Le paludisme d'importation : diagnostic au laboratoire

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    03-Jul-2016

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<ul><li><p>LE PALUDISME DIMPORTATION : DIAGNOSTIC AU LABORATOIRE </p><p>Ludovic de Gentile +*, Franck Genevi&amp;eb </p><p>R&amp;urn6 </p><p>En France mCtropolitaine, le paludisme dimportation est respon- </p><p>sable dune vingtaine de d&amp;z&amp;s chaque ant-&amp;e. D&amp;s le diagnostic de </p><p>paludisme &amp;oquit, aucun retard ne doit 6tre pris et le laboratoire </p><p>danalyses medicales joue un rBle central dans le diagnostic de </p><p>certitude. Le QBCW Malaria test utilisant Iacridine orange permet </p><p>un diagnostic rapide du paludisme mais sa mise en ceuvre n&amp;es- </p><p>site un materiel spbcifique, et son utilisation reste actuellement </p><p>limitbe aux structures traitant un grand nombre de recherche de </p><p>Plasmodium. Les techniques immunochromatographiques r&amp;em- </p><p>ment d6veloppees peuvent 6tre consid&amp;es comme un appoint </p><p>interessant &amp; la d6marche diagnostique mais ne peuvent en aucun </p><p>cas se substituer au frottis sanguin. Celui-ci reste en effet la Pierre </p><p>angulaire du diagnostic du paludisme en urgence. </p><p>Paludisme - test diagnostiques - frottis sanguin - PfHRP2. </p><p>Summary </p><p>In France, imported malaria killed nearly twenty persons per year. When malaria is suspected, no delay is admitted and laboratories </p><p>take a central place for the diagnosis in emergency. </p><p>lmmunochromatographic tests recently developped for the qualita- </p><p>tive detection of Plasmodium falciparum specific antigen </p><p>(PfHRP2) may be interesting for diagnosis but they cant take the </p><p>place of thin blood film. This one is always the stone corn of emer- </p><p>gency malaria diagnosis. </p><p>Malaria - diagnostic tests - thin blood film - PAIRP2. </p><p>1. Introduction </p><p>A vet environ 5000 cas par an, le paludisme dimportation B Plasmodium falciparum reprksente une affection rare en France </p><p>m&amp;ropolitaine. Cependant, cette maladie largement curable est &amp; lori- gine dune vingtaine de d&amp;r% chaque annbe [22]. Sous Idgide de la </p><p>SocW de pathologie infectieuse de langue franqaise (SPILF), sest tenue en avril 1999 une conference de consensus sur la prise en charge et la pr&amp;ention du paludisme dimportation B Plasmodium fal- </p><p>a Laboratoire de parasitologie-mycologic b Laboratoire dh6matologie Centre hospitalier universitaire 4, rue Larrey 49033 Angers cedex 01 </p><p>* Correspondance. </p><p>article re~u le 22 septembre 1999, accept6 le 17 fCvrier 2000. </p><p>0 Elsevier, Paris. </p><p>Revue Franpaise des Labor&amp;&amp;., marslavrll 2000, N 321 </p><p>ciparum. Dans ses conclusions, le jury a rappel6 le r6le central du labo- </p><p>ratoire danalyses medicales dans le diagnostic en urgence et la pr&amp; Bminence du frottis sanguin comme moyen de recherche du parasite </p><p>dans le sang 191. </p><p>2. Le frottis sanguin et la goutte 6paisse </p><p>2.1. La realisation du frottis et de la goutte epaisse </p><p>Le frottis sanguin est de rkalisation simple. Au mieux, il est fait par ponc- </p><p>tion capillaire au bout du doigt apr&amp;s d&amp;infection de la pulpe. A dkfaut, </p><p>le frottis sanguin peut &amp;tre realis B partir dun pr&amp;vement par ponc- tion veineuse sur un tube avec anticoagulant. Le d&amp;p&amp; de la goutte </p><p>de sang se fait $I une extremite de la lame Porte-objet, puis le frottis </p><p>est &amp;al6 et s&amp;h&amp; B Iair. </p><p>Pour realiser une goutte Bpaisse de qualit6, le pr&amp;vement doit etre </p><p>realis par ponction capillaire. En effet, la goutte Bpaisse realisee g </p><p>partir de sang recueilli sur anticoagulant a tendance g se d&amp;coller lors </p><p>des op&amp;ations dh6molyse et de lavage. Apres avoir realis les frot- tis sanguins utiles au diagnostic durgence, Iop6rateur recueille une </p><p>grosse goutte de sang au milieu dune lame Porte-objet puis, rapi- dement, dbfibrine la goutte de sang en la tournant &amp;guli&amp;rement pen- </p><p>dant au moins 1 min &amp; Iaide de la pointe dun