Embed Size (px)
Citation preview
� 0 000000000000000000000000000
�
��
�
�
� 1
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
L’OLI D’OLIVA: FONT DE VIDA
(Estudi de l’efecte beneficiós de l’oli d’oliva pel que fa a les malalties cardiovasculars)
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�Autora: Laura Gutiérrez Rios
Curs: 2n de Batxillerat
Any: 2012
Tutora: Isabel Clavero Martí
� 2
ÍNDEX
1. INTRODUCCIÓ..................................................................................................4
2. L’OLI D’OLIVA....................................................................................................8
3. PART BIOQUÍMICA..........................................................................................10
3.1. Composició química de l’oli d’oliva.............................................................
3.2. Fracció saponificable.................................................................................11
3.2.1 Àcids grassos insaturats...........................................................
3.2.2 Àcids grassos saturats..............................................................14
3.3. Fracció insaponificable..............................................................................15
3.3.1 Els esterols...............................................................................
3.3.2 Els tocoferols: vitamina E..........................................................16
3.3.3 Les vitamines i els pigments: carotens......................................
3.3.4 El compostos fenòlics................................................................17
3.4. Propietats físiques......................................................................................19
3.4.1 El punt de fusió..........................................................................
3.4.2 La solubilitat...............................................................................21
3.5. Propietats químiques..................................................................................22
3.5.1 La hidròlisi i l’esterificació...........................................................
3.5.2 La saponificació amb àlcalis.......................................................
3.5.3 L’enranciment de l’oli d’oliva. Oxidació......................................23
4. PART CULTURAL...............................................................................................24
4.1 L’oliva com a matèria primera.....................................................................
4.2 Història de l’oli d’oliva.................................................................................27
4.3 Criteris qualitatius de l’oli d’oliva.................................................................29
4.4 El procés de refinació de l’oli d’oliva...........................................................30
4.4.1 La refinació química o alcalina.........................................................
4.4.2 La refinació física o destil·lació.........................................................32
4.5 Classificació de l’oli d’oliva..........................................................................33
4.5.1 Oli d’oliva verge.................................................................................
4.5.2 Oli d’oliva refinat...............................................................................36
4.5.3 Oli d’oliva..........................................................................................37
4.5.4 Oli d’oliva de pinyolada.....................................................................
4.6 L’oli d’oliva com a component de la dieta mediterrània..............................39
4.6.1 La dieta mediterrània........................................................................
4.6.2 Característiques de la dieta mediterrània.........................................40
4.6.3 La importància d’una dieta rica en greixos vegetals.........................42
� 3
5. PART BIOLÒGICA........................................................................................44
5.1 L’efecte de l’oli d’oliva en la salut humana............................................
5.2 Els greixos a l’organisme humà............................................................45
5.2.1 Els triglicèrids..............................................................................
5.2.2 Els fosfolípids..............................................................................46
5.2.3 El colesterol................................................................................
5.2.4 Les lipoproteïnes.........................................................................48
5.3 La digestió dels greixos................................��......................�.........51
5.4 Propietats salutíferes de l’oli d’oliva...............................�...............�..52
5.5 L’oli d’oliva i l’aparell digestiu.................................................................53
5.6 L’oli d’oliva i el sistema cardiovascular..................................................54
5.7 L’oli d’oliva i el sistema ossi...................................................................55
5.8 L’oli d’oliva i l’epidermis.........................................................................
5.9 Prevenció i oli d’oliva: la diabetis i el càncer..........................................56
6. PART EXPERIMENTAL.................................................................................58
6.1 Tècniques de treball...............................................................................60
6.2 Preparació del medi de cultiu cel·lular...................................................62
6.3 Tractament amb àcids grassos..............................................................65
6.3.1 Pràctica 1: Extracció de proteïnes i Western Blot .......................67
6.3.2 Pràctica 2: Extracció d’ARN i PCR en ‘’real time’’........................86
6.4 Tractament amb vi negre i vi blanc......................................................102
6.4.1 Pràctica 3: Extracció de proteïnes i Western Blot......................104
6.4.2 Pràctica 4: Extracció d’ARN en PCR en ‘’real time’’...................119
6.4.3 Pràctica 5: Tinció de cèl·lules HepG2........................................131
6.4.4 Pràctica 6: Microscòpia de les cèl·lules HepG2.........................133
7. CONCLUSIONS...........................................................................................140
8. BIBLIOGRAFIA............................................................................................144
� 4
1. INTRODUCCIÓ �
Les malalties cardiovasculars constitueixen la causa principal de mort i discapacitat en els
Estats Units i en la majoria de països europeus. L’aterosclerosi és una de les principals
causes d’aquest tipus de malalties i es troba en estat avançat quan es detecten problemes
de cor. Per tant, es requereix donar major èmfasis en la prevenció de l’aterosclerosi
mitjançant la modificació de factors de risc, tals com l’alimentació sana, l’exercici, i evitar
alguns hàbits influenciadors com fumar.
L’aterosclerosi es veu agreujada en casos d’hipercolesterolèmia, és a dir, quan existeixen
nivells elevats de colesterol en sang. La retenció de colesterol de les LDL (Low-Density
Lipoproteins) conegudes com a colesterol dolent, són les responsables de l’inici d’una
resposta inflamatòria en la paret arterial. També, existeixen les HDL (High-Density
Lipoproteins) que poden retirar el colesterol de les artèries i transportar-lo al fetge per a la
seva secreció. Per aquest motiu, se les coneix com a colesterol bo.
Diversos models experimentals i observacions epidemiològiques demostren el paper del
colesterol LDL en la iniciació i la progressió de l’arteriosclerosi. Kinsell i Groen et al. van ser
els primers en estudiar els efectes clarament diferencials en la concentració de colesterol
entre els àcids grassos saturats i els poliinsaturats. Van demostrar que una alimentació rica
en àcids grassos poliinsaturats (PUFA) i monoinsaturats (MUFA) en la dieta disminueix el
colesterol total en el plasma, cosa que no succeeix amb els àcids grassos saturats (SFA).
Aquestes observacions van ser, més tard, recolzades per estudis com el Seven Countries
Study, en què es va reafirmar la idea que el greix monoinsaturat actua en el nostre
organisme, protegint-lo contra les malalties del cor en comparació amb els greixos saturats.
Els MUFA redueixen eficaçment el colesterol LDL (colesterol dolent), a més de no disminuir
els nivells de HDL (colesterol bo), cosa que succeeix amb els PUFA.
Uns altres compostos als que se’ls ha atribuït un efecte cardioprotector són els compostos
polifenòlics, presents en el vi negre. El vi negre redueix la producció d’apolipoproteïnes com
l’ApoB100 i es va arribar a la conclusió que els seus compostos polifenòlics participen en la
regulació de rutes implicades en el metabolisme lipoproteic. Altres estudis també han
determinat que el consum moderat de vi negre augmenta significativament el colesterol
HDL, reduint el risc coronari.
Aquest treball de recerca es centra en demostrar bàsicament l’efecte beneficiós dels greixos
monoinsaturats, estudiant l’oli d’oliva, i més minoritàriament el del vi negre respecte al vi
� 5
blanc, pel que fa a les malalties cardiovasculars. Tot i així, també s’aprofundeix en l’àmbit
bioquímic i cultural de l’oli d’oliva. A més, es detallen els innumerables beneficis que ens
aporta aquest aliment en cada sistema de l’organisme i en la prevenció de malalties tan
comunes com el càncer i la diabetis. Tot aquest bagatge cultural em va permetre plantejar
un problema i determinar la metodologia que havia de seguir per resoldre’l .
La metodologia utilitzada va consistir en el tractament de cèl·lules amb un àcid gras
monoinsaturat present en l’oli d’oliva, l’àcid oleic, com a representant de l’àcid gras
monoinsaturat. A partir d’aquí es van comparar els seus efectes en la modulació de
l’ApoB100 (apolipoproteïna relacionada amb el colesterol dolent LDL) i l’ApoA1
(apolipoproteïna relacionada amb el colesterol bo HDL) respecte al tractament amb un àcid
gras saturat, utilitzant com a representant, l’àcid palmític.
Els objectius d’aquest procediment varen ser:
• Demostrar que els MUFA, i en concret l’àcid oleic, exerceix una funció protectora pel
que fa a les malalties cardiovasculars, amb el que es podrà confirmar que l’oli d’oliva
és un aliment irrefutablement beneficiós per a la salut.
• Aprovar la distinció de la dieta mediterrània com a una de les dietes més saludables
del món per contenir aliments cardioprotectors.
• Confirmar experimentalment la importància d’una bona alimentació rica en greixos
vegetals i la repercussió que aquesta té en l’organisme humà.
Per altra banda, vaig comparar també els efectes del vi negre en la producció d’aquestes
apolipoproteïnes respecte a un altre grup constituït per cèl·lules tractades amb vi blanc.
Ambdues comparacions, la de l’oli i la del vi, van ser realitzades mitjançant les tècniques de
Western Blot i QPCR (PCR quantitativa). Alhora es van fer observacions per microscòpia de
les secrecions de greix de les cèl·lules hepàtiques en presència d’alcohol. Els objectius
varen ser els següents:
• Comparar els dos tipus de vi i, refutar o bé corroborar la teoria que la ingesta
ocasional d’una copeta de vi és un hàbit saludable.
• Demostrar aquells efectes beneficiosos que ens pot aportar una ingesta moderada
de vi negre en la nostra dieta.
• Mostrar, per una altra banda, l’efecte perjudicial que pot provocar un consum regular
d’alcohol en el nostre organisme.
� 6
• Observar i determinar en quins dels dos tractaments, en vi negre o vi blanc, tenint en
compte un control, augmenta més la producció de secrecions lipídiques de les
cèl·lules HepG2.
Partint del fet que les apolipoproteïnes B (ApoB100) estan relacionades directament amb les
LDL, mentre que les apolipoproteïnes A (ApoA1) ho estan amb les HDL,
la meva hipòtesi és que potser en una alimentació rica en àcid oleic (component principal de
l’oli d’oliva),com a representant dels MUFA, i amb vi negre, ric en compostos fenòlics,
provocaria un augment d’ApoA1 i una reducció d’ApoB100. Contràriament, potser amb una
alimentació rica en àcid palmític, com a representant dels SFA hauria de passar tot el
contrari, és a dir, s’hauria de produir un augment de l’ApoB100 i una reducció de l’ApoA1.
Respecte a les cèl·lules tractades amb vi blanc hauria de comportar els mateixos resultats
qualitatius que en el cas de les cèl·lules tractades amb àcid palmític. D’aquesta manera, es
demostraria el possible efecte beneficiós de l’àcid oleic i el vi negre, i l’efecte perjudicial dels
SFA en el cas de l’àcid palmític, en l’organisme.
Quant a la determinació de la sobre-expressió de secrecions lipídiques en els diferents
tractaments amb vi partint d’un control, tinc dues hipòtesis. Per una banda, en els tractament
amb vi, ja sigui negre o blanc, potser hi haurà major presència de secrecions lipídiques que
en les cèl·lules control, fet que demostraria l’efecte perjudicial de substàncies alcohòliques
en el nostre organisme. Per altra banda, potser la presència serà major en les cèl·lules
tractades amb vi blanc que no pas amb vi negre, fet que corroboraria un cop més el seu
benefici en l’organisme, superior respecte al vi blanc.
La raó principal per la que vaig decidir tirar endavant amb aquest treball va ser per la
inquietud que aquest camp d’investigació em va despertar. La possibilitat de poder veure,
amb els meus propis ulls i a partir de les meves pròpies iniciatives el perquè de la influència
de l’alimentació en la nostra salut. Tanmateix, aquest no va ser pas el meu primer propòsit.
De fet, una de les dificultats d’aquest treball va ser el fet d’adonar-me que havia de realitzar
una recerca que em permetés dur a terme un bon treball de camp i que fos assolible a partir
de les meves aptituds i coneixements de batxillerat. Per això, vaig acabar decidint, amb
l’ajuda de la meva tutora Isabel Clavero Martí, que el projecte inicial enfocat cap a la diabetis
el canviaríem per un de dedicat a la incidència de la nostra alimentació a l’organisme humà.
Però, el que em va fer determinar de debò el meu treball va ser la possibilitat única de
realitzar la part pràctica del treball al departament de Metabolisme i Endocrinologia al Centre
d’Investigació de la Vall d’Hebron (VHIR). Sense cap dubte, vaig oferir-me per fer una
� 7
estància d’aproximadament un mes durant l’estiu i així poder dur a terme el meu treball
experimental en allà mentre que obtenia una experiència inigualable, no només a nivell
acadèmic sinó que també a nivell personal.
Finalment, a partir de les fonts d’informació i de l’ajuda que em podien aportar des del
(VHIR) vaig concloure que el meu treball englobaria la prestigiada dieta mediterrània i el
benefici d’aquesta pel que fa a les malalties cardiovasculars. Tot i així, aquest era un tema
massa ampli en el que fer recerca. Per això, tenint en compte que la trilogia mediterrània ve
marcada per: el pa, l’oli i el vi, vaig acabar per centrar-me únicament en l’oli d’oliva, ric en
àcids grassos monoinsaturats, àcid oleic. Per altra banda, no va ser fins més tard que em
van oferir comparar el vi negre respecte al vi blanc, que a més de presentar moltes altres
propietats, ajuda en la prevenció de patologies coronàries.
Aquesta decisió em va portar un imprevist en el treball, ja que em van suggerir fer una
pràctica centrada en el vi negre, vist que aquest influïa en les malalties cardiovasculars quan
jo ja havia realitzat gairebé tota la part teòrica del treball, centrada fonamentalment en l’oli
d’oliva. A més, els experiments que vaig fer requerien força temps i al presentar un termini,
no es van poder repetir per assegurar el màxim rigor possible en els resultats obtinguts. Sóc
conscient, per tant, que si s’hagués disposat de més temps, s’haurien d’haver repetit tenint
en compte el mètode científic. Un altre imprevist inevitable, típic en el camp de la
investigació, va ser la presència de contaminació en el primer medi de cultiu de les cèl·lules
que, per sort, encara no s’havien començat a tractar i va ser posteriorment resolt amb un
nou cultiu.
Pel que fa al primer imprevist, vaig decidir seguir endavant amb la proposta ja que sabia que
en contades ocasions es tenien oportunitats com aquestes i encara que no ho pogués
incloure en el treball, valdria completament la pena extreure’n conclusions, i així va ser. No
només vaig obtenir uns resultats favorables, sinó que també he pogut afegir els experiments
sobre el vi, relacionant-lo com a component de la dieta mediterrània gràcies al seu efecte
beneficiós en les malalties cardiovasculars. I és que amb tota la recerca i experimentació
que he realitzat, puc concloure aquesta introducció amb l’aprenentatge que efectivament tal i
com anuncia el dit: ‘’L’oli d’oliva, tot mal esquiva!’’.
� 8
2. L’OLI D’OLIVA
La paraula oli que prové del mot llatí oleum i del terme hebreu zait i de l’àrab az-zait (suc de
l’oliva), permet nombrar el líquid gras i espès que s’obté, generalment, a partir de diferents
fruits o llavors com la soja, el coco, l’oliva, el blat de moro o les ametlles.
Cal destacar, abans de començar, que només es pot considerar oli d’oliva, aquell que prové
del fruit de l’olivera i s’exclouen, per tant, tots aquells olis obtinguts per dissolvents, per
procediments de re-esterificació o bé de barreja amb altres olis d’una altra naturalesa.
Aquesta definició tampoc pot ser aplicada als olis de pinyolada d’oliva els quals seran
explicats en el punt 4.5.4 Oli d’oliva de pinyolada del treball.
L'olivera, Olea europaea és una de les plantes conreades més antigues, que es remunta a
uns 4.000 anys abans de Crist a la zona de Palestina (Figura 1). Pertany a la família
Oleaceae, un grup format per arbres, arbusts i plantes. L'olivera és l'única espècie de la
família amb fruit comestible.
Figura 1: Olea Europeae.
L’olivera, el seu fruit, l’oliva, i el suc natural, l’oli, han tingut, des de l’antiguitat, una ampla
difusió pels cinc continents. Originari del Pròxim Orient (Mediterrani oriental), l’olivera va
trobar un clima, terreny, i en definitiva unes condicions òptimes per proliferar.
� 9
L’oli d’oliva té moltíssimes utilitats. Entre d’altres: va ser utilitzat en els oficis litúrgics, va ser
indispensable en els rituals religiosos, servia com a combustible i cosmètic (Figura 2). A
més, en gastronomia, l’oli d’oliva adquireix especial importància, ja que encara avui en dia la
seva poca acidesa, transparència, color, perfum i gust característics fan que mantingui una
superioritat significant respecte a l’ús d’altres tipus d’olis.
Figura 2: Crema nutritiva actual elaborada amb oli d’oliva.
D’altra banda, l’oli d’oliva no ha estat reconegut únicament per les seves virtuts culinàries
sinó que també per les preventives. I és que, l’oli d’oliva ens protegeix de malalties tan
freqüents com l’arteriosclerosi, la diabetis, la hipertensió, així com de diferents tipus de
càncer. Això es deu principalment a la seva composició
química.
Per tant, l’oli d’oliva, a banda de ser la base de molts
aliments i plats de la nostra cultura i del seu indiscutible gust
exquisit, és també un producte saludable (Figura 3). Per
totes aquestes innumerables qualitats, l’oli d’oliva és
considerat un producte complet, natural i el greix més
saludable, un aliment, doncs, que val la pena conservar en
el nostre context cultural.
Figura 3: Oli d’oliva pel consum culinari.
� 10
3. PART BIOQUÍMICA
Aquesta part del treball es centrarà especialment en explicar tots els components de l’oli
d’oliva i les propietats químiques i físiques que aquests li aporten.
3.1 Composició química de l’oli d’oliva
L’oli d’oliva presenta propietats específiques però hi ha dues comunes amb altres
substàncies lipídiques. Els olis estan constituïts per les biomolècules energètiques per
excel·lència: els lípids.
Els lípids, o quotidianament parlant els greixos, són nutrients indispensables per a
l’organisme. Tenen la funció de reserva alimentària a l’organisme i ens aporten l’energia
necessària per desenvolupar les activitats físiques i intel·lectuals a més de ser una font de
calor. En concret ens aporten 9 kcal /g a diferència de la mateixa quantitat d’hidrats de
carboni o proteïna que ens aporta 4 kcal. Per això tot teixit biològic requereix de lípids per
desenvolupar la seva activitat.
Ens garanteixen també l’aportació de certs àcids grassos essencials (àcid linoleic i linolènic),
poliinsaturats en la mesura necessària per al nostre cos. Som incapaços de sintetitzar-los i
hem d’ingerir-los a partir de la nostra dieta alimentària. Així mateix, el fet que algunes
vitamines només siguin liposolubles, explica la necessitat de lípids en el nostre cos perquè
aquestes puguin ser absorbides.
Per això, totes aquelles substàncies que contenen lípids, com l’oli d’oliva, compleixen dues
característiques comunes i essencials:
1. Són insolubles en aigua i en altres dissolvents polars i són menys densos que
l’aigua, amb una densitat d’ aproximadament 920 kg/m3
2. Són solubles en dissolvents orgànics, és a dir apolars.
Els lípids poden o no està formats per àcids grassos3. Els que no en contenen s’anomenen
lípids insaponificables és a dir, que no poden fer saponificacions4 ni esterificacions5. En
canvi, els que contenen àcids grassos, com és el cas de l’oli d’oliva s’anomenen lípids
saponificables6 i presenten una fracció insaponificable i una altra saponificable que fa
referència a alguns àcids grassos lliures, responsables de l’acidesa i als triglicèrids, èsters
format per la reacció de la glicerina (un alcohol) amb els àcids grassos corresponents que
constitueixen triglicèrids principalment.
� 11
Els àcids grassos formen part d’entre el 98,5 i el 99,5% de l’oli d’oliva i tenen caràcter
amfipàtic, és a dir, els àcids grassos tenen una part polar o hidròfila (l'extrem carboxil) i una
part apolar o hidròfoba (la resta de la cadena) (Figura 4).
Figura 4: Estructura d’un àcid gras.
3.2 Fracció saponificable
Els àcids grassos, la fracció saponificable, deriven dels hidrocarburs que estan compostos
per carboni i hidrogen i que a més presenten isomeria. En concret, presenta l’esqualè que és
un compost necessari per a la biosíntesis de colesterol i precursor del cicloartenol,
substància a partir de la qual es sintetitzen els fitoesterols.
Pel que fa els àcids grassos, diferenciem dos grans grups segons la seva composició
química:
3.2.1 Àcids grassos insaturats
Estan formats pels mateixos compostos que els àcids grassos saturats, l’única diferència
és que a les seves molècules tenen un o més enllaços dobles entre els carbonis de la
seva cadena hidrocarbonada. (Figura 5).
Figura 5: Estructura d’àcid gras insaturat, en concret de l’àcid palmitoleic.
� 12
Segons el nombre d’enllaços els podem classificar en dos grups:
• Àcids grassos monoinsaturats
Si només en tenen un s’anomenen àcids grassos monoinsaturats i són poc propensos a
l’oxidació. Els àcids grassos monoinsaturats més importants són presents a la Taula 1:
Taula 1: Àcids grassos monoisaturats.
Nom comú Punt de fusió (ºC) Principal font
Caproleic --- Greixos de llet
Lauroleic --- Greixos de llet
Miristoleic --- Esperma de balena
Palmitoleic --- Olis marins
Petroselínic 30 Umbel·líferes (planta)
Oleic 14-16 Oli d’oliva
Elaídic 44 Greixos bovins
Erúcic 33.5 Crucíferes (planta)
Dos àcids grassos monoinsaturats de gran renom degut a la seva extensa importància
són:
o L’àcid oleic
Aquest àcid constitueix entre el 65 i el 80% del contingut de l’oli d’oliva, però a més és
present en quasi tots els greixos animals i vegetals en proporció d’un 10% aproximadament.
És un àcid gras essencial ja que no el podem sintetitzar i s’ha d’introduir a través de la dieta.
L’alt contingut d’àcid oleic en l’oli d’oliva garanteix l’aportació necessària de greix
monoinsaturat. Aquest àcid té innumerables beneficis en el funcionament de l’organisme
humà i se li atribueixen la majoria de propietats salutíferes de l’oli d’oliva. Aquest component
contribueix en la constitució i configuració de les membranes cel·lulars, donant la fluïdesa i
la permeabilitat necessàries per aquestes.
� 13
o L’àcid palmitoleic
A banda de l’àcid oleic és un dels àcids més difosos a la naturalesa i es troba en tots els
greixos i olis, tot i que en petites proporcions.
• Els àcids grassos poliinsaturats
Els àcids grassos poliinsaturats són els que presenten menys estabilitat. Aquest fet afavoreix
l’inici del procés de formació de radicals lliures i per tant de l’oxidació de l’oli. Aquest procés
és la causa de que els olis es tornin rancis, donant-los mal sabor i olor com a conseqüència
dels compost volàtils que es generen.
Com es pot observar en la Taula 2, a mesura que augmenta el grau d’insaturació,
disminueix el seu punt de fusió, per això aquests àcids són líquids a temperatura ambient.
Taula 2: Àcids grassos poliisaturats.
Nom comú Punt de fusió (ºC) Principal font
Linolènic -11 Oli de llinosa i perilla.
Araquidònic -50 Depòsits de greixos animals
Clupanodònic --- Olis marins
Linoleic -5 Oli de gira-sol, cotó i
càrtam.
o L’àcid linolènic
És un dels àcids poliinsaturats més estesos en la natura, és present en un 2% de l’oli d’oliva.
o L’àcid linoleic:
És present a l’oli d’oliva en un 3-14%, és un dels àcids grassos essencials per a l’organisme.
Els àcids grassos poliinsaturats són els que presenten menys estabilitat. Això afavoreix
l’inici del procés de formació de radicals lliures i per tant de l’oxidació de l’oli. Aquest procés
és la causa de que els olis es tornin rancis, donant-los mal gust i olor com a conseqüència
dels compostos volàtils que es generen. És present, també, en l’oli de càrtam (75%), en el
de gira-sol (60-75%), el de cotó(45%), soja (57%) i en el de blat (66%).
� 14
3.2.2 Àcids grassos saturats
Només tenen enllaços simples entre els àtoms de carboni de la seva cadena alifàtica (Figura
6) Els trobem en greixos d’origen animal (carn, xocolata, mantega, formatge...) i en olis com
el de coco i el de palma. Pel que fa al contingut d’àcids grassos saturats en l’oli d’oliva,
només trobem d’un 13 a un 21% del total d’àcids grassos.
Figura 6: Estructura d’un àcid gras saturat, en concret l’àcid palmitoleic.
Els tres àcids grassos saturats més comuns a la naturalesa són:
o L’àcid làuric
El seu nom el deu a la família de les Lauràcies on aquest tipus d’àcid gras saturat és present
en les seves llavors. A vegades arriba al 90% del total d’àcids grassos que constitueixen l’oli
de la llavor. També és present en els olis de coco(40-50%) i la mantega de vaca (2-8%).
o L’àcid esteàric �
La major part dels olis vegetals contenen àcid esteàric en una proporció de l’1 al 5%. En
canvi, és un component dels greixos animal: en la cansalada (10%), en la mantega de cacau
(20%) i en el sèu (35%).
o L’àcid palmític
És l’àcid saturat més estès de tots ja que és present en gairebé tots els olis i greixos
vegetals i animals, en diferents proporcions. El percentatge d’aquest àcid en l’oli d’oliva varia
entre un 8% i 20%.
� 15
3.3 Fracció insaponificable
A banda del component principal de l’oli d’oliva que són els àcids grassos, i especialment
l’àcid gras monoinsaturat -àcid oleic-, també trobem altres components: tocoferols,
polifenols, esterols i pigments (carotenoides i clorofil·la majoritàriament). Tots aquests
components constitueixen la part insaponificable, denominada així, ja que, a diferència dels
àcids grassos, aquests components no tenen la capacitat d'esterificar-se o saponificar-se
constituïda per: També formen part d’aquesta fracció insaponificable de l’oli d’oliva diferents
compostos orgànics (alcohols, èsters i cetones) que també poden influir en l’oli, sobretot pel
que fa a les seves propietats organolèptiques.
3.3.1 Els esterols
Són alcohols neutres insaponificables, que tenen un alt punt de fusió. Aquests són la major
part de la fracció insaponificable de tots els olis i greixos. Els fitoesterols són presents en l’oli
d’oliva, li aporta propietats antioxidants (Figura 7). Són compostos derivats del esqualè . La
seva funció principal és estructural, ja que són constituents de les membranes cel·lulars
vegetals.
Figura 7: Estructura química dels fitoesterols.
La seva importància fisiològica té a veure amb el fet que interfereix en l’absorció intestinal
del colesterol dietètic. En l’oli d’oliva trobem entre 80 y 265 mg per cada 100 g .La
concentració de fitoesterols pot variar dependent del grau de maduració de l’oliva en el
moment de la recollida.
L’oli d’oliva conté altres components menors, que poden afectar o no a les seves
característiques i comportament.
� 16
3.3.2 Els tocoferols: vitamina E
Els tocoferols són antioxidants que preserven els olis de l’oxidació i constitueixen la vitamina
liposoluble E, en concret α-tocoferol (Figura 8). A més, protegeixen els olis del procés
d’enranciment, oxidant-se ells abans i així evitant, per tant, que l’oxigen arribi a reaccionar
amb els àcids grassos i provoqui l’enranciment de l’oli.
Figura 8: Estructura química del principal component de la vitamina E: α-tocoferol.
Biològicament parlant, a causa de la seva naturalesa lipòfila es troba en les solucions
lipídiques de l'organisme, protegint els fosfolípids de les membranes cel·lulars i les
lipoproteïnes de la peroxidació lipídica. Les ingestes recomanades de vitamina E es xifren
en 8-10 mg / dia. L’oli d’oliva cobreix aquestes necessitats ja que aporta 10 mg d’ α-tocoferol
per cada 100 grams.
3.3.3 Les vitamines i els pigments: carotens
L’oli d’oliva és un aliment ric en vitamines liposolubles. Les vitamines són substàncies
orgàniques glúcids o lípids senzills que són necessàries pel desenvolupament de les
funcions de l’organisme. Les vitamines liposolubles són aquelles que es dissolen en
substàncies lipídiques. En el cas dels animals i humans que, a diferència dels vegetals, som
incapaços de sintetitzar-los, pel que han de ser subministrades a través de la dieta.
Les vitamines liposolubles que trobem en l’oli d’oliva, tot i que en diferents proporcions són:
• Vitamina D (antiraquítica), intervé en l’absorció de calci.
• Vitamina K (antihemorràgiques), regula la coagulació de la sang.
• Vitamina A (el beta-carotè) que és essencial per a la protecció de teixits epitelials i per la
seva participació en el procés de visió de la retina.
• Vitamina E (l’α-tocoferol) que té funció antioxidant.
� 17
A banda de les vitamines, l’oli d’oliva presenta altres compostos lipídics com els pigments ,
que químicament són terpens. Els pigments, com la clorofil·la, aporten als olis el seu color
verd groguenc característic. Altres pigments són els carotenoides (la luteïna, i la
violaxantina) que són insaturats i li donen un color que va del groguenc al vermell i no poden
ser eliminats per neutralització amb sosa, però que són inestables a la temperatura. Un dels
compostos de la família dels carotenoides més important pel seu paper com a precursor de
la vitamina A és el beta-carotè (Figura 9).
Figura 9: Estructura química dels beta-carotens.
3.3.4 Compostos fenòlics
Són compostos característics de les plantes verdes on la unitat bàsica és el fenol.� Els
compostos fenòlics que també trobem en diferents aliments a part de a l’oli d’oliva,
constitueixen una fracció molt complexa formada per un nombre molt gran de compostos,
alguns encara no identificats. Els compostos fenòlics es classifiquen en:
1. No flavonoides: entre ells trobem els fenols no carboxílics i els àcids fenols,
derivats de l’àcid benzoic.
2. Flavonoides: és el grup fenòlic més estès en la naturalesa, formats per 2
grups benzènics units per un pont tricarbonat. Entre ells trobem els antocians,
les isoflavones, els flavonols, que són els que tenen més activitat antioxidant,
els tanins, els lignans i el resveratrol, entre d’altres. Es coneixen més de 8000
polifenols vegetals entre els quals es troben els flavonoides (Figura 10)
Figura 10: Estructura química dels flavonoides.
