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LA SIFILIDELA SIFILIDE

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La sifilide è una malattia infettiva trasmessa principalmente per via sessuale, causata dal Treponema pallidum subsp.pallidum, batterio mobile spiraliforme appartenente all’Ordine Spirochetales, Famiglia Treponematacee.

Il batterio filiforme,appare filamentoso ed avvolto a spirale e le sue Dimensioni in lunghezza sono nell’ordine di 5 mi-cron – 15 micron con un diametro trasverso tra 0,1 micron e 0,2 micron.

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Si moltiplica per scissione semplice con divisione trasversale ed al contrario di molti consimili della sua famiglia, per le sue particolari esigenze nutritive e metaboliche, non può essere coltivato in vitro o meglio può esserlo solo per breve tempo con un massimo sopravvivenza di 7 giorni a 35°, in terreno particolarmente arricchito ed in presenza di CO2.

Non sopravvivono più di 48 ore nel sangue da trasfondere conservato nelle emoteche. In azoto liquido mantengono la loro vitalità, mentre proliferano in maniera eccellente nei testicoli di coniglio.

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Rothschild B.M. Existence of syphilis in a Pleistocene bearNature. 335 (6191):595, 1988 Oct 13Wright D.J.Syphilis and Neanderthal manNature . 229 (5284):409, 1971 Feb 5

Una patologia che viene da lontano….. nel tempo?

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…o nello spazio?

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LA CLINICA

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EVOLUZIONE NATURALE DELLA SIFILIDE

Studio di Oslo 1404 pazienti non trattati seguiti dal 1890 al 1941

sifilide I ---> sifilide II | latenza ---> 25% recidive | < 2 anni | sifilide latente tardiva (sifilide III)

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DEFINIZIONI Per uniformare la notificazione dei casi di sifilide Per uniformare la notificazione dei casi di sifilide

l’OMS già nel 1982 ha raccomandato di attenersi l’OMS già nel 1982 ha raccomandato di attenersi alla seguente classificazione:alla seguente classificazione:

a) infezioni primarie e secondariea) infezioni primarie e secondarieb) infezioni latenti recenti ( <2 anni)b) infezioni latenti recenti ( <2 anni)c) infezioni latenti tardive (>2 anni)c) infezioni latenti tardive (>2 anni)d) infezioni tardive sintomatiched) infezioni tardive sintomatichee) infezioni connatali in soggetti con meno di due e) infezioni connatali in soggetti con meno di due

anniannif) infezioni connatali in soggetti con due anni o piùf) infezioni connatali in soggetti con due anni o più

Si definisce sifilide latente recente un’infezione Si definisce sifilide latente recente un’infezione diagnosticata sierologicamente, la cui durata non diagnosticata sierologicamente, la cui durata non oltrepassi i due anni; dopo due anni si definisce oltrepassi i due anni; dopo due anni si definisce sifilide latente tardiva.sifilide latente tardiva.

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LATENZA Periodo di silenzio clinico caratterizzato dall’assenza di

lesioni e/o sintomi compreso tra:

contagio e comparsa del sifiloma (1° latenza o incubazione)

regressione delle lesioni primarie e comparsa delle eruzioni cutanee secondarie (2° latenza o recente)

regressione delle eruzioni cutanee secondarie e comparsa delle manifestazioni terziarie cutanee e/o sistemiche (3° latenza o tardiva)

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DIAGNOSI

La diagnosi di sifilide si basa su:

- clinicaclinica

- anamnesianamnesi

- laboratorio laboratorio

Sarebbe un grave errore trascurare anche uno solo dei tre elementi

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IL LABORATORIO NELLA SIFILIDE

L’OSSERVAZIONE DI UN ESSERE VIVENTE PUO’ AVVENIRE PER RICONOSCIMENTO DIRETTO….

O INDIRETTO….

