Le gène suppresseur de métastases Growth Arrest … · iii Résumé Nous avons récemment découvert que le gène Gas1 agit comme un suppresseur de métastases chez le mélanome

Le gène suppresseur de métastases Growth Arrest-

Specific 1 (Gas1) est réprimé épigénétiquement

chez le mélanome métastatique

Mémoire

Jimmy Savard-Lalancette

Maîtrise en Biologie Cellulaire et Moléculaire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Jimmy Savard-Lalancette, 2013

ii

iii

Résumé

Nous avons récemment découvert que le gène Gas1 agit comme un suppresseur de

métastases chez le mélanome. Ce gène pourrait être utilisé pour d’éventuelles thérapies

contre la métastase. Afin de découvrir le mécanisme réprimant l’expression de Gas1 chez

les cellules métastatiques, nous avons utilisé des ChIP, des inhibiteurs chimiques et des

petits ARN interférents contre des molécules susceptibles de réprimer Gas1. Chez le

mélanome métastatique murin B16-F10, nous avons observé plusieurs groupements

méthyles sur l’îlot CpG du promoteur de Gas1, ainsi que la marque de répression H3K9me3

et l’absence de la polymérase II. Chez les cellules humaines C8161 et Lox-IMVI, nous

avons découvert qu’il y avait une forte présence d’acétylation au niveau de l’histone 3 et de

polymérase II. Par ailleurs, nous avons prouvé que c-MYC et BRD4 étaient impliqués dans

la régulation de GAS1. Finalement, ces résultats pourront être utilisés pour développer

d’éventuelles thérapies contre la métastase.

iv

v

Table des matières Résumé .................................................................................................................................. iii

Table des matières .................................................................................................................. v

Liste des tableaux ................................................................................................................... ix

Liste des figures ..................................................................................................................... xi

Liste des abréviations .......................................................................................................... xiii

Remerciements ...................................................................................................................... xv

1. Introduction ...........................................................................................................1

1.1. Le cancer ...............................................................................................................1

1.2. Les métastases .......................................................................................................1

1.3. Les gènes suppresseurs de métastases ...................................................................2

1.4. Le gène Gas1 .........................................................................................................4

1.4.1. Gas1 et le cycle cellulaire ................................................................................. 4

1.4.2. Les caractéristiques de Gas1 ............................................................................. 5

1.4.3. Gas1 et les voies de signalisation GDNF et SHH ............................................ 7

1.4.4. Gas1 et l’apoptose ............................................................................................ 8

1.4.5. Gas1, un gène suppresseur de métastases ....................................................... 11

1.4.6. Gas1, un gène à plusieurs rôles ...................................................................... 12

1.4.7. La régulation de Gas1 ..................................................................................... 13

1.5. La régulation épigénétique ..................................................................................14

1.5.1. Le code des histones ....................................................................................... 15

1.5.1.1. Les marques activatrices .......................................................................15

1.5.1.2. Les marques répressives .......................................................................16

1.5.1.3. Les régulateurs épigénétiques ..................................................................... 17

1.5.2. La pause transcriptionnelle ............................................................................. 18

1.5.3. La poly(ADP-ribosyl)ation ............................................................................. 19

1.5.4. Les microARNs .............................................................................................. 20

1.6. L’oncogène c-Myc ..............................................................................................20

1.6.1. Le rôle de répresseur génique de c-Myc ......................................................... 21

1.7. Problématique et implications scientifiques de l’étude du gène Gas1 ................25

2. Méthodologie ................................................................................................................ 27

2.1. Culture cellulaire .................................................................................................27

2.2. Les vecteurs d’expression ...................................................................................27

2.3. Traitements chimiques cellulaires .......................................................................28

2.4. Extraction d’ARN ...............................................................................................28

2.5. Dosage d’ARN ....................................................................................................28

2.6. Réaction de transcription inverse ........................................................................28

2.7. Réaction en chaîne par polymérase quantitative .................................................29

2.8. Immunoprécipitation de la chromatine ...............................................................29

2.8.1. Fixation et récolte cellulaire ........................................................................... 29

2.8.2. Lyse cellulaire ................................................................................................. 30

2.8.3. Sonication ....................................................................................................... 30

2.8.4. Immunoprécipitation ....................................................................................... 30

2.8.5. Préparation de l’ADN ..................................................................................... 31

2.8.6. Isolation de l’ADN .......................................................................................... 31

2.8.7. Réaction en chaîne par polymérase quantitative ............................................. 31

vi

2.8.8. Vérification de la sonication .......................................................................... 32

2.9. Clonage moléculaire ........................................................................................... 32

2.9.1. Réaction en chaîne par polymérase ................................................................ 32

2.9.2. Gel d’agarose .................................................................................................. 33

2.9.3. Purification d’ADN ........................................................................................ 34

2.9.4. Digestion enzymatique ................................................................................... 34

2.9.5. Déphosphorylation de vecteurs ...................................................................... 34

2.9.6. Ligation .......................................................................................................... 34

2.9.7. Transformation bactérienne ............................................................................ 35

2.9.8. Extraction plasmidique de petites quantités (Miniprep) ................................ 35

2.9.9. Séquençage ..................................................................................................... 35

2.9.10. Extraction plasmidique de moyennes quantités (Midiprep) ....................... 35

2.10. Extraction d’ADN génomique ............................................................................ 36

2.11. Conversion d’ADN génomique au bisulfite de sodium ...................................... 36

2.12. Répression d’ARNm par petits ARN interférents .............................................. 37

2.12.1. Production des plasmides lentiviraux pLKO.1 ........................................... 37

2.12.2. Production des lentivirus pLKO.1 .............................................................. 37

2.12.3. Transduction des lentivirus pLKO.1 .......................................................... 37

2.13. Essai luciférase ................................................................................................... 37

3. Résultats ....................................................................................................................... 39

3.1. Le mélanome murin ............................................................................................ 39

3.1.1. Gas1 est réprimé chez les cellules de mélanome murin B16-F10 ................. 39

3.1.2. L'expression de Gas1 est modulable chimiquement par la TSA et le 5-Aza

chez le mélanome métastatique murin B16-F10 .......................................................... 41

3.1.3. Cbx1 est impliqué dans la répression épigénétique du gène Gas1 chez les

cellules de mélanome métastatique murin B16-F10 .................................................... 42

3.2. Le mélanome humain ......................................................................................... 43

3.2.1. L'expression de GAS1 est réprimé chez les cellules de mélanome métastatique

humain C8161 et Lox-IMVI ........................................................................................ 43

3.2.2. L'expression de GAS1 n'est pas modulable par la TSA et le 5-Aza chez les

cellules C8161 et Lox-IMVI ........................................................................................ 44

3.2.3. L’expression de GAS1 n'est pas contrôlée par microARNs ........................... 46

3.2.4. L’expression de GAS1 est contrôlée par les gènes BRD4 et c-MYC chez les

cellules de mélanome humain C81-61, C8161 et Lox-IMVI ....................................... 47

3.2.5. La répression de GAS1 n'implique pas les complexes c-MYC/MAX/MIZ1 ou

c-MYC/TFAP2C/KDM5B ........................................................................................... 50

3.2.6. La régulation de GAS1 implique d'autres protéines comme les PARPs ou

BMI-1 52

3.3. Le cancer du sein murin ...................................................................................... 53

3.3.1. Gas1 est réprimé chez les cellules de cancer du sein murin 4T1 ................... 53

4. Discussion .................................................................................................................... 55

4.1. Les lignées cellulaires murines ........................................................................... 55

4.1.1. Gas1 est réprimé chez les lignées cellulaires métastatiques murines B16-F10

55

4.1.2. L'expression de Gas1 est modulable chimiquement par la TSA et le 5-Aza

chez la lignée cellulaire métastatique murine B16-F10 ............................................... 56

vii

4.1.3. Cbx1 est impliqué dans la répression du gène Gas1 chez la lignée cellulaire

métastatique murine B16-F10 ....................................................................................... 59

4.1.4. Gas1 est réprimé chez les lignées cellulaires murines 4T1 ............................ 61

4.1.5. Conclusion ...................................................................................................... 62

4.2. Les lignées cellulaires humaines .........................................................................62

4.2.1. GAS1 est réprimé chez les cellules métastatiques de mélanome humain C8161

et Lox-IMVI .................................................................................................................. 62

4.2.2. GAS1 n'est pas régulé par les HDACs ou les DNMTS chez les cellules

métastatiques C8161 et Lox-IMVI ............................................................................... 63

4.2.3. L’expression du GAS1 est contrôlée par les gènes BRD4 et c-MYC chez les

cellules métastatiques de mélanome humain C8161 et Lox-IMVI ............................... 67

4.2.4. Conclusion ...................................................................................................... 70

5. Conclusion générale et perspectives ............................................................................. 73

6. Références ..................................................................................................................... 77

7. Annexes ........................................................................................................................ 97

7.1. Annexe un - Candidats criblés par petits ARN interférents ................................... 97

7.2. Annexe deux - Séquence des constructions 3'UTRhGAS1-A.1 et B.1 .................. 99

7.3. Annexe trois - Liste des produits, des anticorps et des amorces utilisés .............. 101

7.4. Annexe quatre - Vecteurs d'expression ................................................................ 107

viii

ix

Liste des tableaux

Tableau 1 : Liste des produits utilisés........................................................................101

Tableau 2 : Liste des anticorps..................................................................................104

Tableau 3 : Liste des amorces...................................................................................105

x

xi

Liste des figures

Figure 1 : Mécanisme d'apoptose induite par les récepteurs Gas1 et Ret....................9

Figure 2 : Métastases in vivo issues d'une injection de cellules B16-F10..................12

Figure 3 : Mécanisme de répression de la protéine Dnmt1 par PARylation..............20

Figure 4 : Différents mécanismes de répression employés par l'oncoprotéine c-

Myc..............................................................................................................................23

Figure 5 : Mécanisme de pause transcriptionnelle induite par c-Myc........................24

Figure 6 : Gas1 est réprimé chez les cellules B16-F10..............................................40

Figure 7 : Gas1 est modulable chimiquement chez les cellules B16-F10 par la TSA

et le 5-Aza....................................................................................................................42

Figure 8 : Le gène Cbx1 est impliqué dans la répression de Gas1.............................43

Figure 9 : GAS1 n'est pas modulable chimiquement par la TSA ou le 5-Aza chez les

lignées métastatiques C8161 et Lox-IMVI..................................................................44

Figure 10 : Le promoteur de GAS1 sont fortement acétylées au niveau des histones et

est caractérisé par la présence de polymérase.............................................................45

Figure 11 : GAS1 n’est pas contrôler par microARNs...............................................46

Figure 12 : BRD4 régule directement le gène GAS1 chez la lignée faiblement

métastatique C81-61....................................................................................................48

Figure 13 : c-MYC est impliqué dans la répression du gène GAS1 chez les cellules

métastatiques C8161 et Lox-IMVI..............................................................................49

Figure 14 : c-MYC réprime directement le gène GAS1 chez les lignées métastatiques

C8161 et Lox-IMVI.....................................................................................................50

Figure 15 : Le complexe c-MYC/MAX/MIZ1 n’est pas impliqué dans la répression

du gène GAS1 chez les C8161....................................................................................51

Figure 16 : La répression de GAS1 n’implique pas les facteurs de transcription

KDM5B, PARG ou NELF..........................................................................................52

Figure 17 : Gas1 est réprimé chez les cellules métastatiques murines du cancer du

sein 4T1.......................................................................................................................54

Figure 18 : Schéma récapitulatif des mécanismes de répression du gène GAS1.......74

Figure 19 : Candidats transduits par petits ARN interférents chez les cellules

C8161...........................................................................................................................97

Figure 20 : Clonage moléculaire de la région 3’UTR du gène GAS1........................99

Figure 21 : Vecteur pGEM-T Easy..........................................................................107

Figure 22 : Vecteur pLKO.1.....................................................................................108

Figure 23 : Vecteur pGL4.13 [luc2/SV40]...............................................................109

xii

xiii

Liste des abréviations

5-Aza 5-Aza-2'-deoxycytidine

Ac Acétyl

Acta2 Alpha-actin-2

ADN Acide Désoxyribonucléique

ADNc ADN complémentaire

ARN Acide Ribonucléique

ARNm ARN messager

BRD4 Bromodomain-containing Protein 4

C/EBP-delta CCAAT/Enhancer Binding Protein-delta

Cggbp1 CGG Triplet Repeat-binding Protein 1

CTCF CCCTC-binding Factor

Ctso Cathepsin O

DEPC Diethylpyrocarbonate

Dmp1 Dentin Matrix Acidic Phosphoprotein 1

Dnmt DNA methyltransferase

DSIF DRB Sensitivity Inducing Factor

ERK Extracellular Signal-regulated Kinases

FBS Fetal Bovine Serum

Gas1 Growth Arrest-Specific 1

GDNF Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor

GFR GDNF Family Receptor

Gly Glycine

GPI Glycophosphatidylinositol

H3K4 Histone 3 Lysine 4






HAT Histone acétyltransférase

Hdac Histone déacétylase

HP1 Heterochromatin Protein 1

HSP70 Heat Shock Protein 70

IgG Immunoglobulin G

kDa Kilo Dalton

KMT Histone Demethylase

LSD1 Lysine (K)-specific demethylase 1A

Me Méthyl

xiv

MKK4 Mitogen-activated Protein Kinase Kinase 4

NELF Negative Elongation Factor

NF-kb Nuclear Factor-Kappa B

NMDA N-methyl-D-Aspartic Acid

ORF Open Reading Frame

PARG Poly ADP Ribose Glycohydrolase

PARP Poly ADP Ribose Polymerase

PCR Polymerase Chain Reaction

PEI Polyethylenimine

PEITC Phenethylisothiocyanate

RET Rearranged During Transfection

PI3-K Phosphoinositide 3-Kinase

Pol II Polymérase II

PRC Polycomb Repressive Complex

Rkip Raf Kinase Inhibitor Protein

Ser Sérine

SHH Sonic Hedgehog

shRNA Small Hairpin RNA

SIRT Sirtuin

TGF-beta Transforming Growth Factor Beta

TSA Trichostatin A

ZBTB17 (Miz1) Zinc Finger and BTB Domain-containing Protein 17

xv

Remerciements

Je voudrais souhaiter tous mes remerciements à l’équipe du Dr. Stéphane Gobeil. Au

travers de deux années de maîtrise, vous avez tous su m’aider et apporter votre grain de sel

dans une excellente équipe de travail. Je vous en suis très reconnaissant.

Pour le Dr. Gobeil, je suis très heureux d’avoir été le premier étudiant à la maîtrise au sein

de votre laboratoire. Avec une belle complicité, nous avons réussi à développer une

méthodologie de travail très intéressante et stimulante. De plus, je voudrais vous remercier

pour toutes les connaissances et les techniques scientifiques que vous m’avez transmises.

Vous avez su tirer le meilleur de moi-même afin de toujours repousser mes limites et

atteindre mes objectifs. Merci beaucoup!

Pour tous les étudiants ou professionnels de recherche avec qui j’ai travaillé, vous êtes

parvenu à enrichir mes semaines au laboratoire. Louis-Jean a toujours été à disposition pour

m’enseigner les voies les plus rapides pour résoudre mes problèmes, en plus d’être un

excellent partenaire de laboratoire. Merci aussi à Yann, Rosette et Josie pour votre bonne

humeur quotidienne. Un gros merci à Coraline et Olivier pour votre aide dans mon projet

de maîtrise, mais aussi pour votre agréable compagnie.

Également un gros merci pour tous les stagiaires avec lesquels j’ai travaillé, ce fût un

plaisir. Finalement, j’aimerais souhaiter merci à ma conjointe qui a toujours été là pour

m’encourager et me soutenir, tout comme notre famille. J’ai été ravi de travail au sein de

l’équipe du Dr. Gobeil et je vous souhaite un très bel avenir!

1

1. Introduction

1.1. Le cancer

Le cancer est défini comme un désordre génétique causant une multiplication cellulaire

anarchique. Tout débute par quelques mutations au niveau de l’ADN. Ces dernières

peuvent être spontanées ou héréditaires. Dans la plupart des cas, les mutations spontanées

sont induites par des expositions aux composés mutagènes. Suite à l’accumulation de

mutations, la cellule peut perdre le contrôle de sa croissance et devenir tumorale197

.

Le cancer est donc défini par dix caractéristiques importantes pour sa progression, soit

l’immortalité, l’évitement du système immunitaire, l’évasion des suppresseurs de la

croissance, le maintient de signaux de survie, la dérégulation énergétique, la résistance à la

mort cellulaire, l’instabilité du génome, l’angiogénèse, la promotion inflammatoire et

l’activité métastatique110

. Le cancer touche donc plusieurs processus cellulaires et est

d’autant plus très complexe à étudier.

Malheureusement, le cancer est devenu la première cause de décès en Amérique du Nord,

dépassant les maladies cardiovasculaires202

. Il est donc vital d’accroître les connaissances

sur le cancer pour contribuer à la mise en place de nouvelles thérapies pour le vaincre.

1.2. Les métastases

Responsables de 90% des décès issus d’une tumeur primaire, les métastases sont l’étape

avancée du cancer69

. Fréquemment retrouvées aux os, au foie, aux poumons ou au cerveau,

les cellules métastatiques devront traverser une série d’étape pour y parvenir, appelée la

cascade métastatique69-201

. Par conséquent, les cellules doivent envahir l’environnement

autour de la tumeur primaire, procéder à l’intravasation dans le système de circulation, être

transportées jusqu’au site secondaire, effectuer l’extravasation dans le tissu et finalement

former la métastase201

. En d’autres mots, les cellules métastatiques devront accumulées des

modifications qui accroîtront leur pouvoir métastatique afin de parvenir à franchir toutes les

étapes de la cascade métastatique. Parmi ces modifications, la perte de gènes suppresseurs

de métastases a été démontrée comme très importante pour faciliter le passage vers les sites

secondaires. Par exemple, la répression de l’E-Cadherin permet de réduire l’attachement

2

aux cellules entourant la tumeur primaire pour augmenter l’invasion et la migration vers le

second site113

. Au final, étant donné la mortalité associée aux métastases, il apparait

impératif d’étudier en détail les mécanismes l’entourant afin de développer de nouveaux

outils thérapeutiques contre la métastase.

1.3. Les gènes suppresseurs de métastases

Les métastases sont la principale cause de décès chez les patients atteints du cancer. Par

exemple, chez le cancer du sein, ces tumeurs secondaires causeront la plupart des décès69

.

Les patients ayant été opérés pour la tumeur primaire devront être suivis jusqu’à dix ans

afin de déceler rapidement l’apparition de métastases. Cependant, plusieurs ne survivront

pas aux colonies secondaires111

, d’où l’importance d’amener de nouveaux outils contre les

métastases. C’est dans ce contexte que les gènes suppresseurs de métastases sont de plus en

plus étudiés.

Tout d’abord, il faut souligner le potentiel important pour combattre les colonies

secondaires grâce aux gènes suppresseurs de métastases. Par exemple, notre laboratoire a

démontré au cours d’essais in vitro et in vivo qu’il était possible de réduire le nombre de

métastases pulmonaires, causées par des cellules de mélanome64

. Il est important de

mentionner qu’afin d’obtenir le titre de gène suppresseur de métastases, le gène doit réduire

la capacité de formation de colonies secondaires in vivo, sans toutefois affecter la capacité

tumorigène de la cellule111-112

. Ceci démontre bien la possibilité d’utiliser ces gènes comme

outil thérapeutique contre la métastase.

Par ailleurs, plusieurs publications s’accordent à décrire les gènes suppresseurs de

métastases comme de bons biomarqueurs de la progression métastatique111

. En effet, des

études ont démontré l’utilité des gènes NM23207

et E-Cadherin208

dans le cadre d’un

diagnostique de la tumeur primaire. Ainsi, lorsque ces deux gènes y sont absents, le

diagnostique est plutôt mauvais111

. Il est donc intéressant d’accroître les connaissances à

propos de ces gènes suppresseurs de métastases, autant dans un contexte thérapeutique que

diagnostique.

Au final, bien que la liste des gènes suppresseurs de métastases reste restreinte, plusieurs

nouveaux gènes comme Gas1, Acta2 ou Ctso64

s’ajoutent aux premiers gènes découverts

3

comme NM23, KAI1, KISS1 ou MKK4111-112

. Il est maintenant possible de compter au

dessus d’une quarantaine de ces suppresseurs de métastases au sein de la littérature. Afin de

bien illustrer leur rôle important en oncologie, voici une description des principaux gènes

suppresseurs de métastases :

NM23 : Découvert en 1988, il est le premier gène suppresseur de métastases. Il a été

démontré que la perte de ce gène aide à promouvoir la survie, la mobilité et bien d’autres

processus cellulaires lors de la cascade métastatique111-112-113

.

KAI1 : Dans les premiers gènes identifiés, il a illustré sa capacité à supprimer la

formation métastatique chez le cancer de la prostate. Il a été associé à l’accroissement de la

capacité d’invasion autour de la tumeur primaire111-112

.

RKIP : Également capable d’empêcher la formation métastatique chez le cancer de

la prostate, le gène RKIP a été associé à des dérégulations signalétiques au sein des cellules,

menant à une augmentation de la croissance, de l’invasion et du pouvoir métastatique112-114

.

KISS1 : Découvert chez le mélanome, KISS1 a été démontré comme empêchant la

colonisation métastatique en y maintenant les cellules en dormance112

.

GAS1 : Découvert par notre laboratoire comme gène suppresseur de métastases, il a

été publié comme un frein du cycle cellulaire, en plus d’induire l’apoptose64

.

NDRG1 : Ce gène a été montré comme absent chez plusieurs lignées cellulaires

métastatiques du cancer du colon. De plus, il a été impliqué dans la capacité d’invasion

cellulaire113

.

