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LAS CEPAS ATCC Herramienta indispensable en el Control

de Calidad Interno en Microbiología.

MARIA ISABEL MONTOYA ROMEROEspecialista en Microbiología ClínicaDirectora Técnica – Coordinadora de Calidad

Instituto Colombiano de Medicina Tropical

TEMAS DE INTERES

� Definición y Generalidades Cepas ATCC� Historia ATCC – MicroBiologics� Clasificación� Reconstitución y Almacenamiento� Registro y control� Usos en el control de Calidad interno� Ventajas de ingresar a un programa de

licencia derivada.

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Que son las Cepas Referencia

� Cepas Certificadas: es un material biológico de referencia certificado.La colección certifica que se suministra una determinada cepa, que es un cultivo puro, y que se han observado las convenientes pruebas morfológicas, bioquímicas y molecularescorrespondientes.

Adquisición de las Cepas de Referencia

Obtención directa a partir de una colección nacional e internacional reconocida, con su respectivo Registro y Certificado.

� CEPAS NCTC: National Collection of type Cultures. Londres.

� CNCM: Colection Nationale de Cultures of Microorganismes. Paris, Francia.

� ATCC: American Type Culture Collection. Rockville, EU

� CCTM: Collection Nationale de Cultures de Microorganismes. Institut Pasteur

� NCYC: National Collection of Yeast Cultures. Norwik UK.

� NCIBM: National Collections of industrial and Marine Bacteria.

� CECT: Colección española de cultivos tipos.

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Generalidades de la ATCC

� La colección que almacena la ATCC se inició en 1925, sobre una colección de bacteriología iniciada en 1911. Es una organización en la que participan actualmente 21 sociedades científicas.

� En la actualidad mantiene colecciones de Bacteriología, Cultivos celulares, Plásmidos, Ácidos nucleicos y Genotecas, Micología y Botánica, Protistología y Virología.

Quien es ?

�El primer fabricante de productos Biologicos (microorganismos liofilizados) para el control de calidad, con licencia aprobada por ATCC®®

Patente de distribución ATCC desde el año 2004

� 35 Años en el Mercado- Laboratorio Comercial (1971)- Fabricante de Medios de Cultivo Preparados (1975)- Microorganismos para el Control de Calidad (1982)- 100% Devoción a los Productos para el Control de Calidad Microbiológico (1996).

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PRINCIPIO DEL SISTEMA DE LIOFILIZACIÓN

� Gelatina: medio transporte� Leche descremada,acido ascórbico, dextrosa y

carbón activado: Agentes Crioprotectores (preservan pared celular, evitan deshidratación por congelación).

� Carbón Vegetal: Neutraliza sustancias toxicas generadas por la liofilización

� El Certif icado es entregado personalmente por LABCARE a los Usuarios Finales de MicroBioLogics para que el laboratorio lo presente como soporte mientras las Cepas estén siendo utilizadas exclusiv amente en los procedimientos del Control de Calidad.

� El Certif icado v alida la trazabilidad y autenticidad de las metodologías y controles hechos por los Usuarios Finales clínicos e industriales ante la ATCC y organismos de v erif icación.

� Si el prov eedor de microorganismos no puede entregar un CERTIFICADO DE CONFORMIDAD, estos materiales no son auténticosATCC.

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CLASIFICACION CEPAS ATCC

� Cepas de Referencia.

� Cepas de Reserva.

� Cepas de Trabajo.

CEPAS DE REFERENCIA

� A fin de demostrar la trazabilidad : las cepas de referencia deben obtenerse directamente de una colección con la reseña nacional o internacional de cultivo de referencia reconocido.

� "ISO 11133-1:2000", son: microorganismos definidos, por lo menos a nivel de género y especie, catalogados, caracterizados y de origen conocido

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CEPAS DE REFERENCIA

� Son distribuidas y presentadas comercialmente liofilizadas; los organismos de acreditación son los encargados de considerar válida la fuente de procedencia de la cepa a fin de que se cumpla con el requisito de prevenir mutaciones, deterioro o alteración de las características típicas de las cepas.

� El número de repiques a partir de la cepa de referencia a de ser limitado, aceptándose hasta cuatro pases como máximo a partir de la cepa o semilla original de referencia.

PRESENTACION

KWIK-STIK™ Plus

KWIK-STIK™

LYFO DISK®

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CEPAREO

Reconstitucion:� Las Cepas de referencia son almacenadas entre

2-8 ºC hasta su uso.� En la reconstitución y siembra de la Cepas de

referencia, se utilizan medios de cultivo de enriquecimiento, las condiciones de incubación y el procedimiento de almacenamiento varia para cada tipo de microorganismo.

