Lokalisation von mRNA-Transkripten auf Gewebeschnitten des ... · Becherzellen liegt basal, so dass apikal Raum für sekretorische Vesikel bleibt. Die Die ciliären Säulenzellen

Lokalisation von mRNA-Transkripten auf Gewebeschnitten des Riechepithels der Ratte

durch in situ Hybridisierung

Diplomarbeit

vorgelegt der Fakultät für Biowissenschaften

der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg

Thomas Hengl Heidelberg, Dezember 2006

Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Zoologie der Universität Heidelberg in

der Zeit vom 13. März bis 13. Dezember 2006 unter Anleitung von Prof. Dr. Stephan

Frings und Dr. Frank Möhrlen ausgeführt.

Referent: Prof. Dr. Stephan Frings

Korreferent: Prof. Dr. Gabriele Petersen

Institut für Zoologie

Im Neuenheimer Feld 230

69120 Heidelberg

Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Diplomarbeit selbstständig unter

Anleitung verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel

benutzt habe.

Heidelberg, den 13. Dezember 2005

Thomas Hengl

Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde in der Arbeitsgruppe Molekulare Physiologie am Institut

für Zoologie der Universität Heidelberg angefertigt. An dieser Stelle möchte ich mich

bei allen recht herzlich für die Unterstützung bei der Anfertigung der Arbeit

bedanken.

Mein besonderer Dank gilt:

• Prof. Dr. Stephan Frings für die Überlassung des interessanten Themas, die

Bereitstellung des Arbeitsplatzes und der Betreuung meiner Arbeit.

• Apl. Prof. Dr. Gabriele Petersen für die Übernahme des Korreferats.

• Dr. Frank Möhrlen für die ausgezeichnete Betreuung, für seine Anregungen

und Hilfestellungen, seine Geduld und seinen Rat bei der Fertigstellung dieser

Arbeit.

• Dipl.-Biol. Nicole Ungerer, Dipl.-Biol. Ulrich Mayer, Dipl.-Biol. Clemens Prinz

zu Waldeck, Dipl.-Biol. Daniel Klimmeck und Dipl.-Biol. Katharina Funk, für

ihre ständige Diskussionsbereitschaft, Hilfestellungen und Korrektur-

lesearbeiten.

• Tanja Keller und Gabriele Günther für die Unterstützung bei

molekularbiologischen und histologischen Fragestellungen.

• Dipl.-Biol. Kerstin Vocke, Dipl.-Biol. Christina Franjic-Würtz, Jochen Schlabing,

Inge Neudorf und Maren Stavermann für die familiäre Atmosphäre im Labor

403 und Zimmer 416. Semir, Philipp, Tilmann und Christine für ihre

Unterstützung im Studentenlabor.

• Meinen Eltern, Verwandten und Freunde, ohne deren Unterstützung dieses

Studium nicht möglich gewesen wäre.

• Meiner Freundin Isabel, die immer für mich da war und an mich geglaubt hat.

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ........................................................................................................... 1

1.1 Die Nasenhöhle der Landwirbeltiere ............................................................ 1

1.1.1 Aufbau des respiratorischen Epithels.................................................... 2

1.1.2 Aufbau des olfaktorischen Epithels ....................................................... 3

1.2 Die olfaktorische Signaltransduktion ............................................................ 5

1.3 Ziel der Arbeit ............................................................................................... 7

2 Material und Methoden ..................................................................................... 8

2.1 Geräte .......................................................................................................... 8

2.2 Verbrauchsmaterialien ................................................................................. 9

2.3 Reaktionskomplettausstattungen ................................................................. 9

2.4 Chemikalien ................................................................................................. 9

2.5 Puffer, Lösungen und Medien .................................................................... 10

2.5.1 Puffer und Lösungen für die Histologie ............................................... 10

2.5.2 Puffer und Lösungen für die Molekularbiologie ................................... 11

2.5.3 Bakterien-Medien ................................................................................ 13

2.6 Bakterien Stämme...................................................................................... 14

2.7 Bakterien Vektoren..................................................................................... 14

2.8 Primer......................................................................................................... 15

2.9 Tiere ........................................................................................................... 18

2.10 Präparation des olfaktorischen Epithels für Nasengewebeschnitte............ 18

2.10.1 Herstellung beschichteter Objektträger ............................................... 18

2.10.2 Fixierung für Paraffinschnitte............................................................... 19

2.10.3 Entwässerung des Gewebes............................................................... 19

2.10.4 Paraffineinbettung ............................................................................... 19

2.10.5 Schneiden der Paraffinblöcke ............................................................. 20

2.10.6 Fixierung für Kryoschnitte ................................................................... 20

2.10.7 Anfertigung der Kryostatschnitte ......................................................... 20

2.11 Molekularbiologische Methoden................................................................. 21

2.11.1 Arbeiten mit RNA ................................................................................ 21

2.11.2 RNA-Isolierung.................................................................................... 21

2.11.3 Konzentrationsbestimmung und RNA-Spektrum................................. 22

Inhaltsverzeichnis

2.11.4 Denaturierende RNA-Agarosegel-Elektrophorese .............................. 22

2.11.5 Die cDNA-Synthese ............................................................................ 23

2.11.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)........................................................ 23

2.11.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen...................................................... 24

2.11.8 Klonierung........................................................................................... 25

2.11.9 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli .............................................. 26

2.11.10 DNA-Sequenzierung........................................................................ 27

2.11.11 Lagerung von Klonen (Glycerinstock).............................................. 27

2.11.12 In vitro Transkription ........................................................................ 27

2.11.13 In situ Hybridisierung (ISH).............................................................. 29

2.11.14 DAPI-Färbung.................................................................................. 30

2.11.15 Bilddokumentation ........................................................................... 31

3 Ergebnisse ....................................................................................................... 32

3.1 Etablierung der ISH auf Gewebeschnitten der Rattennase ........................ 32

3.1.1 OMP als Marker für reife olfaktorische Rezeptorneurone ................... 35

3.1.2 CNG-A2 als Marker für reife olfaktorische Rezeptorneurone .............. 37

3.1.3 Das Golf-Protein als Marker für olfaktorische Rezeptorneurone .......... 39

3.1.4 Crb-2 als Marker für Stützzellen.......................................................... 41

3.2 Bestrophin-2 als möglicher Kandidat für den Ca2+-aktivierten Cl--Kanal .... 43

3.3 Negativkontrollen zu den in situ Hybridisierungen...................................... 47

4 Diskussion ....................................................................................................... 48 5 Zusammenfassung.......................................................................................... 53 6 Literaturverzeichnis ........................................................................................ 54 7 Abkürzungsverzeichnis .................................................................................. 64

Einleitung

1 Einleitung

1.1 Die Nasenhöhle der Landwirbeltiere

Die Nasenhöhle der Landwirbeltiere wird im anterioren Bereich vom respiratorischen

und im posterioren Bereich vom olfaktorischen Epithel ausgekleidet. Die

Einstülpungen (Abb.1) in das Lumen der Nasenhöhle werden als Conchien

bezeichnet (Cole P., 2003) und dienen der Oberflächenvergrößerung der Epithelien.

Die dorsalen Conchien nennt man Nasoturbinaten, die ventralen Conchien

Maxilloturbinaten (Uraih und Maronpot, 1990). Das median gelegene Septum (Abb.1)

trennt die Nasenhöhle in zwei Bereiche, die von den lateralen Wänden nach außen

hin begrenzt werden.

OE

RE

S

N L

M

W

. Abb.1: Koronalschnitt einer Rattennase, die mit Richardson-Blau angefärbt

wurde. Das blaugefärbte OE (olfaktorische Epithel) und RE (respiratorische Epithel)

grenzen die Gewebe vom Lumen ab. L: Lumen M: Maxilloturbinate, N:

Nasoturbinate, S: Septum, W: laterale Wand

1

Einleitung

1.1.1 Aufbau des respiratorischen Epithels

Das in der Nasenhöhle anterior gelegene respiratorische Epithel dient der

Erwärmung, Befeuchtung und Filtration der eingeatmeten Luft (Adams, 1972; Negus,

1956 und 58). Es besteht aus sechs morphologisch unterschiedlichen Zelltypen

(Abb.2): Cuboidal-, Bürsten-, Basal-, Becher-, ciliären und nichtciliären Säulenzellen

(Uraih und Maronpot, 1990).

Abb.2: Schematische Darstellung der Zelltypen des respiratorischen Epithels. (Uraih und Maronpot, 1990) Die sechs Zelltypen: Cuboidalzelle, Bürstenzelle, Basalzelle auf der linken und

Becherzelle, ciliäre und nichtciliäre Säulenzelle auf der rechten Seite. Zusätzlich ist die Basallamina,

die das Epithel basal begrenzt und die darunterliegende Lamina propria mit Fibroblasten und

Axonbündeln dargestellt.

Becherzellen produzieren den Mukus, eine dünne wässrige Schleimschicht, die das

Epithel feucht hält und schützt. Sie erstrecken sich von der Basallamina bis zum

nasalen Lumen und befinden sich hauptsächlich am Septum wo sie sich mit ciliären

Säulenzellen vermischen (Leeson, 1981; Bloom, 1975). Der Nukleus der

Becherzellen liegt basal, so dass apikal Raum für sekretorische Vesikel bleibt. Die

ciliären Säulenzellen sind ähnlich aufgebaut, besitzen jedoch Cilien (4 µm) und

Mikrovilli (1,2 µm) und dienen der Filtration der Atemluft. Sie befinden sich sowohl

am Septum als auch medial der Nasoturbinaten und Maxilloturbinaten (Monteiro-

Riviere und Popp, 1984).

2

Einleitung

Die Basalzellen sind kleine flache Zellen mit großem Nukleus. Sie liegen der

Basallamina direkt auf und treten nicht mit dem nasalen Lumen in Kontakt. Die

Basalzellen gelten als Vorläuferzellen des respiratorischen Epithels und besitzen das

Potential zur Proliferation und zur Differenzierung in Becher- und ciliäre Säulenzellen

(Puchelle und Peault, 2000; Inayama et al., 1989).

Die drei weiteren Zelltypen, Cuboidal-, Bürsten- und nichtciliäre Säulenzellen

besitzen alle Mikrovilli in unterschiedlichen Längen und sind fast ausschließlich auf

der Oberfläche der Conchien und der lateralen nasalen Wand zu finden (Monteiro-

Riviere und Popp, 1984). Die Funktionen dieser Zellen sind noch nicht genau geklärt.

1.1.2 Aufbau des olfaktorischen Epithels

Das olfaktorische Epithel liegt als Verbund einzelner Zellschichten in der Nasenhöhle

und besteht aus vier Zelltypen (Abb.3): Basalzellen, olfaktorischen

Rezeptorneuronen (ORN), Stützzellen und in geringem Umfang aus Phospholipase

C-β2 positiven Zellen (Mikrovillizellen; Anholt, 1993; Elsässer et al., 2005).

Abb.3: Schematische Darstellung des olfaktorischen Epithels.

OE: Olfaktorisches Epithel; LP: Lamina propria; C: Cilien der

Riechsinneszellen; MV: Mikrovilli der Stützzellen und PLC-β2

positiven Zellen; SZ: Stützzellen; RZ: Riechsinneszellen; BZ:

Basalzellen; BD: Bowman-Drüsen (verändert nach Anholt,

1993).

3

Einleitung

Dem Epithel liegt der Mukus auf, eine Schleimschicht (Menco and Farbman, 1992)

die für den Riechvorgang notwendige Elektrolyte und auch hydrophile olfaktorische

Bindeproteine enthält (Pelosi, 1994), welche die Diffusion der hydrophoben

Duftmoleküle zu den olfaktorischen Rezeptorneuronen erleichtern (Ache und

Restrepo, 2000). Er wird von unterhalb des Epithels liegenden flaschenförmigen

Drüsenzellen, den Bowman-Drüsen, sezerniert.

Oberhalb der Basallamina befinden sich die Basalzellen, welche neuronale

Stammzellen darstellen. Aus diesen gehen die darüber liegenden ORNs (Breipohl et

al., 1986; Carr und Farbman, 1993) hervor.

Riechsinneszellen haben eine ungewöhnlich kurze Lebensdauer von etwa vier

Wochen (Farbman, 1990). Da sie zeitlebens von den Basalzellen erneuert werden,

entsteht eine Mischung aus Riechsinneszellen verschiedener Reifegrade (Verhaagen

et al., 1989). Die unreifen ORNs befinden sich nahe der Basallamina und wandern

mit dem Grad ihrer Reifung in Richtung Stützzellen (Graziadei und Monti Graziadei,

1979; Caggiano et al., 1994; Weiler und Farbman, 1997). Deshalb befinden sich reife

Neurone direkt unterhalb der Stützzellen (Verhaagen et al., 1989). Riechzellen sind

primäre, bipolare Sinneszellen. Basal besitzen sie lange Axonfortsätze (Abb.4), die

sich zum Tractus olfactorius bündeln und durch das Siebbein direkt in den Bulbus

Abb. 4 Riechsinneszelle aus Rana pipiens

isoliert und eine vergrößerte Darstellung eines Knopfes mit Dendriten Differential-Interferenz Kontrastbild 1:100; c:

Cilien, d: Dendrit, s: Soma, a: Axon (S.J.

