ORIENTAREA DIAGNOSTICA IN

HEPATITE VIRALE

1. Tablou clinic

2. Teste biochimice • Markerii necrozei hepatocitare (transaminaze, LDH)

• Markeri colestaza (FAL, GGT, bilirubina)

• Markeri ai incapacitatii de sinteza la nivel hepatic (proteine serice, colesterol, trigliceride)

3. Date epidemiologice: cale transmitere, contact infectant, per. incubatie, vaccinuri

4. Diagnostic etiologic = detectia markerilor virali: • antigene virale (Ag)

• anticorpi antivirali (Ac)

• acid nucleic viral

CLINICA

A “Infectioasa”

“Serica”

HEPATITA

VIRALA

Transmitere

Enterica

Transmitere

Parenterala

E

“NANB”

B D

C

EPIDEMIOLOGIE

Virusuri hepatitice F,G…

Coxackie, EBV, CMV, arbovirusuri

McCallum-1942

1989-Choo

Diagnostic V.H.B.

Simptome

AgHBe

ADN/VHB

anti-HBe

anti-HBc totali

anti-HBc IgM anti-HBs AgHBs

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 100

Infectia acuta cu VHB

evolutie spre vindecare

Saptamini post expunere

IgM anti-HBc

Total anti-

HBc

HBsAg

Acute

(6 months)

HBeAg

Chronic

(Years)

anti-HBe

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 Years

Weeks after Exposure

Infectia cronica cu VHB

Tehnica ELISA “sandwich” 1. Incubare ser pacient 1h la 37ºC 2. Spalare 3. Incubare CONJUGAT 60min la 37ºC 4. Spalare 5. Incubare SUBSTRAT 20 min la t.camerei 6. Solutie de stopare 7. Citire la spectrofotometru => D.O., MN, MP,

C.O.

ELISA de detectie a Ag

virale

Ag HBs

Anti HBs

Anti HBs cuplat

cu enzima =

CONJUGAT

SUBSTRAT

+

Diagnostic molecular in infectia VHB

(1) Monitorizarea evolutiei naturale /sub tratament a

hepatitei virale B Riscul de ciroza/CHP creste cu nivelul VL, atat pt persoanele AgHBe negative,

cat si pt cele AgHBe pozitive

(2) Initiere tratamentului pt hepatita cronica B

Tratamentul este initiat pe baza

» PBH

» VL

» Transaminaze serice

La persoanele AgHBe negative, iv >10.000 copii/ml

indica infectie activa (marker de infectivitate virala).

(3)Criterii de evaluare a raspunsului

la terapie in hepatita cronica VHB

Virusologice

• Mentinerea nedetectabila a ADN-VHB plasmatic

• Seroconversie sustinuta la antiHBe la pacientii AgHBe pozitivi

• Eliminarea AgHBs seroconversie anti HBs

Biochimice:

• normalizarea sustinuta a nivelului transaminazelor

Histologice:

• reducerea stadiului de fibroza sau absenta progresiei

• reducerea activitatii necro-inflamatorii

Diagnostic V.H.D.

anti-HBs

Symptoms

ALT Elevated

Total anti-HDV

IgM anti-HDV + IgM anti HBc

HDV RNA

HBsAg

Coinfectia HBV - HDV

Timp dupa expunere

Titru

Jaundice

Symptoms

ALT anti-HDV + anti HBc IgG

IgM anti-HDV

HDV RNA

HBsAg

Suprainfectia HBV - HDV

Timp dupa expunere

Titru

DIAGNOSTIC DE LABORATOR

IN HEPATITE DE ETIOLOGIE

VIRALA

ORIENTAREA DIAGNOSTICA IN

HEPATITE

1. Tablou clinic

2. Teste biochimice• Markerii necrozei hepatocitare (transaminaze, LDH)

• Markeri colestaza (FAL, GGT, bilirubina)

• Markeri ai incapacitatii de sinteza la nivel hepatic (proteine serice, colesterol, trigliceride)

3. Date epidemiologice: cale transmitere, contact infectant, per. incubatie, vaccinuri

4. Diagnostic etiologic = detectia markerilor virali:

• antigene virale (Ag)

• anticorpi antivirali (Ac)

• acid nucleic viral

CLINICA

A“Infectioasa”

“Serica”

HEPATITA

VIRALA

Transmitere

Enterica

Transmitere

Parenterala

E

“NANB”

B D

C

EPIDEMIOLOGIE

Virusuri hepatitice F,G…

Coxackie, EBV, CMV, arbovirusuri

McCallum-1942

1989-Choo

Diagnostic V.H.B.

