1

Page 1

1

1

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ

ΤΡΟΦΙΜΩΝΤΡΟΦΙΜΩΝ

Πέτρος Σ. Ταούκης

Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο, Σχολή Χηµικών ΜηχανικώνΕργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων

2

2Μικροβιολογία Τροφίµων

Τα τρόφιµα, λόγω της υψηλής περιεκτικότητάςτους σε θρεπτικά συστατικά και της ευκολίαςµολύνσεως και ρυπάνσεώς τους, είναι πάντοτεφορείς µικροοργανισµών.Τα µικρόβια αυτά συµµετέχουν στις φυσικοχηµικέςκαι βιολογικές µεταβολές που συµβαίνουν στατρόφιµα. Αυτό αποτελεί και το αντικείµενο τηςεπιστήµης της µικροβιολογίας των τροφίµων.

2

Page 2

3

3

Ο όρος "µικρόβιο" ή "µικροοργανισµός" είναιόρος της τεχνολογίας και αφορά ένα σύνολο εµβίωνόντων από διάφορες ταξινοµικές οµάδες µεορισµένα κοινά χαρακτηριστικά.

Οι µικροοργανισµοί είναι αόρατοι µε γυµνό οφθαλµό, µε µικροσκοπικές διαστάσεις µεγαλύτερες από τηδιακριτική ικανότητα του µικροσκοπίου (0.16 µ).

Γενικά, πρόκειται για µονοκύτταρους οργανισµούς ήκοινοκυτταρικούς χωρίς εγκάρσια τοιχώµατα ή καιπολυκυτταρικούς χωρίς όµως διαφοροποίηση τωνκυττάρων για σχηµατισµό οργάνων ή ιστών.

4

4

Ανάλογα µε την πηγή άνθρακα, αζώτου και ενέργειας, τα µικρόβιαδιαιρούνται σε τέσσερις οµάδες:

α)τα φωτοαυτότροφα, χρησιµοποιούν ως πηγή ενέργειας την ηλιακήακτινοβολία και ως πηγή άνθρακα το CO2,

β)τα φωτοετερότροφα, χρησιµοποιούν ως πηγή ενέργειας την ηλιακήακτινοβολία και ως πηγή άνθρακα οργανικές ενώσεις,

γ) τα χηµειοαυτότροφα, χρησιµοποιούν το CO2 ως µοναδική πηγήάνθρακα και αντλούν ενέργεια από τις οξειδοαναγωγικές αντιδράσειςοργανικών ουσιών, και

δ)τα χηµειοετερότροφα, χρησιµοποιούν ως πηγήάνθρακα οργανικές ουσίες και αντλούν ενέργεια απόοξειδοαναγωγικές αντιδράσεις οργανικών ουσιών.

3

Page 3

5

5

Tα χηµειοετερότροφα, που ενδιαφέρουν κυρίως τη µικροβιολογία τροφίµωνκαι διαιρούνται σε τρεις κατηγορίες ανάλογα µε τη σχέση τους προς τουπόστρωµα ή τον ξενιστή πάνω στον οποίο αναπτύσσονται:

α) παθογόνα µικρόβια, τα οποία αναπτύσσονται πάνω σε ζωντανούςοργανισµούς και δηµιουργούν µε την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασµό τουςπαθολογικές καταστάσεις. Στην περίπτωσή µας ενδιαφέρον παρουσιάζουν µόνοόσα µικρόβια µεταφέρονται µε τα τρόφιµα και το πόσιµο νερό, φθάνουν ως τονάνθρωπο και τα ανώτερα ζώα, τον µολύνουν και δηµιουργούν παθολογικέςκαταστάσεις.

β) παράσιτα µικρόβια, που αναπτύσσονται πάνω σε ζωντανούς οργανισµούς χωρίςνα δηµιουργούν νοσηρές ή παθολογικές καταστάσεις, τουλάχιστον υπό οµαλέςσυνθήκες. Αν όµως µειωθεί η αντοχή του οργανισµού (π.χ. λοιµώξεις), τότεεξελίσσονται σε ισχυρά παθογόνα.

γ) σαπρόφυτα µικρόβια, που αναπτύσσονται πάνω σε νεκρήοργανική ουσία (όπως είναι πολλά τρόφιµα) και όχι πάνω σε ζωντανούςοργανισµούς. Αναπτυσσόµενα όµως πάνω στα τρόφιµα προξενούν αλλοιώσεις, οπότε είναι ανεπιθύµητα, ή διασπάσεις προς ενδιάµεσα προϊόντα που είναιπολύτιµα για τον άνθρωπο, οπότε είναι ωφέλιµα.

6

6

Στο ταξινοµικό σύστηµα των µικροβίων αναγνωρίζονται οι ακόλουθες ταξινοµικέςκατηγορίες:

τάξη, γένος (genus), είδος (species), στέλεχος (strain).Το είδος παρουσιάζει µια υψηλή βαθµίδα φαινοτυπικής οµοιότητας καισηµαντικής ανοµοιότητας ως προς άλλα αθροίσµατα συγγενών πληθυσµών. Ταδιάφορα στελέχη έχουν µεγάλη σηµασία για την Μικροβιολογία Τροφίµων.