vaccinostyle, laissant un aide faire Ih&amp;mostase par pression sur le point de ponction. La </p><p>goutte Bpaisse doit Gtre conservbe &amp; labri de la lumi&amp;e et de la pous- s&amp;e pour btre ensuite traitbe. Un temps de s&amp;hage court peut btre </p><p>&amp; Iorigine dune perte significative des parasites [12, 351. La goutte </p><p>Bpaisse ne permet done pas un diagnostic durgence du paludisme </p><p>mais, quoique de lecture difficile, elle reste Iexamen de reference </p><p>admis par tous dans le cadre du diagnostic du paludisme et doit 6tre </p><p>systematiquement real&amp;e (examen 1125 de la nomenclature des actes de biologie medicale [27]). La lecture de la goutte Bpaisse per- </p><p>met de plus une meilleure approche diagnostique des associations plasmodiales. Cluelques variantes comme le s6chage au four &amp; micro- </p><p>ondes [8] ou Ih8molyse 6 la saponine suivie dune concentration par centrifugation [17, 321 ont BtB proposites pour rbduire le temps de </p><p>realisation de la goutte Bpaisse. </p><p>2.2. La coloration </p><p>Apr&amp; &amp;chage, le frottis est color6 par une coloration panoptique. En France, la coloration de May Grundwald Giemsa (MGG) est la plus </p><p>frbquemment utilisbe ; aux Etats-Unis dAm&amp;ique, la coloration de Field est largement rbpandue. Pour obtenir une coloration permettant de bien </p><p>visualiser les caractbristiques morphologiques des Plasmodium et des h6maties parasitbes, il est important de rbaliser la coloration de MGG </p><p>avec de leau a pH neutre. Parfois, le frottis peut 6tre souill6 par de nombreux artefacts comme des dBp6ts de colorants. Si Ion ne dis- </p><p>pose pas dautre pr&amp;vement, apt&amp; dbgraissage, la lame peut &amp;re d6color6e par immersion dans de IBthanol absolu et soigneusement </p><p>recoloree par la coloration de MGG sans dommage majeur. </p><p>25 </p></li><li><p>Pathologies dimportation </p><p>On distingue f&amp;s souvent un halo c/air autour de /a plaquette. </p><p>Petites et nombreuses, co/odes en bleu au MGG, e/lea correspondent ii une agglu- tinatron de ribosomes dans /es r&amp;ficufocytes, </p><p>&amp;fit corps sph&amp;ique denvkon 7 pm de d&amp;m&amp;e, souvent semi ou par dew co/of6 en vi&amp;t lonct! au IWGG. /I skgif de d&amp;b&amp; provenant de chromosomes s&amp;pa&amp; du fuseau mitotique au cows dune mitose anormale. </p><p>Minces /ignes de couleur rouge.~iolac~ au MGG, disposks en anneau ou parfois 8 B /a p&amp;iph&amp;ie ou au centre de /%matie. N sagif de fibres fusorraies anormalema oersfstantes. </p><p>Wits granules co/or&amp; en b/w ou @o/et ion&amp; par le FAGG, en nombre de frois B di fans ik+mafie. If s agif damas dorga-ganifes cytop~asmiques associ&amp; B des particuie. errugineuses. </p><p>26 Revue Frarqaise des Laboratoires, marsiavril 2000, N 321 </p></li><li><p>Pat~olog;es d;mporfat;on </p><p>Apt-es sechage prolonge de 12 &amp; 24 heures, la goutte epaisse peut etre traitee. Elle est recouverte deau distillee tampon&amp;e pendant 15 </p><p>a 20 min, puis coloree 20 min par le colorant de Giemsa dilue extem- </p><p>poranement (3 gouttes / ml). </p><p>2.3. La lecture et lidentification des parasites </p><p>Pour une observation correcte, la lecture du frottis doit etre faite avec un grandissement final de 500 a 800 1301. Cette &amp;solution est obte- nue par ie couple qs objectif a immersion 50 ou 63 et oculaire 10 ou 12 *. Etle permet de bien reperer trophozoTtes et gam&amp;ocytes sans </p><p>majorer les aberrations chromatiques. Un grandissement plus impor- tant est cependant necessaire pour Ianalyse des details morpholo- giques. En cas de negativite du frottis, la lecture doit etre reprise par plusieurs observateurs et prolongbe au moins 20 min dans une zone </p><p>oti les hematies sont etalees en une couche monocellulaire. </p><p>De nombreux ouvrages et publications presentent la description des parasites observes sur le frottis sanguin [l, 7, 10, 361, ils sont large- </p><p>ment completes par les presentations regulierement faites darts les Annales du controle national de quake en parasitologic. Sur le reseau Internet, une iconographie des parasites est ogalement disponible. ~identification du