörzsek kifejlesztése
1929: A Jackson Laboratórium megalapítása (Little)
Beltenyésztési depresszió (leromlás): a szaporodási képesség, életképesség, egészség stb. csökkenése Csak az első néhány generációban fordul elő. Oka: a káros recesszív gének homozigótaságaA kialakult törzsben már nem fordul elő.
F1 hibridek: két genetikailag különböző beltenyésztett törzs keresztezéséből származó első generáció
Minden egyed izogén és heterozigóta mindazon génlokuszokra, amelyekben a két szülői törzs különbözik (= a gének kodomináns öröklődése és kifejeződése).
Ha két transzplantációs antigénekben (H Ag) eltérő törzset keresztezünk, az F1-ek mindkét szülő H Ag-jeit kifejezik → ezért az egyik szülői törzstől származó bőrgraftot sem lökik ki, a szülői törzsek viszont kilökik az F1 graftokat.
Hibrid „életerő” vagy heterózis: a beltenyésztési depresszió ellentéte a káros recesszív gének elfedése a kialakuló heterozigótaság miatt.
Nevezéktan: Nómenklatúra Bizottság (1952)
Törzsnév: 1-4 nagybetű
Egér: A, AKR, CBA, DBA stb.
Patkány: LEW, WAG, BN, PVG stb.
Számok csak a korábban elterjedt törzsek esetén engedélyezettek (pl. egér: C3H, C57BL; patkány:
F344, AS2, M520)
Altörzs:
- a törzs két v. több ágra oszlik a 8-19. testvérpároztatás között
- ugyanabban a tenyészetben két párhuzamos vonal genetikailag eltér.
Példák: C57BL/6, C57BL/10; CBA/J, CBA/Ca; A/He, A/J stb.
Alvonal: - egy másik laboratóriumban történő hosszú
tenyésztés - a törzs bármilyen manipulációja
Altörzs, alvonal neve: törzsnév/altörzs, alvonal szimbólum(ok) történeti sorrendben (a tenyésztő v. a laboratórium nevének rövidítése, ritkán szám: pl. C57BL/10ScSn: Sc=Scott, Sn=Snell
Manipulációk: f: dajkaság (foster nursing) egy másik törzsnél: pl. C57BL/10ScSnfC3H. Pl. specifikált patogénmentes (SPF)ntörzsek létrehozása a magzatok méhhel együtt történő eltávolítása és dajkaságban történő felnevelése révén
e: embriótranszfer egy másik törzsbe
h: mesterséges táplálás (hand rearing)
o: ovárium-transzplantáció
p: petesejttárolás (preservation) cseppfolyós nitrogénben
Rövidített törzsnevek: AKR=AK, BALB/c=C, C3H=C3, C57BL=B, C57BL/6=B6, C57BL/10=B10
F1 hibridek elnevezése: (nőstény szülői törzs x hím szülói törzs)F1: (BALB/c x C57BL/6)F1=CB6F1
Koizogén törzsek:
Mutáció egy jelentős génlokuszon egy beltenyésztett törzsben egy új beltenyésztett törzs kialakítása a mutációt hordozó állatokból
Az új törzs csak egyetlen génlokuszban (a mutált génben) különbözik az eredetitől a génmutáció fenotipikus hatása tanulmányozható.
A mutáció betegség alapját képezheti: Egér: Anémia: sla gén Diabétesz és elhízás (obesity): db, ob
gének Anyagcsere-betegségek: his
(hisztidinémia), pro (prolinémia)
Vesebetegség: kd gén Izomsorvadás (dystrophia): dy, dy2J gén
Farok (tail) fejlődési rendellenességek: t-allél Szőrtelen (nude) és tímuszhiányos: nu
Patkány: Diabetes insipidus: di gene Szőrtelen (nude) és tímuszhiányos: rnu gén Bilirubinémia: j gene Nevezéktan: törzsnév/altörzsnév-mutáns gén
neve: BALB/c/Rij-nu, C57BL/6J-ob
Kongenikus, ill. kongenikus rezisztens törzsek: - A kívánt gén (D) bejuttatása egy
beltenyésztett donor törzsből (2.) egy másik, (d génallélű) recipiens törzsbe (1.) keresztezéssel F1 hibridek létrehozása; - az F1-ek visszakeresztezése az 1. (recipiens) törzsű egerekkel; - a D gént hordozó utódok (Dd) szelekciója és visszakeresztezése 1. egerekkel.
Legalább 10-12 visszakeresztezés szükséges majd egy Dd heterozigóta hím és nőstény pároztatása ezután egy DD homozigóta hím és nőstény beltenyésztése: az új, kongenikus törzs hordozza a donor D gént, míg az összes egyéb génjei (háttérgének) azonosak a recipiens (1.) törzsével.
Kongenikus rezisztens törzsek: a bőr-, ill. tumorgraftok rejekcióját kiváltó antigének génjeinek (MHC) bejuttatása a recipiens törzsbe
Nevezéktan: recipiens törzs.donor törzs (gyakran rövid nevekkel): pl. B10.D2
génrecipiens: C57BL/10 (B10) (MHC=H-2b), géndonor: DBA/2 (D2) (MHC=H-2d) kongenikus rezisztens törzs = B10.D2(másik elnevezés: C57BL/10ScSn-H-2d)
A B10.D2 (H-2d) törzs kongenikus a B10 (H-2b) törzzsel: csak a H-2 lokuszban térnek el, háttérgénjeik azonosak. A H-2 felfedezése = az egér fő hisztokompatibili-tási komplexe [major histompatibility complex (MHC)]
H-2 kongenikus törzsek közötti transzplantáció: az MHC felelős a graftrejekcióért.