Γένος και είδος συµβολίζονται µε µια διώνυµη λατινική ονοµασία (σε πλάγιαγραφή). Για παράδειγµα στο Saccharomyces cerevisiae, ο όροςSaccharomyces αντιπροσωπεύει το γένος, ο όρος cerevisiae το είδος, ενώχρησιµοποιούνται περισσότερα από 1000 διαφορετικά στελέχη της ζύµης S. cerevisiae ως µαγιές ψωµιού, κρασιού ή µπύρας.

4

Page 4

7

7

Μια κατηγοριοποίηση των µικροοργανισµών, η οποία είναιπρακτική για τα τρόφιµα, είναι :

Α. ΒακτήριαΒ. ΖυµοµύκητεςΓ. Ευρωτοµύκητες

Οι µικροοργανισµοί των τροφίµων µπορεί να είναιείτε ανεπιθύµητοι (παθογόνοι ή αλλοιoγόνοι), είτε χρήσιµοι (ζυµώσεις, ωρίµανση).

8

8

Α. Βακτήρια

Πρόκειται για µικροσκοπικούςµονοκύτταρους οργανισµούς, πουπολλαπλασιάζονται µε διαίρεση.

Είναι ετερότροφοι, αγενείς, χωρίς διάκριτοκυτταρικό πυρήνα, χωρίς χλωροφύλληκαι µε σφαιρικό (κοκκώδες), ραβδόµορφο ή σπειροειδές σχήµα.

5

Page 5

9

9

Τα βακτήρια παρουσιάζουν διάφορες µορφές και µεγέθη

Κόκκοι

Ραβδία/Βάκιλλοι

Σπείρεςrigid

Σπειροχέτεςflexible

Streptococcus

Bacillus

Μορφή

Σπείρα

10

10

6

Page 6

11

11

Τα βακτήρια παρουσιάζουν διάφορες µορφές και µεγέθη

Κόκκοι

Ραβδία/Βάκιλλοι

Σπείρεςrigid

Σπειροχέτεςflexible

Μέγεθος

από 0.5-1.0 έως 2.0-5.0 µ

από 0.5-1.0 έως 2.0-3.0 µ

από 0.4-1.5 έως 200 µ

12

12

Τα βακτήρια παρουσιάζουν διάφορες µορφές και µεγέθη

•∆ιπλόκοκκοι

•Στρεπτόκοκκοι

•Τετράκοκκοι

•Σταφυλόκοκκοι

•Σαρκίνες

Κατηγορίες κόκκων βάσει χωροταξίας διαίρεσης

7

Page 7

13

13

14

14

∆οµή Προκαρυωτικού Κυττάρου

•Έλυτρο•Κυτταρικό τοίχωµα•Πρωτοπλασµατική Μεµβράνη•Κυτταρόπλασµα•Ριβοσώµατα•Πυρήνας•Ινίδια•Μαστίγια•Έγκλειστα•Μεσοσώµατα

8

Page 8

15

15

Τα βακτήρια, ανάλογα µετη χρώση τους κατά Gram, διακρίνονται σε θετικά (+) αν η τελική χρώση τους είναικυανοϊώδης και σε αρνητικά (-) αν είναι κόκκινη. Ηχρώση κατά Gram είναι µια διαδικασία προσθήκηςδιαλυµάτων Α (κρυσταλλοϊώδες σε οινόπνευµα) και Β(Lugol: υδατικό διάλυµα I2 και ΚΙ) και τέλος φουξίνης.

Η χρώση κατά Gram εξαρτάται από τη σύσταση και τηστρωµάτωση του βακτηριακού τοιχώµατος και είναιθεµελιακή ιδιότητα που συνδέεται µε διαφορετικήσυµπεριφορά όσον αφορά την παθογένεια, τηναντοχή στα αντιβιοτικά και άλλους παράγοντες.

16

16

9

Page 9

17

17

Ταξινόµηση των βακτηρίων, κατά Bergey (1984) σε 17 οµάδες. Εµπειρικήταξινόµηση µε βάση τη µορφολογία, τη χρώση κατά Gram, τηνπαθογένεια, το άθροισµα αζωτούχων βάσεων στο DNA, κ.λ.π.

Από το σύνολο των βακτηρίων µόνο ορισµένα είδη αφορούν τη βιοµηχανίατροφίµων. Αυτά ανήκουν στις οµάδες 2, 4, 5, 12, 13, 14 και 15.

Βάσει της δράσης τους µπορούν πρακτικά να κατηγοριοποιηθούν σε:ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΑΘΟΓΟΝΟΥ ΜΟΛΥΝΣΕΩΣ : εκδήλωσηπαθογένειας δια προσβολής του δέκτη ή µέσω τοξίνηςΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΑΛΛΟΙΩΣΕΩΝ : ανεπιθύµητες αλλαγέςοργανοληπτικών χαρακτηριστικών, µη παθογόνες, ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΩΦΕΛΙΜΙΣΤΙΚΗΣ ΧΡΗΣΗΣ : για τηνπαραγωγή χρήσιµων για τον άνθρωπο προϊόντων του µεταβολισµούτους όπως γαλακτικό οξύ (σε τρόφιµα όπως γιαούρτια, τυριά, βουτυρόγαλα, ελιές, τουρσιά, πίκλες, σαλάµι αέρος), προπιονικό οξύ ( σετυριά ελβετικού τύπου Emmenthaler), οξεικό οξύ (παραγωγή ξυδιού) κτλ

18

18

Mycobacteria (Μυκοβακτήρια).Οικογένεια: Mycobacteriaceae.