E-Cadherin : L’absence d’expression de ce gène a été prouvée chez le cancer du

colon. Il a été démontré que la perte de ce récepteur permettait de diminuer les interactions

cellules-cellules afin d’accroitre le potentiel métastatique des cellules tumorales113

.

4

1.4. Le gène Gas1

1.4.1. Gas1 et le cycle cellulaire

Le cancer est défini comme une prolifération cellulaire anormale au sein d’un tissu. Au

cours des années, plusieurs scientifiques se sont donc penchés sur la question et ont étudié

le cycle cellulaire. Il était connu que plusieurs gènes promouvaient le cycle cellulaire.

Schneider (Schneider, 1988) avait ainsi émit l’hypothèse que d’autres gènes freinaient le

cycle cellulaire. C’est donc en 1988 qu’il découvrit six gènes ayant les capacités d’induire

l’arrêt du cycle cellulaire en G0. Il les appela les gènes Growth Arrest-Specific (Gas).60

Parmi ceux-ci, Gas1 a été démontré comme ayant le meilleur rôle de frein du cycle

cellulaire.

Poursuivant plus profondément ses études, Schneider (Schneider, 1988) a décrit Gas1

comme modulateur négatif du cycle cellulaire chez les cellules de fibroblastes murines NIH

3T3. Ainsi, il a illustré qu'en situation de sevrage nutritionnel, l'expression de Gas1

s'accroît après trois heures. Il a déterminé que les cellules sont ensuite maintenues en arrêt

lors de la phase G0, bloquant l'accès vers les phases G1/S. Par la suite, en stimulant les

fibroblastes avec du sérum nutritionnel, il a établi que les cellules redémarrent le cycle

cellulaire et que les niveaux d'expression de Gas1 s’amenuisent. Ensuite, d'autres

laboratoires ont confirmé le rôle de frein cellulaire de Gas1 chez les fibroblastes2-16-17-45

, les

cellules musculaires54

ou les adipocytes10

. Également, Evdokiou (Evdokiou, 1998) a utilisé

un vecteur inductible au dexamethasone pour obtenir des niveaux de Gas1 plus

physiologique chez les 3T3. Il a illustré qu'avec ces conditions de surexpression, la

croissance cellulaire était grandement ralentie et qu'il y avait un changement morphologie

des cellules. En outre, il a prouvé qu'il était possible de rétablir la croissance cellulaire par

un ARN anti-sense contre Gas116

. Fait intéressant, un autre scientifique a trouvé de

l'ARNm de Gas1 chez des cellules murines de foie en G0, mais également en G1/S, suite à

une hépatotectomie, signe qu’il est possible d’observer une hétérogénéité au sein d’une

population des niveaux d'expression de Gas156

. En plus, Schneider (Del Sal et Schneider,

1992) a montré que ce gène pouvait être impliqué également lors de l'inhibition de

5

croissance de contact entre les cellules1. En bref, ces expériences ont bien imagé

l'implication de Gas1 comme frein du cycle cellulaire chez les cellules de fibroblastes.

Afin de mieux comprendre le rôle de Gas1 au sein du cycle cellulaire, Schneider (Del Sal et

Schneider, 1992) a utilisé un vecteur exprimant Gas1 et l’a inséré par microinjection chez

les cellules de fibroblastes NIH 3T3. En accord avec son hypothèse, les cellules exprimant

le vecteur de Gas1 ont inhibé la croissance cellulaire, en plus de la synthèse d'ADN. Pour

valider ces recherches en oncologie, Schneider a introduit son vecteur de Gas1 chez des

cellules transformées par un oncogène, soit v-fos, v-myc, v-src, v-ras ou SV40. Ainsi, il a

montré que l'effet de Gas1 sur l’arrêt du cycle cellulaire était similaire chez toutes ces

cellules transformées, exception faite pour SV401-2

ou par un adénovirus9. Par contre, il a

été prouvé qu'une insertion d'un vecteur v-src diminue l'expression de Gas1 chez ces

cellules NIH 3T3 non transformées, permettant le passage des cellules de G0 vers la phase

S, impliquant donc potentiellement la voie de régulation Src pour ce gène18

. Par

conséquent, il est intéressant de noter que l’action du gène Gas1 n’est pas seulement visible

chez les cellules saines, mais également chez les cellules transformées et potentiellement

tumorigéniques.

Compte tenu de cet effet de frein du cycle cellulaire, Del Sal (Del Sal, 1995) a étudié plus

en profondeur les raisons derrières ce phénomène, pour finalement conclure que l'arrêt

cellulaire chez les 3T3 induite par Gas1 dépendait de p53, un gène inactif chez les cellules

transformées par SV40 ou par un adénovirus9. De plus, ce chercheur a démontré que le

domaine transactivateur de p53 n'était pas nécessaire pour observer l’effet de frein du cycle

cellulaire9, résultat appuyé par un autre groupe qui en plus a montré qu'il pouvait y avoir

compétition entre la signalisation de Gas1 et 53BP213

. Fait intéressant, un autre groupe a

démontré qu'il n'y avait pas d'expression de Gas1 chez les cellules NIH 3T3 transformées

par v-mos en situation de privation nutritionnelle. Selon eux, cet effet serait causé par un

arrêt des cellules en phase de G1 au lieu de G05. Ces travaux ont permis de démontrer plus

en détail le rôle de Gas1 lors du cycle cellulaire.

1.4.2. Les caractéristiques de Gas1

L’existence de Gas1 est connue depuis plusieurs années maintenant. Suite à de nombreux

travaux, il a été possible de comprendre plus en détail les caractéristiques entourant la

6

structure de cette protéine, souvent associée à la famille GDNF23-35

. Malgré cela, il reste

encore beaucoup de recherches à effectuer pour mieux comprendre les utilités des différents

domaines présents au cœur de la protéine Gas1.

Pour ce faire, Schneider (Del Sal et Schneider, 1992) a débuté l'étude de Gas1 au niveau de

l'ARNm lui-même. Par analyse d'extension d'amorces, il a démontré que l’ARNm de Gas1

murin commence à 14 nucléotides en amont d'un site de restriction BamHI. Son ARNm

comporte un 5’UTR de 425 nucléotides ayant trois ATG devant trois sites ORF

interrompus par trois codons d’arrêt. De plus, il a déterminé que le nucléotide 425 code

pour l’ATG de départ, terminant au nucléotide 1579, pour un total de 384 acides aminés.

Par ailleurs, Schneider a trouvé que le 3’UTR était de 1386 nucléotides de long. Or, il a

démontré que ce 3'UTR contient deux sites consensus AUUUA, impliqués dans la

déstabilisation d’ARNm. Pour sa part, ce scientifique a décrit que la protéine contient une

région membranaire entre les acides aminés 38-74. Ensuite, il a indiqué que la région entre

les acides aminés 75 et 384 semblait être une partie extracellulaire, car elle contient une

séquence semblable à des récepteurs à intégrine, deux sites N-glycosylation et des résidus

Ser-Gly, tous caractérisant de manière similaires les parties de domaines extracellulaires1.

En bref, Schneider a mis en lumière la similitude de Gas1 avec d’autres récepteurs

extramembranaires.

En complément, d'autres caractéristiques de Gas1 ont été publiées au fil des années. En

1993, un laboratoire a démontré que Gas1 était présent sur le chromosome 9 au niveau de

la région 9q21.3-q223-6

, une région absente chez le syndrome de Gorlin. De plus, d'autres

scientifiques ont analysé que le gène GAS1 humain comportait 85 % d'homologie avec le

gène murin4. Au niveau de la protéine, Gas1 a été démontré comme ayant un signal peptide

et s'illustrant comme étant un ancre-GPI, situé à la membrane22

, dans des radeaux

lipidiques35

, et codant une protéine d’un total de 45 kDa30

. En contrepartie, un autre

chercheur a prouvé que l'ancre-GPI de Gas1 n'était pas essentiel pour que ce gène soit

effecteur. En effet, avec l'aide d'une protéine de Gas1 soluble, l'effet de frein cellulaire de

Gas1 restait le même chez les cellules NIH 3T323

, mais également chez des cellules

mesangiales58

. En outre, il est justifié d’affirmer maintenant que le gène Gas1 code une

protéine similaire aux récepteurs de la famille GDNF, possédant eux-mêmes un ancre-

GPI209

.

7

1.4.3. Gas1 et les voies de signalisation GDNF et SHH

Découlant des faits que Gas1 pouvait freiner le cycle cellulaire et induire l’apoptose, des

chercheurs se sont penchés sur l’option d’utiliser ce gène comme cible thérapeutique pour

le traitement du cancer. Plusieurs laboratoires ont donc cherché à découvrir les partenaires

d’interaction de Gas1 pour comprendre les voies de signalisation derrière ces complexes,

avec pour objectif d’induire son expression. C’est ainsi que certains laboratoires ont illustré

l’implication de la famille GDNF avec le gène Gas1.

Par exemple, Ruaro (Ruaro, 2000) a émis l'hypothèse que Gas1 pouvait interagir au sein de

la signalisation GDNF grâce aux ligands GDNF, perséphine, artémine ou neurturine, au

récepteur Ret23-35

ou aux co-récepteurs GFR-α ou GFR-β23-27-30-34-37

. De même, un

chercheur a démontré que Gas1 pouvait réduire la phosphorylation de la tyrosine 1062 du

récepteur Ret et en diminuer sa signalisation43

. Dans un même ordre d'idée, il a été dévoilé

que la structure de Gas1 était similaire aux récepteurs GFR-α, en plus de pouvoir induire la

mort cellulaire lorsqu’il y avait une liaison à un ligand GDNF en condition de sevrage

nutritionnel35

. L'hypothèse que Gas1 pourrait freiner AKT et induire ERK a donc été

émise35

et prouvé pour AKT chez le neuroblastome SH-SY5Y43

. D'un autre côté, un

chercheur a montré l'association de Gas1 avec la voie de signalisation Sonic Hedgehog

(Shh) par une co-immunoprécipitation des deux protéines26-41-42-49

. Ce résultat coïncide

avec celui d'autres chercheurs qui ont démontré que la signalisation de la voie Shh était

fortement moins induite chez des souris comportant une ablation de Gas140

, en présence

d’un ARN anti-sens contre Gas155

ou chez un mutant N115K, limitant l'interaction avec

Gas1, à la surface de Shh46

. Également, il a été illustré que Gas1 agissait avec Patched1

pour faire la liaison avec Shh lors du développement murin38

, avec Cdo39

ou même Boc52

.

Bien évidemment, tous ces chercheurs ont réussi à prouver que Gas1 semble agir en

partenariat pour induire sa signalisation par les voies GDNF ou Shh. Plus précisément, il a

même été souligné que Gas1 pouvait joue un rôle au sein des voies de signalisation d’AKT

et de ERK, des joueurs importants en oncologie.

8

1.4.4. Gas1 et l’apoptose

Il est maintenant bien connu que Gas1 possède un rôle important lors du mécanisme

apoptotique. En effet, dès les années 90, les scientifiques avaient remarqué qu’une

surexpression de Gas1 entraînait une mort cellulaire67

. Plusieurs ont par la suite tenté de

déceler les mécanismes entourant l’apoptose enclenché par Gas1.

Le premier exemple impliquant Gas1 avec l’apoptose a été démontré chez une lignée

cellulaire de gliome. En surexprimant la protéine Gas1, les chercheurs ont constaté qu’il y

avait une augmentation de l’activité de la caspase-3, un joueur important de l’apoptose, in

vitro67

. Par la suite, ce même groupe a démontré qu’il était possible avec l’aide d’un

rétrovirus exprimant Gas1, d’induire in vivo l’apoptose66

. En plus, un autre groupe a publié

qu’une version soluble de Gas1 était également capable d’induire l’apoptose61

. Également,

il a été validé que ce gène cause l'apoptose chez les cellules mammaires11

. Il était

maintenant clair que Gas1 possédait un rôle lors de la mort cellulaire, lorsque ce dernier est

exprimé fortement à l’aide d’un vecteur.

Un autre joueur important impliqué lors de l’apoptose est la protéine p53. En effet, cette

molécule est une pierre angulaire de la mort cellulaire, à un point où les cellules tumorales

s’en débarrassent régulièrement pour survivre109

. Un groupe a donc mis au point un

système bicistronique d’expression de Gas1 et p53 grâce à un adénovirus. Ainsi, en

infectant des cellules de gliome, ils ont réussi à induire l’apoptose chez elles. Cependant, ils

ont constaté que Gas1 seul était suffisant pour obtenir la mort cellulaire65

. Ils ont donc

démontré que l’apoptose stimulée par Gas1 était indépendant de p53.

D’un autre point de vue, d’autres scientifiques ont démontré une implication de l’apoptose

causée par Gas1 via la voie de signalisation de Ret. En effet, ils ont constaté qu’une

expression de Gas1 menait à une diminution de l’autophosphorylation du récepteur Ret. En

plus, ils ont observé qu’il y avait une déphosphorylation par AKT de la protéine Bad,

impliqué dans la répression de l’apoptose via l’inhibition du relâchement du cytochrome C,

une molécule essentielle à l’apoptose. Ils ont d’ailleurs enregistré une augmentation du

niveau du cytochrome C lors de la surexpression de Gas1, en plus d’une augmentation de

9

l’activité de la caspase-9 et de la caspase-3. Par la suite, ils ont remarqué qu’il n’y avait pas

plus d’activité de la caspase-8 (Figure 1). Finalement, ils ont exposé qu’une privation

nutritionnelle entraîne une augmentation de Gas1 et cause l’apoptose, mais que s’il y a en

plus une inhibition par petits ARN interférents de Gas1, les cellules ne mourraient plus61

.

Aussi, ce même groupe avait également illustré l’implication des GDNF avec Gas1. En

effet, ils ont découvert que si Gas1 est présent, les GDNF ne peuvent plus activer le

récepteur Ret43

. Par ces expériences, il apparait maintenant plus clair le mécanisme par

lequel Gas1 induit l’apoptose chez les cellules gliales.

Par la suite, un autre laboratoire a affirmé l’implication de Gas1 au sein de l’apoptose, mais

chez le cancer gastrique. Ils ont illustré qu’une augmentation de Gas1 diminue l’activation

de Bad, augmente la phosphorylation de Bax et de la caspase-3 et induit ainsi l’apoptose.

Dans une autre expérience, ils ont inhibé l’expression de Gas1, diminuant alors l’activation

10

de la caspase-3 et augmentant la survie cellulaire57

. Ce groupe a une fois de plus confirmé

le rôle de Gas1 lors de l’apoptose, mais chez un nouveau type de cancer.

Par ailleurs, d’autres chercheurs ont vérifié la possibilité d’un mécanisme d’activation de

Gas1 via la voie de signalisation Sonic Hedgehog (Shh). Ils ont prouvé que chez des

cellules de glioblastomes et astrocytomes, la surexpression de Gas1 cause l’apoptose sans

toutefois passer par la voie de Shh63

. Finalement, notre laboratoire a également démontré

pour la première fois que Gas1 est impliqué dans l’apoptose par l’activation de la caspase-

3, mais chez le mélanome métastatique murin B16-F1064

.

En contrepartie, il est important de souligner que certaines études attribuent le titre de gène

suppresseur de tumeurs à Gas1, pour ses caractéristiques apoptotiques. En effet, un

chercheur a testé des injections de cellules d'adénocarcinomes du poumon A549 ou de

fibrosarcomes HT1080 comportant un vecteur inductible de Gas1 chez des souris. Il a

observé moins de tumeurs et de plus petit volume lorsque Gas1 est exprimé. Il a donc émis

l'hypothèse que Gas1 était un gène suppresseur de tumeurs, faute de tumeurs viables en

présence de Gas115

.

Au final, Gas1 a été identifié lors d'un criblage pour déceler les gènes impliqués durant la

mort neuronale induite par le NMDA. Pour valider ce résultat, le chercheur a exprimé Gas1

par un vecteur chez des cellules de neuroblastome BM69 et a observé une forte diminution

de la viabilité cellulaire. Par contre, ce phénomène pouvait être restreint si le vecteur de

Gas1 était exprimé en même temps qu'un codant pour la protéine Bcl-2 ou OpIAP2, sans

toutefois co-immunoprécipiter ensemble28

. Ces résultats impliquent potentiellement Gas1

durant une mort cellulaire différente des autres études publiées jusqu’à ce jour.

L’apoptose est un processus biologique contre le cancer très intéressant dans l’optique

qu’elle permet d’induire la mort des cellules, éliminant la tumeur. Il est donc très captivant

de poursuivre les recherches entre Gas1 et l’apoptose avec pour cible un traitement par

l’expression de ce gène. Les études présentées ci-haut illustrent bien le potentiel et l’utilité

de Gas1 pour réaliser cet objectif.

11

1.4.5. Gas1, un gène suppresseur de métastases

L’étude fondamentale entourant les mécanismes métastatiques du cancer prend de

l’ampleur chaque jour. Les puces à ADN et l’utilisation des petits ARN interférents sont

des exemples de nouvelles technologies utilisées pour l’étude des métastases. C’est en

utilisant un criblage pangénomique par petits ARN interférents que le Dr. Gobeil a décelé

un nouveau rôle de gène suppresseur de métastases de Gas1 chez le mélanome64

. Il s’agit

d’une découverte importante pour l’avancement de la recherche contre la métastase.

Pour atteindre un site secondaire, les cellules de la tumeur primaire devront parvenir à

franchir les étapes de la cascade métastatique69

. Pour ce faire, elles vont accumuler des

modifications qui vont augmenter leur potentiel métastatique. Ces modifications vont

amener l’activation de gènes pro-métastatiques et la perte d’expression de gènes dont le

rôle réduit directement ou indirectement la capacité métastatique des cellules68

. Dans ce

cas, il s’agit de gènes suppresseurs de métastases. Il est donc fréquent de ne pas retrouver

leur expression chez des cellules métastatiques. Ainsi, il a été démontré que l’expression de

Gas1 est diminuée ou absente chez certains mélanomes64

, cancers de la prostate21-31

,

cancers de la thyroïde33

, cancers colorectaux50

ou gastriques57

. Pour cette raison, il est

important de souligner que Gas1 peut servir de biomarqueur de la progression tumorale44

.

Par conséquent, il est possible de croire en l’importance de la perte de Gas1 chez plusieurs

types de cancer pour le développement des métastases.

Jusqu’à ce jour, le Dr. Gobeil a démontré que Gas1 agit comme gène suppresseur de

métastases chez le mélanome. Tout d’abord, il a illustré qu’il y avait moins de Gas1 chez

les cellules métastatiques de mélanome B16-F10 en comparaison avec les lignées primaires

B16-F0. De plus, il a démontré que la perte d’expression de Gas1 par petits ARN

interférents chez les B16-F0 augmente leur potentiel métastatique. Par la suite, le Dr.

Gobeil a surexprimé Gas1 chez le mélanome métastatique B16-F10, ce qui a provoqué une

diminution de la capacité de formation de métastases. Ces résultats ont également été

confirmés in vivo64

(Figure 2). Ces expériences ont bien démontré le rôle de Gas1 comme

gène suppresseur de métastases chez le mélanome. En outre, bien que l’étude de Gas1

12

comme gène suppresseur de métastases soit jeune, il n’y a aucun doute de son fort potentiel

contre ce stade avancé du cancer.

1.4.6. Gas1, un gène à plusieurs rôles

En dernier lieu, il faut souligner que le gène Gas1 est également étudié pour la résistance

aux agents thérapeutiques, en reproduction, mais aussi chez d’autres pathologies comme

l’Alzheimer.

Un groupe de chercheurs a souligné un effet de résistance au médicament epirubicine chez

le cancer gastrique lors d'une diminution de Gas1. Ils ont émis l'hypothèse que le gène

réduit l'apoptose en dérégulant le ratio des protéines Bcl-2 et Bax47

. Il s’agit d’une première

concernant un rôle de résistance accrue en l’absence de Gas1.

Une autre implication pour le gène de Gas1 concerne son rôle lors du développement. En

effet, ce gène a été associé à l'organogénèse chez les fœtus de rat lors des stages

préliminaires du développement20

. Ensuite, Gas1 a été démontré comme étant exprimé au

sein de plusieurs régions lors de l'embryogénèse murine24

, en fonction du temps25

. Plus

précisément, Gas1 a pleinement été impliqué lors de la mort cellulaire interdigitale pendant

le développement25

. Ces études ont permis d’accroître encore plus les connaissances

entourant le gène Gas1.

13

En plus d'être impliqué pleinement au sein des recherches portant sur l’oncologie, Gas1 fait

l'objet d'études chez la pathologie de l'Alzheimer. En effet, un chercheur a prouvé qu'il y

avait une augmentation du taux de production d'amyloïde-β lorsque Gas1 n'est pas

exprimé51

. Cette recherche illustre bien le rôle important que joue le gène Gas1 contre la

pathologie de l’Alzheimer.

En conclusion, il est crucial de souligner que les études effectuées permettent d’accroître le

savoir entourant le gène Gas1. Ainsi, les recherches ont contribué à connaître mieux le

mécanisme d’opération de Gas1 lors du cycle cellulaire, de l’apoptose et du

développement. Les futures publications pourront donc permettre de mieux comprendre les

procédés derrières la répression de Gas1 chez les cellules les plus agressives et d’obtenir de

meilleurs résultats pour les thérapies contre les métastases.

1.4.7. La régulation de Gas1

Au fil des ans, plusieurs scientifiques se sont intéressés au gène Gas1 et les mécanismes

entourant sa régulation. Parmi eux, c’est la répression de Gas1 par l’oncogène c-Myc qui a

été la mieux détaillée. Par contre, il est important d’ajouter que d’autres recherches ont

réussi à bien illustrer l’implication directe de protéines dans la régulation du gène Gas1

comme le facteur de transcription Cggbp1, par exemple53

.

