Manual de Genetica Pmc Eleazar Serrano

Laboratorio de Genética Aplicada MC. Eleazar Serrano Guzmán

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MANUAL DE LABORATORIO DE

GENETICA APLICADA

Universidad Autónoma de Chiapas Faculta de Ciencias Químicas Campus IV

MC. Eleazar Serrano Guzmán 2012


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INDICE DE PRÁCTICAS

OBJETIVOS Procedimientos de seguridad en el laboratorio de Genética Aplicada………………………………………… 5

Buenas Prácticas de Laboratorio………………………………………… 5 Clasificación de los agentes de riesgo potencial…………………… 7 Agentes Químicos…………………………………………………….. 7 Agentes Físicos…………………………………………………………. 8 Agentes Biológicos……………………………………………………. 9 Clasificación de riesgos por el código de colores………………….. 10 Sistema de National Fire

Protecction Association (NFPA 704-M)…………………….. 10 Interpretación cuadro riesgo…………………………………….. 11

Hoja de Seguridad………………………………………………………………. 11 Residuos……………………………………………………………………………. 13 Practica 1 Medidas de seguridad y calidad en e laboratorio de Genética Aplicada 15 Practica 2 Técnica SQUASH para la identificación de cromosomas………………………. 22 Practica 3 Identificación de cromatina X en mucosa bucal…………………………………. 25 Practica 4 Extracción y purificación de ADN de células procariotas (E. coli)……… 28 Practica 5 Extracción y purificación de ADN de células Eucariotas……………………. 31 Practica 6 Corrimiento electroforético de ADN………………………………………………….. 34 Bibliografía………………………………………………………………………………………. 37


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OBJETIVO GENERAL DE LA MATERIA: en base a los conocimientos previos teoricos y de laboratorio el alumno identificara las diferentes pruebas de laboratorio basadas en biomoleculas especificas, con carácter diagnostico.

OBJETIVOS DE LOS APUNTES DE LA MATERIA: este material es una guia para el estudiante para ayudarlo a la comprension de los temas y la investigación de las unidades tematicas desde el analisis de los acidos nucleicos, proteinas hasta las metodologias para su analsis.


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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

CAMPUS IV

PROCEDIMIENTOS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE

GENETICA APLICADA.

La principal función de la seguridad en un laboratorio de Genética es reducir la posibilidad de accidentes para proteger al personal y a las instalaciones.

De las actitudes y acciones de las personas que trabajan en un laboratorio, depende su propia seguridad y la de los demás, así como la calidad de servicios que estén ofreciendo. El buen uso de los aparatos, el diseño de una estrategia de trabajo y los riesgos de errores son las reglas básicas de seguridad para prevenir riesgos físicos, químicos, biológicos y radiológicos, en cualquier laboratorio y específicamente el de Genética aplicada, por lo cual se requiere de personas entrenadas, concientes y responsables.

Buenas Prácticas de Laboratorio

Las buenas prácticas incluyen reglas, recomendaciones o prohibiciones relacionadas con el conocimiento, el sentido común y la solidaridad en el ambiente de trabajo.

• Estará PROHIBIDO comer, beber (incluye tomar mate), almacenar alimentos, correr, fumar, maquillarse o manipular lentes de contacto en el laboratorio. Aún cuando no se estén realizando Trabajos Prácticos (teóricos, seminarios, etc.).

• El área de trabajo debe estar limpia y ordenada. No debe colocarse libros, mochilas o bolsas sobre las mesas de trabajo. Se deberá verificar que la mesa de trabajo esté limpia al comenzar y al terminar el trabajo realizado.


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• Se deberá usar vestimenta adecuada: MANGA LARGA preferentemente

de algodón (que no será utilizado fuera del laboratorio), zapatos cerrados (no sandalias), y tener el pelo recogido.

• Es obligatorio el uso de ANTEOJOS DE SEGURIDAD, según sea lo que corresponda, durante la realización de los Trabajos Prácticos. Los ojos son órganos muy vascularizados que pueden absorber rápidamente algunos compuestos químicos, por otra parte aunque no estemos trabajando directamente estamos expuestos a posibles aerosoles y vapores. Las gafas son de uso personal y no pueden ser intercambiadas entre los alumnos.

• Los alumnos o docentes que realicen tareas experimentales en el laboratorio es de CARÁCTER OBLIGATORIO usar guantes apropiados acorde a los riesgos y los reactivos que se manipulen. Los guantes previenen el contacto con agentes tóxicos o biológicos, quemaduras por superficies calientes, frías o corrosivas y cortes por objetos punzantes.

• Los guantes deberán desecharse al terminar el trabajo, no se tocarán con ellos lapiceros, carpetas, picaportes, teclados, etc.

• PROHIBIDO pipetear con la boca. Se podrán utilizar pipetas de vidrio o plástico con pipetor o micropipetas.

