L’endotelio nell’imaging corneale - amedeolucente.it · “Corneal Stem Cells” nelle nicchie del limbus a partenza dalle Palizzate di Vogts , e sporadicamente nella cornea centrale,

21oftalmologiadomani - N. 2 - Anno 2011

IntroduzioneLa tecnologia strumentale caratterizza ogni campo dellamedicina. L’oftalmologia, con ancora maggior evidenza,nella diagnosi delle patologie oculari si serve dell’aiutotecnologico come indispensabile e complementare sup-porto. Lo studio della cornea era ristretto, fino a pochianni or sono, alla lampada a fessura, strumento simbolodell’oculista che individua e caratterizza la nostra attivitàclinica. Lo studio delle alterazioni retiniche e l’imagingdelle patologie del segmento posteriore, molto affasci-nanti iconograficamente, hanno posto per lungo tempoin un secondo piano l’iconografia strumentale della cor-nea e del segmento anteriore. La tecnologia OCT - rivolta inizialmente allo studiodella retina - è stata il vero elemento innovativo diagno-stico più positivamente sconvolgente degli ultimi ventianni nel panorama dell’oftalmologia mondiale. All’inizioessenzialmente retinica, ha messo in ombra le innovazionistrumentali riguardanti la cornea e la camera anteriore,che parimenti si sono sviluppate con grande qualità tec-nologica. Tutto ciò che le industrie ci propongono è svi-luppato per le crescenti esigenze scientifiche e clinichema, anche, per più congrui ritorni economici di mercato.Gli OCT sono stati, e ancora rappresentano, il principaleimpegno/business delle più importanti case costruttricied il loro successo è stato scientifico ed economico. Ilbusiness per gli OCT negli USA nel 2010 è stato di 250milioni di $ e si prevede nel 2017 di 650 milioni di $,con investimenti per 30-60 milioni di $/anno delle casecostruttrici. La chirurgia rifrattiva ha favorito lo sviluppodi tutta una serie di strumenti: dalla topografia di su-perficie della cornea alla microscopia endoteliale specu-lare, dalla pachimetria ottica e a contatto alla microscopiaconfocale e, infine, alle indagini corneali e della cameraanteriore per mezzo della tecnologia Scheimpflug e OCT.La nascita di numerose società scientifiche per lo studiodella cornea conferma la crescente rivalutazione per lasuperficie oculare e, se sommiamo i congressi nazionalie internazionali, l’interesse per il segmento anteriore su-pera quasi quello per la retina. Le Società monotematiche

aderenti alla SOI che s’interessano di cornea e di super-ficie oculare sono:A.I.C.C.E.R.: Associazione Italiana di Chirurgia dellaCataratta e Refrattiva;S.I.Co.M.: Società Italiana di Contattologia Medica;S.I.C.S.S.O.: Società Italiana Cellule Staminali e Su-perficie Oculare;S.I.Tra.C.: Società Italiana Trapianto di Cornea;S.I.D.S.O.: Società Italiana di Dacriologia e SuperficieOculare.Dal giugno del 2009 è nata EuCornea, European So-ciety of Cornea & Ocular Surface Disease Specialists,con sede a Dublino, per promuovere le relazioni, le co-noscenze scientifiche e le competenze pratiche tra glispecialisti della cornea in Europa. Il promotore e primopresidente di questa nuova fondazione è il prof. Vin-cenzo Sarnicola, già presidente S.I.C.S.S.O. Come sipuò intuire il fermento scientifico per il segmento an-teriore è ben testimoniato e non meno rilevante dellepatologie retiniche.