Kleene,. R.C. Gesteland, 1981)

4

Einleitung

olfaktorius projizieren. Hier werden die Informationen verarbeitet und an höhere

Gehirnareale gesendet. Apikal entspringt ein Dendrit, der sich bis zur Oberfläche des

Epithels erstreckt und in einem Dendritenknopf endet. Aus dem Dendritenknopf

reichen bis zu 20 Cilien (Abb.4), in denen die Signaltransduktion stattfindet, in den

Mukus. Die Cilien der Säuger besitzen eine Länge von ungefähr 50 µm (Finger et al.,

2000).

Den Abschluss des Epithels zur Nasenhöhle bildet eine palisadenartig angeordnete

Stützzellschicht (Menco and Jackson, 1997b; Pixley et al, 1997; Moran et al 1982b).

Die Stützzellen phagozytieren abgestorbene olfaktorische Neurone und puffern das

extrazelluläre Milieu (Trotier, 1998; Getchell und Mellert, 1991; Getchell und Getchell,

1982). Die PLC-β2-Zellen ähneln morphologisch den Stützzellen tragen aber nur

etwa 5 % zum Riechepithel bei. Es handelt sich wahrscheinlich neben den ORNs um

einen zweiten Typ chemosensorischer Zellen. Sie besitzen an ihrem anterioren Ende

Mikrovilli mit Rezeptoren für Geruchsstoffe, die einen zu den ORNs alternativen

Signalweg in Gang setzen (Sklar et al., 1986; Boekhoff et al., 1990; Ronnett et al.,

1993; Elsässer et al., 2005).

1.2 Die olfaktorische Signaltransduktion

Die olfaktorischen Rezeptorneurone sind für die Detektion der Duftstoffe in der

Atemluft und deren Umwandlung in elektrische Signale verantwortlich. Bindet ein

Duftstoff an einen Rezeptor wird die olfaktorische Signaltransduktion in Gang gesetzt

(Buck & Axel, 1991; Breer et al., 1994; Zufall et al., 1994; Freitag et al., 1998; Schild

& Restrepo, 1998). Die Interaktion eines Duftstoffes mit dem Rezeptor bewirkt eine

Konformationsänderung des Rezeptors, die zur Aktivierung der α-Untereinheit des

membranständigen G-Proteins, Golf (Jones & Reed, 1989; Firestein et al., 1991;

Menco et al., 1992; Zigman et al., 1993) führt. Diese stimuliert die Adenylatzyklase

Typ III (ACIII; Pace et al., 1985; Pfeuffer et al., 1989, Bakalyar & Reed, 1990), die

aus ATP cAMP synthetisiert, was für einen schnellen intrazellulären cAMP Anstieg

sorgt (Sklar et al., 1986; Breer et al., 1990; Lowe & Gold, 1993). Die hohe

Konzentration des sekundäreren Botenstoffes cAMP sorgt für das Öffnen zyklisch-

Nukleotid gesteuerter Kationenkanäle (CNG-Kanäle) in der Plasmamembran

(Nakamura & Gold, 1987; Firestein et al., 1991; Frings et al., 1992).

5

Einleitung

Abb.5: Modell der Signaltransduktion in den Cilien der olfaktorischen Rezeptorneurone von Landwirbeltieren: Schematische Darstellung des olfaktorischen Epithels (links) und der

Transduktionsmoleküle in der Cilienmembran der Ratte (rechts). Bei Stimulation wird die

cAMP-Synthese aktiviert und führt zur Öffnung von Kationenkanälen. Ca2+-Einstrom durch

diese Kanäle öffnet Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle, die den größten Teil des Rezeptorstroms

leiten. Die roten Linien bezeichnen Ca2+- abhängige Wege der Rückkopplungshemmung:

Aktivierung der Phosphodiesterase (PDE) und Hemmung der Kationenkanäle. Beide

Rückkopplungsprozesse werden durch Calmodulin vermittelt. R: Duftstoffrezeptor; Golf: G-

Protein; AC: Adenylatzyklase III; PDE: Phosphodiesterase, CaM: CaM-Kinase II.

Verändert nach: Frings (2001).

Aus dem Mukus können Na+- und Ca2+-Ionen durch die CNG-Kanäle ins ciliäre

Lumen strömen, wodurch die ORNs schwach depolarisieren. Aufgrund des erhöhten

Ca2+-Spiegels (Firestein & Werblin, 1989; Frings et al., 1995; Leinders-Zufall et al.,

1997; Leinders-Zufall, 1998) werden Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle geöffnet (Kleene &

Gesteland, 1991; Kleene, 1993; Kurahashi & Yau, 1993; Hallani et al., 1998) und es

kommt zu einem Cl--Einstrom, der etwa 80 % des Rezeptorstroms trägt (Lowe &

Gold, 1993; Kleene, 1997; Reuter D. et al., 1998; Reisert J. et al., 2003). Diese

Depolarisation führt schließlich zur Entstehung von Aktionspotentialen (Hedlund et

al., 1987; Lynch & Barry, 1989; Kawai et al., 1997; Duchamp-Viret et al., 1999).

6

Einleitung

Der Ca2+-gesteuerte Cl--Kanal ist bisher auf molekularer Ebene nicht charakterisiert.

Mit elektrophysiologischen Methoden konnten jedoch die biophysikalischen

Eigenschaften sehr genau untersucht werden (Reuter et al., 1998; Reisert et al.,

2003; Kaneko et al., 2006). Bestrophin-2 wurde nun kürzlich als möglicher Kandidat

für den Ca2+-aktivierten Cl--Kanal ins Spiel gebracht (Pfifferi et al., 2006). Jedoch

weichen die elektrophysiologischen Eigenschaften des Bestrophin-2 deutlich von den

Eigenschaften des Ca2+-aktivierten Cl--Kanals ab.

Um eine höhere Auflösung von Duftstoffimpulsen zu erzielen, besitzt die

Riechsinneszelle mehrere Adaptionsmechanismen. Zum einen bildet Ca2+ mit

Calmodulin einen Komplex, der an die Calmodulin-Bindestellen der CNG-Kanäle

bindet und deren Affinität für cAMP drastisch sinken lässt (Chen und Yau, 1994; Liu

et al., 1994; Balasubramanian et al., 1996; Frings et al., 1999; Bradley et al., 2004).

Dies wird als schnelle Adaption bezeichnet. Zum anderen wird die Adenylatzyklase

Typ III durch die Ca2+-Calmodulin abhängige CaM-Kinase II phosphoryliert und somit

inaktiviert (Wayman et al., 1995; Wei et al., 1998). Zusätzlich aktiviert der Ca2+-

Calmodulin-Komplex eine Phosphodiesterase (PDE), die den sekundären Botenstoff

cAMP abbaut (Borisy et al., 1992; Yan et al., 1995). Durch Phosphorylierung der

Adenylatzyklase wird vorübergehend kein cAMP mehr gebildet und bestehendes wird

durch die PDE abgebaut.

1.3 Ziel der Arbeit

Das Ziel dieser Diplomarbeit ist es einen Beitrag zur molekularen Identifizierung des

Ca2+-aktivierten Cl--Kanals zu leisten.

Hierzu wurde die Methode der in situ Hybridisierung mit Hilfe von Markerproteinen

der ORNs und der Stützzellen etabliert um weiterführend Proteine auf ihre

zellspezifische Expression im olfaktorischen Epithel analysieren zu können.

Während dem Verlauf der Arbeit erschien eine Publikation (Pfifferi et al., 2006), die

Bestrophin-2 als Ca2+-aktivierten Cl--Kanal beschreibt. Deshalb wurde zusätzlich die

Expression von Bestrophin-2 im olfatoktorischen und respiratorischen Epithel

untersucht um diese Behauptung zu untermauern oder entkräften.

7

Material und Methoden

2 Material und Methoden

2.1 Geräte

Binocular SMZ800, Nikon

Fluoreszenzbinocular MZFL3, Leica

Fluoreszenzlampen ebq100, Nikon

EXFO, Nikon

Fluoreszenzmikroskop Eclipse 90i, Nikon

Hybridisierungsofen SI 20 H, Stuart Sientific

Kamera DXM1200F, Nikon

DS-1QM, Nikon

Kryostat CM 3050 S, Leica

Kühlzentrifuge Z 323 K, Hermle

Lichtmikroskop Axivert 200, Zeiss

Mikrotom Ultramikrotom, Leica

PCR Maschine T personal, Biometra

T gradient, Biometra

Photometer Lambda 25, Perkin-Elmer

Ultraspec Plus, LKB Biochrom

8


2.2 Verbrauchsmaterialien

Deckgläser Roth, Menzel

Mikrotommesser Leica

Kryostatmesser Leica

Objektträger SuperFrost Plus, Menzel-Gläser

SuperFrost Plus Gold, Menzel-Gläser

SuperFrost Excell, Erie Scientific

Company

Adhäsiv-Objektträger, Menzel-Gläser

SuperFrost, gelatinisiert

SuperFrost, Poly-L-Lysin

PAP-Pen Super HT, Polysiences

2.3 Reaktionskomplettausstattungen

NucleoSpin Extract II® Macherey-Nagel

pGEM®-T and pGEM®-T Promega

Easy Vector Systems

NucleoSpin Plasmid® Macherey-Nagel

RevertAid™

First Strand cDNA Synthesis Kits MBI Fermentas

GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit MBI Fermentas

Plasmid Midi Kit Qiagen

2.4 Chemikalien

Alle laborüblichen Chemikalien wurden in p.A.-Qualität von den Firmen Merck KGaA

(Darmstadt), Carl Roth GmbH (Darmstadt), Serva Feinbiochemika GmbH

(Heidelberg), Sigma Aldrich Chemikalien GmbH (Deisenhofen), Boehringer

Mannheim GmbH oder J.T Baker bezogen. Alle eingesetzten Zweit-Antikörper

wurden von der Firma Sigma Aldrich Chemikalien GmbH (Deisenhofen) erworben.

9

https://www.macherey-nagel.com/web%5CMN-WEB-BioKatalog.nsf/Webframes/NSEXTRACTII



https://www.macherey-nagel.com/web%5CMN-WEB-BioKatalog.nsf/Webframes/DKUL-4KZJXD




Wasser wurde stets aus einer MilliQ-UV-Plus-Anlage der Firma Millipore (APS Water

Services Inc., Van Nuys, CA, USA) verwendet, die mit VE-Wasser gespeist und bei

einem ohm`schen Widerstand von 18,2 MΩ entnommen wurde.

2.5 Puffer, Lösungen und Medien

2.5.1 Puffer und Lösungen für die Histologie

Paraformaldehydlösung 4 % (w/v) Paraformaldehyd

1 x PBS

10 x PBS 1370 mM NaCl

27 mM KCl

15 mM KH2PO4

81 mM Na2HPO4

pH 7,4

10 % Saccharose-Lösung 10 % (w/v) Saccharose

0,5 % (w/v) NaN3

1 x PBS

30 % Saccharose-Lösung 30 % (w/v) Saccharose

0,5 % (w/v) NaN3

1 x PBS

DAPI-Lösung 90 µM 4,6-Diamidino-2-phenylindol

1 x PBS

10


2.5.2 Puffer und Lösungen für die Molekularbiologie

Antibiotika-Stocklösungen Ampicillin, 50 mg/ml

Carbenicillin, 50 mg/ml

10 x PBS 1370 mM NaCl

27 mM KCl

15 mM KH2PO4

81 mM Na2HPO4

pH 7,4

50 x TAE 40 mM Tris-Acetat

1 mM EDTA, pH 8,0

5 x MOPS-Laufpuffer 0,1 M 3-[N-Morpholino-]propansulfonsäure

40 mM Na-Acetat

5 mM EDTA pH 8,0

20 x SSPE 3 M NaCl

0,2 M NaH2PO4-H2O

0,5 M EDTA

pH 7,4

20 x SSC 3 M NaCl

0,3 M tri-Na-citrat

pH 7,0

11


RNA-Isolationslösung 4 M Guanidiumthiocyanat

(Solution D) 25 mM NaCitrat

0,5 % N-Lauroylsarcosine (w/v)

0,1 M ß-Mercaptoethanol

Farbentwickler (NBT/BCIP) 0,1M Tris/HCl

0,1M NaCl

5 mM MgCl2

0,1 % Tween-20 (v/v)

1 mM Levamisole

pH 9,5

5 x Ladepuffer 50 % Glycin (v/v)

1 mM EDTA pH 8,0

0,1 % (w/v) Bromphenolblau

0,1 % (w/v) Xylencyanol

50 x Denhardts 1 % (w/v) BSA

1 % (w/v) Ficoll-400

1 % (w/v) Polyvinylpyrrolidon

Prähybridisierungslösung 25 % 5 x SSC (v/v)

10 % 1 x Denhardts (v/v)

50 % Formamid (deionisiert) (v/v)

0,1 % Tween-20 (v/v)

5 µg Heringssperma-DNA

12


Hybridisierungspuffer 25 % 5 x SSC (v/v)

10 % 1 x Denhardts (v/v)

50 % Formamid (deionisiert) (v/v)

5 µg Heringssperma-DNA

RNA-Sonde (siehe in situ Hybridisierung)

PBT 1 x PBS

0,5 % (w/v) BSA

0,1 % (w/v) Triton X-100

Proteinase K Puffer 50 mM Tris/HCl

5 mM EDTA

pH 8,3

Blocklösung 5 % BSA (w/v) in PBT

2.5.3 Bakterien-Medien

LB- Medium (Luria Bertani) 10 g/l Trypton

5 g/l Hefeextrakt

10 g/l NaCl

pH 7,5

Für LB-Agar 15 g/l Agar hinzufügen.

