I. Tujuan

Setelah melakukan praktikum, mahasiswa diharapkan :

1. Mampu melakukan berbagai teknik mikrobiologi dalam skrining

(menanam, mengisolasi dan memurnikan biakan, melakukan tes terhadap

kemampuan biakan menghasilkan antibiotik)

2. Mendapatkan mikroorganisme yang menghasilkan antibiotik dari jaringan

tanaman.

3. Mendapatkan mikroorganisme yang menghasilkan antibiotik dari tanah

4. Melakukan fermentasi fungi untuk menghasilkan antibiotik.

5. Menentukan profil pertumbuhan dan waktu panen antibiotik berdasarkan

profil pembentukan antibiotiknya.

II. Landasan teori

Mikroorganisme adalah sumber enzim yang paling banyak digunakan

dibandingkan dengan tanaman dan hewan. Sebagai sumber enzim, mikroorganisme

lebih menguntungkan karena pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh pada substrat

yang murah, lebih mudah ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan kondisi

pertumbuhan dan rekayasa genetik, serta mampu menghasilkan enzim yang ekstrim

(Buckle, 2003).

Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, suubstrat

yang berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat

berupa bakteri, khamir, kapng dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di

linkungan ini sangatlah beraneka ragam sehinga dalam mengisolasi diperlukan

beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh koloni yang tunggal. Koloni

yang tunggal ini kemudian yang akan diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian

misalnya untuk menngisolasi DNA mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang

telah resisten terhadap suatu antibiotik. Atau untuk mengetahui mikroba yang

dipakai untuk bioremediasi holokarbon (Ferdiaz, 1992).

Isolasi mikroba berarti memisahkan satu jenis mikroba dari biakkan

campuran menjadi biakan murni. (populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel

individu). Mikroorganisme dibiakkan dilaboratorium pada bahan nutrien yang

disebut medium. Banyak sekali medium yang tersedia, macamnya yang dipakai

bergantung pada beberapa faktor salah satu diantaranya ialah macam organisme

yang akan ditumbuhkan (Schegel, 1994).

Ada beberapa metode dalam mengisolasi bakteri, fungi dan khamir

(miroorganisme) yaitu dengan menggunakan metode gores, metode tuang, metode

sebara, metode pengenceran serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling

sering digunakan adalah teknik cawan dan cawan gores. Kedua metode ini

berdasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan mikroorganisme

sedemikian rupa sehingga tiap individu spesies dapat dipisahkan dengan lainnya

(Hadioetomo, 1993).

Metode piringan tuangan (pour-plate metod) pertama kali mengadakan

piaraan biasanya diperoleh dari piaraan campuran, piaraan pertama disebut primary

culture dan sifatnya murni. Piaraan semacam ini dapat disimpan tetapi harus

diadakan peremajaan dengan memindahkannya ke medium baru yang disebut

piaraan turunan (Sub-culture) yaitu piaraan yang diperoleh dari piaraan pertama.

Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage ialah harus adanya kondisi

optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sebelum diinokulasi tangan dan

tempat kerja disemprot dengan alkohol dengan menggunakan metode aseptik,

jarum inokulasi disterilkan dengan membakarnya, dengan api sampai jarum

tersebut pijar (Irianto, 2006).

Kulturisasi bakteri untuk keperluan yang bermanfaat, pada umumnya

dilakukan dengan biakan murni. Biakan murni hanya mengandung satu jenis. Untuk

mengisolasi bakteri dalam biakan murni, umumnya digunakan dua prosedur yaitu:

metode agar cawan dengan goresan dan metode agar tuang. Sebelum bakteri

diinokulasi, tangan dan tempat kerja disemprot dengan alkohol dengan

menggunakan metode aseptik, jarum inokulasi disterilkan dengan membakarnya,

dengan api sampai jarum tersebut pijar (Volk, 1993).