• Los alumnos y docentes deben estar familiarizados con los elementos de seguridad disponibles, salidas, extintores, lavabos.

• Toda herida, aún los pequeños cortes, que se produzca durante un trabajo práctico deben ser informados obligatoriamente al docente.

• Todos los materiales potencialmente contaminados se deben descontaminar o esterilizar antes de desecharlos o reutilizarlos.

• El desecho de los residuos (solventes, ácidos, compuestos orgánicos, radioisótopos, etc.) deben respetar las normas establecidas y no tirarse al caño o en la basura común.

• La manipulación de los microorganismos y material biológico, debe ser restringida a los laboratorios y de ninguna manera se debe permitir su dispersión o propagación en el medio ambiente, aunque podrían parecer inofensivos.


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Clasificación de los agentes de riesgo potencial

Los agentes cuya manipulación en el laboratorio pueden presentar un riesgo potencial para la salud se pueden clasificar en tres grupos: a) agentes químicos, b) agentes físicos y c) agentes biológicos. Hay muchos factores que influyen en el riesgo de estos tres grupos de agentes, de tal manera que todos deben de ser manejados con precaución, tanto por sus efectos conocidos, como por sus efectos desconocidos.

a) Agentes químicos

En el laboratorio se manipulan gran cantidad sustancias químicas potencialmente peligrosas. En función de sus riesgos se pueden clasificar en:

• Irritante: que da lugar a reacciones locales en mucosas y piel (ejemplo: HCl diluido, fenol, etc.).

• Toxica: que ocasiona daño a la Salud cuando es ingerida, inhalada o absorbida por la piel o las mucosas (ejemplo: acrilamida, metanol etc.).

• Carcinogénicas: que puede provocar cáncer (ejemplo: bromuro de etidio, etc.).

• Mutagénicas: que provoca alteraciones en el material genético ( ejemplo: bromuro de etidio)

• Teratógena: que ocasiona daño al feto • Corrosiva: que provoca el desgaste gradual de diversos tipos de material

(ejemplo: HCl, NaOH, etc.). • Inflamable: que tiene un punto de inflamación inferior a 60ºC, y puede

empezar su combustión por fricción, cambios químicos, etc. • Explosiva: que es capaz de producir una reacción detonante a 25ºC y 1.03

Kg/cm³ de presión.

Para identificar estos compuestos existe una señalización internacional (Figura 1) la cual es importante conocer.


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b) Agentes físicos

Equipos de laboratorio:

Los accidentes producidos con equipos suelen ser por fallas humanas debido a: prisas, desconocimiento del manejo, uso inadecuado, falta de mantenimiento, etc.

En el laboratorio estos accidentes se asocian generalmente al uso de las centrifugas (un rotor mal equilibrado puede causar que se rompa él y que salgan volando piezas, al tratar de parar el rotor con las manos uno se podría lastimar, etc), de las cámaras de electroforesis (al quedarse bajo tensión, o sin avisar de uso con alto voltaje).

Generalmente todos los aparatos son eléctricos y por lo tanto se tienen que manipular con las mismas precauciones elementales que cualquier otro de uso doméstico para evitar shock eléctrico, corto-circuito y fuego.

Radiaciones:

Las radiaciones X, UV e ionizantes, como las emitidas por los radioisótopos son potenciales carcinógenos, mutágenos y teratógenos. Su uso requiere tomar las medidas necesarias para evitar una exposición sin protección y/o prolongada.

Sustancias y elementos radioactivos:

El material radioactivo se puede manipular únicamente en laboratorios autorizados por las Comisiones Nacionales de Salvaguardia y bajo reglas específicas y estrictas. Todas estas se establecen con la finalidad de que el personal quede expuesto a dosis mínimas con el material radioactivo. Los tres factores de protección radiológicas son: tiempo (se debe limitar al mínimo el tiempo de exposición); distancia (se debe evitar el contacto o el riesgo de contacto directo con la persona); y blindaje (se debe utilizar protección para limitar la exposición a las radiaciones). A parte de la exposición a las


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radiaciones se incluye dentro de los riesgos: la contaminación de la piel, o de las uñas y el deposito de los radioisótopos en el cuerpo.

c) Agentes biológicos En un laboratorio de Genética aplicada, el personal puede estar en contacto

directo con diversos agentes biológicos (virus, bacterias, células) durante su cultivo y tipificación o durante el tratamiento de muestras biológicas potencialmente contaminadas (sangre, orina, tejido, etc.).

En la entrada de todos los laboratorios debe existir información sobre el nivel de seguridad con el que se trabaja:

Nivel I: Agentes que no se ha comprobado que producen enfermedad en adultos sanos. Sólo este nivel de riesgo está permitido para los laboratorios de enseñaza de grado.

Nivel II: Agentes asociados a enfermedades humanas de riesgo potencial moderado para el personal y el medio ambiente (transmisión por ingestión, daño percutáneo, contacto con mucosas).