ΟΜΑ∆Α 16.

Ακανόνιστα, ασποριογόνα, θετικά κατά Gram ραβδία (Irregular, Nonsporing, Gram-Positive Rods).Γένη: Corynebacterium, Actinomyces, Bifidobacterium κ.λ.π.

ΟΜΑ∆Α 15.

Κανονικά ασποριογόνα, θετικά κατά Gram ραβδία (Regular, Non-sporing, Gram - positive Rods).Γένη: Lactobacillus, Listeria, Brochothrix κ.λ.π.

ΟΜΑ∆Α 14.

Σποριογόνα θετικά κατά Gram ραβδία και κόκκοι (Endospore - forming Gram positive Rods and Cocci).Γένη: Bacillus, Clostridium, Sporosarcina κ.λ.π.

ΟΜΑ∆Α 13.

Κόκκοι θετικοί κατά Gram (Gram - positive Cocci). Οικογένεια: Micrococcaceae.Γένη: Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus Sarcina κ.λ.π.

ΟΜΑ∆Α 12.Ενδοσυµβιωτές (Endosymbionts).ΟΜΑ∆Α 11.

Μυκοπλάσµατα (Mycoplasmas).ΟΜΑ∆Α 10.

Ρικέττσιες και Χλαµύδια (Rickettsias and Chlamydias).ΟΜΑ∆Α 9.

Αναερόβιοι αρνητικοί κατα Gram κόκκοι (Anaerobic Gram - negative Cocci).ΟΜΑ∆Α 8.

Αποικοδοµούντατα θειικά και ανάγοντα το θείο βακτήρια (Dissimilatory Sulfate - or - Sulfur - Reducing Bacteria).Γένη: Desulfovibrio, Desulfomonas κ.λ.π

ΟΜΑ∆Α 7.

Αναερόβια, αρνητικά κατά Gram, ευθέα, καµπύλα ή ελικοειδή ραβδίαΟΜΑ∆Α 6.

Προαιρετικώς αναερόβια αρνητικά κατά Gram ραβδία (Facultatively Anaerobic Gram - Negative Rods).Οικογένειες: Enterobacteriaceae, Vibrionaceae κ.λ.π.Γένη: Zymomonas, Streptobacillus κ.λ.π.

ΟΜΑ∆Α 5.

Αρνητικά κατά Gram, αερόβια ραβδία και κόκκοι (Gram Negative Aerobic Rods and Cocci).Οικογένειες: Pseudomonadacae, Halobacteriaceae, Acetobacteriaceae, κ.λ.π.Γένη: Alcaligenes, Brucella κ.λ.π.

ΟΜΑ∆Α 4.

Μη κινούµενα (ή σπανίως κινούµενα), αρνητικά κατά Gram, καµπύλα βακτήρια (Νonmotile or Rarely Motile, Gram Negative Curved Bcteria).ΟΜΑ∆Α 3.

Αερόβια / Μικροαερόφιλα, Κινούµενα, Ελικοειδή / Βιµπριοειδή.Αρνητικά κατά Gram βακτήρια (Aerobic / Microaerophilic, Motile, Helical / Vibrioid Gram - Negative Bacteria).Γένη: Spirillum, Campylobacter κ.λ.π.

ΟΜΑ∆Α 2.

Οι Σπειροχαίτες (Spirochetes)Γένη: Spirocaeta, Treponema, Borrelia κ.λ.π.

ΟΜΑ∆Α 1.

10

Page 10

19

19

Τα βακτήρια είναι η κυριότερη πηγή µολύνσεως καιαλλοίωσης των τροφίµων. Η συγκριτική “υπεροχή”τους αυτή έναντι των άλλων µικροβίων οφείλεται:Στη µεγάλη παραλλακτικότητα των διαφόρων ειδώντους ως προς τις απαιτήσεις σε pH, θρεπτικάσυστατικά, θερµοκρασία, ERH.Στη δυνατότητα σχηµατισµού ενδοσπορίωνΣτη δυνατότητα αναερόβιας ανάπτυξηςΣτην έκκριση τοξινών

20

20

ΠΑΘΟΓΟΝΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑΜια συστηµατοποιηµένη βάση δεδοµένων µε τα στοιχεία των κυριοτέρωνπαθογόνων βακτηρίων περιλαµβανουν:την προέλευση τουςτα τροφίµων που συναντώνταιτην επικινδυνότητα τουςτη παθογόνο δόσηπεριόδο επώασης και συµπτώµατατη µορφολογία καιτις συνθήκες ανάπτυξης

Τα στοιχεία αυτά διευκολύνουν την εκτίµηση της επικινδυνότητας και τονορισµό κρισίµων ορίων και προληπτικών µέτρων, κατά την ανάπτυξηενός σχεδίου διασφάλισης ασφάλειας (ΗACCP) διεργασίαςσυγκεκριµµένου τροφίµου.

11

Page 11

21

21ΠΙΝΑΚΑΣ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ

65 (µη πρωτεολυτικός τύπος Ε)10 (πρωτεολυτικοί τύποι Α,Β, ...)

5-8108Μέγιστο % NaCl γιαανάπτυξη

0.950.97 (µη πρωτεολυτικός τύπος Ε)0.94 (πρωτεολυτικοί τύποι Α,Β,..)