Le tecnologie e gli strumenti La strumentazione oggi disponibile per lo studio dellacornea allarga spesso il raggio d’azione a tutto il seg-mento anteriore, offrendo immagini della camera an-teriore, dell’angolo camerulare, del cristallino e dellacamera posteriore, con una ricchezza d’informazioni,di dati anatomici e fisiologici impensabili negli annipassati. Se si esclude la microscopia speculare endotelialee confocale, che tratteremo subito dopo, l’imaging offer-to dalle Scheimpflug Camera e dagli OCT per il seg-mento anteriore evidenzia ogni dettaglio anatomo-isto-logico, con assoluta dovizia di particolari, indispensabileper le diagnosi differenziali e ormai imprescindibile perla chirurgia rifrattiva. Alla visione della camera anteriorealcuni strumenti associano l’indagine topografica dellasuperficie corneale anteriore e posteriore, con i profilidello spessore di tutta la cornea: mi riferisco essenzial-mente al Pentacam dell’Oculus, al Sirius della CSO eal Galilei G2 della Ziemer Ophthalmology. L’associa-

L’endotelio nell’imagingcorneale di Amedeo Lucente

zione topo-aberrometrica e pachimetrica punto per pun-to rende meglio correlabile il dato rifrattivo cornealecon quello anatomico. L’immagine della camera ante-riore per mezzo di una o più Scheimpflug Camera con-sente, infatti, la visione del profilo corneale per intero,da bianco a bianco, con tutti i dati anatomici che neconseguono. Alla tecnologia Scheimpflug si contrap-pone, per così dire, quella Tomografica. Tutti gli OCTSpectral in commercio permettono di indagare il seg-mento anteriore. Gli OCT da camera anteriore permet-tono una visione strutturale dei tessuti esaminati, mentrei profili ed i volumi sono meglio indagati dalle Scheim-pflug. Entrambe le tecnologie non permettono una vi-sione della camera posteriore e del corpo ciliare, possibilecon UMB. La molteplicità di offerta tecnologica, conpiù strumenti che eseguono la stessa indagine, magaricon qualche particolare in più, a volte può confondereanche l’oculista più esperto che deve investire in questastrumentazione, sempre più affascinante ed oltremodoesplicativa, ma non certamente a basso costo. In que-st’articolo parlerò della microscopia endoteliale perchéè l’esame a noi più vicino per frequenza di richiesta, edella microscopia confocale, per la stretta parentela chelega queste due metodiche. Le tecnologie bi e tridimen-sionali della camera anteriore, molto sviluppate tecno-logicamente, pur essendo iconograficamente affascinantinon permettono lo studio istologico-citologico dellacornea, come invece è possibile con la microscopia con-focale e, per il solo endotelio, con la speculare.

La microscopia endotelialeLo studio dell’endotelio corneale per mezzo della mi-croscopia speculare consiste nell’analisi morfologica enumerica delle cellule endoteliali. La diffusione di questistrumenti, essenzialmente i microscopi endoteliali noncontact, è cominciata su larga scala con l’utilizzo dellafacoemulsificazione nell’intervento di cataratta. A di-spetto d’interventi chirurgici svolti correttamente, ci sitrovava casualmente nel post-operatorio con cornee

opache ed edematose, senza alcuna apparente spiega-zione. Ci s’interrogava sulle possibili cause di tali graviinsuccessi, e la conoscenza dello stato dell’endotelio cor-neale diventò essenziale e imprescindibile. La causa diquegli “inspiegabili” edemi era dovuta spesso alle solu-zioni usate in camera anteriore durante l’infusione-aspi-razione, o alla scarsa sterilità nel manipolare le lenti in-traoculari, più che allo stato funzionale dell’endoteliopre-operatorio. I microscopi endoteliali non a contattoo speculari trovarono da allora sempre più larga diffu-sione e oggi sono usati nella preparazione dell’interventodi cataratta, in chirurgia rifrattiva, nelle patologie cor-neali senza opacizzazione stromale, nel seguire i trapianticorneali e nei portatori di lenti a contatto. Nella stampadegli esami di tutti gli strumenti in commercio si trovasempre un rilievo pachimetrico dell’area indagata, insostanza della zona pupillare, (mediamente nei vari stru-menti: 02x05 mm di area fotografata, ingrandimento di150x, distanza di lavoro di 20-30 mm).I dati che offrono i printout di stampa indicano il nu-mero di cellule per millimetro quadro, la variabilità del-l’area delle cellule con un minimo e massimo, la loroesagonalità e alcuni parametri: il CV o COV “ Coefficientof variation of cell size”, l’AVG o media delle aree di tuttele cellule e la SD o deviazione standard delle aree cel-lulari. Com’è noto lo spessore della cornea è mediamentedi 535 micron al centro (Doughty e Zaman, 2000),cresce circa del 23% verso la periferia, l’epitelio è menodel 10% del suo spessore (Holden e coll, 1982; Patel ecoll. 2001), mentre l’endotelio, monostratificato, misuracirca 5 micron, con 500-600 mila cellule esagonali allanascita. La superficie della cornea è mediamente 1,3-1,4 cm², cioè 130-140 mm²: essendo circa 3000-4000x mm² le cellule nell’infanzia x 130-140 mm² si hannoin tutto ± 390000-560000 cellule. Alcuni parametrimostrati dalla microscopia endoteliale non contact, de-scrittivi dell’area delle cellule endoteliali, presi singo-larmente sono di difficile comprensione. Vediamoli inparticolare.