Nivel III: Agentes indígenas o exóticos con potencial de transmisión por aerosol, causantes de enfermedades graves o letales. Riesgo personal elevado, moderado riesgo para el medio ambiente.

Nivel IV: Agentes exóticos que producen enfermedades mortales, que pueden producir epidemias o de vía de transmisión desconocida. Elevado riesgo personal y para el medio ambiente.

Estos agentes se clasifican en diferentes grupos dependiendo de los riesgos y en consecuencia de las precauciones a tomar para trabajar con ellos, como se indica en la tabla 1.


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Tabla 1.- Niveles de bioseguridad y resumen de sus recomendaciones

Nivel Practicas y técnicas Equipo de seguridad Instalaciones

I

Practicas microbiológicas estándar

Equipos de seguridad normal para un laboratorio estándar

Básicas

II

Practicas del nivel 1, acceso limitado, descontaminación de residuos infecciosos, uso de guantes, señalamiento de seguridad.

Equipos de contención parcial (campanas de bioseguridad I y II)

Básicas

III

Practicas de nivel 2 ropa apropiada para el laboratorio y acceso limitado.

Equipo de contención parcial (campanas de bioseguridad I y II)

Contención

IV

Practicas de nivel 3 Equipos de contención Máximo (campanas de bioseguridad III)

Máxima contención

CLASIFICACION DE RIESGOS POR EL CODIGO DE COLORES

Sistema de la National Fire Protecction Association (NFPA 704-M).

Establece un sistema de identificación de riesgos para que en un eventual incendio o emergencia, las personas afectadas puedan reconocer los riesgos de los materiales respecto del fuego. Este código ha sido creado para dar información al cuerpo de bomberos en el terreno. No identifica los peligros para la salud de una sustancia química, en situaciones distintas de una emergencia.


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Interpretación cuadro riesgos – NFPA

Salud (azul) Inflamabilidad (rojo) Reactividad (amarillo)

Casos Especiales (Blanco)

4 Fatal 4 Extremadamente

Inflamable

4 Puede detonar A Bata y lentes

3 Extremadamente

Riesgosa

3 Inflamable 3 Puede detonar

con golpe o calor

B Bata, lentes y

Guantes

2 Riesgosa 2 Calentamiento

Moderado. Lo que

puede Inflamar

2 Cambio químico

Violento

C Bata, lentes,

guantes y

mascarilla

1 Ligeramente

Riesgosa

1 Combustible si se

calienta

1 Inestable si se

Calienta

D Bata, lentes,

guantes y

mascara de

seguridad

0 Material Normal 0 No se quema 0 Estable

HOJA DE SEGURIDAD

Es un documento que reúne en forma ordenada y resumida, la información básica de las características fisicoquímicas, de seguridad, ecológicas, toxicológicas y de acciones de emergencias de los materiales considerados riesgosos. Se considera una herramienta básica para prevenir accidentes dentro y fuera de los centros de trabajo donde se manejan sustancias químicas. Así también es el mejor recurso del personal para responder a emergencias con materiales riesgosos.


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Estas hojas son requeridas por la legislación mexicana [Secretaría de

Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNA), Secretaría de Comunicaciones y Transporte (SCT), Secretaría del Trabajo y Prevención Social (STPS), Secretaría de Salud (SS), Secretaría de Gobernación (SG)]. Existe una serie de bancos de datos que cuentan con un gran número de hojas de datos de diferentes sustancias. Recientemente se acordó que una hoja de seguridad completa debe contener la siguiente información:

1.- Identificación del material (nombre y proveedor).

2.- Composición e información de los componentes.

3.- Identificación de su peligrosidad.

4.- Medidas de primeros auxilios.

5.- Medidas para prevención de fuegos.

6.- Medidas para prevención de accidentes.

7.- Manejo y almacenamiento.

8.- Equipo de protección personal.

9.- Propiedades físicas y químicas.

10.- Estabilidad y reactividad.

11.- Información toxicológica.

12.- Información ecológica.

13.- Consideraciones para su disposición.

14.- Información para el transporte.

15.- Regulaciones.

16.- Información adicional.


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En un almacén de sustancias, siempre se debe contar con las hojas de datos de seguridad actualizadas de las sustancias que se manejen, y en un lugar de fácil acceso. Para consultarse cada vez que se va a manipular alguna sustancia específica y así seguir las principales recomendaciones de manejo.

RESIDUOS.

La primera tarea del personal de un laboratorio donde se generan residuos peligrosos es:

1.- Determinar cuando un material es residuo.

2.- Determinar si el residuo es un “residuo peligroso”.

Los residuos peligrosos comprenden:

1.- Los residuos aislados, mezclados o en solución; pueden presentarse en estado sólido, liquido o en forma de lodos y son generados como subproductos de una síntesis o proceso.

2.- Los residuos resultantes de operaciones unitarias.