Medium pertumbuhan mikroba adalah suatu bahan yang terdiri dari

campuran nutrient yang diperlukan mikroba untuk pertumbuhannya. Dengan

menggunakan medium pertumbuhan, aktivitas mikroba dapat dipelajari dandengan

medium tumbuh dapat dilakukan isolasi mikroba menjadi kultur murni,

perbanyakan, pengujian sifat fisiologis, dan perhitungan jumlah mikroba (Pelczar,

1986).

III. ALAT DAN BAHAN

Tahap I

1. Petri (2)

2. Scalpel dan pinset

3. Erlenmeyer

4. Media PDA dan antibiotic kloramfenikol

5. Aquadest

6. Natrium hipoklorid 5%

7. Etanol 70%

8. Bunsen

9. Tabung reaksi

10. Mikropipet dan yellow tip

11. Larutan saline

12. Spreader glass

13. Sampel tanah dan tanaman

Tahap II

1. Petri

2. Ose bulat

3. Bunsen

4. Media PDA

Tahap III

1. Petri

2. Sumuran

3. Bunsen

4. Media NA dan NB

5. Kultur Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

Tahap IV

1. Erlenmeyer

2. Blue tip, Yellow tip

3. Conical tube

4. Sentrifuge

5. Kertas saring

6. Petri dish

7. Fungi terpilih

8. Media PDB dan NA

9. Kultur Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

IV. CARA KERJA

Tahap I

A. Jaringan Tanaman

1. Bersihkan bagian tanaman yang akan digunakan dengan air mengalir

2. Potong kecil-kecil menjadi ± diameter 3 cm, masukkan erlemeyer steril

3. Sterilisasi dengan etanl 70% selama 2 menit kemudian dibilas sekali dengan

4. aquadest

5. Sterilkan dengan Natrium hipoklorid selama 2 menit kemudian dibilas tiga

kali

6. dengan aquadest, tiriskan dalam petri dish yang berisi kertas saring

7. Untuk batang kupas dan hilangkan bagian kulitnya, untuk daun potong

menjadi

8. ukuran 1x1 cm, untuk akar langsung dipotong menjadi 1 – 1,5 cm.

9. Tanam bagian tanaman tersebut ke dalam petri yang berisi media PDA padat

10. Inkubasi suhu ruangan hingga praktikum selanjutnya

B. Tanah

1. Suspensikan 1 gram sampel tanah dengan 10 ml larutan saline dalam tabung

steril

2. Encerkan hingga konsentrasi 10-2

3. Tuang 0,5 ml suspensi tersebut dalam petri steril yang telah dituangi media

PDA dengan penambahan antibiotik kloramfenikol 100 mg/L. Ratakan

dengan menggunakan spreader glass.

4. Inkubasi pada suhu kamar sampai praktikum selanjutnya

Tahap II

1. Ambil koloni dengan ose dan dipindahkan ke media PDA yang baru

2. Inkubasi pada suhu ruang sampai praktikum selanjutnya

Tahap III

1. Inokulum bakteri uji dipindahkan menggunakan ose ke dalam 1 ml media

NB steril di tabung reaksi secara aseptis, kemudian diinkubasi pada suhu

37°C selama 18-24 jam. Setelah itu, kultur bakteri uji disesuaikan dengan

standar McFarland 0,5.

2. Sebanyak 0,1 ml kultur bakteri dicampur dengan 10 ml NA steril dan

dituang ke dalam petri dish. Ditunggu hingga memadat.

3. Buat plug pada media NA diatas

4. Buat plug pada media PDA fungi dan tempatkan pada plug media NA

5. Inkubasi pada suhu 37°C semalam. Amati daya hambat sampai 3 hari.

Tahap IV

1. Pembuatan inokulum

Ambil 2 plug fungi terpilih, masukkan ke dalam 60 mL media PDB steril.

Lakukan fermentasi selam 14 sambil di shaker.