Fig. 1 - Se si impone l'utilizzo di un solo poligono regolare per tutta la tassellatura, abbiamo tre configurazioni possibili; la misura degli angoli del tassello dovrà essere un divisore intero di 360°; andranno bene solo il triangolo equilatero (60°),

il quadrato (90°) e l'esagono regolare (120°).

Il CV, coefficiente di variabilità o de-viazione standard relativa (RDS),individua il rapporto tra SD/AVGcioè tra due indici statistici. La de-viazione standard SD, (standard de-viation, scarto quadratico medio,radice quadrata della varianza), èstatisticamente un indice di disper-sione, indice raffinato che ci indicalo scarto rispetto ad una “norma”,lo scostamento medio dei dati in-torno al valore atteso, in questo casola media aritmetica delle aree cel-lulari trovate (AGV).In sostanza il CV è anch’esso unadeviazione standard, più specifico della SD, relativo allamedia aritmetica AGV, indipendente dall’unità di misuraadottata. Troviamo elencati i seguenti parametri:A) CD densità cellulare per mm². B) HEX coefficiente di esagonalità o di poligonalità

delle cellule (%).C) CV coefficiente di variabilità come rapporto tra

SD/AVG (%).D) MAX dimensioni della cellula maggiore in micron

quadrati.E) MIN dimensioni della cellula minore in micron

quadrati.F) SD deviazione standard delle dimensioni cellulari.G) AGV media delle dimensioni cellulari in micron

quadrati.H) T spessore corneale in micron.I) N numero di cellule selezionate per la conta.

Il valore normale di CV è 0.32, vale a dire che il 32%delle cellule esaminate per campo può avere una super-ficie variabile da quella standard: più alto è questa per-centuale e maggiore è il polimegatismo endoteliale. E’noto che le cellule endoteliali non hanno capacità ri-produttiva e che la loro densità diminuisce con l’età. Adifferenza delle cellule epiteliali, dove sono presenti“Corneal Stem Cells” nelle nicchie del limbus a partenzadalle Palizzate di Vogts, e sporadicamente nella corneacentrale, cellule con caratteristiche clonogenetiche iden-tiche alle staminali, (Olocloni, Paracloni, Meracloni),nell’endotelio non sono state individuate pool di cellulecon potenzialità rigenerative, per cui la densità cellularedecresce lentamente da 3000-4000 a circa 2000 celluleper mm² col progredire dell’età. Note sono pure le fun-zioni di pompa di queste cellule per la normale traspa-renza dello stroma corneale, ma ancor oggi non tuttoè chiaro; come basse densità cellulari, anche sotto le500 cellule per mm², possano permettere la stessa tra-

