LABORATORIO DE BIOQUIMICACUANTIFICACION DE PROTEINAS POR METODO BIURET

ESTEFANIA MEZA BUCHELY Cód. 215076457YESICA HERRERA MONTENEGRO Cód.

UNIVERSIDAD DE NARIÑOFACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE MEDICINA2015

INTRODUCCIÓN

Las proteínas son principios inmediatos orgánicos constituidos por largas cadenas de aminoácidos, los cuales se unen entre sí mediante enlaces peptídico. La existencia del enlace peptídico, de aminoácidos azufrados, puede ponerse de manifiesto en el laboratorio mediante una serie de reacciones coloreadas específicas, que sirve para la identificación de proteínas.

Se pretende reconocer la presencia de proteínas por medio del método Biuret,en cuatro muestras diferentes (leche, gelatina, Yema y clara de huevo), el cual se fundamenta en la formación de un complejo coordinado entre los iones cúpricos del reactivo y el enlace peptídico de la proteína, reacción que transcurre en medio alcalino.

OBJETIVOS

GENERAL

El objetivo de este laboratorio es poder aplicar un método colorimétrico para determinar la concentración de proteína en una muestra problema, reconocer su utilidad y poder deducir propiedades propias de las muestras utilizadas.

Específicos

Aprender el manejo del espectrofotómetro y su aplicación en los métodos colorimétricos.

Aprender el empleo de una curva patrón para la determinación de la cantidad de moléculas presentes en una muestra, en este caso de proteínas.

Determinar la concentración de proteínas en una muestra x, utilizando el método de Biuret.

MARCO TEÓRICO

Las proteínas son macromoléculas compuestas por unidades de alfa –aminoácidos que se unen entre sí mediante enlaces peptídicos y que alcanzan un peso molecular igual o superior a 5000 D.El enlace peptídico, característico de estos compuestos, resulta de la reacción del grupo carboxilo de un aminoácido con el grupo amino del otro aminoácido, lo cual da lugar a un enlace covalente de tipo carbamida.

REACCION DE BIURET

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco. Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta un máximo de absorción a 540 nm. Las características más importantes de la reacción son: La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas. · Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml, y no depende de la composición de aminoácidos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras

Clara y yema de huevo

Leche descremada

Gelatina

Materiales de vidrio

Tubos de ensayo

Gradilla

Vasos de precipitados

Pipetas

Reactivos

Reactivo de Biuret

Método

Usamos el método experimental, el cual implica la observación, manipulación, registro de las variables (dependiente, independiente e intervinientes) que afectan un objeto de estudio. A continuación con este método es indispensable usar el método analítico en el cual se fundamenta en la aplicación del método científico, sus características son la exactitud, precisión, sensibilidad, límite de detección, intervalo dinámico, selectividad, seguridad

Procedimiento

Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un método colorimétrico que permite determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopia ultravioleta-visible a una longitud de onda de 540 nm (para detectar el ión Cu2+).

En total se utilizó 16 tubos de ensayo, 4 por cada proteína /leche, huevo, y gelatina) a cada uno se le adiciono 3ml de reacción de Biuret, posteriormente Se toma la gradilla con los tubos de ensayo y se introduce en el baño de agua termostatizado a 37 ºC, dejándose que se desarrolle el color durante 15 min, al final se enfrían los tubos de ensayo, introduciendo la gradilla en el agua a temperatura ambiente ,a continuación se procede a medir en el espectrofotómetro.

Cálculos

Tubo(Nº) Patrón de proteínaLeche (ml)

Agua Destilada (ml)

Valor reportado de absorbancia

Total Solución

1 0 2,0 0 2 ml2 0,4 1,6 0,523 2 ml3 0,8 1,2 0,817 2 ml4 1,2 0,8 1,028 2 ml

Tubo(Nº) Patrón de proteínaClara de huevo

Agua Destilada (ml)

Valor reportado de absorbancia

1 0 2,0 02 0,4 1,6 0,7693 0,8 1,2 0,8694 1,2 0,8 1,067

Tubo(Nº) Patrón de proteínaYema de huevo

Agua Destilada (ml)

Valor reportado de absorbancia

1 0 2,0 02 0,4 1,6 0,8373 0,8 1,2 0,915

4 1,2 0,8 1,002

Tubo(Nº) Patrón de proteínagelatina

Agua Destilada (ml)

Valor reportado de absorbancia

1 0 2,0 02 0,4 1,6 0,2613 0,8 1,2 0,4694 1,2 0,8 0,567

Curvas de Calibración

Se trata de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia, que se utiliza para determinar la cantidad de esta sustancia (proteínas) presente en una muestra.

Esta técnica analítica instrumental se relaciona con la absorción de fotones de luz, por parte de los enlaces peptídicos de los polipéptidos que están presentes en la materia orgánica de la muestra, de tal forma que al incrementarse la presencia de tales enlaces, entonces se produce mayor Absorbancia de la solución y por ende mayor concentración de proteína en las muestras estudiadas.

La concentración de una muestra es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante absorbida por la sustancia, o inversamente proporcional al logaritmo de energía radiante trasmitido por la sustancia.