0.950.920.95Ελάχιστο aw γιαανάπτυξη

8.36-7.55.0

96.5-7.05.0 (µη πρωτεολυτικός τύπος Ε)4.6 (πρωτεολυτικοί τύποι Α,Β, ...)

97.0-8.04.6

97-7.54.4 στους 30° C(pH 5.0 στους 4°C)

Μέγιστη 9.0Βέλτιστη 6.5-7.5Ελάχιστη 4(HCl/κιτρικό)

4.4( γαλακτικό)5.4(οξεικό)

Περιοχή τιµών pH

5043-4512

4830-373.3 (µη πρωτεολυτικός τύπος Ε)10.0(πρωτεολυτικοί τύποι Α,Β...)

4432-340-1

4525-300

Μέγιστη 45-47Βέλτιστη 37Ελάχιστη 5.1

Θερµοκρασίεςανάπτυξης ( °C)

Αναερόβιο (µπορεί να αναπτυχθείπαρουσία Ο2 στη λογαριθµική φάση)

ΑναερόβιοΠροαιρετικά αναερόβιοΑερόβιο ή µικροαερόφιλοΠροαιρετικά αναερόβιοΑπαιτήσεις σε Ο2

Gram(+) σπορογόνα ραβδία, 0.9-1.3x3.0-9.0 µ

Gram(+) σπορογόνα ραβδία, 0.5-2.4x1.7-22.0 µ

Gram(-) κοντά ραβδία, 0.5-0.1x1.0-2.0 µ

Gram(+) κοντά ραβδία, 0.4-0.5x0.5-2.0 µ

Gram(-) κοντά ραβδία µεπεριµετρικές βλεφαρίδες, 0.5-0.7x1.0-3.0 µ

Μορφολογία

∆ιάρροια, ναυτία, αέριαΣκοτοδίνη, διαταραχές όρασης, αδυναµία κατάποσης → παράλυσηκαι θάνατος

∆ιάρροια, πυρετός, έµετοι, οξύς πόνος στο δεξί χαµηλόµέρος της κοιλίας.

Από γρίππης έως µηνιγγίτιδας.Προκαλεί αποβολές.

Ναυτία, εµετοί, κοιλιακοίπόνοι, πονοκέφαλοι, ρίγη,πυρετός. ∆ιάρκεια: 2-3 µέρες.

Συµπτώµατα

8-24 ώρες<18-96 ώρες1-10 µέρες8 µέρες - 3 µήνες12 - 72 hrΠερίοδος επώασης

Υψηλή 106 - 109 /g τροφίµου (8-10 mgτοξίνης)

πολύ χαµηλή 0.2 µg τοξίνηςΑγνωστη - πιθανόν υψηλή (> 106)

Σχετικά υψηλή- χαµηλότερηγια άτοµα µε επιβαρυµένοανοσοποιητικό σύστηµα

Χαµηλή: 5-24/ml γάλα, 4/kg γάλα σκόνη, 1-5/100gτυρί

Παθογόνος δόση

Συνήθης αίτιος τροφικής παθογένειας.Θερµοάντοχα σπόρια.Παράγει τοξίνη αφού εισέλθει στο έντεροδιά του µολυσµένου τροφίµου

Σπόρια πολύ ανθεκτικά σεθέρµανση - ξήρανση και χηµικούςπαράγοντες. Τοξίνη ευαίσθητη στηθέρµανση αλλά πολύ θανατηφόρος.

Αυξανόµενος αριθµόςκρουσµάτων.Συµπτώµατα παρεµφερή µεκρίση σκωληκοειδίτιδας.

∆υνατότητα ανάπτυξης σε Τψυγείου. Μικροοργανισµόςευρείας διάδοσης.Θανατηφόρο σε 30% τωνπροσβαλοµένων.

Συνήθης υπεύθυνος τροφικήςπαθογένειας λόγω κακήςυγιεινής ή ανεπαρκούςεπεξεργασίαςΈντονα συµπτώµατα.Σπάνια θανατηφόρο

Σηµαντικότητα

Κιµάς, πουλερικά, χοιρινό, γαλακτοκοµικάπροϊόντα

ανεπαρκώς επεξεργασµένες ήεπιµολυσµένες κονσέρβες

γάλα, παγωτά, λαχανικά, ωµό χοιρινό.

γάλα, µαλακά τυριά, ωµό κρέας, παγωτά, λαχανικά

Γάλα, ωµά πουλερικά, αυγά,ωµό κρέας

Τρόφιµα σχετιζόµενα

Εδαφος, θαλάσσια ιζήµατα, σκόνη, περιττώµατα

Εδαφος, φερτές ύλες γλυκού νερού, βλαστηση (ευρεία διάδοση)

Νερό, χοιρίδια, τρωκτικάΕδαφος, βλάστηση, άνθρωπος, λύµατα, νερό, ζώα (ευρείαδιάδοση)

Πουλερικά, κατοικίδια καιάγρια ζώα, άνθρωπος, έντοµα, πουλιά

Φυσικό περιβάλλον

Clostridiumperfringens

Clostridiumbotulinum

Yersiniaenterolitica

Listeriamonocytogenes

SalmonellaΒακτήριοΙδιότητα

22

22

7.56-81018.2 (για παραγωγή τοξίνης 10%)Μέγιστο % NaCl γιαανάπτυξη

άγνωστη0.950.9120.86 (για παραγωγή τοξίνης 0.9)Ελάχιστο aw για ανάπτυξη

104

9.56-74.4

9.36-7.54.35

Μέγιστη 9.8-10Βέλτιστη 6.0-7.0Ελάχιστη 4.0

Περιοχή τιµών pH

42281-4

453710

493010

Μέγιστη 48Βέλτιστη 37Ελάχιστη 7-11

Θερµοκρασίες ανάπτυξης (°C)