parasite repose sur fanalyse des modifications tinc- </p><p>toriales et morphologiqu~s des hematies parasitees, de la morpholo- gie parasitaire et sur Iaspect general du frottis. Le fableau f pr&amp;ente les criteres habitueliement retenus pour iidentification des especes </p><p>plasmodiales. Des anomalies morphologiques peuvent toutefois etre observees lors dune parasitemie importante ou chez les patients pre- </p><p>nant des antipaludeens. </p><p>Certains artefacts sont importants a reconnaRre et ne doivent pas ega- </p><p>rer Iobservateur. Ainsi, les plaquettes peuvent parfois Btre confondues </p><p>avec un parasite lorsquelles se presentent collees ou superposees a une hematie (figures 1 et 2). Les ponctuations basophiles des hema- </p><p>ties (figure 3) qui sont le fait de reticulocytes anormalement visibles </p><p>au MGG, sont surtout observees lors danemies dorigine toxique </p><p>(saturnisme,...) mais aussi parfois chez le nouveau-r&amp; dans les premiers </p><p>jours de vie. Les corps de Howell-Jolly (figure 4) et les anneaux de Cabot {figures 5 et 6) correspondent a des anomalies de ferythro- </p><p>poiese. lls peuvent etre observes a loccasion dun acces palustre comme dans toute situation dhyperh~molyse, danemie severe ou de </p><p>dys~rythropo~~se. lls sont Cgalement fr~quemment observes chez les </p><p>patients splenectomises ou aspleniques. Les corps de Pappenheimer </p><p>(figures 7 et 8) se presentent comme de petits granules bleu ou vio- let fence a la coloration de Giemsa, en nombre de trois a dix. Ils cor- </p><p>respondent a des amas dorganites intracytoplasmiques associes a </p><p>de la ferritine et sont surtout observes dans les anemies sideroblas- tiques et chez les sujets splenectomises. </p><p>Tous ces elements peuvent etre confondus avec un Plasmodium lors </p><p>dune lecture trop superficielle du frottis sanguin. Aussi, lobservateur </p><p>sattachera a une analyse stricte de Iimage obset-vee. Les trophozoites </p><p>des Pfasmodium sont intra-cellulaires, ils presentent un materiel nucleaire colore en pourpre par le MGG et un cytoplasme ptus ou </p><p>moins developpe, de coloration basophile et parfois vacuole. </p><p>2.4. Litvaluation de la parasitkmie </p><p>La parasitemie peut etre &amp;al&amp;e a partir du frottis sanguin en notant </p><p>le pourcentage dhematies parasitees observees sur plusieurs </p><p>champs consecutifs. Une valeur de 5 O/o des hematies parasitees est </p><p>classiquement admise comme critere mineur de gravite mais cet indi- </p><p>cateur pris isolement a peu de valeur pronostique. II doit etre confronte </p><p>de ihbnatie </p><p>Trophozoile 6gi </p><p>Schizonte mature </p><p>Aspect g&amp;n&amp;at du frottis </p><p>hematie de taille normale normochrome </p><p>taches de Maurer notamment en presence dun trophozdite 1ge </p><p>petit et delicat (2-3 urn)* presente souvent deux taches de chromatine en halt&amp;e polyparasitisme frequent, formes marginees accoiees au bord interne de Ihi?matie </p><p>taille moyenne en general compact pigment granulaire parfois present </p><p>de grande taille, en general amoeboide pigment sous forme de batonnets fins </p><p>rare dans Ie sang peripherique 6 a 26 petits merozdites et une masse pigmentaire centrale </p><p>de grande taille, remplissant Ihematie 12 a 24 grands merozoites, pigment en amas, corps en rosace </p><p>en forme de croissant, spherique, compact a noyau a noyau unique unique et au pigment grossier </p><p>monotone, il ny a souvent sue des troohozoTtes </p><p>hematie de grand@ taiile acidophile </p><p>granulations de Schiiffner </p><p>assez gros (4-5 urn), avec une ou deux taches de chromatine epaisse parfois deux anneaux par hematie </p><p>hematie de taifle ldgerement augmentee, souvent de forme ovale et frangee normochrome granulations de Schiiffner </p><p>hematie de taille normale ou diminuee normochrome </p><p>aucune granulation, parfois fin pointille de Ziemann </p><p>de taille moyenne de petite taifle avec pigment grossier, precoce </p><p>poiyparasit~sme frequent </p><p>de taille moyenne, non amoeboide pigment grossier </p><p>de petite tailie, souvent ailonge en bande equatoriale pigment grossier </p><p>plus