� Boletin de informacion tecnica TIB.081 “Recommended Growth Requirements”

� www.microbiologics.com� Requerimientos:Hidratacion,Medios de

cultivo,Incubacion(atmosferas y Tiempo).� Las Cepas de referencia serán sometidas

a un control de calidad de pureza y viabilidad, así se le dará registroCepas ATCC\kwik.pdf. Cepas ATCC\lyfodisk.pdf

CEPAREO

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CEPAS DE RESERVA

� Son cepas idénticas logradas mediante un único subcultivo de una cepa de referencia.

� Son preparadas y conservadas en el laboratorio, dentro del cual se destina un lugar para su almacenaje, se trata de cepas potencialmente peligrosas y cuya manipulación queda exclusivamente restringida al personal autorizado.

� Cada Vial debe estar perfectamente identificado con el nombre de la cepa, procedencia y fecha de congelación

CEPAS DE RESERVA

� Las Cepas de Reserva una vez descongeladas no deben volver a Congelarse.

� Los métodos para la preservación y mantenimiento de cepas de reserva son la LIOFILIZACIÓN y la CONGELACIÓN A BAJAS TEMPERATURAS.

� Se da el uso de agentes Crioprotectores

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CEPA DE TRABAJO

� Se obtienen por subcultivo de las Cepas de Reserva

� Se subcultivan en medios sólidos de enriquecimiento apropiados para C/microorganismo

� Se debe Verificar la calidad, pureza y morfología típica del subcultivo

� Nunca subcultivarlas para sustituir a las cepas de Reserva

Cepas de Referencia

Sub cultiv ada una sola v ez

Cepa de Reserv a (Liofilización, nitrógeno liquido, ultra congelación rápida etc.)

Especificar tiempo y condiciones de Almacenamiento

Mantener en las condiciones específ icas

Descongelación / Reconstitución

Cepa de TrabajoEspecificar tiempo y condiciones de almacenamiento

No permitido

Subcultiv ar una sola v ez

USO RUTINARIO

Maximo 8°Pases

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Cepa Ref erencia ≤≤≤≤ 4°Pasajes

Pase de Reconstitución 5°Pasaje

6°Pasaje

AlmacenamientoCepas Reserv a en 6 °Pasaje

7°Pasaje

8°Pasaje

Registro y Control de Cepas ATCC

� Identificación de la cepa.� Género y especie del

microorganismo� TIPO y Nº de colección.� Nº de lote.� Fecha de recepción.� Fiche de reconstitucion.� Control de calidad de la

cepa de referencia Conforme (SI/NO).

� Fecha de caducidad de la cepa.

� Personal responsable.

Control de calidad de pureza y viabilidad:

� Se realiza a diferentes niveles del proceso

� cada vez que se realiza un replique.

� El objetivo: asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus caracteres bioquímicos.

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HOJA DE REGISTRO CEPAREO

UTILIDAD DE LOS CULTIVOS DE REFERENCIA ATCC EN EL QC INTERNO

1.Evaluar la calidad de los medios de cultivo.2.Asegurar la calidad de los resultados de ensayos

de laboratorio (coloraciones y desempeño de reactivos)

3.Validar métodos microbiológicos.(Pruebas de Sensibilidad)

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El Control de la Calidad en la preparación y evaluación de los Medios de Cultivo

� Una esencial y buena práctica de laboratorio, necesaria para mantener el nivel y la ejecución de cualquier técnica microbiológica.

� Es un proceso continuo que se extiende desde las materias primas, a través del productor hasta el producto final utilizado en el laboratorio.

� Por esta razón, se le confiere una gran importancia y está considerado como uno de los puntos críticos de control en el análisis microbiológico, del cual depende la seguridad de los resultados que emiten los laboratorios de ensayo.

EVALUACIÓN DE EFICIENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

� Cada lote preparado de medio de cultivo se prueba antes de su uso rutinario, por eficiencia o calidad, mediante la inoculación de microorganismos cuyo comportamiento conocemos, tanto para reacciones positivas como negativas.

� Si los medios de cultivo son suministrados por empresas fabricantes hay que solicitar Certificado de Calidad. Es de prioritario cumplimiento evaluar el desempeño de:

Agar ChocolateAgar Thayer Martín

Agar SangreAgares suplementados con AntibioticosAgares Cromogenicos

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PROTOCOLO DE CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

1. ASPECTO FISICO: NIVEL, VOLUMEN, SUPERFICIE, COLOR, EMPAQUE

2. CONTROL DE ESTERILIDAD: 5% DE LA PRODUCCIÓN TOTAL Y SE INCUBA DURANTE 72 HORAS (CUARENTENA).

- Se ACEPTA lotes negativ os.

- Se descarta todo el lote preparado si hay crecimiento Microbiano.

4. CONTROL DE PH

3. CALIDAD MICROBIOLOGICA: Método ECOMETRICO

Prueba de PRODUCTIVIDAD y SELECTIVIDAD: Medios Sólidos y Líquidos.

