LE FORME INVISIBILI Le proteine: dai cristalli alle ... · ratorio di biologia e genetica molecolare e di percorsi ... un test di valutazione e un cd con slide per tenere ... e i

Centro Università di Milano-Scuola per la diffusione delle Bioscienze e delle Biotecnologie

LE FORMEINVISIBILI

In collaborazione conDipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie - Università di Milano

Dipartimento di Fisica - Università di Genova

Le proteine:dai cristalli alle strutture 3D

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PARTE 1 Laboratorio di cristallografia 3

PARTE 2 Laboratorio di bioinformatica 6

Risposte 17

Il CusMiBio è un centro dell’Università degli Studi di Milano e dell’Ufficio Scolastico Regionale dellaLombardia per la formazione ed educazione permanente sulle Bioscienze e sulle loro applicazioni bio-tecnologiche, rivolto agli insegnanti e agli studenti della scuola superiore di secondo grado. Gli spazia disposizione del Centro, un totale di 150 mq situati al settore didattico dell’Ateneo milanese, consi-stono in due laboratori, uno di Bioscienze e uno di Bioinformatica, più uno studio per 2 docenti dellascuola superiore distaccate dall’Ufficio Scolastico Regionale per seguire le attività di laboratorio delCusMiBio. I laboratori sono dotati di strumentazione di alto contenuto tecnologico e mettono a dispo-sizione degli studenti visitatori 35 postazioni attrezzate, adatte alla realizzazione di esperienze in labo-ratorio di biologia e genetica molecolare e di percorsi bioinformatici al computer (il laboratorio diBioinformatica dispone di 16 computer in rete), per accedere e utilizzare le informazioni contenutenelle maggiori banche dati biomediche. I percorsi didattici proposti dal CusMiBio sono il risultato dellavoro collaborativo di alcuni docenti di UniMi e di gruppi di insegnanti della scuola superiore cheinsieme producono dei veri e propri teaching kits, contenenti le procedure di laboratorio, il manuale,un breve testo teorico, un test di valutazione e un cd con slide per tenere lezioni multimediali. Trova-te l’elenco dettagliato delle attività e tutti i riferimenti per contattare il centro sul sito del CusMiBiowww.cusmibio.unimi.it.

Questo manuale è stato realizzato in collaborazione con Mondadori Education. È possibile scaricare laversione elettronica dei PDF all’indirizzo www.pianetascuola.it/risorseweb/scheda/biologi-molecolari.Dalla stessa pagina è possibile scaricare l’intero volumetto Biologi molecolari in classe allegato alcorso Biologia in evoluzione, Alters & Alters, Le Monnier Scuola, contenente altre attività didattiche.

SOMMARIO

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Le proteine: i cristalli

sperimenterete una delle tecniche più utilizzate di cristallizazione delle proteine;monitorerete al microscopio la formazione dei cristalli, identificando le condizioni sperimentali in cui si sonoottenuti i cristalli migliori;imparerete a conoscere le procedure che, partendo dall’analisi dei cristalli, consentono di determinare lastruttura tridimensionale delle molecole proteiche.

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Laboratorio di cristallografia

La medicina del futuro si fa in 3D. L’obiettivo del laboratorio è quello difar sperimentare, in un sistema semplice ed attuabile dal grandepubblico, la tecnica di cristallizzazione delle proteine.In questa esperienza di laboratorio gli studenti determinano le condizioniottimali per la cristallizzazione di una proteina e, successivamente, analiz-zano al computer la struttura della proteina in esame con particolare rife-rimento alle interazioni proteina-proteina che permettono la formazione delreticolo cristallino ordinato.Avendo a disposizione un cristallo ordinato contenente una proteina èpossibile, con tecniche sofisticate, ricostruire il modello tridimensionaledella struttura della molecola.

IN QUESTA ATTIVITÀ

LE FORME INVISIBILI – PARTE

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PARTE 1 LE FORME INVISIBILI

2. Le tecniche per la determinazione della strutturatridimensionale delle proteine

1. Cristallizzazione di una proteina mediante latecnica della diffusione di vapore L’esperienza di laboratorio consiste nella cristallizzazione median-te la tecnica della diffusione di vapore (in configurazione di “gocciaseduta” o “sitting drop”) della proteina lisozima, un enzima che sicomporta come agente battericida essendo in grado di distruggerele pareti cellulari dei batteri.Nell’uomo tale proteina è particolarmen-te abbondante nelle secrezioni quali lacrime,muco e saliva.

Protocollo di cristallizzazione

Nell’esperimento che utilizza la tecnica della diffusione di vapo-re la proteina lisozima (costituita da 129 amminoacidi ed estrat-ta da albume di uovo di gallina) viene cristallizzata equilibran-do una goccia contenente una miscela 1:1 di proteina e di solu-zione di cristallizzazione contro la stessa soluzione di cristalliz-zazione contenuta in un pozzetto sottostante la goccia.Il sistema goccia-pozzetto viene sigillato con un opportuno na-stro adesivo trasparente.Per questo esperimento la soluzione precipitante è costituita dauna miscela Na-acetato e NaCl.

Agli studenti verranno fornite le seguenti soluzioni già pronte:1) soluzione tampone:Na-acetato (pH 4.0) alla concentrazione 1M2) soluzione tampone:Na-acetato (pH 4.6) alla concentrazione 1M 3) soluzione tampone:Na-acetato (pH 5.0) alla concentrazione 1M4) soluzione tampone:Na-acetato (pH 5.4) alla concentrazione 1M5) soluzione precipitante: NaCl alla concentrazione 4M 6) soluzione proteica: lisozima disciolto in H2O alla concentrazio-

ne di 40 mg/ml

Il metodo della diffusione di vapore è una delle tecniche usate piùfrequentemente per ottenere cristalli di proteina. Nella figura ac-canto si possono vedere le due fasi del protocollo.(A) Una goccia di proteina di alcuni ml viene mescolata ad unagoccia di pari volume di soluzione di cristallizzazione prelevatadal pozzetto.(B) Il pozzetto viene sigillato ed il processo di cristallizzazione co-mincia sfruttando la distillazione di H2O dalla goccia al pozzetto(diffusione di vapore).