Dans un premier temps, des chercheurs ont confirmé l'implication potentielle de certains

gènes comme Tgf-β ou c-Myc dans la régulation de Gas1. En effet, lorsque les niveaux

d'expression de c-Myc augmente, les niveaux d'expression de Gas1 diminue, et vice-versa1-

2-29. L'expérience a été réalisée également chez les cellules Rat-1, mais avec plus de

profondeur. En effet, ce groupe a inséré un vecteur luciférase de Gas1 et c-Myc, pour

illustrer la répression de Gas1 par c-Myc et aussi avec un vecteur MycER inductible. Dans

les deux cas, lorsque c-Myc est présent, l’expression de Gas1 est réduite14

. Plus

précisément, un autre laboratoire a montré avec l'aide d'un vecteur MycS, dont la protéine

est tronquée pour inactiver la fonction transactivatrice, qu'il était encore possible de

réprimer un vecteur exprimant Gas1, selon une expérience de luciférase19

. Il en va de même

pour Tgf- β. En sa présence, le niveau d’expression de Gas1 est diminué chez les 3T37. De

plus, d'autres protéines ont été associées à Gas1. Par exemple, un groupe a dévoilé qu'une

liaison de l'intégrine α5-β1 et de la fibronectine amenait une réduction du niveau

14

d'expression du gène Gas18. Finalement, un autre laboratoire a démontré chez des souris

ayant une ablation du gène Dmp1 qu'il y avait une augmentation de l'expression de Gas1,

indiquant un nouveau répresseur potentiel48

. Ces gènes pourraient donc être tous des

répresseurs directs ou indirects de Gas1.

Par la suite, d'autres se sont penchés sur les activateurs potentiels de Gas1. Ainsi, O'Rourke

(O’Rourke, 1997) a stipulé que C/ebpδ pourrait être un activateur direct de Gas1, puisqu'il

est exprimé lors de l'arrêt du cycle cellulaire chez les fibroblastes murins12

. D'autre part, la

protéine Cggbp1 a été confirmée dans la régulation de Gas1 chez la lignée de gliomes

humains U-2987 Mg. En effet, sa réduction par ARN interférent stimule l'expression de

Gas1 et p21, tout en diminuant les marques de répression H3K9me353

. Par ailleurs, un autre

groupe a démontré que Gas1 pourrait être réprimé par la protéine Menin chez les cellules

MEF59

. Des voies de signalisation ont également été scrutées pour induire l'expression de

Gas1. En effet, un laboratoire a prouvé que la VE-cadhérine pouvait induire l'expression de

Gas1 chez les cellules HEK293. En plus, avec l'aide d'une protéine VE-cadhérine tronquée,

il a observé l'implication de la protéine PI3-K pour induire Gas1. Au final, il a également

émis l'hypothèse que Gas1 pourrait être activé par NFkB32

. De surcroît, un groupe a montré

que l'expression de Gas1 peut être induite par un stress engendré par un sevrage en

méthionine, une méthode utilisée pour combattre les cancers de la peau36

.

Par conséquent, il est important de comprendre la portée de ces études pour accroître les

outils face aux pathologies comme le cancer. Ainsi, en démontrant que Gas1 peut être

modulé par des répresseurs comme l’oncogène c-MYC, il est possible de croire en

l’utilisation du gène Gas1 comme mécanisme de frein du cycle cellulaire et pour amener les

cellules tumorales en apoptose. Ces recherches des protéines responsables de la régulation

de Gas1 sont donc particulièrement intéressantes.

1.5. La régulation épigénétique

Bien que les mutations génétiques comme les délétions soient essentielles pour l’évolution

des espèces, la régulation épigénétique tient également un rôle vital au sein de la biologie

cellulaire. Avec l’afflux de signaux externes, une cellule du système immunitaire peut

s’adapter en permettant l’expression de gènes pour la mobilité pour se déplacer vers un site

15

d’une blessure, par exemple197

. Bref, l’épigénétique permet une réactivité cellulaire

importante pour répondre aux différents signaux environnementaux.

Au niveau du cancer, il a été montré que la régulation épigénétique était souvent

déstabilisée afin de permettre l’activation d’oncogènes comme c-MYC185

et d’empêcher la

transcription de gènes anti-tumoraux comme p21104

. Par conséquent, il a été publié

fréquemment des régulations aberrantes de protéines impliquées dans l’épigénétique

comme les HDACs ou les KMTs chez les cellules cancéreuses122

. En somme, la régulation

épigénétique est cruciale pour la survie des cellules tumorales.

1.5.1. Le code des histones

Initialement, les chercheurs attribuaient l’acétylation des histones à des gènes ouverts,

permettant leur expression, et les marques de méthylation à des gènes fermés115

.

Rapidement, ces derniers ont compris que l’épigénétique était beaucoup plus subtile et

complexe qu’à prime abord. En effet, il a été démontré au fil des ans que l’acétylation et la

méthylation dépendaient plutôt de la position de ces marques sur les histones. Par exemple,

la méthylation au niveau H3K4 ou H3K36 a été associée à l’activation115

. De plus, une

balance entre l’acétylation et la méthylation a été décrite régulièrement, impliquant la

présence des deux groupements au même promoteur. De ce fait, la transcription est active

ou non dépendamment de la proportion d’un groupement en comparaison à l’autre56

. Il

apparait évident que beaucoup de recherches reste à effectuer pour déceler toute la finesse

auquel le code des histones est soumis.

1.5.1.1. Les marques activatrices

Il existe plusieurs marques d’histones présentes au promoteur des gènes en transcription.

Cependant, H3K4 et H3K36 sont les deux marques les mieux connues et étudiées

présentement pour mieux comprendre les mécanismes entourant leur régulation chez les

cellules tumorales.

H3K4 : La marque H3K4 a été associée à l’activation de gènes lorsqu’elle était di- ou tri-

méthylée. Par conséquent, il a été démontré que les cellules tumorales pouvaient utiliser des

histones déméthylases comme LSD1 ou JARID1 pour éliminer des groupements méthyles

16

et restreindre l’activation du gène118

. Dans de telle situation, il a été montré qu’il est

fréquent de retrouver de la méthylation à l’ADN apporté par la famille DNMT afin d’y

maintenir le gène fermé196

. De plus, la marque d’activation H3K4me3 a été rapportée pour

être important pour la phase d’initiation de la transcription avec les marques H3K9ac et

H3K14ac198

. En outre, la marque H3K4 est l’une des principales menant à l’activation

génique afin d’entamer la transcription des gènes.

H3K36 : Autre marque d’importance, H3K36 a été associé avec l’élongation lors du processus

de transcription. Par conséquent, il est fréquent d’y retrouver un groupement tri-méthyle

lorsque le gène est activé et produit de l’ARNm198

. De plus, il a été démontré que des

histones méthylases comme KDM5B pouvaient éliminer des groupements méthyles sur

H3K36 afin d’induire la polymérase en pause transcriptionnelle107

. Par conséquent, il s’agit

d’une marque d’activation importante pour permettre l’élongation de la polymérase.

1.5.1.2. Les marques répressives

Dans le cadre de la biologie cellulaire, les marques de répression au niveau des histones

sont très importantes. En effet, elles permettent d’atténuer l’expression de gènes néfastes

pour la cellule comme ceux impliqués dans les voies apoptotiques, mais importants lorsque

survient une nécessité, ce qui ne serait plus possible en présence d’une délétion197

. Par

contre, la répression épigénétique permet aux cellules tumorales d’éteindre des gènes qui

seraient susceptibles de les restreindre. Or, ces études sont très importantes pour mieux

cerner les processus cellulaires comme la répression épigénétique dans l’optique d’apporter

de nouvelles thérapies anti-tumorales.

H3K9 : La marque de répression H3K9me3 a été associée à l’hétérochromatine, dévoilant

bien son rôle lors de la répression115-116-117

. La famille de protéine HP1 a également été

prouvée comme élément stabilisateur de cette marque de répression et de l’état

d’hétérochromatine115

. En effet, cette liaison a été montrée comme possible par le

chromodomaine de la protéine HP1 se liant à la marque H3K9me3115

. D’une part, les

protéines SETDB1, SUV39H1, SUV39H2, EHMT1 et EHMT2 ont été publiées comme des

actrices lors de la modification de l’histone 3 en H3K9me3116-117

.

17

H3K27me3 : Cette marque de répression a été prouvée comme étant ajoutée par le complexe

PRC2116-117

. Récemment, deux autres protéines, AEBP2 et JARID2, ont été illustrées

comme pouvant jouer un rôle lors de la modification de cette marque de répression116

.

Au final, il faut ajouter qu’il existe d’autres marques de répression permettant la régulation

épigénétique comme H4K20me3129

, une marque pouvant jouer des rôles d’activation, de

répression ou même de réparation de l’ADN selon les circonstances. Ces marques sont de

plus en plus étudiées pour apporter de nouvelles perspectives contre le cancer.

1.5.1.3. Les régulateurs épigénétiques

La régulation épigénétique est un processus biologique très complexe impliquant plusieurs

joueurs comme les facteurs de transcription ou des protéines modifiant la configuration de

la chromatine pour permettre la transcription ou non. Au fil du temps, les chercheurs ont su

démontrer toute l’importance des protéines responsables de la modulation de la chromatine,

soit les DNA méthyltransférases, les histones méthyltransférases, les histones déacétylases,

les histones acétylases ou les histones deméthylases118-122-130

. De plus, il a été prouvé que

ces acteurs pouvaient être dérégulés afin de transcrire des gènes favorables au cancer et

d’empêcher la transcription d’autres gènes nuisibles au développement des cellules

tumorales130

.

Tout d’abord, la famille HDAC a été illustrée pour enlever les groupements acétyle des

histones130

. Elle se divise en quatre classes composées des HDAC1 à HDAC11 et des SIRT1

à SIRT7203

. Par ailleurs, il a été publié fréquemment que les HDACs pouvaient être

dérégulés chez plusieurs types de cancer comme celui du colon ou du sein122

. Par exemple,

les gènes p15139

, p21140-141

et p27141

ont été dévoilés comme pouvant être réprimés par les

HDACs. Il existe donc des inhibiteurs chimiques contre les HDACs en essais cliniques afin

d’être utiliser pour les empêcher de réprimer des gènes anti-tumoraux132

. Cette famille est

donc pleinement impliquée dans la régulation de la transcription génique chez le cancer.

Ensuite, la famille HAT a été associée pour sa part avec l’acétylation des histones,

permettant par le fait même la transcription des gènes130

. Cependant, il a été montré que les

cellules tumorales pouvaient diminuer l’expression des HATs pour atténuer la transcription

de gènes anti-tumoraux ou d’en augmenter l’expression pour stimuler des gènes pro-

18

cancer204-205

. En d’autres termes, il a été prouvé que la hausse ou la réduction des HATs

pouvaient influencer la régulation de plusieurs gènes chez les cellules tumorales.

Par la suite, une autre famille a été dévoilée pour jouer un rôle important lors de la

régulation épigénétique, soit les KMTs. Ces protéines ont été démontrées comme

responsables de la déméthylation de lysine sur les histones118-119

. Cette famille a été

associée à plusieurs protéines, soit les gènes KDM1 à KDM6118

. Régulièrement, les KMTs

sont dérégulés chez les cellules tumorales. Par conséquent, les protéines KDM1, KDM2,

KDM4 et KDM5 ont été découvertes comme déméthylant les marques de transcription

H3K4 et H3K36 pour empêcher la transcription de gènes anti-tumoraux alors que KDM3,

KDM4 et KDM6 déméthylent les marques de répression H3K9 et H3K27 pour permettre la

transcription d’oncogènes206

. En outre, il est facile de comprendre l’implication cruciale des

KMTs au sein des cellules cancéreuses.

Au final, la famille DNA méthyltransférase a été publiée pour jouer un rôle lors de la

répression des gènes. En effet, cette famille comportant les gènes DNMT1, DNMT3A,

DNMT3B et DNMT3L a été prouvée comme responsable de la méthylation de l’ADN lors

de la fermeture de gènes au niveau d'îlots CpGs130

. Par ailleurs, les DNMTs ont été montrés

comme pouvant réprimer les gènes anti-tumoraux comme p14142

, p21 ou p16143

. En

somme, cette famille permet de maintenir fermés les gènes agissant contre les cellules

cancéreuses.

1.5.2. La pause transcriptionnelle

La pause transcriptionnelle est un mécanisme qui a été mis en lumière grâce à des études

sur les protéines Hsp70 au cours des années 90. Il a été démontré que la polymérase était

présente au promoteur du gène Hsp70 et parée pour la transcription. Pour ce faire, deux

protéines ont été illustrées comme rétentrices de la transcription, soit NELF et DSIF. En

présence d’un stimulus de choc thermique, le gène peut être rapidement activé pour

permettre aux cellules de résister à la chaleur199

. L’étude des Hsp a permis de mieux

comprendre le mécanisme entourant le maintient de la polymérase dans un état de pause

transcriptionnelle.

19

Dans un contexte oncologique, il arrive régulièrement que les cellules tumorales aient

recours à ce type de mécanisme pour restreindre la transcription de certains gènes pouvant

être utiles dans d’autres circonstances. C’est notamment le cas des gènes c-Myc et c-Fos200

.

Il a été prouvé qu’en premier lieu, les protéines NELF et DSIF étaient responsables d’un

maintient de la polymérase en pause transcriptionnelle en empêchant sa phosphorylation.

Pour sa part, P-TEFb était responsable de la phosphorylation du domaine c-terminal de la

polymérase, inhibant la répression de NELF et DSIF, et permettant la transcription167

. Ce

type de mécanisme est donc très important afin de moduler rapidement l’expression de

certains gènes en toute circonstance.

1.5.3. La poly(ADP-ribosyl)ation

Bien qu’ayant un rôle très important lors de la réparation de l’ADN, la poly (ADP-

ribosyl)ation est un mécanisme épigénétique également utilisé par les processus

biologiques pour l’activation et la répression génique178

. Par exemple, il a été illustré

qu’afin de résister au stress inflammatoire, la PARP-1 pouvait activer p65NF-κB lors de la

tumorigénèse179

. De plus, il a été démontré que certains facteurs de transcription comme

KDM5B pouvaient dépendre d’une PARylation par PARP-1 pour être inactivés, les

empêchant d’effectuer une répression180

. D’ailleurs, il a été publié que la combinaison

PARP-1/CTCF pouvait inhiber la protéine DNMT1 (Figure 3), permettant donc à la

chromatine de rester hypométhylée et donc de permettre la transcription181

. Par contre, il a

été montré que la PARP-2 pouvait agir comme répresseur en recrutant des HDACs183

, tout

comme les isolateurs CTCF avec la cohésine184

. D’un autre côté, le rôle inverse de la

PARG a été dévoilé comme une balance à la PARP. Ainsi, la PARG pouvait réduire la

PARylation de DNMT1 et permettre la méthylation de l’ADN et la répression génique182

.

En outre, il est facile de voir l’équilibre derrière les mécanismes épigénétiques impliquant

la poly(ADP-ribosyl)ation et le rôle important pour les PARPs, la PARG et les isolateurs

CTCF au sein du cancer.

20

1.5.4. Les microARNs

Au cours des dernières années, les scientifiques ont porté leur attention sur les mécanismes

entourant la régulation des gènes par les microARNs. Leur présence permet donc d’ajuster

finement les niveaux d’ARNm de gènes comme p21194

. Pour ce faire, certaines régions

génomiques contenant les microARNs sont transcrites, libérant des pri-microARNs. Ces

derniers sont catalysés en pré-microARNs par le complexe DGCR8/Drosha. Ensuite, les

pré-microARNs sont clivés en duplex microARN/microARN par un autre complexe

contenant la protéine DICER. Par la suite, le complexe RISC assemble l'ARNm, le

microARN et la protéine Ago, responsable de la dégradation de l'ARNm212

. Ainsi, par des

mécanismes de dérégulation génétique ou épigénétique, il a été démontré que les

microARNs sont régulièrement impliqués dans la répression génique chez les cellules

tumorales195

. Par conséquent, il est bien d’ajouter que les cellules cancéreuses peuvent

utiliser ce mécanisme pour réduire l’expression des gènes anti-tumoraux.

1.6. L’oncogène c-Myc

Les oncogènes peuvent mener au développement néoplasique, seuls ou en présence d’autres

facteurs185

. Ras, raf, src et myc sont des exemples de ces gènes186

. Fréquemment, les

21

oncogènes seront exprimés constitutivement. Ces gènes vont permettre la prolifération

cellulaire aberrante en dérégulant des voies de signalisation comme AKT ou ERK186

. Par

exemple, b-Raf est souvent activé constitutivement chez les mélanomes et les cancers

colorectaux, ovariens187

, thyroïdiens188-189

et pulmonaires190-191

. De tous ces oncogènes, c-

Myc est le plus étudié pour ces multiples rôles lors de la régulation cellulaire.

Parmi les facteurs nécessaires pour favoriser l’apparition tumorale, plusieurs types de

cancer possèdent une expression aberrante de proto-oncogènes185

. Le gène c-Myc fait partie

de cette catégorie. Chez de nombreuses tumeurs, c-Myc est surexprimé, causant un

dérèglement du cycle cellulaire. C-Myc est un facteur de transcription ciblant des gènes

impliqués dans la promotion du cycle cellulaire. De plus, il est connu pour réprimer

plusieurs candidats freinant le cycle cellulaire192

. Finalement, il possède également un rôle

de protection contre l’apoptose193

. Il est possible de concevoir la présence particulièrement

grande de c-Myc au sein des processus biologiques.

1.6.1. Le rôle de répresseur génique de c-Myc

Il n’y a plus de doute possible, le facteur de transcription c-Myc possède un rôle

d’activateur, mais également de répresseur génique. En effet, les évidences se sont

accumulées au cours des années, portant sur différents complexes répresseurs comme c-

Myc/Miz1/Max82-89

ou c-Myc/KDM5B/TFAP2C105

. Par conséquent, il est facile de

visualiser toute la finesse cellulaire derrière les mécanismes de répression impliquant c-

Myc et son importance pour mieux s’outiller face au cancer.

En premier lieu, il incombe de porter l’attention sur l’un des premiers complexes répressifs

publiés au fil des ans, soit l’interaction c-Myc/Miz1/Max82-89-92-97

(Figure 4A). En effet,

plusieurs chercheurs ont démontré l’étendu d’un tel partenariat pour la répression génique

au sein des cellules tumorales. Par exemple, des chercheurs ont prouvé que ce complexe

était présent au promoteur du gène C/EBPδ et le réprimait, chez des cellules épithéliales

mammaires en prolifération82-89

. De plus, ce complexe a été découvert au promoteur du

gène GADD153, par immunoprécipitation de la chromatine chez les cellules Rat-192

. Le

complexe c-Myc/Max/Miz1 s’ait aussi révélé être répresseur du gène p15 chez des cellules

MEFs97

. Dans le même sens, un autre laboratoire a utilisé un criblage pour découvrir 67

gènes inhibés par le complexe c-Myc/Miz1. En utilisant un mutant (MycV394D)

22

empêchant le lien entre c-Myc et Miz1, il a trouvé qu’il y avait une forte diminution de

l’expression de ces 67 gènes seulement avec un vecteur exprimant c-Myc en comparaison

au vecteur mutant88

. Par la suite, il a été démontré que Miz1 et c-Myc répriment plusieurs

gènes de la famille Hox100

, p21104

, des membres DNRG102-103

ou un membre de la voie de

signalisation Wnt, WIF-1101

. Il est intéressant d’ajouter que le complexe de répression

entourant c-Myc peut varier. En effet, il a été confirmé que c-Myc/Miz1/Gfi-1 pouvait

réprimer le gène p2190

, mais également le gène p1591

. Ces expériences ont donc permis

d’approfondir les connaissances entourant le dynamisme derrière la répression par c-Myc,

passant par le partenaire Miz1.

Ensuite, bien que certaines études aient stipulé une répression de c-Myc/Miz1/Max,

d’autres laboratoires ont illustré différents mécanismes de répression entre c-Myc et Max

indépendant de Miz1. Une étude a même mis en lumière lors d’un criblage la dépendance

de c-Myc à Max pour réprimer plusieurs gènes93

. De plus, en 2004, c-Myc/Max ont été

directement trouvés au promoteur des gènes GADD45a et GADD153 chez les cellules Rat-

192

. Également, ces deux protéines ont été associées à la répression du gène p2796

. Il est

facile de deviner toute la complexité en arrière des processus de répression par c-Myc et

l’étendu des recherches qu’il reste à faire pour mieux les comprendre.

Il est à souligner également que plusieurs publications ont établi qu’il y a un équilibre entre

les complexes de facteurs de transcription, c-Myc/Max, Max/Max et Max/Mad, pour

réguler les gènes cibles95-99

comme ODC94

ou hTERT98

. Cet équilibre est particulièrement

pratique pour établir des ajustements fins lors des processus biologiques chez les cellules

saines, mais également très complexe à étudier lors de pathologies comme le cancer.

23

Par la suite, il faut mentionner qu’un autre complexe a été impliqué lors de la répression de

plusieurs gènes. Il s’agit du complexe c-Myc/Sp1 (Figure 4B). En fait, Gartel (Gartel,

2001) a illustré le rôle de ce complexe pour la répression du gène p21 chez les cellules

d’adénocarcinome du colon Caco-278-81

. Également, un autre scientifique a montré qu’un

complexe Sp1/Smad2-3/c-Myc pouvait interagir ensemble pour causer une répression du

gène p15Ink4B

chez la lignée cellulaire HaCaT79-81

(Figure 4C). Lors de l’utilisation d’un

nouvel inhibiteur d’histones déacétylases, le Phenethylisothiocyanate (PEITC), Wang

(Wang, 2008) a démontré une nouvelle fois l’action du complexe répressif c-Myc/Sp1 sur

le gène p21, mais chez le cancer de la prostate. Ainsi, suite au traitement avec le PEITC, le

promoteur du gène p21 avait perdu la protéine c-Myc, en plus de devenir hypométhylé et

actif84

. De surcroît, la présence d’un complexe répresseur c-Myc/Sp1/Max au promoteur du

gène BRD7 a également été publiée, bien que seul c-Myc semblait le réguler

négativement85

. Une expérience similaire a montré que Sp1/c-Myc pouvait réprimer le gène

BAG2 chez les cellules TRE29387

. Par ailleurs, le complexe c-Myc/Sp1 a même été publié

chez des cellules T du système immunitaire de patients infectés par le HIV en latence. En

fait, la présence des trois protéines c-Myc/Sp1/Hdac1 a été remarquée au niveau du

promoteur HIV latent83

. Ces résultats dévoilent une nouvelle fois la variabilité entre les

différents mécanismes de répression cellulaire engendrés par la protéine c-Myc.