Προαιρετικά αναερόβιοΠροαιρετικά αναερόβιοΠροαιρετικά αναερόβιοΠροαιρετικά αναερόβιοΑπαιτήσεις σε Ο2

Gram(-) ραβδία µεστρογγυλεµένα άκρα0.3-1.0 x1.0-4.4 µ

Gram(-) ραβδία1.1-1.5 x 2-6 µ

Gram(+) σπορογόνα ραβδία1.0-1.2 x 3.0-7.0 µ

Gram(+) σταφυλόκοκκοι διαµέτρου 0.7-0.9 µΜορφολογία

∆ιάρροια, έµετοι, κοιλιακοίπόνοι, πυρετός.Μπορεί να προκαλέσειµηνιγγίτιδα και σηψαιµία.

Αιµορραγική κολίτιδα, αιµορραγική διάρριοια, νεφρικήανεπάρκεια, θάνατος.

Ναυτία, έµετοι, διάρροιαΝαυτία, έµετοι και διάρροια που διαρκούν 1-2 µέρες

Συµπτώµατα

Αγνωστη3-9 µέρες∆ιαρροϊκή τοξίνη 6-15 ώρεςΕµετική τοξίνη 1/2 - 6 ώρες

2-6 ώρεςΠερίοδος επώασης

ΑγνωστηΑγνωστη103 - 1061 mg τοξίνης (για παραγωγή τοξίνηςαπαιτούνται 106 /g κύτταρα)

Παθογόνος δόση

Ασθενείς µε επιβαρυένοανοσοποιητικό σε κίνδυνο.∆υνατότητα ανάπτυξης σε Τψυγείου παράγει δύο τύπουςτοξίνης.

εντεροαιµορραγικόέντονα συµπτώµατα - πιθανόνθανατηφόρα.

Θερµοάντοχα σπόρια.∆υνατότητα µόλυνσης µεπαραγωγή τοξίνης ή µεπολλαπλασιασµό στο έντερο.

Μπορεί εύκολα να περάσει από τουςανθρώπους στο τρόφιµο σε συνθήκες µησωστών χειρισµών. Παράγει θερµοάντοχητοξίνη.

Σηµαντικότητα

Θαλασσινά, κόκκινο κρέας, πουλερικά, γάλα.

Κιµάς, κρέατα, γάλα.Ρύζι, µπαχαρικά, κρέας, γάλα, λαχανικά, ξηροί καρποί.

Ψάρια, κρέας, γάλα, τυρί, ζυµαρικά, αλλαντικά.Τρόφιµα σχετιζόµενα

Γλυκά νερό , λύµατα, θαλάσσιο νερό.

βοοειδή, κοπριά, κρέας, γάλα. Εδαφος, βλάστηση, γάλα∆έρµα, αµυχές, βλενογόνος.Φυσικό περιβάλλον

Aeromonashydrophila

Escherichia coli0157 Η7

Bacillus CereusStaphylococcus aureusΒακτήριοΙδιότητα

12

Page 12

23

23

ΖυµοµύκητεςΠρόκειται για ελλειψοειδείς, σφαιρικούς ή ραβδόµορφους

µικροοργανισµούς. Το µέγεθός τους ποικίλλει από 2-6 µm, ενώ οπολλαπλασιασµός τους γίνεται µε εκβλάστηση, διχοτόµηση(σχιζοµύκητες) ή σπορογονία (δυσµενείς συνθήκες). Μπορεί ναείναι σπορογόνοι ή και άσποροι.

Η κυτταρική οργάνωση των ζυµοµυκήτων περιλαµβάνει:-Κυτταρικό τοίχωµα από ηµικυτταρίνη, χιτίνη. (Συχνά γλοιώδες περίβληµα πουπροκαλεί συγκόλληση).-Κυτταρική µεµβράνη-Κυτταρόπλασµα µε πυρήνα, χυµοτόπια και σπειρωτά κοκκία.

Οι ζυµοµύκητες είναι αερόβιοι, ανθεκτικοί σε χαµηλό pH και ενεργότητα νερού, αλλά είναι ευαίσθητοι στηθερµοκρασία. Οι ζυµοµύκητες προκαλούν αλλοιώσεις, αλλά όχι παθογένεια.

24

24

Ευρωτοµύκητες (Μούχλες)Είναι πολυκύτταροι µικροοργανισµοί νηµατοειδούς

µορφής.Όσον αφορά την οργάνωσή τους, αποτελούνται απόένα βλαστικό κι ένα καρποφόρο µέρος. Το βλαστικόµέρος περιλαµβάνει διακλαδωµένα νηµατοειδήκύτταρα (νηµατώδη υφή) που σχηµατίζουν µυκήλια. Το καρποφόρο µέρος αποτελεί µια νηµατώδης υφήπου σχηµατίζει σπόρια (γονιδιοφόρος).