� 18
Els polifenols contribueixen al sabor, aroma i color de l’oli d’oliva. De tots els aliments
vegetals l’oli d’oliva, el verge i el verge extra són els únics olis que contenen compostos
fenòlics naturals, ja que els olis de llavors i refinats els perden durant el tractament. Pel que
fa a l’activitat antioxidant dels polifenols, aquests s’oxiden ràpidament fins a desaparèixer i
per tant prevenen l’oxidació de substàncies essencials pel nostre organisme (Figura 11).
Figura 11: Esquema del poder antioxidant de les cèl·lules humanes.
Són substàncies majoritàriament hidrosolubles presents en la polpa de l'oliva, encara que en
l'oli es poden trobar petites quantitats d'aquests elements. Pel que fa a la caracterització dels
compostos polifenòlics de l'oli, Montedoro i col·laboradors el 1992 van trobar que, a més de
certs fenols simples com ara hidroxitirosol i tirosol, els majoritaris en els olis eren les
oleuropeïnes. Altres compostos identificats recentment en els olis són la vanillina,
l’hidroxitirosol acetilat (Brenes et al., 1999) i els lignans 1-acetoxipinoresinol i pinoresinol
(Brenes et al., 2000). Altres compostos fenòlics identificats en l'oli d'oliva verge són l’àcid
gàl·lic i l’àcid cinàmic. La dificultat en la identificació dels polifenols ha fet que, en l'actualitat,
no es conegui amb exactitud el contingut fenòlic dels olis d'oliva. Així, s'ha indicat que
aquest contingut pot oscil·lar entre 60 i 1200 mg / kg segons el tipus d’oliva i el moment de
recollida de les olives.
Tots aquests components de la fracció insaponificable de l’oli també tenen qualitats
nutritives importants que consisteixen bàsicament en l'activitat vitamínica dels carotens
(provitamina A) i tocoferols (vitamina E). A això se sumen els efectes beneficiosos per a la
salut originats per la capacitat antioxidant i antiinflamatòria (entre d'altres) dels compostos
fenòlics. Aquestes propietats antioxidants són el motiu de les seves possibles implicacions
en la salut humana i concretament en la prevenció del càncer, de les malalties
cardiovasculars o fins i tot de malalties neurodegeneratives com l'Alzheimer.
� 19
3.4 Propietats físiques
A causa de la composició química de tots els olis i els greixos, tenen propietats químiques
comunes en tots ells.
3.4.1 Punt de fusió
Una de les característiques principals és la relació que trobem entre el punt de fusió de l’oli
segons la longitud de la cadena alifàtica dels àcids grassos que el formen i la presència o no
d’insaturacions.
En els àcids grassos saturats, el punt de fusió augmenta a causa del número de carbonis,
mostrant tendència a establir enllaços de Van der Waals entre les cadenes carbonades.
Els àcids grassos tendeixen a agrupar-se perquè els grups carboxils estableixen enllaços
d’hidrogen i enllaços per forces de Van der Waals entre les cadenes lipòfiles dels àcids.
Com a conseqüència presenten més tendència a formar sòlids. Per tant, per fondre aquests
sòlids, s’haurien de trencar aquests enllaços. El punt de fusió d’un àcid gras variarà segons
sigui insaturat o saturat, i per tant no tots es fondran a la mateixa temperatura. Els
insaturats, com que presenten enllaços dobles entre alguns dels seus carbonis, les seves
cadenes lineals presenten colzes que dificulten que es puguin establir interaccions d’aquest
tipus entre diferents molècules. Això explica perquè els punts de fusió dels àcids grassos
insaturats són molt més baixos.
� 20
A la taula 3 es mostren els diferents tipus d’àcids grassos saturats i els seus respectius
punts de fusió. Aquells àcids que presenten 10 o més carbonis són sòlids. D’altra banda, el
punt de fusió és directament proporcional a la longitud de la cadena.
Taula 3: Punt de fusió segons l’àcid gras saturat.
ÀTOMS DE CARBONI ÀCID PUNT DE FUSIÓ (ºC)
4 Butíric -8
6 Caproic -3.4
8 Caprílic 16.7
10 Càpric 31.6
12 Làuric 44.2
14 Mirístic 54.4
16 Palmític 62.9
18 Esteàric 69.6
20 Arcaic 75.4
22 Bènic 80
24 Lignocèric 84.2
� 21
3.4.2 Solubilitat
Els àcids grassos de 4 i 6 carbonis són solubles en aigua, però a partir de 8 carbonis són
pràcticament insolubles. Són molècules bipolars o amfipàtiques (del grec amphi, doble), com
s’ha explicat pèviament. El cap de la molècula és polar o iònica i, per tant, hidròfila (-COOH),
que pot establir enllaços amb altres molècules d’aigua o polars. La cadena és apolar o
hidròfoba (grups -CH2- i -CH3 terminal) i que pot establir enllaços de Van der Waals amb
altres molècules lipídiques. Quan això es produeix s’originen unes gotetes en els medis
aquosos que s’anomenen micel·les (capes esfèriques) o be formant una pel·lícula en la
superfície, d'aquesta manera només el cap polar fa enllaços ponts d'hidrogen amb l'aigua.
Les micel·les són l’estructura originària de la bicapa lipídica de les membranes cel·lulars,
d’aquí la seva importància biològica. (Figura )
Figura 12: Comportament d’un àcid gras en contacte amb aigua: micel·la.
� 22
3.5 Propietats químiques
A banda d’aquest aspecte, tots els compostos lipídics poden dur a terme les següents
reaccions:
3.5.1 La hidròlisi i l’esterificació
Els olis són lípids i pertanyen a la classificació dels saponificables simples. Estan formats
generalment per triacilglicèrids , és a dir èsters formats per tres àcids grassos i glicerina. Per
tant, els olis són triacilglicèrids formats per un àcid gras insaturat i una molècula d’alcohol, la
glicerina, que li aporta la propietat de líquid a temperatura ambient. Els èsters que formen
els olis s’obtenen a partir de reaccions d’esterificació.
Així mateix, la reacció contrària a l’esterificació a partir de la qual es formen els glicèrids és
la hidròlisi de la que s’obtenen els seus dos components per l’acció de l’aigua: la glicerina i
els àcids grassos. Els triacilglicèrids donen lloc a mono o diglicèrids, i a àcids grassos lliures
que contribueixen al deteriorament de l’oli ja que fan que l’oli adquireixi un gust àcid.
Aquesta reacció és catalitzada per àcids i enzims lipolítics. Veiem com són les reaccions:
Esterificació trioleïna:
3(CH3-(CH2)7=CH-(CH2)7-COOH) + C3H5(OH)3� 3(CH3-(CH2)7=CH-(CH2)7-COO- C3H5)+3H20
Hidròlisi trioleïna:
3(CH3-(CH2)7=CH-(CH2)7-COO- C3H5)+3H20� 3(CH3-(CH2)7=CH-(CH2)7-HCOOH) + C3H5(OH)3
3.5.2 La saponificació amb àlcalis
Els olis són lípids saponificables per tant poden fer reaccions de saponificació. En aquesta
reacció, els àcids grassos reaccionen amb àlcalis com l’hidròxid de sodi. Finalment,
s’obtenen sals dels àcids grassos que reben el nom de sabons i com a substància de rebuig
aigua. Aquesta reacció és la base de la fabricació de sabons i també el fonament de la
refinació dels olis, perquè així es neutralitzen els àcids grassos que puguin haver quedat
lliures en els olis com a conseqüència de la hidròlisi. Tanmateix, això a vegades comporta la
pèrdua d’alguns compostos fenòlics com l’oleuropeïna que és destruïda amb l’acció d’àlcalis.
La reacció és la següent:
Trioleïna:
3(CH3-(CH2)7=CH-(CH2)7-COO- C3H5) + 3NaOH� C3H5(OH)3+3(CH3-(CH2)7=CH-(CH2)7-COO-Na)
� 23
3.5.3 L’enranciment de l’oli d’oliva. Oxidació.
L’enranciment és degut a la seva composició lipídica. En els llocs on hi ha excés de greix es
produeix una oxidació dels greixos naturals que provoquen el seu deteriorament. L’oxidació
en alguns olis d’oliva consisteix en la combinació dels triglicèrids amb oxigen, reacció que
empitjora les característiques organolèptiques de l’oli d’oliva. Com a conseqüència l’oli deixa
de ser apte per al consum humà és per això que a l’oli s’hi afegeix més antioxidants com els
polifenols i tocoferols per a preservar-lo.
L’oli d’oliva conté més antioxidants naturals que actuen com el seu sistema immunològic,
que els greixos animals o vegetals, per això són més resistents a l’enranciment.
Per tant, aquells olis que presentin més antioxidants seran menys propensos i més
resistents a l’enranciment. En el cas de l’oli d’oliva, per exemple, l’activitat antioxidant no es
deu només als tocoferols, sinó també als polifenols. El contingut total d’aquests compostos
en l’oli d’oliva és un indicador de l’estabilitat de l’oli i de la qualitat de l’oli en qüestió. Cal
assenyalar, que el contingut en polifenols depèn de la varietat d’oliva i que en el procés
d’elaboració de qualsevol oli comestible, s’ha de tenir en compte que les temperatures
superiors als 35ºC descomponen la vitamina E (tocoferols), i conseqüentment l’oli perd un
dels seus antioxidants naturals més importants.
Un oli es pot tornar ranci a partir d’una:
• L’enranciment per auto-oxidació: reacció química per combinació directa amb
l’oxigen produïda a qualsevol temperatura, on es formen els hidroperòxids que
continuen oxidant-se i produeixen aldehids i cetones, responsables dels olors i
gustos desagradables característics dels olis rancis.
• L’enranciment per hidròlisi o oxidació: La presència d’aigua pot provocar la hidròlisi
dels radicals grassos i es restitueixen algunes molècules de l’àcid. Com a
conseqüència, es desenvolupa una cadena de reaccions que fan que l'oli tingui una
olor i un gust desagradables.
• L’enranciment per degradació dels lípids: Els enllaços alfa dels radicals dels àcids
grassos presents en els olis, són atacats per enzims de fongs o bé microorganismes
com bacteris que secreten lipases, encarregades de la degradació del triglicèrid.
Aquest mecanisme allibera una olor molt irritant i repulsiva.
� 24
4. PART CULTURAL
En aquest punt del treball, l’oli d’oliva és enfocat com a un element cultural. I és que, és un
aliment característic de la nostra alimentació, cosmètica i forma part de la nostra història.
Per tant, un aspecte cultural més característic de la nostra vida mediterrània.
4.1 L’oliva com a matèria primera
L’oli d’oliva prové del fruit de l’olivera que pertany a la família de les oleàcies. D’aquest arbre
existeixen unes 2000 varietats diferents que es troben repartides per tot el món tot i que molt
més abundants en els països de la conca mediterrània. Del fruit de l’olivera, l’oliva, s’obté
l’oli d’oliva.
L’oliva és un fruit de color verd o negre violat que està compost per tres parts perfectament
diferenciades (veure Figura 13):
1. La part exterior, anomenada epicarpi o pell.
2. La part intermèdia, anomenada mesocarpi, polpa o carn.
3. La part interior, anomenada endocarpi o os que conté la llavor.
Figura 13: Estructura interior d’una oliva.
La polpa és la part més important, ja que és la conté l’oli en forma de gotes minúscules que
es troben envoltades de membranes proteiques dintre de les cèl·lules parenquimàtiques
(cèl·lules dels teixits de sosteniment) de l’oliva.
El contingut de l’oli dintre de la polpa varia entre un 18 i un 30% del pes del fruit segons la
varietat de l’oliva. L’os o endocarpi, que es troba adherit a la polpa, està lignificat i té una
consistència molt dura, pel seu contingut en cel·lulosa.
� 25
La composició d’una oliva seria aproximadament la següent: un 22% d’oli d’oliva, un 33% de
pell i os (el que es coneix com a sansa- orujo en castellà-) i la resta el constitueix l’aigua de
vegetació (les oliasses). També té importància per la seva riquesa mineral: sofre, calci, clor,
fòsfor, ferro, magnesi, sodi i potassi.
El fruit de l’olivera posseeix les mateixes propietats nutritives pròpies de l’oli que en
produeix, però també té altres característiques culinàries. La riquesa de l’oli obtingut varia
segons el tipus d’oliva a partir de la qual s’ha extret, aquesta riquesa ve determinada per la
meteorologia, la maduresa normal, el moment de recol·lecció i les condicions del sòl on es
trobava l’olivera d’on s’ha recollit el fruit.
El número de varietats d’oliveres i per tant d’olives que es cultiven en el món és molt gran,
existeixen unes 1500 varietats diferents d’oliveres de les quals 260 es troben a Espanya.
Actualment, trobem unes 25 varietats d’olives cultivades a Espanya i es troben repartides
majoritàriament per les comunitats autònomes d’Aragó, Andalusia, Castilla la Manxa,
Castella i Lleó, Catalunya, Extremadura i el País Valencià. Tot i així, la xifra real de varietats
d’oliveres , a nivell mundial, encara està per definir.
� 26
En la següent taula (Taula 4) es troben les diverses composicions d’àcids grassos de les
principals varietats cultivades a Espanya, referits al percentatge d’àcid gras individual , sigui
saturat o insaturat, respecte al total d’àcids grassos.
Taula 4: Contingut d’àcids grassos segons el tipus d’oliva.
Font: Ávila Granados. J. Enciclopedia del aceite de oliva.
Com es pot veure, l’oliva Arbequina i la Cornicabra contenen un alt percentatge en àcid
oleic, cosa que les converteix en productores d’un oli d’excel·lent qualitat no només pel que
fa a les seves propietats organolèptiques, però també salutíferes, degut a la gran quantitat
de beneficis, explicats en l’apartat 5. Part biològica del treball. La composició d’àcids grassos
d’un oli depèn fonamentalment de la varietat d’oliva emprada per a la producció de l’oli. Tot i
així, factors com: el moment de recol·lecció del fruit, la procedencia, el procés d’elaboració i
la conservació de les olives, poden tenir una notable influència en la composició final de l’oli.
ÀCIDS GRASSOS SATURATS (%) ÀCIDS GRASSOS INSATURATS (%)
Varietat Palmític Esteàric Araquídic Oleic Linoleic Linolènic Palmitoleic
Arbequina 13.5 1.9 0.3 70.2 11.4 0.8 1.5
Blanqueta 14.5 1.5 --- 67.4 14.2 0.6 1.5
Changlot
Real
10.9 1.3 --- 80.0 6.1 0.6 0.6
Cornicabra 8.5 3.9 0.4 80.3 5.6 0.7 0.6
Empeltre 12.1 1.4 --- 74.6 9.4 1.0 1.2
Hojiblanca 8.6 4.1 0.4 74.3 10.0 1.4 0.7
Lechín 12.3 1.7 0.2 69.2 13.5 1.4 1.1
Picual 9.9 3.6 0.3 79.7 4.8 0.8 0.6
Picudo 13.5 2.2 0.3 65.6 15.6 1.4 1.4
Verdial 10.8 2.6 0.4 81.1 3.1 0.7 0.9
� 27
4.2 La història de l’oli d’oliva
Les primeres notícies sobre el cultiu de l’olivera daten del 6000 a.C, a l’Orient Mitjà. En la
regió de Síria, junt el riu Èufrates, on ja s’elaborava i es comerciava amb l’oli d’oliva. Des
d’allà, s’aniria expandint el seu cultiu per un costat cap a les illes del mar Egeu, la península
hel·lènica (actual Grècia) i Anatòlia (actual Turquia) i per un altre a Egipte i el Nord d’Àfrica,
ocupant finalment tota la Conca del Mediterrani (Figura 14).
Figura 14: Expansió del cultiu de l’olivera en el Mediterrani.
Els fenicis van ser els grans impulsors del comerç de l’oli d’oliva a través de les seves
colònies, van començar des de Cartago, actualment Tunísia , fins les costes de Grècia i
posteriorment a l’Imperi Romà. A més, l’oli d’oliva va ser introduït a España gràcies els
fenicis pel sud, concretament per les costes gaditanes, cap a l’any 1050 a.C, tot i que no va
ser fins el domini romà que aquest es va acabar d’expandir per la península ibèrica. Amb
l’arribada dels romans a Espanya es produeix un gran desenvolupament del cultiu de
l’olivera i del comerç en la Bètica (actualment part d’Andalusia) anomenada pels romans:
Hispania.
� 28
Des del segle II, l’oli d’oliva s’importava des de la Bètica, principalment, en àmfores (Figura
15) per les vies fluvials europees (Rin, Danubi...) fins arribar a (Germania, Gàl·lia i Britània).
Figura 15: Àmfora Panatenees (500 a.C).
Per altra banda, l’oli, pels romans, era signe de qualitat i puresa i hi ha moltes llegendes
sobre els diversos usos d’aquest, encara que també sobre l’origen de l’olivera i el cultiu del
seu fruit. En les diferents religions i en la mitologia, sobretot la grega, és destacat el paper
de l’oli d’oliva i el valor simbòlic que aquest pren. Per tant, ja des de l’antiguitat l’olivera i el
seu fruit ha estat molt apreciat per moltes civilitzacions que no només l’han utilitzat com
aliment, sinó que també l’han utilitzat per il·luminar, com a cosmètic i com a medicament.
Tanmateix, van ser els àrabs que a més de gaudir de l’oli d’oliva i incorporar mètodes
innovadors d’extracció, elaboració i envasat, a banda d’aportar-nos el seu nom. Així mateix,
la Reconquesta dels Reis Catòlics no van fer desaparèixer l’interès per l’oli d’oliva i amb el
descobriment d’Amèrica, els espanyols van portar l’olivera fins Amèrica, primer fins a les
Antilles i després pels altres països conquistats en el continent americà. Per això, avui és
possible localitzar oliveres a Argentina, Mèxic, Perú, Xile, entre d’altres, moltes d’elles
arribades en els segles XVI i XVII. A partir del segle XVI, es pateix un gran avanç tecnològic
amb la incorporació de màquines per a l’extracció d’oli d’oliva. Més endavant, un cop s’hagi
produït la Revolució Industrial, l’oli esdevindrà un producte actiu gràcies els seus usos
industrials, socials i domèstics.
� 29
4.3 Criteris qualitatius de l’oli d’oliva
Un cop vistes les principals varietats d’oliva a partir de les quals obtenim diferents olis,
passem a parlar sobre els tipus d’olis d’oliva que trobem al mercat un cop han estat
elaborats procurant que el producte que arriba al consumidor ho fa en les condicions
adequades i amb el màxim de qualitat possible. Com és evident, no tots els olis presenten
les mateixes característiques, ja que com s’ha dit, aquestes depenen no només de la
varietat d’on s’ha extret el producte final, és a dir l’oli, sinó també les condicions del sòl i
climatològiques de la regió on ha estat cultivat i fins i tot el procés tecnològic el que ha estat
sotmès. Per totes aquestes raons, trobem olis amb diferents propietats i com a
conseqüència no tots són de la mateixa qualitat. Els criteris de qualitat que s’apliquen a l’oli
d’oliva vénen definits, a banda de l’anàlisi sensorial de les característiques organolèptiques
definides pels experts –panel test- i per determinacions químiques com:
• El grau d’acidesa: expressa el percentatge d’àcids grassos lliures presents a l’oli. El
seu valor ve determinat en percentatge d’àcid oleic. L’oli d’oliva biològicament
sintetitzat és neutre, per tant l’existència d’àcids grassos lliures és una anomalia
deguda a un mal estat de conservació dels fruits, d’un procés incorrecte d’elaboració
o d’una mala conservació. Per tant, major grau d’acidesa, major és el deteriorament
de les olives de les que s’ha obtingut l’oli respectiu. Així, doncs, l’acidesa determina
la qualitat de l’oli, però no té cap incidència en el gust d’aquest. Tot i així, el grau
d'acidesa no condiciona el gust de l'oli, i només es detecta mitjançant una anàlisi
química. Segons la reglamentació sanitària un oli és apte pel consum humà fins el
3,3% d’acidesa.
• L’índex de peròxids: ens ofereix informació sobre l’estat d’oxidació dels àcids grassos
o bé sobre el deteriorament que poden haver patit alguns components de l’oli com la
vitamina E. Els seus límits se situen entre els 20 mg/kg.
• L’absorbència ultraviolada (índexs K232 i K270): aquests índexs proporcionen diferents
indicacions sobre la qualitat de l’oli, ja que detecten els components oxidats presents
en l’oli d’oliva. Un oli obtingut d’una oliva sana i que no hagi estat sotmesa a cap
tractament diferent de les operacions necessàries per l’extracció de l’oli, el seu valor
ha de ser normalment inferior al 0,25%.
� 30
4.4 El procés de refinació de l’oli d’oliva
De tots els olis vegetals que existeixen en el mercat, l’oli d’oliva és l’únic que procedeix del
fruit, tots els altres (gira-sol, soja, cacauet...) procedeixen de llavors. Per tant, l’oli d’oliva és
l’únic directament comestible un cop extret i no necessita ser sotmès a cap procés químic ja
que presenta unes característiques de gust, olor i color agradables pel paladar humà. Tot i
així, per tal de millorar algunes de les propietats organolèptiques o bé modificar algun dels
criteris esmentats en el punt 4.3 Criteris qualitatius de l’oli d’oliva, alguns olis d’oliva també
són refinats. El refinat produeix un oli comestible i apropiat per a fregir. Hi ha dos tipus de
refinació:
o La refinació química o alcalina
o La refinació física o destil·lació
4.4.1 La refinació química o alcalina
Després del procés d’extracció s’obtenen olis crus que s’emmagatzemen. De forma natural
aquests olis contenen fosfolípids, resines, àcids grassos lliures, pigments...
Però, a més, el grau d’acidesa que presenten junt amb les substàncies naturals que
contenen (aldehids, alquens...) els fan poc aptes pel consum humà i cal refinar-los.
Tot i que la majoria d’olis comestibles han de ser refinats per ser aptes pel consum humà,
l’oli d’oliva i concretament l’oli d’oliva verge extra és l’únic que pot ser consumit directament,
sense necessitat de passar per cap procés químic.
La majoria dels olis després de ser premsats en fred com l’oli d’oliva, ja poden ser destinats
al consum sense més tractament (és el cas dels olis verges), però si no compleixen les
característiques adequades també es refinen. Aquest tipus de refinació química, va
corregint, pas a pas, els diversos defectes que pugui tenir l’oli i en cada un d’ells s’elimina
algun component que alteri les característiques organolèptiques o bé que perjudiquin la seva
conservació.
En el procés de refinació, els principals passos són:
• El desfangat� Consisteix en eliminar les impureses sòlides. Aquest procés de separació
dels components sòlids de l’oli només es duu a terme en el cas que el tipus de procés que
s’hagi utilitzat per obtenir l’oli no inclogui fases d’extracció o separació per centrifugació.
• El desgomat�� El desgomat consisteix en eliminar les ceres i els fosfats. S’aconsegueix
eliminar els fosfolípids ja que la presència d’aquests en aigua formen precipitats, que
� 31
espatllen l’aspecte i a més fan que l’oli s’acidifiqui i s’oxidi, causant un gust desagradable.
Aquestes substàncies tenen la característica que poden ser hidratades mitjançant aigua, ja
que com són lípids saponificables i presenten una solubilitat característica.
• Desacidificació o neutralització amb sosa� Bàsicament consisteix en la reducció de
l’acidesa present en els olis degut a la presencia d’àcids grassos lliures amb sosa i per tant
es produeix una reacció de saponificació. Els àcids grassos lliures i fosfolípids presents a
l’oli es redueixen tractant-los amb una solució aquosa d’hidròxid de sodi.
R-COOH+NaOH��R-COONa+H2O On R és l’àcid gras corresponent.
Tot i que, com ja s’ha explicat, l’oli d’oliva com tots els olis són una barreja d’acilglicèrids i
aquests són neutres, teòricament els olis també ho haurien de ser. Però, per diferents raons
com reaccions d’hidròlisis i oxidació, que provoquen l’alliberament d’àcids grassos,
s’augmenta l’acidesa de l’oli.
• Deshidratació� Consisteix en eliminar l’aigua restant i dispersa en l’oli. La deshidratació es
realitza al buit, atomitzant l’oli i eliminant l’aigua per escalfament a 70-80ºC.
• Decoloració o blanqueig� Es tracta d’eliminar les substàncies colorants presents en l'oli, és
a dir, els carotens, la clorofil·la i altres. Intervé un procés físic que s’anomena adsorció.
Consisteix en l’atracció superficial dels pigments colorants cap a un producte que s’anomena
terra decolorant. Els agents decolorants són principalment:
1. Les terres naturals: són poc actives i utilitzades en olis que puguin ser blanquejats
fàcilment.
2. Les terres actives: són argiles que, en estat natural, no tenen cap poder decolorant,
però que es sotmeten a un procés químic d’activació amb àcids forts .
3. Els carbó actius: s’activen de la mateixa manera que les argiles i s’obté un producte
de gran superfície i porositat.
• Desodorització� Consisteix en eliminar les substàncies presents en l’oli que causen olors i
sabors desagradables com: hidrats de carboni no saturats, aldehids i cetones. Es fa
mitjançant destil·lació al buit en corrent de vapor d’aigua, ja que aquests components són
molt més volàtils que els glicèrids i es poden separar per evaporació.
� 32
4.4.2 La refinació física o destil·lació
En aquesta també se l’anomena desodorització neutralitzant i és molt similar al procés de
desodorització que s’acaba d’explicar. El que canvia, principalment, és que es suprimeix la
neutralització amb sosa de manera que l’eliminació dels àcids grassos lliures no es realitza
per saponificació, sinó per destil·lació. Aquest canvi comporta que no es perdi oli neutre per
emulsió amb els sabons formats en la neutralització i s’estalvia el consum de sosa.
Les etapes del procés serien les següents i es duria a terme al mateix que en el cas d’una
refinació química:
• Desgomat amb àcid.
• Blanqueig o decoloració.
• Desodorització/Neutralització.
A més, és necessari treballar en plantes de refinació (Figura 16) i a una temperatura més
alta (uns 230 ºC), major pressió de vapor i major buit.
Figura 16: Planta de refinació física.
La refinació, ja sigui física o alcalina, ens permet obtenir un oli que respon a certs criteris: té
un sabor neutre, visualment està net i presenta un color adequat, a més de ser segur per
l’alimentació. No té una bona conservació, perquè la refinació comporta la pèrdua
d’antioxidants naturals (vitamines E, principalment). Així mateix, aquells olis verges d’oliva
de mala qualitat o en mal estat, és a dir que presenten alteracions de gust, olor etcètera, el
que vindrien a ser els olis llampants, també són refinats.
� 33
4.5 Classificació de l’oli d’oliva
A partir dels criteris explicats al punt 4.4.Criteris qualitatius dels olis d’oliva s’avalua la
qualitat de l’oli d’oliva. A partir d’aquesta avaluació, segons el Conveni Internacional de l’Oli
d’Oliva del 30 de març de 1979, s’estableix com a classificació dels olis la següent:
• Oli d’oliva verge.
-Oli d’oliva verge extra.
-Oli d’oliva verge.
-Oli d’oliva verge corrent.
-Oli d’oliva verge llampant.
• Oli d’oliva refinat.
• Oli d’oliva.
• Oli de pinyolada.
-Oli de pinyolada cru.
-Oli de pinyolada refinat.
-Oli de pinyolada d’oliva.
4.5.1 Oli d’oliva verge
Oli obtingut a partir del fruit de l’olivera exclusivament per procediments mecànics o físics
evitant qualsevol procediment de re-esterificació o barreja amb olis d’una altra naturalesa.
L’objectiu principal és obtenir el suc de l’oliva de forma natural, conservant el gust, l’aroma,
els nutrients i les vitamines del fruit (Figura 17). Aquest tipus d’oli d’oliva i el verge extra
s'obtenen a partir d'un premsat en fred (inferior als 27 º C) que permet conservar el sabor
de la llavor, o per mitjà d'una centrifugació a 3.200 rpm, denominada "extracció en fred".
Figura 17: Oli d’oliva verge pur, extret del mateix fruit.
� 34
Finalment s'aplica un procés físic (com la decantació durant 40 dies) per separar els residus
més fins. Trobem quatre classes diferents d’olis d’oliva verge, a continuació en la taula 5 es
mostren les característiques analítiques d’aquests. A més, també s’hi aporten les dades de
dos tipus d’oli d’oliva que seran explicats en els punts 4.5.2 L’oli d’oliva refinat i 4.5.3. L’oli
d’oliva.
Taula 5: Característiques de les diferents classes d’olis d’oliva.
Font: Herrera, C. Saber de aceite.
-Oli d’oliva verge extra
És la categoria superior a la que pot pertànyer un oli. Aquest tipus d’oli ha de presentar unes
característiques organolèptiques úniques, certificades per un panel de tast i ha de rebre una
puntuació superior a 6,5. A més, ha d’haver estat extret d’olives sanes en el punt òptim de
maduració i per mitjans únicament físics o mecànics, és a dir sense cap manipulació química
-refinacions- i a temperatura moderada.
Les seves qualitats el fan inigualable, és per això que ha de de tenir una acidesa que no pot
superar l’1%, normalment és inferior o igual a 0.8º, és ric en antioxidants, vitamina E i en
pigments que donen lloc a unes tonalitats groguenques i verdoses característiques d’aquest
Classe Acidesa (%) Índex de
peròxids (meq
O2/kg)
Colesterol
(%)
K270 Panel test
Oli d’oliva verge
extra
Màx. 1 Màx. 20 Màx. 0,5 Màx. 0.2 >6,5
Oli d’oliva verge Màx. 2 Màx. 20 Màx. 0,5 Màx.
0,25
>5,5
Oli d’oliva verge
corrent
Màx. 3,3 Màx. 20 Màx. 0,5 Màx.