2. Fermentasi dan sampling

a. Siapkan Erlenmeyer 100 mL sebanyak 7 buah. Beri tanda label : 2,

4, 6, 8, 10, 12, 14 hari fermentasi

b. Ke dalam masing-masing Erlenmeyer tersebut, masukkan 50 mL

media PDB steril, kemudian inokulasikan 2 plug fungi terpilih (atau

inokulum cair pada poin 1 sebanyak 2 mL) secara aseptis.

c. Taruh di alat shaker dan lakukan fermentasi selama 14 hari tersebut

pada suhu kamar.

d. Sampling dilakukan setiap 2 hari dengan cara : gojok kultur sampai

e. homogen, kemudian saring miselia jamur yang diperoleh dengan

kertas saring yang sudah ditara. Filtrat dimasukkan ke dalam conical

tube steril dan bekukan dalam freezer. Lakukan sampai Erlenmeyer

hari ke-14.

3. Pengukuran bobot kering sel

a. Misel yang sudah disaring dengan kertas saring yang sudah ditara,

begitu didapat segera dikeringkan dalam oven suhu 60°C sampai

diperoleh bobot konstan.

b. Buat kurva hubungan antara waktu fermentasi vs bobot kering sel.

4. Ekstraksi

a. Hasil fermentasi selesai, filtrat yang dibekukan dicairkan dengan

cara direndam dalam air hangat suhu 40°C sampai benar-benar

mencair sempurna.

b. Masukkan ke dalam corong pisah, ekstraksi dengan etil asetat

sebanyak 3 kali, masing-masing dengan 20 mL.

c. Kumpulkan sari etil asetatnya, dan uapkan hingga diperoleh ekstrak

yang kering.

5. Pengukuran zona hambat bakteri

a. Timbang ekstrak kering etil asetat sebanyak 15 mg. Masukkan ke

dalam eppendrorf. Ekstrak tidak boleh menempel di dinding

eppendorf, tetapi harus berada di dasar eppendorf. Gunakan bantuan

spatula untuk pemindahan ekstraknya.

b. Tambahkan 15 μL DMSO, homogenkan dengan cara disentil dengan

jari kira-kira selama 2 menit, kemudian tambah dengan 285 μL

akuades steril. Vorteks selama 1 menit.

c. Panaskan media NA sampai mencair. Setelah suhunya mencapai

40°C, tambah dengan bakteri (E. coli atau S. aureus) dengan

perbandingan 1 mL kultur bakteri untuk tiap 50 mL media NA.

Gojok homogeny dan tuang sebanyak 10 mL ke dalam petri steril.

Biarkan media NA memadat.

d. Bagilah petri menjadi 8 area. Kedelapan area ini adalah untuk

penempatan paper disk sampel sebanyak 7 dan kontrol pelarut

sebanyak 1 buah.

e. Uji antibakteri yang dikerjakan adalah dengan metode disc diffusion.

Ke dalam paper disc steril, teteskan 10 μL larutan uji (yang dibuat

pada poin 5b), dan tempelkan di permukaan media NA.

f. Inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.

g. Amati zona jernih yang terbentuk. Ukur diameternya.

h. Buat kurva hubungan antara waktu fermentasi vs diameter zona

hambat yang terbentuk.

6. Analisa golongan senyawa

a. Siapkan plat KLT setinggi 10 cm. Totolkan ketujuh hasil ekstraksi

media fermentasi yang diperoleh (yang dibuat pada poin 5b)

sebanyak 10 μL. Elusi dengan sistem fase gerak yang sesuai

b. Amati bercak pada sinar tampak, sinar UV 254, dan 366 nm.

Kemudian semprot dengan anisaldehid-asam sulfat, segera

panaskan dalam oven suhu 105°C selama 3 menit. Segera amati

warna bercak yang terbentuk.

c. Dokumentasikan pola-pola dan warna bercak hasil KLT-nya.