sparenza di densità nor-mali, perlomeno all’os-servazione con la lampa-da a fessura. Sicuramentela supplenza funzionaledelle cellule endoteliali ènotevole e normalmenteutilizzata solo al minimo:quando il numero com-plessivo delle cellule scen-de sotto un valore soglia,presumibilmente sotto le 500 x mm² (500 x 140 mm²± = area endotelio = 70000 cellule c.a.), si perde la nor-male trasparenza e compare un edema da insufficienzaendoteliale. Basta solo un 5-6% di contenuto di acquain più nello stroma per avere un edema clinicamentesignificativo. Le cellule endoteliali, non potendosi mol-tiplicare, col tempo perdono la loro perfetta forma geo-metrica, aumentando la superficie cellulare, essenzial-mente a carico del citoplasma; tale fenomeno è notocome Polimegatismo (da poli=molti e megatos=dimen-sioni).La perdita della loro originale forma esagonale è notacome Polimorfismo o Pleiomorfismo (da poli=molti e/opleio=più e morfo= forma). Polimegatismo e Polimorfismovanno sempre di pari passo; trovare alterati questi dueparametri vuol dire, in linea di massima, una cellularitànon pienamente fisiologica. Il Polimegatismo è indivi-duato, nel printout dei microscopi endoteliali, dal pa-rametro di variabilità CV, mentre il Polimorfismo daHEX, grado di Esagonalità o Coefficiente di Forma. Sonoparametri morfometrici espressi entrambi in percentuale(%), ritenuti da molte ricerche come l’indice più sen-sibile di funzionalità cellulare, rispetto alla pura DensitàCellulare (CD). Anche in questo caso vale più la qualità funzionale chela quantità numerica, almeno fino ad un certo punto.


Fig. 2 - Figura vitruviana di Leonardo; esagono regolare

Fig. 3 - Favo d’api. Notare laforma perfettamente

esagonale delle cellette.

Un alterato rapporto di CV e HEX, anche se marcato,non deve far pensare tout court ad un imminente scom-penso corneale, che potrebbe diventare certo dopo unintervento di cataratta. La prognosi sulla sopravvivenzae sulla efficienza biologica delle cellule endoteliali èquanto mai imprevedibile. L’insulto chirurgico giocasempre un ruolo di primo piano, con diminuzione va-riabile del numero delle cellule endoteliali ed alterazionidella loro forma. Si potrebbe, in un certo senso, misurarela “delicatezza” dell’atto chirurgico facendo una contadifferenziale tra il pre ed il post chirurgia della cataratta,a parità di tutti gli altri bioparametri; possibilità teorichedi studio, scaturite ed elaborate da un punto di vistaclinico-speculativo, certamente da eseguire come pro-tocollo nell’attività clinico-chirurgica. La forma esago-nale delle cellule endoteliali probabilmente risponde acriteri termodinamici ed entropici, ancora da capirecompiutamente. Una prima testimonianza strutturaledell’endotelio corneale risale ai disegni schematici diVogt riportati nel suo Atlante di Biomicroscopia (1921).In assenza di un microscopio endoteliale è possibileavere una prima visione del mosaico endoteliale già al-

l’esame alla lampada a fessura, specialmente in assenzadi alterazioni corneali e del film lacrimale, in soggettigiovani e particolarmente nelle aree corneali temporali,con adeguati ingrandimenti (30-40 x). L’esercizio quo-tidiano nel ricercare il mosaico endoteliale porta ad au-mentare le personali capacità cliniche, ad intuire lo statofisio-patologico di questo strato cellulare già ad una pri-ma osservazione, con l’approssimazione dovuta all’espe-rienza individuale ed ai limiti posti dallo strumento.Spesso, dopo un primo sguardo biomicroscopico, si ri-chiede un esame strumentale più approfondito, per lavisione di gutte o di disomogeneità delle cellule endo-teliali. Com’è noto l’esagono regolare (da esa=sei e go-no=angolo) ha sei lati uguali e sei angoli congruenti, conampiezza di 120°; inoltre è composto di sei triangoliequilateri con il vertice in comune, e il suo lato è ugualeal raggio della circonferenza circoscritta, con aree quasisovrapponibili (fatta pari a 1 l’area del cerchio, 0.907sarà l’area dell’esagono inscritto). In geometria pianagli esagoni con i quadrati e i triangoli equilateri sonole uniche figure idonee per coprire porzioni di pianosenza lasciare spazi vuoti e senza sovrapporsi (fenomeno