0,25
>3,5
Oli d’oliva verge
llampant
>3,3 >20 Màx. 0,5 >0,25 <3,5
Oli d’oliva refinat Màx. 0,5 Màx. 10 Màx. 0,5 Màx. 1,2 ---
Oli d’oliva Màx. 1,5 Màx. 15 Màx. 0,5 Màx. 1.0 ---
� 35
oli alhora que el fan un greix completament saludable en tots els sentits. També conté
clorofil·les carotenoides i polifenols que influeixen directament en el gust i l’estabilitat
d’aquesta classe d’oli. A més, aquest tipus d’oli és l’únic que pot ser consumit tal i com
s’obté de l’oliva, sense necessitat de ser refinat com passa amb els olis de llavors que
necessiten ser tractats per fer-los comestibles. Tot i així, el caràcter més específic de cada
oli vindrà marcat per les condicions externes de la zona d’on provingui l’oli, a banda del tipus
d’oliva de la que s’ha extret
Dintre de l’oli d’oliva verge extra podem distingir tres categories:
• Monovarietal: Aquell que s’obté únicament d’una sola varietat d’oliva.
• Coupage: Aquell que s’obté a partir de diverses varietats d’oliva amb la finalitat
d’obtenir, en el procés d’elaboració, les mateixes característiques organolèptiques.
• Denominació d’Origen Protegida (DOP): Aquell que s’obté a partir d’olives
procedents d’una àrea geogràfica concreta. A més, aquest tipus d’oli deu ser elaborat
i embotellat en la mateixa zona geogràfica alhora que està sotmès a controls i té un
Consell Regulador oficial. És la màxima qualitat que un oli pot assolir (Figura 18).
Figura 18: Denominació d’Origen Estepa.
-Oli d’oliva verge
Aquest tipus d’oli presenta una acidesa d’àcid oleic inferior o igual al 2º. Encara que pot
presentar alguns defectes que són difícils de detectar, conserva totes les vitamines i
antioxidants naturals. També es pot elaborar amb varietats monovarietals o amb la barreja
de diversos olis, però aquest rep una puntuació organolèptica superior a 5,5, però no a 6,5
com en el cas de l’extra. Aquests olis són els que antigament eren coneguts com a olis fins
d’oliva i han d’haver estat extrets en les mateixes condicions mencionades anteriorment.
� 36
-Oli d’oliva verge corrent
És un tipus d’oli d’oliva verge de bones qualitats organolèptiques, amb una puntuació inferior
a 3,5 i la presenta una acidesa en àcid oleic que no pot superar al 3,3%.
-Oli d’oliva llampant
Aquests olis són de menor qualitat organolèptica amb una puntuació inferior a 3,5 i la seva
acidesa és superior a 3,3º, no són aptes pel consum i per això han de ser refinats per
mitjans físics o químics. Aquests olis es coneixen amb aquest nom perquè els romans
l’utilitzaven per tenir enceses les seves làmpades. En la refinació s’obté l’oli d’oliva refinat
del que parlarem a continuació.
4.5.2 Oli d’oliva refinat
És un oli d’oliva obtingut mitjançant la refinació d’olis d’oliva verges llampants amb una
acidesa inferior a 0,3º i inodors ja que han estat sotmesos a una refinació que ha acabat
eliminant tots els sabors (neutralització) i olors (desodorització) a més de tots els pigments
colorants. A Espanya hi ha 24 refinaries d’oli d’oliva, concentrades principalment els llocs
marcats amb groc en el mapa (Figura 19). Aquests olis, sense estar barrejats amb oli d’oliva
verge no són aptes pel consum humà, ja que és l’oli d’oliva verge el que li aporta les
característiques pròpies de l’oli d’oliva.
Figura 19: Mapa amb la localització de les refinaries espanyoles.
� 37
4.5.3 Oli d’oliva
S’obté de la barreja d’olis refinats amb olis d’oliva verges exceptuant de l’oli llampant amb
una acidesa lliure igual o superior a 0,1º, expressada en àcid oleic. En qualsevol cas, el grau
d’acidesa dependrà de l’oli verge utilitzat, però no pot superar els 1,5º.. El procés de
refinació elimina quasi tot el gust, olor i color del olis, per tant, per poder enriquir-los es
mesclen amb olis d’oliva verges o extra verges recuperant els diferents sabors. A més el seu
índex de peròxids és inferior a 20 meq O2/kg i el K270 és inferior a 0.9 com es pot veure en
la figura . Aquesta categoria és la que més es consumeix en l’actualitat.
A més tots els olis explicats fins ara presenten una molt petita fracció de colesterol, en
concret com a molt poden tenir un 0,5% tal i com mostra la Figura... De totes maneres, els
olis de pinyolada d’oliva que s’explicaran a continuació també presenten només un 0,5% de
colesterol.
4.5.4 Oli de pinyolada d’oliva
A més, existeixen uns altres tipus d’olis que es troben relacionats indirectament amb els
d’oliva que són els olis de pinyolada d’oliva (Taula 6).
Taula 6: Principals característiques dels olis de pinyolada d’oliva.
Classe Acidesa (%) Índex de peròxids
(meq O2/ kg)
Colesterol (%) K270
Oli de pinyolada
d’oliva cru.
Mín. 2 --- Màx. 0,5 ---
Oliva de
pinyolada d’oliva
refinat.
Màx. 0,5 Màx. 10 Màx. 0,5 Màx. 2,5
Oliva de
pinyolada d’oliva.
Màx. 1,5 Màx. 15 Màx. 0,5 Màx. 2,00
� 38
Tots aquests olis s’obtenen mitjançant els residus sòlids resultants de la primera extracció
de l’oli, coneguts com a pinyolada. Estan formats normalment per les restes d’ossos, pell,
polpa i agua i que contenen encara un petit percentatge d’oli, habitualment és inferior al 4%.
A més per tal de detectar si un oli conté oli de pinyolada d’oliva en oli d’oliva s’utilitza el
component: Eritrodiol. Aquest no pot ser superior al 4,5%. D’olis de pinyolada d’oliva en
trobem els següents:
-Oli de pinyolada d’oliva cru
Aquest oli s’aconsegueix afegint la pinyolada a l’extractora on són tractats amb dissolvents
per poder extreure’n l’oli que contenen. Aquest oli no és apte pel consum humà si no es
sotmet a un procés de refinació química o física i es coneix com a «oli de pinyolada d’oliva
cru». Normalment, s’utilitza com a producte d’energia i antigament per encendre les
làmpades d’oli.
-Oli de pinyolada d’oliva refinat
A l’oli de pinyolada que ha estat sotmès a un procés de refinació se’l barreja amb una mica
d’oli d’oliva verge (10-20%) amb una acidesa igual o inferior al 0,1%. El resultat és l’oli de
pinyolada d’oliva que és l’únic oli amb aquestes característiques apte pel consum humà.
-Oli de pinyolada d’oliva
Si l’oli de pinyolada d’oliva refinat es barreja amb oli d’oliva verge, exceptuant el llampant,
dóna com a resultat el que s’anomena com a «oli de pinyolada d’oliva». Aquest oli té un grau
d’acidesa en àcid oleic inferior a 1,5º.
Cal assenyalar que molts consumidors associen la paraula refinat o pur amb la qualitat,
però, en el cas de l’oli aquestes paraules només designen el mètode d’obtenció mitjançant el
qual s’ha obtingut l’oli. L’oli refinat, prové d’un procés químic previ al consum humà mentre
que el pur vindria a ser el propi suc de l’oliva natural, que vindria a ser l’oli d’oliva verge
extra. Aquest, és l’únic que, gràcies al seu gust, olor i composició reuneix totes les
característiques que distingeixen a la dieta mediterrània com a única i singular.
� 39
4.6 L’oli d’oliva com a component de la dieta mediterrània
4.6.1 La dieta mediterrània
La dieta mediterrània és la forma d’alimentació que, des de fa segles, mantenen els pobles
de la ribera del mar Mediterrani on creixen les oliveres (Creta, Grècia i Sud d'Itàlia i
Espanya). Fruit de la influència del pas de diversos pobles pel pas del mar Mediterrani van
impregnar el Mediterrani amb les seves cultures: ibers, celtes, grecs, romans, bàrbars i
àrabs. Grecs i romans van establir les bases del que actualment coneixem com a dieta
mediterrània amb la "trilogia mediterrània"; pa, oli i vi, presents des de sempre en la nostra
cultura i els seus tres aliments més característics (Figura 20). Potser, en lloc de parlar de
dieta únicament, hauríem de parlar de vida mediterrània, perquè no es tracta només d'una
forma d'alimentació, sinó també d'una forma de vida, amb costums tan saludables com la
migdiada i l’activitat física regular que comporta una alta despesa energètica i que en
definitiva són herència de segles i segles de condicionaments culturals i geogràfics.
Figura 20: Matèria primera de la trilogia mediterrània: blat, raïm i oliva.
Tots i cada un dels aliments constituents de la dieta mediterrània ens provenen de diversos
zones de tota la conca mediterrània. Des del Pròxim i Mitjà Orient van arribar al Mediterrani
els cereals, els llegums, la pastanaga, la ceba, els alls, la pruna, el préssec, el cirerer,
l'albercoc, la pomera entre d’altres. D'Europa provenen la remolatxa, la xicoira, la col i els
espàrrecs, de Llunyà Orient, els cigrons, el sèsam, el cogombre, l'albergínia, la mostassa,
l'alfàbrega, els cítrics; del Sud-est asiàtic i Oceania l'arròs, el romaní, el pebre, el sèsam, el
gingebre, l'alfàbrega, el cogombre, la sidra, la canya de sucre; d'Àfrica, el meló, la síndria,
els dàtils, i d'Amèrica, el blat de moro , la mongeta, la patata, el tomàquet, el pebrot, el
carbassó. Pocs àpats mediterranis serien imaginables sense aquestes aportacions. Gràcies
a aquestes aportacions, es va configurar un dels models alimentaris més saludables del
món: la dieta mediterrània. Tot i així, no serà fins la segona meitat del segle XX que la
ciència moderna s’adonarà i començarà a investigar sobre el caràcter excepcional de l'estil
de vida mediterrani i la seva influència en la salut de la població.
� 40
4.6.2 Característiques de la dieta mediterrània
Aquesta dieta presenta unes característiques que la fan única i especialment beneficiosa per
a la salut humana. A banda de la base de la dieta mediterrània –pa, oli i vi- aquesta es
caracteritza per sis conceptes primordials:
1. La seva frugalitat � la moderació en els àpats, on les racions varien
entre les 1900 i 2300 calories per habitant i dia.
2. L’abundància de vegetals� el consum alt d'aliments rics en fibra com
fruites, verdures, llegums i hortalisses.
3. Els seus gustos i àcids aromàtics� ús de vinagre, llimona i tot tipus de
cítrics, a més d’alls, cebes i plantes aromàtiques que acaben d’afegir el
toc final de plats típics com les amanides.
4. La simplicitat dels preparats� combinacions que potencien els sabors
en front de preparacions greixoses d’altres tradicions culinàries.
5. Estructuració dels àpats� quatre àpats al llarg del dia constitueixen la
dieta mediterrània- esmorzar, dinar, berenar i sopar-.
6. L’ús de l’oli d’oliva verge com a greix vegetal addicional, essencial per
portar una vida més saludable. A més a més, el consum d’oli d’oliva,
component bàsic de la dieta mediterrània, segons el SENC (Societat
Espanyola de Nutrició Comunitària) no hauria de ser menor al 35%. Es
recomanen de 3 a 6 racions al dia, cada ració de 10 ml o d’una cullera
sopera. Cal assenyalar, que els veritables guanys venen únicament amb
el consum d’oli d’oliva verge o verge extra, per la seva delicada i natural
extracció.
A banda d’aquests aspectes principals
trobem la coneguda piràmide
alimentària considerada òptima
segons el model de vida mediterrani
que estableix de forma qualitativa la
quantitat de cada tipus d’aliments que
hauríem d’ingerir setmanalment
(Figura 21).
Figura 21: Piràmide d’alimentació segons la dieta mediterrània.
Font: Ajuntament de Barcelona.
� 41
A continuació, en la taula 7, s’esmenta la informació que recull la piràmide i en definitiva els
aliments que trobem en la dieta mediterrània.
Taula 7: Consum aconsellat setmanalment d’aliments, tenint en compte els nutrients
necessaris pel nostre organisme.
ALIMENT CONSUM ADEQUAT
Oli d’oliva 3-6 racions/dia
Cereals 4-6 racions/dia
Productes làctics 2-4 racions/dia
Fruites ≥3 racions/dia
Hortalisses i verdures ≥ 2 racions/dia
Carn fresca 3-4 racions/setmana
Fruits secs 3-7 racions/setmana
Ous 3-4 racions/setmana
Llegums 2-4 racions/setmana
Vi, cava i al res Ocasional i moderat
Peix 3-4 racions/setmana
Carn curada i embotits Ocasional i moderat
Dolços i altres (mel...) Ocasional i moderat
� 42
4.6.3 La importància d’una dieta rica en greixos vegetals
El component principal i beneficiós que trobem en la majoria d’aliments que constitueixen la
dieta mediterrània són els àcids grassos insaturats (Figura 22). Més endavant, quan es parli
sobre els efectes de l’oli d’oliva en el nostre organisme, s’explicarà detalladament com actuen
aquests components presents majoritàriament en l’oli d’oliva.
Figura 22: Aliments salutífers de la dieta mediterrània.
És molt important seguir un patró alimentari de tipus mediterrani ric en greixos d'origen
vegetal com l’oli d’oliva. Tot i així, cal no oblidar que una dieta baixa en greixos totals pot ser
fins i tot contraproduent tal i com indica el National Cholesterol Education Program. Si es
redueix excessivament la ingesta de greix, la font principal d'energia passen a ser els hidrats
de carboni i donada l'abundant disponibilitat d'aliments rics en carbohidrats amb una alta
càrrega de glucèmia, les dietes riques en hidrats de carboni acaben comportant un augment
de la resistència a la insulina i de diabetis, dos factors alhora molt importants de risc
cardiovascular.
De totes maneres, els greixos vegetals són els recomanats a l’hora de fer aquesta aportació
lipídica necessària pel nostre organisme.
Però, per què?
Els greixos saturats presents en els greixos animals, tenen una relació més clara amb alguns
càncers, com el de còlon i el de mama. Tot i així, no s’han d’eliminar totalment aliments que
continguin greixos animals com la carn, perquè també aporten proteïnes, ferro i altres
nutrients importants pel funcionament del nostre organisme.
� 43
Tanmateix, només es recomana que el consum de greixos saturats no superi un 35% de les
calories totals, ja que aquests sí poden tenir incidència en el càncer. També es recomana
incrementar el consum de fibra (uns 20 i 30 g diaris), segons les dades del National Cancer
Institute . Ambdós consells van ser establerts com a pautes preventives contra el càncer a la
conferència del WHO (World Health Organization) de novembre de l’any 1996: "Nutrition in
prevention and therapy of cancer".
Per altra banda, són molt nombrosos els estudis que demostren el benefici dels greixos
vegetals, en concret dels monoinsaturats, gràcies al seu paper en la modulació de les
apolipoproteïnes constituents de les lipoproteïnes. Un dels estudis que demostra la
incidència de l’oli d’oliva en la disminució de mort coronària i cancerígena, és l’estudi
realitzat per l'Institut Català d'Oncologia a 41.358 persones entre els 30 i els 69 anys
seleccionades entre els anys 1992 i 1996. Actualment encara segueixen prenent dades de
40.796, i han conclòs que seguint una dieta mediterrània s'arriba a reduir fins a un 30% el
risc de mort per aquest tipus de malalties. L’estudi va ser publicat a la revista electrònica The
American Journal of Clinical Nutrition.
D'altra banda, Steinmetz i Potter (1996) van recollir dades procedents de 206 estudis
epidemiològics, fet que va posar de manifest que consums elevats de fruites, hortalisses i
verdures (aliments rics en fibra) estan relacionats amb una baixa incidència de diferents
tipus de càncer, com els d'estómac, pulmó, faringe, pàncrees i còlon. Tanmateix, en aquests
estudis és molt difícil concretar si l'efecte és a causa d'un únic compost o si és degut a un
efecte simultani de diferents elements químics presents en aquests aliments com són, a més
dels polifenols, la vitamina E, els carotens, l'àcid fòlic, la fibra, etc.
Per últim, és necessari afegir la importància biològica dels aliments abans mencionats i que
estan associats a la dieta mediterrània: les hortalisses, les fruites i les verdures, i altres com
els cereals. Aquests aliments a banda de presentar propietats preventives en front el càncer
també influeixen en la disminució dels nivells de colesterol, la tensió arterial i el risc de patir
diabetis. El consum de cereals, fruites, hortalisses i verdures que tenen un elevat contingut
en fibra, així com la utilització de greixos monoinsaturats (oli d'oliva), milloren el nivell de
glucosa en sang i, per tant, el perfil lipídic dels diabètics.
En conclusió, el secret de la dieta mediterrània es troba en l’equilibri de les racions del
menjar i en els colors. Colors que ens indiquen les grans propietats de cada aliment en la
seva correcta mesura. Una dieta, practicada des de l’antiguitat, però de la qual se’n deriven
infinitat de beneficis, tot i que coneguts des de fa relativament poc temps.
� 44
5. PART BIOLÒGICA Aquest apartat del treball es centra en explicar com incideix l’oli d’oliva en el nostre
organisme i en conèixer els motius que expliquen aquesta aportació beneficiosa de l’oli
d’oliva, alhora evidenciada en un gran nombre d’estudis epidemiològics.
5.1 L’efecte de l’oli d’oliva en la salut humana
L’oli d’oliva verge , el propi suc de l’oliva , ha estat sotmès a una gran multitud d’estudis dels
quals cada cop s’obtenen resultats més sorprenents pel que fa a la influència que pot arribar
a tenir la nostra alimentació en el nostre organisme i les innumerables propietats salutíferes
que aquest presenta, al igual que altres aliments característics de la dieta mediterrània, com
ara el vi negre.
Entre tots els components que constitueixen l’oli d’oliva destaca l’àcid oleic del tipus
monoinsaturat, beneficiós per a la disminució del colesterol LDL ‘’dolent’’ i el manteniment o
fins i tot l’increment del colesterol HDL ‘’bo’’ (Figura 23).
Figura 23: Representació de l’estructura d’una LDL i una HDL.
És a dir, amb l’oli d’oliva s’obtenen nivells de colesterol similars als obtinguts amb greixos
poliinsaturats, però amb l’avantatge que manté i fins i tot eleva la fracció transportada per les
HDL i disminueix les LDL, amb la qual cosa redueix el risc a patir malalties coronàries. Per
tant, l’àcid gras monoinsaturat millora la distribució entre el colesterol (HDL) ’’ bo’’ i el
colesterol (LDL) ‘’el dolent’’. Els poliinsaturats, en canvi redueixen el colesterol total: tant el
bo com el dolent. Així mateix, gràcies a l’elevat contingut en vitamina E de l’oli d’oliva també
se li atribueix beneficis per a funcions biològiques de gran importància.
� 45
A continuació, s’explicarà l’actuació dels lípids, principals components de l’oli d’oliva, en
l’organisme humà, i tot el recorregut que segueixen a fi d’entendre més àmpliament el
perquè d’aquestes propietats beneficioses en el cos humà aportades per certs aliments de la
dieta mediterrània, com ara l’oli d’oliva.
5.2 Els greixos en l’organisme humà
Els greixos són components fonamentals del metabolisme dels éssers vius. Formen part
dels anomenats principis immediats: els hidrats de carboni, les proteïnes i els greixos.
Trobem diferents tipus de greixos en l’organisme:
• Els que actuen com a dipòsits de reserva d’energia.
• Els que formen part de les cèl·lules i teixits, en especial de les membranes
plasmàtiques .
• Els que tenen una activitat metabòlica, com per exemple les vitamines.
• Els que actuen com a mitjà de transport d’altres substàncies liposolubles, com les
lipoproteïnes.
Els greixos de reserva són lípids complexos, compostos bàsicament per triglicèrids que
s’acumulen en cèl·lules especialitzades. Un gram de greix com l’oli d’oliva aporta 9 kcal,
mentre que la mateixa quantitat d’hidrats de carboni o de proteïna aporten 4 kcal. Per això
mateix, els greixos són la principal font d’energia del cos humà, i es tracta d’una reserva
calòrica molt concentrada. A més, algunes vitamines (A,D,K,E) que són únicament
liposolubles prescindeixen dels lípids per a ser absorbides.
Els greixos que formen la part més important de l’estructura de les cèl·lules i per tant dels
teixits són els següents:
5.2.1 Els triglicèrids
Els triglicèrids o triacilglicèrids són èsters formats per la reacció d’un alcohol (glicerina) amb
tres àcids grassos en concret. A més constitueixen la part saponificable de tots els lípids i
greixos com l’oli d’oliva. Entre els seus components, repassant conceptes ja mencionats en
el treball, trobem els àcids grassos saturats, monoinsaturats o bé poliinsaturats, explicats en
l’apartat.
� 46
5.2.2 Els fosfolípids
Els fosfolípids són glicèrids formats per una molècula de glicerina, on en el tercer grup
alcohòlic s’uneix a un grup fosfat, unida a dos àcids grassos. Els fosfolípids són un
component estructural de la cèl·lula i compleixen una funció molt important en aquesta. Els
fosfolípids formen part de l’anomenat ‘’mosaic fluid’’ de Nicholson i Singer, (Figura 24),
constitueixen la bicapa lipídica, estructura de la membrana cel·lular i unitària de tots els
orgànuls membranosos i membranes de les cèl·lules. En concret, la seva funció és actuar
com a barrera selectiva de substàncies a través de la membrana cel·lular.
Figura 24: Mosaic fluid de Nicholson i Singer.
5.2.3 El colesterol
El colesterol és l’esteroide més important, compost lipídic derivat de l’esterà i sintetitzat en el
reticle endoplasmàtic llis de les cèl·lules, present en el nostre organisme. És un component
de les membranes cel·lulars, que es troba també en el plasma sanguini, sintetitzat en el
fetge on es troba en grans concentració. També s’acumula en la medul·la espinal, en el
pàncrees i en el cervell. Però, el colesterol també pot provenir d’una altra via no endògena
sinó exògena, aquell que s’obté a través dels aliments. Realitza múltiples funcions:
• Constituent de les membranes cel·lulars a les que aporta fluïdesa. És el principal
responsable de l’estabilitat de la bicapa lipídica.
• És precursor de la vitamina D, essencial en el metabolisme del calci.
• És precursor de les hormones esteroides, és a dir les sexuals (progesterona i
testosterona), encarregada en la preparació dels òrgans sexuals femenins per a la
gestació i responsable dels caràcters masculins. Les suprarenals (cortisol i
� 47
aldosterona), encarregada en la regulació de la síntesi del glicogen i encarregada en
la regulació del funcionament dels ronyons.
Actualment, es coneix perfectament el paper que desenvolupa el colesterol en les
lipoproteïnes de baixa densitat (LDL) pel que fa a la malaltia coneguda com a arteriosclerosi
(Figura 25). L'arteriosclerosi és un terme general que es refereix a un grup de malalties que
tenen en comú un enduriment de les parets arterials i una pèrdua de la seva elasticitat. En
general, causa l’estrenyiment de les artèries que pot arribar a impedir el pas de la sang per
l’artèria afectada i conseqüentment provocar un infart de miocardi. L'aterosclerosi és la
variant més important i freqüent de l'arteriosclerosi, un procés en el qual els lípids es
dipositen en les capes de les artèries, augmentant el risc a patir un infart.
Figura 25: Progressió de l’aterosclerosi en una arteria coronària.
A banda del tabac, la diabetis mellitus, l’estrès, la hipertensió i factors genètics com són els
de risc de l’aterosclerosi. Un altre aspecte modificable és la dieta que seguim. Una dieta
abundant en greixos saturats, és a dir contrària a la dieta mediterrània rica en oli d’oliva, pot
comportar hiperlipèmia que es troba fortament lligada a l'obesitat i a una forma de vida
sedentària. La hiperlipèmia també intervé en el desenvolupament d’aquesta malaltia arterial
ja que influeix en l’acumulació de colesterol a les artèries. L'increment dels nivells de
colesterol total i de lipoproteïnes de baixa densitat (LDL) sembla elevar el risc
d'aterosclerosi, mentre que les lipoproteïnes d'alta densitat (HDL) semblen exercir una funció
protectora ja que transporten el colesterol ‘’dolent’’ cap al fetge, evitant la seva acumulació a
les parets arterials. Arran del seu efecte en el nostre organisme s’anomena ‘’colesterol
dolent’’ i ‘’colesterol bo’’, respectivament.
� 48
5.2.4 Les lipoproteïnes
Són macromolècules, compostes per una part proteica en la que trobem apolipoproteïnes,
que s’encarreguen de mantenir l’estructura de les lipoproteïnes i regular el metabolisme i el
transport d’aquestes, ja que actuen com a indicadores del tipus de lipoproteïna que es
tracta. La part lipídica està formada pels fosfolípids, situats a la superfície, triglicèrids
constituïts per àcids grassos de cadena llarga, transportats en el nucli de les lipoproteïnes i
colesterol, que transporten els productes liposolubles del plasma des de l’intestí i el fetge per
tot l‘organisme (Figura 26). El procés acaba retornant el colesterol al fetge on s’elimina de
l’organisme en forma d’àcids biliars. En conjunt, les lipoproteïnes ajuden a mantenir uns 500
mg de lípids totals per 100 ml de sang després de la digestió i absorció al plasma sanguini
del contingut del menjar. Aquest procés és vital per mantenir uns nivells de colesterol i
triacilglicèrids constants en el nostre organisme i no alterar les funcions d’aquest.
Figura 26: Estructura bàsica d’una lipoproteïna.
Hi ha cinc tipus de lipoproteïnes:
• Els quilomicrons són lipoproteïnes que se sintetitzen a les cèl·lules epitelials de
l’intestí. Aquests s’encarreguen de transportar els lípids (el colesterol) introduïts per
via exògena i transporten els triglicèrids i colesterol, provinents dels lípids aportats en
la dieta, per la limfa i per la sang a tot el cos.
• La VLDL o de molt baixa densitat i la IDL o de densitat intermèdia, són sintetitzades
pel fetge, tenen estructures variants ja que a mesura que circulen pel plasma
sanguini van perdent triglicèrids captats per l’enzim lipoproteïna lipasa ubicada en els
capil·lars (Figura 26). Tot i així, totes aquestes i també la LDL, explicada a
continuació, es caracteritzen per tenir l’apolipoproteïna B100 en les seves estructures
que permetrà el reconeixement dels receptors de LDL dels teixits.
� 49
• La LDL o de baixa densitat, transporta el colesterol des del fetge on és sintetitzat, a
la resta del cos (Figura 27). Té pocs triglicèrids i molt colesterol, i és la responsable
del transport de la major part del colesterol en sang, al voltant del 60%. En excés, se
la pot considerar la responsable de l’acumulació de colesterol en els vasos sanguinis
que causa l’arteriosclerosi. Això té lloc quan les lipoproteïnes de baixa densitat es
dipositen a les parets arterials provocant un procés d’oxidació dels radicals lliures
presents, cosa que provoca una resposta en el sistema immunològic de tal manera
que es forma una substància greixosa anomenada ateroma, responsable de la
inflamació de la capa de cèl·lules que recobreix l’interior dels vasos sanguinis, el que
vindria a ser l’endoteli. A mesura que el procés continua, les parets arterials es veuen
danyades donant lloc a l’arteriosclerosi.
• La HDL o d’alta densitat, transporta el colesterol de la sang i dels teixits fins al fetge,
facilitant la seva eliminació (Figura 27). Té molta proteïna, concretament les
apolipoproteïnes que les constitueixen són la Apo A1, Apo AII i l’Apo IV, i poc
colesterol i la seva funció en el nostre organisme sembla beneficiosa, ja que tenen la
propietat d’eliminar part dels dipòsits de colesterol formats a les artèries. És a dir, fan
una funció contrària a la LDL, i transporten al voltant del 25% del colesterol total.
Figura 27: Classificació de les lipoproteïnes.
És necessari comentar la importància d’una de les apolipoproteïnes presents en les
estructures de totes les lipoproteïnes ( HDL, IDL, VLDL i LDL): l’Apo E.
� 50
Aquesta apolipoproteïna a més de ser sintetitzada pels hepatòcits, també es forma en
cèl·lules com els macròfags i les neurones. A més, és l’apolipoproteïna majoritària en els
quilomicrons, un tipus de lipoproteïnes específiques (explicats en el punt 5.3 La digestió dels
greixos). La seva funció és modular el metabolisme i actuar com a lligam del receptor de
LDL i del receptor específic de l’Apo E en teixits hepàtics i així permetre la seva captació i
posterior catabolisme. Aquesta unió entre el receptor i la seva lipoproteïna en qüestió és un
mecanisme essencial per poder remoure les lipoproteïnes riques en Apo E, ja que
determinen l’homeòstasi de colesterol i triglicèrids. Una altre dels aspectes peculiars
d’aquesta apolipoproteïna és el seu paper en la malaltia de l’Alzheimer. Del gen de l’Apo E
existeixen diverses seqüències entre els al·lels que el formen. Aquestes diferències són la
base de la variació en la seqüència d’aminoàcids constituents de les proteïnes que es
codifiquen. Segons la seqüència d’aminoàcids, les proteïnes resultants comportaran un
augment de risc en front aquesta malaltia, i en canvi unes altres confereixin un efecte
protector en la malaltia de l’Alzheimer. Per això, actualment s’estan duent a terme una gran
multitud d’investigacions sobre un al·lel en concret: l’al·lel ApoE-4. Aquest al·lel sembla
presentar-se com un factor de risc si es troba en homozigosi.
� 51
5.3 La digestió dels greixos
La digestió dels greixos que aportem a partir de la nostra dieta a l’organisme es duu a terme
quasi totalment a l’intestí prim. Només, en el cas d’alguns glicèrids de cadena curta, es
digereixen a l’estómac.
L’estómac, en el procés de digestió, realitza una triple funció. La primera és emmagatzemar
els aliments ingerits. La segona és barrejar els aliments amb sucs gàstrics secretats i la
tercera i última és bombejar aquesta barreja cap a l’intestí prim.
Un cop a l’intestí prim, els greixos es barregen i emulsionen amb la bilis que es produeix en
el fetge i s’emmagatzema a la vesícula biliar, d’on passa a l’intestí prim. L’objectiu és reduir
la grandària dels greixos perquè aquests puguin ser correctament absorbits i utilitzats per
l’intestí prim. D’aquesta manera, s’augmenta la superfície d’atac de les lipases
pancreàtiques, encarregades de la hidròlisi dels lípids.
