LABORATOR 43. METODE DE NSMNARE A MEDIILOR DE CULTUR

nsmnarea reprezint trecerea unei culturi microbiene sub form de inocul, care conine microorganisme, pe un mediu de cultur favorabil dezvoltrii speciei microbiene. Condiia esenial de lucru este asepsia.

n funcie de consistena mediului i de tipul de cultur pe care vrem s o nsmnm, exist mai multe tehnici,: nsmnarea pe medii solide

nsmnarea n medii lichide3.1. nsmnarea pe medii solidea) nsmnarea prin epuizare (fig.3.1)

Mod de lucru: se ncarc ansa sterilizat cu produs

se descarc ansa pe mediul de cultur:

se nsmneaz un prim sector [1]

din primul sector nsmnat se traseaz cteva striuri paralele n sensul acelor de ceasornic [2]

se continu nsmnarea prin striuri paralele [3], terminndu-se printr-un striu n zig-zag [4]

dup fiecare etap se sterilizeaz ansa, fr a se ncrca n produs patologic n ultimul sector bacteriile sunt dispersate, astfel nct dup incubare se vor forma colonii izolate Fig. 3.1. nsmnarea prin epuizare

b) nsmnarea n sector (fig.3.2.)

Mod de lucru:

pe o plac pot fi nsmnate mai multe specii bacteriene (prin nsmnare n sector nu se obin colonii izolate)

se ncarc ansa sterilizat cu produs se descarc ansa pe mediul de cultur sub forma unui sector de cerc

Fig. 3.2.nsmnarea mediilor de cultur n sector

c) nsmnarea prin nepare (fig.3.3)

Mod de lucru: se practic pentru nsmnarea mediilor solide turnate n coloan dreapt

se ncarc ansa de inoculare cu produs se neap mediul n direcie vertical pe o distan de din nlimea coloanei

Fig. 3.3. nsmnarea prin nepare

3.2. nsmnarea n medii lichide

nsmnarea unui mediu lichid cu o cultur microbian dezvoltat n mediu lichid - se realizeaz cu pipeta gradat (pentru un volum fix) i pipeta Pasteur (pentru un volum oarecare) nsmnarea unui mediu lichid cu o cultur microbian dezvoltat pe mediu solid se realizeaz cu ajutorul ansei bacteriene (fig.3.4)Mod de lucru: se recolteaz aseptic o poriune de cultur microbian n bucla ansei

se introduce ansa n mod aseptic n eprubeta cu mediu lichid

se depune materialul pe peretele eprubetei, la nivelul interfeei cu mediul lichid, apoi se spal peretele eprubetei cu cteva picturi din mediul de cultur

se omogenizeaz inoculul cu mediul de cultur prin rsucirea eprubetei ntre palme

pe gtul eprubetei se noteaz numele culturii i data incubrii

se termostateaz la temperatura optim de incubaie de 28- 37 oC

dup inoculare se observ tulburarea mediului de cultur datorit multiplicrii celulelor bacteriene

se obine o cultur bacterian n mediu lichid.

Fig. 3.4. nsmnarea n medii lichide

3.3. Studiul caracterelor morfologice coloniale

Dup obinerea culturilor izolate de microorganisme i apoi a culturilor pure, mediile nutritive introduse n termostat, sunt observate zilnic notndu-se:

- momentul de apariie al coloniilor

- gradul de uniformitate al acestora

- forma coloniilor

3.3.1. Studiul caracterelor morfologice coloniale pe medii solide i lichiden cazul germenilor cu cretere rapid (timp de generaie 20-30 minute) dup 18 ore de incubare la 35-370 C, dintr-o singur bacterie ia natere colonia. La colonii se noteaz:

mrimea

forma: rotunde, stelate etc.

aspectul marginilor: regulate, neregulate, cu prelungiri n cap de meduz.

suprafaa coloniei: bombat, granulat, plat, cu depresiune central, cu ridictur central, sau marginal etc.

aspectul: lucios, mat, mucoid, aspect curgtor uleios, vitros etc.

consistena: vscoas, filant

dac se emulsioneaz uor sau nu n ser fiziologic transparena sau opacitatea coloniei

pigmentarea coloniei

apariia unei zone colorate sau incolore n jurul coloniei

eventual lichefierea mediului

Tipuri de colonii pe medii solide: Colonii tip S (smooth = neted, lucios) (fig.3.5.)

colonii rotunde

margini regulate, bombate

suprafaa neted, translucid

caracteristice pentru germeni patogeni

Fig. 3.5. Colonii tip S

Colonii tip R (rough = rugos, aspru, zbrcit) (fig.3.6)

colonii neregulate

suprafaa plat, rugoas

uscate, mate

aderente de mediu

este caracteristic, n general, bacteriilor nepatogene exist i trei excepii la care forma R caracterizeaz specii patogene: Bacillus anthracis, (fig.3.7) Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphtheriae Fig.3.6. Colonii tip R Fig.3.7.Colonii R (Bacillus anthracis) Colonii tip M (mucoid) (fig.3.8) suprafa neted

foarte mari, bombate, foarte lucioase

cu tendin de curgere i de confluare

caracteristice bacteriilor care posed capsul ( Klebsiella)

Fig.3.8. Colonii tip M

Colonii pufoase (fig.3.9) caracteristice mucegaiurilor

reea de filamente (hife) aeriene Fig. 3.9.Colonii pufoase Tipuri de colonii n medii lichide (fig.3.10): tulburarea uniform a mediului: Staphylococcus, Salmonella etc.

depozit grunjos sau nisipos la fundul tubului, mediul rmne clar: Streptococcus spp.

depozit floconos, mediul rmne clar: B. anthracis

mediul prezint vl subire la suprafa: Corynebacterium diphtheriae

membran groas rugoas, plisat la suprafa, restul lichidului limpede: Mycobacterium tuberculosis inel aderent pe pereii tubului: Escherichia coli

pelicul la suprafa, sub aceasta mediul este colorat verde-albastru: Pseudomonas spp.

inel aderent de recipient Escherichia coli

Fig. 3.10. Aspectul culturilor pe medii lichide