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IL LABORATORIO NELLA SIFILIDE

DIAGNOSI DIRETTA Dimostrazione in sede di lesione della presenzadel Treponema pallidum, indice certo di malattia

DIAGNOSI INDIRETTA o SIEROLOGICADimostrazione degli anticorpi anti Treponema pallidum, indice di infezione

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DIAGNOSI DIRETTA dimostrazione del Treponema pallidum

1905: Identificazione del Tp al microscopio ottico

(Schaudinn F & Hoffmann E)

1907: Trasmissione del Tp dall’uomo al testicolo di coniglio

(Parodi U Giornale dell’Accademia Medica di

Torino 13:288;1907 )

1909: Microscopia in campo oscuro (Coles)

1948: Rabbit Infectivity Test (Magnuson)

1964: Immunofluorescenza diretta (Yobs AR)

1990: PCR (Hay)

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Diagnosi diretta del treponema

• Cross section of a spirochete PF=periplasmic flagell OS=outer sheath

IL Treponema pallidum,Treponema pallidum, appartiene alla famiglia delle Treponematacee, batteri di forma elicoidale,

mobili, a divisione trasversale.lunghezza variabile da 8 a 14 micron

larghezza variabile da 0.15 a 0.20 micron.

TEM x60.000

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Treponema pallidum

• Microscopia elettronica al Scansione (SEM)

Microscopia elettronica a scansione (SEM)

Microscopia elettronica a trasmissione (TEM): spirocheta infiltrata nei tessuti

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Struttura antigenica

Un antigene polisaccaridicoUn antigene lipidicoUn antigene proteicoAntigeni del corpo del treponema

La conoscenza antigenica del treponema pallido ha consentito l’uso di metodi diagnostici diretti specie specifici

(DFA-TP)

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Trasmissione del Tp dall’uomo al testicolo di coniglio

Istopatologia: Treponema pallidum coltivato su testicolo di conoglio (whartin-Starry silver stain)

Il treponema pallido non cresce in vitro ma può essere coltivato nel testicolo di coniglio e identificato su preparato istopatologico colorato con sali di argento

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1909: Microscopia in campo oscuroContrasto di fase: Questa tecnica si usa per evidenziare

preparati trasparenti che non possono assorbire luce. Il preparato è reso visibile perchè viene contrastato con un'altra angolazione di luce e quindi canbiandogli il proprio indice di rifrazione.

Campo oscuro: Viene inserito un disco opaco (chiamato “stop”) sul percorso della luce, cosicchè solo un cono vuoto di luce illumina il soggetto e permette la risoluzione di dettagli fini. L’illuminazione è obliqua e entra nell’obiettivo solo se rifratta dall’oggetto osservato, il fondo rimane scuro.

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1909: Microscopia in campo oscuro

(PARABOLOIDE)La microscopia in campo oscuro è il metodo più veloce e diretto per diagnosticare la sifilide primaria e secondaria.  I campioni devono essere esaminati immediatamente dopo il prelievo da parte di personale addestrato al riconoscimento del Treponema pallidum.

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1964: Immunofluorescenza diretta (DFA-TP)

L’immunofluorescenza diretta mediante ab specifici (DFA-TP) può essere utilizzata per identipicare il T. pallidum.  I vantaggi di questa tecnica rispetto alla microscopia in campo oscuro è che lo striscio non deve essere esaminato subito ed è specie specifico. Richiede tuttavia attezzature specifiche e personale con esperienza.

anticorpo monoclonale fluorescente diretto verso l’antigene lipoproteico di 47 kd. Courtesy of Sheila Lukehart

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BIOLOGIA MOLECOLARELa conoscenza della sequenza genomica e di alcune proteine specifiche da esso codificate ha consentito l’uso di indagini biomolecolari :

• PCR x gene codificante proteina 47Kd sensibilità 10-50 spirochete

• PCR x DNApolimerasi I sensibilità 10-50 spirochete

• RT-PCR sensibilità 1 spirocheta

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Attendibilità diagnosticaSENSIBILITÀ: amnios (100%), lesione mucose o cutanee esulcerate (96%), sangue (67%) liquor (60%)

SPECIFICITÀ: lesione cutanea (96%), amnios e sangue(100%) LIMITI:

CostiIncapacità distinguere TP vitali e tracce di TP morti Non indicato su liquorTempi di esecuzione

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PCR x gene codificante proteina immunogena di membrana 47Kd

• Zoechling N. et al 1997: PCR nested per il gene di una proteina di membrana immunogenica di 47 Kd----- banda 196 pb

• H S Jethwa et al. J Clin Microbiol. 1995 January; 33(1): 180–183 ------banda 658pb

• Karina A. Orle Et al 1996. Multiplex PCR Haemophilus, Treponema (47KdProt.), Herpes.