Οι ευρωτοµύκητες όπως και ζυµοµύκητες είναιαερόβιοι, ανθεκτικοί σε χαµηλές θερµοκρασίες,χαµηλό pH και ενεργότητα νερού, και συνήθωςευαίσθητοι σε ψηλές θερµοκρασίες.

13

Page 13

25

25

Aspergillus niger• Γονίδια (1000Χ)• Μυκήλιο µε

γονιδιοφόρα (250Χ)• Γονιδιοφόρο (250Χ)• ∆ιακλαδωµένα

στηρίγµατα (600Χ)

26

26

ΑΑ. . ΤυπικόΤυπικό παράδειγµαπαράδειγµα φθοράςφθοράς απόαπόµύκητεςµύκητες σεσε καλαµπόκικαλαµπόκι

ΒΒ. . ΑνάπτυξηΑνάπτυξη µούχλαςµούχλας πουπου οφείλεταιοφείλεταισεσε PenicilliumPenicillium σταστα πορτοκάλιαπορτοκάλια

ΓΓ. . ΜούχλαΜούχλα πουπου αναπτύχθηκεαναπτύχθηκε σεσεσταφύλιασταφύλια

ΑΑ

ΒΒ ΓΓ

14

Page 14

27

27

Οι ευρωτοµύκητες διακρίνονται σε παθογόνους καικοινούς. Οι τελευταίοι µπορεί να είναι ευρωτοµύκητεςεδάφους, αλλοίωσης ή ωφέλιµοι (ωρίµανση τυριού, οργανικά οξέα, αντιβιοτικά, ένζυµα).

Οι ευρωτοµύκητες που αναπτύσσονται στα τρόφιµα δενείναι παθογόνοι µε εξαίρεση την κάτω από ορισµένεςακραίες συνθήκες κακής πρακτικής δυνατότηταπαραγωγής από ορισµένους µυκοτοξινών που είναιιδιαίτερα τοξικές.

28

28

ΜΥΚΟΤΟΞΙΝΕΣΑφλατοξίνες ( από Aspergillus flavus και Aspergillus parasiticus)

Τύποι: B1, B2, G1, G2 (σε ξηρούς καρπούς, δηµητριακά) και Μ1, Μ2 (µεταβολίτεςτων Β1, Β2 σε γάλα)

Με αποθήκευση σε υγρές συνθήκες ή ανάπτυξη του καρπού σε συνθήκες ξηρασίας. Προκαλούν ηπατοπάθειες.

Οχρατοξίνες ( από Aspergillus ochraceus, Penicillium spp.)Σε καλαµπόκι, φασόλια, φυστίκια.Προκαλούν νεφροπάθειες.

Πατσουλίνη (patulin) (από Penicillium)Σε µουχλιασµένα φρούτα, φρουτοχυµούς.Καρκινογόνο, αιµοραγίες.

Τριχοθεσίνες (trichothecenes) (Fusarium graminearum)Τύποι: Ζεαραλινόνη, δεοξυνιβαλενόλη (DON). Σε σίτο, καλαµπόκι.

15

Page 15

29

29

ΟιΟι τέσσεριςτέσσερις βασικέςβασικές δοµέςδοµές αφλατοξινώναφλατοξινών πουπου παράγονταιπαράγονται απόαπό στελέχηστελέχηAspergillusAspergillus flavusflavus καικαι άλλαάλλα συγγενήσυγγενή γένηγένη πουπου αυξάνονταιαυξάνονται σεσε διάφοραδιάφορατρόφιµατρόφιµα

30

30

ΦΑΣΕΙΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΥ ΠΛΗΘΥΣΜΟΥΑ.Φάση προσαρµογής ή λανθάνουσα lag phaseB. Εκθετική φάση exponential phaseΓ. Φάση στασιµότητας stationary phase∆. Φάση κάµψης decline phase

0 5 10 15 20 25 30

TIME (h)

0

2

4

7

9

11

Log

cfu/

g 1 log κύκλος=3,32 διπλασιασµοί

Χρόνος για3,32 διπλασιασµούς

ΧρόνοςΠροσαρµογής

ανώτερηασύµπτωτη

κατώτερηασύµπτωτη

διαφορά

16

Page 16

31

31Ανάγκη για προσδιορισµό και καταµέτρηση των µικ/ώνστα τρόφιµα

•Ασφάλεια των τροφίµων: Ανάλυση των τροφίµων για την παρουσία, τον τύπο και την συγκέντρωση παθογόνων µικροοργανισµών καιπροϊόντων τους (π.χ τοξίνες)