1.1

Preparazione delle prove dicristallizzazione

a) Pipettare 0.5 ml di soluzione di cristallizzazione (composta dasoluzione precipitante + soluzione tampone + H2O) nei 24 poz-zetti della piastra di cristallizzazione seguendo lo schema sotto ri-portato:b) Pipettare 2 µl di soluzione proteica nel ponticello presente alcentro del pozzetto di cristallizzazione.c) Aggiungere alla soluzione proteica 2 µl di soluzione di cristal-lizzazione (presa dal pozzetto) e mescolare.La goccia finale avràquindi un volume di 4 µl.d) Sigillare il pozzetto di cristallizzazione con il nastro adesivo tra-sparente per prevenire l’evaporazione della goccia e per garanti-re il corretto raggiungimento dell’equilibrio di vapore necessarioper la cristallizzazione della proteina.e) Mantenere le prove di cristallizzazione alla temperatura costan-te di 21 °C.f) La formazione dei cristalli sarà monitorata mediante microsco-pio ottico dopo 2 ore. Per raggiungere la loro dimensione massi-ma i cristalli impiegheranno alcuni giorni. Eventuali additivi pos-sono essere aggiunti all’atto della preparazione delle prove di cri-stallizzazione per accelerare la crescita cristallina.g) Paragonando i risultati ottenuti nelle 24 prove di cristallizzazio-ne sarà possibile identificare le migliori condizioni di cristallizza-zione della proteina.

1.2

A B

La diffrazione ai raggi XÈ una tecnica non distruttiva utilizzata per l’analisi qualitativa equantitativa dei materiali cristallini, in polvere o allo stato solido.Sfrutta il fatto che qualunque radiazione elettromagnetica è in gra-do di interagire con la materia attraverso due processi principali:• l’assorbimento, nel corso del quale la radiazione cede tutta o

parte della propria energia al sistema materiale, aumentandonela temperatura o determinandone la transizione ad uno stato ec-citato.Nel caso dei raggi X, la radiazione incidente ha energia suf-ficiente per provocare transizioni elettroniche, ed espellere elet-troni dagli atomi (effetto fotoelettrico);

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PARTE 1LE FORME INVISIBILI

• la diffusione (scattering),nel corso della quale la radiazione vie-ne diffusa dalla materia e le onde elettromagnetiche a questa as-sociate cambiano direzione di propagazione. Questo cambia-mento può essere accompagnato da scambio di energia tra foto-ni e materia.Questa metodologia di analisi consiste in una serie di passaggioperativi.Si parte con la cristallizzazione della macromolecola,unpassaggio che presuppone la disponibilità di un cristallo ordina-to contenente la proteina.Cosa non sempre scontata,dal momen-to che i cristalli ben formati crescono con difficoltà, in quanto leproteine sono molecole irregolari che difficilmente si impaccanoordinatamente.Spesso poi i cristalli e le strutture che noi conoscia-mo contengono anche molecole di solvente con il quale la mo-lecola è stata cristallizzata. Una volta ottenuto il cristallo lo si po-siziona tra la sorgente di raggi X e il rivelatore. Gli atomi del cri-stallo di proteina deviano i raggi X dal loro percorso e fanno sì chequesti,colpendo una lastra fotografica,vi producano una caratte-ristica figura di diffrazione (diffrattogramma), costituita da tantemacchie separate, da cui è possibile ricavare una mappa di den-sità elettronica. Si costruisce quindi un modello della struttura del-la molecola compatibile con le mappe di densità elettronica giàconosciute. È necessario utilizzare numerosissime immagini perpoter ricostruire in modo ottimale una struttura tridimensionale.

La risonanza magnetica nucleare Questa tecnica, utilizzata per determinare la struttura 3D di pro-teine relativamente piccole, contenenti fino a 200 amminoacidi,

consiste nel mettere una soluzione concentrata di proteina in uncampo magnetico. Si misurano a questo punto gli effetti di diver-se radio-frequenze sulle proprietà di risonanza dei diversi atomi.Il comportamento di ciascun atomo è influenzato dagli atomi cir-costanti. Dall’ampiezza dell’effetto di tali interferenze è possibilecalcolare le distanze fra gli atomi.Queste distanze sono poi utiliz-zate per generare un modello della struttura tridimensionale del-la proteina.Questa tecnica ha il vantaggio di non richiedere la cri-stallizzazione della proteina.

Dall’analisi dei cristalli allacostruzione della struttura in 3Ddella molecola

Nel periodo intercorrente fra la preparazione delle prove di cri-stallizzazione e l’analisi al microscopio dei cristalli sarà illustratala procedura di raccolta dei dati di diffrazione derivante dall’in-terazione dei raggi X con le molecole proteiche contenute nel cri-stallo. L’analisi di tali dati consentirà la visualizzazione della den-sità elettronica della proteina e la costruzione della sua strutturatridimensionale.Una volta determinata la struttura tridimensiona-le del lisozima verrà visualizzata tramite un opportuno softwaregrafico la disposizione delle molecole proteiche all’interno del re-ticolo cristallino.

2.1

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Le proteine: le strutture in 3D

identificherete le sequenze amminoacidiche di alcune proteine;metterete a confronto proteine simili e ne individuerete le differenze;ricercherete e analizzerete le funzioni delle proteine e i loro eventuali effetti sulla salute umana;analizzerete proteine omologhe appartenenti a specie diverse;proverete a disegnare un farmaco capace di legarsi in modo ottimale a una sostanza tossica e dineutralizzarne gli effetti.

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Laboratorio di bioinformatica

Conoscere nei dettagli atomici come è fatta una macromolecola biologicarappresenta un punto chiave per capirne la funzionalità. Le strutturemacromolecolari sono raccolte in banche dati specializzate e sonoosservabili utilizzando programmi di visualizzazione specifici checonsentono di estrarre informazioni funzionali dalla struttura e diconfrontare fra loro strutture di macromolecole normali con quellecoinvolte in processi patologici. Questi programmi sono inoltre largamenteutilizzati per il disegno razionale dei farmaci e dei vaccini del futuro.

Nello scenario proposto, l’indagine molecolare si rivela fondamentalenell’individuazione e nell’analisi di sostanze tossiche che possono avercausato danni alla salute o morti accidentali. Con questa attivitàcercherete le sequenze di alcune proteine rinvenute nel corpo di unuomo trovato morto. Identificherete le molecole e indicherete quella chepotrebbe aver causato il decesso. Analizzerete i le differenze tra leproteine date e altre molecole omologhe ma appartenenti a speciediverse e con funzioni diverse. Analizzerete la struttura tridimensionaledella sostanza che ha causato il decesso. Imparerete ad interpretare laricostruzione grafica al computer di questa molecola e a rintracciarne glielementi funzionali più importanti. Proverete a progettare un farmaco ingrado di neutralizzare la sostanza tossica.

IN QUESTA ATTIVITÀ

LE FORME INVISIBILI – PARTE

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Il caso di Jack Stevenson

Il ritrovamento del cadavereUn’adetta alle pulizie trova nei bagni dell’aeroporto di Roma ilcadavere di un uomo di mezz’età, all’apparenza un turista ame-ricano.Spaventata lancia l’allarme,che viene raccolto da alcunipassanti, tra cui un medico, il quale si precipita prontamente neipressi dei bagni. Dopo aver attentamente osservato il cadavere,il dottore ipotizza che l’uomo abbia avuto delle convulsioni e siamorto per un’emorragia interna. Richiama poi l’attenzione deipresenti su una bottiglia riversa accanto al corpo, contenentetracce di un liquido dall’aspetto del latte.

