LE PALUDISME D’IMPORTATION : DIAGNOSTIC AU LABORATOIRE

Ludovic de Gentile +*, Franck Genevi&eb

R&urn6

En France mCtropolitaine, le paludisme d’importation est respon-

sable d’une vingtaine de d&z&s chaque ant-&e. D&s le diagnostic de

paludisme &oquit, aucun retard ne doit 6tre pris et le laboratoire

d’analyses medicales joue un rBle central dans le diagnostic de

certitude. Le QBCW Malaria test utilisant I’acridine orange permet

un diagnostic rapide du paludisme mais sa mise en ceuvre n&es-

site un materiel spbcifique, et son utilisation reste actuellement

limitbe aux structures traitant un grand nombre de recherche de

Plasmodium. Les techniques immunochromatographiques r&em-

ment d6veloppees peuvent 6tre consid&es comme un appoint

interessant & la d6marche diagnostique mais ne peuvent en aucun

cas se substituer au frottis sanguin. Celui-ci reste en effet la Pierre

angulaire du diagnostic du paludisme en urgence.

Paludisme - test diagnostiques - frottis sanguin - PfHRP2.

Summary

In France, imported malaria killed nearly twenty persons per year. When malaria is suspected, no delay is admitted and laboratories

take a central place for the diagnosis in emergency.

lmmunochromatographic tests recently developped for the qualita-

tive detection of Plasmodium falciparum specific antigen

(PfHRP2) may be interesting for diagnosis but they can’t take the

place of thin blood film. This one is always the stone corn of emer-

gency malaria diagnosis.

Malaria - diagnostic tests - thin blood film - PAIRP2.

1. Introduction

A vet environ 5000 cas par an, le paludisme d’importation B Plasmodium falciparum reprksente une affection rare en France

m&ropolitaine. Cependant, cette maladie largement curable est & l’ori- gine d’une vingtaine de d&r% chaque annbe [22]. Sous I’dgide de la

SocW de pathologie infectieuse de langue franqaise (SPILF), s’est tenue en avril 1999 une conference de consensus sur la prise en charge et la pr&ention du paludisme d’importation B Plasmodium fal-

a Laboratoire de parasitologie-mycologic b Laboratoire d’h6matologie Centre hospitalier universitaire 4, rue Larrey 49033 Angers cedex 01

* Correspondance.

article re~u le 22 septembre 1999, accept6 le 17 fCvrier 2000.

0 Elsevier, Paris.

Revue Franpaise des Labor&&., marslavrll 2000, N” 321

ciparum. Dans ses conclusions, le jury a rappel6 le r6le central du labo-

ratoire d’analyses medicales dans le diagnostic en urgence et la pr& Bminence du frottis sanguin comme moyen de recherche du parasite

dans le sang 191.

2. Le frottis sanguin et la goutte 6paisse

2.1. La realisation du frottis et de la goutte epaisse

Le frottis sanguin est de rkalisation simple. Au mieux, il est fait par ponc-

tion capillaire au bout du doigt apr&s d&infection de la pulpe. A dkfaut,

le frottis sanguin peut &tre realis B partir d’un pr&vement par ponc- tion veineuse sur un tube avec anticoagulant. Le d&p& de la goutte

de sang se fait $I une extremite de la lame Porte-objet, puis le frottis

est &al6 et s&h& B I’air.

Pour realiser une goutte Bpaisse de qualit6, le pr&vement doit etre

realis par ponction capillaire. En effet, la goutte Bpaisse realisee g

partir de sang recueilli sur anticoagulant a tendance g se d&coller lors

des op&ations d’h6molyse et de lavage. Apres avoir realis les frot- tis sanguins utiles au diagnostic d’urgence, I’op6rateur recueille une

grosse goutte de sang au milieu d’une lame Porte-objet puis, rapi- dement, dbfibrine la goutte de sang en la tournant &guli&rement pen-

dant au moins 1 min & I’aide de la pointe d’un vaccinostyle, laissant un aide faire I’h&mostase par pression sur le point de ponction. La

goutte Bpaisse doit Gtre conservbe & l’abri de la lumi&e et de la pous- s&e pour btre ensuite traitbe. Un temps de s&hage court peut btre