Fig. 4 - Grandi gutte endoteliali

conosciuto come tassellazione o tassellatura o pavimen-tazione); le figure piane in geometria sono anche dette“tasselli” (Fig. 1). L'architettura esagonale per la sua per-fezione è stata studiata da matematici e zoologi. A questoproposito lo scienziato Renè Antoine De Réaumur evi-denziò la forma esagonale come unità di misura del si-stema metrico decimale, affermatosi nel XVIII secoloe, nell’Uomo vitruviano di Leonardo, le figure geome-triche regolari che si possono disegnare, circoscrivonoun esagono come figura più interna e centrale (Fig. 2).Numerosi sono stati inoltre gli studi sui favi delle apiper la loro forma tipicamente esagonale (Fig. 3); esago-nale è anche la forma delle viti per il bloccaggio mec-canico, per la migliore possibilità di avvitamento, conil minor dispendio di energia e per l’omogenea distri-buzione delle forze trasmesse. In citologia la forma triangolare e quadrata è poco oniente rappresentata, permette pochi scambi intercel-lulari e soprattutto non consente, in caso di apoptosi omorte di un’unità biologica, lo scivolamento di una cel-lula nello spazio occupato da quella vicina senza pro-vocare soluzione di continuità. Come s’intuisce la natura

aveva poche scelte nella forma del mosaico endoteliale:l’esagono risponde meglio di tutti gli altri poligoni allecaratteristiche geometriche e biologiche di una popo-lazione cellulare perenne in lenta diminuzione negli an-ni, che deve ricoprire perfettamente una determinatasuperficie biologica. Normalmente l’esagonalità è parial 60% nei soggetti normali non portatori di lenti acontatto. Questo significa che fisiologicamente si tro-vano cellule eptagonali o pentagonali nel mosaico en-doteliale per un 40% dell’intera popolazione. Com’èstato riferito, le cellule diminuiscono di numero (circa0.6% l’anno) ed aumentano di dimensioni, e questa al-terazione subisce un’accelerazione dopo un interventodi cataratta, anche ben condotto. Si ritiene che una di-minuzione di 200-400 cellule per mm², circa del 10%,sia compatibile con un atto chirurgico ben condotto.Una deplezione maggiore è indice di procedure intrao-peratorie non corrette, escludendo le cataratte dense edure, che comportano comunque stress eccessivo perl’endotelio corneale, anche con chirurghi molto esperti.La conversione dalla faco alla ECCE, in alcuni casi se-lezionati, permette di evitare complicanze le più dispa-


Fig. 5 - Endotelio senza gutte

rate, ma non migliora la sopravvivenza delle cellule en-doteliali, come dimostrato in numerose ricerche. Il goaldella chirurgia della cataratta è avere cornee trasparentied un visus ottimale subito dopo l’intervento, con mi-nime diminuzioni delle cellule endoteliali, proporzionalealla durezza delle opacità del cristallino.Con gli anni anche la membrana di Descemet, strutturaacellulare costituita principalmente da collagene di tipoVIII, diverso da quello stromale, sintetizzata dalle celluleendoteliali, aumenta di spessore di oltre 10 volte, pas-sando da 3 micron a 30-40 micron nell’anziano. Questoaumento di spessore dovrebbe essere considerato, oltretutto, come fattore d’errore nel rilievo tonometrico,non solo per il dato pachimetrico, in aumento negli an-ni, ma anche per il conseguente irrigidimento del mo-dulo elastico della cornea. Questi due dati possono entrambi determinare un falsoaumento del tono oculare rilevato, motivo in più perconsiderare la pachimetria e l’elasticità corneale in ge-nerale (o l’isteresi in particolare), come parametri es-senziali nella valutazione del paziente iperteso e/o glau-comatoso. La distribuzione delle perdite cellulari e l’au-mento della loro superficie assumono caratteri differentise dovuti all’invecchiamento oppure a condizioni pa-tologiche. La ridistribuzione cellulare dovuta all’età è maggior-mente omogenea, quasi mimetizzata nella molteplicitàdella sconfinata pavimentazione esagonale, mentre percause patologiche è meno omogenea, con la comparsadi grandi cellule con una superficie molte volte quellaoriginaria, e con una densità che può scendere fino a1000 cellule o meno per mm². Normalmente l’area me-