24

Au cours des dernières années, plusieurs laboratoires ont découvert d’autres partenaires ou

processus permettant une répression par c-Myc. Par exemple, il a bien été illustré qu’une

interaction entre c-Myc/KDM5B/TFAP2C (Figure 5) menait à la répression du gène p21

chez les cellules MCF-7105

, confirmant l’implication potentiel de membres de la famille

d’histone 3 lysine 4 demethylases JARID1 avec c-Myc106

. De plus, il a été prouvé que la

répression par c-Myc pouvait impliquer des histones déacétylases comme HDAC183

et

HDAC3108

ou des DNA methyltransférases comme DNMT3a et DNMT3b109

, chez

plusieurs gènes. Cependant, c-Myc a été démontré comme pouvant réprimer non

seulement des gènes, mais aussi des microARNs. Ainsi, il a été publié que c-Myc était

responsable de la répression du miR-26a, un microARN ayant des vertus d’atténuation de

la prolifération cellulaire, chez des cellules d’un lymphome murin107

.

En conclusion, il apparait évident que c-Myc joue un rôle majeur lors de la répression de

plusieurs gènes engagés dans une grande variété d’activité cellulaire comme p2178-81

ou

Gas129

. Avec les années, beaucoup études ont démontré l’implication de plusieurs

partenaires potentiels pour exercer le rôle de répresseur attribué à c-Myc. Bien que Sp1 ou

Miz1 semble faire partie de ce complexe empêchant la transcription de gènes, certains

scientifiques se posent la question à savoir si ces deux partenaires sont bien nécessaires

pour que c-Myc parvienne à exécuter sa répression86

. D’autres publications futures pourront

permettre de mieux cerner les différents rôles intermoléculaires joués par cet ensemble très

complexe de facteurs de transcription.

25

1.7. Problématique et implications scientifiques de l’étude du gène

Gas1

L’étude des gènes suppresseurs de métastases comme Gas1 est très important pour la

recherche contre le cancer. En effet, cette pathologie est devenue la première cause de

décès en Amérique du Nord. De surcroît, les métastases sont responsables d’un très grand

nombre de cette mortalité. L’acquisition de connaissances entourant les mécanismes

biologiques menant à la formation de colonies secondaires est donc cruciale dans cette lutte

contre le cancer. Nous nous sommes donc penché à découvrir comment le gène Gas1 est

régulé chez les lignées métastatiques étudiées. À la lumière de la littérature illustrant

l’implication de c-Myc lors du processus de répression du gène Gas1, nous avons émis

l’hypothèse que cet oncogène était responsable de l’arrêt de la transcription de Gas1 par le

recrutement de complexes répresseurs.

Pour en découvrir la véracité, nous avons d’abord fixé comme objectifs de trouver un

modèle cellulaire de lignées primaires et métastatiques pour en vérifier les niveaux

d’expression du gène Gas1. Par la suite, nous voulions déterminer la composition

moléculaire au niveau du promoteur de ce gène, soit en étudiant les groupements

d’acétylation et de méthylation sur l’ADN et les histones. En plus, nous voulions démontrer

l’implication de complexes par l’utilisation d’inhibiteurs chimiques empêchant la

répression de Gas1. Ensuite, nous désirions établir les facteurs de transcription

responsables d’empêcher la transcription de ce gène par des immunoprécipitations de la

chromatine et l’utilisation de petits ARN interférents. Finalement, notre objectif principal

était de détourner la répression du gène Gas1 dans l’optique d’une utilisation thérapeutique

contre la métastase.

26

27

2. Méthodologie

Par souci d'allègement, les références des produits utilisés sont en annexe 1.

2.1. Culture cellulaire

Les lignées de mélanomes murins faiblement métastatique B16-F0 (ATCC #CRL-6322) et

fortement métastatique B16-F10 (ATCC #CRL-6475) sont cultivées dans le milieu de

culture DMEMA1

contenant du FBSA2

[10%]. Les lignées de mélanomes humains

faiblement métastatiques C81-61 (Don du Dre. MJ Hendrix) et fortement métastatiques

C8161 (Don du Dre. MJ Hendrix) sont cultivées dans le milieu F10-HAMA3

contenant du

FBSA2

[15%] et du Mito+ extension de sérumA4

[1x] et dans le milieu RPMI 1640A5

contenant du FBSA2

[10%] et de l'hepesA6

[20mM] respectivement. La lignée de mélanome

métastatique Lox-IMVI (Don Dr. MR Green) a été cultivée dans le milieu RPMI 1640A5

contenant du FBSA2

[10%]. Par la suite, les lignées du cancer du sein murin faiblement

métastatiques 67NR (Don du Dr. MR Green) et fortement métastatiques 4T1 (ATCC

#CRL-2539) sont cultivées dans le milieu DMEMA1

contenant du FBSA2

[10%] et

DMEMA1

contenant du FBSA2

[5%], du MEM [5%] et du NCSA8

[5%] respectivement.

Finalement, les cellules embryonnaires humaines de rein HEK 293T (Don Dr. MR Green)

et HEK 293T G/P (Don du Dr. MR Green) sont cultivées dans le milieu de culture

DMEMA1

contenant du FBSA2

[10%]. Il est à noter que tous les milieux de culture sont

complétés avec de la L-glutamineA9

[2mM] et les antibiotiques pénicilline/streptomycineA10

[1x].

2.2. Les vecteurs d’expression

Tous les clonages moléculaires passent par un vecteur de transport, pGEM-T Easy, pour

conserver un vecteur facilement transférable vers une autre destination. Les shRNA pour la

répression d'ARNm sont tous dans le vecteur lentiviral pLKO.1. Les surexpressions

géniques sont dans le vecteur QCXI-P. Finalement, les séquences 3'UTR de Gas1 pour les

essais de luciférase sont dans le vecteur pGL4.13. Cartographie des vecteurs en annexe

trois.

28

2.3. Traitements chimiques cellulaires

Les cellules sont traitées avec un inhibiteur d'histone déacétylases, la TSAB1

, [0,3µM et 1

µM] pendant 24 à 48 heures. Les cellules sont traitées également avec un inhibiteur de

DNA méthyltransférases, le 5-AzaB2

, [1µM, 3µM et 10µM] pendant 48 à 72 heures.

Finalement, les cellules sont traitées avec un inhibiteur de c-MycB3

[50µM et 100µM] et un

inhibiteur de bromodomaine, JQ1B4

, [500nM] pendant 4 à 24 heures.

2.4. Extraction d’ARN

De 2-8 millions de cellules sont incubées dans un pétri de 100 mmC1

pour chaque extraction

d’ARN. Le milieu de culture est aspiré et les cellules sont lavées au PBS [1x] deux fois. Par

la suite, les cellules sont grattées et lysées directement dans le pétri avec la solution de

lyseC2

. Les échantillons sont filtrés sur une colonneC3

pour enlever les débris cellulaires. De

l'éthanol-H2O DEPC [70%] est ajouté aux échantillons filtrés pour permettre l'adhésion à la

colonneC3

. Ensuite, le mélange est passé sur une colonne d’attachement d’ARNC4

pour

conserver l’ARN des cellules. Les colonnes sont lavées une première fois avec la solution

de lavage IC5

. Les traces d’ADN sont dégradées avec l’ajout de DNAseC6

[1x] sur colonne

pendant 20 minutes à température pièce. L’ARN est lavé une deuxième fois avec la

solution de lavage IC5.

Par la suite, l’échantillon est lavé deux fois avec la solution de

lavage IIC7

. Finalement, l’ARN est récupéré avec la solution d’élutionC8

.

2.5. Dosage d’ARN

Tous les échantillons d’ARN sont dosés au spectrophotomètre. Le blanc de référence est la

solution d’élutionC8

. L’ARN est dosé aux longueurs d’ondes 260/280. La pureté de l’ARN

peut être vérifiée par bioanalyseur.

2.6. Réaction de transcription inverse

Une quantité de 2 µg d’ARN total est combiné avec un mélange d’amorces d’hexamères et

d’oligo(dT) ancréesD1

[60 µM] et complété à 16 µl avec de l’H2O DEPC. Les échantillons

sont incubés à 70°C pendant 5 minutes et rapidement déposés sur glace. Ensuite, l’enzyme

de transcriptase inverseD2

[200U/µl] avec son tamponD3

[10x] et l’inhibiteur de RNasesD4

29

[40U/µl] sont ajoutés à l’échantillon pour effectuer la réaction de transcription inverse.

Finalement, le tout est incubé à 25°C pendant 5 minutes pour l'appariement des amorces,

42°C pendant 1 heure pour la synthèse de l'ADNc et 80°C pendant 5 minutes pour

l'inactiver l'enzyme. Les échantillons sont complétés à 200 µl avec de l’H2O Milli-Q.

2.7. Réaction en chaîne par polymérase quantitative

L’expression des gènes est quantifiée en temps réel avec une PCR quantitative210

. De 500

ng à 1000 ng de la réaction de transcription inverse est mélangée avec de l’H2O Milli-Q,

des amorces de gauche et de droite [5 µM] et un mélange de l’agent fluorescent, de tampon

et de polyméraseE1

[2x] dans une plaque 96 puitsE2

. La plaque est scellée avec un film

collantE3

. Le protocole est le suivant : activation de l'enzyme à 95°C pendant 10 minutes,

dénaturation de l'ADN à 95°C pendant 15 secondes, liaison des amorces avec l’ADNc et

élongation à 60°C pendant 1 minute. Les deux dernières étapes sont répétées 40 cycles. La

qualité des amorces est vérifiée par une courbe de dissociation allant de 65°C à 95°C par

0.5°C pendant 0.05 seconde. Liste des amorces utilisées en annexe.

2.8. Immunoprécipitation de la chromatine

Protocole par le Dr. Nelson211

.

2.8.1. Fixation et récolte cellulaire

Toutes les étapes sont effectuées sur glace pour protéger les protéines de la dégradation. Un

nombre de 10 millions de cellules par immunoprécipitation de la chromatine sont incubées

dans des pétris 150 mmF1

. Les cellules sont fixées avec de la formaldéhydeF2

[37%] à une

concentration finale de 1.42% pendant 10 minutes. Le formaldéhyde est inhibé avec de la

glycineF3

[1M] à une concentration finale de [141 mM] pendant 5 minutes. Les cellules

sont lavées deux fois au PBS [1x] froid et elles sont grattées et transférées dans un tube de

1.5 mlF4

. Les cellules sont centrifugées à 2000g pendant 5 minutes et le surnageant est

aspiré.

30

2.8.2. Lyse cellulaire

Le culot cellulaire est lysé avec du tampon d’immunoprécipitation froid (NaClF5

[150mM],

TrisF6

-HCLF7

[50mM] pH 7.8, EDTAF8

[5mM], NP-40F9

[0.5% vol/vol] et Triton X-100F10

[1% vol/vol]) contenant des inhibiteurs de protéases (PMSFF11

[0.1M] et leupeptineF12

[10

µg/ml]). L’échantillon est centrifugé à 12 000g pendant 5 minutes et le surnageant est

aspiré. Le culot nucléaire est lysé à nouveau avec du tampon d’immunoprécipitation froid

contenant des inhibiteurs de protéases. L’échantillon est centrifugé à nouveau et le

surnageant est aspiré. Le culot nucléaire est lysé une dernière fois avec du tampon

d’immunoprécipitation froid contenant des inhibiteurs de protéases. L’échantillon est

séparé en deux parties pour augmenter l’efficacité de la sonication.

2.8.3. Sonication

Chaque échantillon est soniqué par ultrason avec un sonicateurF13

possédant une sondeF14

1/8 pour permettre le déchirement de l’ADN en longueur de 1 à 5 nucléosomes. Les

conditions de sonication sont les suivantes : 10 répétitions de 15 secondes à la puissance 10

sur 20 sur glace. Par la suite, les échantillons sont centrifugés 12 000g pendant 10 minutes

et le surnageant de tous les échantillons est transféré dans un même tube de 15 mlF15

. Le

tout est mélangé par inversion douce.

2.8.4. Immunoprécipitation

Ensuite, le mélange est séparé en un aliquote servant de référence, congelé à -80°C, un

aliquote pour vérifier la sonication de l’échantillon, congelé à -80°C, un volume pour servir

de bruit de fond et un volume par anticorps. Les aliquotes sont de 1x105 cellules et les

volumes d’immunoprécipitation sont de 1x107 cellules. Les anticorps pour

l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt sont ajoutés. La quantité d’anticorps varie

entre 2 µg et 8 µg (Liste en annexe). Un anticorps normal de lapin de type IgG est utilisé

pour l’échantillon de bruit de fond. Il permet en effet de réduire l’ADN non spécifique en

diminuant son interaction avec les billes. Les échantillons avec les anticorps sont incubés à

4°C toute la nuit sur un rotatoire. Le lendemain, les échantillons sont centrifugés à 12 000g

pendant 10 minutes. Pendant ce temps, les billes d’agarose AF16

ou GF17

, selon les types

31

d’anticorps, sont lavées 3 fois avec du tampon d’immunoprécipitation pour enlever

l’éthanol des billes. Un lavage consiste à ajouter du tampon, centrifuger à 2000g pendant 1

minute et aspirer le surnageant avec précaution. Ensuite, les billes sont pré-nettoyées avec

de la BSA [5%] pendant 30 minutes sur rotatoire. Une fois la centrifugation des

échantillons de 10 minutes terminée, 90% du surnageant est transféré dans les billes

d’agarose. Les échantillons sont incubés pendant 45 minutes à 4°C sur le rotatoire. Après

l’immunoprécipitation, les billes d’agarose sont lavées 5 à 6 fois. Un lavage consiste à

centrifuger les billes à 2000g pendant 1 minute à 4°C et aspirer le surnageant. Le tampon

d’immunoprécipitation froid est ajouté pour laver les billes. Une fois les lavages terminés,

il faut aspirer complètement le tampon des billes d’agarose.

2.8.5. Préparation de l’ADN

Pendant l’immunoprécipitation, la référence et l’échantillon sont décongelés pour vérifier la

qualité de la sonication. L’ADN est précipité avec de l'éthanol [100%] et incubé à

température pièce 10 minutes. Le tout est centrifugé à 12 000g pendant 3 minutes à 4°C et

le surnageant est aspiré. Ensuite, le culot d’ADN est lavé avec de l’éthanol [75%],

centrifugé à 12 000g pendant 1 minute à 4°C et le surnageant est aspiré. L’ADN est séché

pendant 15 minutes à température pièce. Une fois terminée, du chelex-100F18

[10%] est

ajouté aux échantillons.

2.8.6. Isolation de l’ADN

Du chelex-100F18

[10%] est ajouté aux billes d’agarose des échantillons et de la protéinase

KF19

[20 µg/ µl]. Les échantillons sont incubés à 55°C pendant 30 minutes. Ensuite, ils sont

bouillis pendant 10 minutes. Ces deux étapes permettent de dégrader les protéines pour ne

conserver que l’ADN. Le tout est centrifugé à 12 000g pendant 1 minute à 4°C et le

surnageant est transféré dans un nouveau tube de 1.5 mlF4.

De l’eau Milli-Q est ajoutée pour

laver les billes et le chelex-100F18

. Les échantillons sont centrifugés à nouveau et le

surnageant est transféré avec l’autre surnageant.

2.8.7. Réaction en chaîne par polymérase quantitative

L’expression des gènes d’intérêt est quantifiée en temps réel avec une PCR quantitative.

L'ADN immunoprécipité est mélangé avec de l'H2O Milli-Q, des amorces de gauche et de

32

droite [5 µM] et du Sybr GreenE1

[2x] dans une plaque 96 puitsE2.

La plaque est scellée

avec un film collantE3.

Le protocole est le suivant : activation de l'enzyme à 95°C pendant

10 minutes, dénaturation de l'ADN à 95°C pendant 15 secondes, liaison des amorces à

l’ADNc et élongation de l'ADN à 60°C pendant 1 minute. Les deux dernières étapes sont

répétées 40 cycles. La qualité des amorces est vérifié une courbe de dissociation allant de

65°C à 95°C par 0.5°C pendant 0.05 seconde. Les résultats sont comparés à

l’enrichissement au dessus du bruit de fond. En d’autres mots, lorsque la protéine est

présente au promoteur du gène d’intérêt, l’immunoprécipitation a enrichi la quantité

d’ADN disponible, contrairement au contrôle négatif. Par conséquent, plus

l’enrichissement est élevé par rapport au contrôle négatif, plus la protéine est présente au

promoteur du gène. Liste des amorces en annexe.

2.8.8. Vérification de la sonication

Les résultats de la sonication sont vérifiés sur un gel d'agarose [1%]. Le gel est obtenu en

mélangeant 1% d'agarose avec un tampon de TAE [1x] (TrisF6

[40mM], acide acétique

glacialF20

[20mM] et EDTAF8

[1 mM] pH 8.0). Le mélange est chauffé aux micro-ondes

pour dissoudre l'agarose. Une fois refroidit à 60°C, du bromure d'éthidium [10 mg/ml] est

ajouté au mélange pour permettre la visualisation de l'ADN aux rayons ultraviolets. Les

échantillons sont ajoutés aux puits et migrés à 100 volts pendant 1 heure. Les résultats sont

observés aux rayons ultraviolets et comparés à une échelle de 100 paires de basesF21

[500µg/ml].

2.9. Clonage moléculaire

2.9.1. Réaction en chaîne par polymérase

Les échantillons sont amplifiés à partir d'une librairie d'ADN complémentaire obtenue suite

à l'extraction d'ARN et d'une réaction de transcription inverse. Les amplifications ont été

effectuées avec deux types d'enzymes selon les besoins, soit la Pfu ADN polymérase et la

Taq polymérase.

Pfu ADN polymérase Phire IIG1

:

33

Les éléments suivants sont utilisés pour effectuer l'amplification désiré : du tampon de

Phire IIG2

[5x], des dNTPsG3

[10mM], des amorces de droite et de gauche [5 µM], de

l'ADNc, du DMSOG4

[100%], du CES [5x] (un amplificateur permettant une meilleure

amplification des régions riches en GC), de la Phire IIG1

et le tout est complété avec de

l'H2O Milli-Q. La réaction est exécutée selon le protocole suivant : activation de l'enzyme à

98°C pendant 30 secondes, dénaturation de l'ADN à 98°C pendant 10 secondes,

appariement des amorces - température variable selon les amorces - pendant 30 secondes et

élongation de l'ADN à 72°C pendant 1 minute. Les trois dernières étapes sont répétées 25 à

40 cycles selon les besoins. Finalement, l'élongation est complétée par une étape de 72°C

pendant 10 minutes. Étant donné les bouts francs laissés par la Pfu ADN polymérase, de la

Taq polyméraseG5

est ajouté aux échantillons avec une incubation additionnelle à 95°C

pendant 5 minutes pour activer la Taq polymérase et 72°C pendant 15 minutes pour ajouter

une queue de poly-A. Liste des amorces en annexe.

Taq polyméraseG5

:

Les éléments suivants sont utilisés pour effectuer l'amplification désiré : du tampon de Taq

polyméraseG6

[10x], des dNTPsG3

[10mM], des amorces de droite et de gauche [5 µM], de

l'ADNc, du MgCl2G7

[25mM], du CES [5x], de la Taq polyméraseG5

et le tout est complété

avec de l'H2O Milli-Q. La réaction est exécutée selon le protocole suivant : activation de

l'enzyme à 95°C pendant 5 minutes, dénaturation de l'ADN à 95°C pendant 30 secondes,

appariement des amorces - température variable selon les amorces - pendant 30 secondes et

élongation de l'ADN à 72°C pendant 1 minute. Les trois dernières étapes sont répétées 25 à

40 cycles selon les besoins. Finalement, l'élongation est complétée par une étape de 72°C

pendant 10 minutes. Liste des amorces en annexe.

2.9.2. Gel d’agarose

Tous les produits obtenus par PCR sont vérifiés sur gel d'agarose [0.8%]. Le gel est obtenu

en mélangeant 0,8% d'agarose avec un tampon de TAE [1x] (TrisF6

[40mM], acide acétique

glacialF20

[20mM] et EDTAF8

[1 mM] pH 8.0). Le mélange est chauffé au four à micro-

ondes pour dissoudre l'agarose. Une fois refroidit à 60°C, du bromure d'éthidium [10

mg/ml] est ajouté au mélange pour permettre la visualisation de l'ADN aux rayons

ultraviolets. Les échantillons sont ajoutés aux puits et migrés à 100 volts pendant 1 heure.

34

Les résultats sont observés aux rayons ultraviolets et comparés à une échelle de 1000 paires

de basesG9

[500µg/ml].

2.9.3. Purification d’ADN

Les bandes sélectionnées sur le gel d'agarose sont coupées avec l'aide d'un scalpel et

déposées dans un tube 1.5 mlF4

. Trois volumes de tampon QX1G9

sont ajoutés par 100 mg

de bandes d'agarose extraites pour permettre la dégradation de l'agarose. La solution

QX2G10

est ajoutée au mélange pour lier l'ADN resuspendu. Le tout est incubé à 50°C

pendant 10 minutes pour entamer la dégradation de l'agarose. Ensuite, l'échantillon est

centrifugé à 13000 rpm pendant 30 secondes. Le culot est lavé avec la solution QX1G9

pour

enlever les traces d'agarose restantes. Le tout est centrifugé à nouveau à 13000 rpm pendant

30 secondes. Le culot est ensuite nettoyé deux fois avec la solution tampon PEG11

pour

éliminer les sels. Le culot est séché pendant 10 à 15 minutes à l'air pour finalement être

élué dans de l'H2O Milli-Q.