TY–Medium 2 % Trypton (w/v)

0,5 % Hefeextrakt (w/v)

0,51 % MgSO4 (w/v) * 7 H2O

0,058 % NaCl (w/v)

pH 7,0

13


SOB–Medium 2 % Bactotrypton (w/v)

0,5 % Hefe (w/v)

0,58 g/l NaCl (w/v)

0,19 g/l KCl (w/v)

ad 1000 ml H2O

SOC–Medium SOB

+ 1 % 1 M MgCl2 (sterilfiltriert) (w/v)

+ 1 % 1 M MgSO4 (sterilfiltriert) (w/v)

+ 1 % 2 M Glucose (sterilfiltriert) (w/v)

2.6 Bakterien Stämme

XL1–blue (Stratagene) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44

relA1 lac[F´proAB laclqZ∆M15Tn10(Tetr)]

2.7 Bakterien Vektoren

pGEM®-T Promega

Abb. 6: pGEM-T Vektor

14


pGEM®-T Easy Promega

Abb. 7: pGEM-T Easy Vektor

2.8 Primer

Die Primer (Tab.1-3) wurden mit dem der Oligo® Primer Analysis Software 5.0 der

Firma Molecular Biology Insights generiert und von der Firma Thermo in Heidelberg

synthetisiert.

Tab. 1: Die Bestrophin-Genfamilie:

Kandidat Sequenz Primer forward

Sequenz Primer reverse

Produktlänge

Best 1 5' GGA GGG CAA GGA

CGA GCA AG 3´

5' AGC CCA TGA AGG

ATT GTC GGT 3'

743 bp

Best 2 5' CCG CCT ATC GCT

TCT TAC TGG 3'

5' CAG CAA GGT GAA

GAT CGG AAT G 3'

695 bp

15


Tab. 2: Marker für ORNs und Stützzellen:



Produktlänge

CNG-A2 5' GGC CAA CAA GAA

TTT CCG TGA A 3'

5' GTA GTC CAG CAC

CAG CCA TAC CA 3'

332 bp

CNGA2

long

5' AAT GAA GTC GCA

GCT AGT ATG G 3'

5' ATG CCT TGG GAG

ACA GTT TAG 3'

717 bp

Crb-2 5' CGT GAC GCG AAC

CAA TGC 3'

5' GCG GGG TCT GGA

GAT CAG TT 3'

709 bp

GAPDH 5' ATG ACA ACT TTG

GCA TCG TGG AA 3'

5' GGT TTC TCC AGG

CGG CAT GT 3'

262 bp

Golf 5' ACC CTG AGA ACC

AGT TTC GGT CA 3'

5' TCT GGC CTC CAA

CGT CAA ACA 3'

321 bp

Golf long 5' TGG TGA TCC GGG

AAG ATA ACA A 3'

5' CCA GAG GGT GAT

ACG GGG ATA C 3'

711 bp

OMP long 5' AGT GGT GGC AGT

GGC AAC A 3'

5' ACA CCA CAG AGG

CCT TTA GGT T 3'

514

Tab. 3: Kandidatenprimer aus dem Proteomprojekt:



Produktlänge

K1 5' AAC CAA AGG TCT

TCC CCA TAA A 3'

5' ACT TCC CAA CCA

TCT TGA ACA G 3'

319 bp

K5 5' GGT CTC TTG GCT

GAC AGA TAT GG 3

5' GTG ATG GAA AGG

CTT AGT CGT CT 3'

824 bp

K6 5' CAC AGT TTA TTG

CTC CGC TTT GT 3'

5' GGA CCC CTA TCC

GAA TTA CCA G 3'

712 bp

K8 5' TTG GCT ACT TTG

AAG GTG CAA G 3'

5' GCC ACA AGG ACA

ATG TCA TAG AA 3'

716 bp

K11 5’ TTG GCT ACT TTG

AAG GTG CAA G 3’

5’ GCC ACA AGG ACA

ATG TCA TAG AA 3’

716 bp

16


K13 5’ CCA GTT CAC ACT

CAA GCC TAT 3’

5’ TGA TTG TAT TTC

TCT AGG TCG AA 3’

666 bp

K16 5’ GCT GAG GTT TAC

TTC GCA CAG T 3'

5’ CAG CTT TGG CAC

ATC GTC TAC 3'

282 bp

K20 5’ CCT CTA CTC TGA

CCG CTA CAC CA 3’

5’ CAG CGT AGG AAG

AAG GGT AGG A 3’

743 bp

K22 5' TGT TGG CAT TAA

CAT GGG CAT AT 3'

5' CGG GTA TCA GTG

GGA GTT ATG GT 3'

652 bp

K23 5' TGA TTT GAA AAC

GAA GTC CGA GA 3'

5' CAC CCG CAT TGA

CGT TCT T 3'

728 bp

K24 5' GGC ACG AGG AGT

CGC AAG T 3'

5' TGA TGT GAA GCT

TGG GTA AGA GG 3'

681 bp

K25C 5' AAC TGA AGA CCT

TCG CAC CT 3'

5' CCT CAT TAA TCT

CTG GAG AGT TTG 3'

749 bp

K25N 5' GTA TTA CCA CCT

ACC CGT GAA GC 3'

5' TCT CTG AAT TTT

GAG GCG TCT C 3'

746 bp

K26 5' ATT ATG CAT CTA

AGC TTG GGG ACG A 3'

5' TGT CTC CAA CAT

GTC TTC AAC TGC C 3'

746 bp

K27C 5’ GGT GGA GAA GGA

GGC GGA AAC 3’

5’ GTG TGG AGA GGA

GGA GCA CTC TG 3’

504 bp

K27N 5' AGA GGA CAC TAC

TGC TGC TCG GT 3'

5' TTG AAG ATG AGG

GCC TTG TCA TAG 3'

408 bp

K28 5' CGT TTT CTA GCG

AAG TCC CAC 3'

5' GCT CTT CTA TCT

GGC GCT CC 3'

732 bp

K29 5' GCT CTG CAC CAG

CTG TAC CTC 3'

5' GAT GCG CAC GTT

CTT GAG TT 3'

630 bp

K30 5' GGA CAG TGT GCA

GAG GAA CGG 3'

5' TGT GTG GGA TGC

TCA GGG TAC T 3'

767 bp

K31 5' GGA CAA CGA CGA

CGA CGA GC 3'

5' GGC CAG TTT GTG

GAT AAC CCA A 3'

747 bp

17


2.9 Tiere Als Versuchstiere wurden weibliche Wistar-Ratten verwendet. Die Ratten stammten

vom Zentralen Tierlabor (ZTL) der Universität Heidelberg und wurden dort unter

standardisierten Bedingungen in einem vollklimatisierten Raum bei künstlichem Tag-

Nacht-Rhythmus gehalten.

Es wurden drei Wochen alte Wistar-Ratten für die Präparation von Nasen und ein

Jahr alte für die Präparation der Conchien verwendet. Die Nasen dienten für

Gewebeschnitte, die Conchien für die RNA-Isolierung.

OMP-GFP-Mäuse des M55/Cre7-Stammes (Potter et al., 2001) wurden

freundlicherweise von Priv.-Doz. Dr. Jörg Strotmann (Universität Hohenheim) zur

Verfügung gestellt.

2.10 Präparation des olfaktorischen Epithels für Nasengewebeschnitte Vor der Gewebepräparation wurden die Tiere durch eine CO2-Begasung getötet und

dekapitiert. Daraufhin wurden das Fell und der Unterkiefer vom Kopf entfernt, sowie

der posteriore Teil des Oberschädels durch einen koronalen Schnitt hinter dem

Siebbein abgetrennt. Die Nasenspitze wurde posterior der Schneidezähne koronal

abgetrennt, um das Abstumpfen der Stahlmesser am harten Dentin der

Schneidezähne zu vermeiden. Weiterhin wurde durch einen Sagitalschnitt des

Schädeldachs von posterior nach anterior über das Siebbein hinweg ein Zugang zur

Nasenhöhle geschaffen. Dies ist nötig um der Luft das Entweichen und dem Fixativ

das Eindringen in die Nasenhöhle zu ermöglichen. Die gesamte Präparation erfolgte

bei Raumtemperatur.

2.10.1 Herstellung beschichteter Objektträger

• Gelatine beschichtete Objektträger

SuperFrost Objektträger (Menzel) wurden über Nacht in 100 % Ethanol gelagert. Am

nächsten Tag wurden diese in destilliertem Wasser gewaschen und in 0,5 % Gelatine

(w/v) bei 40-50°C gegeben. Nach 2-3 h wurden die Objektträger aus dem

18


Gelatinebad genommen und für mindestens 5 h bei 60°C getrocknet. Die

Objektträger wurden in Aluminiumfolie eingepackt um sie vor Staub zu schützen.

• Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger

Die Objektträger SuperFrost (Menzel) wurden ebenfalls in 100 % Ethanol gelagert,

im Inkubator bei 60°C getrocknet und dann in eine 0,1 mg/ml Poly – L – Lysinlösung

überführt. Am nächsten Tag wurden die Objektträger für 1-2 h bei 40°C im Inkubator

getrocknet.

2.10.2 Fixierung für Paraffinschnitte Die Fixierung dient dem Erhalt der Gewebestruktur und sorgt dafür, dass die mRNA-

Transkripte an Ort und Stelle verbleiben. Als Fixationsmittel wurde Paraformaldehyd

benutzt. Die präparierten Nasenhöhlen der Tiere wurden für 2 Tage bei 4 °C in 4 %

Paraformaldehyd fixiert.

2.10.3 Entwässerung des Gewebes Zur Entwässerung wurde eine aufsteigende Alkoholreihe (3 x 20 min. 70 % Ethanol,

je 2 x 30 min. 80 %, 90 %, 96 % Ethanol und 100 % Isopropanol) benzutzt. Es folgte

eine 8-, 16- und 3 stündige Behandlung mit dem Intermedium Methylbenzoat um

Wasser vollständig zu entfernen.

2.10.4 Paraffineinbettung Die entwässerten Objekte wurden in das wasserunlösliche Medium Paraffin

eingebettet, welches ein Gemisch aus aliphatischen Kohlenwasserstoffen ist. Die

präparierten Tiere wurden zuerst 3,5 Std., dann nochmals über Nacht in flüssigem,

57 °C warmem Paraplast (Tyco Healthcare Group LP, Mansfield) getränkt. Die

Einbettung erfolgte in geschmolzenem Paraplast in vorgewärmten Gießformen. Nach

Abkühlung auf einer 4°C Platte erstarrt das Paraplast und das Präparat ist zum

Schneiden bereit.

19


2.10.5 Schneiden der Paraffinblöcke Die eingebetteten Präparate wurden mit einem Schlittenmikrotom geschnitten. Ein

Stahlmesser wurde hierbei über das jeweilige Präparat hinweggeführt. Es wurden

bei Raumtemperatur Schnitte mit einer Dicke von 8 - 16 µm angefertigt. Diese

wurden im Wasserbad GFL 1052 bei 40 °C gestreckt und anschließend auf

Objektträger aufgezogen. Die Objektträger wurden in einem Wärmeschrank

(Heraeus) 5 h bei 50°C getrocknet und bis zur weiteren Verarbeitung staubfrei bei

Raumtemperatur gelagert.

2.10.6 Fixierung für Kryoschnitte Der Schädel des jeweiligen Präparates wurde zunächst in 1 x PBS gewaschen, um

Blutreste und Verunreinigungen zu entfernen. Danach wurde durch Inkubation in 4 %

Paraformaldehyd für 40 min fixiert. Die verbleibende Luft in der Nasenhöhle wurde

durch Anlegen eines Unterdrucks mittels Exsikkator entfernt. Nach Auswaschen des

Paraformaldehyds mit 1 x PBS (3 x 5 min.) wurde das Gewebe in einem

ansteigenden Saccharose-Gradienten entwässert: Zunächst 2 - 3 h Inkubation in

10 % Saccharose-Lösung bei Raumtemperatur und schließlich über Nacht in 30 %

Saccharose-Lösung bei 4°C. Die Präparate wurden mit einer 30 % Saccharose:

TissueTek Lösung (Sakura, Gießen) im Verhältnis 1:2 übergossen und bei -20°C in

TissueTek eingebettet, bevor sie dann bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert wurden.