dia delle cellule endoteliali è di 200-300 µ² in soggettigiovani; si possono trovare cellule con aree anche di1500-2500 µ² in cornee patologiche, ma ancora traspa-renti. Tutto dipende dal numero totale di cellule mor-fologicamente non alterate superstiti. Un polimegatismo(CV) così esasperato si trova specialmente nelle chera-toplastiche di vecchia data, dove non è raro trovare cor-nee ancora chiare con densità (CD) di 500 cellule permm² (Fig. 4 e 5).

I buchi neri o BlebsUna citazione a parte meritano i “buchi neri” o “Blebs”.Scoperti nel 1977 da Zantos e Holden, furono descritticome piccole aree scure, non riflettenti, che compaiononel mosaico endoteliale dopo l’uso di Lac. Sono, ineffetti, cellule endoteliali edematose, ripiene di acqua,incapaci di riflettere la luce in modo speculare, appa-rendo perciò come dei buchi neri. La deformazione diqueste cellule avviene posteriormente, verso la cameraanteriore: la Descemet ne limita l’espansione verso lostroma mantenendo, di fatto, immutata la loro formaverso l’esterno, mentre la parete cellulare trova poca onulla resistenza verso la camera anteriore, ripiena di ac-queo. La loro superficie diventa così globosa e questocambiamento non permette l’osservazione al microsco-pio endoteliale, determinando una non riflessione, uneffetto buco nero, “cellula bleb” (Fig. 6). Bisogna subito dire che il fenomeno Blebs è largamentereversibile, come dimostrato da Nathan Efron nel 2001,confermando le osservazioni di Zantos e Holden. Lacomparsa di buchi neri è quasi immediata all’applica-zione delle Lac sia morbide sia rigide già dopo 10’ dal-l’inserimento; altrettanto rapida è la loro scomparsa do-po 60’, con un picco massimo a 30’. Il fattore scatenante di questa degenerazione idropicacellulare si ritiene sia lo shift del pH stromale, dovutoalla produzione di biossido di carbonio-acido lattico,per la glicolisi attivata dall’ipossia secondaria alle Lac(Holden 1985), relativamente reversibile. Da più studi sembra ormai certo che l’entità della ri-sposta alle Lac sia inversamente proporzionale al valoredi trasmissibilità (Dk/t) della lente nei confronti del-l’ossigeno. La “sindrome da intolleranza alle lenti a contatto” produce,com’è noto, una soggettiva riduzione dell’acuità visiva,fotofobia e edema stromale all’applicazione della Lac.In questi casi si è dimostrato un disordine del mosaicocorneale endoteliale con gradi elevati di polimegatismo,che persiste dopo molto tempo negli ex-portatori. Sipotrebbe, in un certo senso, riconoscere un ex-portatoredi Lac dal suo CV, essendo la tassellazione endotelialestabile nei portatori di lac da breve tempo. Maggiori


Fig. 6 - Ottica geometrica della riflessione dell’endoteliocorneale normale e di una cellula edematosa (bleb)(Nathan Efdron. “Contact Lens Complication”. 2004Butterworth-Heinemann.)

dimensioni cellulari con aumento del polimegatismosi riscontrano solo nei portatori di lungo termine.

