730 RECUEIL 70 (1951)

547.059.2-502.4 LA PURIFICATION DE L'ACIDE PTeROYLGLUTAMIQUE

(acide folique synthttique) 1)

PAR

H. J. BACKER et A. C. HOUTMANZ) (Universite de Groningue. Laboratoire de chimie organique) .

Une modification de la methode de WallerS) pour la preparation de I'acide pteroylglutamique cristallise est proposee et motivee.

Apres la publication de quatre syntheses pour l'acide pteroyl- glutamique (IV) 3) 4 ) 5 ) 6 ) en 1948, nombre d'autres methodes .de preparation ont et6 decrites. surtout dans la litterature des brevets. La synthese se fait ordinairement a partir d'acide p-aminobenzoyl- I ( + )-glutamique ( I ) , de 2.4.5-triamin0-6-hydroxypyrimidine (11) et d'un derive halogen6 d'aldehyde propionique.

La premiere methode, due a Angier7) et precisee par Walfer31, fait usage du 2,3-dibromopropanal (111) :

1 111 I 1 IV

La condensation est accompagnee de la perte de deux atomes d'hydrogene. Le pauvre rendement mentionne (2 "/o ) peut Ctre impute. entre autres, au choix du derive de propanal possedant deux atomes d'hydrogene en exces. C'est pourquoi les syntheses nouvelles font usage ordinairement de propanal trihalogkne.

Lorsque nous avons essay6 (1948-1949) dc suivre la methode de Waller, dans le but de l'appliquer a la synthtse de derives substituks

I ) Memoire precedent, Rec. trav. chim. 70, 725 (1951). 2) These Groningue 1950. 3 ) C. W . Waller c.s., J. Am. Chem. SOC. 70, 19 (1948). 4) R. B. Angier et coll., Ibid. 70, 25 (1948). 3) J. H. Boothe et coll., Ibid. 70, 27 (1948). 6 ) M. E. Hultquist et coll., Ibid. 70, 23 (1948). ;) R. B. Angier et coll., Science 102, 227 (1945); 103, 667 (1946).

La purification de l'acide pteroylglufamique. 70 (1951) kECUEIL 731

dans le noyau benzenique, nous avons constate que la mCthode de purification decrite par cet auteur n'est pas trts recommandable. Nous proposons quelques modifications.

Le rendement et la purete du produit s'elhent, lorsqu'on ajoute de temps en temps, pendant la condensation, une nouvelle quantite de triaminohydroxypyrimidine.

En effectuant le premier stade de la purification selon W a l l e r s ) . la majeure partie des impuretes reste en solution collofdale 5 pH 7.0 et precipite avec l'acide pteroylglutamique pendant I'acidification (pH 3.0). L'addition de chlorure calcique fait precipiter les impuretb en solution neutre. Plusieurs essais avec une solution alcaline du produit brut (2.5 g dans 1500 ~ m 3 d'eau) ont permis de tirer les conclusions suivantes.

La solution neutre doit Ctre additionnee d'une quantite assez grande de CaCl, (25 cm:' de solution a 10 %) pour faire precipiter les impuretes colloidales. Apres filtration et purification, la solution donne 0.09 g d'acide pteroylglutamique (environ 1 $%).

En ajoutant le CaCl, a la solution alcaline chaude et en la neutrali- sant ensuite, on obtient un precipite dont le filtrage est beaucoup plus facile: dans ce cas une quantite modCree de CaCl, suffit.

L'emploi d'un grand exces de CaCI, cause, a pH 7.0, la precipitation partielle du produit avec les impuretes. En faisant usage de 25 cm:; d'une solution a 10 "/c, on n'obtient par acidification (pH 3) que 0.1-0.15 g de produit impur; l'usage de 6 cm3 conduit h 0.5 g de produit. qui est plus pur.

Pour recueillir le produit enferme on dissout 1e precipite d'impuretes (pH 7) dans 1500 cm3 d'eau chaude alcalinisee (pH 11) . Puis le processus de purification est repete: addition de. CaCl,, neutralisation, filtrage et acidification. Le produit obtenu ainsi est de meilleure qualite que celui de la premiere precipitation a pH 3. I1 semble qu'une des impuretes reste dissoute h pH 7 et se dCpose a pH 3.

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Pa r t i e e x p 6 r i m e n t a 1 e.

hiparat ion de I'acide ptiroylglutamique. L'acide pteroylglutamique a ete prepare selon la methode decrite par WaZZcr 0 )

t t ses collaborateurs. Comme nous I'avons changee en plusieurs details, surtout quant au procede d'isolation. nous mentionnons le procede complet.