& I’origine d’une perte significative des parasites [12, 351. La goutte

Bpaisse ne permet done pas un diagnostic d’urgence du paludisme

mais, quoique de lecture difficile, elle reste I’examen de reference

admis par tous dans le cadre du diagnostic du paludisme et doit 6tre

systematiquement real&e (examen 1125 de la nomenclature des actes de biologie medicale [27]). La lecture de la goutte Bpaisse per-

met de plus une meilleure approche diagnostique des associations plasmodiales. Cluelques variantes comme le s6chage au four & micro-

ondes [8] ou I’h8molyse 6 la saponine suivie d’une concentration par centrifugation [17, 321 ont BtB proposites pour rbduire le temps de

realisation de la goutte Bpaisse.

2.2. La coloration

Apr& &chage, le frottis est color6 par une coloration panoptique. En France, la coloration de May Grundwald Giemsa (MGG) est la plus

frbquemment utilisbe ; aux Etats-Unis d’Am&ique, la coloration de Field

est largement rbpandue. Pour obtenir une coloration permettant de bien

visualiser les caractbristiques morphologiques des Plasmodium et des h6maties parasitbes, il est important de rbaliser la coloration de MGG

avec de l’eau a pH neutre. Parfois, le frottis peut 6tre souill6 par de nombreux artefacts comme des dBp6ts de colorants. Si I’on ne dis-

pose pas d’autre pr&vement, apt& dbgraissage, la lame peut &re d6color6e par immersion dans de I’Bthanol absolu et soigneusement

recoloree par la coloration de MGG sans dommage majeur.

25

Pathologies d’importation

On distingue f&s souvent un halo c/air autour de /a plaquette.

Petites et nombreuses, co/odes en bleu au MGG, e/lea correspondent ii une agglu- tinatron de ribosomes dans /es r&ficufocytes,

&fit corps sph&ique d’envkon 7 pm de d&m&e, souvent semi ou par dew co/of6 en vi&t lonct! au IWGG. /I skgif de d&b& provenant de chromosomes s&pa& du fuseau mitotique au cows d’une mitose anormale.

Minces /ignes de couleur rouge.~iolac~ au MGG, disposks en anneau ou parfois 8 B /a p&iph&ie ou au centre de /%matie. N s’agif de fibres fusorraies anormalema oersfstantes.

Wits granules co/or& en b/w ou @o/et ion& par le FAGG, en nombre de frois B di fans ik+mafie. If s ‘agif d’amas d’orga-ganifes cytop~asmiques associ& B des particuie. errugineuses.

26 Revue Frarqaise des Laboratoires, marsiavril 2000, N” 321

Pat~olog;es d’;mporfat;on

Apt-es sechage prolonge de 12 & 24 heures, la goutte epaisse peut etre traitee. Elle est recouverte d’eau distillee tampon&e pendant 15

a 20 min, puis coloree 20 min par le colorant de Giemsa dilue extem-

poranement (3 gouttes / ml).

2.3. La lecture et l’identification des parasites

Pour une observation correcte, la lecture du frottis doit etre faite avec un grandissement final de 500 a 800 1301. Cette &solution est obte- nue par ie couple qs objectif a immersion 50 ou 63 et oculaire 10 ou 12 *. Etle permet de bien reperer trophozoTtes et gam&ocytes sans

majorer les aberrations chromatiques. Un grandissement plus impor- tant est cependant necessaire pour I’analyse des details morpholo- giques. En cas de negativite du frottis, la lecture doit etre reprise par plusieurs observateurs et prolongbe au moins 20 min dans une zone

oti les hematies sont etalees en une couche monocellulaire.