2.9.4. Digestion enzymatique

Les échantillons d'ADN purifié sont mélangés avec les enzymes de restriction (Liste en

annexe) et leur tampon respectifG12-G13-G14-G15

. De plus, pour certaines enzymes, de la

BSAG16

est ajoutée. Toutes les digestions sont incubées à 37°C pendant 1 heure et vérifiées

sur un gel d'agarose [0.8%].

2.9.5. Déphosphorylation de vecteurs

Une fois digérée, les vecteurs sont déphosphorylés pour empêcher qu'ils ne se referment sur

eux-mêmes en mélangeant : le tampon de phosphatase alcalineG17

[2x], le vecteur et la

phosphatase alcalineG18

[10000U/ml]. Le mélange est incubé à 37°C pendant 30 minutes.

La phosphatase est ensuite inactivée en incubant à 65°C pendant 10 minutes.

2.9.6. Ligation

Les ligations sont effectuées en mélangeant l'ADN à insérer avec un vecteur, le tampon de

ligation [2x], la ligase T4G19

[400000U/ml] et en complétant avec de l' H2O Milli-Q. Les

échantillons sont par la suite incubés à 16°C toute la nuit.

35

2.9.7. Transformation bactérienne

Une partie du produit de ligation est mélangée avec des bactéries TOP10F' chimio-

compétentes et incubée sur glace pendant 30 minutes. Par la suite, un choc thermique est

effectué en déposant l'échantillon dans un bain à 42°C pendant 45 secondes, suivi d'un

retour sur glace pour permettre l'entrée du plasmide dans les bactéries. Du milieu de culture

LB est ajouté pour la croissance des bactéries et elles sont déposées à 37°C avec agitation

de 200 rpm pour 1 heure. Le mélange est finalement déposé sur pétri LB contenant

l’antibiotique approprié selon la résistance du plasmide.

2.9.8. Extraction plasmidique de petites quantités (Miniprep)

Au premier jour, plusieurs colonies sont repiquées dans un milieu LBG20

contenant

l'antibiotique approprié et incubées à 37°C avec agitation de 200 rpm toute une nuit. Le

lendemain, une partie des bactéries sont conservées pour un stock de glycérolG21

[50%]. Le

reste des bactéries sont centrifugées à 13 000 rpm pendant 30 secondes et resuspendues

avec la solution IG22

. Les bactéries sont ensuite lysées avec la solution IIG23

pendant 1

minute à température pièce. La lyse est arrêtée avec la solution IIIG24

en incubant 1 minute

à température pièce. Les débris cellulaires sont éliminés en centrifugeant 12 000 rpm

pendant 5 minutes et le surnageant est transféré sur colonneG25

. La colonne est centrifugée à

10 000 rpm pendant 2 minutes, laissant adhérer les plasmides à la matrice de la colonne. La

colonneG25

est lavée deux fois avec la solution de lavage pour éliminer les restes d'ADN

bactérien. La colonne est centrifugée une autre fois pour enlever les traces de la solution de

lavage et les plasmides sont élués dans la solution de tampon d'élution.

2.9.9. Séquençage

Toutes les constructions plasmiques sont séquencées par la plate-forme de séquençage pour

vérifier que les plasmides sont exacts.

2.9.10. Extraction plasmidique de moyennes quantités (Midiprep)

Au premier jour, plusieurs colonies sont repiquées dans un milieu LBG20

contenant

l'antibiotique approprié et incubées à 37°C avec agitation de 200 rpm toute une nuit. Le

lendemain, une partie des bactéries sont conservées pour un stock de glycérolG21 [50%].

36

Le reste des bactéries sont centrifugées à 5 000g pendant 10 minutes et resuspendues avec

la solution de resuspensionG26

. Les bactéries sont ensuite lysées avec la solution de lyseG27

pendant 4 minutes à température pièce. La lyse est arrêtée avec la solution de

neutralisationG28.

Une solution d'attachementG29

est ajoutée pour permettre une meilleure

adhésion des plasmides à la colonne. Les débris cellulaires sont éliminés en passant sur

seringueG30

l'homogénat et le tout est transféré sur colonneG31

. La colonne est centrifugée à

3 000g pendant 2 minutes, laissant adhérer les plasmides à la matrice de la colonne. La

colonne est lavée deux fois avec la solution de lavage IG32

et la solution de lavage IIG33

pour

éliminer les restes d'ADN bactérien. La colonne est centrifugée une autre fois pour enlever

les traces de la solution de lavage et les plasmides sont élués dans la solution de tampon

d'élutionG34

.

2.10. Extraction d’ADN génomique

Une quantité variant de 2-8 millions de cellules est incubée dans un pétri de 100 mmC1

pour

chaque extraction d’ADN génomique. Le milieu de culture est aspiré complètement.

Ensuite, la solution de lyseH1

est ajouté sur le pétri pour lyser les cellules. L'homogénat est

transféré dans un tube de 1.5 mlF4.

De l'éthanol [100%] est ajouté pour isoler l'ADN

génomique formant une boule qui est transférée dans un nouveau tube de 1.5 mlF4.

L'ADN

génomique est ensuite lavé avec de l'éthanol [75%] deux fois. Finalement, l'ADN

génomique est resuspendu dans du NaOHH2

[8 mM].

2.11. Conversion d’ADN génomique au bisulfite de sodium

L'ADN génomique est mélangé avec le tampon de dilutionI1

et complété avec de l'H2O

Milli-Q. Le tout est incubé à 37°C pendant 15 minutes. Ensuite, le bisulfite de sodiumI2

est

ajouté pour convertir les cytosines non méthylées en cytosine sulphonate et l'échantillon est

incubé à 50°C toute la nuit dans le noir. Le lendemain, l'échantillon est déposé sur glace

pendant 10 minutes et transféré sur colonneI3

pour y faire adhérer l'ADN. La colonne est

lavée une fois avec la solution de lavageI4

. Par la suite, le tampon de désulphonationI5

est

ajouté pour convertir les cytosines sulphonates en uracile et incubé à température pièce

pendant 20 minutes. La colonne est lavée deux autres fois avec la solution de lavageI6

et

l'ADN génomique est élué avec le tampon d'élutionI7

.

37

2.12. Répression d’ARNm par petits ARN interférents

2.12.1. Production des plasmides lentiviraux pLKO.1

Idem à la section 2.9.8.

2.12.2. Production des lentivirus pLKO.1

Quatre millions de cellules HEK 293T sont laissées adhérer dans un pétri 100 mmC1

dans

leur milieu de culture standard ne contenant que de la pénicilline-StreptomycineA10

[0.1x].

Huit heures plus tard, les cellules sont transfectées avec les éléments suivants : 1.5 µg de

vecteur psPAX2 – la particule virale d’empaquetage – 0.167 µg de vecteur pMD2.G –

l'enveloppe virale – et 1.6 µg de vecteur pLKO.1 shRNA, le tout dans du tampon LBS

(NaClF5

[150mM], acétate de sodiumJ1

[20mM] pH 4.0). La combinaison est mélangée avec

l'agent transfectant, soit le PEIJ2

[5 mg/ml], et est incubée à température pièce pendant 20

minutes. Le mélange est ajouté au milieu de culture des cellules. Le lendemain, les cellules

sont rafraîchies avec leur milieu de culture normal contenant 5.5 g de BSA pour aider la

préservation des lentivirus. Deux jours plus tard, les lentivirus sont récoltés dans des tubes

de 15 mlF15

.

2.12.3. Transduction des lentivirus pLKO.1

Les cellules à infecter sont laissées adhérer dans un pétri 100 mmC1

. Le milieu de culture

est retiré et les lentivirus sont déposés sur les cellules. Du polybrène [10µg/ml] est ajouté

par la suite pour favoriser les interactions ioniques pour l'entrée du lentivirus. Le

lendemain, les cellules sont rafraîchies avec du milieu de culture et de la puromycineJ3

(les

quantités varient d’une lignée cellulaire à l’autre. Elles sont déterminées selon une courbe

de mort cellulaire) est ajouté pour sélectionner les cellules transduites.

2.13. Essai luciférase

Quatre millions de cellules à transfecter sont laissées adhérer dans un pétri 100 mmC1

dans

leur milieu de culture standard. 8 heures plus tard, les cellules sont transfectées avec les

éléments suivants : 18 µg d'ADN du plasmide pGL4.13 – contenant le gène d’intérêt, et

180 ng de pRL-CMV – codant pour la rénilla pour normaliser les échantillons – le tout dans

38

du tampon LBS. La combinaison est mélangée avec l'agent transfectant, soit le PEI [5

mg/ml], et est incubée à température pièce pendant 20 minutes. Le mélange est ajouté au

milieu de culture des cellules. Le lendemain, le milieu de culture est aspiré et les cellules

sont rincées deux fois au PBS [1x]. Le tampon de lyseL1

est ajouté aux cellules et les pétris

sont incubés 45 minutes sur une plaque rotatoire. Les cellules sont par la suite grattées et

transférées dans des tubes 1.5 mlF4

. Les échantillons sont congelés dans la glace sèche et

décongelés dans un bain chauffant à 37°C deux fois pour briser les cellules. Dans une

plaque 96 puits blancheK4

, les échantillons sont ajoutés en triplicata et ensuite analysés au

bioluminomètre suite à l'ajout des solutions de substrats pour luciférase et de renillaL2

.

39

3. Résultats

Avec pour objectif d’étudier la régulation du gène Gas1, plusieurs expériences ont été

effectuées pour en démontrer les mécanismes. Ainsi, les variations d’ARNm ont été

analysées par PCR quantitative afin de voir les effets des inhibiteurs chimiques ou des

petits ARN interférents utilisés. De plus, pour l’étude du promoteur de Gas1, des

expériences de bisulfite de sodium et d’immunoprécipitation de la chromatine ont permis

de révéler des résultats nouveaux, notamment aux niveaux des protéines pouvant être

responsables de la régulation du gène Gas1. Finalement, il est important de souligner que

diverses lignées cellulaires, murines ou humaines, ont été utilisées pour valider l’étendue

des résultats observés.

3.1. Le mélanome murin

3.1.1. Gas1 est réprimé chez les cellules de mélanome murin B16-F10

Pour confirmer des résultats déjà obtenus par le Dr. Gobeil, le niveau d'expression d'ARNm

de gas1 a été mesuré par PCR quantitative entre les lignées cellulaires de mélanome

faiblement métastatique B16-F0 et fortement métastatique B16-F10. La figure 6A démontre

qu'il y a environ 22 fois plus d'ARNm chez les cellules B16-F0 que chez celles

métastatiques B16-F10. Ces résultats illustrent bien la faible expression du gène Gas1 chez

la lignée de mélanome métastatique murin B16-F10.

Pour poursuivre l'investigation de cette répression du gène Gas1, l'ADN génomique des

cellules B16-F10 a été extrait, traité au bisulfite de sodium, amplifié par PCR et cloné dans

le vecteur d'expression pGEM-T Easy. En effet, le séquençage d'ADN traité au bisulfite de

sodium permet de vérifier le niveau de méthylation d'îlots CpGs au promoteur des gènes.

Suite au séquençage, l'analyse entre la lignée métastatique B16-F10 sauvage et celle ayant

subie le traitement permet de démontrer que l’îlot CpGs du promoteur de Gas1 est

fortement méthylé (en noir), tel qu'illustré à la figure 6B. Concrètement, une forte présence

de méthylation indique un gène réprimé et implique donc des DNA méthyltransférases. Ce

40

résultat est classique des gènes réprimés, tout comme pour Gas1 chez la lignée

métastatique B16-F10.

Finalement, pour continuer l'étude du gène Gas1 chez les cellules métastatiques B16-F10,

une immunoprécipitation de la chromatine a été effectuée avec les anticorps contre la

marque d'acétylation AcH3, la marque de méthylation H3K9me3 et la polymérase II totale.

Illustré à la figure 6C, ces résultats montrent une forte présence de la marque de répression

H3K9me3 comparativement à la marque d'acétylation AcH3 ou à la polymérase II.

L’enrichissement est comparé au contrôle négatif contenant un anticorps normal IgG de

souris. Ce résultat accroît les évidences d'une répression du gène Gas1 chez le mélanome

métastatique B16-F10.

41

3.1.2. L'expression de Gas1 est modulable chimiquement par la TSA et le 5-

Aza chez le mélanome métastatique murin B16-F10

Pour vérifier que la répression de Gas1 n'était pas génétique, par exemple par délétion du

gène, la lignée métastatique B16-F10 a été traitée avec un inhibiteur d’histones

déacétylases et un inhibiteur de DNA méthyltransférases, soit la TSA et le 5-Aza

respectivement, pouvant affecter plusieurs gènes réprimés. Dans un premier temps, les

cellules ont été traitées avec de la TSA [1μM] pendant 48 heures, illustré à la figure 7A. Par

la suite, elles ont été incubées en présence de 5-Aza [3μM] pendant 72 heures, présenté à la

figure 7A, également. Dans les deux cas, les résultats démontrent une augmentation de 10

et 8 fois respectivement du niveau d'ARNm, mesuré par PCR quantitative. L'expression de

Gas1 est donc modulable chimiquement chez la lignée métastatique B16-F10 et implique

les familles Hdac et Dnmt dans le processus de répression.

Pour déterminer précisément les candidats responsables de cette répression épigénétique de

Gas1, la dégradation par petits ARN interférents a été effectuée pour les gènes ciblés. En

premier lieu, trois histones déacétylases potentielles ont été sélectionnées, soit hdac1,

hdac2 et hdac7. En effet, ces gènes font parties de la famille ciblée par l'inhibiteur TSA.

L'ARNm de ces gènes a été dégradé par petits ARN interférents et par la suite, l'effet

encouru sur le gène Gas1 a été analysé par PCR quantitative, tel que visualisé à la figure

7B. En deuxième lieu, les trois principaux types de DNA méthyltransférases ont été choisis,

soit dnmt1, dnmt3a et dnmt3b. L'ARNm de ces gènes a été dégradé par petits ARN

interférents et ensuite, l'effet encouru sur le gène Gas1 a été rapporté par PCR quantitative,

tel qu'illustré à la figure 7C. Également, il est possible de voir les niveaux d’ARNm des

gènes ciblés. Dans tous les cas, l'effet de modulation du gène Gas1 n'a pas été au niveau

escompté, soit une hausse au même niveau qu'avec les inhibiteurs chimiques.

42

3.1.3. Cbx1 est impliqué dans la répression épigénétique du gène Gas1 chez les

cellules de mélanome métastatique murin B16-F10

Dans l'optique d'identifier les candidats impliqués dans la répression du gène gas1 chez les

cellules métastatiques B16-F10, plusieurs gènes potentiels ont été criblés par petits ARN

interférents. Ces gènes ont été choisis pour leur implication lors de la méthylation d'îlots

CpGs et d'histones de type H3K9me3. Ainsi, les gènes setdb1, cggbp1, cbx1, cbx3, cbx5,

suv39h1 et suv39h2 ont été réprimés par petits ARN interférents. Par la suite, l'effet de leur

répression sur le niveau d'expression du gène Gas1 a été mesuré par PCR quantitative,

visualisé à la figure 8. Il est donc possible d'apercevoir une augmentation moyenne de

l’ARNm de Gas1 de 5 fois lors de l'inhibition de l’ARNm de cbx1, illustré à la figure 8A.

La figure 8B montre le résultat des autres gènes ciblés, ayant un effet moindre sur

l’expression du gène Gas1. Il est maintenant démontré que cbx1 est impliqué dans la

répression du gène Gas1 chez les cellules métastatiques B16-F10, bien que d'autres joueurs

comme cbx5 pourraient y être mêlés.

43

3.2. Le mélanome humain

3.2.1. L'expression de GAS1 est réprimé chez les cellules de mélanome

métastatique humain C8161 et Lox-IMVI

Le niveau d'expression d'ARNm de GAS1 a été mesuré par PCR quantitative entre trois

lignées cellulaires de mélanome humain, soit les cellules faiblement métastatiques C81-61

et les deux lignées fortement métastatiques C8161 et Lox-IMVI. La figure 9A démontre

qu'il y a 275 fois plus d'ARNm chez les cellules C81-61 que chez celles métastatiques. Ces

résultats illustrent bien la faible expression du gène GAS1 chez les lignées de mélanome

métastatique humain C8161 et Lox-IMVI.

44

3.2.2. L'expression de GAS1 n'est pas modulable par la TSA et le 5-Aza chez

les cellules C8161 et Lox-IMVI

Pour vérifier le mécanisme de répression du gène GAS1, les lignées métastatiques C8161 et

Lox-IMVI ont été traitées avec un inhibiteur d’histones déacétylases et un inhibiteur de

DNA méthyltransférases, soit la TSA et le 5-Aza respectivement, pouvant affecter plusieurs

gènes réprimés. Dans un premier temps, les cellules ont été traitées avec de la TSA [0,1μM]

pendant 48 heures, illustré à la figure 9B. Par la suite, elles ont été incubées en présence de

5-Aza [3μM] pendant 72 heures, présenté à la figure 9C. Dans les deux cas, les résultats ne

démontrent aucun changement majeur du niveau d'ARNm, mesuré par PCR quantitative.

L'expression de GAS1 n'est donc pas modulable chimiquement par la TSA ou le 5-Aza chez

les lignées métastatiques C8161 et Lox-IMVI.

Pour poursuivre l'investigation de cette répression du gène GAS1, l'ADN génomique des

cellules C81-61, C8161 et Lox-IMVI a été extrait, traité au bisulfite de sodium et cloné

dans le vecteur d'expression pGEM-T Easy. Suite au séquençage, l'analyse entre la lignée

45

sauvage et celle ayant subie le traitement permet de démontrer que l’îlot CpG du promoteur

de GAS1 est faiblement méthylé chez les trois lignées cellulaires, tel qu'illustré à la figure

10A. Ce résultat est classique des gènes actifs malgré l'absence de GAS1 chez les cellules

métastatiques C8161 et Lox-IMVI, amenant des indices d'une répression différente des

cellules murines B16-F10.

Finalement, pour continuer l'étude du gène GAS1 chez les cellules métastatiques C81-61 et

C8161, une immunoprécipitation de la chromatine a été effectuée avec les anticorps contre

la marque d'acétylation AcH3, la marque de méthylation H3K9me3 et la polymérase II

totale. Illustrés au graphique 10 B) et C), ces résultats montrent une forte présence de la

marque d’activation AcH3, ainsi qu'une présence moindre de la polymérases II et de la

marque de répression H3K9me3 chez les deux lignées cellulaires. L’enrichissement est

comparé au contrôle négatif contenant un anticorps normal IgG de souris. Ce résultat

accroît les évidences d'un mécanisme de répression du gène GAS1 très différent des cellules

murines B16-F10.

46

3.2.3. L’expression de GAS1 n'est pas contrôlée par microARNs

Par conséquent, l'option d'une régulation par microARN du gène GAS1 a été émise. En

effet, la région 3'UTR de GAS1 contient quatre sites du miR-495, un microARN présent en

abondance chez la lignée métastatique C8161, comparativement à celle faiblement

métastatique C81-61. Afin de vérifier cette possibilité suite aux résultats obtenus jusqu'à

présent, la région 3'UTR du gène GAS1 a été clonée en deux parties (Figure 20 - en

annexe). La partie 3'UTRhGAS1-A.1 s'accapare les nucléotides 1 à 797 de la région 3'UTR,

tandis que la partie 3'UTRhGAS1-B.1 comporte les nucléotides 798 à 1378. C'est la région

B.1 qui contient les quatre sites du miR-495. Le processus est le suivant : le vecteur

pGL4.13 est transcrit en ARNm et traduit en protéine de luciférase. Avec l'ajout d'un

substrat, la luciférase le transforme, ce qui cause une luminosité détectable au

bioluminomètre. Dans cet expérience, la région 3'UTR de la luciférase a été remplacé par la

région A.1 ou B.1, et si GAS1 est régulé par microARNs, l'ARNm de la luciférase diminue,

réduisant la quantité de lumière produite lors de l'ajout du substrat. Ainsi, les cellules

métastatiques C8161 ont été transfectées avec les constructions A.1 et B.1 et la quantité de

luciférase dosée par bioluminomètre. À la figure 11, il est montré que les parties A.1 et B.1

expriment autant de luminosité que le contrôle positif, normalisé par la renilla. Ce fait

illustre l'inaction des microARNs contre l'ARNm du gène GAS1 chez les cellules

métastatiques C8161.

47

3.2.4. L’expression de GAS1 est contrôlée par les gènes BRD4 et c-MYC chez

les cellules de mélanome humain C81-61, C8161 et Lox-IMVI

Pour étudier le rôle de régulateur des protéines c-MYC et BRD4 sur le gène GAS1 chez les

cellules de mélanome humain, les cellules faiblement métastatiques C81-61 ont été traitées

avec un inhibiteur de bromodomaine, JQ1, dont fait partie le gène BRD4. En effet, dans la

littérature, c-MYC est considéré comme un répresseur de GAS1, tandis que BRD4 est

impliqué dans la transcription de c-MYC. À la figure 12A, il est possible de voir une

diminution de 80% de l'expression du gène GAS1 suite au traitement avec l'inhibiteur JQ1

[500nM] pendant 24 heures. De plus, les cellules C81-61 ont été infectées par un lentivirus

codant pour des petits ARN interférents contre l'ARNm du gène BRD4. Ainsi, suite à cette

transduction, l'expression de GAS1 est diminuée pour deux des trois petits ARN

interférents, illustré à la figure 12B. Il est également possible d’observer une diminution de

l’expression du gène c-MYC, une autre cible de BRD4. Finalement, une

immunoprécipitation de la chromatine avec un anticorps contre BRD4 a été exécutée pour

en vérifier la présence au promoteur de GAS1. Cette expérience a démontré l'implication

directe de BRD4 sur la transcription de GAS1 par son enrichissement de 5 fois au dessus du

contrôle négatif IgG, tel que visualisé à la figure 12C. Ces expériences permettent de

déceler un rôle pour BRD4 dans l’activation du gène GAS1 chez la lignée de mélanome

C81-61.