2.10.7 Anfertigung der Kryostatschnitte Die Kryostatschnitte wurden am Kryostat CM3050 S (Leica) mit einem Stahlmesser

bei -20°C angefertigt. Die Schnittdicke betrug 8 - 20 µm.

20


2.11 Molekularbiologische Methoden

2.11.1 Arbeiten mit RNA Beim Arbeiten mit RNA dürfen die Gebrauchsgegenstände nicht mit aktiven RNasen

kontaminiert sein. Zur Inaktivierung von RNasen wurden deshalb folgende

Vorkehrungen getroffen: Glaswaren oder andere hitzebeständige Materialien wurden in einem Wärmeschrank

(Heraeus) für mindestens 4 h bei 180°C inkubiert.

Lösungen und Puffern wurde Diethylpyrocarbonat (DEPC) im Verhältnis 1:1000

zugesetzt, anschließend über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und danach 30

min autoklaviert. DEPC zerfällt dabei zu Kohlenstoffdioxid und Ethanol. Lösungen,

die Substanzen mit Aminogruppen wie TRIS oder MOPS enthalten, dürfen nicht mit

DEPC behandelt werden. Diese wurden mit RNase-freien Chemikalien, mit DEPC–

vorbehandeltem Wasser und ausgeglühtem Spatel angesetzt.

Hitzeempfindliche Gegenstände wurden mit 0,1 M NaOH oder RNase AWAY

(Molecular BioProducts) behandelt. Die Inkubationsdauer lag bei 30 min. Danach

wurde das Material mit DEPC behandeltem Wasser abgespült.

2.11.2 RNA-Isolierung Zur Isolierung von RNA aus dem Riechepithel der Ratte wurde die „single step“

Methode (Chomczynski und Sacchi, 1987) durchgeführt. Das Gewebe wurde in

einem Glashomogenisator aufgebrochen, die RNasen mit Guanidiumthiocyanat

inaktiviert und mittels Phenol/Chloroform- und Alkoholfällung wurde die RNA aus

dem Lysat ausgefällt.

100 mg Riechgewebe wurde mit 1 ml Solution D versetzt und mit einem

Homogenisators für 5 min auf Eis lysiert. Nach Zugabe von 100 µl/ml 2 M

Natriumacetat pH 4, 500 µl/ml Phenol pH 4,5–5 und 200 µl/ml

Chloroform/Isoamylalkohol wurde gründlich homogenisiert und 15 min auf Eis

inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation bei 14000 g für 15 min bei 4°C. Die wässrige

Phase wurde in ein RNasefreies Gefäß überführt. Dieser Schritt wurde einmal ohne

Zusatz von Natriumacetat wiederholt. Zur RNA-Fällung wurde der wässrigen Phase

Isopropanol im Verhältnis 1:2 zugegeben und für 60 min bei -70°C inkubiert. Nach

21


einer 20 minütigen Zentrifugation bei 13000 g und 4°C wurde das Pellet in 100 µl

Solution D gelöst. Es folgte eine weitere Isopropanolfällung. Das Pellet wurde mit

75 % Ethanol gewaschen, nochmals abzentrifugiert und schließlich luftgetrocknet.

Der Niederschlag wurde in 20-50 µl DEPC-H2O resuspendiert. Die Reinheit und

Konzentration der so gewonnenen RNA wurde photometrisch bestimmt.

2.11.3 Konzentrationsbestimmung und RNA-Spektrum

RNA hat sein Absorbtionsmaximum bei 260 nm. Mit einem Spektrometer (Perkin

Elmer, Lamda 25 UV/VIS Spektrometer) wurde die Absorbtion der Lösung bei 260

nm gemessen und die RNA-Konzentration berechnet. Eine OD260 = 1 hat eine RNA-

Konzentration von 40 µg/ml. Des Weiteren war eine Aussage über die Reinheit der

Probe mit einem Spektrum von 220-320 nm möglich, da das Absorbtionsmaximum

von Phenol bei 220 nm und das von Proteinen bei 280 nm liegt.

2.11.4 Denaturierende RNA-Agarosegel-Elektrophorese Für ein 1 %-iges Gel wurde 1 g Agarose in 62,1 ml DEPC-H2O aufgekocht, auf 60°C

abgekühlt, 20 ml 5 x Laufpuffer (0,1 M MOPS ( 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure )

pH 7,0, 40 mM Natriumacetat, 5 mM EDTA pH 8,0) und 17,9 ml 37 % Formaldehyd

zugegeben und in einen Agarosegelschlitten gegossen. Zur Probenvorbereitung

wurden je 6 μl RNA Probe, die zuvor für 15 min bei 65°C denaturiert wurde und 6µl 2

x RNA-Ladepuffer (2 x Loading Dye Solution, Fermentas) in die Taschen des Gels

pipettiert. Die Gelelektrophorese erfolgte in 1 x Laufpuffer bei 5 V/cm und wurde

gestoppt, sobald der Farbmarker 2/3 des Gels durchlaufen hatte. Abschließend

wurde 30 min mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid in 0,1 M Ammoniumacetat gefärbt und

die RNA auf einem UV-Transluminator überprüft.

22


2.11.5 Die cDNA-Synthese Um aus RNA cDNA zu synthetisieren wurde der RevertAid™ H Minus First Strand

cDNA Synthesis Kit (Fermentas) verwendet. Es wurden 5 µg RNA und 0,2 µg eines

random Hexamer-Primers eingesetzt und auf 12 µl mit DEPC-H2O aufgefüllt. Der

Ansatz wurde 5 min bei 70°C inkubiert und dann auf Eis abgekühlt. 4 µl 5 x

Reaktionspuffer, 20 Units RiboLock™ Ribonuclease Inhibitor und 10 mM dNTPs

wurden zugegeben. Nach einer Inkubation von 5 min bei 25°C wurden 200 Units der

RevertAid™ H Minus M-MuLV Reverse Transkriptase hinzugefügt und nochmals 10

min bei 25°C und 60 Minuten bei 42 °C inkubiert. Dieses Enzym ist in der Lage die

RNA-Stränge revers zu transkribieren und aufgrund der geringen RNase H Aktivität

den RNA-Strang nicht abzubauen. Die Reaktion wurde bei 70°C für 10 min gestoppt.

2.11.6 Polymerasekettenreaktion (PCR) Zur Amplifikation von DNA wurde die Polymerasekettenreaktion benutzt. Ein

Reaktionsansatz setzte sich folgendermasen zusammen (Tab.4)

Tab. 4: Reaktionsansatz einer PCR

1 µg Template DNA

0,75 µl dNTPs 10 mM

1 µl Primer 1 (vorwärts) 10 pmol

1 µl Primer 2 (rückwärts) 10 pmol

5 µl Taq-Puffer (10x)

0,5 µl Taq Polymerase 2,5 U (Axon)

2 µl MgCl2 25 mM

Ad 50 µl H2O

23


Die PCR fand unter folgenden Bedingungen statt:

Standard PCR-Programm

94°C 2’

24

94°C 30’’

58°C 30’’ 30 Zyklen

72°C 90’’

72°C 8’

4°C bis damit weitergearbeitet wurde.

2.11.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen Nach Auftrennung der DNA-Fragmente mittels Agarosegelelektrophorese kann die

gewünschte DNA aus dem Gel extrahiert werden. Der NucleoSpin® Extract II Kit von

Macherey-Nagel wurde hierzu verwendet.

Das DNA-Fragment wurde mit einem sauberen Skalpell aus dem Gel

ausgeschnitten. Zu 100 mg Agarose wurde 200 µl Puffer NT gegeben, 10 min bei

50°C inkubiert und in 3 minütigen Abständen gevortext bis die Agarose verflüssigt

war. Die Probe wurde auf die Säule gegeben und 1 min bei 11000 g zentrifugiert. Der

Überstand wurde abgenommen und die Säule mit 600 µl NT3 gewaschen. Nach

einer einminütigen Zentrifugation bei 11000g wurde der Überstand wiederum

abgenommen und 2 min bei 11000 g zentrifugiert um letzte Flüssigkeitsreste zu

entfernen. Da im Puffer NT3 Ethanol enthalten ist, wurde die Probe für 2-5 min auf 70

°C erwärmt um mögliche Ethanolverunreinigungen zu entfernen. Die DNA wurde

daraufhin in 15-50µl Elutionspuffer NE eluiert.


2.11.8 Klonierung

• Klonieren von PCR-Produkten mit AT-Überhängen

Clark (1988) konnte zeigen, dass die Taq-Polymerase während einer PCR keine

Fragmente mit glatten Enden produziert, sondern einen Überhang von Adenin

schafft. Die von der Taq-Polymerase amplifizierten PCR-Fragmente lassen sich

deshalb in einen offenen Vektors mit Thymin-Überhängen klonieren. Diese Methode

wird auch als TA-Klonierung bezeichnet. Zur Herstellung von Klonen wurde der

pGEM®-T beziehungsweise pGEM®-T Easy Vector (Abb.1 + 2) der Firma Promega

verwendet.

• Ligation

Als Ligation bezeichnet man die Verknüpfung des Inserts mit einem Vektor. Es wird

ein offener Vektor, ein Insert (mit kompatiblen Enden) und eine Ligase, die die

Veresterungsreaktion katalysiert, benötigt. Die Reaktion wurde mit der pGEM®-T

beziehungsweise pGEM®-T Easy Vector Reaktionskomplettausstattung, nach

Angaben des Herstellers, durchgeführt (Tab.5).

Tab. 5 Reaktionsansatz der Ligation

5µl 2xRapid Ligation Buffer

1µl (50 ng) pGEM®-T (Easy) Vector

3µl PCR-Produkt (Konzentration

war immer unterschiedlich)

1 µl T4 Ligase (3 Units)

Die Inkubationszeit betrug 1 h bei Raumtemperatur.

• Transformation

Nach der Ligation wurde der Vektor mit Insert zur Vermehrung in E.coli-Bakterien

überführt. Dieser Vorgang wird als Transformation bezeichnet.

Es wurden elektrokompetente XL1–blue Zellen mittels Elektroporation (EasyjecT

Plus von EquiBio) transformiert. Die XL1–blue Zellen wurden auf Eis aufgetaut, SOC-

Medium auf 37°C erwärmt und Küvetten auf Eis bereitgestellt. 1-2 µl des

Ligationsansatzes wurden zu 50 µl XL1–blue Zellen gegeben und bei 2500 Volt,

einem ohmschen Widerstand von 201 Ω, einer Kapazität von 25 µF und einer 25


Pulsdauer von 5 µs elektroporiert (V=2500, R=0201, C=0025, T=0005). Die

Bakterien wurden daraufhin schnellstmöglich in 1 ml SOC-Medium aufgenommen

und für 1 h bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert.

Anschließend wurde ein Teil des Bakterienansatzes auf Agarplatten gegeben, die

sowohl mit einem selektiven Antibiotikum (Carbenicillin) als auch mit IPTG und X-Gal

(Blau-Weiß-Selektion) versetzt waren. Aufgrund dieser Selektionen war es möglich

die Bakterien zu identifizieren, die den Vektor aufgenommen haben.

• Kolonie-PCR

Die Kolonie-PCR wurde zur Detektion von Insert-Fragmenten benutzt. Dabei wird ein

Bakterienklon von einer Plattenkolonie zum PCR-Ansatz gegeben, um das gesuchte

Fragment mit Hilfe geeigneter Primer zu amplifizieren.

Zur Durchführung der PCR wurde Zellmaterial von Einzelkolonien mit einem sterilen

Zahnstocher direkt in das vorbereitete PCR-Reaktionsgemisch (Tab. 4) gegeben. Die

PCR fand unter den oben beschriebenen Standartbedingungen statt.

2.11.9 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli

• Minipräparation (Plasmid-Isolation aus E.coli-Bakterien)

Die Plasmid-Isolation im kleinen Maßstab (5 ml Übernachtkultur) wurde mit dem

NucleospinTM Plasmid Purification Kit von Machery-Nagel nach Angaben des

Herstellers durchgeführt. Die Plasmid-DNA wurde in 50 µl TE eluiert

• Midipräparation (Plasmid-Isolation aus E.coli-Bakterien)

Die Plasmid-Isolation im großen Maßstab (50 ml Übernachtkultur) wurde mit dem

QIAGEN Plasmid Midi Kit, laut Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Plasmid-

DNA wurde in 500 µl TE eluiert.