3.- En muchos casos, podrían también convertirse en residuos peligrosos las materias primas que caduquen o se deterioren durante el tiempo de su almacenamiento.

Es muy difícil establecer un sistema o método de tratamiento general para todos los residuos específicos de un laboratorio, ya que depende del volumen generado, del tipo de laboratorio que se trate y sobre todo por la variedad de residuos que se generan; por otra parte los residuos casi nunca están constituidos por un solo producto, por lo general son mezclas complejas. Un adecuado etiquetado y descripción de la composición cualitativa, en forma aproximada a la cuantitativa de los residuos peligrosos, es una responsabilidad importante en un sistema de tratamiento, ya sea por el mismo personal o a través de una compañía especializada en manejo y disposición de residuos

peligrosos. Los responsables de una adecuada identificación de los residuos, son los propios generadores, sean estudiantes, profesores o investigadores.


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Todos los residuos deben estar etiquetados correctamente, indicando el nombre y ubicación del generador, así como las precauciones e indicaciones correspondientes para el manejo adecuado del residuo. Los generadores de los residuos son responsables ante la Ley por los accidentes ocasionados por un inadecuado etiquetado y/o transporte y deben pagar por los daños causados a los seres vivos y a los bienes materiales, en ocasiones con dinero y en otros con encarcelamiento.

Los residuos bien etiquetados deben proporcionar información adecuada de su composición: el saber que en un contenedor se tiene los productos finales de una reacción (por ejemplo, los residuos de la reacción de Oxidación de alcoholes), no es suficiente. Si el residuo es identificado como un compuesto específico o mezcla conocida (número de productos, su naturaleza y cantidad), dan una idea de su peligrosidad, clase química, reactividad, grupos funcionales y con esto puede establecerse su compatibilidad, o medidas de emergencia en caso de un derrame accidental. El conocimiento de un producto químico o de un residuo así como sus propiedades físicas, químicas y toxicológicas, antes de tomar cualquier decisión del tratamiento es responsabilidad del personal que lo generó y/o lo tratará.


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FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

CAMPUS IV

PRACTICA No. 1

“MEDIDAS DE SEGURIDAD Y CALIDAD EN EL LABORATORIO DE GENETICA APLICADA”

OBJETIVO

El alumno conocerá las medidas de seguridad y calidad que se exigen en

el laboratorio de genética. Además de estandarizar el manejo del material de

precisión.

INTRODUCCIÓN

Los agentes cuya manipulación en el laboratorio pueden presentar un riesgo potencial para la salud, se pueden clasificar en tres grupos: agentes químicos (sustancias irritantes, toxicas, carcinogénicas, mutagénicas, corrosivas, etc.), agentes físicos (uso inadecuado del equipo, falta de mantenimiento, elementos radioactivos, etc.), y agentes biológicos (virus, bacterias, etc.).

Hay muchos factores que influyen en el riesgo de estos grupos, de tal manera que todos deben ser manejados con precaución tanto por sus efectos conocidos como por sus efectos desconocidos.

Otro aspecto importante en el laboratorio de genética es la elevada calidad de los resultados, por lo que se requiere la realización de controles de calidad durante todo el procedimiento. Dentro de los errores mas comunes que se realizan en este laboratorio son los debidos a los reactantes (muestras, reactivos, estándares, etc.) y los errores al nivel de las diferentes etapas de la


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n-1

técnica (transferencia de reactivos y muestra, contaminación inter-muestras, temperatura, duración de la reacción, etc.). Para prevenirlos es necesario realizar ciertas medidas de control como son la realización de un blanco, una curva de calibración, uso de controles negativos, entre otros.

La calidad depende de dos criterios esenciales: la exactitud y la presición.

La exactitud representa la concordancia entre el valor promedio aritmético de varios resultados y el valor real (Figura 1).

La inexactitud absoluta corresponde a dA = m - µ

Y la inexactitud relativa dR = m- µ / µ

La presición (o fidelidad) es inversamente proporcional a la dispersión de los resultados obtenidos de ensayos respectivos sobre la misma muestra, en condiciones constantes y determinadas (Figura 1).

La imprecisión esta evaluada por la desviación estándar (σ) o S n-1

S n-1=√ (x-m)²

El resultado esta expresado en porcentaje del promedio o coeficiente de variación

CV = S n-1 - 100

m


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Figura 1. Presición y Exactitud.

Para lograr la calidad en cualquier técnica que sea cualitativa como cuantitativa implica conocer dos características importantes de ésta:

- su límite de detección: concentración mínima que se puede medir y que sea significativamente distinta del ruido de fondo. Por ejemplo,

¿Cuál es la cantidad mínima de DNA que se requiere para obtener siempre la amplificación del gen de interés?

- su límite de linearidad (en caso de cuantificación): rango de concentración en el cual la concentración medida es proporcional al valor real.