48

Par la suite, l'implication directe du proto-oncogène c-MYC dans la répression de GAS1 a

été démontrée chez les lignées cellulaires métastatiques C8161 et Lox-IMVI. En effet, les

cellules ont été infectées avec des petits ARN interférents ciblant c-MYC et l'augmentation

de l'expression du gène GAS1 a été analysé par PCR quantitative. La figure 13A révèle une

augmentation moyenne de l’expression en ARNm du gène GAS1 de 13 fois et 9 fois chez

les C8161 et Lox-IMVI respectivement et ce par rapport aux cellules contrôles. De plus, les

cellules C8161 et Lox-IMVI infectées avec les petits ARN interférents contre l'ARNm du

gène c-MYC ont été traitées avec l'inhibiteur de bromodomaine JQ1 [500nM] pendant 24

heures. La figure 13B et 13C dévoile que l'augmentation de l’expression du gène GAS1 est

réduite lorsque les cellules métastatiques sont traitées avec l'inhibiteur JQ1. Le même

résultat a été observé pour l’expression d’ARNm du gène contrôle c-MYC. Finalement, des

immunoprécipitations de la chromatine avec des anticorps contre c-MYC et BRD4 ont été

effectuée pour valider leur présence au promoteur du gène GAS1. Tel que démontré à la

figure 14, la protéine c-MYC est présente au promoteur de GAS1, grâce à un

enrichissement supérieur au contrôle négatif IgG, montrant ainsi une répression directe de

49

GAS1 par c-MYC chez les C8161 (A) et les Lox-IMVI (B). Le gène GAPDH est utilisé

comme contrôle positif, tandis que le gène RHAG comme contrôle négatif. De plus,

l’immunoprécipitation de la chromatine avec un anticorps de BRD4 chez les cellules

métastatiques C8161 dévoile sa présence au promoteur de GAS1, montré à la figure 14C,

par un enrichissement d’au moins deux fois au dessus du contrôle négatif IgG. Par ces

résultats, il est possible d’affirmer que c-MYC joue un rôle de régulateur du gène GAS1, en

plus de la protéine BRD4.

50

3.2.5. La répression de GAS1 n'implique pas les complexes c-

MYC/MAX/MIZ1 ou c-MYC/TFAP2C/KDM5B

Par ailleurs, l'hypothèse d'une répression par un complexe c-MYC/MIZ1/MAX a été

envisagée, suite aux résultats précédents. Pour en vérifier la véracité, les cellules C8161 ont

été traitées avec un inhibiteur chimique de l'interaction c-MYC/MAX, le 10058-F4, aux

doses de [50μM], [100μM] et [200μM], pendant 48 heures, les empêchant d'accomplir leur

mécanisme de répression. Tel qu'illustré à la figure 15A, l'utilisation de cet inhibiteur n'a

pas augmenté l'expression du gène GAS1, malgré l’augmentation de l’expression du

contrôle p21 par plus de deux fois aux doses de [100μM] et [200μM]. De surcroît, l'ARNm

des gènes MAX et MIZ1 ont été dégradé par petits ARN interférents chez les cellules

métastatiques humaines C8161 sans aucune augmentation du niveau d'expression de GAS1,

visualisé à la figure 15B et 15C. Par contre, il est possible de voir à la figure 15B qu’un

seul petit ARN interférent contre l’ARNm de MAX semble efficace à augmenter

l’expression des gènes contrôles p21 ou C/EBPδ. Également, à la figure 15C, deux petits

ARN interférents sur trois augmente l’expression du gène contrôle p21, mais pas celle du

gène C/EBPδ. Il est envisageable d'affirmer que la répression du gène GAS1 n'est pas

causée par un complexe c-MYC/MAX/MIZ1.

51

En plus, un autre complexe de répression, c-MYC/TFAP2C/KDM5B a été considéré pour

la régulation négative de l'expression du gène GAS1. Ainsi, les gènes TFAP2C et KDM5B

ont été réprimés par petits ARN interférents pour vérifier leur rôle dans la régulation de

GAS1. Démontré à la figure 16A, la dégradation de leurs ARNm n'a pas apporté

d'augmentation comparable à l'expérience avec c-MYC du gène GAS1. Ce complexe ne

semble donc pas avoir d'incidence sur la régulation de GAS1.

52

3.2.6. La régulation de GAS1 implique d'autres protéines comme les PARPs

ou BMI-1

Afin d'élucider le rôle potentiel de la PARP-1 et de la PARP-2 dans le contrôle positif de

GAS1, les cellules faiblement métastatiques C81-61 ont été traitées avec un inhibiteur de

PARP-1 et PARP-2, l'ABT-888 [10μM] pendant 48 heures. En effet, les PARPs peuvent

permettre la transcription de certains gènes par la poly ADP-ribosylation de répresseurs. À

la figure 16B, il est possible de voir qu'il y a une diminution de 60% de l'expression du

gène GAS1, établissant une implication de la PARP-1 ou la PARP-2 dans sa régulation. Par

la suite, le rôle de la PARG, une protéine antagonisme de la poly (ADP-ribosyl)ation des

PARPs, a été vérifié pour la répression de l’expression de GAS1 chez les cellules

métastatiques C8161. En fait, en éliminant les poly ADP-ribosyl, les répresseurs peuvent

exercer leur fonction. Les cellules C8161 ont donc été transduites avec un lentivirus codant

pour des petits ARN interférents contre le gène PARG. Démontré à la figure 16C, sa

dégradation n'a pas amené d'augmentation de l'expression du gène GAS1, mais plutôt le

contraire.

53

Dans un autre ordre d'idée, pour percevoir la possibilité d'un mécanisme de pause

transcriptionnelle, le gène WHSC2, une composante vitale du complexe NELF impliqué

dans un tel mécanisme, a été dégradé par petits ARN interférents. En effet, il existe un lien

potentiel entre le maintient en pause transcriptionnelle par c-MYC et le complexe NELF

dans la littérature. Toutefois, présenté à la figure 16D, cette expérience n'a pas eu d'impact

sur l'expression du gène GAS1, excluant ce type de répression.

3.3. Le cancer du sein murin

3.3.1. Gas1 est réprimé chez les cellules de cancer du sein murin 4T1

Pour étudier le gène Gas1 chez le cancer du sein, le niveau d'expression d'ARNm de Gas1

a été mesuré par PCR quantitative entre les lignées cellulaires faiblement métastatiques

67NR et fortement métastatiques 4T1. La figure 17A présente qu'il y a 45 fois plus

d'ARNm chez les cellules 67NR que chez celles métastatiques. Ces résultats illustrent bien

la faible expression du gène Gas1 chez la lignée de cancer du sein métastatique murin 4T1.

Pour poursuivre l'investigation de cette répression du gène Gas1, l'ADN génomique des

cellules 4T1 a été extrait, traité au bisulfite de sodium et cloné dans le vecteur d'expression

pGEM-T Easy. Suite au séquençage, l'analyse entre la lignée métastatique sauvage et celle

ayant subie le traitement permet de démontrer que l’îlot de CpGs du promoteur de Gas1 est

fortement méthylés (en noir), tel qu'illustré à la figure 17B. Ce résultat est classique des

gènes réprimés, tout comme pour Gas1 chez la lignée métastatique B16-F10.

Pour vérifier que la répression de Gas1 n'était pas génétique, la lignée métastatique 4T1 a

été traitée avec un inhibiteur d’histones déacétylases, soit la TSA, pouvant affecter

plusieurs gènes réprimés. En effet, les cellules ont été traitées avec de la TSA [0,3μM]

pendant 48 heures, illustré à la figure 17C. Les résultats démontrent une augmentation de

18 fois du niveau d'ARNm, mesurée par PCR quantitative. L'expression de Gas1 est donc

modulable chimiquement chez la lignée métastatique 4T1.

54

Pour conclure cette section, il est important d’appuyer que les résultats obtenus entre les

lignées métastatiques murines et humaines indiquent des mécanismes de régulation du gène

Gas1 différents. Dans un premier temps, chez les cellules B16-F10, le gène Gas1 est

modulable par les inhibiteurs TSA et 5-Aza, contrairement aux cellules C8161 ou Lox-

IMVI. Ensuite, le promoteur de Gas1 est complètement différent : chez les B16-F10, l'îlots

CpG est fortement méthylé et la marque de répression H3K9me3 très présente, tandis qu’il

en est tout le contraire chez les C8161 et les Lox-IMVI. À la lumière de ces résultats, il est

possible d’affirmer que les mécanismes de régulation du gène Gas1 sont différents entre les

lignées investiguées et également très complexes.

55

4. Discussion

4.1. Les lignées cellulaires murines

Le développement de la biotechnologie permet de fournir aux chercheurs des outils

puissants pour étudier la science. Dans l’optique de créer un tel outil pour étudier la

métastase, le Dr. Fidler a développé une nouvelle lignée cellulaire, les cellules fortement

métastatiques murines de mélanome B16-F10. Pour y parvenir, il a injecté la lignée

faiblement métastatique murine de mélanome B16-F0 chez la souris. Fidler a ensuite

récolté la tumeur, isolé les cellules et répété l’expérience dix fois. Par le fait même, il a

sélectionné une partie de la population des B16-F0 de plus en plus agressives et

métastatiques. Les cellules B16-F10 sont nées123

. En outre, Fidler a développé un bon

modèle cellulaire pour étudier les variations géniques selon les différentes capacités

métastatiques cellulaires.

Découlant du fait qu’il s’agit d’un bon modèle pour l’étude de la métastase, le Dr. Gobeil a

choisi les cellules B16-F0 et B16-F10 pour vérifier les différences géniques entre elles par

un criblage pangénomique par petits ARN interférents. Il a donc découvert 22 gènes que

lorsque leur expression est réduite par petits ARN interférents, il y a une hausse de la

capacité métastatique des cellules faiblement métastatiques B16-F0, sans affecter la

croissance de la tumeur primaire64

. Au final, nous avons décidé d’étudier plus en

profondeur en premier le gène Gas1, car il est le gène le plus réprimé entre les lignées

cellulaires B16-F0 et B16-F10.

4.1.1. Gas1 est réprimé chez les lignées cellulaires métastatiques murines B16-

F10

En premier lieu, afin de confirmer les résultats obtenus précédemment64

, nous avons

comparé les niveaux d’expression du gène Gas1 entre les lignées cellulaires B16-F0 et

B16-F10 par PCR quantitative. Tel qu’escompté, la figure 6A montre que l’expression de

Gas1 est 22 fois plus forte chez la lignée faiblement métastatique B16-F0 que celle

56

fortement métastatique B16-F10. Ce résultat coïncide avec d’autres études démontrant

l’absence de Gas1 chez les cellules les plus agressives ou métastatiques au sein du cancer

de la prostate21-31

, du cancer de la thyroïde33

, du cancer colorectal50

et du cancer gastrique57

.

En effet, ces études ont toutes mises en valeur la répression de Gas1 chez les lignées

tumorales démontrant une plus grande capacité à franchir la cascade métastatique.

Par conséquent, la démonstration in vivo que Gas1 puisse supprimer la formation de

métastases64

conjuguée à l’ensemble des données montrant la diminution de Gas1 chez les

cellules agressives permet d’affirmer que certaines cellules métastatiques tendent à

réprimer Gas1 pour parvenir à former les colonies secondaires. En outre, cette information

est importante parce qu’elle permet d’envisager l’utilisation de Gas1 comme moyen

thérapeutique contre la métastase qui cause la majeure partie des décès issus de tumeurs

solides64

. De plus, les publications dévoilant que Gas1 permet l’arrêt du cycle cellulaire2-10-

16-17-45-54-60 et peut induire l’apoptose

11-61-64-66-67, supportent l’idée d’utiliser Gas1 comme

outil thérapeutique. Également, Gas1 a été utilisé comme biomarqueur de la progression

tumorale33-64

. En somme, il est important de poursuivre l’investigation des mécanismes

répresseurs de Gas1, car comprendre la répression de ce gène pourrait permettre de mettre

en place des stratégies visant sa réactivation avec pour but de réduire le pouvoir

métastatique cellulaire.

4.1.2. L'expression de Gas1 est modulable chimiquement par la TSA et le 5-

Aza chez la lignée cellulaire métastatique murine B16-F10

Nous avons décidé de débuter l’analyse du mécanisme réprimant Gas1 par une étude de

l’épigénétique. Il existe plusieurs mécanismes de répression d’un gène. Il n’y a qu’à penser

aux modifications des marques d’histones, à la dégradation protéomique, aux délétions et

aux mutations de l’ADN ou encore aux microARNs. Par conséquent, pour nous éclairer sur

la direction à prendre, nous avons vérifié l’aspect du promoteur de Gas1 par séquençage et

par immunoprécipitation de la chromatine chez les cellules métastatiques B16-F10. À la

figure 6B, suite au traitement au bisulfite de sodium, nous avons pu visualiser la

méthylation du promoteur de Gas1 dans la région entre les nucléotides -288 et +59 du site

de départ de la transcription. En effet, le traitement de l'ADN au bisulfite de sodium permet

de vérifier le niveau de méthylation d'îlots CpGs au promoteur des gènes213

. Nous avons

57

donc décelé que cette région était fortement méthylée chez tous nos clones analysés. Tel

que démontré par plusieurs publications214-215

, la méthylation des groupements CpGs des

promoteurs est utilisée pour maintenir l’ADN dans un état d’hétérochromatine. C’est

seulement au moment de la transcription que la région codante du gène devient en état

d’euchromatine et que les groupements CpGs seront déméthylés pour permettre

l’élongation de la polymérase124-125

. Par cette expérience, nous avons commencé à mettre

les premières pièces du casse-tête entourant le mécanisme réprimant le gène Gas1.

Par la suite, nous avons poursuivi l’étude épigénétique en vérifiant les marques

d’acétylation et de méthylation des histones pour en apprendre d’avantage sur le gène

Gas1. Nous avons donc analysé plusieurs marques de répression et d’activation par

immunoprécipitation de la chromatine chez les cellules B16-F10. Parmi celles-ci, il n’y a

pas eu d’enrichissement significatif des marques H3K27me3 et H4K20me3 (résultats non

dévoilés), ni de AcH3 et de la polymérase II totale (Figure 6C). Cependant, nous avons une

forte présence de la marque de répression H3K9me3 (Figure 6C). Ce résultat corrobore avec

la littérature scientifique. En effet, bien qu’il existe plusieurs mécanismes de répression

génique, l’arrêt de la transcription par la marque H3K9me3 est fréquent lorsque le gène est

maintenu en hétérochromatine116-126-128

. Pour sa part, Nestorov (Nestorov 2013) croit que

les deux mécanismes de répression H3K9me3 et H3K27me3 sont mutuellement exclusifs127

.

Dans cette optique, il apparait tout à fait logique que nous n’ayons pas trouvé la marque

H3K27me3 au promoteur du gène Gas1. Bien que rien n’indique que la marque de

répression H4K20me3 ne pourrait pas être présente en plus de celle H3K9me3129

, nous

n’avons décelé que très peu sa présence chez Gas1. D’autre part, il est également normal de

retrouver faiblement les marques d’acétylation sur l’histone trois d’un gène à l’état

d’hétérochromatine115-117-122

, tout comme la présence de la polymérase II128

. À la lumière

de ces résultats, il est maintenant possible d’affirmer que le gène Gas1 est réprimé chez les

cellules B16-F10 par des groupements méthyles au niveau de l’ADN, mais également au

niveau de l’histone 3 à la lysine 9.

Le remodelage de la chromatine est un processus biologique très important. En effet, par

l’intervention d’acteurs clés comme les HATs, les HDACs, les DNA methyltransférases ou

les HMTs, les modifications épigénétiques peuvent être préservées entre les générations

cellulaires118-122-130

. Chez les cellules tumorales, l’expression aberrante de HDACs est très

58

fréquente130

. Par conséquent, plusieurs inhibiteurs de HDACs ont été créés pour faire face

au cancer comme la TSA, le SAHA ou le Depsipeptide132

. Partant de ces faits et pour

obtenir une réponse plus précise du mécanisme réprimant le gène Gas1, nous avons traité

les cellules B16-F10 avec l’inhibiteur TSA (figure 7A). Le résultat démontre qu’il y a une

augmentation de l’expression de Gas1 de 10 fois par rapport aux cellules non-traitées. Cette

expérience illustre bien l’implication des histones déacétylases pour empêcher la

transcription de Gas1. Cependant, il est important de souligner que la TSA est un inhibiteur

de HDACs de classes I et II seulement133

. L'expérience ne démontre donc pas l'implication

d'HDACs des classes III et IV. D’ailleurs, il a été publié que la TSA pouvait inhiber la

répression des gènes p15139

, p21140-141

ou p27141

, des gènes impliqués dans le contrôle du

cycle cellulaire comme Gas1. Plus précisément, nous avons utilisé des petits ARN

interférents contre certains HDACs de la classe I et II, soit HDAC1, HDAC2 et HDAC7. Il

est possible de voir à la figure 7B qu’il n’y a pas de variation par rapport au contrôle, sauf

quand le cas de hdac1. Par contre, l’élévation de l’expression de Gas1 n’est pas aussi

prononcée qu’avec l’inhibiteur TSA. La diminution de l’expression de hdac1 par le shRNA

utilisé n’est peut-être pas suffisante pour produire un effet plus concluant sur l’expression

de Gas1. Ce résultat pourrait être significatif, l’expérience pourra être essayée à nouveau,

mais également avec plus d’un petit ARN interférent pour en valider sa pertinence. En

somme, ce résultat semble classique, puisque le lien entre la TSA et Hdac1 a déjà été établi

chez plusieurs cancers humains134

. Il est donc possible de croire que les histones

déacétylases jouent un rôle dans la répression du gène Gas1 chez les cellules B16-F10, au

sein d’un complexe moléculaire beaucoup plus grand.

D’ailleurs, des publications ont déjà démontré la dynamique entre les HDACs et les DNA

méthyltransférases135

, en plus de leur association avec la marque de répression H3K9me3124

.

Or, il existe également des inhibiteurs de DNA méthyltransférases comme le 5-Aza ou le

Zebularine ayant été testés in vivo ou même en phase clinique136-137

. Pour le 5-Aza, il a été

publié qu’il pouvait induire l’expression des gènes p14142

, p21 ou p16143

, impliqué dans le

contrôle du cycle cellulaire. Ainsi, afin d'étudier l’épigénétique du promoteur de Gas1,

nous avons traité les cellules B16-F10 avec du 5-Aza (figure 7A). Il est possible

d’apercevoir une hausse de l’expression du gène Gas1 de 7,5 fois par rapport au contrôle,

illustrant l’implication de DNA méthyltransférases dans sa répression. Pour persévérer dans

59

cette direction, nous avons réduit l’expression des trois principaux dnmts, soit Dnmt1,

Dnmt3a et Dnmt3b par petits ARN interférents. Illustré à la figure 7C, l’expérience

démontre qu’il n’y a que très peu de changement de l’expression du gène Gas1, malgré une

efficacité de réduction de l’expression des Dnmts d’au moins 50%. Ce résultat n’est pas

surprenant, puisqu’il a été publié que les Dnmts peuvent avoir des rôles redondants138

. Dans

les prochaines expériences, il faudra donc utilisé un vecteur permettant de supprimer deux

Dnmts à la fois pour vérifier lesquels sont réellement impliqués. Bien que les familles

HDAC et DNMT soient impliquées dans la répression de GAS1, le complexe répresseur

comporte assurément d’autres joueurs importants.

4.1.3. Cbx1 est impliqué dans la répression du gène Gas1 chez la lignée

cellulaire métastatique murine B16-F10

Ayant découvert des marques de répression H3K9me3 chez le gène Gas1, nous avons

formulé l’hypothèse que la famille de protéines HP1 pouvait jouer un rôle important dans le

maintient de l’ADN en hétérochromatine via la stabilisation des marques de répression

H3K9me3. En effet, il a été démontré que les trois isoformes du gène HP1, soit Cbx1, Cbx3

et Cbx5, pouvaient se lier à la marque de répression H3K9me3 par leur chromodomaine127-

144 et participer à la répression génique

127-145. De plus, il a été publié que ces trois isoformes

pouvaient avoir un rôle redondant144

. Nous avons donc réduit l’expression de Cbx1 (Figure

8A), Cbx3 et Cbx5 (Figure 8B) par petits ARN interférents et vérifier l’effet sur

l’expression du gène Gas1 chez la lignée métastatique B16-F10. Nous avons démontré

qu’il y avait une hausse moyenne de l’expression de Gas1 de 5,5 fois par rapport au

contrôle entre les deux petits ARN interférents testés contre Cbx1. Par ailleurs, il y a une

augmentation moyenne de 2,25 fois de l’expression de Gas1 suite à la transduction contre

Cbx5. Cependant, il faudra refaire l’expérience pour s’assurer de l’exactitude du résultat.

Par contre, il n’y a pas eu de changement par la transduction de petits ARN interférents

contre Cbx3. En somme, nous pouvons maintenant dire que Cbx1 est impliqué dans la

répression du gène Gas1 chez les cellules B16-F10. Il faudra donc utiliser une

immunoprécipitation de la chromatine pour confirmer son rôle direct dans la régulation de

Gas1.