CEPAS DE REFERENCIA ATCC

- Cada v ez que se prepare un Lote nuev o de un Medio de Cultiv o.

- Cada v ez que ingrese un Medio de Cultiv o Nuev o al Laboratorio.

- Cada v ez que un medio de cultiv o supere su f echa de caducidad

METODO ECOMETRICO

Es una técnica simple que permite Recuperar, Comparar y Cuantificar el crecimiento de microorganismos ATCC con cargas de UFC definidas en diferentes medios de Cultivo con el fin de evaluar su MANUFACTURA.

� TECNICA ECOMETRICA DE MOSSEL (RADIAL)

� MÉTODO ECOMETRICO MODIFICADO de MILES y MISRA

A. PRUEBA DE PRODUCTIVIDAD Y SELECTIVIDAD PARA MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS.

B. PRUEBA DE PRODUCTIVIDAD Y SELECTIVIDAD PARA Y SELECTIVIDAD PARA MEDIOS DE CULTIVO LIQUIDOSMEDIOS DE CULTIVO LIQUIDOS..

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PRODUCTIVIDAD

� Determina el Rendimiento, Recuperación y crecimiento de microorganismos que habitualmente se desarrollan en un medio de cultivo.

SELECTIVIDAD

� Evalúa la supresión del crecimiento del microorganismo, que se espera sea inhibido en el medio.

PRUEBA DE PRODUCTIVIDAD Y SELECTIVIDAD PARA MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS

METODO CUANTITATIVO: MODELO DE MILES Y MISRA.

Para medios muy exigentes o para comparar Medios

-1 -2 -3 -4 -5 -6

450 uL s.s

CEPA CEPA REFERENCIA REFERENCIA

EN BHI 18EN BHI 18--24. 24. ANTESANTES

50uL 50uL50uL

1’000000 a 10 UFC

Control positivo en una Agar Nutritivo: Agar chocolate

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-1

-2

-3-4

-5

-6

10 uL

METODO CUANTITATIVO: MILES Y MISRA

IR: RAZON DE PRODUCTIVIDAD Y RAZON DE SELECTIVIDAD

� Incubar : 37ºC x 18 Horas

� Contar el numero de colonias presente en cada una de las diluciones

� Calcular IR

� RP: 70% a 80%

� RS: 0.1% a 0%

IR: Nº de colonias presentes x Factor dilución

Nº de colonias Control x Factor dilución

Interpretación Metodo Ecometrico

� PRODUCTIVIDADCrecimientos por encima de la 5º dilución.(100 UFC)

� SELECTIVIDADInhibicion completa y/o crecimiento unicamente en la 1º dilución.(1’000.000 UFC)

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� Obligatoriamente se debe probar cada lote nuevo de Mueller-Hinton y cada lote de sensidiscos.

Realizar el control cada semana.

� En caso de fallas en los halos de inhibición se debe realizar diariohasta encontrar la causa…..Agar, T°, McFarlan, Discos etc.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTO

• Discos de Antimicrobianos

• Tubos con Sln Salina estéril o caldo nutritivo

• Placas de MH, MH con sangre de cordero 5%, MH-chocolate,

• Escala de McFarland

�En caso de Galerías Automatizadas, el QC interno es de acuerdo a la casa Comercial, pero no inferior a una vez cada mes.

Control de calidad en determinación de

sensibilidad a antimicrobianos

21 – 22 ml

pH de 7.2- 7.4AGAR MUELLER HINTON

McFarland 0.5%

DO 625 nm

Absorbancia de 0.08 – 0.1

1.5 x 10 (8) UFC

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CONTROL DE CALIDAD ANTIBIOGRAMA

Control de difusión de antibioticos Cepas ATCC

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Valores Referencia: diámetro de las zonas de inhibición en mm según la OMS

Test Discos E.coliATCC

25922

S. aureusATCC 25923

Pseudomona aeuriginosa

ATCC 27853

Enterococcus feacalis

ATCC 29212

Ampicilina 10 ug 15-20 mm 24-35 mm --- ---

Tetraciclina 30 ug 18-25 mm 19-27 mm --- ---

Gentamicina 10 ug 19-26 mm 19-27 mm 16-21 mm ---

Imipenem 10 ug 26-32 mm --- 20-28 mm ---

Polimixina B 300 IU 12-16 mm 7 -13 mm --- ---

Sulfamethoxazole 1.25 ugTrimehoprim 23.75 ug

24 - 32 mm

24 -32 mm

--- 16 -23 mm

OTROS..\NORMAS NCCLS M2 A7 Doc.doc

S.SMcFarland 0.5

Cepa ATCC

Suspensión de Cepa ATCC hasta 0.5 McFacland.