L’analisi biomolecolareIntanto un ragazzo è corso ad avvisare i poliziotti incaricati del-la sicurezza in aeroporto.Questi accorrono immediatamente sul-la scena e identificano nella vittima Jack Stevenson,un diploma-tico americano di quarantasei anni.Sequestrano il reperto stesoaccanto al corpo, ordinano che venga sottoposto agli esami dilaboratorio e richiedono un’autopsia del cadavere.I risultati nontardano ad arrivare e presentano i primi elementi utili a chiari-re la dinamica del decesso.

Nel contenuto dello stomaco e nel sangue della presunta vitti-ma, infatti, vengono rilevate alcune proteine sospettate di avercausato la morte del diplomatico.Sarete voi ad analizzare e a identificare le sequenze amminoa-cidiche di queste proteine e a scoprire se una di queste,ed even-tualmente quale, possa aver determinato la morte di Jack Ste-venson.

1. Identificate le proteine sospetteLa ricerca delle sequenzeamminoacidiche

Vi vengono fornite le seguenti sequenze amminoacidiche delle quat-tro proteine sospette rintracciate nello stomaco e nel sangue di Jack:

1.1 • Andate su http://mrs.cmbi.ru.nl/mrs-web/, la home page diMRS,un motore per effettuare ricerche nelle principali banche datibiologiche on-line.• Cliccate poi sul link Blast, posto sulla barra verde in cima allapagina.

> p. sospetta 1 RPKHPIKHQG LPQEVLNENL LRFFVAPFPE VFGKEKVNEL SKDIGSESTE

DQAMEDIKQMEAESISSSEE IVPNSVEQKH IQKEDVPSER YLGYLEQLLR LKKYKVPQLE

IVPNSAEERLHSMKEGIHAQ QKEPMIGVNQ ELAYFYPELF RQFYQLDAYP SGAWYYVPLG

TQYTDAPSFSDIPNPIGSEN SEKTTMPLW

> p. sospetta 2 LIVTQTMKGL DIQKVAGTWY SLAMAASDIS LLDAQSAPLR VYVEELKPTP

EGDLEILLQKWENGECAQKK IIAEKTKIPA VFKIDALNEN KVLVLDTDYK KYLLFCMENS

AEPEQSLACQCLVRTPEVDD EALEKFDKAL KALPMHIRLS FNPTQLEEQC HI

> p. sospetta 3 QQNLPQRYIE LVVVADHRVF MKYNSDLNTI RTRVHEIVNF INGFYRSLNI

HVSLTDLEIWSNEDQINIQS ASSDTLNAFA EWRETDLLNR KSHDNAQLLT AIELDEETLG

LAPLGTMCDP

Che cos’è?

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)È un software per il confronto multiplo trasequenze nucleotidiche e amminoacidiche.Consente di identificare una determinatasequenza appartenente a un gene o a unaproteina ignoti, confrontandola con altresequenze archiviate nei principali databasebiologici e calcolandone il grado di simila-rità con ciascuna di queste. È uno strumen-to utile per ricostruire le relazioni funziona-li ed evolutive tra sequenze diverse e iden-tificare membri di una stessa famiglie geni-ca o proteica.

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li a quella ricercata , la banca dati in cui sono archiviate le se-quenze di queste proteine , il grado di similarità tra la protei-na di partenza e quelle trovate .• Osservate attentamente la schermata: Blast ha individuato nel-la banca dati SwissProt 66 proteine con una sequenza amminoa-cidica simile a quella da voi ricercata. L’E-value di questa ricer-ca, ossia il valore che misura il livello di similarità tra la sequen-za ignota e quelle rintracciate da Blast è molto basso: questo si-gnifica che il risultato della ricerca è molto attendibile.• Cliccate a questo punto sull’intera riga della tabella.Nella nuo-va schermata vi apparirà la hit list, ossia la lista delle proteinesimili a quella ricercata.In prima posizione il software riporta sempre la proteina che mo-stra il più alto grado di somiglianza con la sequenza query, ap-partenente alla proteina di partenza. Nel nostro caso il primo ri-sultato consiste nella casein alpha s1 bovin.

• Osservate la lista. Per ciascuna proteina riconosciuta da Blastcome simile a quella di partenza vengono riportati:- nella colonna ID il codice che identifica nella banca dati la se-quenza della proteina.Esso è costituito dal nome della proteinaseguito dal nome abbreviato dell’organismo di provenienza,che nel nostro caso, per il primo risutato, è quello del bue (figu-ra 2 );- nella colonna Coverage indicazioni relative al livello di corri-spondenza tra la sequenza della proteina da voi cercata e quel-la omologa trovata dal software. In particolare, la sequenza que-ry è rappresentata da una linea grigia, quella trovata da Blast dauna linea colorata. Nel nostro caso il primo risultato della listanon presenta segmenti grigi. Le sequenze p.sospetta1 e

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3

2

2

1 43

Nella colonnaHsps, Bitscoree E-value sonoriportati deivalori calcolatida Blast cheindicano ilgrado diaffidabilitrà deirisultati dellaricerca.

Nella colonnaDescriptionsi trova unabrevedescrizionedelle proteinericonosciutesimili allaquery.

Nella colonnaID sonoriportati icodici con cuile proteinerintracciate daBlast sonoidentificatenelle banchedati.

2

Nella colonnaCoverage ilrapporto tra isegmenti grigi equelli coloratimostra il grado dicorrispondenzatra la proteina dipartenza e quellerintracciate daBlast.

• Nel riquadro bianco che compare al centro della nuova pagi-na inserite la sequenza amminoacidica della proteina sospetta nu-mero 1.La prima riga della sequenza cercata deve sempre comin-ciare con il simbolo > seguito dal nome della proteina per essereconforme con FASTA,il formato di testo standard per la ricerca nel-le banche dati biologiche on-line.• Verificate che sia selezionata l’opzione Filter sequence (lowcomplexity).• Cliccate a questo punto su Run Blast.

La lettura dei risultati prodotti daun motore di ricerca bioinformatico

• Soffermatevi sulla nuova pagina.Qui compare una tabella articolata in diversi campi, che riportaindicazioni circa (figura 1): lo stato di avanzamento della ri-cerca , il numero di proteine riconosciute da Blast come simi-1

1.2

1

2

Alla voce Hits è riportato ilnumero di molecolericonosciute da Blast comesimili al gene o alla proteinaricercata. 1

Alla voce Status si trovanoinformazioni circa lo statodi avanzamento dellaricerca, che può richiederediversi secondi.