Concentración de proteínas de leche tubo 2, 3, 4.

Tubo # 2 C= 0.4 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 1 g/l

Tubo # 3 C= 0.8 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 2 g/l

Tubo # 4 C=1.2 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 3 g/l

Concentración de proteínas de la clara del huevo tubo 2, 3, 4.

Tubo # 2 C= 0.4 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 1 g/l

Tubo # 3 C= 0.8 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 2 g/l

Tubo # 4 C=1.2 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 3 g/l

Concentración de proteínas de la yema del huevo tubo 2, 3, 4.

Tubo # 2 C= 0.4 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 1 g/l

Tubo # 3 C= 0.8 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 2 g/l

Tubo # 4 C=1.2 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 3 g/l

Concentración de proteínas de la gelatina tubo 2, 3, 4.

Tubo # 2 C= 0.4 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 1 g/l

Tubo # 3 C= 0.8 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 2 g/l

Tubo # 4 C=1.2 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 3 g/l

1 gr/l x 1 l/1000ml x 1000 mg/1gr = 1mg/ml2 gr/l x 1 l/1000ml x 1000 mg/1gr = 2mg/ml3 gr/l x 1 l/1000ml x 1000 mg/1gr = 3mg/ml

Tubo No.leche

Solución Concentración de la solución mg/ml

Absorbancia a 540

1 2.0 ml agua destilada 0 blanco2 1.6 ml agua destilada 100mg/ml 0,5233 1.2 ml agua destilada 200mg/ml 0,8174 0.8 ml agua destilada 300mg/ml 1,002

Tubo No.Clara de huevo

Solución Concentración de la solución mg/ml

Absorbancia a 540

1 2.0 ml agua destilada 0 blanco

2 1.6 ml agua destilada 100 mg/ml 0,8693 1.2 ml agua destilada 200 mg/ml 0,7694 0.8 ml agua destilada 300 mg/ml 1,067

Tubo No.yema de huevo

Solución Concentración de la solución mg/ml

Absorbancia a 540

1 2.0 ml agua destilada 0 blanco2 1.6 ml agua destilada 100 mg/ml 0,8373 1.2 ml agua destilada 200mg/ml 0,9154 0.8 ml agua destilada 300 mg/ml 1,002

Tubo No.Gelatina

Solución Concentración de la solución mg/ml

Absorbancia a 540

1 2.0 ml agua destilada 0 blanco2 1.6 ml agua destilada 100 mg/ml 0,2613 1.2 ml agua destilada 200 mg/ml 0,4794 0.8 ml agua destilada 300 mg/ml 0,967

Trasmitancia (0-100%)

Inversamente proporcional a la cantidad de concentración de la proteína

Tubo No.leche

Solución Transmitancia

1 2.0 ml agua destilada blanco2 1.6 ml agua destilada 52.33 1.2 ml agua destilada 81.74 0.8 ml agua destilada 100.2

Tubo No.Clara de

Solución Transmitancia

huevo1 2.0 ml agua destilada blanco2 1.6 ml agua destilada 86.93 1.2 ml agua destilada 76.94 0.8 ml agua destilada 100.6

Tubo No.yema de huevo

Solución Transmitancia

1 2.0 ml agua destilada blanco2 1.6 ml agua destilada 83.73 1.2 ml agua destilada 91.54 0.8 ml agua destilada 100

Tubo No.Gelatina

Solución Transmitancia

1 2.0 ml agua destilada blanco2 1.6 ml agua destilada 26.13 1.2 ml agua destilada 47.94 0.8 ml agua destilada 96.7

LEY DE BUOGUER-LAMBERT

Abs

orba

ncia

0 0.4 0.8 1.20

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

GelatinaHuevo (clara)Huevo (yema)Leche

TRANSMITANCIA

paso optico0

20

40

60

80

100

120

GelatinaHuevo(clara)Huevo (yema)Leche

CONCLUSIÓN

Concentración

Abs

orba

ncia

Tr

ansm

itanc

ia

(%)

Efectivamente, aplicando el método Biuret se puede determinar la concentración de proteína en una o varias muestras problema, que resultan al interpolar los valores de absorbancia en una curva patrón originada a partir de concentración de proteína conocida.

Por medio de las expresiones gráficas, en donde se recaudan los datos por medio de las fórmulas de concentración y de los datos del espectrofotómetro, se puede observar que respecto a absorbancia se puede definir que es directamente proporcional a la concentración de la solución, y la transmitancia es inversamente proporcional a ella.

El método de Biuret, nos arroja en corto tiempo la definición de presencia de proteína, en el caso experimental observamos que la yema de huevo no arroja una coloración violeta, por ende no refiere la presencia de proteína

BIBLIOGRAFÍA

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Segal, C. (2005) Manual de prácticas de biología molecular de la célula. Editorial publidisia.

Cambell, P.N.; Smith, A.d.; Peters, T.J. (2006) Bioquímica ilustrada: bioquímica y biología molecular en la era posgenómica. Masson, España.

Harris, D.C. (2003). Quantitative chemical analysis. San Francisco: W.H. Freeman