ANTIGENE VHB

Sisteme antigenice VHB

• Ag HBs Ac antiHBS

• Ag HBc Ac antiHBc

• Ag HBe Ac antiHBe

Hepatita B•Hepatita acuta

•Hepatita cronica persistenta

•Hepatita cronica agresiva» Ciroza hepatica

» Carcinom hepato-celular

ALGORITM

Simptome

AgHBe

ADN/VHB

anti-HBe

anti-HBc totali

anti-HBc IgM anti-HBsAgHBs

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 100

Infectia acuta cu VHB

evolutie spre vindecare

Saptamini post expunere

IgM anti-HBc

Total anti-

HBc

HBsAg

Acute

(6 months)

HBeAg

Chronic

(Years)

anti-HBe

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 Years

Weeks after Exposure

Infectia cronica cu VHB

•ELISA de detectie a Ag virale

Tehnica ELISA “sandwich”

1. Incubare ser pacient 1h la 37ºC

2. Spalare

3. Incubare CONJUGAT 60min la 37ºC

4. Spalare

5. Incubare SUBSTRAT 20 min la t.camerei

6. Solutie de stopare

7. Citire la spectrofotometru => D.O., MN, MP,

C.O.

ELISA de detectie a Ag

virale

Ag HBs

Anti HBs

Anti HBs cuplat

cu o enzima =

CONJUGAT

SUBSTRAT

+

Diagnostic molecular in

infectia VHB

Mortalitatea datorata bolilor hepatice

0.8%o / an la cei mono-infectati VHB

14.2%o / an la cei co-infectati HIV - VHB

(1) Monitorizarea evolutiei naturale /sub tratament a

hepatitei virale BRiscul de ciroza/CHP creste cu nivelul VL, atat pt persoanele AgHBe negative,

cat si pt cele AgHBe pozitive

(2) Initiere tratamentului pt hepatita

cronica BTratamentul este initiat pe baza

» PBH

» VL

» Transaminaze serice

La persoanele AgHBe negative, iv >10.000 copii/ml

indica infectie activa (marker de infectivitate virala).

(3)Criterii de evaluare a raspunsului

la terapie in hepatita cronica VHB

Virusologice

• Mentinerea nedetectabila a ADN-VHB plasmatic

• Seroconversie sustinuta la antiHBe la pacientii AgHBe pozitivi

• Eliminarea AgHBs seroconversie anti HBs

Biochimice:

• normalizarea sustinuta a nivelului transaminazelor

Histologice:

• reducerea stadiului de fibroza sau absenta progresiei

• reducerea activitatii necro-inflamatorii

Diagnostic V.H.D.

RNA

Hepatitis D Virus

anti-HBs

Symptoms

ALT Elevated

Total anti-HDV

IgM anti-HDV + IgM anti HBc

HDV RNA

HBsAg

Coinfectia HBV - HDV

Timp dupa expunere

Titru

Jaundice

Symptoms

ALTanti-HDV + anti HBc IgG

IgM anti-HDV

HDV RNA

HBsAg

Suprainfectia HBV - HDV

Timp dupa expunere

Titru

Diagnostic in infectia VHC

Diagnosticul infecţiei VHC TESTE EXEMPLE APLICATII COMENTARII

SEROLOGICE ELISA de detectie Ac anti VHC RIBA / Western

Blot

Nu pot diferenţia între o infecţie acută, cronică sau vindecată

ELISA-sensibilitate

mare, în populaţii cu risc scăzut de infecţie are valoare predictivă mică

MOLECULARE TESTE CALITATIVE RT-PCR

Diagnosticul infectiei active

Detecţia timpurie a infectiei O singură determinare negativă-neconcludentă

TESTE CANTITATIVE -Rt-PCR -b-DNA

Aprecierea rezultatelor terapiei

Nu exclude diagnosticul infecţiei

TESTE DE GENOTIPARE

Secvenţiere nucleotidică, RFLP, LiPA

Genotipuri Subtipuri Qvasispecii

Apreciază durata tratamentului şi prognosticul răspunsului virusologic susţinut

Patternul serologic al infectiei VHC acute cu vindecare

Symptoms +/-

Time after Exposure

anti-HCV

ALT

Normal

0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4

Years Months

HCV RNA

Ac anti VHC

ALT

Patternul serologic al infectiei VHC care cronicizeaza

Symptoms +/-

Time after Exposure

anti-HCV

ALT

Normal

0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4

Years Months

HCV RNA

ALT

Ac anti VHC

Diagnosticul infecţiei VHC TESTE EXEMPLE APLICATII COMENTARII

SEROLOGICE ELISA RIBA / Western Blot

Nu pot diferenţia între o infecţie acută, cronică sau vindecată

ELISA-sensibilitate mare, în populaţii cu risc scăzut de infecţie are valoare predictivă mică