Les lipases pancreàtiques trenquen els triglicèrids en els seus components, és a dir en
acilglicèrids, glicerina i àcids grassos lliures. Aquests components són transportats per
micel·les de sals biliars, fins les mucoses intestinals, on els lípids poden ser absorbits. Les
sals biliars orienten els lípids en una certa posició permetent i facilitant els atacs enzimàtics
per a l’absorció dels substrats. El colesterol i els fosfolípids segueixen processos similars.
Un cop s’ha passat la mucosa intestinal, els àcids grassos lliures, recomponen amb facilitat
els triglicèrids que s’associen dintre de la cèl·lula amb els fosfolípids, colesterol i algunes
proteïnes, formant els anomenats quilomicrons, prèviament explicats. (Figura 28)
Figura 28: Digestió dels lípids per via exògena.
� 52
Gràcies a diversos estudis, sembla ser que l’oli d’oliva presenta avantatges, a diferència
d’altres olis o greixos, en els processos digestius. Els avantatges són els següents:
• Activa la secreció biliar.
• Estimula la lipasa pancreàtica amb major intensitat que els greixos saturats.
• Provoca i accelera, pel seu alt contingut en àcid oleic, la síntesi dels triglicèrids.
• Incrementa el ritme d’absorció i digestió dels greixos.
Aquests avantatges són deguts a la digestibilitat dels greixos que depèn fonamentalment de
la cadena i els tipus d’àcids grassos presents en la molècula del triglicèrid. En concret, la
velocitat de digestió està relacionada amb la presència d’àcids grassos saturats. Per tant,
l’alta digestibilitat de l’oli d’oliva és deguda a la presència d’àcid oleic, que facilita l’atac de la
bilis i per tant, l’absorció intestinal.
5.4 Propietats salutíferes de l’oli d’oliva
L’oli d’oliva, a més de contenir àcids grassos essencials com el linoleic i el linolènic, àcids
poliinsaturats, destaca pel seu alt contingut en àcid oleic, fet que el diferencia exclusivament
d’altres greixos vegetals i animals. Cal afegir que en aquest apartat, quan es parli d’oli
d’oliva es fa referència a l’oli d’oliva verge i el verge extra.
Com hem vist, els greixos són necessaris per l’obtenció d’energia i per un bon funcionament
de l’organisme humà. Tanmateix, és molt important per assegurar un òptim funcionament
d’aquest, seguir una dieta rica en greixos insaturats.
L’alt contingut en àcid monoinsaturat de l’oli d’oliva i l’efecte que té aquest tipus d’àcid en
l’organisme el fan un dels aliments més saludables i així mateix, posicionen a la dieta
mediterrània com a la dieta més saludable del món. Això és degut al nivell de colesterol en
el plasma sanguini i el procediment que segueixen en el nostre organisme les lipoproteïnes
encarregades de transportar aquest greix vegetal.
Tots aquests aspectes fan de l’oli d’oliva un dels aliments més complets i saludables del
món. En els següents punts del treball s’explicarà la influència de l’oli d’oliva en el nostre
organisme i els beneficis que la seva peculiar composició química ens aporta. A més, es
citaran detalladament propietats úniques que afavoreixen al correcte funcionament de
l’organisme i alhora la prevenció de malalties tan comunes com el càncer i la diabetis.
� 53
5.5 L’oli d’oliva i l’aparell digestiu
L’oli d’oliva afavoreix els processos digestius ja que reté els aliments un cert temps i regula
l’evacuació de l’estómac. A més, tendeix a disminuir una mica l’acidesa del suc gàstric i
també ho fa de tot el que seria el contingut intestinal. Així mateix, estimula la secreció biliar i
combat certs casos d’estrenyiment, ja que és un aliment lleugerament laxant i de ràpida
digestió. A banda d’això, l’oli d’oliva actua estimulant el fetge i la vesícula biliar de tal manera
que facilita les funcions digestives i intestinals.
Altres beneficis que ens aporta pel que fa a l’aparell digestiu són els següents:
-Facilita la digestió dels lípids i l’absorció intestinal. En persones adultes, l’oli d’oliva
ajuda a equilibrar l’absorció dels nutrients que es veu alterada en produir-se una
reducció de la capacitat digestiva de l’organisme.
-Afavoreix la relaxació de l’esfínter d’Oddi que envolta la sortida del conducte biliar i
el pancreàtic al duodè, mantenint-lo obert més temps (Figura 29). A l’obrir-se els
sucs digestius biliars i pancreàtics poden entrar en el duodè i barrejar-se amb els
aliments per realitzar la digestió.
Figura 29: Òrgans i conductes de l’aparell digestiu.
-Millora l’halitosi, és a dir, el mal alè i la gastritis.
-Protegeix contra la formació de càlculs biliars (litiasis biliar).
-És un greix molt tolerat en persones que pateixen úlceres a l’estómac.
� 54
5.6 L’oli d’oliva i el sistema cardiovascular
Les malalties cardiovasculars són la causa més important de mortalitat en els països
desenvolupats, raó per la que se’n dut a terme moltes investigacions al voltant de les
cardiopaties coronàries. L’estudi epidemiològic pioner en observar els beneficis de l’oli
d’oliva i de la dieta mediterrània va ser ‘L’estudi dels set països’ entre els anys 1950-60 pel
Dr. Ancel Keys, més tard per Grande Covián, a set països: EUA, Japó, Finlàndia, Holanda,
Grècia, Itàlia i l'antiga Iugoslàvia. Es va comprovar que existeix una alta relació entre la
proporció de greixos saturats en la dieta i el risc a patir una malaltia cardiovascular.
Com s’ha vist anteriorment, arran del paper que desenvolupen els components de l’oli d’oliva
en el transport del colesterol en sang, es pot afirmar que l’oli d’oliva:
-Té un efecte preventiu i terapèutic sobre l’arteriosclerosi i altres malalties
cardiovasculars com ara: l’infart de miocardi i la trombosi cerebral entre d’altres.
Gràcies en part als fitoesterols, a banda de l’àcid oleic, que realitzen funcions
semblants i ajuden a regular el colesterol plasmàtic total, bloquejant l’absorció de
colesterol a nivell intestinal.
-Redueix i equilibra la tensió arterial elevada, al ser ric en àcid monoinsaturat.
-Estimula la producció de vasodilatadors gràcies el que millora la fluïdesa de la sang.
Pel que fa els compostos fenòlics de l’oli d’oliva, destaquen pel seu paper en la prevenció de
les malalties cardiovasculars. A la taula 8 trobem els efectes beneficiosos que se’ls atribueix,
que tenen a veure amb el seu poder antioxidant i com a donadors d’hidrogen ( a través dels
grups hidroxil) que resulta en una menor oxidació dels lípids que intervenen en el
desenvolupament de la malaltia i en una disminució de les taxes de colesterol i LDL oxidada.
Taula 8 : Efectes beneficiosos atribuïts als compostos fenòlics en la prevenció de les
malalties cardiovasculars.
• Disminució de l'oxidació de les lipoproteïnes de baixa densitat (LDL)
• Disminució del procés inflamatori a la placa d'ateroma
• Inhibició de l'agregació plaquetària
• Estabilització de les fibres de col·lagen de la paret arterial.
Font: Petroni et al (1994); Mazur i Adlercreutz (1999).
� 55
Finalment cal destacar la importància d’alguns polifenols, com ara l'hidroxitirosol, que
inhibeix l'agregació plaquetària i estabilitza les fibres de col·lagen de la paret arterial. D'altra
banda, els polifenols poden inhibir la lipo-oxigenasa, que provoca la disminució en la
formació de tromboxà i leucotriens. Amb tot això, els fenols poden controlar la reacció
inflamatòria de la placa d'ateroma i conseqüentment el risc a patir aterosclerosis.
5.7 L’oli d’oliva i el sistema ossi
Un dels aspectes en el que més insisteixen els investigadors és en la necessitat de consumir
oli d’oliva verge a qualsevol edat ja que contribueix a evitar pèrdues de calci i algunes
lesions cutànies. Això és degut a que l’oli d’oliva estimula el creixement i afavoreix l’absorció
de calci i fòsfor i per tant la mineralització i el desenvolupament dels ossos de l’esquelet
humà. A més, l’oli d’oliva aporta els lípids necessaris pel creixement de l’ésser humà,
millorant les funcions metabòliques de la manera més saludable, ja que aporta àcids
monoinsaturats (àcid oleic) i poliinsaturats (àcids linoleic i linolènic) en les proporcions
adequades i essencials. Altres aspectes positius de l’oli d’oliva són:
� Degut al seu alt contingut en antioxidants, aportats per la vitamina E o alfa-
tocoferol i el beta-carotè (provitamina A), prevé l’oxidació dels radicals lliures que
provoquen l’envelliment de les cèl·lules. Per tant, ajuda a retardar l’envelliment ja
que prevé l’estrès oxidatiu que comporta danys a les molècules i un major risc a
adquirir malalties.
� Durant la infància, aporta la quantitat essencial d’àcids grassos pel
desenvolupament del nadó i manté un equilibri en els seus components (àcid
linoleic, àcid linolènic i antioxidants) semblant a la de la llet materna.
5.8 L’oli d’oliva i l’epidermis
Des de l’antiguitat s’utilitza l’oli d’oliva com a cosmètic per a la pell i per a la cura
d’aquesta. De fet l’oli d’oliva actua positivament sobre l’epidermis i ho fa de la
següent manera:
� Protegeix la pell de la radiació solar; alleuja el dolor i les marques posteriors de
cremades; prevé l’aparició d’estries, evitant que les fibres de la pell es trenquin i
puguin deteriorar els teixits.
� Els greixos, sobretot els vegetals i en concret l’oli d’oliva, serveixen per protegir
les cèl·lules, assimilar vitamines, mantenir la pell llisa i acumular energia de
reserva.
� 56
5.9 Prevenció i oli d’oliva: la diabetis i el càncer.
A mesura que les investigacions sobre els efectes de l’oli d’oliva avancen, s’estan descobrint
propietats terapèutiques i preventives indiscutibles, propietats úniques que podrien
comportar grans progressos en el camp de la medicina.
Recents estudis epidemiològics demostren la gran incidència de l’oli d’oliva concretament en
dues malalties freqüents en a la societat: la diabetis i el càncer.
Prevenció de la diabetis
El component principal que contribueix a millorar el control del metabolisme lipídic de
persones que pateixen diabetis és el greix monoinsaturat de l’oli d’oliva verge que disminueix
els nivells de glucosa en sang. Això comporta que el pàncrees només secreti la dosis
d’insulina necessària i a l’hora que aquesta vagi disminuint.
La causa de mort més freqüent en diabètics s’atribueix a les complicacions cardiovasculars.
Per poder evitar-les, s’ha recomanat una dieta baixa en greixos saturats i hidrats de carboni,
ja que redueixen el colesterol total i per tant també el colesterol transportat per les
lipoproteïnes HDL (Figura 30). Per tant és molt més interessant que els hidrats de carboni, en
una dieta per a diabètics, siguin substituïts per oli d’oliva, per així reduir el risc cardiovascular.
Figura 30: Estructura d’una lipoproteïna HDL.
� 57
Prevenció del càncer
A banda de la diabetis, també és molt important l’efecte beneficiós de l’oli d’oliva en alguns
tipus de càncer, com el de mama o el de colon. Això és degut a la poderosa activitat
antioxidant de l’oli d’oliva gràcies a les vitamines A i E i els polifenols.
Els polifenols tenen la capacitat d'inhibir la producció de les cèl·lules mare malignes, les
veritables responsables de l'aparició d'un càncer (Taula 9).
Taula 9: Efectes beneficiosos atribuïts als compostos fenòlics en la prevenció del
càncer
• Inhibició de la proliferació cel·lular: inhibició del cicle cel·lular o inducció d'apoptosi en
cèl·lules tumorals.
• Inhibició del dany oxidatiu de l'ADN
• Activació dels enzims de detoxificació de carcinògens
Font: Birt et al (2001).
Tot i així els mecanismes a través dels quals els compostos fenòlics poden prevenir el
càncer no estaven encara definitivament establerts. Però, resultats experimentals en rates
obtinguts en estudis epidemiològics com ara l’estudi de Birt et al l’any 2001, indiquen que
aquest tipus de compost químic aporta els beneficis salutífers prèviament resumits en la
taula 9.
Actualment, vàries investigacions sobre l’oli d’oliva entreveuen la funció dels polifenols en la
regulació de l’expressió dels gens implicats directament en l’aparició i el desenvolupament
d’alguns tumors com per exemple el càncer mama. Es va observar que l’àcid oleic és capaç
de suprimir un dels oncògens humans, és a dir, un dels gens responsables de la
transformació d’una cèl·lula normal en una de maligna, associats al tumor de colon. Aquesta
hipòtesi es recolza, entre d’altres, en un estudi dirigit pel científic Javier Menéndez, biòleg
molecular de l’Institut Català d’Oncologia de Girona i de l'institut d'Investigació per a la Salut
North Western de Chicago. Tot i ser una notícia esperançadora per tota la societat i la
comunitat científica, els investigadors remarquen la necessitat de seguir investigant.
� 58
6. PART EXPERIMENTAL
En aquest apartat del treball es redacten les diverses pràctiques que vaig poder realitzar al
centre d’investigació de la Vall d’Hebron (VHIR), durant el mes de juny i juliol. Vaig estar
treballant al laboratori 118 (Figura 31) , amb
l’equip dirigit pel Dr. Rafael Simó, al
departament de Metabolisme i
Endocrinologia (Figura 32).
Les investigacions del benefici de l’oli
d’oliva i el vi negre, són dues de les més
comunes actualment, ja que cada cop són
més òbvies les grans propietats de
compostos com: l’àcid oleic i compostos
fenòlics: polifenols, flavonoides, resveratrol
entre d’altres.
Figura 31: En el laboratori 118.
Partint del fet que les
apolipoproteïnes B (ApoB100) estan
relacionades directament amb les
LDL mentre que les apolipoproteïnes
A (ApoA1) ho estan amb les HDL, és
imprescindible recordar la meva
hipòtesi del treball, esmentada a la
introducció.
Figura 32: Departament de Metabolisme i Endocrinologia (VHIR).
� 59
Potser una alimentació rica en àcid oleic , com a representant dels MUFA (component
principal de l’oli d’oliva), i amb vi negre, ric en compostos fenòlics, provocarà un augment
d’ApoA1 i una disminució de la quantitat d’ApoB100. En canvi, potser una alimentació amb
àcid palmític com a representant dels (SFA), hauria de passar tot el contrari, és a dir,
s’hauria de produir un augment de l’ApoB100 i una reducció de l’ApoA1. Respecte a les
cèl·lules tractades amb vi blanc, hauria de passar el mateix que en les cèl·lules tractades
amb àcid palmític. D’aquesta manera, es demostraria el possible efecte beneficiós de l’àcid
oleic i el vi negre, i l’efecte perjudicial dels (SFA) en el cas de l’àcid palmític, en l’organisme
humà.
És molt important tenir en compte que l’única variable que es modifica en tots els
experiments és, per una banda, el suplement d’àcid gras monoinsaturat (àcid oleic) o d’àcid
gras saturat (àcid palmític) i el suplement de vi negre o vi blanc. Aquest control de variables
és essencial en tot experiment, ja que ens assegura que els nostres resultats no es trobaran
alterats per altres variables que no s’estudien. A banda d’aquests experiments, es van dur a
terme dues pràctiques més en relació als vins per poder observar les secrecions lipídiques
de les cèl·lules HepG2, cèl·lules hepàtiques, en el tractament amb vi blanc, vi negre i un
control suplementat amb PBS (proporciona un medi estable per a les cèl·lules i el seu
tractament). Aquests pràctiques van ser: la tinció i la microscòpia de les cèl·lules HepG2.
Per a la metodologia que vaig seguir per poder corroborar l’efecte cardiovascular de l’oli
d’oliva i del vi negre respecte al vi blanc, es van utilitzar les següents tècniques de treball:
� 60
6.1 Tècniques de treball
• Cultius cel·lulars: manteniment de la línia cel·lular HepG2 i sembra en 2 plaques de
sis pouets pels tractaments. Aquestes cèl·lules creixen en un medi DMEM-low
glucose. Trobem dos tractaments:
o Tractament amb àcids grassos: tres d’aquests pouets es van tractar amb
oleil’CoA mentre que els altres tres es van tractar amb palmitoil’CoA.
o Tractament amb vi: tres dels poeuts s’hi va afegir vi blanc i a uns altres tres vi
negre.
• Tractament amb els dos tipus d’àcid gras: les cèl·lules van estar suplementades amb
una concentració de 100 mg/ml durant 72 hores.
• Tractament amb vi negre i vi blanc: cèl·lules suplementades amb 5 μl de vi
blanc/negre per cada mil·lilitre de medi cel·lular.
• Extracció de proteïna, amb Buffer RIPA, O/N (overnight –tota la nit-) a 4ºC, i d’RNA
amb TRIZOL.
• Western Blot, amb anticossos anti-ApoA1 i anti-ApoB100 de ratolí i cabra, utilitzant la
tubulina com a control i per corregir la concentració de proteïna. El Western blot és
un mètode molt utilitzat en el camp de la
investigació per a la detecció de proteïnes. En
concret, la paraula ‘’blotting’’ fa referència a la
transferència de macromolècules biològiques
des d’un gel fins una membrana mitjançant
l’electroforesi, una tècnica que separa les
macromolècules segons la seva massa
molecular, aplicant una diferència de potencial.
Un cop estan transferides a les membranes,
són examinades utilitzant anticossos específics
per a les proteïnes que interessen, gràcies el
paràmetre marcat per BIO-RAD. (Figura 33)
Figura 33: Paràmetre d’identificació de
proteïnes de BIO-RAD.
� 61
Aquesta mostra permet identificar la proteïna que busquem segons la seva massa
molecular. Només cal saber quina és la massa i un cop hagi corregut la proteïna mirar
per on es situarà per poder identificar-la. Aquesta tècnica permet comparar els nivells de
presència de proteïnes en les diferents mostres que tinguem, entre d’altres aplicacions
que no venen el cas.
• Quantificació de l’RNA per Real-time PCR a partir de la CDNA obtinguda per
retrotranscripció.
• Tinció de les cèl·lules tractades amb vi, amb oil-red i ús de microscòpia.
� 62
6.2 Preparació del medi de cultiu cel·lular
Per poder iniciar els experiments, primer de tot es van descongelar les cèl·lules hepG2 una
línia de cèl·lules tumorals que, gràcies a la seva ràpida i indefinida proliferació, i per tant són
perfectes per a experiments al laboratori. Aquestes cèl·lules tenen una gran activitat
metabòlica i viuen adherides als teixits. Per a descongelar-les es segueixen els següents
passos:
• Treure el vial de cèl·lules del congelador i descongelar-ho a temperatura ambient o a
37˚ C en el bany (Figura 34). El bany permet adequar les substàncies a la
temperatura ambient per a assegurar cap alteració i unes condicions normals en el
desenvolupament de les cèl·lules.
• Posar la suspensió cel·lular (0,5 ml) en un flascó petit amb 5 ml de medi de cultiu.
• Deixar 2 h a la campana de flux, laminar perquè es fixin les cèl·lules vives i canviar el
medi de cultiu per a eliminar les mortes.
Figura 34: Bany a 37ºC on es descongelen o bé s’escalfen les substàncies.
Per sembrar les cèl·lules, primer de tot cal preparar el medi de cultiu cel·lular on aquestes es
fixaran al flascó i proliferaran. Un cop es trobin confluents es procedirà a sembrar-les en una
placa de sis pouets i a subministrar el tractament específic.
� 63
Material
Medi de cultiu cel·lular (500 ml)
-Línia cel·lular tumoral HepG2
-22 ml de medi de cultiu en un flascó de vidre:
-DMEM low glucose: aporta els nutrients pel creixement de les cèl·lules
-FBS 10%: sèrum de boví fetal.: aporta les proteïnes necessàries
-Antibiòtic 5% (PS-penicilinaestreptomicina): evita la proliferació de
bactèries en el medi
-Pipetes graduades
-Bomba de buit
-2 Plaques de sis pouets (una pel tractament d’àcids grassos i l’altre pel dels vins)
-10 ml PBS
-1 ml de tripsina.
-1 ml de medi de cultiu nou/pouet
-1ml de suspensió cel·lular/pouet
-Incubadora (5% CO2 i 21% 02)
Procediment
Qualsevol tractament amb cèl·lules es dur a
terme a dins de les campanes de flux laminar,
per evitar contaminacions (Figura 35)
Les cèl·lules es cultiven en un flascó de vidre
fins que, en el microscopi, veiem que estan
suficientment confluents per passar-les a un
altre flascó a la fi de que continuïn creixent.
Finalment, quan tornen a estar confluents es
traspassen a la placa de sis pouets.
Figura 35: Campana de flux laminar a
la sala de cultius
� 64
Per aconseguir que les cèl·lules creixin hem d’afegir, mitjançant pipetes, 22 ml de medi de
cultiu ja preparat, que conté DMEM low glucose que aportarà els nutrients necessaris. El
FBS al 10% aportarà les proteïnes necessàries i
l’antibiòtic al 5% PS evitarà l’aparició de bacteris
que contaminin el medi (Figura 36).
Per traspassar les cèl·lules a la placa de sis
pouets, cal treure el medi mitjançant la bomba de
buit. Les cèl·lules seguiran estan fixades a causa
de la seva pròpia naturalesa. Després s’afegeixen
10 ml de PBS al flascó que s’utilitza per rentar i
extreure les proteïnes del sèrum de boví (FBS)
que no ens interessen i després es torna a treure
mitjançant la bomba de buit. A continuació,
s’afegeix 1 ml de tripsina que trencarà les
proteïnes que mantenen les cèl·lules adherides al
flascó.
Figura 36: Medi de cultiu.
Un cop desenganxades, s’afegeixen 10 ml de medi de cultiu (Figura 36) per inhibir l’actuació
de la tripsina, que acabaria per desnaturalitzar totes les proteïnes de les cèl·lules i no ens
permetria fer l’estudi. Finalment, mitjançant la pipeta, es remou el contingut, acció que
s’anomena ‘’resuspendre’’ i s’afegeix a cada pouet de les dues plaques 1 ml de suspensió
cel·lular i 1 ml de medi de cultiu nou. Després, les cèl·lules es guarden a la incubadora
comuna on es simulen unes condicions de 21% d’O2 i 5% de CO2, uns 25ºC de temperatura.
A partir d’aquí es procedirà al tractament de les cèl·lules d’una de les plaques amb àcids
grassos.
Va succeir una primera contaminació deguda principalment a alguna manca d’atenció en
l’esterilitat de tot el material utilitzat a la sala de cultius. S’ha d’anar molt en compte, perquè
les incubadores són comunes a diversos departaments i, el descuit de no rentar-se bé les
mans o no esterilitzar amb etanol tots els estris utilitzats pot provocar la contaminació de les
cèl·lules, i conseqüentment la fallida d’un experiment.
� 65
6.3 Tractament amb àcids grassos
Material
- Pipeta graduada
- Placa de sis pouets
Procediment
Per començar a tractar les cèl·lules amb àcids grassos ens hem d’assegurar que les
cèl·lules s’han adherit correctament a les places i que no estan contaminades. Es comprova
observant-les al microscopi (Figura 37). Les cèl·lules d’una de les plaques ens serviran per a
estudiar l’efecte dels àcids grassos palmitoil’CoA i oleil-CoA en la producció de les
apoliproteïnes ApoB100 i ApoA1. Les cèl·lules de tres d’aquests pouets van ser tractades
amb oleil’CoA mentre que les altres tres restants es van tractar amb palmitoil’CoA.
Figura 37: Observació de l’estat de les cèl·lules al microscopi.
La terminació ‘’CoA’’ fa referència al coenzim (coenzim A) que es troba adherit a l’àcid gras.
Com ja s’ha explicat en la part bioquímica del treball, els àcids grassos són llargues cadenes
alifàtiques i per tant insolubles en aigua. La funció del coenzim és l’activació de l’àcid gras,
que permetrà la interacció dels àcids grassos dins de les cèl·lules.
� 66
A continuació, hem esquematitzat en el quadre següent el tractament que s’ha dut a terme
pel que fa als àcids grassos.
Un dilluns, es van començar a tractar les cèl·lules amb concentracions de 100 mg d’àcid
gras per cada mil·lilitre de medi cel·lular mitjançant les pipetes (Figura 38).
Aquest tractament té una durada de 72 hores, i per tant dijous es va procedir a fer el següent
pas: l’extracció de proteïna de les cèl·lules.
Figura 38: Campana de fluxe laminar on s’afegeixen els àcids grassos mitjançant una
pipeta.
DIVENDRES DISSABTE DIUMENGE DILLUNS DIMARTS DIMECRES DIJOUS
Es sembren les cèl·lules
Tractament de les cèl·lules amb àcids grassos:
• 100 mg/ml OCoA (àcid oleic)
• 100 mg/ml PCoA (àcid palmític)
� 67
6.3.1 Pràctica 1: Extracció de proteïnes i Western Blot.
Passades les 72 hores, les cèl·lules HepG2 hauran produït suficient material (RNA i
proteïna) per poder ser quantificat, poder discutir els resultats i extreure`n conclusions. Cal
recordar, que aquesta línia cel·lular té una gran activitat metabòlica, és a dir que en
aquestes 72 hores hi haurà alts nivells de tot tipus de substància produïda per les cèl·lules i
fins i tot secrecions cel·lulars com a substàncies de rebuig. En principi, les cèl·lules, al haver
estat tractades amb àcids grassos diferents, aquesta quantitat ha de ser diferent en aquells
pouets on s’ha subministrat Palmitoil-CoA dels que s’ha afegit Oleil-CoA. Primer de tot es va
procedir a extreure les proteïnes i per una altra banda l’RNA de les cèl·lules. En aquest
apartat ens centrarem únicament en l’extracció de les proteïnes. Aquest procediment ve
seguit d’una sèrie de passos que constitueixen la tècnica del Western Blot, explicat en
l’apartat de 6.1 Tècniques de treball.
Aquest mètode permet comparar la quantitat de les proteïnes que ens interessen: l’
ApoB100 relacionada amb les lipoproteïnes LDL, i l’ApoA1 relacionada amb les lipoproteïnes
HDL. Sense aquest mètode no podríem refutar o confirmar la nostra hipòtesi: el benefici dels
àcids grassos monoinsaturats en front els saturats i l’evidència de l’oli d’oliva com a un
aliment cardioprotector.
A continuació, s’explica com extreure el material proteic de les cèl·lules.
• Extracció de proteïnes de les cèl·lules
Material
-Bomba de buit
-1ml PBS/ pouet
-2 scrappers –rascadors- , un pels tractats amb àcid palmític i un per l’àcid oleic
-500 μl de cèl·lules en PBS
-Centrífuga
-50 μl Buffer RIPA
-12 eppendorfs
-Pipetes graduades
-Cambra freda� sínia de tubs
� 68
Un cop finalitzat el tractament, s’extreu el medi dels sis pouets amb la bomba de buit (Figura
39). Després s’afegeix 1ml de PBS amb una pipeta a cada pouet per rentar i treure les
substàncies que les cèl·lules hagin pogut secretar.
Figura 39: Extracció del medi cel·lular mitjançant la bomba de buit.
A continuació, s’extreu el PBS i amb un ‘’scrapper’’ (una mena de rasclet petit) es rasca la
superfície dels pouets suaument per desenganxar les cèl·lules que es troben adherides.
(Figura 40). En aquest cas, no s’afegeix tripsina perquè trencaria totes les proteïnes.
Figura 40: Ús del ‘’scrapper’’ en cada pouet.
� 69
Tot seguit, es torna a afegir 1ml de PBS a cada pouet i es preparen dotze eppendorfs
identificant-los, sis d’aquests seran utilitzats per a l’extracció de proteïna de les cèl·lules i els
altres sis per a l’extracció d’ARN. De cada pouet s’extreu 1 ml de cèl·lules en medi de PBS,
es pipetegen 500 μl en un eppendorf per a l’extracció de proteïna i 500 μl per a l’extracció
d’ARN per a cada una de les mostres obtingudes de cadascun dels pouets. (Figura 41).
Figura 41: Els 12 eppendorfs utilitzats (els tres últims de cada fila pertanyen a un experiment
paral·lel que feien el VHIR).
Per a l’extracció de proteïna, primer de tot es centrifuga 10 minuts, a 4ºC, a 12000 rpm per
obtenir un ‘’sobrenedant’’, que és la part que no queda enganxada al fons sinó que queda
flotant, i un ‘’pellet’’, que és el sediment que s’obté en la centrifugació. En aquesta primera
centrifugació s’obté com a sobrenedant el PBS que permet la seva decantació mitjançant
una pipeta de precisió. Per altra banda, el que queda com a ‘’pellet’’ seran les cèl·lules.
Després s’afegeixen 50 μl de buffer RIPA que permet separar les proteïnes de tota les
cèl·lules i es deixa durant tota la nit, a 4ºC, a la cambra freda.
� 70
Al dia següent, es tornen a centrifugar les mostres a 12000 rpm, durant 10 minuts, i
s’obtenen les proteïnes com a sobrenedant (Figura 42).
Figura 42: Centrífuga amb les mostres.
El següent pas és preparar els gels per a l’electroforesi del Western Blot. Un cop preparat tot
el muntatge del Western Blot se li aplicarà una diferència de potencial per a que comencin a
córrer les proteïnes segons la seva massa molecular. Es necessita:
-Un muntatge on correran les proteïnes a l’electroforesi (Figura 43)
-Running Buffer: - 30.3 g trizma
-144 g glicina
-10 g SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)
Posteriorment aquesta solució es dilueix 1:10 en aigua
-Una diferència de potencial (150 V)
Figura 43: Muntatge d’electroforesi amb Running Buffer.