26


2.11.10 DNA-Sequenzierung Die DNA-Sequenzierungen wurden von der Firma Seqlab Göttingen durchgeführt. Es

wurden 20 pmol des Sequenzierprimers mit 600 ng der zu sequenzierenden DNA in

ein 0,2 ml Reaktionsgefäß gegeben und auf 7 µl mit H2O aufgefüllt.

2.11.11 Lagerung von Klonen (Glycerinstock) Für die Lagerung von Klonen wurden 600 µl Flüssigkultur des jeweiligen Klons

verwendet und mit 200 µl Glycerin (80%) versetzt. Nach gutem Durchmischen wurde

die Probe in flüssigem N2 schockgefroren und bei -70°C aufbewahrt.

2.11.12 In vitro Transkription RNA-Sonden (Tab. 7) werden durch in vitro Transkription klonierter DNA-Fragmente

hergestellt. Hierfür wurden die Transkriptionsvektoren pGEM®-T und pGEM®-T Easy

der Firma Promega verwendet.

Die Vektoren pGEM®-T beziehungsweise pGEM®-T Easy (Abb. 6 + 7) wurden einmal

stromaufwärts des Inserts mit den Restriktionsenzymen NotI oder SacI und in einem

anderen Ansatz stromabwärts mit ApaI, SphI oder NcoI verdaut. Der aufgereinigte

linearisierte Vektor wurde als Template in einer Konzentration von 1 µg dem

Reaktionsansatz zugegeben (Tab. 6) und mit dem Enzym SP6 oder T7 (Abb. 6 + 7),

je nach Schnittstelle, versetzt. So entstehen sense (Negativkontrolle) und antisense

(Sonde) Strang. Der DIG-RNA-Labeling Mix (Roche) lieferte die

Nukleotidtriphosphate, wobei etwa 1/3 der UTPs ein Digoxygeninmolekül, ein

Glycosid aus dem Roten Fingerhut (Digitalis purpurea), gebunden hat. Der RNase-

Inhibitor RiboLock™, die Polymerasen SP6 beziehungsweise T7 und der 5 x

Reaktionspuffer wurden von MBI Fermentas bezogen.

27


Tab. 6: Reaktionsansatz für die in vitro Synthese von RNA-Sonden

Volumen Konzentration

Geschnittener Vektor X µl 1 µg

5 x Puffer 10 µl

RiboLock™ 2 µl 80 Units

DIG-RNA-Labeling Mix 2 µl 10 mM/Nukleotidart

Polymerase SP6/T7 2 µl 40 Units

DEPC-H2O Ad 50 µl

Die Substanzen des Reaktionsansatzes wurden in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß

gegeben und für 2 h bei 37°C inkubiert. 2 Units DNase 1, RNase-frei (MBI

Fermentas), verdaute in 15 Minuten bei 37°C die eingesetzte Plasmid-DNA. Die

Enzymreaktion wurde mit 5 µl 0,2 M EDTA-Lösung pH 8, welche die für die

Polymerasen nötige Mg2+ Ionen bindet, gestoppt.

112,5 µl einer alkalischen Hydrolyse-Lösung (5µl 1 M DTT, 40µl 1 M NaHCO3, 60µl 1

M Na2CO3, 395µl DEPC-H2O) sorgte für eine Hydrolyse der RNA-Sonden in etwa

200 Basen lange Fragmente. Die Inkubationszeit betrug 45 min bei 60°C. Die

Reaktion wurde durch Abkühlen auf 4°C gestoppt und mit 112,5 µl eines

Neutralisationspuffers (5µl 1 M DTT, 5 µl CH3COOH, 100 µl Na(CH3COO), 390 µl

DEPC-H2O) neutralisiert.

Die RNA-Sonden wurden mindestens 1 h lang durch Zugabe von 28,4 µl

Lithiumchlorid und 750 µl Ethanol bei -80°C ausgefällt. Nach Zentrifugation bei

13000g für 20 min bei 4°C wurde das RNA-Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen,

abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet luftgetrocknet. Die RNA-

Sonden wurden in 30 µl Formamid (deionisiert) und 5 x SSC (im Verhältnis 3:1)

aufgenommen und bei -70°C gelagert. Die Sonden, die aus dem Antisense-Strang

der DNA entstanden sind, wurden als Negativkontrolle benutzt.

28


Tab. 7: Hergestellte RNA-Sonden als Marker für ORNs und Stützzellen

Sondenname Beschreibung

OMP (olfaktorisches Markerprotein) Lösliches Protein in ORNs, Aufgaben

unbekannt

CNG-A2 Membranprotein, Untereinheit des

olfaktorischen CNG-Kanals

Golf Membranständiges Protein, olfak-

torisches G-Protein

Crb-2 (Carbonyl reductase 2) Lösliches Protein in den Stützzellen

Sowohl die Negativkontrollen als auch weitere hergestellte RNA-Sonden der Best-

familie sind nicht aufgeführt.

2.11.13 In situ Hybridisierung (ISH) Die Methode der in situ Hybridisierung wurde 1969 entdeckt (Das NK, Alfert M.,

1969) und seit den 90ern in vielen Fachgebieten angewendet. Es handelt sich dabei

um die Hybridisierung von Nukleinsäuresonden an zelluläre komplementäre

Nukleinsäuren zur Identifizierung bestimmter Chromosomen, Genloci oder auch von

RNA-Molekülen, die auf bestimmte Expressionsmuster einer Zelle hinweisten.

Es existieren diverse Standardprotokolle (Schaeren-Wiemers und Gerfin-Moser,

1993; Bradley 1997). Diese Standardprotokolle haben sich bei der Anwendung auf

Gewebeschnitten der Rattennase als nicht geeignet erwiesen, deshalb wurde in der

vorliegenden Arbeit das folgende Protokoll ausgearbeitet.

Es wurden coronale Gewebeschnitte von Rattennasen angefertigt (siehe 1.10). Die

Schnitte wurden 20 min getrocknet bevor sie erneut 10 min mit 4 % Paraformaldehyd

fixiert wurden. Nach zweimaligem waschen in 1 x PBS (5 min) wurde das Gewebe

mit Proteinase K (50 µg/ml) für 5 min bei 37°C verdaut. Danach wurde erneut in 1 x

PBS (2 x 5 min) gewaschen. Die Schnitte wurden für 10 min in 0,1 M Triethanolamin

pH 8 mit einer Endkonzentration von 0,25 % Essigsäureanhydrid inkubiert.

Anschließend wurde wiederum zweimal in PBS gewaschen. Es folgte die

Prähybridisierung mit dem Prähybridisierungspuffer um mit Heringssperma DNA

unspezifische Bindestellen zu belegen. Die Inkubationsdauer betrug zwischen 4 und

6 h bei Raumtemperatur. Der Hybridisierungspuffer mit verschiedenen

Sondenkonzentrationen (30 ng-1 µg) wurde auf die Schnitte gegeben, die daraufhin 29


über Nacht in einem Hybridisierungsofen (SI 20 H, Stuart Sientific) bei 55°C inkubiert

wurden.

Am nächsten Tag wurden die Objektträger zuerst für 30 min bei 60°C in 5 x SSC,

anschließend 30 min bei 60°C in 0,2 x SSC und 5 min bei Raumtemperatur in 0,2 x

SSC gewaschen. Es folgte eine Inkubation in PBT für 5 min mit anschließendem

Blocken in 5 % BSA proteinasefrei (Roth) in PBT für 1 h. Daraufhin wurde der

Antikörper Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments (Roche) im Verhältnis 1: 5000 in PBT

mit 5 % BSA proteinasefrei (Roth) für 2 h bei Raumtemperatur auf die Schnitte

gegeben. Danach wurde 2 Mal für 30 min in PBT gewaschen. Die Schnitte wurden in

die Färbelösung, die NBT und BCIP enthielt, gegeben. Die Farbreaktion dauerte

zwischen 30 min und 6 h. Anschließend wurden die Schnitte nochmals gewaschen,

zum Teil mit DAPI gefärbt (siehe 2.11.14), mit Aqua PolyMount Medium benetzt und

mit Deckgläsern bedeckt.

2.11.14 DAPI-Färbung 4,6-Diamidino-2-phenylindol, auch kurz DAPI genannt, färbt Zellkerne, genauer AT-

reiche Bereiche der DNA, an. Die Gefrierschnitte wurden 3 x 10 min mit 1 x PBS

gewaschen und die Flüssigkeitsreste mit Papier am Rand des Objektträgers

abgesaugt. Danach wurde mit einer 1:300 Verdünnung einer 90 µM DAPI-

Stammlösung für 45 s inkubiert. Nach weiteren Waschschritten (3 x 10 min in PBS)

wurden die Schnitte erneut getrocknet, mit Aqua PolyMount benetzt und mit

Deckgläsern bedeckt.

30


2.11.15 Bilddokumentation

31

Zur Dokumentation der mit NBT und BCI

me Adobe® Photoshop®

P gefärbten Gewebeschnitte diente die

Hellfeld-Mikroskopie. Für diese Technik

wurde das Nikon Eclipse 90i Mikroskop

mit der Farbkamera Nikon DXM1200C

im Nikon Imaging Center verwendet.

Zur Nachbearbeitung der Bilder diente

das Program

7.0.

Abb. 8: Nikon Eclipse 90i Mikroskop mit der rb-kamera Nikon DXM1200C im Nikon aging Center

Fa

Im

http://www.nikonusa.com/template.php?cat=5&grp=26&productNr=DXM1200C

Ergebnisse

3 Ergebnisse

Das Ziel dieser Arbeit ist es einen Beitrag zur molekularen Identifizierung des Ca2+-

aktivierten Cl--Kanals in olfaktorischen Rezeptorneuronen zu leisten. Deshalb wurde

die in situ Hybridisierung mit Markerproteinen für ORNs und Stützzellen etabliert und

die zellspezifische Expression von Bestrophin-2 im olfaktorischen wie auch im

respiratorischen Epithel veranschaulicht.

3.1 Etablierung der ISH auf Gewebeschnitten der Rattennase

Im Rahmen der Etablierung der Methode der in situ Hybridisierung an

Gewebeschnitten der Rattennase dienten das Standardwerk „In Situ Hybridization“

von D.G.Wilkinson sowie Veröffentlichungen zu in situ Hybridisierungen an Neuronen

von Schaeren-Wiemers und Gerfin-Moser 1993 und Bradley 1997., als Leitfaden.

Die exakte Durchführung der in situ Hybridisierung an Gewebeschnitten der

Rattennase mit den oben genannten Protokollen erwies sich jedoch zunächst als

unzureichend und musste deshalb optimiert werden.

Die Objektträgerwahl spielte dabei eine entscheidende Rolle, da das aufliegende

Gewebe etwa 36 h lang verschiedenen Agenzien ausgesetzt ist und sich nicht

ablösen darf. Bradley empfiehlt Superfrost Plus, Schaeren-Wiemers und Gerfin-

Moser Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger. Allerdings zeigten beide

Objektträgerarten (mit Paraffinschnitten) nur geringen Erfolg, da etwa 80 % der

Gewebeschnitte sich schon nach einigen Stunden bzw. spätestens nach dem

Hybridisierungsschritt ablösten. Daraufhin wurden folgende Objektträger getestet:

• SuperFrost Plus, Menzel-Gläser

• SuperFrost Plus Gold, Menzel-Gläser

• SuperFrost Excell, Erie Scientific Company

• Adhäsiv-Objektträger, Menzel-Gläser

• SuperFrost gelatinisiert

• SuperFrost mit Poly-L-Lysin

Anfangs wurden die Präparate in Paraffin eingebettet und mit einem Mikrotom

geschnitten. Es konnten Schnitte mit einer Dicke von 6-8 µm hergestellt werden.

32

Ergebnisse

Dem gegenüber stehen Gewebeschnitte mit dem Kryostaten, die zwar dicker (10-16

µm) sind, aber eine wesentlich kürzere Präparationsdauer und damit einhergehend

eine kürzere Fixierungszeit haben. Deshalb wurde sowohl das Haften von Paraffin-

als auch von Kryostatschnitten auf den genannten Objektträgern getestet.

SuperFrost Excell-Objektträger konnten 50-80 % der Paraffinschnitte und SuperFrost

Plus bzw. SuperFrost Plus Gold 50-80 % der Kryostatschnitte bis zum Ende der in

situ Hybridisierung binden. Von allen anderen lösten sich die Gewebeschnitte schon

nach wenigen Stunden komplett ab.

Die Parafifinschnitte weisen im Gegensatz zu den Kryostatschnitten nach der in situ

Hybridisierung unter dem Mikroskop eine wesentlich schlechtere Qualität auf. Sie

sind grau, verwaschen und kontrastarm im Vergleich zu den Kryostatschnitten. Aus

diesen Gründen wurde mit Kryostatschnitten weitergearbeitet.

Die Kryostatschnitte hafteten zwar größtenteils auf den SuperFrost Plus bzw.