MOLECULARE TESTE

CALITATIVE

RT-PCR

Diagnosticul

infectiei active

Detecţia timpurie a infectiei

O singură determinare negativă-neconcludentă

TESTE

CANTITATIVE

-RT-PCR

-b-DNA

Aprecierea

rezultatelor

terapiei – (RVS-

răspunsul virusologic

sustinut

Nu exclude diagnosticul

infecţiei

TESTE DE

GENOTIPARE

Secvenţiere nucleotidică, RFLP, LiPA

Genotipuri

Subtipuri

Qvasispecii

Apreciază durata tratamentului şi prognosticul

Anti-HCV / HCV RNA Interpretare clinică

Anti-HCV negativ, HCV-RNA

negativ •Absenţa infecţiei VHC

Anti-HCV pozitiv, HCV-RNA pozitiv

•Infecţie VHC acută sau cronică

(activă)

Anti-HCV negativ, HCV-RNA pozitiv

•Infecţie acută recentă în care nu

a avut loc încă seroconversia

•Infecţie cronică la un pacient

imunosupresat

Anti-HCV pozitiv + HCV RNA negativ • Infecţie vindecată

• Viremie cu nivel redus sau fluctuantă, intermitent negativă

0

1

2

3

4

5

6

7

8

-6 0 6 4 12 36 42 48 54 60 66 72 78

Timp (saptamani)

AR

N V

HC

(U

I/

mL)

scadere 2 log

Limita de

detectie

IFN+RBV

Recadere dupa

oprirea tratamentului

Recadere in timpul tratamentului Nonresponderi

Succesul terapeutic in hepatita cronica C

Raspunsul virusologic sustinut (RVS)

RVS

TRATAMENT

RVR EVR EoT

Genotipare VHC

Distributia genotipurilor VHC pe glob, OMS 2009

LiPA

LiPA Line Probe Assay – genotipare

Hibridizare cu sonde moleculare cu specificitate pentru regiuni conservate din cadrul genotipurilor si subtipurilor

evidentierea profilului specific unui genotip prezent in ampliconii din 5’NTR si core.

Diagnostic V.H.A.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 saptamana

simptomatologie

ALT

IgM

IgG

VHA in MF

Infectie

Viremie

EVOLUTIA MARKERI DE INFECTIE VHA

HEPATITA A NU CRONICIZEAZA!!

Diagnostic hepatita acuta A = detectie Ac anti VHA IgM (ELISA de captura)

Ac anti VHA IgG = vindecare sau vaccinare

ELISA de detectie anticorpi de clasa IgM

ELISA de captura

Anti-IgM

IgM

Ag marcat

enzimatic =

conjugat

ETAPE

1. Incubare ser pacient 1h la 37ºC

2. Spalare

3. Incubare conjugat 30 min la 37ºC

4. Spalare

5. Incubare substrat 20 min la t. camerei

6. Citire la spectrofotometru – DO, CO

Utilizarea metodelor moleculare in

infectiile virale:

HIV, hepatite, papilomavirusuri

• infectia HIV

• infectia VHB – Monitorizarea evolutiei naturale /sub tratament a hepatitei virale B

– Initierea tratamentului pt hepatita cronica B

• infectia VHC – Diagnosticul infectiei active + Aprecierea rezultatelor terapiei

– GENOTIPARE - apreciază durata tratamentului şi prognosticul

• infectia HPV – Detectia ADN HPV (PCR)

– GENOTIPARE – genotipuri “high risk” si “low risk”