La calidad de un análisis, o experimento depende del buen conocimiento de los instrumentos de trabajo, uno de los más importantes en esta rama de la investigación es la micropipeta. De la buena calibración de estos instrumentos depende la exactitud del resultado.

Exacto pero impreciso

Inexacto pero preciso

Exacto y preciso


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Descripción de una micropipeta

Es indispensable no tratar de sobrepasar el volumen máximo ideado: una micripipeta de un mL no permite tomar volumen de 1.05 mL, por ejemplo. Al hacerlo así se descalibra la micropipeta, y por lo tanto no se pipetean los volúmenes indicados. Del buen manejo de la micropipetas depende la exactitud y precisión de los pipeteos (Figura 2).

1) Sujetar la pipeta con una mano y con la otra ajustar el volumen que se desea medir utilizando el micrómetro.

2) Colocar la puntilla en la parte inferior de la pipeta.

Botón de opresión

Ajuste de volumen Micrómetro

Indicador de volumen

Botón de

expulsión

Cuerpo de la Micropipeta

Brazo de

Expulsión

Puntilla

Columna de plástico


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3) Presione el embolo con el pulgar hasta el primer tope, sumergir la

puntilla en el liquido deseado y dejar regresar nuevamente el embolo a la posición original (una manipulación rápida puede causar errores en la medición).

4) Quitar el exceso del líquido por fuera de la puntilla utilizando papel secante con mucho cuidado para evitar la contaminación del orificio de la puntilla.

5) Para descargar el liquido, aplicar la puntilla contra la pared del tubo y oprimir el botón hasta el segundo tope.

6) Para retirar la puntilla usada presione el botón expulsor.

Figura 2. Influencia de la posición de la pipeta sobre la exactitud del volumen

pipeteado


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MATERIALES Y REACTIVOS

� Micropipetas (10, 100 y 1000µL) � Vaso de precipitado de 100mL � Balanza analítica

PROCEDIMIENTO

1.- Calibrar micropipetas de diferentes capacidades (10,100 y 1000 µL).

2.- Medir un volumen determinado (100µL) de agua en un vaso de precipitado, previamente tarado, y pesar en balanza analítica. Realizar diez repeticiones.

3.- Anotar en la tabla los valores determinados

4.- Obtener el peso promedio, volumen promedio pipeteado y el coeficiente de variación.

5.- Comparar el resultado con el real (100µL) y discutir.

TABLA

Ensayo Nº. Peso en mg Ensayo Nº. Peso en mg

1 6

2 7

3 8

4 9

5 10


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CUESTIONARIO

1.- ¿Cuales son las reglas de seguridad básicas en el laboratorio de genética?

2.- ¿Qué es un control negativo?

3.- ¿Cómo evitarías los errores debidos a los reactantes?

4.- Menciona al menos tres errores realizados durante el procedimiento de una técnica de laboratorio y ¿como los evitarías?

5.- Dibuja una micropipeta y ubica sus partes.

6.- ¿Cuáles son las principales fuentes de error en la manipulación de micropipetas?


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PRACTICA No. 2

“TECNICA DE SQUASH PARA LA IDENTIFICACION

DE CROMOSOMAS”

OBJETIVO:

El alumno aplicará la técnica de Squash para la identificación de

cromosomas en diversas muestras vegetales.

INTRODUCCIÓN

Los cromosomas de la célula están constituidos por cromatina y contienen información genética de su especie, la cual es necesaria para el funcionamiento de sus células, la morfogénesis de los organismos, así como su reproducción. Son estructuras visibles al microscopio compuesto solo durante la división celular mitosis o meiosis, en la interfase solo se aprecia en el núcleo delgados filamentos de cromatina. Los cromosomas contienen la información necesaria para los cambios del material genético, contenidos en ellos la variación, mutación y selección de los seres vivos.

La morfología del cromosoma se llama al aspecto externo que presenta en las etapas de la división celular. Estos se pueden clasificar en cuatro tipos de acuerdo con la forma que presentan durante la metafase y la anafase media.

• Telocéntricos. Centrómero ubicado en el extremo proximal, lo que da aspecto bastoniforme, el cromosoma tiene solo un brazo.

• Acrocéntricos. Centrómero ubicado en posición subterminal, lo que da lugar a la formación de un brazo muy corto.

• Submetacéntricos. Brazos desiguales en forma de J. • Metacéntricos. Brazos iguales o casi iguales en forma de V.


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El número de cromosomas es una constante que puede explicar la

individualidad a través de las generaciones celulares del individuo, hay excepciones sobre la variación del número de cromosomas. Los seres vivos constituyen un juego o complemento somático diploide de cromosomas originado por la unión de dos gametos: el espermatozoide y el ovulo, cada uno de los cuales aporta un juego de cromosomas, haploide o monoploide. El número somático o diploide en el hombre es de 46, formado por los juegos haploides de cada gameto, cada uno con 23 cromosomas. Cada juego haploide se designa por n y el diploide por 2n.