Le GutteUn altro breve accenno si deve fare sulle gutte endote-liali. L’endotelio corneale con l’età si altera e la perditadelle cellule, oltre a determinare Polimorfismo e Polo-megatismo, provoca un ispessimento della membranadi Descemet (Jean Descemet 1732-1811) che, se è con-centrato in piccole aree, si caratterizza con formazioniistologiche dette gutte o corpi di Hassall-Henle. Nor-malmente sono dislocate in aree corneali periferiche esi possono ritrovare con grande frequenza dopo i qua-ranta anni (in più del 70%). Se centrali, possono essereuno dei segni della Distrofia di Fuchs, che si manifestatardivamente e, solo di raro in infanzia, particolarmentenel sesso femminile, bilateralmente, anche se si riscontraspesso una cornea più coinvolta dell’altra. Prima di arrivare alla cheratopatia bollosa terminale,che portava questi pazienti al trapianto corneale a tuttospessore, il quadro clinico della Fuchs si caratterizza perun diffuso ispessimento della Descemet (spesso 20-30micron) con edema stromale secondario, fino alle for-mazione di micro bolle epiteliali. Nelle fasi iniziali le gutte sono l’elemento patologicoprincipale, diffuse su tutta l’area endoteliale e, all’esamespeculare, appaiono come buchi neri di varia dimen-sione, facendo acquistare all’endotelio un aspetto tarlato,a vetro battuto. Oggi al trapianto a tutto spessore nonsi arriva più. Le nuove tecniche di cheratoplastica en-doteliale DSAEK/DSEK permettono di risolvere primae meglio questa patologia. In sostanza ciò che noi chia-miamo gutte (dal latino guttae= goccia) sono aree diendotelio senza cellule, con addensamento della Desce-met e della lamina basale, che appaiono come aree nereall’esame microscopico endoteliale ed alla lampada afessura.

La Microscopia ConfocaleIl microscopio confocale nasce negli anni cinquanta.Le basi teoriche della strumentazione sono state attuateda Marvin Lee Minsky, (nato a New York 1927) che siè dedicato, tra l’altro, a studi sull’intelligenza artificiale,suo principale campo d’applicazione. I primi microscopiprogettati con tecnologia CLSM (Confocal Laser Scan-ning Microscope), furono costruiti in Inghilterra all’iniziodegli anni novanta e commercializzati dalla ditta Bio-Rad da prototipi costruiti nel MRC Laboratory of Mo-lecular Biology di Cambrige su progetti di W. BradshawAmos, iniziati dieci anni prima. Lo strumento opera co-me un normale microscopio ottico, ma la risoluzionefinale è molto aumentata. Attraverso due diaframmi

(pinholes) per la luce emessa e per quella riflessa, s’im-pediscono al massimo le dispersioni e le interferenzedovute sia alla luce di eccitamento, che viene concentratasull’area campione, sia alla luce riflessa dagli altri piani,con l’eliminazione di perdite di nitidezza. Il termineconfocale descrive appunto la caratteristica di questo


Fig. 7 - Modulo Rostok per HRT 3 Heidelberg Engineering;HRT 3 ; Immagini di sezioni corneali dall’epitelio all’endotelioall’HTR 3

microscopio: il pun-to d’osservazione ela fonte d’illumina-zione sono focaliz-zati su un unicopunto “common focalpoint”. Tale peculiarità faridurre le riflessionidi luce dalle zonevicine al puntod’osservazione,“chiacchierio” in mi-croscopia, con aumento della risoluzione e dell’ingran-dimento. Si ottiene così una visione cellulare e in parteintracellulare, senza arrivare alla visione degli organuliintracellulari, mitocondri o nucleolo. Esistono due mo-dalità di microscopia confocale in oftalmologia: a lucebianca ed a luce laser. Quella a luce bianca è utilizzatadal Confoscan 4.0, (Nidek Technologies, Italy), mentrequella a luce laser è usata dal HRT3-Rostock con CorneaModule (Heidelberg Eng., Germany) (Fig. 7 e 8).Il Confoscan 4 della Nidek è uno strumento dedicatoallo studio della cornea, il primo commercializzato edideato a tale fine. Permette un ingrandimento di 800-1000X, su un’area d’immagine di 300-400 micron dilato con lenti 40X, acquisite da una telecamera ad altarisoluzione. Permette di studiare la cornea in tutti i suoistrati, sezionandola “a fettine” di pochi micron, dall’en-dotelio all’epitelio, con acquisizione dei valori pachi-metrici di ogni strato indagato, per mezzo di un gel vi-scoso trasparente interposto tra la probe e la cornea.Maggiore è la riflettività dello strato corneale, miglioreè la qualità dell’immagine finale, per cui l’endotelio,che è a maggior riflettenza, è fortemente evidenziato,mentre lo stroma si nota con minor dettaglio. L’HRT è uno strumento della Heidelberg Eng., multi-funzione, con la possibilità di avere tre moduli. Nell’ul-tima versione l’HRT 3 può avere: • il modulo glaucoma con il Glaucoma Probabilità Score