AMPLICOT Kit format (Roche Molecular system) colorimetric detection sistem

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PCR x gene codificante DNA polymerase I.

Liu H, Rodes B, Chen CY, Steiner B.New tests for syphilis: rational design of a PCR method for detection of Treponema pallidum in clinical specimens using unique regions of the DNA polymerase I gene.

J Clin Microbiol. 2001 May;39(5):1941-6. agarose gel electrophoresis of polA PCR from serial dilutions of known concentrations of T. pallidum DNA extract. (A) Primer set I. The arrow indicates a 377-bp product. (B) Primer set II. The arrow indicates a 395-bp product. Lanes 1, 2

Sensibilità 95,8%; specificità 95.7%

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N.L. Treponema pallidum Kit

•Estrazione mediante gel di silice

•Banda specifica per Treponema p. 273 pb

•Controllo interno 668pb Tempo di esecuzione

: in giornata

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N. L. Treponema pallidum Kit•Estrazione mediante gel di silice

•amplificazione

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N. L. Treponema pallidum Kit

•Banda specifica per Treponema p. 273 pb

•Controllo interno 668 pb

273 pb Treponema

668 pb Controllo interno

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Treponema pallidum PCRcasistica centro MST

1° Clinica Dermatologica Torino

n. campioni

POSITIVI NEGATIVI

NO LUE 18 0 18LUE I 44 38 6*LUE II 13 12 1**LUE SIEROLOGICA RECENTE

2 0 2

* 3 lesioni alla cervice uterina 3 solco balano-prepuziale

** roseola del tronco

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Isolamento del Tp da lesioni muco-cutaneeMICROSCOPIA IN CAMPO OSCURO

• sensibilità buona (80%)

• specificità buona

• operatore-dipendente

• risposta immediata

• labilità del campione

• economico

• adatto a qualsiasi laboratorio

PCR

• sensibilità elevata (96%)

• specificità elevata

• operatore indipendente

• risposta in giornata

• invio dei campioni

• costo elevato

• laboratorio attrezzato

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Indicazioni alla diagnosi diretta

La dimostrazione del T. pallidum

è raccomandata in:

•sifilide primaria sieronegativa

•sifilomi extragenitali (orale, anale)

•Sifiloma cervicale

•re-infezioni

•coinfezione con HIV

•Sifilide secondaria atipica

E’ poco utile nelle forme

secondarie e terziarie

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DIAGNOSI SIEROLOGICA:dimostrazione di anticorpi anti T. pallidum

Il riscontro di anticorpi anti T. pallidum indica solo una risposta

immunitaria dell’ospite alla presenza del Treponema, presente o

passata.

Non esiste un unico test sierologico che fornisca informazioni

certe sullo stadio della malattia.

Solo l’esecuzione di più test in contemporanea associati alla

clinica ci può permettere di definire l’esatto stadio.

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DIAGNOSI SIEROLOGICAdimostrazione di anticorpi anti T.

pallidum1906:Reaz. di Wassermann

1946: Venereal Disease Research Laboratory (VDRL)

1949: Treponema Pallidum Immobilisation (TPI)

1956: Rapid Plasmin Reagin (RPR)

1964: Fluorescence Treponemal Antibody-absorption

(FTA-abs)

1965: Treponema Pallidum HemAgglutination (TPHA)

1975: ELISA

1988: Western Blot

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CLASSIFICAZIONE DEI TEST

NON-TREPONEMICI : VDRL (aspecifici) RPR Test TREPONEMICI : TPHA (specifici) FTA-abs ELISA/EIA Western Blot

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Test NON-TREPONEMICI (VDRL, RPR)

Questi test rivelano anticorpi IgG e IgM diretti contro lipidi di membrana del Treponema pallidum e contro lipidi serici presenti nell’ospite per il danneggiamento di membrane mitocondriali causato da diverse patologie.A questo scopo si utilizza la cardiolipina di bue che cross-reagisce con questi antigeni

Pangborn MC. A new serologically active phospholipid from beef heart. Proc Soc Exp Biol Med. 1941;48:484.