Dans 420 c d d'eau on dissout 2.82 g (0.02 mo1.g) de 2,4,5-triamino-6-hydroxy- pyrimidine et 5.32 g (0.02 mo1.g) d'acide p-aminobenzoyl-I( + )-glutamique. La valeur de pH est fixee a 4.0 et maintenue pendant la reaction. ,

En agitant le melange on ajoute en 90 minutes, goutte a goutte. une solution de 4.32 g (0.02 mo1.g) de 2.3dibromopropanal. Pendant la reaction on ajoute encore, en petites portions, 2.82 g (0.02 mo1.g) de triaminohydroxypyrimidine et on continue d'agiter le melange quelques heures. Le dep6t est essore, lave successiire-

732 H. 7. Backer et A. C. Houtman, La purification de l'acide pteroylblufamique. ~-

ment a l'alcool dilue (50y0), a l'eau et ii I'alcool (96%) et puis seche dam Ie vide en presence d'acide sulfurique. Le produit brut est une poudre brun rougeatre pesant 3.12 g.

Purif icatim. En tenant compte des observations decrites dans la partie theorique, nous avons

effe'ctue la purification selon la method,: suivante. a) On dissout 2.5 g de produit brut dans un litre d'eau de 60" en ajoutant une

lessive de soude caustique jusqu'a pH = 11.0. La solution rouge fond est additionnee ae chlorure calcique (10 yo, 28 un3) et puis legerement acidifiee (pH = 6:4) en ajoutant assez rapidement de I'acide chlorhydrique N et en agitant le melange. Par refroidissement de la solution a 15". le pH s'Pl6ve 2 7.0.

Le precipite est recueilli sur un entonnoir Biichner. La solution filtree n'est pas employee.

On dissout le precipite a 60" dans 2 litres d'eau additionnee de soude caustiqric (pH = 11.0) et I'on y ajoute 5 cm3 de chlorure calcique (10 yo). En agitant le melange energiquement, on I'additionne ensuite tres lentement dacide chlorhydrique 0.5 N jusqu'a pH = 6.4. Le melange est refroidi (pH = 7.0) et filtre. La solution filtree est Claire et jaune. Le precipite soumis a la meme operation donne une solution jaune p5le. Les deux solutions acidifiecs jiisqu'a pH = 3.0 se troublent. Par centrifugation

elles donnent 0.49 g et 0.11 g de precipite respectivement. Le produit est brun jauniitre.

Une solution de ce produit (0.6 g) dans une lessive diluee de soude caustique est additionnee d'eau, jusqu'au volume de 150 cm3 (pH = 10.5). La solution est agitee pendant quelques minutes avec 0.75 g de charbon vegetal et filtree. La solution filtree, qui est faiblement coloree, est acidifiee en ajoutant rapidement un melange bouillant de 600 cm3 d'eau et de 8 cm3 d'acide acetique. La solution chaude est filtrke rapidement et puis mise a part pour refroidir lentement. Le produit jaune (0.36 g) se compose de tres petits cristaux grumeleux.

c) La solution de ce produit dans 175 cm3 deau alcaline (pH 10.5) est agitee avec 0.70 g de charbon actif et filtree apres dix minutes. La solution filtree faiblement jaune est additionnee d'un melange bouillant de 1100 cm3 d'eau et de 12 cm3 d'acide acetique. La solution jaune se refroidissant lentement donne un dep6t cristallin (0.28 g) qui presente l'image microscopique d'acide folique. Comme 0.02 mo1.g d'acide p-arninobenzoyl-I( +)-glutamique ont donne 3.12 g de produit brut et que la purification de 2.50 g conduit 5 0.28 g de produit pur, le rendement en acide pteroylglutamique (folique) pur est de 3.95 yo.

Lacide pMroylgIufamique cristallise avec 2 mol. d'eau qu'il cede dans le wide (0.1 mm) en presence d'anhydride phosphorique et qu'il reprend a ]'air.

b)

Trouve H,O 7.53; C 47.22. 47.18; H 4.91, 4.88. C,,H,,O,N, . 2 H,0(477.43). Calcule ,, 7.55; ,, 47.80; ,, 4.86.

Au moyen de 0.008 y de ce compose dans 10 cm3 de liqueur de culture (labora- toires Difco) on a obtenu une croissance maximale de Streptococcus faecalis R.. egale a celle provoquee par l'acide folique du commerce (laboratoires Lederle).

(Rep le 4 juin 1951).