(GPS) che permette di evidenziare l’evoluzione deldanno delle fibre ottiche nel tempo;

• il modulo retina, che permette di quantificare lo spes-sore per settori del polo posteriore della retina;

• il modulo cornea che è un vero microscopio confocale.

L’HRT utilizza una sorgente laser a diodo Elio-Neon a670 nm, fornendo sezioni di cornea di 10 micron dispessore. La differenza sostanziale tra le due tecnologie consistenel fatto che l’utilizzo di una sorgente laser permetted’indagare anche le zone periferiche e limbari della cor-

nea-sclera, senza la diffrazione luminosa, propria di que-ste strutture non trasparenti, molto evidente nella mi-croscopia confocale a luce bianca. L’indagine limbarenon è comunque possibile a tutto lo spessore, rimanen-do confinata agli strati superficiali, per ora limite diquesta metodica anche con luce laser. La microscopiaconfocale è utilizzata largamente in biologia. Permettelo studio tridimensionale delle strutture indagate, consezione in piani paralleli dei preparati, minimizzandole interferenze provenienti dalle altre sezioni adiacenticon l’uso di diaframmi, i pinholes, già citati. Per lo stu-dio dei tessuti biologici è usato unicamente il laser comesorgente di luce (Fig. 9 e 10). Questa metodica d’inda-gine permette quindi un esame istologico di tutta lacornea, lo studio dettagliato delle patologie corneali,delle sezioni dello stroma prodotte dalle diverse chirurgierifrattive corneali. Con lo studio confocale molti insuccessi chirurgici sisono compresi meglio, e lo studio confocale della corneaguida ormai l’evoluzione delle tecniche chirurgiche ri-frattive, come indispensabile banco di prova. Lo strato


Fig. 8 - Confoscan 4 Nidek

Fig. 9 - Rappresentazione schematica del principio difunzionamento del microscopio confocale

endoteliale è ben visiona-to ma non acquista mag-giore definizione rispettoalla microscopia endote-liale speculare.Considerazioni FinaliL’endotelio corneale affa-scina e stupisce l’oculistaper la sua sorprendenteunicità morfo-funziona-le, risultando un “uni-cum” biologico nel nostroorganismo.Sia la microscopia spe-

culare che quella confo-cale ne danno un’imma-gine chiara e dettagliata,senza grandi differenzequalitative. Il limite an-cor oggi è che s’indagauna piccola area centraledella cornea, anche se sipuò spostare il campod’indagine su zone me-dio-periferiche, facendoguardare il paziente lateralmente o scegliendo campinon centrali nel menu a disposizione in alcuni strumentispeculari (Topcon 3000 SP) o confocali (HRT3 Ro-stok). Il futuro avrà come sfida l’indagine limbare e dellecellule staminali con tecnologie non invasive, per un’in-formazione veloce e confortevole dello stato cornealeglobale, compresa la riserva staminale cellulare. Per ora

possiamo solo estendere lo studio corneale ancora piùdiffusamente nella pratica clinica, per avere dati che ser-viranno nella storia del paziente, e che potranno aiutarele nostre scelte terapeutiche verso decisioni più oggettive,appropriate e documentate. n


Fig. 10 - Schema microscopio confocale

1. Zantos SG and Holden BA (1977) “Transient endothelial chan-ges soon after wearing soft contact lens”. Am J Optom PhysiolOpt. 54, 856-858

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BIBLIOGRAFIA

Documents

L’endotelio nell’imaging corneale - amedeolucente.it · “Corneal Stem Cells” nelle nicchie del limbus a partenza dalle Palizzate di Vogts , e sporadicamente nella cornea centrale,