De nombreux ouvrages et publications presentent la description des parasites observes sur le frottis sanguin [l, 7, 10, 361, ils sont large-

ment completes par les presentations regulierement faites darts les Annales du controle national de quake en parasitologic. Sur le reseau Internet, une iconographie des parasites est ogalement disponible. ~identification du parasite repose sur f’analyse des modifications tinc-

toriales et morphologiqu~s des hematies parasitees, de la morpholo- gie parasitaire et sur I’aspect general du frottis. Le fableau f pr&ente les criteres habitueliement retenus pour i’identification des especes

plasmodiales. Des anomalies morphologiques peuvent toutefois etre observees lors d’une parasitemie importante ou chez les patients pre-

nant des antipaludeens.

Certains artefacts sont importants a reconnaRre et ne doivent pas ega-

rer I’observateur. Ainsi, les plaquettes peuvent parfois Btre confondues

avec un parasite lorsqu’elles se presentent collees ou superposees a une hematie (figures 1 et 2). Les ponctuations basophiles des hema-

ties (figure 3) qui sont le fait de reticulocytes anormalement visibles

au MGG, sont surtout observees lors d’anemies d’origine toxique

(saturnisme,...) mais aussi parfois chez le nouveau-r& dans les premiers

jours de vie. Les corps de Howell-Jolly (figure 4) et les anneaux de Cabot {figures 5 et 6) correspondent a des anomalies de f’erythro-

poi’ese. lls peuvent etre observes a l’occasion d’un acces palustre comme dans toute situation d’hyperh~molyse, d’anemie severe ou de

dys~rythropo~~se. lls sont Cgalement fr~quemment observes chez les

patients splenectomises ou aspleniques. Les corps de Pappenheimer

(figures 7 et 8) se presentent comme de petits granules bleu ou vio- let fence a la coloration de Giemsa, en nombre de trois a dix. Ils cor-

respondent a des amas d’organites intracytoplasmiques associes a

de la ferritine et sont surtout observes dans les anemies sideroblas- tiques et chez les sujets splenectomises.

Tous ces elements peuvent etre confondus avec un Plasmodium lors

d’une lecture trop superficielle du frottis sanguin. Aussi, l’observateur

s’attachera a une analyse stricte de I’image obset-vee. Les trophozo’ites

des Pfasmodium sont intra-cellulaires, ils presentent un materiel nucleaire colore en pourpre par le MGG et un cytoplasme ptus ou

moins developpe, de coloration basophile et parfois vacuole.

2.4. L’itvaluation de la parasitkmie

La parasitemie peut etre &al&e a partir du frottis sanguin en notant

le pourcentage d’hematies parasitees observees sur plusieurs

champs consecutifs. Une valeur de 5 O/o des hematies parasitees est

classiquement admise comme critere mineur de gravite mais cet indi-

cateur pris isolement a peu de valeur pronostique. II doit etre confronte

de i’hbnatie

Trophozoile 6gi

Schizonte mature

Aspect g&n&at du frottis

hematie de taille normale normochrome

taches de Maurer notamment en presence d’un trophozdite 1ge

petit et delicat (2-3 urn)* presente souvent deux taches de chromatine en halt&e polyparasitisme frequent, formes marginees accoiees au bord interne de I’hi?matie

taille moyenne en general compact pigment granulaire parfois present

de grande taille, en general amoebo’ide pigment sous forme de batonnets fins

rare dans Ie sang peripherique 6 a 26 petits merozdites et une masse pigmentaire centrale

de grande taille, remplissant I’hematie 12 a 24 grands merozo’ites, pigment en amas, corps en rosace

en forme de croissant, spherique, compact a noyau a noyau unique unique et au pigment grossier

monotone, il n’y a souvent sue des troohozoTtes

hematie de grand@ taiile acidophile

granulations de Schiiffner

assez gros (4-5 urn), avec une ou deux taches de chromatine epaisse parfois deux anneaux par hematie

hematie de taifle ldgerement augmentee, souvent de forme ovale et frangee normochrome granulations de Schiiffner