Harris, A., A. A. Rosenberg, and L. M. Riedel. 1946. A microflocculation test for syphilis using cardiolipin antigen. Preliminary report. J. Ven. Dis. Inform. 27:169-174.

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VDRLHarris, A., A. A. Rosenberg, and E. Del Vecchio. 1948. The VDRL slide flocculation test for syphilis. II. A supplementary report. J. Ven. Dis. Inform. 29:72-75.

Venereal Disease Research Laboratory. VDRL tests. In: Scheele L A. , editor; Scheele L A. , editor. Manual of serologic tests for syphilis. U.S. Washington, D.C: Government Printing Office; 1949. pp. 109–120.

La VDRL ha soppiantato la reazione di fissazione del complemento, descritta per la prima volta da Wassermann, Neisser & Bruck, in 1906, conosciuta sotto il nome di reazione di Wassermann

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VDRLL’antigene VDRL, che è una miscela di cardiolipina, lecitina e colesterolo, è la base di tutti i test non treponemici.

Con varie modificazioni l’antigene è stato stabilizzato per essere usato in altri test aggiungendo stabilizzatori e pigmenti:USR (unheated serum reagin test) con siero non scomplementatoRPR (rapid plasma reagin test) con plasma non scomplementato TRUST (toluidine red unheated serum test) (TRUST) con siero non scomplementato e aggiunta di blu di toluidina.

La velocità del test ha favorito l’RPR, ma la VDRL rimane l’unico test consigliato dalla FDA americana per diagnosticare la neurosifilide su liquor. Inoltre la VDRL rimane il test più economico e perciò è preferito nei laboratori con scarse disponibilità finanziarie (“paesi poveri”).

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Antigene:cardiolipina di bue +lecitina + colesterolo

VDRL

anticorpi del

pazienteflocculazione

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VDRL

4 agitazione

2 siero

3 reattivo

1 inattivazione complemento

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VDRL POS

VDRL

VDRL NEG

Tempo di esecuzione

45-50 minuti

5 lettura

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RPR e' un test non-treponemico di flocculazione per la determinazione qualitativa e semiquantitativa delle reagine (anticorpi) in siero o plasma

Il test viene effettuato su siero o plasma. l'antigene è costituito da una sospensione colloidale di cardiolipina, lecitina e colesterolo miscelata a microparticelle di carbone. Quando un siero reattivo viene posto a contatto con l'antigene, si ha la formazione di una flocculazione macroscopica.

RPR (Rapid Plasma Reagin) Portinoy J, Garson W, Smith Ca.

Rapid plasma reagin test for syphilis.Public Health Rep. 1957 Sep;72(9):761-6.

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RPRRPR è una variazione della tecnica standard VDRL, ha analoga specificità e sensibilità lievemente diversaoffre i seguenti vantaggi: Reagente pronto all’uso Stabilità elevata Non è richiesta l’inattivazione del campione Può essere usato sia siero che plasma

Lettura ad occhio nudo dei risultati.