� 71
• Preparació de dos gels per a l’electroforesi
Material
1. 10 ml de gel d’acrilamida al 6% �� ApoB
-5,3 ml H20
-2 ml acrilamida
-2,5 ml d’1,5M Tris (pH 8,8)
-0,1 ml SDS (10%)
-0,1 ml APS (10%)
-0,008 ml TEMED
2. 10 ml de gel d’acrilamida al 15% � Apo A
-2,3 ml H2O
-5,0 ml d’acrilamida
-2,5 ml 1,5 M Tris (pH 8,8)
-0,1 ml SDS (10%)
-0,1 ml APS (10%)
-0,004 ml TEMED
�
������2 tubs d’assaig
- 2 suports de vidre pels gels
- 2 mini raspalls especials de plàstic
- 100 μl isopropanol
3. Preparació Stacking (mix que posicionarà les proteïnes en una zona
concreta, a partir de la que es començaran a separar)
-6ml H20
-1,3 ml acrilamida
-2,5 ml Tris
-100 ml SDS (10%)
-50 ml APS (10%) (persulfat amònic)
-10 ml TEMED (etilen diamina)
Resolving: mix que iniciarà
la separació de les
proteïnes.
Resolving: mix que iniciarà
la separació de les
proteïnes.
� 72
A l’hora de preparar els gels s’han de tenir en compte les masses moleculars de les
proteïnes que volem estudiar. El gel d’acrilamida en polimeritzar-se i gelificar-se forma una
sèrie de porus, no visibles, que serveix en per separar les proteïnes. A major contingut
d’acrilamida, els porus seran més petits perquè el gel tindrà més consistència. Per això, en
el cas de l’Apo B que és una proteïna molt gran d’uns 260 KDa (Kilodaltons), el gel ideal és
el del 6% d’acrilamida. En primer lloc, es prepara el ‘’Resolving’’ afegint tots els components
mitjançant pipetes diferents i s’introdueix en un tub d’assaig. Per altra banda es preparen els
vidres del suport, entremig d’aquests es vessarà part del ‘’Resolving’’ (Figura 44). En una
altre tub d’assaig es prepara el gel per a la separació de l’ApoA1. Aquesta proteïna té una
massa molecular de 31,4KDa, per tant és una proteïna molt petita.
Figura 44: Muntatge dels dos gels, el del 6% correspon el de l’ApoB100 i
el del 15% el de l’ApoA1.
Per aquest motiu utilitzarem un gel en un 15% d’acrilamida que formarà uns porus més
petits i per tant permetrà separar l’ApoA1 i altres proteïnes de baixa massa molecular. A
ambdues plaques cal assenyalar quin gel conté, per saber quina de les proteïnes
identificarem en cadascuna.
El contingut del ‘’Resolving’’ està tabulat per a cada tipus de gel d’acrilamida. Cada
‘’Resolving’’ es vessa entre els vidres del suport corresponent fins a la ratlla verda de dalt, i
després a cadascuna d’ells s’hi afegeixen 100 μl d’isopropanol que evita la formació de
bombolles que puguin impedir l’electroforesi, per a la correcta separació de les proteïnes.
El contingut que quedi en el tub d’assaig ens servirà per saber si el gel ha polimeritzat o no.
� 73
Un cop el gel hagi polimeritzat, es prepara i es vessa el ‘’Stacking’’, que també està tabulat i
és comú per a tots els gels i que posiciona totes les proteïnes des d’un mateix nivell.
• Preparació de les proteïnes extretes
-Pipetes de precisió
-10 μl H20
-5 μl mostra de proteïnes de les cèl·lules tractades.
-3 μl solució de tampó de càrrega � blau de bromofenol
� beta-mercapto-etanol.
-6 Eppendorfs
-Vortex
-Termoblot
-6 μl per marcador. (3 marcadors necessaris)
-Centrífuga
Al pas previ a aplicar-hi el voltatge, consisteix en la preparació de les proteïnes que s’han
extret i l’afegiment d’un marcador. Per això, s’elabora una plantilla per saber quina mostra
introduir en cada pouet. A més per tal de diferenciar els gels encara més, en el gel
d’acrilamida al 6% es va afegir un sol marcador de 6 μl i en el d’acrilamida al 15% es va
afegir dos marcadors, de 6 μl cadascun. Aquestes plantilles es realitzen en tots els
experiments i també serveixen per a experiments futurs. La plantilla és la següent:
M Oa1 Oa2 Oa3 P1 P2 P3
M M Oa1 Oa2 Oa3 P1 P2 P3
On (M) fa referència al marcador i Oa1, Oa2 i Oa3 fan referència als tres poeuts tractats
amb àcid oleic, dels quals s’han extret les seves proteïnes i s’han introduït en tres
eppendorfs diferents. El P1, P2 i P3 fan referència als altres tres pouets tractats amb àcid
palmític.
En el gel d’acrilamida 6%, és a dir el que conté un sol marcador, s’identificarà la proteïna
ApoB100 mentre que en el del 15% s’identificarà la proteïna ApoA1.
Per altra banda, a les mostres que tenim de proteïna s’afegeix en sis nous eppendorfs, 10 μl
d’aigua i 5 μl de mostra de proteïna mitjançant les pipetes.
� 74
L’últim que s’afegeix és el marcador, uns 6 μl, i 3 μl de tampó de càrrega que conté blau de
bromofenol, que és una molècula colorant molt petita que s’encarrega de donar color a les
proteïnes i que migra per davant de les proteïnes, de manera que es pot fer el seguiment del
moviment de les proteïnes en el gel. En el gel les proteïnes més petites són les que correran
més ràpid, per això s’endinsen més en el gel i arriben a les zones més inferiors. El tampó de
càrrega també conté beta-mercapto-etanol que és un agent reductor que serveix per donar
càrrega negativa a les proteïnes, cosa que també fa l’SDS (detergent) del ‘’Running Buffer’’
a més de desnaturalitzar les proteïnes. En la seva forma natural, cada proteïna, depenent
dels grups que contingui, està carregada de forma diferent, aleshores la migració de la
proteïna en el gel estaria alterada. Per tant, donant a totes un excés de càrrega negativa
aconseguim que totes les proteïnes parteixin d’una mateixa càrrega i migrin cap al pol
positiu només en funció de la seva grandària.
Després, aquestes mostres s’agiten al ‘’vortex’’ on es tornen homogènies (Figura 45). Tot
seguit es col·loquen al ‘’termoblot’’ durant uns 10 minuts.
Figura 45: Mostres sent agitades al vortex.
El ‘’termoblot’’ es troba a 95ºC i es fa servir per acabar de trencar els enllaços de les
conformacions de les proteïnes. Per últim, es centrifuguen les mescles per obtenir tota la
mostra conjunta i no dispersa pels eppendorfs.
� 75
Abans d’iniciar l’electroforesi s’introdueix cada mostra en el pouet corresponent segons la
plantilla elaborada (Figura 46) i es procedeix a aplicar-hi el Running Buffer. El Running
Buffer és un medi adequat per al moviment de les proteïnes en el gel. L’SDS que conté és
un detergent desnaturalitzant que s’uneix a les proteïnes, i els hi aporta càrrega negativa
proporcional a la seva grandària. També acaba de trencar els enllaços d’hidrogen i
destrueix l’estructura terciària de les proteïnes, col·locant-les en forma linial. Finalment,
s’aplica la diferència de potencial (Figura 47). A partir d’aquest nivell començaran a córrer
un cop es sotmeti tot el muntatge a la diferència de potencial. Abans d’aplicar-li aquest
voltatge cal afegir les proteïnes als forats que s’han deixat lliures gràcies a l’ús d’uns mini
raspalls especials de plàstic, que es fiquen entre els vidres per assegurar que quedin uns
pouets per on poder introduir-hi les diferents mostres de proteïna.
Figura 46: Muntatge d’electroforesi i introducció de cada mostra de proteïnes extretes
de les cèl·lules d’un pouet en un dels forats del gel d’acrilamida.
Figura 47: Muntatge d’electroforesi connectat a una diferència de potencial de 150V.
� 76
El procés d’electroforesi, i per tant la migració de les proteïnes, triga aproximadament 45
minuts. Un cop totes les proteïnes hagin migrat pel gel, les obtindrem separades segons la
seva grandària. Tot i així, de totes les proteïnes que obtenim només n’utilitzarem tres: l’Apo
B, l’Apo A i la tubulina, que servirà com a proteïna control. Per poder reconèixer únicament
les proteïnes que ens interessen s’han d’afegir els anticossos específics. Per poder afegir
aquests anticossos, i que en siguin efectius, fa falta traspassar les proteïnes a unes
membranes de paper whatman, mitjançant una intensitat elèctrica, on es podran afegir els
primers i segons anticossos.
• Transferència de proteïnes a membranes
Material
-Cubell mitjanament gran i 2 esponges negres
-Buffer de transferència� 14 g Glicina
� 3,05 g Trizma
� 800 ml H20
� 200 ml metanol
� 5,6 ml SDS
- Paper whatman
- Suport foradat (Sandwich): format per una placa negra i una de transparent
- Gels provinents del Western Blot
- Membranes de transferència de proteïnes
- Muntatge de transferència
- Pipeta graduada trencada i els gels
- Aplicació d’una intensitat de 300 mA
� 77
Primer de tot, s’han de traspassar les proteïnes del gel a unes membranes on, un cop
revelades, s’exposaran les proteïnes en el film auto-radiogràfic. Paral·lelament, es prepara el
buffer de transferència amb les quantitats indicades prèviament i el suport foradat
(Sandwich) on es durà a terme la transferència (Figura 48).
Figura 48: Preparació del –sandwich-.
El ‘’sandwich’’ està format per dues esponges, la pipeta trencada, que serveix per extreure
part del buffer que hi ha quedat adherit i la membrana on es transferiran les proteïnes.
Aquest ‘’sandwich’’ es fa per tots dos gels. En el suport s’afegeix primer de tot una esponja,
després la membrana de paper whatman i el gel amb les proteïnes. Tot seguit, es passa per
sobre la pipeta trencada per tal d’extreure líquid del gel i impedir la formació de bombolles.
Finalment, s’hi diposita damunt l’altra esponja i es tanca el ‘’sandwich’’. S’introdueix al suport
(Figura 49), que es connecta a una intensitat de 300mA. Amés d’estar completament
recobert de gel per evitar que la gran quantitat de calor despresa afecti a les proteïnes que
s’han de transferir.
Figura 49: Muntatge de transferència connectat a una intensitat.
� 78
Quan el muntatge porta uns 30 minuts connectat es treu la intensitat de corrent i les
membranes dels ‘’sandwiches’’. Els gels es llencen i les proteïnes queden fixades a les
membranes.
• Reconeixement de les proteïnes que ens interessen
1. Tractament amb anticossos primaris
- Dues cubetes
- Dues membranes
- Tres tubs de 10 ml
- Solució de bloqueig: llet al 5% en PBS i 0,01% de tween
- Anticossos primaris � 5 μl antiApoB i 5 μl antiApoA de cabra
� 1 μl antitubulina de ratolí.
- Buffer de rentat de les membranes (PBS- Phosphate Buffered Saline- i tween al
0,01%)
-Dos tubs de 10 ml
-5 ml de llet/tub
-Tisores
-Cambra freda� sínia de tubs
Un cop feta la transferència de proteïnes a les dues membranes, les introduïm a dues
cubetes i les incubem en una solució de bloqueig (llet al 5% en PBS i 0,01% tween) durant
1h. La quantitat d’aquesta solució no és del tot important, aproximadament uns 10 ml,
únicament és necessari que la solució cobreixi completament les membranes.
Després del bloqueig, posem l’anticòs primari en la cambra freda (a 4ºC) tota la nit, és a dir:
es treuen les membranes de les solucions de bloqueig i es tallen. Cal tallar les membranes,
sense que s’arruguin, mirant el marcador de masses moleculars de BIO-RAD segons el de
les proteïnes que volem identificar. Aquest marcador ens indica en quina part de la
membrana estan les proteïnes de cada grandària i ens permet tallar les membranes
adequadament. En aquest cas, la membrana amb les proteïnes procedents del gel al 15%
d’acrilamida es talla aproximadament per la banda de 37kDa per detectar l’Apo A que fa
31,4kDa i la tubulina que en fa 55 kDa. La membrana que conté les proteïnes procedents del
gel d’acrilamida al 6%, es talla per la franja dels 150 kDa, ja que la proteïna que volem
detectar en aquest cas és l’Apo B i fa 260 kDa.
� 79
En aquesta membrana també identifiquem la tubulina, que ens permetrà avaluar la quantitat
de proteïna, per tant tallarem la membrana també al voltant dels 50 kDa. Tallar les
membranes ens permet detectar proteïnes diferents alhora si incubem cada tros tallat amb
un anticòs concret, sinó només podríem incubar la membrana amb un únic anticòs.
Per tant, cada tros de membrana és incubat amb un anticòs encarregat de detectar la
proteïna que ens interessa. La concentració d’anticòs primari depèn de com sigui l’anticòs
(característica comercial) i de quant s’expressa o quina quantitat hi hagi de proteïna que ens
interessi. S’afegeix cada anticòs primari en un tub diferent amb el tros de membrana per on
es trobarà la proteïna que s’haurà d’identificar. En tots tres tubs de 10 ml s’afegeixen 5 ml de
llet. En un dels tubs s’afegeixen 10 μl d’antiApo B de cabra, en un altre 5 μl antiApo A de
cabra i en el tercer 1 μl antitubulina de ratolí. Els tres tubs són marcats amb la proteïna que
reconeixeran, per no confondre’ls i s’introdueixen a la sínia de tubs a la cambra freda tota la
nit, perquè així les membranes quedin ben impregnades.
Un altre aspecte a tenir en compte és la necessitat d’anotar totes les quantitats i la
procedència animal dels anticossos per a l’addició de l’anticòs secundari al dia següent.
2. Tractament amb anticossos secundaris
-2 cubetes.
-Solució bloqueig: llet, PBS i tween.
-Pipetes.
- Buffer de rentat de les membranes (PBS- Phosphate Buffered Saline- i tween al
0,01%).
-Anticossos secundaris �2 μl AntiApoA i 2 μl antiApoB de cabra.
�2 μl Antitubulina de ratolí.
-1,5 ml de cada revelador (reactiu i substrat).
Al dia següent, es treuen els tubs de la cambra freda i es posen els trossos de membrana en
dues cubetes, identificant les zones tallades, i es fan tres rentats de 15 min cadascun. El
rentat es fa gràcies al buffer de rentat que conté PBS amb tween (detergent) al 0,01%.
Aquesta solució serveix per rentar millor les membranes de tal manera que es treu només
l’anticòs primari, no el que es troba ja fixat a les proteïnes que ha reconegut sinó aquell
sobrant, per tal d’evitar que l’anticòs secundari reconegui una zona on no es troba la
proteïna, i que per tant, no interessa i que alteri els resultats.
� 80
Després, s’afegeix l’anticòs secundari, tenint en compte la procedència animal del primer
anticòs, i es deixa 1h en l’aparell que manté les cubetes en moviment constant i per tant
afavoreix la impregnació total de les membranes amb els anticossos secundaris (Figura 50).
Figura 50: Cubetes amb les membranes impregnant-se d’anticòs secundari.
Normalment es posa en concentració 1:5000, per això, com al posar 10 ml (100000 uL) de
llet, hem d’afegir 2 uL d’anticòs secundari. Després del anticòs secundari es fan tres rentats,
també de 15 min cadascun, afegint buffer de rentat a les cubetes.
Per últim, mitjançant les pipetes, s’afegeixen els reveladors junts que contenen un reactiu i
un substrat en la mateixa proporció, 1,5 ml de cadascun, en les dues cubetes: una té
reconeguda l’Apo A i la tubulina i en l’altra cubeta l’Apo B i també la tubulina. Al afegir els
reveladors, es permet la seva reacció d’oxidació que és el que ens permet veure els
resultats de la reacció de la peroxidasa, que es troba unida a l’anticòs secundari, en els films
auto-radiogràfics, un cop s’ha passat per la reveladora. Així, podrem comparar la quantitat
de proteïna a partir de la seva expressió.
� 81
• Revelació Western Blot
-Membranes
-Plàstic per embolicar les membranes
-Cúter.
-Màquina reveladora
-Film auto-radiogràfic
-Permanent negre
Un cop afegits tots els components necessaris pel reconeixement de les proteïnes que ens
interessen: Apo B, Apo A i tubulina, s’agafen les membranes i es col·loquen sobre una taula
per ser embolicades amb un plàstic. El plàstic mantindrà unides les membranes tal com les
teníem en extreure-les dels gels, és a dir, formant dues úniques membranes tot i haver estat
retallades per ser tractades amb diferents anticossos, segons la proteïna que ha de ser
identificada. (Figura 51). El tros de plàstic que quedi sobrant es talla amb el cúter.
Figura 51: Embolicament de les membranes.
� 82
Per últim, es porta a la màquina reveladora on mitjançant unes plaques es treuen els plàstics
es copien les membranes en el film auto-radiogràfic, es revelen i s’obtenen els resultats que
després hauran de ser quantificats a l’Excel (Figura 52). Com es pot veure en la Figura 52,
la de la dreta correspon al gel d’acrilamida al 15% ja que conté els dos marcadors que ens
ho indiquen i per tant en aquest es reconeixerà l’Apo B. En canvi, el de l’esquerra, que
només conté un marcador, correspon al gel d’acrilamida del 6% i per tant el gel on
s’identificarà l’Apo A.
Tubulina
Apo A
Figura 52: Membranes embolicades amb els marcadors proteics al costat.
Sense l’anticòs secundari no podríem observar cap mena de resultat, ja que el anticòs
primari no s’uneix a la peroxidasa i per tant, sense el secundari unit al primari no podríem
observar res en revelar les membranes.
Si mirem la Figura 52, en la membrana de la dreta haurà d’aparèixer la tubulina en la franja
blava i l’Apo B per la franja superior, per sobre de la franja blava, ja que es troba entre les
màximes masses moleculars possibles. Per altra banda, a la membrana de la dreta, l’Apo A
haurà d’aparèixer al voltant de la franja rosa i blava, i la tubulina per sobre d’aquesta.
A
Apo B
Tubulina
� 83
Conclusions dels resultats del Western Blot
En extreure els films auto-radiogràfics de la màquina reveladora, es va observar que
afortunadament obtenim uns resultats força favorables. En primer lloc, cal mirar, segons la
massa molecular de les proteïnes, la franja per on han d’aparèixer. En aquest cas,
apareixien l’Apo A i la tubulina, dues de les tres proteïnes que es buscaven. Tanmateix, no
hi ha havia presència d’Apo B. Aquest fet va ser degut principalment al què una massa
molecular gran comporta una difícil detecció de la proteïna. De fet, els investigadors
professionals tenen greus problemes en identificar aquest tipus de proteïna, és per això que
en aquest camp d’investigació vers l’Apo B s’utilitzen altres mètodes com el que s’explicarà
en el següent apartat a partir dels RNA fabricats per la cèl·lula.
En veure que no apareixia, vàrem tornar a reincubar les membranes, un cop rentades,
seguint la mateixa metodologia, amb els anticossos primaris i secundaris, per veure si amb
una major concentració d’Apo B es podia detectar la proteïna i poder fer uns resultats
comparatius. D’anticòs primari es va canviar la concentració a 1:500 de tal manera que es
van afegir 10 uL en lloc de 5 uL. Després, d’antiApo B (anticòs secundari) es van afegir 5 uL
per poder afavorir la seva expressió en la revelació del Western Blot, per tant la seva
concentració va passar a ser 1:2000. L’Apo B al ser una proteïna de gran massa molecular,
té una certa dificultat a l’hora de ser revelada ja que en molts casos no s’obté el senyal i per
tant, no es pot quantificar correctament la proteïna. Augmentant la concentració d’anticòs
secundari, s’incrementa la possibilitat de reconeixement de l’anticòs primari i secundari, per
tant de l’Apo B.
Tot i així, en revelar les membranes reincubades, la proteïna va sortir sobre-expressada i
per tant no es podia diferenciar res, degut a l’alta concentració d’anticossos. Això venia
provocat principalment per les raons prèviament explicades i per l’alta inespecificitat de
l’antiApo B. La inespecificitat fa referència a la capacitat que té l’anticòs d’unir-se a la
proteïna que ha de reconèixer.
El problema es troba en què els anticossos a vegades si no són gaire específics s’uneixen i
identifiquen altres zones, fins i tot d’altres proteïnes d’estructures amb fraccions semblants o
iguals, i que per tant no havien d’identificar i provoquen l’alteració dels resultats. Un cop hem
obtingut l’expressió de les proteïnes que es volen estudiar, es processen les imatges del
Western Blot en un programa anomenat Image J.
� 84
Si mirem la Figura 53, podem veure qualitativament que els pouets OCoA tenen més Apo A
respecte de la nostra proteïna control, que és la tubulina. Aquests resultats, però, s’han de
quantificar. El programa quantifica l’expressió de la proteïna segons la intensitat i l’àrea
expressada. A la taula 10, la quantificació està feta a partir de l’àrea expressada.
Figura 53: Resultats obtinguts en la revelació del Western Blot.
Taula 10 : Quantificació per l’Excel Western Blot.
Mostra Apo A Tubulina (Cyp A) Apo A/ Cyp A
OCoA 1392 5328 0,261261261
OCoA 1275 5136 0,248247664
OCoA 1296 5136 0,252336449
PCoA 1053 5562 0,189320388
PCoA 781 5454 0,143197653
PCoA 814 5200 0,156538462
Mitjana PcoA: 0,163018834
Primer de tot, cal fer el rati de cada mostra, dividint el nivell de proteïna Apo A de cadascuna
entre la tubulina. Després es fa la mitjana del rati obtingut amb un dels dos grups: PCoA o
OCoA. En aquest cas, vam fer-lo del PCoA, per comparar totes les mostres respecte l’àcid
palmític i veure per tant, com augmenta o disminueix en els pouets de les cèl·lules tractades
amb àcid oleic respecte les tractades amb el palmític.
Apo A
Tubulina
PCoA OCoA
� 85
Taula 11: Quantificació per l’Excel Western Blot.
Mostra Rati mostra/ Mitjana PCoA
Mitjana Desvest (Desviació respectla mitjana)
Error estàndard de la mitjana
OCoA 1,602643013
OCoA 1,522814295 1,557784417 0,040822696 0,013607565
OCoA 1,547895942
PCoA 1,161339404
PCoA 0,878410818 0,999998984 0,14559302 0,048531007
PCoA 0,960246729
A partir de la quantificació es fan els gràfics, agafant la mitjana de la quantitat de rati
mostra/mitjana PCoA dels tres pouets tractats amb àcid oleic (OCoA) i el dels tractats amb
àcid palmític (PCoA) (Taula 11). A més, es fan barres d’error, agafant l’error estàndard de la
mitjana, que consisteix en dividir el ‘’desvest’’ entre el nombre de mostres que es tenen, 3 de
cada grup en aquest cas (3 mostres de PCoA i 3 de OcoA) . L’error estàndard és la
desviació estàndard de la variabilitat estadística de cada mostra.
Figura 54: Gràfic comparatiu del nivell de proteïna Apo A en l’estudi d’àcids grassos.
Al estar fent un rati de quantitat de proteïna entre de la tubulina, no hi ha unitats. Tot i així,
en molts articles s’utilitzen les unitats: proteïna estudiada/ CypA, on CypA és la proteïna
‘’control’’, és a dir la tubulina . Aquestes unitats també s’anomenen ‘’arbitrary units’’ –unitats
arbitràries- . Es pot observar que, efectivament, en els pouets tractats amb àcid oleic, el
nivell de proteïna és superior als tractats amb àcid palmític (Figura 54).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
OCoA PCoA
Apo
A/C
ypA
� 86
6.3.2 Pràctica 2: Extracció d’ARN i PCR en ‘’real time’’
En realitzar el tractament de les cèl·lules amb àcids grassos es menciona la necessitat
d’extreure les seves proteïnes, fet que permet la quantificació de l’Apo B i l’Apo A i per tant,
la certesa de la nostra hipòtesi. Tanmateix, la tècnica del Western Blot no és l’única que pot
ser utilitzada per provar aquest tipus d’hipòtesi. Un altre dels mètodes molt emprats en
investigació i que desenvolupàrem és: la PCR -polimerase chain reaction- en ‘’real time’’ –en
temps real-. Aquesta reacció en cadena de la polimerasa coneguda com a PCR és una
tècnica que permet obtenir un gran nombre de còpies d’un fragment d’ADN particular, a
partir d’una quantitat molt petita. Això serveix per amplificar un fragment d’ADN (Figura 55),
molt més fàcil d’identificar i amb més alta probabilitat. Aquesta tècnica permetrà quantificar
la CDNA dels RNAs extrets de la cèl·lula per obtenir a partir d’un ‘’ratio gen’’ (gen control) és
a dir, aquell gen a partir del que farem un rati per demostrar en quin tractament el gen
quantificat es troba més augmentat si en el cas d’aquelles cèl·lules subministrades amb àcid
palmític o amb àcid oleic.
Figura 55: Esquema visual de l’amplificació de la CDNA (còpia d’ADN) per PCR en real time.
Aquesta tècnica i els resultats que obtinguem en el programa ‘’real time SDS 7000’’ no
deixen de ser una manera més de demostrar que efectivament les proteïnes que buscàvem
per a comparar (Apo A i Apo B respecte la tubulina) augmenten o disminueixen segons el
tractament. Per tant, els gens que s’estudiaran seran: el de l’Apo B i el de l’Apo A respecte el
gen del 18s, el gen control. Aquest gen control és present en totes les cèl·lules eucariotes i
forma part estructural del RNA (àcid ribonucleic) ribosòmic, és a dir dels ribosomes
encarregats de la síntesi de proteïna a partir de l’RNA que surt del nucli un cop duplicada i
transcrita la cadena DNA.
� 87
En definitiva, en extreure l’RNA de les cèl·lules, el que estem obtenim no és res més que la
seqüència de bases nitrogenades a partir de les quals es codifiquen els aminoàcids, que
constituiran les proteïnes que ens interessen. En aquest cas, les proteïnes són les
apolipoproteïnes A i B, presents a l’estructura de les lipoproteïnes, que intervenen en el
metabolisme del colesterol i conseqüentment en el risc de cardiopatia cardiovascular. Tot i
així, per dur a terme la PCR en ‘’real time’’ necessitem fer la retrotranscripció per passar
d’RNA a CDNA, és a dir una còpia de material genètic que podrà ser amplificat gràcies a la
PCR.
• Extracció d’RNA de les cèl·lules
Material
-Bomba de buit
-1ml PBS/ pouet.
-Scrapper (rascador)
-500 μl de cèl·lules
-30-50 μl d’aigua
-200 μl de cloroform
-500 μl d’isopropanol
-650 μl d’etanol
-1 ml de Trizol/eppendorf
-Centrífuga
-Termoblock
-Vortex
-12 eppendorfs
-Pipetes de precisió
Un cop finalitzat el tractament d’àcids grassos, s’extreu el medi dels sis pouets amb la
bomba de buit. Després s’afegeix 1ml de PBS amb una pipeta a cada pouet per rentar i
treure les substàncies que les cèl·lules hagin pogut secretar.
� 88
En aquest apartat ens centrarem únicament en l’extracció d’RNA que segueix el mateix
procediment que l’extracció de proteïnes prèviament explicada. S’extreu el PBS i amb un
‘’scrapper’’ es rasca la superfície dels pouets suaument per desenganxar les cèl·lules que es
troben adherides. Tot seguit, es torna a afegir 1ml de PBS per cada pouet. De cada pouet
s’extreu 1 ml de cèl·lules en medi de PBS i es pipetegen 500 μl per a l’extracció d’ARN per a
cada una de les mostres obtingudes de cada un dels pouets (Figura 56).
Figura 56: Extracció de PBS amb bomba de buit.
Per a aquests 500 μl de cèl·lules es preparen 12 eppendorfs enumerats, a sis dels quals s’hi
afegirà 200 μl de cloroform i els altres 6, 500 μl d’isopropanol. A cada eppendorf es pipeteja
la mateixa quantitat de cèl·lules. Es centrifuguen els eppendorfs durant 10 minuts i ens
quedem amb el pellet, és a dir amb les cèl·lules ja separades del PBS. Com el que es vol
extreure és RNA, ara no s’afegeix Buffer RIPA sinó que afegim 1ml de TRIZOL en cada
eppendorf i 30-50 μl d’aigua destil·lada. Aquest pas s’ha de realitzar dintre de la campana
perquè és una substància tòxica que evita la degradació del material genètic a causa de
l’acció dels enzims RNAses, enzims que trobem a la pell, el cabell...
Els eppendorfs es col·loquen en el vortex, perquè el pellet (concentració cel·lular) es dilueixi
amb el TRIZOL. El trizol s’utlitza per homogeneïtzar les mostres d’RNA. Després se
centrifuga durant 5 minuts per separar el pellet i el sobrenedant, que ara serà el RNA amb el
TRIZOL.
� 89
El sobrenedant (RNA + TRIZOL) que obtenim a cada un dels 6 eppendorfs centrifugats
l’afegim als sis eppendorfs que presenten cloroform i ho deixem 5 minuts a temperatura
ambiental per assegurar que tot es mescli. Aquesta tècnica requereix molta atenció i cura a
l’hora de fer correspondre el material de cada pouet a un eppendorf i fer-ho de manera
constant en tot el procés. Per això és tan important enumerar tots els eppendorfs. Els
nostres eppendorfs estaven enumenats segons el tractament (P-palmític- o Oa-oleic-) i el
número de pouet o prova (1, 2 o 3). Per tant , P1, P2, P3, Oa1,Oa2,Oa3, en total 6
eppendorfs.
Un cop passats els 5 minuts, se centrifuga durant 10 minuts a 12000 rpm i es deixa 10
minuts més a temperatura ambient per separar en dues fases el material que tenim; una
fase (rosada i inferior) que contindrà el TRIZOL i les impureses de la mostra, com proteïnes,
membranes lipídiques etc. I la superior (aquosa, transparent i incolora) on es trobaran els
àcids nucleics, constituents de l’RNA.
Després, es transfereix tota la fase aquosa als eppendorfs que contenen isopropanol i on
també s’hi ha afegit 1 ml de TRIZOL en cadascun, per evitar que en aquests passos es
degradi l’RNA. Això, es torna a deixar 10 minuts a temperatura ambient i a centrifugar uns
10 minuts a 12000 rpm i es llença el sobrenedant on quedarà l’isopropanol. L’RNA purificat
haurà precipitat al fons dels eppendorfs.
Per últim, s’afegeixen 650 μl etanol per rentar les mostres i les mesclem en el ‘vortex’ i
centrifugant-les 10 min més. Després, els eppendorfs s’afegeixen al termoblock (Figura 57),
màquina que arriba a temperatures molt altes i en aquest cas els posem a 50ºC per
evaporar l’etanol.