SuperFrost Plus Gold Objekträgern, aber die Anzahl an auswertbaren Schnitten nach

der in situ Hybridisierung war zu gering. Es lösten sich einige Bereiche, wie z.B. das

Septum, vom Objektträger ab und legten sich über die Schnitte, so dass weitere

Areale des Gewebes verdeckt und somit unbrauchbar wurden. Zusätzlich lösten sich

regelmäßig große Bereiche des apikalen Epithels vom Objektträger ab. Dies ließ sich

auf die lange Beanspruchung des Gewebes während des Experimentes

zurückführen. Die Dauer der Versuche, besonders vor der Hybridisierung der Sonde,

wurde deshalb stark reduziert. Das dreimalige Waschen zwischen den

verschiedenen Versuchsschritten vor der Hybridisierung, wie in den

Standardprotokollen beschrieben, wurde auf zweimal reduziert. Alle späteren

Waschschritte mussten erhalten werden um Hintergrundsignale durch nicht

spezifisch gebundene Sonde beziehungsweise Antikörper zu vermeiden.

Rehydrationen bzw. Dehydrationen des Gewebes in Form von absteigenden bzw.

aufsteigenden Ethanolreihen, wie sie in vielen Protokollen erwähnt sind, wurden um

die Versuchsdauer weiter zu verkürzen vermieden. Der Proteinase K Verdau wurde

von 30 min (Schaeren-Wiemers und Gerfin-Moser 1993) auf 5 min verkürzt, aber

gleichzeitig wurde die Proteinase K Konzentration von 10 µg/ml auf 50 µg/ml erhöht.

Auf weitere Schritte wie Ansäuerung des Gewebes mit HCl oder eine zweimalige

Triethanolbehandlung wurde ebenfalls verzichtet. Dies führte zu eindeutigeren und

besseren Signalen, sowie zu einer größeren Zahl auswertbarer Schnitte.

33

Ergebnisse

Der Prähybridisierungs- bzw. der Hybridisierungspuffer mit Dextransulfat und

Heparin, wie sie ebenfalls in vielen Protokollen beschrieben sind, erwiesen sich als

ungeeignet, da die Schnitte nach der Hybridisierung mit beiden Chemikalien bedeckt

waren und selbst nach den folgenden Waschschritten sich nicht von den

Gewebeschnitten lösten. Dies führte schließlich zu einem Ablösen des Schnittes

aufgrund erhöhter Beanspruchung durch gebundene Chemikalien oder zu einem

Blockieren der Bindestellen der RNA-Sonden und somit zu keinem Signal. Ohne

Dextransulfat und Heparin blieben die Gewebeschnitte an den Objektträgern haften

und Ablagerungen auf dem Gewebe werden vermieden.

Ein weiterer entscheidender Schritt ist die Herstellung qualitativ hochwertiger

Sonden, welche nach der alkalischen Hydrolyse die die optimale Länge von ca. 200

Basen haben. Die Dig-markierten RNA-Sonden wurden sowohl nach der in vitro

Transkription als auch nach der alkalischen Hydrolyse mittels denaturierender RNA-

Gelelektrophorese auf ihre Größe und Qualität überprüft. Hierbei wurde

ausschließlich mit Sonden, welche die richtige Größe haben und kaum weitere

Degradationen auf dem Gel zeigten, weiter gearbeitet. Die RNA-Sonden wurden

nach der alkalischen Hydrolyse in Formamid und 5 x SSC aufgenommen. Aus

diesem Grund konnte, wie in den oben genannten Standardwerken bzw.

Veröffentlichungen beschrieben, keine exakt bestimmte Konzentration pro

Gewebeschnitt eingesetzt werden. Es erwies sich als geeignet von den Sonden

verschiedene Mengen zwischen 30 ng und 1 µg pro Gewebeschnitt zu verwenden.

Zusammengefasst sind bei der Durchführung der in situ Hybridisierung 4 Parameter

ausschlaggebend. Die Qualität und Größe der RNA-Sonde, welche die

Hybridisierung dieser an spezifische mRNA-Transkripte ermöglicht, sowie die

Adhäsionskraft des Objektträgers, welche das Gewebe über den gesamten

Versuchsverlauf ausreichend bindet. Weiterhin das Verkürzen bzw. Streichen einiger

Arbeitsschritte bis zur Hybridisierungsreaktion um das Gewebe zu schonen und

schlussendlich das Vermeiden von Dextransulfat und Heparin im

Hybridisierungspuffer um Ablagerungen auf den Schnitten zu vermeiden.

34

Ergebnisse

3.1.1 OMP als Marker für reife olfaktorische Rezeptorneurone

Das cytosolische olfaktorische Markerprotein (OMP) wird spezifisch in ORNs

exprimiert und deshalb als Markerprotein verwendet.

In Abb. 8 sind Aufnahmen von coronalen Nasengewebeschnitten nach in situ

Hybridisierung und anschließender BCIP/NBT-Färbung zu sehen. Als Sonde wurde

eine zur OMP-mRNA komplementäre RNA hergestellt. (A) zeigt eine

Maxilloturbinate, die sich ins Lumen der Nasenhöhle erstreckt. Es ist eine

rotlich/violette Färbung im Bereich des olfaktorischen Epithels zu erkennen. In (B) ist

eine Vergrößerung des Septums mit aufliegendem olfaktorischem Epithel zu sehen.

Hier kann man eindeutig die Basallamina erkennen, die das OE von der darunter

liegenden Lamina propria abgrenzt. Die darauf folgenden Zellschichten, Basalzellen

und unreife Neuronen, zeigen keine OMP-Färbung. Nur die Somata der reifen ORNs

sind rot-violett gefärbt und lassen sich von der folgenden Stützzellschicht klar

abgrenzen. In (C) ist ein Teil des Septums mit aufliegendem OE und der Übergang

zum respiratorischen Epithel (RE) gezeigt. Zusätzlich zur Abgrenzung der ORNs zu

den Stützzellen ist auch die Scheidelinie zum beginnenden RE durch die deutliche

OMP-Färbung zu sehen. (D) zeigt einen Bereich des dorsal gelegenen Bogens der

Nasenhöhle, in dem wiederum eine spezifische Färbung der ORNs sichtbar ist. Die

Bilder (E) und (F) repräsentieren den in (D) dargestellten Ausschnitt in einer höheren

Vergrößerung, die nochmals die durch das OMP-Signal abgrenzbaren Bereiche der

ORNs und der Stützzellen hervorhebt.

35

Ergebnisse

Abb. 8: Nachweis von mRNA-Transkripten des olfaktorischen Markerproteins in reifen olfaktorischen Rezeptorneuronen durch ISH: BCIP/NBT-Färbung coronaler Nasengewebeschnitte.

ORN: olfaktorische Rezeptorneuron, SZ: Stützzelle, OE: olfaktorisches Epithel, RE: respiratorisches

Epithel, BL: Basallamina, BG: Blutgefäß, S: Septum, M: Maxilloturbinate, (Sondenmenge: ca. 30

ng/Schnitt)

36

Ergebnisse

3.1.2 CNG-A2 als Marker für reife olfaktorische Rezeptorneurone

CNG-A2 ist die Hauptuntereinheit des olfaktorischen CNG-Kanals und ist in den

Cilien der ORNs lokalisiert.

Abb. 9 zeigt die Ergebnisse der in situ Hybridisierung mit der CNG-A2-Sonde. In (A)

ist ein ventraler Ausschnitt der Nasoturbinate mit aufliegendem olfaktorischen Epithel

abgebildet. Es ist eine starke rot-violette Färbung im Bereich des OE erkennbar,

wobei bei dieser mikroskopischen Auflösung nicht eindeutig geklärt werden kann

welcher Zelltyp markiert ist. In Bild (B) ist dieser Ausschnitt vergrößert dargestellt. Im

äußersten Bereich des OE ist vermutlich die ungefärbte Stützzellschicht aber

aufgrund der prominenten Färbung in den ORNs nicht eindeutig erkennbar. Gleiches

gilt für (C), einem dorsalen Ausschnitt einer Maxilloturbinate. Die ORNs sind

eindeutig gefärbt, jedoch ist der Übergang sowohl zu den Stützzellen als auch hin zur

Basallamina nicht eindeutig von der Färbung abgrenzbar. Jedoch kann in der

Vergrößerung (D) dieser Übergang klar gezeigt werden. Sowohl die Stützzellschicht

als auch der basale Bereich des olfaktorischen Epithels sind ungefärbt. Die

nochmalige Vergrößerung dieses Bereiches in (E) und (F) veranschaulicht dies

zusätzlich. Im Bereich der ORNs ist die rote Färbung sehr prominent, wohingegen

die basalen und die apikale Zellschicht(en) weiß erscheinen.

Somit wurde die mRNA der CNG-A2 Untereinheit nachgewiesen. Wie erwartet

korreliert die Färbung stark mit der in Abb. 8 dargestellten OMP-Färbung, da CNG-

A2-Proteine immer in OMP-positiven Zellen exprimiert werden.

37

Ergebnisse

Abb.9: Nachweis von mRNA-Transkripten der CNG-A2 Untereinheit in reifen olfaktorischen Rezeptorneuronen durch ISH: BCIP/NBT-Färbung coronaler Nasengewebeschnitte. ORN:

olfaktorische Rezeptorneuron, SZ: Stützzelle, OE: olfaktorisches Epithel, , BL: Basallamina, , M:

Maxilloturbinate, N: Nasoturbinate, (Sondenmenge: ca. 300 ng/Schnitt)

38

Ergebnisse

3.1.3 Das Golf-Protein als Marker für olfaktorische Rezeptorneurone

Das G-Protein Golf ist ebenfalls Bestandteil der olfaktorischen Signaltransduktion und

deshalb nur in ORNs exprimiert.

In Abb. 10 sind Ausschnitte von coronalen Nasengewebeschnitten mit aufliegendem

olfaktorischem Epithel zu sehen. Die Hybridisierung wurde mit der Golf-Sonde

durchgeführt. (A) zeigt den Ausschnitt einer Turbinate. Die rot-violette Färbung ist vor

allem im apikalen Bereich des OE erkennbar. Somit sind die Basalzellen, sowie

unreife Neurone, die sich basal des OEs befinden, nicht gefärbt. Die darüber

liegenden ORNs sind deutlich gefärbt, aber die das Epithel abschließende

Stützzellschicht kann mit dieser Auflösung nicht von den ORNs abgegrenzt werden.

(B) zeigt diesen Bereich in einer stärkeren Vergrößerung, so dass die Trennung der

verschieden Schichten nun möglich ist. Die Stützzellschicht erweist sich als farblos

und die ORNs zeigen deutliche Signale in den Somata. Weitere Vergrößerungen

dieses Ausschnittes in (C) und (D) untermauern dies nochmals. Stützzellen im

rechten Bildrand zeigen keine Signale, der Basale Bereich des OE ist weitestgehend

farblos und die sich nahe den Stützzellen befindenden ORNs weisen eine deutliche

Färbung auf. Nochmalige Vergrößerungen von weiteren Ausschnitten des

olfaktorischen Epithels in (E) und (F) heben abermals die farblosen Stützzellen von

den roten ORNs ab.

Zusammenfassend zeigen damit drei Marker für olfaktorische Rezeptorneurone,

OMP, CNGA-2 und Golf, eine spezifische Färbung der ORNs.

39

Ergebnisse

Abb.10: Nachweis von mRNA-Transkripten des Golf-Proteins in reifen olfaktorischen Rezeptorneuronen durch ISH: BCIP/NBT-Färbung coronaler Nasengewebeschnitte. ORN:

olfaktorische Rezeptorneuron, SZ: Stützzelle, OE: olfaktorisches Epithel, BL: Basallamina,

(Sondenmenge: ca. 300 ng/Schnitt)

40

Ergebnisse

3.1.4 Crb-2 als Marker für Stützzellen

Die Carbonyl-Reductase 2 ist ein Protein, das spezifisch in Stützzellen exprimiert

(Yu, 2005) und am xenobiotischen Stoffwechsel beteiligt ist.

In Abb. 11 ist der dorsal gelegene Bogen eines Nasengewebeschnitts mit

olfaktorischem Epithel in verschiedenen Vergrößerungen dargestellt. Im Vergleich zu

den vorherigen Markern sind hier keine neuronalen Zellen, sondern die Stützzellen,

die das Epithel zum Lumen hin abgrenzen mit BCIP/NBT gefärbt. In (A) ist die

Basallamina, die das OE zur Lamina propria hin abgrenzt, dargestellt. Es ist eine

schwache rote Färbung im apikalen Bereich des OE erkennbar, doch kann sie in

dieser Vergrößerung noch keinem spezifischen Zelltyp zugewiesen werden. Im

Ausschnitt (B) ist die Färbung bedeutend stärker und eindeutig der äußeren

Zellschicht, also den Stützzellen, zu zuordnen. Die darunter liegenden Zellschichten

des OEs zeigen keine Färbung. Dieses Bild spiegelt sich auch bei höherer

Vergrößerung in(C) und (D) wieder. Die Somata der Stützzellen weisen eine

deutliche violette Färbung auf und die restlichen Zelltypen des olfaktorischen Epithels

sind farblos. In (E) und (F) sind die einzelnen Somata der Stützzellen und der lila

Farbniederschlag aufgrund der höheren Vergrößerung deutlicher zu erkennen und

gegenüber den darunter liegenden Schichten leichter abzugrenzen. Wie erwartet ist

auch hier eine spezifische Färbung in den Stützzellen zu detektieren.