4 Alla voce E-value è riportatoil valore che misura il gradodi similitudine tra lasequenza di partenza equelle rintracciate da Blast.

3 Alla voce Databank èindicata la banca dati in cuisono archiviate le sequenzedelle molecole simili a quelladi nostro interesse.

La raccolta di informazioni sulle funzioni e le caratteristiche di una proteina

• Cliccate dunque su casa1_bovin: si aprirà una pagina con di-verse informazioni utili a identificare la proteina e l’organismo dacui proviene ,a scoprire la sua funzione e i suoi effetti sulla sa-lute umana.

• Servitevi delle informazioni contenute nelle sezioni Entry in-formation e Comments,in particolare all’interno dei campi Pro-tein name, From, Keywords, Function per rispondere alle suc-cessive domande relative alla proteina casa1_bovin.

• A questo punto ricercate le sequenze delle altre tre proteine so-spette (vedi pag. 7), analizzate le informazioni ottenute e rispon-dete per ciascuna molecola alle cinque domande precedenti.• Traete infine le vostre conclusioni sul caso di Jack Stevenson.

1

1.4

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casa1_bovin risultano sovrapponibili: dunque corrispondonoperfettamente per tutta la lunghezza ;- nella colonna Description una breve descrizione della sequen-za rintracciata da Blast ;- nelle colonne Hsps,Bitscore e E-value,dei valori calcolati daBlast che indicano a un occhio esperto il grado di affidabilità deirisultati della ricerca .

L’allineamento di due sequenzeamminoacidiche

• Soffermatevi ora sul primo risultato della lista, casa1_bovin.Cliccate sulla barra colorata corrispondente e successivamentesulla barra a due colori e osservate i risultati.Compare una sezione in cui viene mostrato l’allineamento trap.sospetta1 e casa1_bovin.La sequenza della prima proteina da voi inserita è identificatadalla lettera Q, che sta per query (figura 3 ).Quella della proteina casa1_bovin,che mostra la maggior somiglian-za con p.sospetta1 è contrassegnata invece dalla lettera S .Le lettere che identificano gli amminoacidi identici tra Q e S ven-gono riportate nella riga posta tra le due sequenze.Se le sequenze non coincidono, in corrispondenza degli ammi-noacidi che differiscono tra Q e S ci sono dei gap,ossia degli spa-zi vuoti . Come vedete, la sequenza p.sospetta1 è identica peril 100% alla sequenza della caseina alpha-S1: non ci sono infat-ti spazi vuoti nelle righe centrali.

• Ora che avete identificato la prima proteina sospetta dovete sco-prire se questa possa aver causato la morte di Jack Stevenson.

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3

1

1.3

4

3

2

3

1 La sequenza della proteinaricercata è contrassegnata conla lettera Q.

2 Nella riga posta tra Q e S sono indicati con una letteracorrispondente gli amminoacidi identici nella sequenza di partenzae in quella rintracciata da Blast, con uno spazio gli amminoacidiche differiscono tra le due sequenze.

3 La sequenza della proteinasimile a quella ricercata èidentificata dalla lettera S.

1 Nella sezione Name and origin of the protein trovateinformazioni sul nome della proteina e l’organismo a cui appartiene.

2 Nella sezione Comments trovate indicazioni circa la funzione dellaproteina, i tessuti in cui si trova, la famiglia di appartenenza.

1. Di quale proteina si tratta?

2. Da quale organismo proviene?

3. Qual è la sua funzione?

4. Può essere la responsabile della morte del diplomatico? Argomentate la vostra risposta.

5. Ha altre caratteristiche rilevanti per l’indagine?

Spazio all’analisi

6. Quale proteina ha causato secondo voi la morte del diplo-matico americano? Perché? Motivate la vostra risposta.


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• Cercate ora all’interno della hit list �-lactoglobulina della ca-pra, dal codice lacb_ovimu e cliccate come in precedenza pri-ma sulla barra colorata poi su quella a due colori.• Osservate dunque l’allineamento tra le due sequenze. Teneteconto che proteine appartenenti a specie diverse che mostranouna stretta somiglianza nelle sequenze, e vengono perciò detteomologhe, svolgono spesso funzioni simili.• Concentratevi sulla colonna Identity: le due sequenze sono identiche per il 96%, differiscono dunque per pochi am-minoacidi.

• Osservate la riga posta tra le due sequenze:sapete ormai che quisono trascritti gli amminoacidi identici tra Q e S.In questo caso,al-cune posizioni all’interno della riga sono occupate da uno spazioo un segno +,invece che da lettere:ciò significa che le due sequen-ze presentano alcune differenze.Non tutte le differenze però han-no lo stesso peso:gli amminoacidi non identici possono essere in-fatti più o meno simili tra loro dal punto di vista funzionale.• Soffermatevi per esempio sul primo blocco dell’allineamento.Quitrovate una L, che sta per “leucina”, nella sequenza bovina e una I,che sta per “isoleucina”,nella posizione corrispondente della sequen-za caprina.Leucina e isoleucina sono amminoacidi funzionalmen-te simili (vedi struttura dei 20 amminoacidi,pag. 13): il programma

• Ora che avete identificato la causa della morte di Jack Steven-son spetta alla polizia completare le indagini. Con la prima partedell’attività avete imparato ad analizzare le sequenze delle protei-ne interrogando le banche dati mediante software specifici. Sco-prirete ora altre possibilità offerte dai principali strumenti bioin-formatici. In particolare approfondirete l’indagine sulle sequenzeproteiche sin qui incontrate, scoprirete le caratteristiche e le fun-zioni degli amminoacidi più importanti,analizzerete le omologiee le differenze tra proteine provenienti da organismi diversi.

Il riconoscimento di differenze più o meno marcate

• Riavviate la sessione di ricerca aperta sul sito http://mrs.cmbi.ru.nl/mrs-web/, cliccando sul pulsante Blast Results nellabarra in cima alla pagina.

• Cliccate a questo punto su p. sospetta 2.• Il primo risultato indicato da Blast per la seconda sequenza so-spetta è lacb_bovin. La proteina in questione, come sapete già, èla �-lactoglobulina bovina.

2.1

2. Confrontate le sequenzeamminoacidiche con altre omologhe

1 Gli amminoacidi funzionalmente simili sono segnalati, nella rigaposta tra Q e S, dal simbolo +.

2 Gli amminoacidi funzionalmente diversi sono segnalati, nella rigaposta tra Q e S, da uno spazio vuoto.

7. Quanti sono gli amminoacidi diversi nelle �-lactoglobulinecaprina e bovina?


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segnala questa caratteristica inserendo nella riga centrale, in corri-spondenza degli amminoacidi,il simbolo + .Concentratevi ora sul-l’ultimo blocco dell’allineamento.Qui trovate una E,che sta per “glu-tammato”,nella sequenza bovina,e una G ,che sta per “glicina”,nel-la stessa posizione della sequenza caprina.La glicina e il glutamma-to sono amminoacidi funzionalmente diversi:questo aspetto è segna-lato dal software mediante l’inserimento nella riga centrale di unospazio vuoto,sempre in corrispondenza dei due amminoacidi .