V. Data pengamatan

Kelompok= 4

Sampel= tanah di dekat pembuangan limbah kimia

Table pengamatan

Hari

ke bakteri Foto pengamatan

1

E. coli

Terlihat adanya sedikit

zona bening atau zona

bening mulai terbentuk

S.Aureus

Terlihat adanya sedikit

zona bening atau zona

bening mulai terbentuk

2

E. coli

Zona bening yang

terbentuk mulai meluas

S.Aureus

Zona bening yang

terbentuk mulai meluas

3

E. coli

Zona bening yang

terbentuk seluas 2,125 cm

S.Aureus

Zona bening yang

terbentuk seluas 0,8 cm

Perbandingan dengan kelompok lain

klp sampel bakteri diamete

r (cm)

diamete

r(cm)

diamete

r (cm)

diame

r(cm)

Rata-

rata(cm)

1 Daun sirih e.coli 1,4 1,2 1,9 1,3 1,45

S. aureus Tidak terdapat zona bening -

2 Tanah limbah

kimia

e.coli 0,4 0,2 0,1 0,2 0,225

S. aureus Tidak terdapat zona bening -

3 Tanah limbah

kimia

e.coli 0,1 0,3 0,2 0,1 0,175

S. aureus Tidak terdapat zona bening -

4

Tanah

limbah

kimia

e.coli 2,4 1,9 2,2 2 2,125

S. aureus 0,8 0,7 0,9 0,8 0,8

5 Tanah limbah

kimia

e.coli 0,9 1,1 0,6 0,9 0,875

S. aureus 0,6 0,3 0,2 0,2 0,325

6 Tanah

makam

e.coli 1,1 1,4 0,9 1,3 1,175

S. aureus Tidak terdapat zona bening -

7 Tanah

makam

e.coli 0,4 0,6 0,9 0,1 0,5

S. aureus Tidak terdapat zona bening -

8 Tanah

makam

e.coli Tidak terdapat zona bening

-

S. aureus -

9 Tanah

makam

e. coli Tidak terdapat zona bening

-

S. aureus -

10 Tanah

makam

e.coli 0,5 0,4 0,2 0,3 0,35

S. Aureus Tidak terdapat zona bening -

VI. Pembahasan

Pada praktikum kali ini akan melakukan isolasi jamur baik dari

tanah maupun tumbuhan dan kelompok kami memilih untuk menggunakan

tanah. Isolasi ini bertujuan agar dapat dengan mudah untuk melakukan

identifikasi dan mengetahui spesies jamur yang menghasilkan antibiotik.

Sampel tanah yang digunakan adalah tanah yang diambil dari belakang

laboratorium kimia yang dicurigai telah terkontaminasi oleh bahan-bahan

kimia. Dalam pengambilan sampel sebaiknya mengambil tanah yang kering

untuk meminimalisir kandungan air. Semakin banyak kandungan air pada

tanah maka penimbangan tanah juga semakin tidak akurat sehingga sampel

tanah perlu dioven terlebih dahulu.

Isolasi tanah dilakukan dengan melakukan pengenceran pada tanah

hingga tingkat pengenceran 10-2. Langkah yang harus dilakukan yaitu

dengan menimbang terlebih dahulu sampel tanah sebanyak 1 gram.

Kemudian memasukkan tanah ke dalam labu takar ukuran 10 ml dan

menambah aquades hingga tanda batas serta mengocoknya hingga

homogen. Mengambil larutan sebanyak 1 ml dan melakukan pengenceran

hingga 10-2. Memasukkan sebanyak 0,5 ml suspensi tanah pada tingkat

pengenceran 10-2 dengan teknik pour plate pada cawan petri yang telah

terdapat Media PDA (Potato Dextrose Agar) padat. Media PDA dan alat-

alat harus disterilisasi terlebih dahulu dengan autoklaf untuk meminimalisir

terjadinya kontaminan. Penggunaan media PDA dengan tujuan agar

mikroorganisme yang tumbuh pada media hanya jamur. Selain

menggunakan media pertumbuhan jamur, untuk lebih meminimalisir

terjadinya kontaminasi dari bakteri ditambahkan antibiotik sulphametazole

dalam media PDA karena antibiotik suphametazole bersifat menghambat

pertumbuhan bakteri. Setelah itu, membungkus dengan koran dan

diinkubasi selama 3 hari dengan suhu 37oC. Perlakuan inkubasi selama 3

hari dikarenakan jamur memiliki waktu tumbuh yang lebih lama daripada

bakteri yaitu berkisar antara 3-5 hari.