41

Ergebnisse

Abb.11: Nachweis von mRNA-Transkripten des Crb-2-Proteins in den Stützzellendurch ISH: BCIP/NBT-Färbung coronaler Nasengewebeschnitte. ORN: olfaktorische Rezeptorneuron, SZ:

Stützzelle, OE: olfaktorisches Epithel, BL: Basallamina, (Sondenmenge: ca. 300 ng/Schnitt)

42

Ergebnisse

3.2 Bestrophin-2 als möglicher Kandidat für den Ca2+-aktivierten Cl--Kanal

Durch den aktuellen Bericht von Pifferi et al., 2006 sollte Bestrophin-2 mittels in situ

Hybridisierung auf Gewebeschnitten von Rattennasen zellspezifisch nachgewiesen

werden, um die Indizien für Bestrophin-2 als potentiellen Ca2+-aktivierten Cl--Kanal zu

bestätigen oder zu entkräften.

In Abb.12 sind die mit BCIP/NBT angefärbten mRNA-Transkripte im olfaktorischen

Epithel und in Abb.13 die im respiratorischen Epithel der Nasenhöhle zu sehen. In

Abb.12 (A) ist das mit Pfeilen gekennzeichnete OE dargestellt. Schon bei geringer

Vergrößerung ist zu erkennen, dass die apikale Zellschicht, also die Stützzellen, nicht

gefärbt, die darunter liegenden reifen ORNs allerdings stark gefärbt sind. Ob die

basal gelegenen Basalzellen und die unreifen ORNs gefärbt sind, ist nicht eindeutig

zu erkennen. In (B) ist ein Ausschnitt des Septums mit aufliegendem OE zu sehen.

Auch hier ist die Stützzellschicht nicht gefärbt, die darunter liegenden Schichten

zeigen jedoch ein deutliches Bestrophin-2-Signal. Erst mit einer stärkeren

Vergrößerung in (C) zeigt sich, dass die Basalzellen und die unreifen Neuronen keine

Färbung aufweisen. Zusätzlich ist eine Bowman´sche Drüse, die auch farblos bleibt

zu sehen. Die gefärbten reifen ORNs grenzen sich apikal von der Stützzellschicht ab.

Die Aufnahmen mit der höchstmöglichen Vergrößerung (D-F) bestätigen nochmals

die spezifische Färbung in den ORNs.

43

Ergebnisse

Abb.12: Nachweis von mRNA-Transkripten des Best-2-Proteins im olfaktorischen Epithel durch ISH: BCIP/NBT-Färbung coronaler Nasengewebeschnitte. ORN: olfaktorische Rezeptorneuron, SZ:

Stützzelle, OE: olfaktorisches Epithel, BL: Basallamina, BD: Bowman´sche Drüse, (Sondenmenge: ca.

300 ng/Schnitt)

44

Ergebnisse

Zusätzlich zu den Signalen in den ORNs sind aber auch Färbungen im

respiratorischen Epithel nachweisbar (Abb.13). (A) zeigt den Übergang des

olfaktorischen in das respiratorische Epithel bei schwacher Vergrößerung. Rechts der

Trennlinie kann man die gefärbten Neurone des olfaktorischen Epithels von den

farblosen Stützzellen unterscheiden, links sind basal und apikal im respiratorischen

Epithel Färbungen sichtbar. In (B) ist ebenfalls das respiratorische Epithel zu sehen,

allerdings ist die rote Färbung etwas diffuser im Epithel verteilt, so dass keine

Aussage über zellspezifische Färbungen im RE möglich ist. In (C) ist die Färbung

wieder spezifischer in Zellen oberhalb der Basallamina beziehungsweise im apikalen

Bereich des Epithels zu erkennen. Allerdings kann auch hier kein Zelltyp der Färbung

zugeordnet werden. Bei hohen Vergrößerungen (D)-(F) sind wieder deutliche

Färbungen sowohl basal als auch apikal des Epithels, aber nicht median, zu

erkennen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Färbung im olfaktorischen

Epithel eindeutig ORNs und im respiratorischen Epithel keinem speziellen Zelltypen

zugeordnet werden kann, allerdings sind die Zellen knapp über der Basallamina, bei

denen es sich um Basalzellen handelt, farblos.

45

Ergebnisse

Abb.13: Nachweis von mRNA-Transkripten des Best-2-Proteins im respiratorischen Epithel nach ISH: BCIP/NBT-Färbung coronaler Nasengewebeschnitte: RE: respiratorisches Epithel, OE:

olfaktorisches Epithel, BG: Blutgefäß, BL: Basallamina, ORN: olfaktorische Rezeptorneuron, CSZ:

ciliäre Säulenzelle, BZ: Basalzelle, BüZ: Bürstenzelle, die Pfeile ohne Beschriftung zeigen auf

Färbungen im respiratorischen Epithel, (Sondenmenge: ca. 300 ng/Schnitt)

46

Ergebnisse

3.3 Negativkontrollen zu den in situ Hybridisierungen

Es wurden zwei verschiedene Negativkontrollen durchgeführt (Abb. 14). Zum einen

wurden Schnitte mit Hybridisierungspuffer ohne Sonde und zum anderen wurden

Schnitte mit der Antisense-Sonde behandelt. Die Antisense-Sonde (Negativkontrolle)

ist komplementär zur Sense-Sonde (Positivkontrolle) und entspricht einem Teil der

zellulären mRNA.

Abb. 14: Negativkontrollen: A: ISH mit BCIP/NBT-Färbung ohne Sonde, B: ISH mit BCIP/NBT-

Färbung mit Antisense-Sonde (Sondenmenge: ca. 300 ng/Schnitt) der OMP-Sonde. BL: Basallamina,

OE: olfaktorisches Epithel

In Abb. 14 (A) ist ein Ausschnitt eines coronalen Nasengewebeschnitts mit

olfaktorischem Epithel gezeigt. Es handelt sich um die Negativkontrolle einer in situ

Hybridisierung bei der im Hybridisierungsschritt keine Sonde eingesetzt wurde. Es ist

weder eine Färbung im olfaktorischen Epithel noch im basal liegenden

Knorpelgewebe erkennbar. In (B) ist ein Bereich eines Nasengewebeschnitts mit

olfaktorischem Epithel nach in situ Hybridisierung und BCIP/NBT-Färbung

dargestellt. Als Sonde wurde die Antisense-Sonde von OMP benutzt. Auch hier sind

keine spezifischen Färbungen sichtbar. Sowohl die Zellen des olfaktorischen Epithels

als auch das Knorpelgewebe sind nicht gefärbt.

Die Negativkontrollen zu CNG-A2, Golf, Crb-2 und Best-2 zeigen auch keine Färbung,

deshalb wurde nur die Negativkontrolle zu OMP dargestellt.

47

Diskussion

4 Diskussion

Im Rahmen der Diplomarbeit wurde ein Beitrag zur molekularen Identifizierung des

Ca2+-aktivierten Cl--Kanals geleistet. Als Werkzeug hierzu wurde die in situ

Hybridisierung auf Gewebeschnitten der Rattennase mit Markerproteinen etabliert

und die Bestrophin-2 Expression im olfaktorischen und respiratorischen Epithel

dargestellt.

Die in situ Hybridisierung ist eine Methode zur zellspezifischen Lokalisation von

mRNA-Molekülen, die alternativ für das zu untersuchende Gewebe jeweils empirisch

optimiert werden muss. Bei in situ Hybridisierungen an Gewebeschnitten ist dabei

der wichtigste Schritt einen Objektträger zu finden, der in der Lage ist das Gewebe

während der Dauer des Versuchs zu binden. Dies erwies sich im Rahmen dieser

Arbeit als Herausforderung, da selbst Objektträger, die in Vorversuchen das

olfaktorische Gewebe fest binden konnten, im eigentlichen Versuchsablauf dann

aber nur Bruchstücke des Gewebes erhalten konnten.

Ein weiterer wichtiger Versuchsparameter bei der Etablierung der in situ

Hybridisierung auf Nasengewebeschnitten ist die Länge der Behandlung mit

Proteinase-K. Zu lange Inkubationszeiten zerstörten das Gewebe in solchem

Umfang, dass die RNA-Sonden zwar mit komplementären mRNAs hybridisieren

konnten, aber die Zellen soweit zerstört wurden, dass die Färbungen keinem Zelltyp

mehr zugeordnet werden konnte. Andererseits führte eine zu kurze Inkubationszeit

zu keiner Färbung, da die Sonde vermutlich nicht durch das Gewebe zur mRNA

„vordringen“ und hybridisieren konnte. Eine Inkubation für 5 min bei 37°C mit einer

Proteinase-K Konzentration von 50 µg/ml erwies sich hier als geeignet.

Weiterhin stellte sich bei den Versuchen heraus, dass vor der Hybridisierung

möglichst kurze Inkubationszeiten einzuhalten waren. Dies erwies sich für die

Gewebeerhaltung als auch gegen mögliche Degradation der mRNA durch RNasen

als unbedingt notwendig.

Weiterhin zeigte sich, dass die Qualität der eingesetzten Sonden und deren Länge

eine entscheidende Rolle für die Qualität der Färbung spielte. Nur RNA-Sonden, die

nach der in vitro Transkription und alkalischer Hydrolyse eine Länge von ungefähr

200 Basen zeigten, ergaben auf Gewebeschnitten der Nase zufrieden stellende

48

Diskussion

Färbungen. Sonden, die zusätzliche Fragmente oder Degradationen auf dem RNA-

Gel zeigten, ergaben in keinem Fall eine spezifische Färbung.

Mit den Hybridisierungsbedingungen wie Temperatur und Formamidkonzentration im

Hybridisierungspuffer musste darüber hinaus solange variiert werden bis ein

eindeutiges Signal erhalten wurde und kein unspezifisches Hintergrundsignal auftrat.

Eindeutige quantitative Aussagen über die Anzahl der im jeweiligen Gewebeschnitt

vorhandenen mRNA-Transkripte und damit die Expressionsstärke des jeweiligen

Gens waren mit der hier durchgeführten in situ Hybridisierung nur schwer möglich, da

sowohl die jeweilig eingesetzte RNA-Sonden-Konzentration variierte als auch die

Färbedauer mit BCIP/NBT verschieden war. Dies war nötig, um eine möglichst

optimale Färbung des zu untersuchenden Gens zu erhalten und war nicht für den

quantitativen Vergleich der Expressionsstärke vorgesehen.

Die in situ Hybridisierung auf Nasengewebeschnitten erwies sich so als geeignete

Methode um eine zellspezifische Lokalisation von mRNA-Molekülen nachzuweisen.

Dies unterstreichen die in Abb. 8-11 gezeigten Markerproteine OMP, CNG-A2, Golf

und Crb-2. Während die OMP-, CNG-A2-, und Golf-Sonden eindeutig ORNs

detektierten, konnte die Crb-2-Sonde die Stützzellen anfärben und diese somit klar

von den ORNs abgrenzen. Nach der Etablierung war es aufgrund der Vergleiche mit

den Markerproteinen möglich auch ein Protein, dessen zelluläre Expression nicht

bekannt war, den verschieden Zelltypen zuzuordnen.

Die Bestrophine sind eine relativ neue Genfamilie, die Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle

ausbilden können. Das erste identifizierte Gen war Bestrophin-1, welches nach der

Krankheit Morbus best benannt ist. Kurz darauf wurden in Säugetieren auch die

Bestrophine 2, 3 und 4 im Genom identifiziert.

Bestrophin-2 wurde nun kürzlich als möglicher Kandidat des Ca2+-aktivierten Cl--

Kanals beschrieben (Pfifferi et al., 2006). Als Indiz dafür spricht eine spezifische

Expression von Bestrophin-2 im OE der Maus, die Bestrophine-1, 3 und 4 wurden

nach Pfifferi et al. nicht gefunden. Eine Einzellzell-PCR zeigte darüber hinaus, dass

Bestrophin-2 in den ORNs aber nicht in den Stützzellen exprimiert ist.

Demgegenüber stehen allerdings PCR-Analysen anderer Autoren die eindeutig alle 4

Bestrophine sowohl im olfaktorischen Epithel der Ratte als auch in der ODORA-

Zelllinie, eine primär Zelllinie von olfaktorischen Neuronen, nachweisen (Christina

49

Diskussion

Franjic-Würtz, Diplomarbeit 2006; Anja Brühl, Dissertation 2005). Zusätzlich konnte

Barro Soria et al. Bestrophin-1, 2 und 4 im Riechepithel nachweisen (Barro Soria et

al., 2006). Damit ist die von Pfifferi et al. nachgewiesene spezifische Expression von

Bestrophin-2 im olfaktorischen Epithel alleine mehr als fragwürdig.