Una spiegazione evolutiva di alcune differenze molecolari

• Tornate nuovamente nella hit list della lactoglobulina e rintrac-ciate la sequenza della �-lactoglobulina del cane. Cliccate sullabarra colorata corrispondente e poi sulla barra a due colori:si apri-rà la solita sezione in cui viene mostrato l’allineamento tra la �-lactoglobulina bovina e quella canina.

Gli amminoacidi identici tra le due specie sono quelli che sisono conservati nel corso dell’evoluzione biologica.Si tratta nor-malmente dei residui che giocano un ruolo importante nel de-terminare la funzione e le caratteristiche di una certa proteina.• Osservate per esempio la porzione della sequenza bovina chesi estende dalla cisteina presente nella posizione 66 alla cisteinapresente nella posizione 160.Nella sequenza del bue tra questi dueamminoacidi,evidenziati nella figura soprastante,si trova un pon-te disolfuro.Come poetete vedere,anche nelle corrispondenti po-sizioni della sequenza del cane ci sono due cisteine.Gli amminoa-cidi in questione si trovano però nelle posizioni 66 e 159, inveceche 66 e 160. Questo perché nella posizione 150 della della pro-teina del bue c’è una Serina (S) che manca invece nella proteinadel cane. Una difformità dovuta alla delezione, ossia alla perdita,durante l’evoluzione, di tre nucleotidi nel gene del cane.

L’individuazione degli amminoacidi“importanti”

Occupiamoci ora della la sequenza di p. sospetta 3, la metal-loproteinasi atrolisina del serpente a sonagli, che produce fortiemorragie nelle vittime morse dal serpente.• Cliccate sempre sul pulsante BLAST results per tornare alla hitlist di p.sospetta 3.

2.3

2.2

2

1• Guardate i primi risultati della lista.Noterete che tutte le protei-ne qui elencate sono metalloproteinasi, ossia enzimi che usano imetalli come catalizzatori per tagliare altre proteine. Al settanta-quattresimo posto all’incirca troverete una voce contrassegnatadal codice vmh1_agkac.Anche questa proteina è una metallo-proteinasi del veleno del serpente cento-passi (Deinagkistrodonacutus) e provoca emorragie interne.• Visualizzate l’allineamento tra il veleno del serpente a sonaglie quello del cento-passi: le loro sequenze sono identiche al 46%.• Mettete a confronto le due sequenze, tenendo presente che:- le due proteine sono molto simili nella parte iniziale della se-quenza, molto diverse in quella finale, che si estende dall’ammi-noacido 160 al 185. Gli amminoacidi responsabili delle differen-ze tra le due proteine si concentrano in questa regione;- l’amminoacido glutammato,E 145,costituisce il sito attivo dell’en-zima.Si tratta del residuo più importante di tutta la proteina,in quan-to responsabile dell’attività della metalloproteinasi. Questo ammi-noacido occupa la stessa posizione in entrambi i veleni, sia nellasequenza che nella struttura tridimensionale delle due proteine.- ci sono tre istidine (H 144, 148, 154) che coordinano il legamecon un atomo di zinco nelle due sequenze;- ci sono dei legami disolfuro in entrambe le proteine:uno di que-sti è presente nelle due proteine in posizione equivalente, ossiadalla cisteina 118 alla cisteina 198 nel serpente a sonagli, e dallacisteina 291 alla 372 nel serpente cento-passi.Questo ponte disol-furo si è conservato nel corso dell’evoluzione;- nel veleno del serpente a sonagli c’è poi un ulteriore ponte di-solfuro che va dalla cisteina 158 alla cisteina 165,mentre in quel-lo dell’altro serpente ce ne sono due: il primo si estende dalla ci-steina 331 alla 356 e l’altro dalla cisteina 333 alla 339.

Dall’osservazione e dal confronto dei legami disolfuro presenti nel-le due sequenze deduciamo che questi determinano differenze chenon incidono sulla funzione e l’attività generale della proteina.

8. Quanti sono gli amminoacidi diversi tra la �-lactoglobulinabovina e quella canina?


9. Rintracciate le posizioni di queste cisteine nell’allineamentoed evidenziatele.


2 Il ponte disolfuro presente nelle due proteine in posizione equivalentesi estende dalla cisteina 118 alla 198 nel serpente a sonagli e dallacorrispondente cisteina 291 alla 372 nel serpente cento-passi.

1 L’amminoacido glutammato (E), in posizione 145, costituisce il sitoattivo dell’enzima. Si tratta del residuo più importante di tutta laproteina, in quanto responsabile dell’attività della metalloproteinasi.

12


• Tornate nella pagina con la hit list dei risultati relativi alla se-quenza di p.sospetta 3.Nell’elenco delle proteine simili alla que-ry trovate anche il veleno del serpente Habu di Okinawa, identi-ficato dal codice vmhr2_trifl.Si tratta di un’altra metalloproteina-si identica per il 52% all’atrolisina del serpente a sonagli e per il51% al veleno del serpente cento-passi.• Visualizzate l’allineamento di questo veleno con quello del ser-pente a sonagli: il grado di identità tra le due proteine è del 52%,dunque la sequenza del serpente a sonagli condivide un maggiornumero di amminoacidi con quella del serpente Habu di Okina-wa che con la proteina del serpente cento passi appena analiz-zata.Tuttavia il veleno di Habu di Okinawa agisce in modo mol-to diverso dagli altri due: non causa emorragie. Questo apparen-te paradosso mostra che in realtà non conta tanto la percentua-le di somiglianza o differenza tra due proteine, quanto il tipo diamminoacidi in cui queste differiscono.Le diverse caratteristichedelle proteine dipendono in sostanza da un piccolo numero diamminoacidi.

L’atrolisina, il veleno del Crotalus atrox,meglio conosciuto come ilserpente a sonagli dal dorso a losanghe,è una sostanza tossica mol-to potente.Negli Stati Uniti ogni anno causa il maggior numero deimorti per un morso di serpente. È una metalloproteinasi, ossia unenzima che distrugge le pareti dei vasi sanguigni e provoca emor-ragie interne dall’effetto letale. In questa attività vi siete soffermatisulla struttura primaria di questo veleno ossia la sua sequenza am-minoacidica. Se volete visualizzare la sua struttura terziaria da cuidipendono la funzione e l’attivi-tà della proteina,andate a pagi-na 30.Analizzerete così un mo-dello della molecola ricostruitoal computer,individuerete il sitoattivo della proteina,ossia la re-gione responsabile della sua at-tività enzimatica, e proverete aprogettare l’antidoto capace dineutralizzare gli effetti letali delveleno.