Svantaggi: non può essere usata su liquor

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Test NON-TREPONEMICI (VDRL, RPR): pregi e difetti

test quantitativi, se titolati follow-up

alta sensibilità

basso costo ed esecuzione semplice e rapida

positivizzazione precoce (80% positivi nella Sifilide I)

negativizzazione entro 2 anni dalla terapia

variabilità d’interpretazione legata all’operatore

fenomeno prozona

bassa specificità (30% falsi positivi)

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TEST TREPONEMICI(TPPA, FTA-ABS, ELISA, WB)

test qualitativi (TPPA e FTA titolo) alta sensibilità (falsi neg eccezionali) buona specificità (rari falsi pos) positivizzazione variabile (IgM > FTA >TPPA) negativizzazione assente (o molto tardiva) costo variabile tempi più lunghi, laboratorio attrezzato

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TPHA/TPPA

TPHA (T. Pallidum HemAgglutination)

TPPA (T. Pallidum Particle Agglutination)

Il TPHA, ideato nel 1965 è stato recentemente sostituito dal TPPA, più sensibile e utilizza particelle di gelatina al posto di emazie di pollo o altri volatili

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Particelle di gelatina

particelle sensibilizzateantigeni treponemici

particelle sensibilizzate

anticorpi del paziente agglutinazione

TPPA (T. Pallidum Particle Agglutination)

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TPHA/TPPA2 siero

3 particelle sensibilizzate e non

1 tampone sorbent

4 lettura

Tempo di esecuzione: circa 2h30’

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TPHA/TPPA2 siero titolazione

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FTA (Fluorescent Treponemal

Antibody)Deacon WE, Falcone VH & Harris A.Fluorescent Test for Treponemal Antibodies.Proc. Soc. Exper. Biol. & Med.96: 477-489, 1957

FTA-absHunter Ef, Deacon We, Meyer Pe. An Improved Fta Test For Syphilis, The Absorption Procedure (Fta-abs). Public Health Rep. 1964 May;79:410-2.

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E’ il test storicamente usato per l’dentificazione delle IgM (lue congenita), oggi affiancato da ELISA e WB

FTA IgG e IgM

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vetrino con Treponemi

adesi

FTA-abs

anticorpi del paziente

(siero adsorbito)

rivelazione

legame antigene - anticorpo

anticorpi anti Ig umane

Tempo di esecuzione 2h30’ ore

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ELISA/EIA test qualitativo rapido, di facile interpretazione ed

automatizzato per la ricerca di Ig (G+M), IgG e IgM

indicato per lo screening di grandi popolazioni a

bassa prevalenza di sifilide (donatori, gravide, etc)

I casi positivi devono essere confermati con un altro

test

sensibilità elevata - no fenomeno prozona

specificità buona

basso costo solo per grandi popolazioni

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ELISA/EIA

Tempo di esecuzione < 2 ore

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WESTERN BLOTTest qualitativo utilizzato come test di

conferma nei casi dubbi:

sifilide congenita: ricerca IgM neurosifilide: esclusione di infezione

in caso di negatività

sensibilità buona: nella s. congenita (83-98% > FTA-abs)

specificità alta : > TPHA > FTA-abs promettente per neurosifilide e

treponematosi endemiche

Tempo di esecuzione

1h30’

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Treponema pallidum immobilization

(TPI o test di Nelson) Test altamente specifico

Oggi in disuso

•Necessita di uno stabulario attrezzato per l’allevamento dei conigli e le colture dei Treponemi

•Utilizzo di apposite celle per l’esecuzione del test

•Gli anticorpi del paziente insieme al complemento immobilizzano i treponemi.

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Il problema dei

FALSI NEGATIVI e

FALSI POSITIVI

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REAZIONI FALSAMENTE NEGATIVEFENOMENO di PROZONA

Falsa negatività della VDRL per un meccanismo competitivo dovuto all’ inibizione della agglutinazione per una eccessiva quantità di anticorpi circolanti (TPHA 1:5120) Si verifica in corso di: sifilide secondaria sifilide latente recente reinfezioni HIV+

Si evita titolando la VDRL negativa fino a 1/16 La diluizione va eseguita solo in caso di sospetto clinico

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REAZIONI FALSAMENTE POSITIVE

più frequenti nei test non treponemici (VDRL, RPR)

titolo stabile e basso (VDRL< 1: 8)

reazione falsamente positiva generalmente isolata

identificabili con i test di conferma

impossibilità a distinguere le treponematosi

endemiche (Framboesia, Bejel, ecc)

la reazione falsamente positiva può coesistere con

cicatrice sierologica rilevabile solo dall’anamnesi

Molto frequenti (1% pop. generale, 30% tossicodipendenti) La discordanza coi test treponemici permette la diagnosi