hematie de taille normale ou diminuee normochrome

aucune granulation, parfois fin pointille de Ziemann

de taille moyenne de petite taifle avec pigment grossier, precoce

poiyparasit~sme frequent

de taille moyenne, non amoeboide pigment grossier

de petite tailie, souvent ailonge en bande equatoriale pigment grossier

plus petit que ceux de F? t&ax petit, prenant un aspect en *marguerite*

6 a 12 merozoites, pigment dense et ion&

6 a 12 grands merozoites, pigment grossier

spherique mais de petite taille, spherique, de petite taille, compact B noyau unique et compact a noyau unique au pigment grossier

panache, tres polymorphe avec differents stades morphologiques p&en%

Revue Framyse des Laboratoires, marslavril 2000, No 321 27

Pathologies d’importation

RCactif : solution d’h6molyse filtrbe

- O-,4 g de saponine - 1,5 ml de formol commercial - 0,l g de thimerosal - 0,l ml de Tween 20 A diluer dans 100 ml d’eau physiologique

Technique

Ajouter 1 ml de la solution d’h6molyse g 500 pl de sang total, le sang est laqub en moins d’une minute

Placer 300 pl de sang laque dans chaque puits de la chambre de cyto- centrifugation, ce volume peut etre r&ajust& selon la numeration leu- cocytaire du patient. Cytocentrifuger immbdiatement pendant 12 min & 447 g avec une forte

acc&ration. Fixer au methanol puis colorer 30 min avec le colorant de Giemsa.

?I I’Btat clinique et au statut immun ou non du patient vis-&is du

Plasmodium. La technique de numeration la plus fiable est r&ali&e par

le comptage des trophozdites sur la goutte Bpaisse et rapportee B 200

voire 400 leucocytes. Une simple r&gle de trois permet d’obtenir la parasitemie exacte. En I’absence de numeration globulaire, le nombre

de leucocytes par pl est fix& & 8 000 [l].

3. Les autres techniques

3.1. Le Quantitative Buffy CoatTM Malaria test (QBCF Malaria test - Becton Dickinson)

Cette technique est une adaptation de la technique QBC’” mise au point pour la lecture automatis&e des formules sanguines. Elle a BtB

proposee en 1989 pour la concentration des parasites sanguicoles [23, 341. Son principe repose d’une part sur la repartition diff&en-

tielle des Bl&ments figures du sang lors d’une centrifugation en tube capillaire et la position des hematies parasitees sous la couche leu-

cocytaire et d’autre part sur la propri& que pr&+ente I’acridine

orange de s’intercaler entre les acides nucleiques et d’bmettre une lumi&e fluorescente lors de l’examen en microscopic de fluorescence

(h= 640 nm). Un flotteur cylindrique permet la distribution des h&ma- ties parasitbes en une couche monocellulaire le long de la paroi d’un

tube capillaire. Sa sensibilite est de 95 O/o ti 97 % par rapport au frot- tis sanguin [13, 161. Cidentification de I’esp8ce plasmodiale en cause

n’est pas possible, mais I’avantage majeur de cette technique est de permettre le traitement rapide d’un grand nombre d’8chantillons.

Toutefois, sa mise en ceuvre nbcessite I’utilisation d’un materiel sp&

cifique [21, 311.

La coloration directe du frottis avec de I’acridine orange a BtB r&em-

ment &al&e [14, 241. La technique est rapide, sa sensibilitb est

supbrieure & celle du frottis sanguin, la goutte epaisse restant la tech-

nique de rbf&ence, mais les auteurs insistent sur la sp&ificit&

moindre et I’impossibilit6 de pouvoir porter un diagnostic d’espkce avec cette technique.

3.2. Recherche de I’antigene PMRP2

Cantigene PHRPP correspond Z!I une prot&ne soluble riche en

histidine remarquablement bien conservbe specifique des stades

non sex&s et pr&gam8tocytaires de /? falciparum [4, 291.

Actuellement deux tests permettant sa recherche par immuno- chromatographie sont disponibles en France : le ParaSightTM-F (Becton Dickinson) et I’ICT” Malaria Pf (lmmuno Chromatographic

Test Diagnostics, Sydney, Australie, distribue en France par le labo- ratoire Fumouze).