El cariotipo puede ser representado por un esquema que se denomina idiograma, basado en los valores promedios. Así pues, se considera un cromosoma metacéntrico si su índice brazo largo / brazo corto es 1, es decir, que presenta los dos brazos iguales.


� Muestra problema � Material de disección � Vaso de precipitado de 50mL � Tubos de ensaye de 13X100 � Porta y cubreobjetos � Mechero bunsen � Microscopio compuesto � Agua destilada � Acetato de Orceína al 1%

PROCEDIMIENTO

1.- Realizar el pre-tratamiento indicado por el instructor

2.- Colocar la muestra en un tubo de ensaye con acetato de orceína durante 20 minutos.

3.- Calentar ligeramente con el mechero bunsen.

4.-Sacar la muestra y cortar en forma transversal finamente.


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5.-Montar en portaobjetos y adicionar una gota de colorante.

6.- Poner el cubreobjetos y presionar la muestra con la ayuda de la goma de un lápiz nuevo (Squash).

7.- Fijar la muestra con la flama del mechero y esperar a enfriar para posteriormente observar al microscopio.

8.- Observar primero los contornos y después ir hacia el centro.

CUESTIONARIO

1.- ¿En que consiste la teoría cromosómica?

2.- ¿Qué es el cariotipo y que utilidad tiene en estudios genéticos?

3.- ¿En que consiste la amniocentesis?

4.- Describe dos desordenes genéticos humanos causados por mutaciones a nivel de gen y dos a nivel de cromosoma.

5.- Esquematiza el cariotipo de un vegetal.


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PRACTICA No. 3

“IDENTIFICACION DE CROMATINA X EN MUCOSA BUCAL”

OBJETIVOS:

El alumno conocerá la importancia de los estudios relacionados con la

cromatina X.

El alumno identificará corpúsculos de Barr (Cromatina X) en muestras de

mucosa bucal.

INTRODUCCIÓN

Los trabajos de Alfred Jost (1947) en los cuales castraba embriones macho de conejo después de la diferenciación de los testículos pero antes de la masculinización de los conductos mesonéfricos, demostraron que en ausencia de testículos el desarrollo de los embriones sigue un fenotipo hembra por lo tanto, en sentido embriológico, el fenotipo hembra puede considerarse como neutro. Las substancias que secretan los testículos fetales inician el desarrollo de los conductos mesonéfricos, y causan atrofia o regresión de los conductos de Müller; produciéndose así los caracteres masculinos. En la actualidad, sabemos que de existir el cromosoma Y, el fenotipo resultante es masculino, aun cuando existan también 2 o más cromosomas X. La supervivencia del embrión exige la presencia de un cromosoma X cuando menos, y son necesarios dos cromosomas X para un desarrollo ovárico normal. Si el único cromosoma sexual existente es de tipo X (XO), el fenotipo es femenino, pero la porción germinativa de los ovarios no se desarrolla.

En 1949 Barr y Bertram al estudiar neuronas de gato, observaron una diferencia entre los núcleos de células machos y hembras: sobre la cara interna de la membrana nuclear existía una pequeña masa de cromatina densa, en las células de las hembras, posteriormente se vio que este fenómeno ocurría en


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casi todos los tejidos del cuerpo. Barr reconoció (1951) que se encontraba asociado al borde interno de la membrana nuclear y debido a su asociación con el sexo femenino, se le denomino cromatina sexual, actualmente también se le conoce como corpúsculo de Barr, cromocentro, ó cromatina X.

Diferentes investigaciones reconocieron que mujeres con síndrome de Turner tenían cromatina negativa y que hombres con síndrome de Klinefelter presentaban cromatina positiva. Estudios posteriores demostraron que el corpúsculo de Barr puede ser único o múltiple y este último caso se debe al exceso de cromosomas X en un individuo. Esto llevo a formular una regla precisa: todos los cromosomas X supernumerios se inactivan y el número de cromatinas X observadas corresponden al número de cromosomas X presentes, menos uno. Posteriormente los estudios de Ohno en 1959 demostraron que la cromatina sexual corresponde a la condensación de uno de los cromosomas X en la mujer durante la interfase.

En 1961 Mary Lyon presentó su hipótesis para explicar la presencia de cromatina X. Propuso que, en el momento de aparecer por primera vez la cromatina sexual en el embrión femenino, un cromosoma X de cada célula se inactiva, y constituía la masa de cromatina sexual. Pensó también que esta inactivación era al azar, de modo que, por probabilidad en el 50% de las células el cromosoma X inactivado provenía del macho y el otro 50% de la hembra. De esta elección al azar, el mismo cromosoma X se seguirá inactivando en las células descendientes.


� Cubreobjetos y Portaobjetos � Mechero bunsen � Microscopio compuesto � Alcohol de 96º � Aceto-orceina


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PROCEDIMIENTO

1.- Realizar dos raspados de la cara interna de la mejilla con una pequeña espátula.