•Έλεγχος διαδικασιών: π.χ εξυγίανση, χειρισµός, επεξεργασία

•Προσδιορισµός αλλοίωσης και πρόβλεψη της διάρκειας ζωής

•Αναγνώριση Κινδύνων

•Ανάπτυξη και εκτίµηση µεθόδων συντήρησης

•Προσδιορισµός και αξιολόγηση Κρίσιµων Σηµείων Ελέγχου στοσύστηµα HAACP

•Έλεγχος συµφωνίας µε µικροβιολογικά κριτήρια

32

32

Παράγοντες που σχετίζονται µε τη δειγµατοληψία

•Αντιπροσωπευτικότητα του δείγµατος

•Τυχαία επιλογή

•Συχνότητα δειγµατοληψίας

•Αριθµός δειγµάτων προς ανάλυση

•Πηγή δείγµατος: π.χ πρώτη ύλη, επεξεργασία, τελικό προϊόν

•Σχέδιο δειγµατοληψίας

•Χαρακτηριστικά δείγµατος: οµοιογένεια, µέγεθος, υγρό, στερεό κ.λ.π

17

Page 17

33

33

J

DISTRIBUTION OF MICROORGANISMS

SOURCE: ICMSF/Flowers, 1999

Οµοιογενής Κατανοµή

Ανοµοιογενής Κατανοµή

A

B

C

34

34

ΠΡΟΣΟΧΗ κατά τη δειγµατοληψία

•Το δείγµα είναι αντιπροσωπευτικό της παρτίδας

•Το µέρος του δείγµατος που αναλύεται αντιπροσωπεύει το δείγµα

•Οι µετρήσεις (π.χ ζύγιση) είναι ακριβείς

•Το δείγµα δεν υφίσταται κακοµεταχείριση κατά τη συλλογή, µεταφορά,αποθήκευση και ανάλυση

•Εφαρµογή ασηπτικών τεχνικών κατά τη συλλογή, µεταφορά,αποθήκευση και ανάλυση

•Χρήση της κατάλληλης µεθόδου ανάλυσης

•Εκπαιδευµένο προσωπικό

18

Page 18

35

35Χειρισµός δειγµάτων

Συλλογή και παράδοση των δειγµάτων προς ανάλυση µε τέτοιο τρόποώστε να αποδεικνύεται ότι τα αποτελέσµατα της ανάλυσηςαντιπροσωπεύουν την κατάσταση της παρτίδας κατά τη στιγµή τηςδειγµατοληψίας

Χειρισµός δειγµάτων µε τέτοιο τρόπο ώστε:

•Να αποφεύγεται η επιµόλυνση

•Να µην επιτρέπεται η ανάπτυξη ή µείωση των µικ/ων

∆ηλαδή έλεγχος θερµοκρασίας και άλλων παραµέτρων που επηρεάζουντην συµπεριφορά των µικ/ων, αποφυγή έκθεσης του δείγµατος, τουεξοπλισµού δειγµατοληψίας και αποθήκευσης

36

36Προσδιορισµός και Καταµέτρηση Μικ/ωνΙδανική µέθοδος προσδιορισµού µικροβιακού φορτίου

•Ακριβής•Ταχεία•Εύκολα εφαρµόσιµη•Οικονοµική

Καµία διαθέσιµη µέθοδος προσδιορισµού δεν είναι ικανή να προσδιορίσειτον ακριβή αριθµό των µικ/ων. Αυτό που παίρνουµε είναι απλά έναςυπολογισµός

Σφάλµατα κατά τον προσδιορισµό

•Σφάλµατα που σχετίζονται µε τη µέθοδο δειγµατοληψίας

•Σφάλµατα που σχετίζονται µε τη µέθοδο ανάλυσης

•Σφάλµατα που σχετίζονται µε το προσωπικό

19

Page 19

37

37

Μέθοδοι απαρίθµησης µικροοργανισµώνΥπάρχουν αρκετές διαδικασίες οι οποίες µπορούν να χρησιµοποιηθούν γιατον υπολογισµό ενός µικροβιακού πληθυσµού. Αυτές περιλαµβάνουν: µικροσκοπικές µετρήσεις, ηλεκτρονικές µετρήσεις σωµατιδίων, µετρήσεις σε τρυβλία (pour or spread plates), διάλυση (αραίωση) σε σωλήνες (tube dilution), τεχνική του πιο πιθανούαριθµού µικροβίων (ΜΡΝ), καλλιέργεια από µεµβράνη διήθησης, χηµικούς δείκτες, τριφωσφορικήαδενοσίνη (ΑΤΡ), µέθοδοι οπτικής πυκνότητας, κ.ά.

Ένα ιδανικό τεστ πρέπει να είναι ακριβές, γρήγορο, χρήσιµογια τους περισσότερους τύπους δειγµάτων και όχι ακριβό.

38

38

Μέθοδοι µέτρησης αριθµού ζωντανών κυττάρωνΑερόβια µέτρηση σε τρυβλία (aerobic plate count)

Η µέθοδος αυτή (pour plate count) είναι η πιο συνηθισµένη τεχνικήγια την µέτρηση των ζωντανών µικροοργανισµών στα τρόφιµα. Βασίζεται στην υπόθεση ότι τα µικροβιακά κύτταρα που υπάρχουν σεένα δείγµα αναµειγµένο µε άγαρ και θρεπτικά υλικά (πεπτόνες(αλµπουµίνη, πεπτόνη, πολυπεπτίδια, αµινοξέα), εκχύλισµα κρέατος(πεπτόνες + P, k), ζελατίνη, CHO, ανόργανα συστατικά), σχηµατίζουνξεχωριστές και ορατές αποικίες. Oι µετρήσεις που προκύπτουν από τηµέθοδο αυτή δεν πρέπει να αναφέρονται ως µετρήσεις ζωντανώνκυττάρων, αλλά ως µετρήσεις αποικιών ανά µονάδα ή µονάδεςσχηµατισµού αποικιών ανά µονάδα (Colony Forming Units, cfu). Επίσης χρησιµοποιείται ο όρος TPC (Total Plate Count).Κατάλληλες αραιώσεις του δείγµατος, ώστε τελικά να έχουµε αριθµόCFU µεταξύ 30 και 300, απλώνονται σ' ένα αποστειρωµένο τρυβλίοPetri και προστίθεται αποστειρωµένο, τηγµένο, ψυχρό άγαρ. Ηθερµοκρασία και ο χρόνος της επώασης ποικίλλουν ανάλογα µε το είδοςτου µικροοργανισµού (ψυχρότροφα, µεσόφιλα ή θερµόφιλα).