3. Disegnate l’antidoto al veleno atrolisina

In questa parte dell’attività analizzerete la struttura tridimensiona-le dell’atrolisina, il veleno del serpente a sonagli e proverete a di-segnare un antidoto per contrastarne gli effetti.Studiare la struttu-ra 3D di una molecola è indispensabile per risolvere problemi do-vuti alla presenza di proteine tossiche con cui il nostro organismopuò venire a contatto, come l’atrolisina.Una proteina con un’alterazione nella struttura primaria e di con-seguenza anche nella struttura terziaria può perdere parzialmen-te o completamente la sua funzione.Tuttavia piccole modificazio-ni possono non avere alcun effetto sulla funzione della proteinao causare solo modeste variazioni della sua attività. Non tutti gliamminoacidi di una proteina hanno infatti la stessa importanza.Gli studi sugli effetti delle mutazioni e sugli allineamenti multiplisono molto informativi per capire l’importanza dei singoli ammi-noacidi all'interno di una proteina: negli enzimi gli amminoacidipiù importanti si trovano nel sito attivo e cioè nella regione dellaproteina in cui effettivamente avviene la reazione enzimatica.Perprogettare l’antidoto all’ atrolisina dovrete dunque imparare a di-stinguere in una ricostruzione tridimensionale i diversi elementidi una molecola e individuare il sito attivo sul quale agire per con-trastare gli effetti letali del veleno.

Primi passi con il software YASARA

• Installate il software YASARA e avviatelo.

• Cliccate sul pulsante File,posto nella barra degli strumenti e poiselezionate Load, YASARA Scene. Selezionate il file introduc-tion.sce e confermate con OK.Vi appare la struttura del peptide con la sequenza Asp-His-Arg-Gly-Gly-Met-Lys-Tyr nella rappresentazione detta a “ball andstick”. In questa modalità di visualizzazione i singoli atomi sonorappresentati da pallini, connessi fra loro da bastoncini che raffi-gurano i legami chimici. Non sono invece rappresentati gli atomidi idrogeno.

3.1

10. Spiegate perché la mutazione sistematica di tutti gli ammi-noacidi di una proteina può aiutare a individuare gli ammi-noacidi importanti.


Che cos’è?

Yasara È un programma di grafica molecolare,di modeling e di si-mulazione per Windows, Macintosh e Unix, utile per visua-lizzare e manipolare i modelli delle proteine.È stato svilup-pato da Elmar Krieger, al CMBI (Centre for Molecular andBiomolecular Informatics) in Olanda. Consente, tra le altrecose, di creare immagini da inserire nei lavori scientifici.Ha un’interfaccia intuitiva e una grafica fotorealistica.Di fa-cile utilizzo, garatisce una buona interazione con la realtàvirtuale.

13


La struttura 2D del peptide Struttura dei 20 amminoacidi

La struttura 3D del peptide

• Osservate il modello: noterete che il peptide è avvolto in una nuvola che rappresenta la superficie di Van der Waals.Questa superficie mostra lo spazio effettivamente occupato da-gli atomi.• Muovete il mouse lungo la parte inferiore dello schermo diYASARA: comparirà la barra con la sequenza. Per mantenerla visibile cliccate sul pulsante blu posto all’estremità sinistra del-la barra.• Cliccate ora sui singoli amminoacidi: il programma metterà inevidenza il carbonio alfa (C�). Premendo il tasto Ctrl mentrecliccate su un amminoacido la proteina ruota e si ingrandiscein modo da mostrare distintamente l’atomo C�. Tenendo premuto il tasto del mouse e muovendolo potete manipolare laproteina.• Cliccate ora:- il pulsante sinistro del mouse. Così farete ruotare la proteina;- il pulsante centrale del mouse. Così la sposterete;- il pulsante destro del mouse. Così attiverete lo zoom.• Cliccate a questo punto sui diversi atomi,che sono contrasse-gnati da YASARA mediante l’uso di uno specifico codice colore:nella parte sinistra della finestra compariranno informazioni suciascuno di questi.• Osservate a questo punto la seguente lista di amminoacidi.

• Soffermatevi ora sui bastoncini corti che collegano gli atomi:rappresentano i legami covalenti.

• Ora spostate la vostra attenzione sui bastoncini colorati in ver-de, blu e arancione che compaiono nella rappresentazione: raf-figurano 3 dei 4 diversi tipi di interazioni importanti per l’assun-zione della struttura terziaria di una proteina.

La struttura 3D del veleno atrolisina

Ora analizzerete la struttura 3D del veleno del serpente a sonagli.• Cliccate sempre pulsante File posto nella barra dei menu epoi su New: si aprirà una scheda in cui vi si chiede confermadella scelta di abbandonare la precedente sessione. Conferma-te con Yes.

3.2

11. Quali sono gli atomi presenti nelle proteine ?

12. Qual è il codice colore utilizzato nel programma YASARAper i diversi atomi?Rosso = .......................... Blu = ................................Verde = ............................. Azzurro = .........................


13. Qual è la differenza tra i legami colorati in giallo e quelli inbianco?


14. A quale tipo di interazione corrisponde ciascun colore?

15. Localizzate queste interazioni nella rappresentazione 2D delpeptide.


14


• Cliccate come in precedenza su File,Load,PDB file e a questopunto selezionate veleno.pdb.Apparirà la molecola nella rappre-sentazione a pallini: qui vengono mostrati solo gli atomi della pro-teina, identificati da piccole sfere. Per osservare altri elementi pre-senti nella molecola potete visualizzare ricostruzioni grafiche alter-native della proteina premendo sulla tastiera i pulsanti da F1 a F8.In particolare cliccando sul tasto:F2: visualizzerete la rappresentazione a pallini e bastoncini. Quioltre ai singoli atomi, sempre raffigurati mediante pallini, appaio-no anche i legami sotto forma di bastoncini;F3: visualizzerete la rappresentazione a bastoncini. In questocaso gli atomi sono mostrati come dei segmenti;F4: visualizzerete traccia degli atomi di carbonio alfa collegati at-traverso dei bastoncini;F5: visualizzerete la traccia dell’ossatura della proteina senza lecatene laterali;F6: visualizzerete gli elementi della struttura secondaria in unarappresentazione a cartoon;F7: visualizzerete sempre la struttura secondaria in una rappresen-tazione a cartoon alternativa;

F8: aggiungerete o rimuoverete le catene laterali degli amminoa-cidi (gruppi “R”) nelle rappresentazioni a bastoncini e a pallini ebastoncini;F1: visualizzerete nuovamente la rappresentazione a pallini.• Navigate nelle rappresentazioni che mettono in evidenza gli ele-menti della struttura secondaria, cliccando sui pulsanti F5, F6 eF7 e rispondete alle domande successive.