Les deux trousses sont p&es B I’emploi. Les nombreux travaux les

comparant entre elles, au frottis sanguin et g la goutte Bpaisse sont concordants. Ils montrent une grande facilite de mise en ceuvre et une bonne sensibilitb dans la detection de I’antigbne PfHRPP.

Celle-ci est &al&e & 96 Q/o lorsque la parasitbmie est supbrieure g 100 parasites par pl et B 74,6 O/o pour une parasitemie inferieure

& 10 parasites 11.11 137, 161. Cependant, I’antig&&mie peut &re detectable dans les 10 g 15 jours suivant le traitement sans

pour autant etre le tbmoin d’un Bchec thbrapeutique [l 1, 20, 261. Certains auteurs ont signal& de rares faux negatifs avec ces tests et Bmettent I’hypoth.+se de I’existence d’isolats de

I? falciparum dbfectifs en production d’antigkne PfHRP2 [15]. De m&me, des faux positifs ont et6 rapport& avec la pr&sence du facteur rhumatoi’de [31.

4. Les modifications de la numeration formule sanguine et de la numeration plaquettaire

La diminution des plaquettes sous la valeur de 150 Giga/l est un signe biologique frkquent au tours du paludisme, quelle que soit I’es- p&e en cause. Elle est rapportee dans de nombreuses etudes Bpi- demiologiques concernant le paludisme d’importation [5, 161. Une Btude franGaise montre clairement que son association avec I’ab-

sence de leucocytose (leucocytes < 10 000 IpI) est frequente au tours du paludisme. Pour une prevalence du paludisme de 10 O/o,

on note, pour cette association, une valeur predictive positive (VPP) de 52 % et une valeur predictive negative (VPN) de 97 O/o ; pour une prevalence du paludisme de 50 %, la VPP atteint 91 % alors que la VPN chute ti 79 % [6].

5. Les perspectives

5.1. La lactate deshydrogknase parasitaire

Chaque espece plasmodiale possbde une isoenzyme d’une lactate

deshydrogenase parasitaire specifique caracteristique des stades viables 1251. La mise au point d’anticorps monoclonaux spbcifiques de chaque isoenzyme a permis le d&eloppement de tests diag- nostiques permettant une discrimination entre les diffbrentes espbces plasmodiales par une technique immunochromatographique

[19, 28, 331. Ces trousses diagnostiques (Flow Inc., Portland, OR, USA) ne sont pas disponibles en France.

5.2. Les techniques de biologie mol&xlaire

A I’instar des autres pathologies infectieuses, les techniques de bio- logie moleculaire ont et6 appliquees au diagnostic du paludisme [2]. Lors du paludisme expkrimental, la polymerase chain reaction (PCR)

permet d’atteindre un seuil de detection de 1 a 4 parasites pour 50 pl de sang [18]. Cependant, leur rbalisation reste longue et incompatible avec un diagnostic d’urgence. Toutefois, ces tech- niques m&itent d’etre &al&es pour la prevention du paludisme transfusionnel en zone d’endkmie [181.

28 Revue Franqaise des Laboratwes, marslavril 2000, No 321

6. Conclusion

D epuis la decouverte des P/asmodium, le diagnostic du paludisme

en urgence repose toujours sur la lecture prolongbe d’un frottis

sanguin. Les nouvelles techniques diagnostiques sont interessantes

par leur facilite d’ex8cution et leur rapidit& mais ne peuvent &re uti-

Ii&es seules. La mise en route d’une therapeutique adaptbe &ant une

urgence, le diagnostic biologique ne doit pas etre diff&e. Selon les

recommandations du jury de la conference de consensus sur la prise

en charge et la prevention du paludisme d’importation a Plasmodium

falciparum, le resultat du frottis sanguin doit &re transmis au pres-

cripteur dans un delai de deux heures. II est Bgalement important

que le prescripteur dispose rapidement du &sultat de la numera-

tion plaquettaire.

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