Figura 57: Termoblock on s’escalfen els eppendorfs fins a 50ºC.
� 90
• Quantificació de RNA
Per a poder fer la PCR en ‘’real time’’ cal saber quina quantitat de RNA tenim per poder
preparar les quantitats correctes per obtenir els mixts a partir de les proporcions tabulades
per un sol gen. Per això, cal preparar les mostres i portar-ho al nanodrop, una màquina que
permet quantificar el RNA a partir d’un ‘’blanc’’ o control que ve a ser la resta de l’RNA
menys l’aigua destil·lada que s’afegeix al principi per obtenir la dissolució de l’RNA. El més
important de tot el procés d’extracció és arribar a obtenir un RNA el màxim de pur possible
per assegurar que no hi haurà cap alteració a l’hora que el nanodrop quantifiqui el material
genètic que tenim. Si hi hagués presència d’altres RNAs estructurals com ara RNAr –
ribosòmic- o les proteïnes de les membranes lipídiques entre d’altres, tot aquest material
genètic seria quantificat i interferiria en els nostres resultats erròniament. I és que, el que es
vol quantificar i identificar és el material genètic que codificarà les proteïnes que ens
interessen, no el material genètic que simplement fa funció estructural.
Però, anem pas a pas:
Material
- Mixt de cada eppendorf: - 1,5 ml H2O destil·lada
- 2 μl RNA out (inhibidor RNAses)
- Nanodrop - Eppendorfs de diferents mides: un gran i altres petits
- Els 6 eppendorfs amb RNA purificat
- 6 nous eppendorfs
- Pipetes de precisió
� 91
En un eppendorf preparem el mixt afegint 1,5 ml d’aigua destil·lada i 2 μl d’RNAout (inhibidor
de RNAses). Afegim a cada nou eppendorf 2 μl de dissolució d’RNA purificat i 20 μl de mixt.
Això es porta al nanodrop (Figura 58) i es quantifica el total de nanograms (ng) d’RNA per
cada μl de dissolució. Al nanodrop, s’hi afegeixen amb molta cura, 2 μl de mostra de cada
eppendorf i es va anomenant la quantificació informàtica per cada mostra.
�
�
�
�
�
�
�
�
�
Figura 58: Nanodrop.
De la quantificació de tots els eppendorfs, es van obtenir els resultats de la taula 12, afegint
com a primera mostra 2 μl de ‘’blanc’’ la mesura d’aigua que hi hem afegit i que per tant,
servirà per ser restat del valor que obtingui en quantificar la dissolució d’RNA en el
nanodrop. Així, només quantificarà el material genètic sense l’aigua.
Taula 12: Quantificació d’RNA en el nanodrop.
MOSTRA ID ng/ μl
P1 832,36 P2 676,45 P3 245,95 O1 688,20 O2 836,86 O3 450,35
Ara ja es pot calcular la quantitat d’aigua destil·lada, de mostra d’RNA i d’oligo dt (‘’primer’’
que permet l’inici de la retrotranscripció). Tot i així, la quantitat òptima que hem de tenir
d’RNA per a ser transcrit són 3μg, és a dir 3000 ng d’RNA. Per això, a continuació s’han de
fer una sèrie de càlculs per a preparar els eppendorfs amb les substàncies necessàries per
a realitzar la retrotranscripció, pas d’RNA a CDNA.
� 92
• Retrotranscripció ( d’RNA a CDNA)
- Calculadora
- Mixt 1:
- Aigua
- Oligo dt
- RNA
- Mixt 2 /mostra:
- 1 μl NTP’s (nucloside triphosphate –nucleòtids, esquelet dels àcids nucleics-)
- 2 μl DTT (Dithiothreitol –agent reductor- )
- 4 μl FSB (buffer –medi amb cofactors necessaris per a la reacció-)
- Termociclador (màquina de PCRs)
- Enzim retrotranscriptasa
- Mini eppendorfs.
El càlcul necessari per assegurar-nos que les quantitats dels nous mixts que farem són
proporcionals segons el material que tenim, consisteix en factors de conversió. En cada un
dels casos (P1,... O1...) es fa el mateix procés. Per exemple en el cas del P1, tenim 832,36
ng/ μl i es volen obtenir 3000 ng, per tant per saber quants μl de l’RNA d’aquesta mostra
necessitaré per a fer la retrotranscripció. Si es fa la divisió de 832, 36 ng/ 3000 ng s’obtenen
3,6 μl d’RNA necessaris.
A més, el mixt haurà de contenir aigua destil·lada i 1 μl d’oligo dt tabulat, ‘’primer’’ que
permetrà l’inici de la retrotranscripció de l’enzim retrotranscriptasa. Per això, cada mostra es
prepara sobre 12 μl totals. Seguim amb el cas P1: Si restem 12 μl menys 1 μl obligatori
d’oligo dt, obtenim 7,4 μl d’aigua destil·lada que és la quantitat que haurem d’afegir en
aquest eppendorf. Per a cada una de les mostres d’RNA es fan els mateixos càlculs
metòdics i obtenim els resultats presents a la taula 13:
Taula 13: Càlculs de mixt d’RNA dissolució amb oligo dt.
Mostra (μl) RNA (μl) Aigua destil·lada (μl) Oligo dt (μl)
P1 3,6 7,4 1
P2 4,4 6,6 1
P3 12,2 1,2 1
Oa1 4,4 6,6 1
Oa2 3,6 7,4 1
Oa3 6,7 4,3 1
� 93
Per últim, s’afegeixen els volums dels mixts calculats a cadascun dels nous sis eppendorfs,
mitjançant pipetes.
Un cop tenim els eppendorfs llestos, els introduïm al termociclador (màquina de PCRs)
durant 5 minuts per a desnaturalitzar, a 65ºC , les estructures majors dels RNAs. Cal
destacar també que la resta de material genètic que no s’utilitza, ni per la PCR quantitativa
ni pel Western Blot, s’ha de mantenir en fred en eppendorfs en contacte amb gel que es trobi
en capses i després congelar-los. Així, s’assegura la conservació de les molècules, s’evita
que es degradin i per tant, podran ser utilitzats per a experiments futurs en les mateixes
condicions.
Després, preparem els segons mixts i afegim a cada eppendorf, 1 μl de NTP’s, 2 μl de DTT i
4 μl FBS i s’introdueix al termociclador durant 3 minuts aproximadament (Figura 59).
Figura 59: Introducció dels eppendorfs al termociclador o màquina de PCRs.
A continuació, a cadascun dels eppendorfs s’afegeix 1 μl de l’enzim retrotranscriptasa
inversa, que és el biocatalitzador de la reacció, i es torna a col·locar al termociclador. Aquest
procés durarà 1h i 10 min. aproximadament. Obtindrem la CDNA, és a dir l’RNA transcrit a
DNA.
� 94
• Amplificació de CDNA i QPCR
Material
- Mixt d’amplificació per a un gen:
- 1 μl up (forward)
- 1 μl low (reverse)
- 8 μl aigua destil·lada
- 12,5 μl SYBR green
- Suport amb pouets
- 4 eppendorf grans
- Eppendorfs
- 90 μl TE buffer
- 10 μl ’’primer’’
- 22 μl dissolució de CDNA ( 9 μl de CDNA i 13 μl d’aigua destil·lada)
- Pipetes de precisió
Per a la PCR necessitem preparar uns altres mixts que s’afegiran per a cada eppendorf i
una taula (Taula 14) on es representin tots els pouets per evitar equivocacions a l’hora
d’afegir els diferents CDNA corresponents a cada mostra (P1... Oa1...) .
Taula 14: Plantilla per QPCR del tractament d’àcids grassos.
Mostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Gen
A P1 P1 P2 P2 P3 P3 Oa1 Oa1 Oa2 Oa2 Oa3 Oa3 Apo A
B P1 P1 P2 P2 P3 P3 Oa1 Oa1 Oa1 Oa1 Oa1 Oa1 Apo B
C P1 P1 P2 P2 P3 P3 0a1 0a1 Oa2 Oa2 Oa3 Oa3 18s
‘’Primer’’
� 95
Cal recordar que s’estudien tres gens: el gen de l’Apo A, el gen de l’Apo B i el gen 18s
(control). Per tant, per a la Real Time dupliquem el nombre de pouets que necessitem (3) x2
i així obtenir rèpliques de cada mostra per si una d’elles falla, ens equivoquem a l’hora
d’afegir alguna substància o hi ha algun error. Per tant, a la taula que s’elabori (Taula 14) per
a cada gen corresponen 12 pouets i com s’estudien tres gens, es multiplica 12x3= 36 pouets
totals. Per tant dels 98 pouets que es poden utilitzar a la QPCR només s’utilitzaran 36.
Després es tornen a fer una sèrie de càlculs a partir dels pouets que hem d’omplir per a
cada gen. Com s’ha dit abans, tenim 36 pouets totals dels quals 12 seran per a cada gen.
Per tant, preparem les proporcions del mixt per a 14 pouets, dos de més per assegurar que
no hi manqui mixt. Tenint en compte les següents dades, que indiquen el volum que hem
d’afegir a cada un dels pouets, es multipliquen per 14 pouets, per calcular el total de cada
substància que s’ha de preparar en un mateix eppendorf per a cada un dels tres gens
estudiats:
1 μl up
1 μl low
8 μl H2O destil·lada
12,5 μl SYBR green
L’up i el low fan referència al ‘’primer’’ específic de cada gen. De cada cadena d’RNA, un
dels components del ‘’primer’’ amplificarà el gen que interessa d’esquerra a dreta (towards) i
l’altre a l’inrevés (reverse). Per altra banda, el SYBR green és una molècula que s’introdueix
entre mig de la molècula de la CDNA i s’acobla energèticament als àcids nucleics i
incrementa la seva emissió fluorescent. Aquesta substància és utilitzada com a medi de
visualització directa dels productes de la PCR en ‘’real time’’. De fet, és la molècula que
provoca la fluorescència i que per tant, si hi ha molta quantitat del gen, la fluorescència
s’aprecia més ràpidament. En canvi, si n’hi ha poca quantitat triga molt més en manifestar-se
la fluorescència. A partir dels cicles en que s’altera i es manifesta, es quantifiquen els gens
que interessen.
14 μl up
14 μl down
112 μl H2O destil·lada
175 μl SYBR green
� 96
L’últim que queda per a preparar són els mini eppendorfs amb la dissolució de CDNA i aigua
destil·lada. A cada eppendorf li fem correspondre una de les mostres de CDNA (P1, O1...) i
s’hi afegeixen 90 μl de TE buffer i 10 μl de ‘’primer’’ (Figura 60). Aquest ‘’primer’’ són
oligonucleòtids complementaris i necessaris per a l’amplificació de la CDNA i es troba en
stock. Preparant aquesta solució, diluïm el primer que està en ‘’stock’’ i la CDNA per
amplificar-la.
Figura 60: Els tres ‘’primers’’ d’oligonucleòtids que s’utilitzaran, un per a cada gen.
Després cada mostra diluïda l’afegim a uns altres eppendorfs, fent correspondre cada
mostra amb un eppendorf concret. S’hi afegeixen 9 μl de CDNA de la mostra corresponent i
13 μl d’aigua destil·lada. D’aquesta nova dissolució s’afegeixen 2 μl a cada pouet
corresponent a cada mostra. En aquest procediment és molt important seguir la plantilla
elaborada anteriorment (Taula 14), que permet seguir un ordre i afegir la CDNA de cada
mostra en el seu pouet corresponent (P1, O1....), independentment del gen que es vulgui
identificar. Per exemple, en el cas de la CDNA extreta de la primera placa de les cèl·lules
tractades amb àcid palmític (P1), s’hi afegeixen 2 μl a cada pouet on s’hagi marcat P1. Per
tant, ja que es volen identificar 3 gens diferents, hi haurà tres pouets que contindran la
CDNA del P1. A més, com s’han fet rèpliques, hi hauran 3x2= 6 pouets amb CDNA del P1.
Aquest procediment s’aplica a totes les mostres que hi hagin.
� 97
Els pouets, que seran portats a les UCTS (Unitat de Suport Cientificotècnic) per a la PCR
quantitativa (QPCR), a més de CDNA també han de contenir el mixt format per SYBR green,
‘’primer’’ up i low i aigua destil·lada. A diferència de l’anterior dissolució de CDNA, aquesta
solució depèn de cada gen i és independent de la mostra. És a dir, cada pouet on es vulgui
identificar un gen concret, per exemple el de l’Apo A, s’hi afegirà la mateixa quantitat de
SYBR green, low, up i aigua destil·lada. Tant se val si és P1 o O1 o el que sigui, ja que aquí
només s’hi afegeixen les substàncies que reconeixeran el gen en concret, seguint amb
l’exemple, vindria a ser el de l’Apo A. Tot i així, és indispensable que només s’afegeixi
aquest mixt en tots els pouets on es vulgui identificar el gen de l’Apo A i no en aquells on
s’identificarà el de l’Apo B o el del 18S. En aquests últims, s’hi afegiran d’altres mixts que
contindran els primers (up i low) encarregats d’amplificar únicament el gen interessat i no
d’altres.
Proporcions per a cada pouet segons el gen:
1 μl up
1 μl low
8 μl H2O destil·lada
12,5 μl SYBR green
Un cop es tenen tots els pouets llestos, com el suport on s’hi afegeixen les diferents
susbtàncies és transparent, cal observar detalladament que no hi hagi cap pouet buit per
evitar equivocacions i permetre corregir l’error abans que sigui massa tard. S’afegeix
l’Adhesive Optical Cover i el suport amb els pouets es recobreix amb paper d’alumini, per
evitar que la dissolució de substàncies no s’evapori en realitzar la QPCR, tècnica que arriba
a grans temperatures.
Finalment, cal demanar cita a la UCTS (Unitat Cientificotècnic de Suport de la Vall d’Hebron)
per a que realitzin la PCR quantitativa en Real Time i que els resultats siguin enviats al
Departament de Metabolisme i Endocrinologia.
Anotació: Cal tenir molt en compte que totes les dissolucions i mixts es fan suposant
més quantitat de la necessària, per tal d’evitar que l’experiment es vegi interromput
per la manca de substància requerida en algun dels procediments que es duen a
terme.
� 98
Resultats QPCR
Un cop rebuts els resultats de les UCTs des del programa SDS7000 (System SDS software),
es fan una sèrie de càlculs a l’Excel per a poder fer el rati dels dos gens (Apo A i Apo B) que
ens interessen respecte al 18s. Si s’observa la taula 15, es poden veure diferents números
marcats en vermell. Tots aquests números han estat descartats per diversos motius. Tots els
motius tenen a veure amb el gran marge d’error que es pot observar en comparar una
mostra amb les altres. Per exemple, les mostres P3 i O1 i O2 han estat descartades perquè
el Ct 18s (cicle on ha saltat la fluorescència) o bé el cicle (Ct) de l’Apo A és molt diferent
respecte als altres cicles, és a dir, que ha sortit en un cicle més avançat del que tocava.
Aquesta diferència indica que hi ha hagut algun tipus d’error en la QPCR, causat per la poca
quantitat de CDNA (2 μl) que es va afegir i la possible aparició d’alguna bombolla en la
dissolució que altera els resultats de la mostra i el cicle en el que la fluorescència hauria de
saltar.
• Gen Apo A
Per a la quantificació dels nivells d’Apo A en cada mostra cal restar el cicle Apo i el control
(18s) i així obtenir la diferència. Aquesta diferència la relativitzem restant-li la mitjana de les
mostres tractades amb PCoA (àcid palmític) (Taula 15).
Taula 15: Quantificació del gen de l’Apo A de l’RNA.
Mostra Ct Apo A Ct 18s Resta Ct Apo A i Ct 18s.
Rati - mitjana PCoA
P1 30,3899 10,0339 20,356 -1,050525 P1 30,3207 10,0632 20,2575 -1,149025 P2 32,9187 11,0993 21,8194 0,412875 P2 33,3114 10,1182 23,1932 1,786675 P3 32,0224 16,1944 15,828 -5,578525 P3 33,9011 15,5098 18,3913 -3,015225 O1 31,7699 11,4646 20,3053 -1,101225 O1 34,0244 11,1986 22,8258 1,419275 O2 33,9154 11,1878 22,7276 1,321075 O2 29,6681 12 17,6681 -3,738425 O3 31,1119 12,4398 18,6721 -2,734425 O3 30 11,1842 18,8158 -2,590725 Mitjana PcoA: 21,406525
� 99
Per a poder quantificar el cicle que ens analitza la QPCR, s’utilitza una fórmula establerta
que en aquest cas és la següent: 2^ -(rati-mitjana PCoA) x100. Finalment es fa la mitjana, el
‘’desvest’’ i l’error estàndard de cada grup, és a dir, dels resultats obtinguts pels pouets
tractats amb OCoA i els tractats amb PCoA (Taula 16).
Taula 16: Quantificació del gen de l’Apo A de l’RNA.
Mostra Quantificació del gen
Mitjana Desvest Error estàndard de la mitjana
P1 207,1283455 P1 221,7639716 133,2471871 95,81947507 23,95486877 P2 75,11250407 P2 28,98392735 P3 4778,629464 P3 808,4872375 O1 214,5367795 O1 37,39001616 O2 40,02365981 O2 1334,682793 O3 665,493696 494,1439414 244,1931301 81,39771005 O3 602,4013487
Amb els valors obtinguts en la quantificació del gen de l’Apo A i l’error estàndard, s’elabora
el gràfic (Figura 61) i es comenten els resultats. Tal i com es pot veure al gràfic (Figura 61),
les cèl·lules tractades amb àcid oleic es manifesta més la proteïna Apo A que no pas en les
tractades amb àcid palmític. Això es pot confirmar, gràcies al fet que els gens són
moduladors de les proteïnes, tal i com s’ha explicat prèviament. Per tant, a més quantitat
d’RNAm del gen Apo A (RNA missatger, aquell que codifica els aminoàcids constituents de
les proteïnes), més proteïna Apo A serà transcrita.
Figura 61: Nivells del gen Apo A de l’RNA en el tractament amb àcids grassos.
0
100
200
300
400
500
600
700
OCoA PCoA
Arb
itrar
y U
nits
� 100
• Gen Apo B
Es fan els mateixos càlculs a l’Excel per a poder fer el rati, en aquest cas, del gen Apo B
respecte al 18s. Si s’observa la taula 17, també es poden veure diferents números marcats
en vermell que també van ser descartats per a la quantificació del gen de l’Apo B.
Taula 17: Quantificació del gen de l’Apo B de l’RNA.
Mostra Ct Apo B Ct 18s Resta Ct Apo B i Ct 18s
Rati - mitjana OcoA
P1 21,6373 11,4646 10,1727 -0,1472525 P1 20,2527 11,1986 9,0541 -1,2658525 P2 21,5171 11,1878 10,3293 0,0093475 P2 20,0198 12 8,0198 -2,3001525 P3 20,064 12,4398 7,6242 -2,6957525 P3 19,3651 11,1842 8,1809 -2,1390525 O1 19,98031 10,0339 9,94641 -0,3735425 O1 20,4553 10,0632 10,3921 0,0721475 O2 21,046 11,0993 9,9467 -0,3732525 O2 21,1128 10,1182 10,9946 0,6746475 O3 26,0411 16,1944 9,8467 -0,4732525 O3 26,8968 15,5098 11,387 1,0670475
Mitjana OCoA: 10,3199525
� 101
Per a poder quantificar el cicle que ens analitza la QPCR, s’utilitza la fórmula establerta: 2^ -
(rati-mitjana OCoA)x100. Finalment es fa la mitjana, el ‘’desvest’’ i l’error estàndard de cada
grup (Taula 18).
Taula 18: Quantificació del gen de l’Apo B de l’RNA.
Mostra Quantificació del gen
Mitjana Desvest Error estàndard de la mitjana
P1 110,7458395 P1 240,4692631 P2 99,35417514 270,670172 182,8252973
36,56505946
P2 492,5098233P3 647,891621 P3 440,4726678 O1 129,5530068 O1 95,12210193 104,2126509 32,11003337
8,027508342
O2 129,5269677 O2 62,64852725 O3 138,8235666 O3 47,72947921
Després amb els valors obtinguts en la quantificació del gen de l’Apo B i l’error estàndard
s’elabora el gràfic (Figura 62). Tal i com es pot veure en aquest (Figura 62), a les cèl·lules
tractades amb àcid palmític, la proteïna Apo B es manifestarà més que no pas en les
tractades amb àcid oleic, perquè el nivell del gen Apo B és major en aquelles cèl·lules. Per
tant, a més quantitat d’RNAm del gen Apo B, més proteïna Apo B serà transcrita.
Figura 62: Nivells del gen Apo B de l’RNA en el tractament amb àcids grassos.
0
50
100
150
200
250
300
350
PCoA OCoA
Arb
itrar
y U
nits
� 102
6.4 Tractament amb vi negre i vi blanc
- Pipeta graduada
- Placa de sis pouets
- Xeringa
- Paper de filtre
- Erlenmeyer
En la preparació del medi de cultiu explicat en 6.2 Preparació del medi de cultiu cel·lular , es
van obtenir una gran quantitat de cèl·lules; part d’aquestes van ser utilitzades i sembrades
per al tractament d’àcids grassos. Una altra gran quantitat va ser destinada al tractament
amb vi negre i vi blanc. Per començar a tractar les cèl·lules amb vins ens hem d’assegurar
que les cèl·lules s’han adherit correctament a les plaques i que no estan contaminades. Es
comprova observant-les al microscopi (Figura 63). Les cèl·lules d’una de les plaques ens
serviran per estudiar l’efecte del vi negre i l‘altra la del vi blanc, referent a la producció de les
apolipoproteïnes ApoB100 i ApoA1. Les cèl·lules de tres d’aquests pouets van ser tractades
amb vi negre mentre que les altres tres amb vi blanc.
Figura 63: Microscopi per a l’observació de l’estat de les cèl·lules en el microscopi.
� 103
A continuació, hem esquematitzat en el quadre el tractament que s’ha dut a terme pel que fa
als àcids grassos.
Un dilluns, es van començar a tractar les cèl·lules amb concentracions de 5 μl de vi per
cada mil·lilitre de medi cel·lular mitjançant les pipetes. El vi era prèviament agafat amb una
xeringa i es filtrava per obtenir polifenols i eliminar les possibles bactèries. Els polifenols són
els compostos als quals se’ls atribueix la influència en la modulació de les apolipoproteïnes
que estudiarem.
Aquest tractament dura unes 72 hores de tal manera que es van començar a tractar un
dilluns i el dijous de la mateixa setmana es va procedir a fer el següent pas: l’extracció de
proteïna de les cèl·lules (Figura 64).
Figura 64: Flascó de vidre d’on es van extreure les cèl·lules HepG2 pel tractament.
DIVENDRES DISSABTE DIUMENGE DILLUNS DIMARTS DIMECRES DIJOUS
Es sembren les cèl·lules
Tractament de les cèl·lules amb àcids grassos:
• 5 μl vi negre/ml medi
• 5 μl vi blanc/ml vi blanc
� 104
6.4.1 Pràctica 3: Extracció de proteïnes i Western Blot.
Un cop han passat les 72 hores, les cèl·lules HepG2 hauran produït suficient material (RNA i
proteïna) per a què pugui ser quantificat i poder discutir els resultats i extreure conclusions.
Cal recordar, que aquesta línia cel·lular té una gran activitat metabòlica, és a dir que en
aquestes 72 hores hi haurà alts nivells de tot tipus de substància produïda per les cèl·lules i
fins i tot secrecions cel·lulars com a substàncies de rebuig. Primer de tot es va procedir a
extreure les proteïnes i per una altra banda l’RNA de les cèl·lules. En aquest apartat ens
centrarem únicament en l’extracció de les proteïnes. Aquest procediment ve seguit d’una
sèrie de passos que constitueixen la tècnica del Western Blot, explicat en l’apartat de 6.1
Tècniques de treball on intentarem refutar o confirmar la nostra hipòtesi. És a dir, el benefici
del vi negre en front el vi blanc.
A continuació, s’explica com extreure el material proteic de les cèl·lules.
• Extracció de proteïnes de les cèl·lules
Material
-Bomba de buit
-1ml PBS/ pouet
-2 scrappers –rascadors-, un pels tractats amb vi negre i un pel vi blanc
-500 μl de cèl·lules en PBS
-Centrífuga
-50 μl Buffer RIPA
-12 eppendorfs
-Pipetes graduades
-Cambra freda� sínia de tubs
� 105
Un cop finalitzat el tractament, s’extreu el medi dels sis pouets amb la bomba de buit.
Després s’afegeix 1ml de PBS amb una pipeta a cada pouet per rentar i treure les
substàncies que les cèl·lules hagin pogut secretar (Figura 65).
Figura 65: Rentat dels pouets amb PBS.
A continuació, s’extreu el PBS i amb un ‘’scrapper’’ (una mena de rasclet petit) es rasca la
superfície dels pouets suaument per desenganxar les cèl·lules que es troben adherides. En
aquest cas, no s’afegeix tripsina perquè trencaria totes les proteïnes, incloses les que
m’interessen.
Tot seguit, es torna a afegir 1ml de PBS a cada pouet i es preparen dotze eppendorfs
identificant-los. Sis d’aquests seran utilitzats per a l’extracció de proteïna de les cèl·lules i els
altres sis per a l’extracció d’ARN. De cada pouet s’extreu 1 ml de cèl·lules en medi de PBS,
es pipetegen 500 μl en un eppendorf per a l’extracció de proteïna i 500 μl per a l’extracció
d’ARN per a cadascuna de les mostres obtingudes de cada un dels pouets.
� 106
Per a l’extracció de proteïna, primer de tot es centrifuga 10 minuts, a 4ºC, a 12000 rpm per
obtenir un ‘’sobrenedant’’, que és la part que no queda enganxada al fons sinó que queda
flotant, i un ‘’pellet’’, que és el sediment que s’obté en la centrifugació. En aquesta primera
centrifugació s’obté com a sobrenedant el PBS que permet la seva decantació mitjançant
una pipeta de precisió. Per altra banda, el que queda com a ‘’pellet’’ seran les cèl·lules.
Després s’afegeixen 50 μl de buffer RIPA que permet separar les proteïnes de tota les
cèl·lules i es deixa durant tota la nit, a 4ºC, a la cambra freda.
Al dia següent, es tornen a centrifugar les mostres, a 12000 rpm, durant 10 minuts i
s’obtenen les proteïnes com a sobrenedant
El següent pas és preparar els gels per a l’electroforesi del Western Blot (Figura 66). Un cop
preparat tot el muntatge del Western Blot se li aplicarà una diferència de potencial per a què
comencin a córrer les proteïnes segons la seva massa molecular. Es necessita:
-Un muntatge on correran les proteïnes a l’electroforesi
-Running Buffer: - 30.3 g trizma,
-144 g glicina
-10 g SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)
Posteriorment aquesta solució es dilueix 1:10 en aigua
-Una diferència de potencial (150 V)
Figura 66: Muntatge d’electrofersi de la Western Blot.
� 107
• Preparació de dos gels per a l’electroforesi
Material
3. 10 ml de gel d’acrilamida al 6% �� ApoB
-5,3 ml H20
-2 ml acrilamida
-2,5 ml d’1,5M Tris( pH 8,8)
-0,1 ml SDS (10%)
-0,1 ml APS (10%)
-0,008 ml TEMED
4. 10 ml de gel d’acrilamida al 15% � Apo A
-2,3 ml H2O
-5,0 ml d’acrilamida
-2,5 ml 1,5 M Tris (pH 8,8)
-0,1 ml SDS (10%)
-0,1 ml APS (10%)
-0,004 ml TEMED
�
������2 tubs d’assaig
- 2 suports de vidre pels gels
- 2 mini raspalls especials de plàstic
- 100 μl isopropanol
4. Preparació Stacking (mix que posicionarà les proteïnes en una zona
concreta, a partir de la que es començaran a separar)
-6ml H20
-1,3 ml acrilamida
-2,5 ml Tris
-100 ml SDS (10%)
-50 ml APS (10%) (persulfat amònic)
-10 ml TEMED (etilen diamina)
Resolving: mix que iniciarà
la separació de les
proteïnes.
Resolving: mix que iniciarà
la separació de les
proteïnes.
� 108
A l’hora de preparar els gels s’han de tenir en compte les masses moleculars de les
proteïnes que volem estudiar. El gel d’acrilamida en polimeritzar-se i gelificar-se forma una
sèrie de porus, no visibles, que serveixen per separar les proteïnes. A major contingut
d’acrilamida, els porus seran més petits perquè el gel tindrà més consistència. Per això, en
el cas de l’Apo B, que és una proteïna molt gran d’uns 260 KDa (Kilodaltons), el gel ideal és
el del 6% d’acrilamida. En primer lloc, es prepara el ‘’Resolving’’ afegint tots els components
mitjançant pipetes diferents i s’introdueix en un tub d’assaig. Per altra banda es preparen els
vidres del suport, entremig d’aquestes es vessarà part del ‘’Resolving’’. En una altre tub
d’assaig es prepara el gel per a la separació de l’ApoA1. Aquesta proteïna té una massa
molecular de 31,4KDa i per tant és una proteïna molt petita.
Per aquest motiu utilitzarem un gel en un 15% d’acrilamida que formarà uns porus més
petits i per tant permetrà separar l’ApoA1 i altres proteïnes de baixa massa molecular. A
ambdues plaques cal assenyalar quin gel conté, per saber quina de les proteïnes
identificarem en cadascuna.
El contingut del ‘’Resolving’’ està tabulat per a cada tipus de gel d’acrilamida. Cada
‘’Resolving’’ es vessa entre els vidres del suport corresponent fins a la ratlla verda de dalt, i
després a cadascun d’ells s’hi afegeixen 100 μl d’isopropanol que evita la formació de
bombolles que puguin impedir l’electroforesi, a la correcta separació de les proteïnes. El
contingut que quedi en el tub d’assaig ens servirà per saber si el gel ha polimeritzat o no.