16. Qual è la struttura secondaria delle regioni rosse della pro-teina? E di quelle blu?

17. Trovate poi i seguenti cinque elementi o strutture, utilizzan-do per ciascun elemento la rappresentazione appropriata:un atomo di ossigeno con un doppio legame; un legamepeptidico; la catena laterale di un’istidina; un’alfa elica; unponte disolfuro. Prendete nota delle corrispondenze inquesto modo: “Atomo di ossigeno con un doppio legame.Rappresentazione a pallini e bastoncini”.


Rappresentazione a pallini Rappresentazione a pallini e a bastoncini Rappresentazione a bastoncini

Traccia dell’ossatura della protina Rappresentazione a cartoon

Rappresentazione a cartoon alternativa Visualizzazione delle catene laterali

F1 F3F2

F4 F6F5

F7 F8

Traccia dei C�

15


L’individuazione del sito attivo

Adesso dovrete trovare il sito attivo della proteina,e cioè il sito incui avviene effettivamente la reazione catalizzata dall’enzima.Ti-picamente esso si trova nella tasca o nelle cavità più ampia pre-sente sulla superficie della proteina.

• Cercate ora il sito attivo del veleno facendo ruotare il modello3D della proteina e avvicinandolo con lo zoom. Scegliete la rap-presentazione che ritenete più appropriata e avviate la ricerca,chenon deve superare il minuto di tempo.Se passato il minuto non avete ancora trovato niente non preoc-cupatevi. Esiste un altro sistema per identificare il sito attivo, chesfrutta il fatto che molti enzimi utilizzano ioni metallici per svol-gere la loro attività.Tra poco vi cimenterete con questo metodo,tenendo comunque presente che ci sono molte altre ragioni percui uno ione metallico può trovarsi nella struttura 3D di una pro-teina e che dunque non dovrete affidarvi ciecamente a questosistema.

• Per avviare la nuova attività cliccate su File, poi su New, quin-di confermate con Yes.• Caricate a questo punto il file veleno2.pdb cliccando ancorasu File,Load,PDB file e selezionando a questo punto il file.• Cercate ora il sito attivo,prendendo come riferimento uno ionezinco (Zn2+) rappresentato da un pallino viola,molto ben visibi-le nella rappresentazione appropriata.• Se non riuscite a trovarlo identificate il tasto Zn posto alla finedella sequenza riportata nella barra in basso.

3.3 • Cliccateci sopra e premete nel frattempo sulla tastiera il pulsan-te Ctrl: in questo modo la proteina inizierà a ruotare automatica-mente e lo ione diventerà visibile.

La progettazione dell’antidoto

Ora che conoscete il sito attivo dell’atrolisina,potete cercare di di-segnare un antidoto.Prima però bisogna aver chiaro il meccanismo della chiave e del-la serratura, in base al quale gli enzimi riescono a svolgere laloro azione.

Probabilmente sapete che una serratura può bloccarsi se vieneoccupata da un corpo estraneo. E se la serratura è fuori uso, lachiave che la apre non riesce più a entrare.Il nostro antidoto devefunzionare secondo lo stesso principio: deve bloccare la serratu-ra. Dovrete dunque cercare una molecola in grado di legarsi inmodo irreversibile al veleno in modo da inattivarlo.Avete già vi-sto che l’avvolgimento di una proteina dipende da specifiche in-terazioni tra gli atomi.Anche il legame dell’antidoto si basa su in-terazioni simili.Dovete quindi cercare una molecola che sia in grado di formarelegami idrogeno, interazioni idrofobiche e legami ionici e cheinoltre si adatti alla cavità del sito attivo.

• Cliccate sempre dal menu su Options,poi su Play movie, rat-tle_snake,rattlesnake.mcr e confermate con OK.Partirà un’ani-mazione in cui si vede una piccola molecola che entra nel sitoattivo e si lega alla proteina velenosa. Una piccola molecola diquesto tipo che alloggia bene in una cavità di una proteina sichiama ligando. La molecola che qui vedete raffigurata, tuttavia,è composta solo da atomi di carbonio e non è in grado di forma-re molte interazioni forti con il sito attivo.Nell’ultima parte di questa esercitazione,vi verranno mostrate treversioni modificate del ligando.A voi decidere quale delle tre fun-zionerà meglio come antidoto.Il ligando migliore è quello che for-ma il maggior numero di interazioni con la proteina e che quin-di dovrebbe essere anche l’antidoto migliore.

• Osservate l’immagine sottostante.Qui sono mostrate 4 molecolediverse. La prima (A) è il ligando visto nell’animazione, le altre tre(B, C e D) rappresentano le versioni 1, 2 e 3 dell’antidoto. Per cia-scuna di queste, esiste un modello 3D visulizzabile con YASARA.• Soffermatevi innanzitutto sulle diverse strutture degli antidoti eidentificate gli atomi che possono essere coinvolti nelle interazio-ni con la proteina.Analizzate a questo punto diversi modelli dell’antidoto in YASA-RA. Per facilitarvi il compito potete osservare delle simulazioniche vi consentiranno di valutare rapidamente le differenze fra imodelli.

3.4

20. Spiegate in poche parole il meccanismo della chiave e dellaserratura, eventualmente aiutandovi con un disegno.


18. Sulla base delle vostre conoscenze spiegate perché il sitoattivo si trova nella cavità della superficie.


19. Conoscete almeno una proteina umana che usa uno ionemetallico per la sua attività?


16


• Cliccate su File, Load, YASARA Scene.Caricate a questo pun-to ligandB.sce.Si aprirà una rappresentazione “ball-and-stick“ delligando. Il veleno è qui rappresentato con un cartoon, gli ammi-noacidi vicini al ligando con bastoncini.

• Osservate a questo punto le ricostruzioni ligandC.sce e li-gandD.sce.

• Potete verificare la vostra risposta aprendo i file che mostranole interazioni dell’antidoto con il veleno, rappresentate come ba-stoncini arancioni.Caricateli ciccando su File,Load,YASARA Sce-ne, intB.sce, intC.sce e intD.sce.

Congratulazioni: siete arrivati alla fine di un’attività che vi ha resocapaci di interpretare sofisticati modelli grafici della struttura 3Ddi una proteina. Avete analizzato gli elementi funzionali più im-portanti di un enzima e le sue interazioni con sostanze diverse.Siete riusciti anche a identificare una molecola effettivamente im-piegata come antidoto al veleno del temibile serpente a sonagli.Sapete ormai per diretta esperienza quale importante contri-buto la Bionformatica metta in campo per risolvere problemiconcreti.