60

Dans la même lancée, nous avons cherché à découvrir d’autres joueurs impliqués dans la

répression du gène Gas1. Nous avons donc vérifié la participation d’histones

méthyltransférases, soit Setdb1, Ehmt2, Suv39h1 et Suv39h2. Ces quatre membres de la

famille KMT ont été démontrés comme des acteurs importants du mécanisme de répression

H3K9me3/HP1127-150

. L’interaction entre Suv39h1, Hp1, dnmt3a et dnmt3b a déjà été

illustré146

, ainsi que celui entre Suv39h1 et hdac1147

ou Suv39h1, Hp1, Ehmt2 et dmnt3a148

.

Suv39h1 a même été associé à la répression de l’E-cadherin, un autre gène suppresseur de

métastases, chez le cancer du sein149

. Pour sa part, l’étude de Suv39h2 est très récente.

Malgré tout, il a été dévoilé qu’une ablation de Suv39h1, Suv39h2 ou les deux n’était pas

létale chez la souris, mais il y avait tout de même des problèmes de taille et des troubles

chromosomiques151

. Pour Setdb1, il a été publié que cette histone méthyltransférase pouvait

interagir avec dnmt3a et dnmt3b pour la méthylation de l’ADN de novo152

, mais également

avec Akt153

ou b-raf154

. Finalement, Ehmt2 a été démontré comme partenaire avec

Hdac1155

, avec Jarid1a156

ou Glp156-157

.

Ainsi, par petits ARN interférents, nous avons réduit l’expression des gènes Setdb1,

Suv39h1, Suv39h2 et Ehmt2 chez les cellules métastatiques B16-F10. Il est donc possible

de visualiser à la figure 8B les effets des petits ARN interférents sur le gène Gas1 pour

Setdb1, Suv39h1 et Suv39h2, mais pas pour Ehmt2. En effet, la réduction par petits ARN

interférents des trois premiers gènes a causé beaucoup de morts cellulaires suite à la

sélection, alors qu’avec Ehmt2, toutes les cellules sont mortes. De plus, il n’y a eu aucune

hausse notable de l’expression du gène Gas1, tel qu’attendue, avec toute cette mort

cellulaire. Dans les prochaines expériences, il faudra impérativement utiliser un vecteur

d’expression inductible afin de moduler plus finement l’expression des petits ARN

interférents contre ces quatre gènes. Il pourrait d'ailleurs être intéressant de vérifier si la

mort cellulaire est causée par l'apoptose engendré par Gas1. En somme, il sera obligatoire

de bien démontrer leurs implications, par petits ARN interférents et par

immunoprécipitation de la chromatine, parce qu’il apparait clair que l’une ou plusieurs de

ces protéines peuvent jouer un rôle important dans la répression du gène Gas1 chez les

cellules B16-F10.

D’autre part, nous avons voulu analyser l’implication du gène Cggbp1 et c-Myc dans la

répression de Gas1. En effet, Cggbp1 a été trouvé au promoteur de Gas1 chez les cellules

61

de gliomes humaines U-2987 Mg53

, tandis que c-Myc a été démontré comme régulateur

indirect de Gas1 chez les fibroblastes NIH 3T314

. Pour notre part, nous n’avons trouvé

aucun indice chez les cellules métastatiques B16-F10 du rôle répresseur de Cggbp1 par

petits ARN interférents (Figure 8B), ni pour c-Myc par petits ARN interférents ou même

par immunoprécipitation de la chromatine (Résultats non illustrés). Bien que ces

expériences soient préliminaires, il n’y a aucune indication de leurs implications lors de la

répression du gène Gas1 chez les cellules métastatiques B16-F10.

4.1.4. Gas1 est réprimé chez les lignées cellulaires murines 4T1

Parallèlement, nous avons choisi de valider nos résultats chez un autre type de cancer, celui

du sein. En effet, il a été publié que certains gènes suppresseurs de métastases comme l’E-

Cadherin pouvaient être régulés épigénétiquement chez le cancer du sein149

. Nos avons

donc sélectionné les cellules 67NR faiblement métastatiques et les cellules 4T1 fortement

métastatiques pour faire nos expériences. Pour vérifier notre modèle, nous avons analysé

par PCR quantitative les niveaux d’expression du gène Gas1 entre les deux lignées

murines. À la figure 17A, il est possible d’apercevoir qu’il y a 43 fois plus d’ARNm de

Gas1 chez la lignée 67NR que celle 4T1. Une fois encore, ce résultat semble indiqué que

les cellules métastatiques du cancer du sein répriment Gas1 pour accroître leur potentiel

métastatique.

Pour continuer l’investigation, nous avons effectué le séquençage de l’îlot CpGs du

promoteur de Gas1 chez la lignée métastatique 4T1. Par conséquent, la figure 17B dévoile

que les groupements CpGs sont pratiquement tous méthylés, impliquant donc le rôle

potentiel des dnmts136-137

. De plus, nous avons utilisé l’inhibiteur TSA pour vérifier

l’implication des histones déacétylases dans la répression de Gas1. Tel qu’illustré à la

figure 17C, le traitement des cellules 4T1 augmente l’expression du gène Gas1. Bien que

ces expériences nous indiquent l’implication potentielle des dnmts et des hdacs dans la

répression de Gas1, il faudra effectuer des essais avec des petits ARN interférents et des

immunoprécipitation de la chromatine pour en confirmer le rôle direct. En somme, il est

tout de même plausible de croire que la répression de Gas1 chez la lignée du cancer du sein

4T1 est similaire à celle obtenue chez la lignée de mélanome B16-F10.

62

4.1.5. Conclusion

Pour conclure, nous avons démontré que le gène suppresseur de métastases Gas1 était

réprimé épigénétiquement chez le mélanome métastatique B16-F10. Nous avons également

montré qu’il était possible d’induire l’expression de Gas1 à l’aide de deux inhibiteurs

chimiques, soit la TSA et le 5-Aza. En plus, nous avons prouvé l’implication de la protéine

Cbx1 au sein du mécanisme répresseur. Bien que nous n’ayons toujours pas trouvé les

HDACs, DNMTs ou les KMTs responsables de la répression de Gas1, nous avons tout de

même illustré qu’ils sont forcément impliqués. En outre, nous avons montré que le

mécanisme réprimant Gas1 semble être similaire chez le cancer du sein murin, offrant de

nouvelles voies d’exploration.

4.2. Les lignées cellulaires humaines

Le plus diagnostiqué en Amérique du Nord, le cancer de la peau possède une forme moins

fréquente, mais très agressive, soit le mélanome. En effet, les métastases issues de la

tumeur primaire causeront plus de 80% de décès chez le patient diagnostiqué158-159

. Offertes

par la Dre. MJ Hendrix160-161

, nous avons choisi les cellules faiblement métastatiques C81-

61 et fortement métastatiques C8161 comme modèle d’étude pour découvrir les

mécanismes entourant la répression du gène Gas1 chez le mélanome humain. Ces cellules

sont très intéressantes, puisqu’elles proviennent d’un même patient. De plus, nous avons

utilisé une deuxième lignée de mélanome humain métastatique, les Lox-IMVI, n’exprimant

pas Gas164

, afin de valider certains résultats. Ainsi, avec l’aide de ces outils, nous avons

décidé de poursuivre l’investigation du gène GAS1 chez le mélanome humain, ayant un

impact clinique plus significatif.

4.2.1. GAS1 est réprimé chez les cellules métastatiques de mélanome humain

C8161 et Lox-IMVI

Dans un premier temps, nous avons émis l’hypothèse que le gène GAS1 était régulé

épigénétiquement selon la même approche qu’avec la lignée métastatique B16-F10 chez les

lignées métastatiques C8161 et Lox-IMVI. Tout d’abord, nous avons vérifié les niveaux

d’expression du gène GAS1 par PCR quantitative chez nos trois lignées de mélanome

63

humain, les C81-61, les C8161 et les Lox-IMVI. À la figure 9A, il est possible de voir qu’il

y a environ 250 fois plus d’ARNm chez la lignée faiblement métastatique C81-61, en

comparaison avec les deux lignées fortement métastatiques. Ce résultat permet de croire

que les lignées cellulaires doivent empêcher l’expression de GAS1 pour accroître leur

pouvoir métastatique, tel que démontré également chez le cancer de la prostate21-31

, le

cancer colorectal50

, le cancer de la thyroïde33

ou le cancer gastrique57

. En somme, étant

donné le rôle de frein du cycle cellulaire2-10-16-17-45-54-60

et d’induction de l’apoptose11-61-64-66-

67 du gène Gas1, l’étude de ce gène pour une utilisation thérapeutique est donc très

intéressante.

4.2.2. GAS1 n'est pas régulé par les HDACs ou les DNMTS chez les cellules

métastatiques C8161 et Lox-IMVI

Par la suite, nous avons voulu analyser l’implication des HDACs et des DNMTs lors de la

répression du gène GAS1 chez les lignées métastatiques C8161 et Lox-IMVI. Par

conséquent, nous avons traité ces deux lignées avec l’inhibiteur d’histones déacétylases

(TSA) et l’inhibiteur de DNA méthyltransférases (5-Aza). Étonnamment, il est possible de

constater à la figure 9A (TSA) et 9B (5-Aza) qu’il n’y a aucun effet significatif de ces deux

inhibiteurs sur les lignées C8161 et Lox-IMVI, contrairement aux cellules métastatiques

B16-F10, observées précédemment. Du fait de l’inaction de ces inhibiteurs, il est possible

de croire qu’il n’y a pas d’HDACs des classes I et II et de DNMTs régulant GAS1124-132-136-

137. À la lumière de ces évidences, nous avons conclue que la répression du gène GAS1

procédait par un mécanisme différent chez les lignées C8161 et Lox-IMVI.

Dans l’optique d’approfondir le mécanisme entourant la répression de GAS1 chez les

lignées métastatiques de mélanome humain, nous avons effectué des études épigénétiques

pour vérifier l’acétylation et la méthylation de ce gène. Pour ce faire, nous avons séquencé

le promoteur du gène GAS1 suite au traitement avec le bisulfite de sodium. En comparaison

avec la séquence sauvage, il est donc possible d’affirmer que l’îlot CpGs du gène GAS1 est

faiblement méthylé chez les lignées cellulaires C81-61, C8161 et Lox-IMVI (Figure 10A).

Impliqué lors de la méthylation de l’ADN et de la répression H3K9me3124-135

, nous

pouvons donc conclure que la répression du gène GAS1 utilise un autre mécanisme pour

64

empêcher sa transcription que les DNMTs ou les HDACs. Bref, un autre complexe

moléculaire répresseur semble à l’œuvre chez ces lignées cellulaires.

D’ailleurs, pour nous indiquer une direction pour chercher le mécanisme de répression du

gène GAS1, nous avons choisi d’effectuer une immunoprécipitation de la chromatine chez

les cellules C81-61 et C8161 pour vérifier la différence entre les marques épigénétiques de

gène GAS1. Curieusement, à la figure 10B (C81-61) et 10C (C8161), il est possible de

discerner une forte présence de la marque d’acétylation au niveau de l’histone 3, une plus

faible présence de la marque de répression H3K9me3, mais aussi un enrichissement de la

polymérase II totale. Également, nous avons immunoprécipité les marques de répression

H3K9me2, H4K20me3 et H3K27me3, et la marque d’activation H3K36me3 au promoteur de

GAS1, bien qu’en très faible quantité (Résultats non montrés). Cette expérience est

importante, puisqu’elle présente des résultats très différents de ceux obtenus avec la lignée

métastatique B16-F10 et ils nous ont poussé à chercher de nouveaux mécanismes

responsables de la répression du gène GAS1 chez la lignée métastatique C8161. Par

ailleurs, nous avons pu tirer plusieurs conclusions de cette expérience. Tout d’abord, la

faible présence de la marque de répression H3K27me3 nous indique que la répression du

gène GAS1 chez la lignée cellulaire C8161 ne procède pas par le complexe répresseur

PRC2. En effet, ce complexe comprenant notamment les protéines EZH2, SUZ12 et

JARID2, est responsable de la mise en place des groupements méthyles au niveau de la

lysine 27 de l’histone 3126-162

. De plus, nous avons effectué une immunoprécipitation de la

chromatine contre SUZ12 chez les C8161, où il n’y a pas eu d’enrichissement, signe de

l’absence de cette protéine au promoteur de GAS1 (Résultat non illustré). Il est intéressant

de noter que nous avons également vérifié l’implication du complexe répresseur PRC1,

notamment par une immunoprécipitation de la chromatine contre RING1B (Résultat non

montré) et par l’utilisation de petits ARN interférents contre BMI1 (Figure 19A - en

Annexe). Bien que l’immunoprécipitation de RING1B n’ait pas donnée de résultat positif,

la dégradation de l’ARNm de BMI1 par petits ARN interférents a causé une hausse de

l’expression du gène GAS1 chez les cellules C8161. En fait, les deux protéines sont

utilisées dans le complexe PRC1 pour la répression par monoubiquitination H2AK199 et

recrutées par PRC2126

. En outre, il est possible de croire que PRC2 et la marque de

répression H3K27me3 ne jouent aucun rôle dans la répression de GAS1 chez la lignée

65

métastatique C8161, alors que BMI1 pourra y en avoir un par un autre mécanisme.

D’autres expériences devront donc être envisagées pour connaître son implication.

Ensuite, nous avons examiné l’implication des marques H3K9me2 (Résultat non dévoilé) et

H3K9me3 (Figure 10C) lors de la répression de GAS1. Marques de répression catalysées par

les KMTs, elles sont généralement présentes au niveau de gènes non transcrits127-128

.

Malgré tout, il a été démontré qu’il pouvait exister un équilibre entre les marques

d’activation et de répression au promoteur de Gas1 chez des cellules hépatiques lors des

différents cycles cellulaires et que la transcription du gène dépendait des proportions entre

les marques activatrices et répressives56

. Par conséquent, il apparait probable qu’un tel

équilibre existe entre les marques d’acétylation et de méthylation au niveau du promoteur

de GAS1 chez les cellules C8161, d’autant plus qu’il y a présence d’une forte acétylation

sur l’histone 3 (Figure 10C). Bien qu’il y ait moins de marque H3K9me3 et très peu de

H3K9me2 par rapport à celle d'AcH3, nous avons tout de même cherché à trouver le

responsable de cette méthylation. Pour l’instant, nous avons réduit l’expression du gène

SETDB1, une KMT, par petits ARN interférent (Figure 19A - en annexe), sans observer

d’effet sur le gène GAS1. En somme, bien que les marques H3K9me3 et H3K9me2 sont

présentes en faible proportion au promoteur de GAS1, la forte présence d’acétylation et la

présence de la polymérase nous signale un autre type de mécanisme impliqué dans sa

répression.

Par la suite, la faible présence de la marque H3K36me3 pose de nouvelles interrogations. En

effet, la marque d’H3K36me3 a été régulièrement associée à l’élongation de la

polymérase126

. De plus, il a été démontré que son absence pouvait empêcher la transcription

du gène p21, en induisant une pause transcriptionnelle à l’aide du complexe NELF163

. Étant

donné qu’il y a présence de la polymérase II et qu’il n’y avait pas de marque H3K36me3 au

sein du gène GAS1, nous avons émis l’hypothèse qu’il pourrait s’agir d’une répression par

pause transcriptionnelle. Par conséquent, nous avons dégradé par petits ARN interférents

l’ARNm du gène WHSC2, codant pour une protéine essentielle au complexe NELF, soit

NELF-A, chez la lignée métastatique C8161. À la figure 16D, il est possible de constater

que bien que la répression de l’ARNm de WHSC2 soit supérieure à 50% pour trois petits

ARN interférents testés, il n’y a aucun effet sur l’expression de GAS1. Par ailleurs, il a été

publiée que le complexe NELF requière tous ces composantes pour être fonctionnel164-166

.

66

Nous pourrions donc exclure ce type de mécanisme. Par contre, une autre publication a

illustré par une étude d’ablation des composantes NELF qu’il y avait des gènes pouvant

être augmentés ou diminués en fonction du type de NELF, en plus d’une variation de

l’intensité165

. Nous pouvons donc croire que la dégradation de l’ARNm d’un autre

composant du complexe NELF pourrait avoir un effet sur GAS1. Il apparait d’ailleurs pour

certain que l’un ou l’autre entre NELF et DSIF, un autre complexe responsable de

l’inhibition de l’élongation, pourrait avoir un rôle plus important pour certains gènes ou

tissus167

. À la lumière de ces évidences, il est clair que le mécanisme de répression du gène

GAS1 pourrait dépendre d’une pause transcriptionnelle chez les cellules métastatiques

C8161, induite par les complexes NELF et DSIF. D’autres expériences pourront démontrer

la pertinence de cette hypothèse.

Également, nous avons trouvé très peu de marque H4K20me3, une marque de répression qui

a été associée aux régions d’hétérochromatine129

. Son absence illustre bien l’implication

d’un mécanisme différent pour réprimer le gène GAS1 chez les cellules métastatiques

C8161.

Au final, la forte présence d’acétylation sur l’histone 3 nous dévoile que les lysines 9 et 27

de l’histone 3 sont potentiellement acétylées. De plus, conjugué avec la présence de la

polymérase, il apparait évident que le mécanisme de répression du gène GAS1 implique une

dynamique épigénétique pour empêcher la transcription de son ARNm. Malheureusement,

nous n’avons pas encore vérifié d’autres mécanismes possibles de répression comme

l’absence de phosphorylation sur certain activateur génique, l’acétylation de la marque

H3K4 ou la glycosylation d’histones115

.

Parallèlement, nous avons construit deux vecteurs luciférases exprimant la région 3’UTR

du gène GAS1 (Figure 20 - en annexe). En effet, il a été démontré plusieurs fois que les

microARNs peuvent jouer un rôle majeur dans la régulation des gènes. Par exemple, le

microARN 144 a été illustré comme un promoteur du pouvoir métastatique chez le

carcinome du nasopharynx en réprimant le gène PTEN176

. Nous avons décidé d'étudier cette

possibilité, car il a été démontré qu'il y avait une forte présence du miR-495 chez les

cellules métastatiques C8161, en comparaison avec les cellules faiblement métastatiques

C81-61217

. De plus, avec un outil de détection des sites de microARNs, MiRanda218

, nous

67

avons trouvé qu'il y avait quatre sites possibles pour le miR-495 présents dans la région

3'UTR de GAS1. Nous avons donc effectué un essai luciférase avec les deux constructions,

soit la partie A.1 et la partie B.1 de la région 3’UTR de GAS1 chez la lignée métastatique

C8161. Or, il n’y a pas eu de dégradation d’aucune des deux parties en comparaison avec le

contrôle positif (Figure 11). Nous pourrions donc croire qu’il n’y a pas d’implication des

microARNs chez les cellules C8161, mais d’autres expériences devront être effectué pour

en être certain. Par exemple, il faudra exprimer le microARNs miR-495 en même temps

que les vecteurs exprimant la région 3’UTR de GAS1 afin de bien valider leur implication

chez la lignée C8161.

4.2.3. L’expression du GAS1 est contrôlée par les gènes BRD4 et c-MYC chez

les cellules métastatiques de mélanome humain C8161 et Lox-IMVI

Très abondant chez plusieurs types de cancers, l’oncogène c-MYC est une protéine aux

multiples rôles. Tant activateur que répresseur, il a été démontré qu’elle possédait un

champ d’action grandiose, contrôlant autant la prolifération, l’apoptose et bien d’autres

processus biologiques. Plusieurs publications portaient à croire que c-MYC était impliqué

dans la répression de GAS1, mais sans le démontrer directement. Nous avons donc émis

l’hypothèse que GAS1 pouvait être réprimé épigénétiquement par un complexe moléculaire

comprenant c-MYC chez le mélanome métastatique.

Dans un premier temps, pour valider notre hypothèse, nous avons dégradé l’ARNm du gène

c-MYC chez les lignées cellulaires métastatiques C8161 et Lox-IMVI. À la figure 13A, il

est possible de voir que chez les deux lignées observées et transduites par petits ARN

interférents contre c-MYC, l’expression du gène GAS1 est augmentée en moyenne de 10

fois par rapport au contrôle. De plus, la figure 14B (C8161) et 14C (Lox-IMVI) illustre

l’enrichissement au dessus du contrôle négatif de 4 fois (C8161) et de 2,5 fois (Lox-IMVI)

d’une immunoprécipitation de la chromatine avec un anticorps contre c-MYC au promoteur

du gène GAS1. Pris ensembles, ces résultats prouvent bien la présence et la répression

directe induite par la protéine c-MYC du gène GAS1 chez les mélanomes métastatiques

C8161 et Lox-IMVI. Par ailleurs, ces expériences abondent dans le même sens que la

littérature scientifique, où c-MYC a été régulièrement retrouvé répresseur de gènes

impliqués dans la régulation du cycle cellulaire comme p21104

, p1597

ou GADD15392

. De

68

plus, d’autres évidences démontraient son rôle dans la répression de GAS1, mais

indirectement et chez d’autres lignées cellulaires comme les fibroblastes 3T31-2-14-29

. En

somme, ces résultats démontrent bien le rôle répresseur de c-Myc au gène GAS1.

D’ailleurs, nous avons poursuivi l’investigation en vérifiant la capacité à empêcher la

répression de GAS1 par c-MYC en utilisant l’inhibiteur chimique JQ1. Ce produit est un

composé inhibant le domaine BET de la protéine BRD4, impliqué dans l’activation du gène

c-MYC177

. Par conséquent, la répression de c-MYC devait augmenter les niveaux

d’expression du gène GAS1 chez les lignées métastatiques C8161 et Lox-IMVI. De plus, en

parallèle, nous avons effectué une dégradation de l’ARNm de c-MYC par petits ARN

interférent pour vérifier le potentiel synergique des deux combinaisons. La figure 13B

(C8161) et 13C (Lox-IMVI) nous dévoile qu’il y a belle et bien synergie de l’inhibiteur

JQ1 avec les petits ARN interférent pour la répression de c-MYC, mais curieusement, la

combinaison n’augmente pas plus l’expression de GAS1 en comparaison avec les petits

ARN interférent contre c-MYC seul. Or, la synergie avec JQ1 provoque au contraire une

légère diminution de l’expression de GAS1. Il nous a donc fallu envisager la possibilité du

rôle activateur de BRD4 au promoteur de GAS1. En effet, plusieurs publications dénotent la

présence de BRD4 comme régulation de la transcription chez les gènes Aurora B168

ou NF-

κB169

. De plus, d’autres articles stipulent la capacité de BRD4 à phosphoryler la sérine 2 de

la polymérase II pour démarrer la transcription170-171

. Bref, il s’avèrerait plausible que

l’expression de GAS1 soit contrôlée par c-MYC et par BRD4.