Diagnostic in infectia VHC

Diagnosticul infecţiei VHCTESTE EXEMPLE APLICATII COMENTARII

SEROLOGICE ELISA de

detectie Ac anti

VHC

RIBA / Western

Blot

Nu pot

diferenţia

între o

infecţie acută,

cronică sau

vindecată

ELISA-sensibilitate

mare, în populaţii cu risc

scăzut de infecţie are

valoare predictivă mică

MOLECULARE TESTE

CALITATIVE

RT-PCR

Diagnosticul

infectiei active

Detecţia timpurie a infectiei

O singură determinare

negativă-neconcludentă

TESTE

CANTITATIVE

-Rt-PCR

-b-DNA

Aprecierea

rezultatelor

terapiei

Nu exclude diagnosticul

infecţiei

TESTE DE

GENOTIPARE

Secvenţiere

nucleotidică,

RFLP, LiPA

Genotipuri

Subtipuri

Qvasispecii

Apreciază durata

tratamentului şi prognosticul

răspunsului virusologic

susţinut

Patternul serologic al infectiei VHC acute cu vindecare

Symptoms +/-

Time after Exposure

anti-HCV

ALT

Normal

0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4

YearsMonths

HCV RNA

Ac anti VHC

ALT

Patternul serologic al infectiei VHC

care cronicizeaza

Symptoms +/-

Time after Exposure

anti-HCV

ALT

Normal

0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4

YearsMonths

HCV RNA

ALT

Ac anti VHC

Diagnosticul infecţiei VHCTESTE EXEMPLE APLICATII COMENTARII

SEROLOGICE ELISA

RIBA / Western Blot

Nu pot diferenţia între o

infecţie acută, cronică

sau vindecată

ELISA-sensibilitate mare, în

populaţii cu risc scăzut de

infecţie are valoare predictivă

mică

MOLECULARE TESTE

CALITATIVE

RT-PCR

Diagnosticul

infectiei active

Detecţia timpurie a

infectiei

O singură determinare

negativă-neconcludentă

TESTE

CANTITATIVE

-RT-PCR

-b-DNA

Aprecierea

rezultatelor

terapiei – (RVS-

răspunsul

virusologic

sustinut

Nu exclude diagnosticul

infecţiei

TESTE DE

GENOTIPARE

Secvenţiere

nucleotidică,

RFLP, LiPA

Genotipuri

Subtipuri

Qvasispecii

Apreciază durata

tratamentului şi

prognosticul

Anti-HCV / HCV RNA Interpretare clinică

Anti-HCV negativ, HCV-RNA

negativ

•Absenţa infecţiei VHC

Anti-HCV pozitiv, HCV-RNA

pozitiv

•Infecţie VHC acută sau cronică

(activă)

Anti-HCV negativ, HCV-RNA

pozitiv

•Infecţie acută recentă în care nu

a avut loc încă seroconversia

•Infecţie cronică la un pacient

imunosupresat

Anti-HCV pozitiv + HCV RNA negativ

• Infecţie vindecată

• Viremie cu nivel redus sau fluctuantă, intermitent negativă

0

1

2

3

4

5

6

7

8

-6 0 6 4 12 36 42 48 54 60 66 72 78

Timp (saptamani)

AR

N V

HC

(U

I/

mL)

scadere 2 log

Limita de

detectie

IFN+RBV

Recadere dupa

oprirea tratamentului

Recadere in timpul tratamentuluiNonresponderi

Succesul terapeutic in hepatita cronica C

Raspunsul virusologic sustinut (RVS)

RVS

TRATAMENT

RVR EVR EoT

Genotipare VHC

Distributia genotipurilor VHC pe glob, OMS 2009

LiPA

LiPA Line Probe Assay –genotipare

Hibridizare cu sonde moleculare cu specificitate pentru regiuni conservate din cadrul genotipurilor si subtipurilor

evidentierea profilului specific unui genotip prezent in ampliconii din 5’NTR si core.

Diagnostic

V.H.A.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13saptamana

simptomatologie

ALT

IgM

IgG

VHA in MF

Infectie

Viremie

EVOLUTIA MARKERI DE INFECTIE VHA

HEPATITA A NU CRONICIZEAZA!!

Diagnostic hepatita acuta A = detectie Ac anti VHA IgM (ELISA de captura)

Ac anti VHA IgG = vindecare sau vaccinare

ELISA de detectie anticorpi de clasa IgM

ELISA de captura

Anti-IgM

IgM

Ag marcat

enzimatic =

conjugat

ETAPE

1. Incubare ser pacient 1h la 37ºC

2. Spalare

3. Incubare conjugat 30 min la 37ºC

4. Spalare

5. Incubare substrat 20 min la t. camerei

6. Citire la spectrofotometru – DO, CO

Utilizarea metodelor moleculare in

infectiile virale:

HIV, hepatite, papilomavirusuri

• infectia HIV

• infectia VHB – Monitorizarea evolutiei naturale /sub tratament a hepatitei virale B

– Initierea tratamentului pt hepatita cronica B

• infectia VHC – Diagnosticul infectiei active + Aprecierea rezultatelor terapiei

– GENOTIPARE - apreciază durata tratamentului şi prognosticul

• infectia HPV– Detectia ADN HPV (PCR)

– GENOTIPARE – genotipuri “high risk” si “low risk”