Un cop el gel hagi polimeritzat, es prepara i es vessa el ‘’Stacking’’, que també està tabulat i
és comú per a tots els gels i que posiciona totes les proteïnes des d’un mateix nivell. Abans
d’aplicar-li el voltatge de 150V, cal afegir les proteïnes als forats que s’han deixat lliures
gràcies a l’ús d’uns mini raspalls especials de plàstic, que es fiquen entre els vidres per
assegurar que quedin uns pouets per on poder introduir-hi les diferents mostres de proteïna.
� 109
• Preparació de les proteïnes extretes
-Pipetes de precisió
-10 μl H20
-5 μl mostra de proteïnes de les cèl·lules tractades
-3 μl solució de tampó de càrrega � blau de bromofenol
� beta-mercapto-etanol
-6 Eppendorfs.
-Vortex
-Termoblot
-6 μl per marcador. (3 marcadors necessaris)
-Centrífuga
Al pas previ a aplicar-hi el voltatge, consisteix en la preparació de les proteïnes que s’han
extret i l’afegiment d’un marcador. Per això, s’elabora una plantilla per saber quina mostra
introduir en cada pouet. A més per tal de diferenciar els gels encara més, en el gel
d’acrilamida al 6% es va afegir un sol marcador de 6 μl i en el d’acrilamida al 15% es va
afegir dos marcadors, de 6 μl cadascun.
Aquestes plantilles es realitzen en tots els experiments i també serveixen per a experiments
futurs. La plantilla és la següent:
M T1 T2 T3 B1 B2 B3
M M T1 T2 T3 B1 B2 B3
On (M) fa referència al marcador i T1, T2 i T3 fan referència als tres poeuts tractats amb vi
negre (tinto), dels quals s’han extret les seves proteïnes i s’han introduït en tres eppendorfs
diferents. El B1, B2 i B3 fan referència als altres tres pouets tractats ambvi blanc. En el gel
d’acrilamida 6%, és a dir el que conté un sol marcador, s’identificarà la proteïna ApoB100
mentre que en el del 15% s’identificarà la proteïna ApoA1.
Per altra banda, a les mostres que tenim de proteïna s’afegeixen en sis nous eppendorfs, 10
μl d’aigua i 5 μl de mostra de proteïna mitjançant les pipetes.
� 110
L’últim que s’afegeix és el marcador, uns 6 μl, i 3 μl de tampó de càrrega que conté blau de
bromofenol, que és una molècula colorant molt petita que s’encarrega de donar color a les
proteïnes i que migra per davant de les proteïnes, de manera que es pot fer el seguiment del
moviment de les proteïnes en el gel. El tampó de càrrega també conté beta-mercapto-etanol
que és un agent reductor que serveix per donar càrrega negativa a les proteïnes, cosa que
també fa l’SDS (detergent) del ‘’Running Buffer’’ a més de desnaturalitzar les proteïnes.
Després aquestes mostres s’agiten al ‘’vortex’’ on es tornen homogènies. Tot seguit es
col·loquen al ‘’termoblot’’ a 95ºC durant uns 10 minuts. Per últim, es centrifuguen les
mescles per obtenir tota la mostra conjunta i no dispersa pels eppendorfs.
Abans d’iniciar l’electroforesi s’introdueix cada mostra en el pouet corresponent segons la
plantilla elaborada prèviament i es procedeix a aplicar-hi el Running Buffer. El Running
Buffer és un medi adequat per al moviment de les proteïnes en el gel.
El procés d’electroforesi, i per tant la migració de les proteïnes, triga aproximadament 45
minuts. Per poder reconèixer únicament les proteïnes que ens interessen s’han d’afegir els
anticossos específics. Per poder afegir aquests anticossos i que en siguin efectius, fa falta
traspassar les proteïnes a unes membranes de paper whatman, mitjançant una intensitat
elèctrica, on es podran afegir els primers i segons anticossos.
• Transferència de proteïnes a membranes
Material
-Cubell mitjanament gran i 2 esponges negres
-Buffer de transferència� 14 g Glicina
� 3,05 g Trizma
� 800 ml H20
� 200 ml metanol
� 5,6 ml SDS
- Paper whatman
- Suport foradat (Sandwich): format per una placa negra i una de transparent
- Gels provinents del Western Blot
- Membranes de transferència de proteïnes
- Muntatge de transferència amb intensitat de 400 mA
- Pipeta graduada trencada i els gels
� 111
Primer de tot, es traspassen les proteïnes del gel a unes membranes on, un cop revelades,
s’exposaran les proteïnes en el film auto-radiogràfic. Paral·lelament, es prepara el buffer de
transferència amb les quantitats indicades prèviament i el suport foradat (sandwich) on es
farà la transferència (Figura 67).
Figura 67: Material utilitzat en la transferència de les proteïnes a les membranes.
El ‘’sandwich’’ es fa per tots dos gels. En el suport s’afegeix primer de tot una esponja,
després la membrana de paper whatman i el gel amb les proteïnes (Figura 68). Tot seguit,
es passa per sobre la pipeta trencada, per impedir la formació de bombolles. Finalment, s’hi
diposita damunt l’altra esponja i es tanca el ‘’sandwich’’. S’introdueix al suport de
transferència, que es connecta a una intensitat de 300mA. A més d’estar completament
recobert de gel.
Figura 68: Ordre de construcció del ‘’sandwich’’.
Quan el muntatge porta uns 30 minuts connectat es treu la intensitat de corrent i les
membranes dels ‘’sandwiches’’. Els gels es llencen i les proteïnes queden fixades a les
membranes.
� 112
• Reconeixement de les proteïnes que ens interessen
1. Tractament amb anticossos primaris
- Dues cubetes
- Dues membranes
- Tres tubs de 10 ml
- Solució de bloqueig: llet al 5% en PBS i 0,01% de tween
- Anticossos primaris � 5 μl antiApoB i 5 μl antiApoA de cabra
� 1 μl antitubulina de ratolí.
- Buffer de rentat de les membranes (PBS- Phosphate Buffered Saline- i tween al
0,01%)
-Dos tubs de 10 ml
-5 ml de llet/tub
-Tisores
-Cambra freda� sínia de tubs
Un cop feta la transferència de proteïnes a les dues membranes, les introduïm a dues
cubetes i les incubem en una solució de bloqueig (llet al 5% en PBS i 0,01% tween) durant
1h. La quantitat d’aquesta solució no és del tot important, aproximadament uns 10 ml,
únicament és necessari que la solució cobreixi completament les membranes.
Després del bloqueig, posem l’anticòs primari a la cambra freda (a 4ºC), tota la nit. Per fer-
ho, primer cal treure les membranes de les solucions de bloqueig i tallar-les. Cal tallar les
membranes, sense que s’arruguin, mirant el marcador de masses moleculars de BIO-RAD
segons el de les proteïnes que volem identificar. Aquest marcador ens indica en quina part
de la membrana estan les proteïnes de cada grandària. En aquest cas, la membrana amb
les proteïnes procedents del gel al 15% d’acrilamida es talla aproximadament per la banda
de 37kDa per detectar l’Apo A que fa 31,4kDa i la tubulina que en fa 55 kDa. La membrana
procedent del gel d’acrilamida al 6%, es talla per la franja dels 150 kDa, ja que la proteïna
que volem detectar en aquest cas és l’Apo B i fa 260 kDa. En aquesta membrana també
identifiquem la tubulina, ja que ens permetrà avaluar la quantitat de proteïna, per tant
tallarem la membrana també al voltant dels 50 kDa. Tallar les membranes ens permet
detectar proteïnes diferents alhora si incubem cada tros tallat amb un anticòs concret, sinó
només podriem incubar la membrana amb un únic anticòs.
� 113
Per tant, cada tros de membrana és incubat amb un anticòs encarregat de detectar la
proteïna que ens interessa (Figura 69). La concentració d’anticòs primari depèn de com sigui
l’anticòs (característica comercial) i de quant s’expressa o quina quantitat hi hagi de proteïna
que ens interessi. S’afegeix cada anticòs primari en un tub diferent amb el tros de membrana
per on es trobarà la proteïna que s’haurà d’identificar. En tots tres tubs de 10 ml s’afegeixen
5 ml de llet. En un dels tubs s’afegeixen 10 μl d’antiApo B de cabra, en un altre 5 μl antiApo
A de cabra i en el tercer 1 μl antitubulina de ratolí. Els tres tubs són marcats amb la proteïna
que reconeixeran, per no confondre’ls i s’introdueixen a la sínia de tubs a la cambra freda
tota la nit, perquè així les membranes quedin ben impregnades.
Figura 69: Impregnació de les membranes amb diferents anticossos primaris.
Un altre aspecte a tenir en compte és la necessitat d’anotar totes les quantitats i la
procedència animal dels anticossos per a l’addició de l’anticòs secundari al dia següent.
� 114
2. Tractament amb anticossos secundaris
-2 cubetes
-Solució bloqueig: llet, PBS i tween
-Pipetes graduades
- Buffer de rentat de les membranes (PBS- Phosphate Buffered Saline- i tween al
0,01%)
-Anticossos secundaris �2 μl AntiApoA i 2 μl antiApoB de cabra
�2 μl Antitubulina de ratolí
-1,5 ml de cada revelador (reactiu i substrat)
Al dia següent, es treuen els tubs de la cambra freda i es posen els trossos de membrana en
dues cubetes, identificant les zones tallades, i es fan tres rentats de 15 min cadascun
(Figura 70). El rentat es fa gràcies al buffer de rentat que conté PBS amb tween (detergent)
al 0,01%. Aquesta solució serveix per rentar millor les membranes de tal manera que es treu
només l’anticòs primari, no el que es troba ja fixat a les proteïnes que ha reconegut sinó
aquell sobrant, per tal d’evitar que l’anticòs secundari reconegui una zona on no es troba la
proteïna, i que per tant, no interessa que alteri els resultats.
Figura 70: Rentat de les membranes amb PBS amb tween al 0,01%.
� 115
Després, s’afegeix l’anticòs secundari i es deixa 1h en l’aparell que manté les cubetes en
moviment constant i afavoreix la impregnació total de les membranes amb els anticossos
secundaris. Normalment es posa en concentració 1:5000, per això, com es posen 10 ml
(10000 uL) de llet, hem d’afegir 2 uL d’anticòs secundari.
Després del anticòs secundari es fan tres rentats, també de 15 min cadascun, afegint buffer
de rentat a les cubetes (Figura 71).
Figura 71: Material necessari pels rentats de les membranes.
Per últim, mitjançant les pipetes graduades, s’afegeixen els reveladors junts que contenen
un reactiu i un substrat en la mateixa proporció, 1,5 ml de cadascun, en les dues cubetes:
una té reconeguda l’Apo A i la tubulina i en l’altra cubeta l’Apo B i també la tubulina. Al afegir
els reveladors, es permet la seva reacció d’oxidació que és el que ens permet veure els
resultats de la reacció de la peroxidasa, que es troba unida al anticòs secundari, en els films
auto-radiogràfics, un cop s’ha passat per la reveladora. Així podrem comparar la quantitat de
proteïna a partir de la seva expressió.
� 116
• Revelació Western Blot
-Membranes
-Plàstic per embolicar les membranes
-Cúter
-Màquina reveladora
-Film auto-radiogràfic
-Permanent negre
Un cop afegits tots els components necessaris pel reconeixement de les proteïnes que ens
interessen: Apo B, Apo A i tubulina, s’agafen les membranes i es col·loquen sobre una taula
per ser embolicades amb un plàstic. El tros de plàstic que quedi sobrant es talla amb el
cúter. Per últim, es porta a la màquina reveladora on mitjançant unes plaques es treuen els
plàstics es copien les membranes en el film auto-radiogràfic, es revelen i n’obtenim els
resultats que després hauran de ser quantificats a l’Excel.
Conclusions dels resultats del Western Blot
En aquest cas, apareixien l’Apo A i la tubulina, dues de les tres proteïnes que es buscaven
(Figura 72). Tanmateix, no hi ha havia presència d’Apo B tal i com va ocórrer en l’experiment
amb àcids grassos, per això mateix no es va procedir a reincubar les membranes, ja que
aquest error repetitiu demostrava la inespecificitat de l’anticòs. Per tant, tampoc es va poder
quantificar aquesta proteïna. Un cop hem obtingut l’expressió de les proteïnes que es volen
estudiar, es processen les imatges del Western Blot en un programa anomenat Image J.
�
�
�
Figura 72: Resultats obtinguts en la revelació del Western Blot.
Primer de tot, cal fer el rati de cada mostra, dividint el nivell de proteïna Apo A de cadascuna
entre la tubulina (Taula 19). Després, es va fer la mitjana dels ratis de les mostres tractades
ApoA1
Tubulina
Vi blanc Vi negre
� 117
amb vi blanc, per comparar-lo amb totes les mostres i veure per tant, com augmenta o
disminueix en els pouets de les cèl·lules tractades amb vi negre respecte les tractades amb
el blanc.
Taula 19: Quantificació per Excel del Western Blot.
Apo A Tubulina (Cyp A) Rati Apo A/Cyp A
V.Negre 2175 3652 0,595564074
V.Negre 2325 4080 0,569852941
V.Negre 3403 3315 1,026546003
V.Blanc 2688 5100 0,527058824
V.Blanc 3071 4794 0,640592407
V.Blanc 2190 4557 0,480579329
Mitjana vi blanc: 0,549410186 �
Taula 20: Quantificació per Excel del Western Blot.
�
A partir de la quantificació es fan els gràfics, agafant la mitjana de la quantitat de rati
mostra/mitjana vi blanc dels tres pouets tractats amb vi negre i el dels tractats amb vi blanc
(Taula 20). A més, es fan barres d’error agafant l’error estàndard de la mitjana, que
consisteix en dividir l’error estàndar –desvest- entre el nombre de mostres que es tenen, 3
de cada grup en aquest cas.
�
�
�
�
Mostra Rati mostra/ Mitjana vi blanc
Mitjana Desvest (Desviació respectla mitjana)
Error estàndard de la mitjana.
V.Negre 1,084006615
V.Negre 1,037208899 1,329889044 0,46699544 0,155665147
V.Negre 1,868451617
V.Blanc 0,959317856
V.Blanc 1,165964229 1,000000339 0,149824077 0,049941359
V.Blanc 0,874718932
� 118
En aquest gràfic tampoc hi ha unitats, perquè s’està fent un rati de quantitat de proteïna
entre la tubulina i utilitzem unitats arbitràries o bé proteïna estudiada/ CypA (Figura 73). Es
pot observar que efectivament en els pouets tractats amb vi negre, el nivell de proteïna és
superior als tractats amb vi blanc.
�
�
�
Figura 73: Gràfic comparatiu del nivell de proteïna Apo A en l’estudi dels vins.
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
0 0,2 0,4 0,6 0,8
1 1,2 1,4 1,6
Apo
A /C
ypA
Vi negre Vi blanc
� 119
6.4.2 Pràctica 4: Extracció d’ARN i PCR en ‘’real time’’
En realitzar el tractament de les cèl·lules amb vins es menciona la necessitat d’extreure les
seves proteïnes, fet que permet la quantificació de l’Apo B i l’Apo A i per tant, la certesa de
la nostra hipòtesi. Tanmateix, la tècnica del Western Blot no és l’única que pot ser utilitzada
per provar aquest tipus d’hipòtesi. Un altre dels mètodes molt emprats en investigació i que
desenvolupàrem és: la PCR -polimerase chain reaction- en ‘’real time’’ –en temps real-,
explicada anteriorment en el tractament amb àcids grassos.
Aquesta tècnica i els resultats que obtinguem no deixen de ser una manera més de
demostrar que efectivament les proteïnes que buscàvem per comparar (Apo A i Apo B
respecte la tubulina) segons el tractament. Per tant, els gens que s’estudiaran seran: el de
l’Apo B i el de l’Apo A respecte el gen del 18s, el gen control.
Per fer la PCR en ‘’real time’’, primer de tot necessitem fer la retrotranscripció per passar
d’RNA a CDNA, és a dir una còpia de material genètic que podrà ser amplificat.
• Extracció d’RNA de les cèl·lules
Material
-Bomba de buit
-1ml PBS/ pouet
-Scrapper (rascador)
-500 μl de cèl·lules
-30-50 μl d’aigua
-200 μl de cloroform
-500 μl d’isopropanol
-650 μl d’etanol
-1 ml de Trizol/eppendorf
-Centrífuga
-Termoblock
-Vortex
-12 eppendorfs.
-Pipetes de precisió
� 120
Un cop finalitzat el tractament d’àcids grassos, s’extreu el medi dels sis pouets amb la
bomba de buit. Després s’afegeix 1ml PBS amb una pipeta a cada pouet per rentar i treure
les substàncies que les cèl·lules hagin pogut secretar.
En aquest apartat ens centrarem únicament en l’extracció d’RNA que segueix el mateix
procediment que l’extracció de proteïnes prèviament explicada. S’extreu el PBS i amb un
‘’scrapper’’ es rasca la superfície dels pouets per desenganxar les cèl·lules que es troben
adherides. Tot seguit, es torna a afegir 1ml de PBS per pouet. De cada pouet s’extreu 1 ml
de cèl·lules en medi de PBS i es pipetegen 500 μl per a l’extracció d’ARN per a cada una de
les mostres obtingudes de cada un dels pouets.
Per a aquests 500 μl de cèl·lules es preparen 12 eppendorfs enumerats, a sis dels quals s’hi
afegirà 200 μl de cloroform i els altres 6, 500 μl d’isopropanol. A cada eppendorf es pipeteja
la mateixa quantitat de cèl·lules. Es centrifuguen els eppendorfs durant 10 minuts i ens
quedem amb el pellet, és a dir amb les cèl·lules ja separades del PBS. Com el que es vol
extreure és RNA ara no s’afegeix Buffer RIPA sinó que afegim 1ml de TRIZOL en cada
eppendorf i 30-50 μl d’aigua destil·lada.
Els eppendorfs es col·loquen en el vortex, perquè el pellet (concentració cel·lular) es dilueixi
amb el TRIZOL. Després se centrifuga durant 5 minuts per separar el pellet i el sobrenedant,
que ara serà l’RNA amb el TRIZOL.
El sobrenedant (RNA + TRIZOL) que obtenim a cadascun dels 6 eppendorfs centrifugats
l’afegim als 6 eppendorfs que presenten cloroform i ho deixem 5 minuts a temperatura
ambiental per assegurar que tot es mescli. Aquesta tècnica requereix molta atenció i cura a
l’hora de fer correspondre el material de cada pouet a un eppendorf i fer-ho de manera
constant en tot el procés. Per això és tan important enumerar tots els eppendorfs. Els
nostres eppendorfs estaven enumerats segons el tractament (T-tinto (negre)- o B-blanc-) i el
número de pouet o prova (1, 2 o 3). Per tant T1, T2, T3, B1, B2, B3, en total 6 eppendorfs.
Un cop passat els 5 minuts, se centrifuga durant 10 minuts, a 12000 rpm, i es deixa 10
minuts més a temperatura ambient per separar en dues fases el material que tenim; una
fase (rosada i inferior) que contindrà el TRIZOL i les impureses de la mostra, com proteïnes,
membranes lipídiques etc, i la superior (aquosa, transparent i incolora) on es trobaran els
àcids nucleics, constituents de l’RNA.
� 121
Després, es transfereix tota la fase aquosa als eppendorfs que contenen isopropanol i on
també s’hi ha afegit 1 ml de TRIZOL en cadascun, per evitar que en aquests passos es
degradi l’RNA. Això, es torna a deixar 10 minuts a temperatura ambient i a centrifugar uns
10 minuts a 12000 rpm i es llença el sobrenedant on quedarà l’isopropanol. L’RNA purificat
haurà precipitat i es trobarà al fons dels eppendorfs. Per últim, s’afegeixen 650 μl d’etanol
per rentar les mostres, es mescles i s’homogeïnitzen al ‘vortex’ i es centrifuguen 10 min més.
Després, els eppendorfs s’afegeixen al termoblock i en aquest cas els posem a 50ºC per
evaporar l’etanol.
• Quantificació de RNA
Per a poder fer la PCR en ‘’real time’’ cal saber quina quantitat d’RNA tinc per poder
preparar les quantitats correctes per obtenir els mixts a partir de les proporcions tabulades
per un sol gen. Per això, cal preparar les mostres i portar-ho al nanodrop, una màquina que
permet quantificar l’RNA a partir d’un ‘’blanc’’ o control que ve a ser la resta de l’RNA menys
l’aigua destil·lada, afegida al principi. És molt important arribar a obtenir un RNA amb pures
màxima per assegurar que no hi haurà cap alteració a l’hora que el nanodrop quantifiqui el
material genètic que tenim.
Material
- Mixt de cada eppendorf: - 1,5 ml H2O destil·lada
- 2 μl RNA out (inhibidor RNAses)
- Nanodrop - Eppendorfs de diferents mides: un gran i altres petits
- Els 6 eppendorfs amb RNA purificat
- 6 nous eppendorfs
- Pipetes de precisió
En un eppendorf preparem el mixt afegint 1,5 ml d’aigua destil·lada i 2 μl d’RNAout (inhibidor
d’RNAses). Afegim a cada nou eppendorf 2 μl de dissolució de RNA purificat i 20 μl de mixt
en cadascun. Això es porta al nanodrop i es quantifica el total de nanograms (ng) d’RNA per
cada μl de dissolució.
� 122
De la quantificació de tots els eppendorfs, es van obtenir els resultats recollits a la taula 21,
afegint com a primera mostra 2 μl de ‘’blanc’’. Així, només quantificarà el material genètic
sense l’aigua.
Taula 21: Quantificació d’RNA en el nanodrop.
MOSTRA ID ng/ μl T1 329,13 T2 101,02 T3 121,85 B1 57,30 B2 40,77 B3 329,13
Un cop obtinguda la quantificació de l’RNA de cada mostra, podrem calcular la quantitat
d’aigua destil·lada, de mostra d’RNA i d’oligo dt (‘’primer’’ que permet l’inici de la
retrotranscripció). Tot i així, la quantitat òptima que hem de tenir d’RNA per ser transcrit i
quantificat, per a aquest tractament, en la PCR són 0.6 μg, és a dir 600 ng d’RNA. A
continuació es fan els càlculs per a preparar els eppendorfs amb les substàncies
necessàries per a realitzar la retrotranscripció, pas d’RNA a CDNA.
• Retrotranscripció (d’RNA a CDNA)
- Mixt 1:
- Aigua
- Oligo dt
- RNA
- Mixt 2 /mostra:
- 1 μl NTP’s (nucloside triphosphate –nucleòtids, esquelet dels àcids nucleics-)
- 2 μl DTT (Dithiothreitol –agent reductor- )
- 4 μl FSB (buffer –medi amb cofactors necessaris per a la reacció-)
- Termociclador (màquina de PCRs)
- Enzim retrotranscriptasa
- Mini eppendorfs.
El càlcul necessari per assegurar-nos que les quantitats dels nous mixts que farem són
proporcionals segons el material que tenim, consisteix en factors de conversió. En cadascun
dels casos (T1, B1...) es fa el mateix procés. Per exemple en el cas del T1, tenim 329,13 ng/
μl i es volen obtenir 600 ng, per tant per saber quan μl de l’RNA d’aquesta mostra
necessitaré per fer la retrotranscripció.
� 123
Si es fa la divisió de 329,13 ng/ 600 ng s’obtenen 1,82 μl d’RNA necessaris. Tanmateix, la
mostra B2 com conté baixa quantitat d’RNA es prepara tenint en compte que es necessiten
400 ng/ μl és a dir, 0,4 mg/ μl. Els càlculs són els mateixos.
A més, el mixt haurà de contenir aigua destil·lada i 1 μl d’oligo dt tabulat, ‘’primer’’ que
permetrà l’inici de la retrotranscripció de l’enzim retrotranscriptasa. Per això, cada mostra es
prepara sobre 12 μl totals. Seguim amb el cas T1: Si restem 12 μl menys 1 μl obligatori
d’oligo dt menys la quantitat d’RNA que hi afegirem, obtenim 9,18 μl d’aigua destil·lada que
és el volum que haurem d’afegir en aquest eppendorf. Per a cadascuna de les mostres
d’RNA es fan els mateixos càlculs metòdics (Taula 22).
Taula 22: Càlculs de mixt d’RNA dissolució amb oligo dt.
MOSTRA (μl) RNA (μl) AIGUA
DESTIL·LADA (μl)
OLIGO DT (μl)
T1 1,82 9,18 1
T2 5,93 5,07 1
T3 4,92 6,08 1
B1 10,47 0,53 1
B2 9,81 1,19 1
B3 4,76 6,24 1
Per últim, s’afegeixen els volums dels mixts calculats a cadascun dels nous sis eppendorfs
mitjançant pipetes.
Un cop tenim els eppendorfs llestos els introduïm al termociclador (màquina de PCRs)
durant 5 minuts per a desnaturalitzar a 65ºC les estructures majors dels RNAs.
Després, preparem els segons mixts i afegim a cada eppendorf, 1 μl de NTP’s, 2 μl de DTT i
4 μl FBS i s’introdueix al termociclador durant 3 minuts aproximadament.
A continuació, a cadascun dels eppendorfs s’afegeix 1 μl de l’enzim retrotranscriptasa
inversa i es torna a col·locar al termociclador. Aquest procés durarà 1 hora i 10 min.
aproximadament. Obtindrem la CDNA, és a dir l’RNA transcrit a DNA.
� 124
• Amplificació de CDNA i QPCR
Material
- Mixt d’amplificació per a un gen:
- 1 μl up (forward)
- 1 μl low (reverse)
- 8 μl aigua destil·lada
- 12,5 μl SYBR green
- Suport amb pouets.
- 4 eppendorf grans
- Eppendorfs
- 90 μl TE buffer
- 10 μl ’’primer’’
- 15 μl dissolució de CDNA ( 10 μl de CDNA i 5 μl d’aigua destil·lada)
- Pipetes de precisió
Per a la PCR necessitem preparar uns altres mixts que s’afegiran per a cada eppendorf i
una taula (Taula 23) on es representin tots els pouets per evitar equivocacions a l’hora
d’afegir els diferents CDNA corresponents a cada mostra (T1, B1...) .
Taula 23: Plantilla per QPCR del tractament amb vins.
Mostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Gen
A T1 T1 T2 T2 T3 T3 B1 B1 B2 B2 B3 B3 Apo A
B T1 T1 T2 T2 T3 T3 B1 B1 B1 B1 B1 B1 Apo B
C T1 T1 T2 T2 T3 T3 B1 B1 B2 B2 B3 B3 18s
‘’Primer’’
� 125
Cal recordar que s’estudien tres gens: el gen de l’Apo A, el gen de l’Apo B i el gen 18s
(control). Per tant, per a la Real Time dupliquem el nombre de pouets que necessitem (3)x2 i
així obtenir rèpliques de cada mostra per si hi ha algun error.
Després es tornen a fer una sèrie de càlculs a partir dels pouets que hem d’omplir per a
cada gen. Preparem les proporcions del mixt per a 14 pouets, dos de més per assegurar que
no hi manqui mixt. Tenint en compte les següents dades, que indiquen el volum que hem
d’afegir a cadascun dels pouets, es multipliquen per 14 pouets, per calcular el total de cada
substància per a cada un dels tres gens estudiats:
1 μl up
1 μl low
8 μl H2O destil·lada
12,5 μl SYBR green
L’up i el low fan referència al ‘’primer’’ específic de cada gen. De cada cadena de RNA, un
dels components del ‘’primer’’ amplificarà el gen que interessa d’esquerra a dreta (towards),
l’altre a l’inrevés (reverse) i el SYBR green.
L’últim que queda per preparar són els eppendorfs amb la dissolució de CDNA i aigua
destil·lada. A cada eppendorf li fem correspondre una de les mostres de CDNA (T1, B1...) i
s’hi afageixen 90 μl de TE buffer i 10 μl de ‘’primer’’. Aquest ‘’primer’’ són oligonucleòtids
complementaris i necessaris per a l’amplificació de la CDNA i es troba en stock. Preparant
aquesta solució, diluïm el primer que està en ‘’stock’’ i la CDNA per amplificar-la. Després
cada mostra diluïda l’afegim, fent correspondre cada mostra amb un eppendorf concret. S’hi
afegeixen 10 μl de CDNA de la mostra corresponent i 5 μl d’aigua destil·lada. Finalment, s’hi
afegeixen 2 μl a cada pouet corresponent a cada mostra.
És molt important seguir la plantilla elaborada anteriorment (Taula 23) per afegir la CDNA de
cada mostra en el seu pouet corresponent (T1... B1....), independentment del gen que es
vulgui identificar. Per exemple, en el cas de la CDNA extreta de la primera placa de les
cèl·lules tractades amb vi blanc (B1), s’hi afegeix 2 μl a cada pouet on s’hagi marcat B1, per
tant com es volen identificar 3 gens diferents, hi haurà tres pouets que contindran la CDNA
del B1. A més, com s’han fet rèpliques hi hauran 3x2= 6 pouets amb CDNA del B1. Aquest
procediment s’aplica a totes les mostres que hi hagin.
14 μl up
14 μl down
112 μl H2O destil·lada
175 μl SYBR green
� 126
Els pouets, que seran portats a les UCTS (Unitat de Suport Cientificotècnic) per a la PCR
quantitativa (QPCR), a més de CDNA també han de contenir el mixt format per SYBR green,
‘’primer’’ up i low i aigua destil·lada. A diferència de l’anterior dissolució de CDNA, aquesta
solució depèn de cada gen i és independent de la mostra. És a dir, a cada pouet on es
vulgui identificar un gen concret, per exemple el de l’Apo A, s’hi afegirà el mateix volum de
mix de SYBR green, low, up i aigua destil·lada, preparat anteriorment en 3 eppendorfs, un
per a cada gen identificat, i segons els valors calculats prèviament per a 14 pouets.
Finalment, s’afegeix l’Adhesive Optical Cover i el suport amb els pouets es recobreix amb
paper d’alumini, per evitar que la dissolució de substàncies no s’evapori en realitzar la
QPCR i es porta a la UCTS (Unitat Cientificotècnic de Suport de la Vall d’Hebron) per a què
la realitzin.
Anotació: Cal tenir molt en compte que totes les dissolucions i mixts es fan suposant
més quantitat de la necessària per evitar la manca de substància en algun dels
procediments que es duen a terme.