21. Sapreste ritrovare la posizione dello zinco negli schemi degliantidoti confrontandoli con la ricostruzione in 3D?

22. Infine, quale dei 3 ligandi ritenete sia l’antidoto migliore?Spiegate il perché.


17


Risposte parte 2: Laboratorio di bioinformaticaP. sospetta 11. alfa-1-caseina bovina. Questa sequenza corrisponde agli

amminoacidi 16-214 della proteina (gli amminoacidi 1-15sono il peptide segnale). Questa, insieme alla lattoglobulina,è la principale proteina del latte. Viene secreta nel latte.

2. Bos taurus (bue/mucca).

3. Ha un importante ruolo nella capacità del latte di trasportareil fosfato di calcio.

4. La proteina non è sospetta. E’ una proteina naturale del latte.

5. Nessuna caratteristica rilevante per le indagini.

P. sospetta 21. Questa proteina è il precursore della beta-lactoglobulina della

mucca, la principale proteina del latte. Amminoacidi 17-178(1-16 è il peptide segnale).

2. Bos taurus (bue/mucca)

3. Componente primario del siero del latte, lega il retinolo ed èprobabilmente coinvolta nel trasporto di questa molecola.Proteina tessuto specifica. Sintetizzata dalla ghiandola mam-maria e secreta nel latte.

4. La proteina non è sospetta.

5. Allergene. Nell’uomo provoca reazioni allergiche ed è unadelle cause dell’intolleranza al latte bovino.

P. sospetta 31. Metalloproteinasi emorragica (EC 3.4.24.42) (Atrolysin D/C).

Emorragico significa che causa emorragie e quindi sanguina-menti.

2. Crotalus atrox (serpente a sonagli, crotalo adamantino occi-dentale).

3. L’atrolisina, il veleno del Crotalus, contiene dei fattori emorra-gici detti emorragine. Sono principalmente delle metallopro-teinasi (cioè enzimi che tagliano i legami peptidici e distrug-gono quindi le proteine) che usano come cofattore un metal-lo, in particolare nel caso del veleno del Crotalo, lo zinco. Uncofattore è un elemento fondamentale per l’azione enzimati-ca. In assenza di zinco la proteinasi non può funzionare. Que-sta classe di enzimi viene prodotta dalle cellule epiteliali, daifibroblasti e dalle cellule infiammatorie. L’azione proteoliticasi svolge soprattutto sulle proteine della membrana basaledegli endoteli dei vasi capillari (collagene tipo IV, fibronecti-

na). Alcune metalloprotasi hanno anche domini addizionalicon funzioni che potenziano l’attività emorragica. Per esem-pio, l’atrolisina del Crotalo possiede un dominio (detto disin-tegrina) che ha la funzione di inibire l’aggregazione delle pia-strine, tappa fondamentale della coagulazione, potenziandoquindi l’azione emorragica del veleno.

4. L’enzima è molto sospetto, perché causa emorragie interne.E’ una tossina molto potente, un veleno.

5. Zinco - proteasi. La sequenza nella banca dati è molto piùlunga. Gli amminoacidi 191-393 costituiscono il dominiofunzionale dell’enzima.

P. sospetta 41. Albumina umana.

2. Homo sapiens.

3. L’albumina è la principale proteina del plasma, lega acqua,ioni Ca(2+), Na(+), K(+), acidi grassi, ormoni, bilirubina efarmaci. La sua funzione più importante è la regolazione dellapressione osmotica del sangue.

4. La proteina non è sospetta.

5. Nessuna caratteristica rilevante per le indagini.

6. La vittima è deceduta per un morso di un serpente a sonagli.

7. Sei amminoacidi sono diversi, ma di questi quattro sonomolto simili.

8. Ci sono 62 amminoacidi non uguali, ma 37 sono molto simi-li. A causa della differenza di lunghezza fra le due sequenzeproteiche, 1 amminoacido della proteina sospetta 2 (Serina150) non ha un residuo corrispondente nel cane.

9. I ponti disolfuro in più sono colorati in giallo, arancio e rosso

18


10.Negli studi mutazionali, vengono sostituiti uno a uno tutti gliamminoacidi, in genere con una alanina. Si guarda qualisono le posizioni che, se sostituite, provocano alterazioni fun-zionali della molecola. La maggior parte delle mutazioni hanno effetti poco rilevan-ti o non ne hanno alcuno. Le mutazioni di residui importantihanno effetti drastici sulla funzione: generalmente, quando sisostituisce un residuo cruciale, la proteina perde completa-mente la sua funzione.

11.Gli atomi presenti negli amminoacidi sono carbonio idrogenoossigeno azoto e zolfo.

12.Rosso: ossigeno; blu scuro: azoto; verde: zolfo; azzurro: car-bonio.

13.Legami bianchi: legami singoli covalenti. Legami gialli: legami doppi covalenti

14.Verde: legami idrogeno; blu: interazioni ioniche / ponti salini;arancione: interazioni idrofobiche.

15.

16.Rosso: beta-filamento (più beta-filamenti formano il beta-foglietto); blu: alfa elica.

17.Un atomo di ossigeno con un doppio legame: ball e stick. Unlegame peptidico: ball e stick. La catena laterale di una istidi-na: tutte le rappresentazioni che mostrano le catene laterali.Un’ alfa elica: backbone o cartoon. Un ponte disolfuro: stick

18.Perché in una cavità è possibile un maggior numero di inte-razioni (legami idrogeno, interazioni ioniche, interazioni idro-fobiche). Queste interazioni fanno aumentare la specificitàdell’interazione con il substrato/ligando.

19.Emoglobina: usa il ferro; il citocromo: usa il ferro; la calmo-dulina usa il calcio.

20.Secondo il principio della chiave e serratura l’enzima (la ser-ratura) funziona solo con il ligando (la chiave) giusto.

21.La maggior parte degli atomi indicati con la freccia può for-mare legami idrogeno. Il gruppo -SH (grouppo -tio) in teoria può formare legamiidrogeno, ma sono molto deboli. L’ossigeno carico negativa-mente nel candidato 2 (C) può formare un legame ionico conlo Zn2+ della proteinasi, mascherandone la carica e impeden-do l’attività catalica dell’enzima. NB: la carica è distribuitasull’intero gruppo carbossilico. Il legame ionico si forma quin-di con l’intero gruppo (l’ossigeno carico e l’ossigeno con ildoppio legame).

22. Il ligando C è il candidato migliore come antidoto. In questoligando, il legame peptidico forma due legami idrogeno e ilgruppo carbossilico forma un ponte salino molto forte con loione zinco della proteina. Gli altri ligandi formano meno (omeno forti) legami.

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Redazione Silvia ParisImpaginazione CL’EM Progetti per l’editoria, Sandro VenturaProgetto grafico CL’EM Progetti per l’editoriaCopertina Sandro Ventura

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