Dans l’optique de valider cette nouvelle hypothèse, nous avons utilisé l’inhibiteur JQ1 pour

empêcher la liaison de BRD4 au promoteur de GAS1 chez la lignée faiblement métastatique

C81-61. Or, la figure 12A divulgue qu’il y a bien une diminution de l’expression de GAS1

de plus de 80% chez les cellules C81-61 traitées avec l’inhibiteur JQ1. Nous avons donc

poursuivi en diminuant la présence de BRD4 par petits ARN interférent. Concordant avec

la première expérience, l’expression de GAS1 est bien réduite avec deux des trois petits

ARN interférents testés (Figure 12B). Pour finaliser le tout, nous avons effectué une

immunoprécipitation de la chromatine contre la protéine BRD4 au promoteur de GAS1

chez la lignée faiblement métastatique C81-61 et démontré sa présence (Figure 12C), mais

également chez la lignée métastatique C8161 (Figure 14C), prouvant son implication direct

69

dans l’activation du gène GAS1. Ces expériences nous ont bien illustré le rôle de BRD4

dans la promotion de la transcription de GAS1.

D’une part, nous avons voulu établir le complexe répresseur entourant l’oncogène c-MYC

lors de la régulation de GAS1. Il a été régulièrement démontré dans la littérature que MIZ1

et MAX pouvaient être des partenaires de c-MYC lors de la répression92-97

. Dans ce

contexte, nous avons utilisé l’inhibiteur 10058-F4, un composant empêchant la liaison entre

MAX et c-MYC, pouvant réduire leur potentiel répressif. En effet, ce produit a déjà été

publié pour empêcher la répression des gènes p21 et p27172

. À la figure 15A, il est possible

de voir que le gène p21 est effectivement plus exprimé en présence de l’inhibiteur de c-

MYC/MAX, mais ce n’est pas le cas de GAS1 chez la lignée métastatique C8161. Pour être

certain, nous avons tout de même réprimé par petits ARN interférents le gène MAX (Figure

15B). Une fois encore, l’expression de p21 est augmentée pour l’un des petits ARN

interférents, mais pas les deux autres. Par contre, il n’y a toujours aucun changement pour

notre gène d’intérêt, GAS1. Fait intéressant, il y a également une hausse de l’expression du

gène C/EBPδ, indiquant potentiellement une répression MAX/MAD, plutôt que c-

MYC/MAX/MIZ195-99

pour celui-ci. Pour clore l’investigation, nous avons dégradé

l’ARNm du gène MIZ1, impliqué dans le complexe de répression avec c-MYC et MAX104

.

Bien que l’expression du contrôle p21 soit augmentée, ce n’est pas le cas pour GAS1

(Figure 15C). À la lumière de ces évidences, il est donc possible d’affirmer que le gène

GAS1 est réprimé épigénétiquement par c-MYC chez la lignée cellulaire métastatique

C8161, mais sans la participation des facteurs de transcription MAX ou MIZ1.

Dernièrement, un article avait publié pour la première fois un nouveau complexe répressif

avec c-MYC, impliquant les protéines KDM5B et TFAP2C105

. Pour valider cette

possibilité, nous avons donc réduit le niveau d’ARNm de ces deux gènes chez la lignée

métastatique de mélanome C8161 par petits ARN interférents. Or, à la figure 16A, il est

possible de constater que la diminution de l’expression de ces deux gènes ne provoque pas

ou peu d’augmentation du niveau d’ARNm de GAS1. Nous avons donc exclue ce type de

mécanisme de répression chez la lignée C8161 pour le gène GAS1.

Dans un autre ordre d’idée, plusieurs publications ont démontré la voie TGF-β comme

stimulateur de la progression tumorale173-174

. Nous avons donc émis l’hypothèse que la

70

répression de GAS1 pouvait être issue de cette voie de signalisation. Pour le vérifier, nous

avons donc dégradé par petits ARN interférents divers acteurs de cette voie, soit SMAD2,

SMAD3, SMAD4 et TGFβRII (Figure 19B - en annexe). Malheureusement, aucune des

expériences n’a eu d’incidence sur l’expression du gène GAS1 chez la lignée cellulaire

C8161. La répression de GAS1 passe donc par une autre voie de signalisation chez cette

lignée de mélanome.

Pour finir, nous avons voulu examiner la possibilité d’un contrôle du gène GAS1 chez la

lignée cellulaire C8161 par un mécanisme employant les isolateurs CTCF. En effet, le

mécanisme utilisant les PARPs, la PARG et les isolateurs CTCF peut réguler les gènes en

activant ou réprimant ceux-ci comme illustré pour le gène RARRES1175

. Ainsi, les

isolateurs CTCF se lient aux régions hypométhylées, empêchent la prolifération

d'hétérochromatine et facilitent la transcription génique216

. Dans certains cas, les PARPs

peut favoriser cette transcription par PARylation de répresseurs comme DNMT1,

empêchant la méthylation de ces promoteurs actifs216

. Par conséquent, nous avons utilisé un

inhibiteur de PARP-1 et de PARP-2, l’ABT-888. Ces PARPs pouvaient être responsables

de l’activation génique avec les isolateurs CTCF en inhibant DNMT1178

, chez la lignée

faiblement métastatique C81-61. À la figure 16B, il est possible d’observer que l’utilisation

de ce composé réduit l’expression du gène GAS1 de 60%. Il est donc envisageable de croire

en l’implication de ce type de mécanisme comme répression de GAS1 chez la lignée C81-

61. Cependant, la dégradation par petits ARN interférents du gène de la PARG chez la

lignée fortement métastatique C8161 n’induit pas d’expression de GAS1 (Figure 16C), mais

réduit plutôt son expression. En effet, la PARG élimine les poly (ADP-ribose) mis en place

par les PARPs, permettant la prolifération d'hétérochromatine par des protéines comme les

DNMTs182

. Il pourrait donc être possible que la dégradation de l'ARNm de la PARG permet

la prolifération de l'hétérochromatine, réduisant encore plus l'expression de GAS1 chez la

lignée métastatique C8161. En somme, nous avons conclue que le mécanisme de répression

du gène GAS1 chez les cellules C8161 utilisait un autre procédé que la PARG.

4.2.4. Conclusion

En conclusion, bien que la dynamique entre l’activation et la répression génique reste très

complexe, il est possible d’affirmer que chez notre modèle cellulaire C81-61 et C8161, la

71

répression du gène GAS1 est très différente de celle retourné chez les cellules B16-F0 et

B16-F10. Dans un premier temps, le promoteur de la lignée C8161 est dans un état ouvert

avec une forte présence d’acétylation et une plus faible présence de la polymérase II. En

plus, nous avons démontré l’implication lors de la répression de GAS1 de l’oncogène c-

MYC, sans toutefois identifier ses partenaires. Par conséquent, un mécanisme de pause

transcriptionnelle pourrait être une possibilité intéressante, dans l’optique où c-MYC

pourrait empêcher le recrutement de facteurs de transcription responsables de la

méthylation de marques d’élongation comme H3K36me3. En somme, il serait intéressant

lors des prochaines expériences d’analyser l’implication de gènes de la famille HMTs pour

élucider ces perspectives.

72

73

5. Conclusion générale et perspectives

Depuis quelques années, le cancer est devenu la première cause de décès en Amérique du

Nord. Dans 90% de ces décès, ce sont les métastases issues d’une tumeur primaire solide

qui en seront responsables. Il est donc impératif d’accroître les outils thérapeutiques pour

combattre cette pathologie.

Pour notre part, nous avons choisi d’étudier la régulation transcriptionnelle du gène

suppresseur de métastases Gas1 dans l’optique de freiner la capacité métastatique des

cellules tumorales. Dans un premier temps, nous avons démontré que Gas1 n’était pas

exprimé chez les cellules métastatiques, autant chez les cellules murines B16-F10 que chez

les cellules humaines C8161 et Lox-IMVI. De plus, nous avons illustré que le mécanisme

de répression de Gas1 chez les B16-F10 utilisait la méthylation d’histones et d’ADN grâce

aux Hdacs et Ddnmts. De plus, nous avons prouvé l’implication de la marque de la

répression H3K9me3 et des protéines associées HP1.

Dans un deuxième temps, nous avons montré que le mécanisme de répression du gène

GAS1 chez les cellules métastatiques humaines C8161 et Lox-IMVI utilisait un processus

différent des cellules B16-F10. En effet, nous avons dévoilé qu’il y avait très peu de

marque de répression, mais plutôt une forte présence des marques d’activation et même la

présence de la polymérase II. Également, nous avons démontré l’implication de l’oncogène

c-MYC et du facteur de transcription BRD4 pour la régulation de GAS1 chez les C8161.

Nous avons finalement émis l’hypothèse que sa répression pourrait être basée sur une pause

transcriptionnelle induite par la déméthylation d’histones impliquées dans l’élongation. Un

schéma récapitule ces découvertes à la figure 18. Finalement, nous avons découvert que le

gène Gas1 n’est pas présent chez les cellules métastatiques 4T1, ouvrant une nouvelle voie

vers le cancer du sein.

74

En perspective, il serait intéressant de poursuivre les découvertes entourant la régulation du

gène Gas1 chez la lignée métastatique B16-F10. Par exemple, l'utilisation de petits ARN

interférents contre les Dnmts ou du 5-Aza, suivi d'un séquençage d'ADN traité au bisulfite

de sodium pourrait démontrer directement leur implication. Pour palier leur rôle redondant,

il serait également intéressant d'effectuer des dégradations de plus d'un Dnmt à la fois. En

plus, l'utilisation d'un vecteur inductible pour vérifier l'implication des KMTs serait efficace

pour réduire la mort cellulaire afin d'observer l'effet sur le gène Gas1 chez la lignée B16-

F10.

Pour les lignées métastatiques humaines, il serait stimulant de poursuivre l'implication des

facteurs de transcription c-MYC et BRD4 par des dégradations par petits ARN interférents

en même temps que des immunoprécipitations de la chromatine. L'étude plus en profondeur

des membres de la famille HMTs serait une future avenue pour découvrir les mécanismes

de régulation du gène GAS1 chez les lignées métastatiques C8161 et Lox-IMVI. En effet, la

marque d'élongation H3K36me3 est absente du gène GAS1 chez ces cellules.

Avec ces nouvelles évidences, il est maintenant possible de mieux comprendre les

mécanismes entourant la répression de Gas1 chez les cellules métastatiques. Chez ces

75

cellules, Gas1 semble réprimer tout comme d'autres gènes impliqués dans la régulation du

cycle cellulaire, tel que p21 ou p15. Au niveau protéique, Gas1 a été démontré comme un

récepteur pouvant induire l'arrêt de la croissance cellulaire, mais également l'apoptose via

des partenaires comme Ret et les GFRs. Bien que d’autres expériences devront être

effectuées pour augmenter les connaissances de Gas1, il est dès maintenant envisageable

d’utiliser ce gène comme outil thérapeutique contre la métastase. Par exemple, Gas1 a déjà

été utilisé pour induire l'apoptose chez des cellules d'un gliome65

. Il pourrait également être

intéressant d'induire l'expression de Gas1 chez des cellules métastatiques afin de réduire

leur expansion ou même les éliminer par apoptose.

76

77

6. Références

1- Del Sal, G. et al. : The Growth Arrest-Specific Gene, gas1, is involved in growth

suppression, Cell 1992, 70 : 595-607.

2- Chen-Cleland, TA. et al. : Recovery of transcriptionally active chromatin restriction

fragments by binding to organomercurial-agarose magnetic beads. A rapid and

sensitive method for monitoring changes in higher order chromatin structure

during gene activation and repression, Journal of Biological Chemestry 1993,

268(31): 23409-23416.

3- Evdokiou, A. et al. : Localization of the human growth arrest-specific gene (GAS1)

to chromosome bands 9q21.3-q22.a region frequently deleted in myeloid

malignancies, Genomics 1993, 18(3): 731-733.

4- Del Sal, G. et al. : A structure, function, and chromosome mapping of the growth-

suppressing human homologue of the murine gas1 gene, PNAS 1994, 91(5): 1848-

1852.

5- Rhodes, N. et al. : v-mos-transformed cells fail to enter quiescence but growth

arrest in G1 following serum withdrawal, Experimental cell research 1994, 213(1):

210-217.

6- Wicking, C. et al.: The human growth-arrest-specific gene GAS1 maps outside the

candidate region of the gene for nevoid basal cell carcinoma syndrome,

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97

7. Annexes

7.1. Annexe un - Candidats criblés par petits ARN interférents

98

99

7.2. Annexe deux - Séquence des constructions 3'UTRhGAS1-A.1 et

B.1

100

101

7.3. Annexe trois - Liste des produits, des anticorps et des amorces

utilisés

Tableau 1 : Liste des produits utilisés Numéro Produit Compagnie Catalogue

A1 DMEM Sigma-aldrich D5648

A2 FBS Sigma-aldrich F6178

A3 F10-HAM Sigma-aldrich N6635

A4 Mito+ BD Biosciences 355006

A5 RPMI 1640 Gibco 11875119

A6 Hepes Sigma-aldrich H4034

A7 MEM Sigma-aldrich M7145

A8 NCS Sigma-aldrich N4639

A9 L-glutamine Sigma-aldrich G3126

A10 Pénicilline/Streptomycine Sigma-aldrich P4333

Numéro Produit Compagnie Catalogue

B1 TSA Cell Signaling 9950

B2 5-Aza Calbiochem 189825

B3 Inhibiteur de c-Myc Calbiochem 475956

B4 JQ1 Biovision 2070-01-01


C1 Pétri de 100 mm Fisher Scientific 12556002

C2 Solution de lyse Sigma-aldrich L8285

C3 Colonne de filtration Sigma-aldrich C9346

C4 Colonne d'attachement de l'ARN Sigma-aldrich C9471

C5 Solution de lavage I Sigma-aldrich W3136

C6 DNAse I sur colonne Sigma-aldrich DNASE70-1SET

C7 Solution de lavage II Sigma-aldrich W3261

C8 solution d’élution Sigma-aldrich E8024


D1 Mélange d'amorces d'hexamètres et

d'ancres poly-dT

New England

Biolabs S1330S

D2 Transcriptase inverse New England

Biolabs M0253L

D3 Tampon de transcriptase inverse New England

Biolabs B0253S

102

D4 Inhibiteur de RNAses New England

Biolabs M0307S


E1 Green-2-Go Sybr Green Bio Basic Inc. QPCR004-S

E2 Plaque de qPCR 96 puits Thermo

Scientific AB-0700

E3 Film collant pour plaque qPCR 96

puits BIO-RAD MSB1001


F1 Pétri de 150 mm Fisher Scientific 12556003

F2 Formaldéhyde Sigma-Aldrich F8775

F3 Glycine Sigma-Aldrich G8898

F4 Tube 1.5 ml Axygen MCT-150-C

F5 NaCl Sigma-Aldrich S7653

F6 Tris Fisher Scientific BP152-1

F7 Hcl J.T.Baker 9535-02-01

F8 EDTA Sigma-Aldrich E4884

F9 NP-40 Fluka 74385

F10 Triton X-100 ICN

Biomedicals Inc. 807426

F11 PMSF Sigma-Aldrich P7626

F12 Leupeptine Sigma-Aldrich L8411

F13 Sonicateur Sonic Dismembrator Fisher Scientific Modèle 60

F14 Sonde 1/8 Fisher Scientific 15338253

F15 Tube 15 ml Sarstedt 62.554.205

F16 Billes d’agarose A Genscript L00210

F17 Billes d’agarose G Genscript L00209

F18 Chelex-100 BIO-RAD 142-1253

F19 Protéinase K Sigma-aldrich P2308

F20 Acide acétique glacial Sigma-aldrich 695084

F21 Échelle de 100 paires de bases New England

Biolabs N3231S


G1 Pfu ADN polymérase Phire II Finnzymes F-122S

G2 Tampon de Phire II Finnzymes F-524

G3 dNTP Omega P01-01, P02-01,P03-

01 et P04-01

G4 DMSO Finnzymes F-515

G5 Taq polymérase Qiagen 1032502

G6 Tampon de Taq polymérase Qiagen 1005479

103

G7 MgCl2 Qiagen 1005482

G8 échelle de 1000 paires de bases New England

Biolabs N3232S

G9 Tampon QX1 Qiagen 20912

G10 Tampon QX2 Qiagen 20902

G11 Tampon PE Qiagen 19065

G12 Tampon 1 New England

Biolabs B7001S


Biolabs B7002S


Biolabs B7003S


Biolabs B7004S

G16 BSA New England

Biolabs B9001S

G17 Tampon de la alcaline phosphatase New England

Biolabs B7003S

G18 Alcaline phosphatase New England

Biolabs M0290S

G19 Ligase T4 et son tampon New England

Biolabs M2029S

G20 Milieu LB Fisher Scientific BP1426500

G21 Glycérol Fisher Scientific BP229-4

G22 Solution I Bio Basic Inc. BS614

G23 Solution II Bio Basic Inc. BS614

G24 Solution III Bio Basic Inc. BS614

G25 Colonnes Bio Basic Inc. BS423

G26 Solution de resuspension Sigma-Aldrich R1149

G27 Solution de lyse Sigma-Aldrich L1912

G28 Solution de neutralisation Sigma-Aldrich N1285

G29 Solution d'attachement Sigma-Aldrich B4683

G30 Seringues Sigma-Aldrich G8917

G31 Colonnes Sigma-Aldrich G4792

G32 Solution de lavage I Sigma-Aldrich W0263

G33 Solution de lavage II Sigma-Aldrich W4639

G34 Solution d'élution Sigma-Aldrich E7777


H1 DNAzol Invitrogen 10503-027

H2 NaOH Fisher Scientific S318-1


104

I1 Tampon de dilution Zymo Research D5001-2

I2 Bisulfite de sodium Zymo Research D5001-1

I3 Colonnes Zymo Research C1004-50

I4 Solution de lavage Zymo Research D5002-4

I5 Tampon de désulphonation Zymo Research D5001-5

I6 Solution de lavage Zymo Research D5002-4

I7 Solution d'élution Zymo Research D5001-6


J1 Acétate de sodium Matlab Sr-0190

J2 PEI Polysciences 23966-2

J3 Puromycine VWR CA80503-312


K1 SDS Fisher Scientific BP166-500

K2 Bleu de bromophénol Alfa Aesar 115-39-9

K3 β-mercaptoéthanol Sigma-Aldrich M7522

K4 Plaque blanche 96 puits BD Biosciences 353296

K5 Bradford BIO-RAD 500-0114

K6 Membrane de nitrocellulose Life Sciences P/N 66485

K7 Solution d'ECL GE Healthcare W398390


L1 Tampon de lyse passif Promega E1941

L2 Solution de luciférase et de renilla Promega E1910

Tableau 2 : Liste des anticorps

Nom Compagnie Numéro

AcH3 Millipore #06-599

H3K9me3 Millipore #05-1250

BRD4 Abcam #5716-1

c-MYC Santa Cruz Technology #sc-764

IgG Genscript #A01007

Suz12 Millipore #17-661

105

Tableau 3 : Liste des amorces Nom Forward Reverse

ChIP

pGAS1 TTA AAG CCT CGC TGC

TAA CG

GCG GGG AGA ACA AGA

AAG TC

pGAPDH CGG CTA CTA GCG GTT

TTA CG

AAG AAG ATG CGG CTG

ACT GT

pRHAG TTA CAA CAC AGC CAC

CTC CA

ATG TTT TGG AAA CGG

CAA TC

pgas1 GCC TCT CTC ATC CTG

TGA GG

GGA CTG TCC ACC TCT

CCA AA

qPCR humain

U6 CTC GCT TCG GCA GCA

CA

AAC GCT TCA CGA ATT

TGC GT

hGAS1 TGG GAC AGA TAG AAG

GGA TGG TT

ACC GGC TAC ACC AAG

TTG ACT T

hCMYC TTC GGG TAG TGG AAA

ACC AG

CAG CAG CTC GAA TTT

CTT CC

hMAX GGC AAG AAG ACC TGA

TTG GA

CTG CAA ATC TGT CCC

CAC TT

hZBTB17 AAG CCC TAC CAG TGC

GAC TA

TCA GCG ATG TGG ATC

TTC AG

hCDKN1A GCG ACT GTG ATG CGC

TAA T

GTC ACC CTC CAG TGG

TGT CT

hCEBPd ACA TAG GAG CGC AAA

GAA GC

CCT TAG CTG CAT CAA

CAG GA

qPCR murin

mgas1 GCG AAT CGG TCA AAG

AGA AC

CGC TGC TGC TCG TCA

TAT T

mdnmt1 TGA GGA AGG CTA CCT

GGC TA

GTC TGC CAT TTC TGC

TCT CC

mdnmt3a ACC AGG CCA CCT ACA

ACA AG

GCT TGT TCT GCA CTT

CCA CA

mdnmt3b GGT GTG AGG GAT ACG

AAG GA

GAG GAA CTA GGG GGT

TCT GG

106

107

7.4. Annexe quatre - Vecteurs d'expression

108

109

Documents

Le gène suppresseur de métastases Growth Arrest … · iii Résumé Nous avons récemment découvert que le gène Gas1 agit comme un suppresseur de métastases chez le mélanome