� 127
Resultats QPCR Un cop rebuts els resultats de les UCTs es fan una sèrie de càlculs a l’Excel per a poder fer
el rati dels dos gens (Apo A i Apo B) que ens interessen respecte al 18s. Si s’observa la
taula 24, es pot veure que hi falta una de les rèpliques del V.Negre 1, que ha estat
descartada. El seu cicle sortia a uns 35,569875 i per tant era molt diferent dels cicles de les
altres mostres que es veuen recollits a la taula 24.
• Gen Apo A
Per a la quantificació dels nivells d’Apo A en cada mostra cal restar el cicle Apo A i el control
(18s) i així obtenir la diferència. Aquesta diferència la relativitzem restant-li la mitjana de les
mostres tractades amb vi blanc (Taula 24).
Taula 24: Quantificació del gen de l’Apo A de l’RNA.
Mostra Ct ApoA1 Ct 18S Ct Apo A –Ct 18S
Rati - mitjana vi blanc
V.Negre 1 32,5911 15,8365 16,7546 -1,4847167 V.Negre 2 33,4405 15,1351 18,3054 0,0660833 V.Negre 2 32,7727 15,2454 17,5273 -0,7120167 V.Negre 3 32,2771 16,618 15,6591 -2,5802167 V.Negre 3 32,4558 16,6763 15,7795 -2,4598167 V.Blanc 1 31,2339 12,7527 18,4812 0,2418833 V.Blanc 1 31,4223 13,6527 17,7696 -0,4697167 V.Blanc 2 31,5793 14,0329 17,5464 -0,6929167 V.Blanc 2 31,9125 14,1544 17,7581 -0,4812167 V.Blanc 3 34,1613 15,0387 19,1226 0,8832833 V.Blanc 3 34,2106 15,4526 18,758 0,5186833
Mitjana vi blanc: 18,23931667
� 128
Per poder quantificar el cicle que ens analitza la QPCR, s’utilitza una fórmula establerta que
en aquest cas és la següent: 2^ -(rati-mitjana vi blanc) x100. Finalment es fa la mitjana, el
‘’desvest’’ i l’error estàndard de cada grup, és a dir, dels resultats obtinguts pels pouets
tractats amb vi negre i els tractats amb vi blanc (Taula 25).
Taula 25: Quantificació del gen de l’Apo A del RNA.
Amb els valors obtinguts en la quantificació del gen de l’Apo A i l’error estàndard, s’elabora
el gràfic (Figura 74) i es comenten els resultats. Tal i com es pot veure al gràfic (Figura 74),
en les cèl·lules tractades amb vi negre la proteïna Apo A es manifesta més que no pas en
les tractades amb vi blanc. Recordem que, a més quantitat d’RNAm del gen Apo A (RNA
missatger, aquell que codifica els aminoàcids constituents de les proteïnes), més proteïna
Apo A serà transcrita.
Figura 74: Nivells del gen Apo A de l’RNA en el tractament amb vins.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
vi negre vi blanc
Arb
itrar
y U
nits
Mostra Quantificació del gen
Mitjana Desvest Error estàndard de la mitjana
V.Negre 1 279,8622116 V.Negre 2 95,52277807 V.Negre 2 163,8092357 337,4741139 226,4607424 45,29214849 V.Negre 3 598,0295197 V.Negre 3 550,1468245 V.Blanc 1 84,56406887 V.Blanc 1 138,4837503 V.Blanc 2 161,6548397 V.Blanc 2 139,5920423 108,051464 44,0626296 7,343771599 V.Blanc 3 54,21322362 V.Blanc 3 69,80085919
� 129
• Gen Apo B
Es fan els mateixos càlculs a l’Excel per a poder fer el rati, en aquest cas, del gen Apo B
respecte al 18s (Taula 26).
Taula 26: Quantificació del gen de l’Apo B de l’RNA.
Mostra Ct Apo B Ct 18s Resta Ct Apo B i Ct 18s
Rati - mitjana vi negre
V.Negre 1 24,4784 16,755 7,7234 -0,81706667 V.Negre 2 26,0588 15,8365 10,2223 1,68183333 V.Negre 2 23,5859 15,1351 8,4508 -0,08966667 V.Negre 3 24,0135 15,2454 8,7681 0,22763333 V.Negre 3 24,4632 16,618 7,8452 -0,69526667 V.Blanc 1 24,9093 16,6763 8,233 -0,30746667 V.Blanc 1 21,0934 12,7527 8,3407 -0,19976667 V.Blanc 2 22,9485 13,6527 9,2958 0,75533333 V.Blanc 2 21,3847 14,0329 7,3518 -1,18866667 V.Blanc 3 22,3342 14,1544 8,1798 -0,36066667 V.Blanc 3 24 15,0387 8,9613 0,42083333 V.Negre 1 24,5405 15,4526 9,0879 0,54743333
Mitjana vi negre: 8,540466667
Per a poder quantificar el cicle que ens analitza la QPCR, s’utilitza la fórmula establerta: 2^ -
(rati-mitjana vi negre) x100. Finalment es fa la mitjana, el ‘’desvest’’ i l’error estàndard de
cada grup (Taula 27).
Taula 27: Quantificació del gen de l’Apo B de l’RNA.
Mostra Quantificació del gen
Mitjana Desvest Error estàndard de la mitjana
V.Negre 1 176,1820164 V.Negre 2 31,16863046 V.Negre 2 106,4124292 114,1396987 52,90397117 8,817328528 V.Negre 3 85,40347451 V.Negre 3 161,9183698 V.Blanc 1 123,753272 V.Blanc 1 114,8512589 V.Blanc 2 59,24094954 V.Blanc 2 227,9419832 112,25984 62,91748518 10,48624753 V.Blanc 3 128,4019106 V.Blanc 3 74,69930213 V.Negre 1 68,42363574
� 130
Després, amb els valors obtinguts en la quantificació del gen de l’Apo B i l’error estàndard,
s’elabora el gràfic (Figura 75). Tal i com es pot veure al gràfic (Figura 75), les cèl·lules
tractades amb vi negre o vi blanc manifesten una quantitat de proteïna Apo B pràcticament
idèntica. En aquest cas, la meva hipòtesi es veu refutada. (Consultar 7. Conclusions).
Figura 75: Nivells del gen Apo B de l’RNA en el tractament amb vins.
0
20
40
60
80
100
120
140
vi negre vi blanc
Arb
itrar
y U
nits
� 131
6.4.3 Pràctica 5: Tinció de cèl·lules HepG2.
Material
- Mostra de cèl·lules congelades amb DMSO
- Dissolució d’aigua destil·lada amb oil-red (tint vermell) a 1:2
- 1 ml de medi en PBS en cada pouet
-PFA al 4%
- Pipetes graduades
- Placa de sis pouets
- DAPI
En dur a terme el tractament amb vi negre i vi blanc, part de la solució de cèl·lules que no
es van tractar sinó que simplement es van deixar reproduir en el flascó, van ser congelades i
utilitzades per a la tinció amb oil-red. L’oil-red, un tint vermell, va ser utilitzat per examinar la
presència de lípids en el microscopi, presents a les cèl·lules i comparar la seva expressió
segons el tipus de vi subministrat, a partir d’un control. El grup control consisteix en aquell
pouet on només s’afegeix solució cel·lular. Això és necessari, ja que a les cèl·lules
hepàtiques es produeixen boles lipídiques en qualsevol condició. Tot i així, el que
s’observarà és com incrementa o disminueix la quantitat de secrecions lipídiques en
presència d’alcohol i també en quin cas augmenta o disminueix més, en el tractament amb vi
negre o en el de blanc.
Els passos que calen seguir són els següents:
1. Es descongelen les cèl·lules en fregar l’eppendorf amb les mans. La
solució on es troben les cèl·lules conté DMSO (dimetil sulfòxid), un
dissolvent orgànic utilitzat per evitar el trencament de les membranes, un
cop congelades, a causa dels cristalls que es formen.
2. Es sembren les cèl·lules i s’afegeix PFA (polioximetilè) al 4%, a 4ºC, i es
deixa actuar durant 10 minuts, aquest procediment permetrà la fixació de
les cèl·lules congelades a la superfície de la placa.
3. Es tracten les cèl·lules amb 10 μl de vi negre i vi blanc en 2 ml de medi
que hi ha a 3 pouets durant cinc dies. A un dels pouets no se li
subministrarà res, serà el control.
4. El cinquè dia s’extreu el medi amb bomba de buit i s’introdueix 1 ml de
medi en PBS a cada pouet i després s’extreu.
� 132
5. Es renten els pouets amb PBS, dos cops durant 10 minuts cadascun i es
prepara la dissolució d’oil-red, agafant 5 ml d’oil-red i 10 ml de solució
aquosa, obtenint una solució de concentració 1:2.
6. S’afegeix 1 ml d’oil-red en dissolució aquosa i es deixa actuar uns 10-20
minuts. (Figura 76).
Figura 76: Placa que conté la solució d’oil-red, en moviment.
7. Es fan dos rentats més en PBS, de 10 minuts cadascun. (Figura 77)
8. S’afegeix DAPI (colorant nuclear adequat pel recompte cel·lular) amb la
pipeta, i es deixa actuar uns 10 minuts.
Figura 77: Introducció de PBS en el medi.
9. Es tornen a fer dos rentats en PBS, de 10 minuts cadascun.
10. Les cèl·lules ja estan preparades per ser observades en els microscòpics.
� 133
6.4.4 Pràctica 6: Microscòpia de les cèl·lules HepG2
L’objectiu principal de la tinció amb oil-red és l’observació de les vesícules lipídiques a punt
de ser secretades al medi. Amb aquesta tècnica es van poder observar diferències
qualitatives entre el pouet de cèl·lules tractat amb vi negre i el tractat amb vi blanc. Les
diferències s’analitzen prenent com a control el pouet de cèl·lules tractat únicament amb
PBS. El PBS, com ja s’ha explicat, és un buffer que només conté les substàncies perquè les
cèl·lules es mantinguin en un medi estable de pH i evitar gradients dels líquids intracel·lulars
que puguin degenerar-les.
Material
- Placa de sis pouets
- Microscopi Nikon
- Programa informàtic: DP controller
�
De cadascun dels tres pouets que van ser tractats de la placa de sis, s’hi van fer diverses
fotografies, dividint l’espai en quatre quadrants per obtenir diferents perspectives dels
pouets. Es van fer fotografies amb potència x10, x20 i x40 amb el microscopi Nikon (Figura
78).
Figura 78: Observació i fotografies de cèl·lules mitjançant el programa DP controller.
Per altra banda, a l’inici d’aquesta pràctica es proposava quantificar de forma aproximada el
número de secrecions lipídiques per poder confirmar rigorosament que efectivament aquest
número varia segons el tractament subministrat.
� 134
Tanmateix, no va ser possible la seva quantificació a causa de l’absència d’un mètode o
suport acurat que permetés la seva quantificació automàtica. De fet, l’únic que es podria
haver fet és la seva quantificació manual, intentada inicialment sense èxit.
Per això, al final es va decidir fer un balanç qualitatiu, ja que tampoc eren uns resultats
significatius i influenciables per a respondre la pregunta plantejada en el treball. Observem
les fotografies dels 4 quadrants de cada pouet subministrat amb un tractament diferent
(Figures 79, 80 i 81).
Pouet 1: Tractament amb vi negre
Figura 79: Fotografies x10 del pouet tractat amb vi negre.
� 135
Pouet 2: Tractament amb vi blanc
Figura 80: Fotografies x10 de les cèl·lules tractades amb vi blanc.
Pouet 3: Control amb PBS
Figura 81: Fotografies x10 de les cèl·lules control, subministrades amb PBS.
� 136
Per poder observar millor les secrecions lipídiques, marcades amb color vermell aportat per
el tint oil-red, es van fer fotografies x20 (Figures 82, 83 i 84)
Figura 82: Fotografia x20 pouet 1.
Figura 83: Fotografia x20 pouet 2.
VI NEGRE
VI BLANC
� 137
Figura 84: Fotografia x20 pouet 3.
I per últim, es van fer fotografies amb un augment de x40, per a observar amb més exactitud
la grandària de les vesícules o ‘’gotes’’ lipídiques (Figures 86, 87 i 88).
Figura 85: Fotografia x40 del pouet 1.
CONTROL
VI NEGRE
� 138
Figura 86: Fotografia x40 del pouet 2.
Figura 87: Fotografia x40 del pouet 3.
CONTROL
VI BLANC
� 139
Resultats qualitatius
La presència de secrecions lipídiques es produeix a totes les cèl·lules, independentment del
tractament subministrat, com s’havia predit anteriorment.
Tot i així, s’observen petites diferències entre els pouets subministrats amb alcohol i el pouet
control. Si s’observen les fotografies x10 (Figures 79,80 i 81), es pot contrastar que hi ha
més zones acolorides amb vermell en els pouets amb cèl·lules a les que se’ls ha
subministrat vi blanc o vi negre que no pas en les del control. Per tant, això podria mostrar,
hipotèticament, que en presència de substàncies alcohòliques les cèl·lules hepàtiques
augmenten el seu metabolisme i per tant contribueixen a l’aparició de l’anomenat ‘’fetge
gras’’.
Per altra banda, si s’observen les fotografies x40 (Figures 85 i 86) es detecta que en les
cèl·lules tractades amb vi blanc hi ha presència de secrecions lipídiques majors en número i
grandària que no pas en les cèl·lules tractades amb vi negre, tot i que també hi apareixen en
gran quantitat. Tanmateix, si s’observa l’última fotografia x40 (Figura 87), s’observa que,
efectivament, en el control les cèl·lules hepàtiques es fabriquen secrecions lipídiques però
no s’hi troben tan concentrades i la seva grandària és clarament diferent i menor que en els
altres pouets. Això vol dir que l'acumulació de material gras en els hepatòcits o cèl·lules
hepàtiques, augmenta més en el pouet tractat amb vi blanc que en el pouet tractat amb vi
negre. En aquest possible resultat ens trobem amb una hipotètica evidència més del vi
negre com a substància beneficiosa. Tot i així, en aquest cas segueix sent alcohol i per tant,
en excés té una sèrie de conseqüències com per exemple la seva contribució en la
inflamació del fetge causada pel fetge gras. De fet, l’alcohol intervé afavorint la sobre-
aparició de secrecions de greix en les cèl·lules hepàtiques.
El fetge gras -tècnicament denominat esteatosi hepàtica-, segons Vicente Carreño, president
de la Fundació per a l’Estudi de les Hepatitis Virals (FEHV),’’consisteix en dipòsits de greix a
les cèl·lules hepàtiques i pot cursar amb o sense inflamació’’. Aquesta malaltia comença
amb l’acumulació excessiva, doncs cal recordar que la presència de greix és inevitable i en
part necessària, a les cèl·lules del fetge. Aquesta malaltia apareix a causa d’una deficiència
de l’organisme per processar el sucre en sang i pot conduir a la cirrosi (dany en el teixit del
fetge). D’aquesta forma, augmenta la producció d’insulina i la quantitat de greix.
� 140
7. CONCLUSIONS En un inici, com tot treball d’aquestes característiques, és indispensable el plantejament de
moltes preguntes a les que en principi, no tenim resposta. Respostes que fan sorgir
inquietuds sobre diversos temes que ens interessen, que ens apassionen o que simplement
ens atrauen. Considero que el més important per poder tenir èxit en aquest tipus de tasques,
és que ens agradi el treball que realitzarem, que de veritat ens faci sentir que aprendrem
alguna cosa nova i que ens permeti sentir-nos realitzats un cop el treball estigui enllestit.
No només puc afirmar que he après coneixements i mètodes científics que em serviran per a
un futur, sinó que també em sento satisfeta per tota la feina feta. Ha estat un repte personal i
que sens dubte ho recordo i ho recordaré com a una experiència única. No ha estat un
treball fàcil, però n’estic molt orgullosa i considero que ha valgut molt la pena malgrat que
tots els resultats no han estat els esperats. Per aquest motiu, vull agrair l’ajuda rebuda per
part de la meva tutora del treball de recerca, Isabel Clavero Martí, la investigadora Cristina
Saez López, la meva supervisora al Centre d’Investigació de la Vall d’Hebron (VHIR) i la
Dra. Cristina Hernández Pascual.
Cal destacar, que no es van poder fer un gran nombre de repeticions de les pràctiques degut
a l’escàs temps disponible, a la llarga durada de cadascuna d’elles i a una primera
contaminació del medi de cultiu de les cèl·lules. Tot i així, he pogut demostrar que els àcids
grassos monoinsaturats (MUFA), i en concret l’àcid oleic, exerceixen una funció protectora
pel que fa a les malalties cardiovasculars. Aquest fet es veu confirmat gràcies als resultats
favorables que s’han obtingut en la part experimental. La meva hipòtesi respecte al
tractament de les cèl·lules ha estat aprovada. En el tractament amb àcid oleic, com a
representant dels MUFAs (àcids grassos monoinsaturats), s’ha obtingut un augment de l’Apo
A i per tant de ‘’colesterol bo’’ i una disminució de l’Apo B i per tant de ‘’colesterol dolent’’,
resultat que confirma experimentalment un dels meus objectius: la importància d’una bona
alimentació rica en greixos vegetals, a causa de la seva prevenció a patir malalties
cardiovasculars. Per tant, aquest fet permet afirmar la distinció de la dieta mediterrània, rica
en greixos vegetals insaturats, com a una de les dietes més saludables del món pel seu alt
contingut en aliments cardioprotectors.
Això implica la demostració experimental de la meva hipòtesi, és a dir, s’ha demostrat
l’efecte beneficiós dels MUFAs i en concret de l’àcid oleic i l’efecte perjudicial dels SFA
(àcids grassos saturats) en el cas de l’àcid palmític en l’organisme humà.
� 141
Això es deu al seu paper en la modulació de les apolipoproteïnes situades a l’estructura de
les lipoproteïnes HDL i LDL, encarregades del transport de colesterol. Tenint la certesa
d’aquesta hipòtesi, altres experiments interessants serien els estudis d’altres proteïnes i
gens participants en el metabolisme del colesterol com ara l’Apo E.
Com que la seva funció és modular el metabolisme i actuar com a lligam del receptor de LDL
i així permetre la seva captació i posterior catabolisme, es podria comparar la seva
quantificació en un tractament amb àcids grassos saturats i un altre amb àcids grassos
insaturats. A més, tots aquests experiments també es podrien realitzar prenent, com a
variable independent, àcids grassos monoinsaturats i poliinsaturats, per observar les
diferències i comparar-les per extreure’n resultats i conclusions de com repercutirien en el
nostre organisme.
Per altra banda, s’han pogut comparar els efectes del vi negre en la producció d’aquestes
apolipoproteïnes (Apo A i Apo B) respecte a un altre grup de cèl·lules tractades amb vi
blanc. Tanmateix, la meva hipòtesi en aquest tractament no ha estat totalment aprovada. En
la quantificació d’apolipoproteïna A s’han obtingut els resultats esperats tant en el Western
Blot com en la QPCR, ja que en les cèl·lules subministrades amb vi negre hi havia major
quantitat d’Apo A que en aquelles tractades amb vi blanc. Tot i així, per poder assolir el meu
objectiu i corroborar el benefici pel nostre organisme d’una ingesta ocasional de vi negre,
caldria haver aconseguit bons resultats també en la quantificació d’Apo B.
L’Apo B, tant en el tractament d’àcids grassos com de vins, no va aparèixer en la tècnica de
la Western Blot. Aquest error es deu principalment a l’alta massa molecular d’aquesta
proteïna i a la inespecificitat dels seus anticossos, que fa impossible la seva correcta
manifestació. De fet, es va intentar afavorir la seva expressió re-incubant les membranes
amb un anticòs més concentrat, però això va provocar que la proteïna es sobre-expressés i
no fos possible la seva quantificació. Finalment, es va arribar a la conclusió que havia de ser
degut a la poca inespecificitat de l’anticòs i per tant el baix reconeixement d’aquesta
proteïna. Afortunadament, amb la tècnica de QPCR es va poder estudiar tant el gen de l’Apo
A com el de l’Apo B. Els resultats, però, no van ser totalment favorables pel que fa al gen de
l’Apo B.
En estudiar-lo, no es va observar una clara diferència quantitativa i això indicava que tant el
vi negre com el vi blanc influïen de manera semblant en l’expressió d’aquesta proteïna i que
per tant repercutien similarment en el nostre organisme.
� 142
Per això, la meva hipòtesi és refutada parcialment i m’impedeix afirmar del tot el benefici del
vi negre respecte al vi blanc en la prevenció de malalties cardiovasculars. A més, com no es
van obtenir els resultats quantitatius de la proteïna en sí, no es va poder fer una comparació
entre l’expressió produïda a partir de la quantitat de gen de l’Apo B, que sí s’havia pogut
estudiar.
Una de les propostes futures seria la repetició d’aquest mateix estudi, canviant l’anticòs
utilitzat per afavorir l’aparició de l’Apo B i el seu posterior estudi. Així mateix, seria
interessant observar la modulació d’Apo B i d’Apo A en les cèl·lules HepG2 sense
subministrar-hi cap tipus de tractament. Aquest experiment permetria veure més clarament
l’efecte perjudicial de substàncies alcohòliques, en concret el vi, en el nostre organisme a
partir de la quantificació de les apolipoproteïnes relacionades amb les lipoproteïnes HDL i
LDL, és a dir l’Apo A i l’Apo B respectivament.
Per últim, en les observacions per microscòpia de les secrecions de greix de les cèl·lules
hepàtiques HepG2, es va afirmar la meva hipòtesi totalment, tot i que de forma qualitativa
per manca de suports tècnics suficients. Efectivament, es va poder observar la presència de
secrecions lipídiques i determinar que en el tractament de vi negre hi havia menys presència
d’aquestes secrecions que en el vi blanc. A més, com que en tots dos tractaments amb vi
s’hi manifestaven més secrecions que en el control, es demostrava el perjudici de l’alcohol
en abundància i la incidència d’aquest en la sobre-aparició de secrecions de greix en les
nostres cèl·lules i per tant l’afavoriment de patir ‘’fetge gras’’, tècnicament anomenat
esteatosi hepàtica.
En conclusió, he après a fer ciència i tot el que n’implica. En tot treball científic i
d’investigació és gairebé inevitable trobar-se amb diversos resultats, ja sigui per la
metodologia seguida, per un petit error en les concentracions o simplement per condicions
alterades. Aleshores els nostres resultats deixen de ser els esperats i refuten la nostra
hipòtesi parcialment o total. Afortunadament gran part de la meva hipòtesi l’he pogut
confirmar, tot i que per una altra banda n’he obtingut resultats inesperats en el tractament de
les cèl·lules hepàtiques amb el vi. Tanmateix, la majoria dels objectius han estat assolits
amb força èxit, fet del qual estic molt contenta.
� 143
A més, era conscient que tot no podia sortir a la perfecció, això és ciència i la ciència és
observació, experimentació i implica refutació. No sempre tot surt rodó, però la ciència
consisteix en això, en plantejar-se una sèrie de preguntes de les que intentem buscar
resposta. Respostes que a mesura que passa el temps poden ser modificades, perquè la
ciència implica qüestionar-se tot, fins i tot allò que ha estat comprovat. I és que he après que
en l’àmbit de la investigació no val res que no estigui argumentat i alhora res pot ser
descartat, perquè dels resultats i hipòtesis més inesperades i contradients poden sorgir les
teories i models científics més potents i aproximats a la realitat del món.
Per això mateix, és essencial seguir investigant i fent-nos noves preguntes. I si els resultats
no són convenients ,no s’ha de tirar mai la tovallola, perquè l’esforç, la constància i la
precisió en tot allò que ens proposem, un dia o altre es veurà recompensat amb nous
resultats significatius pel món científic. I és que adonar-se que has assolit allò que tan
anhelaves i tan temps t’ha ocupat, no té preu i és una sensació que no te la treu ni la gran
quantitat d’experiments repetitius, ni els moments adversos pels quals has passat per
aconseguir-ho, ni ningú. Una sensació sobretot d’èxit personal que et demostra que a la vida
i en la ciència una primera derrota pot comportar una posterior i merescuda victòria.
� 144
8. BIBLIOGRAFIA Llibres i monografies
• GRANADOS ÁVILA, J. Enciclopedia del aceite de oliva. A. Madrid Vicente Ediciones.
Madrid, 2011. ISBN978-84-96709-68-3.
• HERNÁNDEZ VERA, M. Aceite de oliva virgen extra. Barcelona. Planeta, 2000. ISBN
84-08-035442-8
• HERRERA, C. Saber de aceite. Styria de Ediciones y Publicaciones S.L. Barcelona,
2008. ISBN: 978-84-96626-77-5.
• ROMERO, C. [et al.]. Contenido polifenólico del aceite de oliva. Sevilla (Espanya).
Instituto de a Grasa (CSIC) 2001.
• RUBIO, P. [et al. L’oli d’oliva: tots els secrets del principal ingredient de la dieta
mediterrània. Grata Lectura DL, 2005.
Articles: de diaris i oficials
• BENITO S. Los flavonoides en la protección vascular a través de la dieta en
ratas. Barcelona: Universidad de Barcelona. Departamento de Nutrición y
Bromatología de la Facultad de Farmacia (División IV) y Departamento de
Fisiología de la Facultad de Biología (División III), 2001. [15 d’octubre 2012].
Article oficial. • BONET, S. ‘’Un bálsamo para salud’’. La Vanguardia, [Barcelona], (15
setiembre 2012), núm p. 29, 30, 31. Article de diari.
Pàgines web
• ASOLIBA (Asociación Española de la Industria y el Comercio Exportador del
Aceite de Oliva) Variedades de aceitunas, Madrid.
�http://www.asoliva.com/aceite_espanol/variedad.htm> [Consulta: 15 juliol
2012].
• ASTORCH, NÚRIA ‘’L’oli d’oliva ajuda a combatre el càncer’’. El punt avui
electrònic [Girona] (04/02/11) 02:00. [Consulta]: 30/09/2012.
• CELL SIGNALING TECHNOLOGY�� Estats Units, 2007.�
�http://www.cellsignal.com/pdf/9806.pdf> [20 juliol 2012].
� 145
• DR. LAMARCHE. B [et. Al.] American Heart Association. Apolipoprotein A-I
and B Levels and the Risk of Ischemic Heart Disease. CANADA, 1996.
<http://circ.ahajournals.org/content/94/3/273.long> [Última consulta: 15
d’octubre 2012].
• ENCICLOPEDIA CATALANA [En línia]. Apolipoproteïnes i colesterol
Catalunya: Enciclopedia catalana, 2002.
<http://www.enciclopedia.cat/totcerca.jsp?q=allintitle:apoptosi&client=enci_cat
_interfaz&filter=0&ie=utf8&oe=utf8&site=enciclopedia_cat&outpu=xml_no_dtd
&proxystylesheet=enci_cat_interfaz&ud=1&start=0&entqr=0 > [ 28 setembre
2012].
• FARQUHARSON,C i BENITEZ COLLANTE, L. Facultat de Medicina,
Universtitat del Nord-Oest. Espanya. Fisiología humana
<http://www.med.unne.edu.ar/catedras/fisiologia1/lipoproteinas1.PDF>.
[Última consulta: 29 d’octubre 2012].
• GIMENO CREUS, E Compostos fenòlics [En línia]. Gimeno Creus, E. p.80
Vol. 23.
<http://apps.elsevier.es/watermark/ctl_servlet?_f=10&pident_articulo=130635
08&pident_usuario=0&pident_revista=4&fichero=4v23n06a13063508pdf001.p
df&ty=134&accion=L&origen=doymafarma&web=www.doymafarma.com&lan
=es > [Consulta: 15 d’octubre 2012].
• GRUP FAIGES. Beneficis de l’oli d’oliva Tarragona.
<http://www.faiges.com/cat/el_aceite.php > [Consulta: 3 novembre 2012].
• HERNÁNDEZ URQUIZA H.D El metabolismo de los quilomicrones. Estats
Units: American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2008. <http://temasdebioquimica.wordpress.com/2008/08/28/metabolismo-de-los-
quilomicrones/> [Consulta: 15 de julio 2012].
• LA BODEGA IBÉRICA. Tipos de aceite de oliva.
<http://bodegaiberica.com/aceite.htm> [Última consulta: 3 novembre 2012].
• La agencia para el aceite de oliva (AAO). Ministeri d’agricultura, alimentació i
medi ambient d’ Espanya. Madrid.
�http://aplicaciones.magrama.es/pwAgenciaAO/Salud.aao?opcion_selecciona
da=3000&control_acceso=S&idioma=CAT> [10 juliol 2012].
� 146
• MARTÍNEZ ÁLVAREZ, J.S [et.al.]. El aceite de oliva y la dieta mediterránea.
José A. Pinto Fontanillo y Jesús R. Martínez Álvarez, Instituto de Salud
Pública. Consejería de Sanidad y Consumo. Madrid 2011.
<http://www.nutricion.org/publicaciones/pdf/aceite_de_oliva.pdf > [Última
consulta: 30 d’octubre 2012].
• MILLÀS JIMENEZ, R. Beneficis de l’oli d’oliva. Gremi d’Insustrials Oliaires de
Catalunya (GIO). Barcelona, 2011.< http://www.gio.cat/varietats-doli-doliva >
[Última consulta: 2 novembre 2012].
• Salud y aceite de oliva. Espanya, Jaén. Fundación CEAS (Centro de
Excelencia de Investigación del Aceite de oliva y Salud), 2010
<http://www.fundacionceas.es/> [Última consulta: 31 d’octubre 2012]
• SERRA MAJEM, L. [et.al.] La dieta mediterrània. Fundación Dieta
Mediterránea, Barcelona, 2011 <http://dietamediterranea.com/>
• UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA. Aspectos básicos de la
apolipoproteína E���http://bioinformatica.uab.es/biocomputacio/treballs02-
03/M_Pera/Bases_moleculares2.htm.> [Consulta: 2 Octubre 2012].
• W.M. KECK FOUNDATION BIOTECHNOLOGY MICROARRYAY
RESOURCE LABORATORY AT YALE UNIVERSITY, TRIZOL RNA Isolation
Protocol
<http://medicine.yale.edu/keck/ycga/Images/TRIZOLRNAIsolation_092107_tc
m240-21453.pdf> [Consulta: 10 de novembre].
• ZAMORA, A. Poder antioxidant ponifenols i vitamines. Espanya 2012.
<http://www.scientificpsychic.com/fitness/aceites-grasas.html> [Consulta: 25
de setembre ].