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POSITIVITA’ RISCONTRATE SU 400 SIERI CHE DIMOSTRAVANO F.R.P. ALLA VDRL

(cortesia Dr. Panuccio Sanità pubblica Milano)

n. campioni positivi

%

Anti-HCV (epatite C) 89 22,3%

RA TEST (artrite reumatoide) 53 13,3%ASMA (anti muscolo liscio) 52 13%

Anti.HIV (AIDS) 40 10%APCA (anti cellule parietali)

14 3,5%ANA (anti nucleo) 14 3,5%AMA (anti mitocondrio) 4 1%HbsAg (epatite B)

ALTRE CAUSE4 1%

130 31,4%

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TEST di CONFERMAnecessario per

• Esclusione di test falsamente positivi VDRL TPHA, FTA-abs ELISA TPHA + VDRL TPHA FTA-abs, Western Blot ELISA IgM (neonato) WB- IgM

• Esclusione di test falsamente negativi fen. prozona: VDRL VDRL diluita,

ELISA

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APPLICAZIONE DEI TEST

SCREENING: VDRL/RPR + TPHAELISA (G+M)

TEST di CONFERMA: TPHA FTA-abs (FTA-IgM x sifilide

congenita) Western Blot

FOLLOW-UP: VDRL titolata

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SCREENING PER POPOLAZIONIbanca del sangueostetricia (gravide)reparti neuro-psichiatrici

centro MST chirurgia d’urgenza espianto d’organo

VDRL/TPPA

test rapido:RPR o TPPA

ELISA(G+M)VDRL/TPPA

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Screening per la sifilide negli utenti asintomatici di un Centro MST

VDRL / TPPA

VDRL - / TPPA +

anamnesi

infezione pregressa

posneg

ELISA,WB FTA-abs

ripetere TPPA > 15 gg

infezione recente

titolo VDRL

VDRL + / TPPA -

infezione pregressa

1:8 1:4

pos neg

infezione iniziale

falso positivo

neg

VDRL + / TPPA +

pos

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INTREPRETAZIONE SIEROLOGIAVDRL TPHA IgM* DIAGNOSI

- - - No sifilide Sifilide pre-sierologica

- - + Sifilide I iniziale FTA-abs falso +

+ 1/ 8

- - Sifilide I iniziale VDRL falsa +

+ - + Sifilide I iniziale

+ + + Sifilide I-II, latente recente

+ + - Sifilide latente tardiva VDRL falsa + in sifilide pregressa

- + - Sifilide pregressa VDRL falsa – (f. prozona)

* FTA-abs, ELISA, WB

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In caso di madre con sierologia positiva il siero neonatale sarà positivo per il passaggio transplacentare delle IgG materne ma non per le IgM

Gli anticorpi materni si negativizzano < 6° mese: test non treponemici < 15° mese: test treponemici La diagnosi sierologica di sifilide neonatale si basa

sulla dimostrazione delle IgMcon FTA-abs, ELISA e Western Blot (golden-standard e test di conferma)

IgM negative: assenza di infezione neonatale positivizzazione tardiva per infezione > VIII° mese ripetere test mensilmente per 3 mesi o trattare

IgM positive: infezione neonatale possibile falso positivo (Fatt. Reumatoide) conferma con WB

SIERO NEONATALE

IgG IgM

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VALUTAZIONE DEL LIQUORpleiocitosi 5 cell/ccproteinorrachia 40 mg/dlVDRL + (nel 50-70% dei casi)TPPA/FTA-abs [Western Blot ]

Nelle forme recenti tutti i parametri sono alterati

Nelle forme tardive i test anticorpali possono essere l’unico parametro alterato

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INTERPRETAZIONE dei test su liquor

VDRL TPPA  

+ + NEUROSIFILIDE

- + Falso positivo, frequente

+ - Falso positivo, eccezionale

- - No neurosifilide

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Il Treponema pallidum…..sfuggente come le Cerastes del Sahara…