petit que ceux de F? t&amp;ax petit, prenant un aspect en *marguerite* </p><p>6 a 12 merozoites, pigment dense et ion&amp; </p><p>6 a 12 grands merozoites, pigment grossier </p><p>spherique mais de petite taille, spherique, de petite taille, compact B noyau unique et compact a noyau unique au pigment grossier </p><p>panache, tres polymorphe avec differents stades morphologiques p&amp;en% </p><p>Revue Framyse des Laboratoires, marslavril 2000, No 321 27 </p></li><li><p>Pathologies dimportation </p><p>RCactif : solution dh6molyse filtrbe - O-,4 g de saponine - 1,5 ml de formol commercial - 0,l g de thimerosal - 0,l ml de Tween 20 A diluer dans 100 ml deau physiologique </p><p>Technique </p><p>Ajouter 1 ml de la solution dh6molyse g 500 pl de sang total, le sang est laqub en moins dune minute </p><p>Placer 300 pl de sang laque dans chaque puits de la chambre de cyto- centrifugation, ce volume peut etre r&amp;ajust&amp; selon la numeration leu- cocytaire du patient. Cytocentrifuger immbdiatement pendant 12 min &amp; 447 g avec une forte </p><p>acc&amp;ration. Fixer au methanol puis colorer 30 min avec le colorant de Giemsa. </p><p>?I IBtat clinique et au statut immun ou non du patient vis-&amp;is du </p><p>Plasmodium. La technique de numeration la plus fiable est r&amp;ali&amp;e par </p><p>le comptage des trophozdites sur la goutte Bpaisse et rapportee B 200 </p><p>voire 400 leucocytes. Une simple r&amp;gle de trois permet dobtenir la parasitemie exacte. En Iabsence de numeration globulaire, le nombre </p><p>de leucocytes par pl est fix&amp; &amp; 8 000 [l]. </p><p>3. Les autres techniques </p><p>3.1. Le Quantitative Buffy CoatTM Malaria test (QBCF Malaria test - Becton Dickinson) </p><p>Cette technique est une adaptation de la technique QBC mise au point pour la lecture automatis&amp;e des formules sanguines. Elle a BtB </p><p>proposee en 1989 pour la concentration des parasites sanguicoles [23, 341. Son principe repose dune part sur la repartition diff&amp;en- </p><p>tielle des Bl&amp;ments figures du sang lors dune centrifugation en tube capillaire et la position des hematies parasitees sous la couche leu- </p><p>cocytaire et dautre part sur la propri&amp; que pr&amp;+ente Iacridine </p><p>orange de sintercaler entre les acides nucleiques et dbmettre une lumi&amp;e fluorescente lors de lexamen en microscopic de fluorescence </p><p>(h= 640 nm). Un flotteur cylindrique permet la distribution des h&amp;ma- ties parasitbes en une couche monocellulaire le long de la paroi dun </p><p>tube capillaire. Sa sensibilite est de 95 O/o ti 97 % par rapport au frot- tis sanguin [13, 161. Cidentification de Iesp8ce plasmodiale en cause </p><p>nest pas possible, mais Iavantage majeur de cette technique est de permettre le traitement rapide dun grand nombre d8chantillons. </p><p>Toutefois, sa mise en ceuvre nbcessite Iutilisation dun materiel sp&amp; </p><p>cifique [21, 311. </p><p>La coloration directe du frottis avec de Iacridine orange a BtB r&amp;em- </p><p>ment &amp;al&amp;e [14, 241. La technique est rapide, sa sensibilitb est </p><p>supbrieure &amp; celle du frottis sanguin, la goutte epaisse restant la tech- </p><p>nique de rbf&amp;ence, mais les auteurs insistent sur la sp&amp;ificit&amp; </p><p>moindre et Iimpossibilit6 de pouvoir porter un diagnostic despkce avec cette technique. </p><p>3.2. Recherche de Iantigene PMRP2 </p><p>Cantigene PHRPP correspond Z!I une prot&amp;ne soluble riche en histidine remarquablement bien conservbe specifique des stades </p><p>non sex&amp;s et pr&amp;gam8tocytaires de /? falciparum [4, 291. </p><p>Actuellement deux tests permettant sa recherche par immuno- chromatographie sont disponibles en France : le ParaSightTM-F (Becton Dickinson) et IICT Malaria Pf (lmmuno Chromatographic </p><p>Test Diagnostics, Sydney, Australie, distribue en France par le labo- ratoire Fumouze). </p><p>Les deux trousses sont p&amp;es B Iemploi. Les nombreux travaux les </p><p>comparant entre elles, au frottis sanguin et g la goutte Bpaisse sont concordants. Ils montrent une grande facilite de mise en ceuvre et une bonne sensibilitb dans la detection de Iantigbne PfHRPP. </p><p>Cell...</p></li></ul>