Agitado en VOrtex

Sembrado homogéneo con torunda, por estría con rotación por tres veces

Colocar sensidiscos con dispensador o pinzas flameadas y frías. < 15´.

Encubar por 18 horas a 35 + 2 ºC.

En estafilococos y estreptococos por 24 horas completas.

Leer con regla y establecer que estén dentro de los rangos de la tabla de ref erencia para cada cepa analizada.

Control de Calidad en determinación de sensibilidad a Antimicrobianos

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Nota: Las normas LSCCI/NCCLS sugieren un control de calidad diario y semanal. De no tener las facilidades, se sugiere un control de calidad mensual, debiendo incrementar la frecuencia del mismo de acuerdo a las posibilidades del laboratorio. Pero, se debe realizar por lo menos un control de calidad quincenal para los siguientes antibióticos: Oxacilina, imipenen, meropenem y beta-lactamasa.

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Control de Calidad Interno de losReactivos Empleados

� Las Cepas Util izadas para control deben ser SIEMPRE cepas Referencia� Los Controles deben efectuarse con Cultivos Frescos

� En general se deben usar dos Tipos de Cepa para probar cada Reactivo o Reacción,idealmente para probar reacciones débiles y Fuertes y variaciones en el tiempo de los reactivos.

� Las Coloracionesdeben siempre controlarse con controles Positivos y Negativos, Tanto las de rutina como las especiales

� Las Tinciones especialesdeben controlarse en cada Tanda o serie de trabajo, las de Rutina una vez por semana y en cada lote nuevo de colorantes.

Frecuencia de Control Reactivos – Discos y Tiras

Catalasa – Oxidasa – Coagulasa - Sondas de ADN

CADA NUEVO LOTE O VIAL Y CADA DIA DE USO

CADA NUEVO LOTE Y CADA SEMANA DE USO

Bacitracina - Optoquina - ONPG - Factores X-V-XV -Betalactamasa - Indol - PYR - CAMP

CADA NUEVO LOTE Y CADA MES

Antisueros - Kits Comerciales de Identificación – Patron Mcfarland

Control de Calidad Interno de los Reactivos Empleados

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QUE ES EL PROGRAMA ATCC®

DE DERIVADO LICENCIADO?

Es un programa amplio de distribución comercial que asegura la autenticidad de los Materiales Biológicos de ATCC, que son distribuidos porcompañías elegidas por sus credenciales de Sistemas de Calidad, cuidadosas auditorias, investigación y evaluación continua de los productos por parte de ATCC.

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PROPOSITO DEL ATCC® LICENSED DERIVATIVE PROGRAM ™

� Incrementar los requerimientos de Control de Calidad de los laboratorios clínicos e industriales.

� Proporcionar los productos derivados de Cultivo de Referencia a costos accesibles.

� Crear, a través de las compañías comerciales, las tecnologías que permiten ahorrar tiempo bajar los costos del Control de Calidad.

� Beneficiar el Usuario Final con las validaciones de los fabricantes autorizados – el final de los cultivos “in-house”.

TRAZABILIDAD SEGURA

El Programa asegura la trazabilidad de los Materiales Biológicos desde su origen en ATCC, a través de los procesos de manufactura de la compañía, el almacenamiento físico, el manejo y envío del producto desde el fabricante, pasando por los canales de distribución hasta llegar al Usuario Final.

Los acuerdos contractuales unen a todas las partes de este proceso en una “cadena de custodia y cadena de responsabilidad” adecuándose a nuestro mundo actual.”

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¿QUE SIGNIFICA EL “LDP” PARA EL LABORATORIO DEL USUARIO FINAL?

� Acceso fácil y económico a las fuentes de Materiales Biológicos de ATCC®

� Autenticidad y trazabilidad a los Cultivos de Referencia de ATCC®

� Avance tecnológico en productos de Materiales Biológicos para satisfacer las demandas del Control de Calidad

� Confianza en un Sistema Mundial de proveedores legalmente autorizados y licenciados de Microorganismos para Control de Calidad

¿EN QUIENES PODEMOS CONFIAR?

� En los proveedores comerciales de Materiales Biológicos cuyos números de referencia ATCC®

estén aprobados, autorizados y licenciados.

� Cualquier compañía comercial, instituto o colección de cultivos que no esté licenciada o autorizada para comercializar los Materiales Biológicos de ATCC®

está operando fuera de los Acuerdos de Transferencia de Material (MTA) y del aseguramiento de autenticidad de ATCC®

� Los Usuarios Finales no tienen ninguna garantía acerca de la validez y exactitud de datos generados al usar productos de proveedores no licenciados

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“Sólo es posible avanzar cuando se

mira lejos. Solo cabe progresar cuando se piensa en grande”.

José Ortega y Gasset

mimontoya@ces.edu.coTEL: (4) 305 35 00 EXT 312

www.microbiologics.com