2.- Hacer un frotis con el segundo raspado y fijar con alcohol de 96º.

3.- Retirar el exceso de alcohol y teñir con aceto-orceina.

4.- Coloque el cubreobjetos y fije con la flama del mechero

5.- Observe al microscopio con los objetivos de 10, 40 y 100X, las células de la mucosa bucal e identifique la cromatina X.

CUESTIONARIO

1.- Describa la importancia de la cromatina X

2.- Indica otra metodología para la identificación de los cuerpos de Barr

3.- Menciona las ventajas y desventajas sobre la metodología realizada en mucosa bucal para la identificación de cromatina X

4.- Escriba 5 colorantes utilizados para la identificación de Cromosomas.

5.- Ordenar el cariotipo humano que se proporciona en la hoja anexa, e identificar si presenta alguna alteración, en que locus y a que síndrome se refiere.


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PRACTICA No. 4

“EXTRACCION Y PURIFICACION DE ADN DE CÉLULAS PROCARIOTES (E. coli)”

OBJETIVO:

El alumno realizará la extracción y purificación de ADN de células

procariotes (E. coli).

INTRODUCCIÓN

Podemos identificar a las células en dos tipos, procarióticas y eucarióticas. La principal diferencia entre ambos tipos es que las células procarióticas no tienen envoltura nuclear y su ADN ocupa en la célula un espacio denominado nucleoíde.

Es interesente señalar que gran parte de nuestro conocimiento actual en genética se origina en el estudio de virus y bacterias. Una célula bacteriana, como la Escherichia coli (E. coli) presenta un ADN con una sola molécula circular de 3,400,000 de pares de bases y una longitud total de 1.4 mm, comparado con la cantidad de ADN en el hombre, que es 700 veces mayor, es decir, el ADN de una sola célula diploide humana, completamente extendida, puede tener una longitud total de 1.7 m. Esta bacteria además, presenta la ventaja de su fácil cultivo, tiene un tiempo de generación corto y se adapta perfectamente a los estudios de laboratorio.

La extracción de ADN de una célula requiere la ruptura o lisis de la misma, la cual se consigue mediante métodos físicos o químicos. Posteriormente se realiza una extracción orgánica para precipitar todas las proteínas y restos celulares. Finalmente se precipita el ADN y se eliminan las sales.


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Los análisis moleculares requieren la obtención de altas concentraciones

de ADN puro con el fin de evitar errores posteriores, por lo que se debe tomar en cuenta la cantidad de muestra con que se cuenta. En el caso de cultivo bacteriano no debe ser mayor de 2X109 unidades formadoras de colonias (cfu) y para levaduras 2X107 cfu.


� Muestra de cultivo bacteriano (E. coli) � Solución de lisis � β-mercaptoetanol � Fenol saturado � Solución de SEVAG � Acetato de sodio 3M � Etanol � Micropipetas (2,10,100 y 1000µL) � Tubos eppendorf � Centrifuga

PROCEDIMIENTO

1.- Centrifugar la muestra problema a 2000rpm durante tres minutos.

2.- Tomar un alícuota de 100µL de precipitado y volver a centrifugar a 10,000rpm durante un minuto.

3.- Separar el precipitado y adicionar 100µL de la solución de lisis, 5µL de β-

mercaptoetanol y 250µL de fenol saturado, mezclar.

4.- Adicionar 250µL de solución SEVAG y mezclar vigorosamente.

5.- Centrifugar a 10,000rpm durante diez minutos.

6.- Separar la fase acuosa, adicionarle 35µL de acetato de sodio y mezclar.

7.- Agregar 1.5mL de etanol absoluto frío. Observar precipitado.

8.- Incubar una hora a -20ºC.


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9.- Centrifugar diez minutos a 10,000rpm.

10.- Separar el precipitado y adicionarle 200µL de etanol al 70% frío.

11.- Centrifugar a 10,000rpm por diez minutos.

12.- Decantar el etanol y dejar secar a temperatura ambiente.

13.- Disolver el precipitado en 40µL de agua tridestilada y cuantificar ADN por espectrofotometría.

CUESTIONARIO

1.- Investigar las características químicas y físicas de los reactivos utilizados en la práctica.

2.- ¿Cuál es la función del etanol en el procedimiento de la práctica?

3.- Explica las posibles fuentes de error en el procedimiento realizado.

4.- ¿Qué es un control negativo y como lo aplicaría en esta practica?


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PRACTICA No. 5

“EXTRACCION Y PURIFICACION DE ADN DE CÉLULAS EUCARIOTES”

OBJETIVO:

El alumno realizará la extracción y purificación de ADN de células

eucariotes.

INTRODUCCIÓN

El ácido desoxirribonucleico (ADN) se encuentra en todas las células de los seres vivos y contiene las unidades de la herencia conocidas como genes.