Rekombináns törzsek: két nem rokon beltenyésztett törzs keresztezésével létrehozott F2 generációból származnak, >20 generáción át végzett testvér-testvér pároztatással állítják elő őket.
Elnevezés: BALB/c (C) x C57BL/6 (B6) CXB vonalak
Mindkét ős génjeit hordozzák random eloszlásban.
Poligénes tulajdonságok tanulmányozására alkamasak:
pl. élettartam, morfológiai és fiziológiai jellemzők, betegségek, viselkedés, gyógyszerhatások stb.
Transzgenikus állatok:
- idegen DNS-szekvenciák = transzgének bejuttatása megtermékenyített petesejtek pronukleuszaiba
- a petesejt bejuttatása álterhes nőstények petevezetékébe
- a transzgént kifejező transzgenikus állatok kiválasztása és homozigóta vonal kitenyésztése.
A transzgéneket ki lehet fejeztetni:
- meghatározott szövetekben a megfelelő regulátoros szekvenciákhoz való kapcsolás révén (pl. antigénreceptor-gének lymphocytákban)
- gyógyszerekre v. hormonokra (pl. tetraciklin, ösztrogén) válaszoló promoterekhez kapcsolva
A transzgenikus állatokat lehet használni: - a transzgén élettani, patológiai hatásainak
vizsgálatára; - betegségmodellként; - transzgenikus fehérjék/peptidek
(gyógyszerek, hormonok stb.) nagy mennyiségben történő előállítására.
Génkiütött állatok:
Gének célzott mutációja v. szétrombolása homológ rekombináció révén: a kiütésre használt működésképtelen exogén génkonstrukció az endogén génnel homológ szekvenciákat tartalmaz rekombináció a kódoló szekvenciák diszrupciója a génexpresszió és/vagy -funkció megszűnése, deléciója
A génfunkció in vivo tanulmányozása
Klónozott állatok:
Klón: az utód genomja teljesen azonos a kiinduló egyedével.
Sejtosztódások (pl. megtermékenyített petesejtek és testi sejtek osztódása a kiinduló sejt klónjai)
Többsejtű élőlények klónozása:
I. Embrióosztási technika:
Rutin módszer a jó tulajdonságokkal rendelkező háziállatok klónozására (pl. szarvasmarha).
Mesterségesen egypetéjű ikreket állítanak elő. Lépések:
1. Egy petesejtet mesterségesen megtermékenyítenek spermiummmal.
2. A zigótát hagyják osztódni 8-sejtes embrióvá.
3. Az embriót 2 x 4-sejtes v. leggyakrabban 4 x 2- sejtes darabokra osztják.
A sejtek még nem differenciálódnak a 8-sejtes embrióban a szétválasztott embriók genetikailag azonosak, mint az egypetéjű ikrek: ikerkészítés embrióból.
4. A szétválasztott embriókat hagyják fejlődni in vitro.
5. Azután beültetik őket egy álterhes nőstény méhébe.
II. Testi sejtmag átvitele [somatic cell nuclear transfer (SCNT)]
Ian Wilmut és Keith Campbell, Roslin Intézet, Skócia, 1997: a Dolly bárány létrehozása
Az SCNT-hez két sejt szükséges: a magdonor testi sejt + egy megtermékenyítetlen petesejt mint recipiens sejt:
- A petesejt megfelelőbb recipiens sejt, mint a testi sejtek: könnyebb osztódásra késztetni.
- megtermékenyítetlen petesejt könnyebben befogadja a sejtmagot, mint a megtermékenyített.
Az SCNT lépései (the Roslin-technika):
1. A donorsejtet (a Dolly esetében emlőmirigysejt) fötális borjúsavót tartalmazó tápfolyadékban tenyésztik, és hagyják osztódni in vitro.
2. Ezután a sejteket FCS-mentes tápfolyadékba helyezik az osztódás leáll, és a sejtek G0 v. nyugalmi állapotba kerülnek. Ez szükséges,
hogy a recipens sejt befogadja a donormagot.
3. A sejtmagot eltávolítják a petesejtből. 4. A donorsejtet a mag nélküli recipens sejt
közelébe helyezik.
5. 1-8 órával a mageltávolítás után elektromos inger:
- donorsejt (v. izolált mag) fúziója a mag nélküli petesejttel;
- a sejtosztódás aktivációja és az embrió fejlődése
A differenciált donorsejt genetikai programja lenullázódik a petesejtben differenciálatlan, pluripotens sejt
6. Az embriót birka-petevezetékbe helyezik 5-6 napra (itt az embriók túlélése jobb, mint szövettenyészetben).
7. Amikor az embrió eléri a blasztoméra állapotot (kb. 100 sejt), az embriót beültetik egy dajka anya méhébe.
8. Az anya kihordja a terhességet. Az utódok a donor genetikailag pontos másolatai reproduktív klónozás
A blasztomérákat őssejtforrásként is lehet használni.
Honolulu-technika: egerek sikeres klónozása
A klónozott állatok képesek voltak normálisan szaporodni, fenntartani a klónt szexuális reprodukció révén.
Kromatintranszfer: A klónozandó sejtek kezelése eltávolítja a sejtdifferenciálódással kapcsolatos molekulákat, mielőtt a magot eltávolítják a genetikai program lenullázódása könnyebben megy végbe.