Pengamatan dilakukan pada hari ke-3 dan didapatkan jamur dengan

warna yang beragam. Ada yang berwarna putih dan hijau. Pengamatan kali

ini tidak menghitung jumlah koloni jamur tetapi hanya melihat berapa jenis

jamur yang terdapat pada sampel tanah. Setelah itu, jamur putih dan hijau

diisolasi kembali pada media PDA yang baru sehingga akan terdapat 2

cawan petri yang masing-masing akan ditumbuhkan jamur dengan warna

yang berbeda-beda. Isolasi jamur dilakukan dengan hanya mengambil

sedikit spora dengan jarum ose steril dan mengetukkan pada media PDA

baru. Isolasi jamur harus dilakukan secara aseptis untuk meminimalisir

terjadinya kontaminan bakteri. Setelah itu, dibungkus dengan koran dan

diinkubasi dengan suhu kamar selama 3 hari.

Pengamatan dilakukan kembali pada hari ke-3 setelah praktikum ke-

II dan didapatkan hasil yaitu pada setiap cawan petri terdapat 1 koloni jamur

dengan hifa warna putih. Warna jamur atau warna spora pada cawan petri

mengikuti warna spora yang diketukkan pada setiap cawan petri. Apabila

hasil yang didapat sesuai dengan yang diinginkan, maka dilanjutkan pada

tahap ke-III.

Tahap ke-III bertujuan untuk mengamati daya hambat jamur pada

sampel tanah. Dalam pengamatan daya hambat, diperlukan inokulum

bakteri uji. Jenis bakteri yang digunakan yaitu Eschericia Coli dan

Staphylococcus Aureus. Pengunaan bakteri tersebut dikarenakan memiliki

sifat yang bertolak belakang yaitu bakteri E.Coli yang bersifat gram negatif

sedangkan bakteri S.Aureus yang bersifat bakteri gram positif. Inokulum

bakteri dibuat dengan membuat suspensi bakteri dan kekeruhan suspensi

disesuaikan dengan larutan Mc.Farland 0,5. Larutan Mc.Farland dapat

dibuat dengan mencampurkan larutan asam sulfat dan barium klorida.

Setelah membuat suspensi bakteri, selanjutnya yaitu memindahkan 0,1 ml

suspensi bakteri E.Coli pada cawan petri I yang telah dibagi menjadi 5

bagian. Kemudian menambahkan media NA dan menunggu hingga padat.

Begitu juga dengan pemindahan suspensi bakteri S.Aureus yaitu dengan

memindahkan 0,1 ml suspensi bakteri S.Aureus pada cawan petri II yang

telah dibagi menjadi 5 bagian. Kemudian menambahkan media NA dan

menunggu hingga padat.

Selanjutnya yaitu membuat plug pada media NA cawan petri I yang

telah memadat dan membuang plug media NA. Hasil koloni jamur pada

tahap ke-2 juga dibuat plug pada media PDA yang ditumbuhi koloni jamur.

Setelah itu menempatkan plug PDA pada plug media NA pada daerah.