Ein weiteres Argument von Pfifferi et al. Bestophin-2 als möglichen Ca2+-aktivierten

Cl--Kanal zu nennen, war die immunhistochemische Lokalisation von Bestrophin-2 in

einer Cilienanreicherung. Auch diese Tatsache ist nicht eindeutig, da auf dem

gezeigten Immuno-Blot eine Kreuzreaktion des Antikörpers mit einem weiteren

Protein zu sehen ist.

Noch klarer sind die Widersprüche beim Vergleich der biophysikalischen

Eigenschaften des nativen olfaktorischen Ca2+-aktivierten Cl--Kanals (Kaneko et al.,

2006; Reisert et al., 2003; Reuter et al.; 1998) mit dem in HEK-293 Zellen heterolog

exprimierten Bestrophin-2 (Pfifferi et al., 2006). Es konnte nur im whole cell Modus

ein messbarer Ca2+-induzierter Cl--Strom in diesen HEK-293 Zellen gemessen

werden, nicht aber in excised patches (Pfifferi et al., 2006). Die Einzelkanal-

leitfähigkeit wurde daher im whole cell Modus bestimmt und war um mehr als das

Fünffache niedriger als die des nativen Ca2+-aktivierten Cl--Kanals (Pfifferi et al.,

2006). Des Weiteren liegt die Öffnungsgeschwindigkeit des Ca2+-aktivierten Cl--

Kanals im Millisekundenbereich, die von heterolog exprimiertem Bestrophin-2 im

Sekunden- bis Minutenbereich. Zusammenfassend stellen diese Befunde damit

Bestrophin-2 als möglichen olfaktorischen Ca2+-aktivierten Cl--Kanal mehr als in

Frage. Pfifferi et al. versuchen diese Unstimmigkeiten mit dem Hilfsargument des

Fehlens von Regulationsproteinen oder weiteren Kanaluntereinheiten in der HEK-

293 Zelle zu erklären.

Aufgrund dieser Widersprüche wurde im Rahmen der Arbeit deshalb die

zellspezifische Lokalisation von Bestrophin-2 auf Gewebeschnitte mittels in situ

Hybridisierung überprüft. Dabei zeigte sich zunächst, dass Bestrophin-2 tatsächlich

spezifisch ORNs anfärbt. Im Vergleich mit den ORN-Markern OMP, CNG-A2 und Golf

zeigt Bestrophin-2 allerdings bedeutend weniger gefärbte ORNs. Daraus lässt sich

schließen, dass Bestrophin-2 möglicherweise nicht in allen OMP- bzw. CNG-A2- und

Golf -positiven Zellen exprimiert wird. Vielleicht handelt es sich hierbei um eine

Subpopulation von ORNs, die einen anderen Rezeptor nutzen. Hierbei könnte es

sich beispielsweise um die von Liberles und Buck, 2006 identifizierten TAARs (trace

50

Diskussion

amine-associated receptors) handeln, die flüchtige Amine detektieren können.

Bestrophin-2 zeigt nach den in situ Hybridisierungen nicht nur im olfaktorischen

sondern auch im respiratorischen Epithel sehr starke Signale. Dies ist ein weiteres

starkes Indiz dafür, dass es sich bei Bestrophin-2 nicht um den olfaktorischen Ca2+-

aktivierten Cl--Kanal handeln kann. Elektrophysiologische Untersuchungen zeigten

nämlich, dass der Ca2+-aktivierte Cl--Kanal nur in ORNs, sowie glatten Muskelzellen

und DRG-Neuronen exprimiert wird. Welche Rolle Bestrophin-2 im respiratorischen

Epithel erfüllen kann, muss hier zunächst zurückgehalten werden. Die in situ

Hybridisierung stellt somit ein weiteres Argument gegen Bestrophin-2 als

Transduktionskanal in ORNs dar, weil die Expression auf weniger ORNs beschränkt

ist und auch verschiedene Zelltypen des respiratorischen Epithels gefärbt sind.

Anhand der biophsikalischen Eigenschaften von Bestrophin-2 in HEK-293 Zellen

(Pfifferi et al, 2006) und den Ergebnissen der in situ Hybridisierung könnte man daher

vermuten, dass es sich eher um ein Transporter handelt, der für die Anionen-

Homöostase des Mukus, sowohl im respiratorischen als auch im olfaktorischen

Epithel, verantwortlich sein könnte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in situ Hybridisierung mit den

Markerproteinen etabliert wurde und ein zellspezifischer Expressionsnachweis auf

Gewebeschnitten der Rattennase möglich ist. Bestrophin-2 kann aufgrund der

Ergebnisse von Pfifferi et al. und dem mittels in situ Hybridisierung erbrachten

Nachweis, dass Bestrophin-2 auch in Zellen des respiratorischen Epithels exprimiert

ist, als Kandidat für den olfaktorischen Ca2+-aktivierten Cl--Kanal weiter bezweifelt

werden.

Im Rahmen der Suche nach dem olfaktorischen Ca2+-aktivierten Cl--Kanal wurden

über die Analyse von Bestrophin-2 hinaus auch ca. 300 Membranproteine aus einer

Cilienpräparation der Ratte isoliert und massenspektrometrisch identifiziert. Diese

Proteinsequenzen wurden bioinformatisch analysiert und konnten daraufhin

bekannten Proteinen der olfaktorischen Signaltransduktion, des xenobiotischen

Stoffwechsels, des Cytoskelets und weiteren physiologischen Funktionen zugeordnet

werden. Allerdings fanden sich auch 32 Proteine unbekannter Funktion, unter denen

sich möglicherweise der nach wie vor unbekannte Ca2+-aktivierte Cl--Kanal befinden

könnte.

51

Diskussion

Nachdem die Methode der in situ Hybridisierung nun etabliert ist, können diese

Proteine unbekannter Funktion auf Nasengewebeschnitten der Ratte nachgewiesen

werden. Die Proteine, die auf mRNA-Ebene nicht in ORNs oder in ORNs und

weiteren Zelltypen des olfaktorischen beziehungsweise respiratorischen Epithels

detektiert werden, können nicht der gesuchte Ca2+-aktivierte Cl--Kanal sein.

Alle Proteine, die ausschließlich in den ORNs nachgewiesen werden, müssen mit

weiteren Versuchen wie z. B der siRNA-Technik und der patch clamp-Methode weiter

untersucht werden bis ein Protein gefunden ist, das in transfizierten HEK-293 Zellen

einen Ca2+-aktivierten Cl--Kanal mit den richtigen biophysikalischen Eigenschaften

ausbildet.

Die Suche nach dem Ca2+-aktivierten Cl--Kanal dient nicht nur der weiteren

Erforschung der olfaktorischen Signaltransduktion, sondern erlaubt auch einen

Einblick in die Schmerzsignaltransduktion. Die Reizweiterleitung des Schmerzes wird

ebenfalls durch das öffnen eines Ca2+-aktivierten Cl--Kanals verstärkt (Ault and

Hildebrand, 1994; Carlton et al., 1999). Hierbei wird vermutet, dass es sich um einen

dem olfaktorischen Mechanismus ähnlichen Weg handelt, da eine aktive

Chloridakkumulation (Alvarez-Leefmans et al., 2001; Kaneko et al., 2006) in der

Schmerzzelle und die Expression eines Ca2+-aktivierte Cl--Kanals (Currie et al., 1995;

Kenyon and Goff, 1998; Lee et al., 2005) nachgewiesen ist. Weiterhin zeigen die

Ca2+-aktivierten Cl--Kanäle sowohl des olfaktorischen als auch des Schmerz-

Signaltransduktionsweges die gleichen elektrophysiologischen Eigenschaften, z.B.

besitzen sie ähnliche Leitfähigkeit, Ionenselektivität und die Aktivierbarkeit durch

Ca2+-Ionen (Frings, 1999). Aus diesen Gründen ist die molekulare Identifizierung

auch für pharmakologische Zwecke interessant, da eine Unterdrückung der aktiven

Chloridakkumulation zum Abklingen der Schmerzempfindung führt (Willis et al.,

2004) und gleichzeitig ein Schmerztherapeutika gegen den Ca2+-aktivierten Cl--Kanal

synthetisiert werden kann, welches den Kanal blockiert und somit die Verstärkung

des Rezeptorstroms verhindert

52

Zusammenfassung

5 Zusammenfassung

Die olfaktorische Signaltransdukion bei Landwirbeltieren ist in ihren Grundzügen

bereits gut verstanden. Der Ca2+-aktivierte Cl--Kanal, der für den größten Teil der

Erregungsbildung verantwortlich ist, ist jedoch auf molekularer Ebene noch nicht

identifiziert. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb zunächst die in situ Hybridisierung

auf Gewebeschnitten der Rattennase mit Markerproteinen für olfaktorische

Rezeptorneurone und Stützzellen zu etablieren. Bei der Etablierung waren vier

Arbeitsschritte entscheidend. Die richtige Wahl des Objektträgers, der das Gewebe

bis zum Versuchsende binden muss, die Synthese von RNA-Sonden optimaler

Länge und Qualität, die Verringerung der Inkubationszeiten vor der wesentlichen

Hybridisierungsreaktion, um eine optimale Gewebeerhaltung zu garantieren und eine

mögliche Degradation der RNA zu verhindern sowie der Ausschluss von

Dextransulfat und Heparin im Hybridisierungspuffer, da dieses auf den

Gewebeschnitten präzipitiert und dadurch das Eindringen der Sonden in das

Gewebe verhindert.

Die in situ Hybridisierung wurde mit OMP, CNG-A2 und Golf als Marker für reife

olfaktorische Rezeptorneurone und mit Crb-2 als Stützzellmarker etabliert. Die

Marker für reife Neuronen zeigten deutliche Färbungen in den ORNs und keine

unspezifischen Signale in anderen Zellen. Mit Hilfe des Stützzellmarkers konnten die

gefärbten Stützzellen klar von den Neuronen unterschieden werden.

Ein Bericht von Pfifferi et al. beschrieb Bestrophin-2 als Kandidat für den

olfaktorischen Ca2+-aktivierten Cl--Kanal. Diese Behauptung sollte mit einer

zellspezifischen Expression von Bestrophin-2 auf Nasengewebeschnitten untersucht

werden. Bestrophin-2 konnte zwar eindeutig in ORNs des olfaktorischen Epithels

nachgewiesen aber auch deutlich in Zellen des respiratorischen Epithels detektiert

werden. Da die Existenz des olfaktorischen Ca2+-aktivierten Cl--Kanals aber nur in

ORNs und nicht in Zellen des respiratorischen Epithels nachgewiesen ist, muss diese

Aussage von Pfifferi et al., in Frage gestellt werden.

53

Weitere 32 Kandidaten, die aus dem ciliären Proteomprojekt unserer Arbeitsgruppe

stammen und denen keine physiologischen Funktionen und eindeutige zelluläre

Lokalisation zugewiesen werden können, sollen zukünftig mit der in situ

Hybridisierung auf ihre zellspezifische Expression auf Nasengewebeschnitten

untersucht werden.

Literaturverzeichnis

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63

Abkürzungsverzeichnis

7 Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Erklärung

α anti-

Abb. Abbildung

AC III Adenylatcyclase Typ III

ATP Adenosin-5'-Triphosphat

BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indoylphosphat

BG Blutgefäß

BL Basallamina

BSA Bovines Serumalbumin

ca. circa

bzw. beziehungsweise

cAMP 3´,5´-zyklisches Adenosinmonophosphat

cm Zentimeter

CNG-Kanal cyclic nucleotide gated channel

DAPI 4,6-Diamidino-2-phenylindol

DRG (dorsal root ganglion)

EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure

GFP green fluorescent protein

Golf olfaktorisches G-Protein

h Stunde

ISH in situ Hybridisierung

LP Lamina propria

M Molar

mA Milliampère

ml Milliliter

mm Millimeter

mM milli-Molar

ms milli-Sekunde

NBT Nitro Blue Tetrazolium

OD Optische Dichte

OE Olfaktorisches Epithel

OMP olfaktorisches Markerprotein 64

Abkürzungsverzeichnis

ORN Olfaktorische Rezeptor-Neurone

p.a pro analysi

PBS phosphate buffered saline

PDE Phosphodiesterase

RE respiratorisches Epithel

rpm rounds per minute

s Sekunde

S Septum

SDS Sodium-Dodecylsulfat

SZ Stützzelle

Tab. Tabelle

TRIS 2-Amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propandiol

U Unit

µg Microgramm

µl Microliter

µm Micrometer

v/ v volume per volume

w/ v weight per volume

z.B. zum Beispiel

65

Documents

Lokalisation von mRNA-Transkripten auf Gewebeschnitten des ... · Becherzellen liegt basal, so dass apikal Raum für sekretorische Vesikel bleibt. Die Die ciliären Säulenzellen