20

Page 20

39

39

Μέθοδοι µέτρησης αριθµού ζωντανών κυττάρωνΜια άλλη µεθόδος είναι η επιφανειακή ανάπτυξη σε τρυβλία (spread

plate count).Το αποστειρωµένο, τηγµένο και ψυχρό άγαρ απλώνεται πρώτα σεαποστειρωµένο τρυβλίο Petri. Ύστερα από την στερεοποίηση, τατρυβλία προεπωάζονται κατά τη διάρκεια της νύχτας. Η επώασηξηραίνει την επιφάνεια του άγαρ, έτσι ώστε οι µικροοργανισµοί να µηνσυνενωθούν κατά το άπλωµά τους πάνω στο άγαρ. Η µέθοδος αυτήπαρουσιάζει κάποια σηµαντικά πλεονεκτήµατα σε σχέση µε τηνκλασσική µέθοδο απαρίθµησης σε τρυβλία (pour plate count):

- ∆εν είναι απαραίτητη η χρήση ηµιδιαφανούς µέσου, όπως στηνκλασσική µέθοδο για την διευκόλυνση της εύρεσης των αποικιών.

- Η µορφολογία των αποικιών µπορεί να παρατηρηθεί καλύτερα στιςεπιφανειακές αποικίες, βελτιώνοντας την ικανότητα του αναλυτή ναδιακρίνει ανάµεσα σε διαφορετικά είδη αποικιών.

40

40

Sample is pipettedonto surface of agar plate (0.1mL or less)

Sample is spread evenly over surface of agar using sterile

glass spreader

Sample is pipettedinto sterile plate

Sterile medium is added and mixed

with inoculum

21

Page 21

41

41

42

42

22

Page 22

43

43

44

44

ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ

Κάθε υγρό ή στερεό µέσο το οποίο µπορεί να καλύψει τις θρεπτικέςανάγκες ενός µικροοργανισµού

Απαραίτητα στοιχεία: Νερό, Πηγή άνθρακα/ενέργειας,

Πηγή αζώτου, Άλατα

23

Page 23

45

45

Κατηγοριοποίηση θρεπτικών υποστρωµάτων

Χηµικώς ορισµένα (Defined Media)Αυστηρά καθορισµένη χηµική σύσταση

Σύνθετα (Complex Media)Περιέχουν συστατικά όχι απόλυτα καθορισµένης χηµικήςσύστασης (πεπτόνες, εκχυλίσµατα ζωικών ιστών κ.λ.π.)

46

46

Παράδειγµα χηµικώς ορισµένου µέσουΒG-11 Μέσο καλλιέργειας κυανοβακτηρίων Σύσταση (g/L)

Μέσο καλλιέργειας Escherichia coli Σύσταση (g/L)

24

Page 24

47

47

Μερικά Κοινά Σύνθετα Μέσα

48

48

Κατηγοριοποίηση θρεπτικών υποστρωµάτων

Βακτηριολογικά ή Μυκητολογικά θρεπτικά υποστρώµατα

Αντιπροσωπεύουν το φυσικόπεριβάλλον ανάπτυξης του

µικροοργανισµού

Γενικό σύνθετο µέσο για µύκητες

25

Page 25

49

49

Κατηγοριοποίηση θρεπτικών υποστρωµάτων

Εκλεκτικά υποστρώµατα (Selective Media)Ευνοούν την ανάπτυξη συγκεκριµένων µικροοργανισµών

∆ιαγνωστικά υποστρώµατα (Diagnostic Media)Θρεπτικά στα οποία είναι δυνατός ο διαχωρισµός µεταξύ διαφορετικών οµάδωνβακτηρίων και επιτρέπουν ένα στοιχειώδη προσδιορισµό ο οποίος βασίζεται στα

φυσιολογικά χαρακτηριστικά

Π.χ. Χολικά άλατα ή χρωστικές ευνοούν την ανάπτυξη Gram(-) αναστέλλοντας τα Gram(+)

Χρήση κυτταρίνης ως πηγή άνθρακα χρησιµοποιείται στην αποµόνωση κυτταρινολυτικώνστελεχών

Π.χ. Αγαρ αίµατος διαχωρίζει τα αιµολυτικά από τα µη αιµολυτικά βακτήρια

MacConkey άγαρ περιέχει λακτόζη και ουδέτερη κόκκινη χρωστική οπότε µικροοργανισµοί πουζυµώνουν λακτόζη εµφανίζουν ροζ αποικίες

50

50Κατηγοριοποίηση θρεπτικών υποστρωµάτων

Θρεπτικά υποστρώµατα αναερόβιων µικροοργανισµών

Αναγωγικά θρεπτικά υποστρώµατα

Επωαστικός κλίβανος γιααναερόβιους µικροοργανισµούς

26

Page 26

51

51Κατηγοριοποίηση θρεπτικών υποστρωµάτων

Θρεπτικά υποστρώµατα ταυτοποίησης (ΑΡΙ)