Perlakuan yang sama juga pada media NA cawan petri II yaitu membuat

plug pada media NA cawan petri II yang telah memadat dan membuang

plug media NA. Hasil koloni jamur pada tahap ke-2 juga dibuat plug pada

media PDA yang ditumbuhi koloni jamur. Setelah itu menempatkan plug

PDA pada plug media NA pada daerah. Penempatan plug PDA disesuaikan

dengan nama kelompok sehingga daerah 1 untuk plug PDA dari kelompok

1 dan seterusnya. Selanjutnya dilakukan pengamatan selama 3 hari berturut-

turut. Hasil yang didapat yaitu pada daerah kelompok 4, setiap harinya zona

bening yang terbentuk semakin luas. Pada awalnya memang hanya sebatas

garis plug, namun pada hari ke 3 sudah terbentuk zona bening pada cawan

yag berisi bakteri Eschericia Coli seluas 2,125 cm dan pada cawan yang

berisi bakteri Staphylococcus Aureus seluas 0,8 cm. Dari luas zona bening

yang didapat dapat ditarik kesimpulan bahwa antibiotic yang dihasilkan

jamur yang kami isolasi lebih efektif untuk menghambat bakteri gram

negative daripada gram positif. Namun terdapat kekurangan dalam

praktikum ini karna tidak ada perlakuan lebih lanjut terhadap jamur yang

telah diisolasi sehingga kami tidak mengetahui jenis jamur yang telah

ditumbuhkan. Terdapat juga keanehan terhadap praktikum kali ini karna ada

beberapa sampel yang diambil dari tempat yang sama, namun hasil yang

ditunjukkan berbeda, seperti pada kelompok 8 dan kelompok 9, meski

sama-sama menggunakan sampel dari tanah makam namun jamur yang

diisolasi oleh kedua kelompok tersebut tidak dapat menghasilkan zona

bening yang digunakan sebagai parameter kemampuan daya hambat atau

antibiotik yang dihasilkan oleh jamur. Hal ini dapat dikarenakan perbedaan

dalam proses, baik dalam hal keseterilan maupun tanah yang digunaka bias

saja tanah yang masih basah dan tidak melalui proses pengeringan terlebih

dahulu. Namun rata-rata percobaan dari setiap kelompok menunjukkan

bahwa jamur yang dihasilkan dapat menghambat pertumbuhan bakteri

Eschericia Coli kecuali kelompok 8 dan 9, dan hanya beberapa kelompok

saja yang dapat meghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus Aureus.

VII. Kesimpulan

1. Dari data pengamatan didapatkan hasil bahwa antibiotic yang

dihasilkan jamur yang kami isolasi lebih efektif untuk menghambat

bakteri gram negative daripada gram positif

2. Dari hasil percobaan yag telah dilakukan diketahui bahwa luas zona

bening pada inoculum bakteri Eschericia Coli 2,125 cm adalah dan

pada bakteri Staphylococcus Aureus adalah 0,8 cm.

3. Tidak diketahui jenis jamur penghasil antibiotic pada percobaan kali ini

karna tidak ada perlakuan lebih lanjut terhadap jamur yang telah

diisolasi.

VIII. Saran

1. Saat melakukan praktikum harus benar-benar dengan steril

2. Saat melakukan isolasi, hendaknya tidak hanya satu jenis

mikroorganisme yang diisolasi, namun semua jenis yang ada pada

cawan petri sehingga dapat dibandingkan antara mikroorganisme

yang menghasilkan antibiotik

IX. Daftar pustaka

Schegel, H., 1994. Mikrobiologi Umum. UGM-Press : Yogyakarta.

Buckle, K.A. 1987. Ilmu Pangan. Universitas Indonesia : Jakarta.

Fardiaz, S. 1992.Mikrobiologi Pangan I . PT Gramedia Pustaka

Utama : Jakarta.

Hadioetomo,R.S.1993 .Mikrobiologi Dasar dalam Praktek : Teknik dan

Prosedur Dasar dalam Praktek. PT Gramedia Pustaka Utama :

Jakarta.

Irianto, K. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. CV.

Yrama Widya : Bandung.

Pelczar,M.J dan E.C.S Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Universitas

Indonesia Press : Jakarta.

Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Erlangga :Jakarta.

X. Lampiran