A los genes se deben las características visibles del organismo que en conjunto se conoce como fenotipo. El gen es la unidad de la herencia y su papel en el organismo se revela mediante cambios en el fenotipo llamados mutaciones, que ocurren cuando algunas de las secuencias del ADN del total de la constitución genética o genotipo del organismo es alterada, y se pierde o se modifica la función del gen codificado.

Estos genes se encuentran en las células eucariotes formando las estructuras macromoleculares: la cromatina o los cromosomas, estos últimos son la forma transitoria y mas condensada de la cromatina, que se hacen evidentes durante la división celular.

Este arreglo del ADN en forma de cromatina no solo sirve para empaquetar casi dos metros de ADN dentro de un núcleo de una célula, sino que también contribuye a regular la función de los genes.

En la década del setenta, el panorama de los estudios en biología molecular de genes eucariotes era incierto. La tremenda complejidad del genoma eucariótico (3 x 109 pares de bases por genoma humano haploide) constituían el principal obstáculo para iniciar estos estudios.


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El descubrimiento de las enzimas de restricción y la creación del

concepto de vehiculo molecular (vector) dio pie, al desarrollo de tres poderosos métodos de estudio directo de los genes eucarióticos: 1) determinación de la secuencia nucleotídica de genes, 2) detección y caracterización de secuencias génicas, por hibridación molecular, usando rastreadores radioactivos y 3) clonación molecular.

Actualmente, las técnicas de ADN son una de las herramientas más útiles en varios campos de la investigación, desde las pruebas de paternidad hasta la medicina forense.


� Muestra de sangre � Solución de lisis � β-mercaptoetanol � Fenol saturado � Solución de SEVAG � Acetato de sodio 3M � Etanol � Micropipetas (2,10,100 y 1000µL) � Tubos eppendorf � Centrifuga

PROCEDIMIENTO

1.- Centrifugar la muestra a 2500rpm durante tres minutos.

2.- Separar los glóbulos blancos y colocarlos en un tubo eppendorf

3.- Adicionar 100µL de la solución de lisis, 5µL de β-mercaptoetanol y 250µL de fenol saturado, mezclar.

4.- Adicionar 250µL de solución SEVAG y mezclar vigorosamente.

5.- Centrifugar a 10,000rpm durante diez minutos.

6.- Separar la fase acuosa, adicionarle 35µL de acetato de sodio y mezclar.


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7.- Agregar 1.5mL de etanol absoluto frío. Observar precipitado.

8.- Incubar una hora a -20ºC.

9.- Centrifugar diez minutos a 10,000rpm.

10.- Separar el precipitado y adicionarle 200µL de etanol al 70% frío.

11.- Centrifugar a 10,000rpm por diez minutos.

12.- Decantar el etanol y dejar secar a temperatura ambiente.

13.- Disolver el precipitado en 40µL de agua tridestilada y cuantificar ADN por espectrofotometría.

CUESTIONARIO

1.- Explica que es la paradoja del valor C

2.-Describe el procedimiento químico y enzimático, para la determinación de la secuencia de nucleotidos en un gen

3.- ¿Qué es un vector?

4.- Esquematiza el proceso de clonación

5.- ¿Cómo realizaría la extracción y purificación de ADN en una muestra de tejido animal?


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PRACTICA No. 6

“CORRIMIENTO ELECTROFORETICO DE ADN”

OBJETIVO

El alumno realizará el corrimiento electroforético de ácidos nucleicos

extraídos y purificados de diferentes tipos de muestras.

INTRODUCCIÓN

La electroforesis es una técnica analítica que permite la separación de moléculas como resultado de su diferente movilidad en un campo eléctrico debido a su carga/masa.

Esta técnica consta de una fase móvil y una estacionaria, la primera proporciona el medio amortiguador que permite la movilidad de las moléculas cargadas hacia los electrodos correspondientes cuando se genera un campo eléctrico. La fase estacionaria por su parte, es un gel con tamaño de poro homogéneo que se encuentra sumergido en la fase móvil. Existen diferentes tipos de geles, como son los de poliacrilamida, almidón y agarosa, siendo este último el más utilizado para el análisis de ácidos nucleicos (100pb- 10Kb).

Los ácidos nucleicos son moléculas cargadas negativamente, debido a la presencia de grupos fosfato en la estructura; por lo que la separación en el gel se lleva a cabo en base a la masa molecular de los fragmentos de ADN.

Transcurrida la electroforesis se lleva a cabo su detección mediante la tinción con bromuro de etidio y una posterior iluminación con luz UV, llegándose a observar bandas fluorescentes.

La electroforesis en gel de agarosa es una técnica muy empleada que permite separar los fragmentos de ADN, localizarlos en función de su peso molecular (por comparación con marcadores de peso molecular conocido) y


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puede llegar a permitir la extracción del fragmento de interés para posteriores aplicaciones.


� Muestras extraídas y purificadas de eucariontes y procariontes � Agarosa 1% � Buffer de corrimiento � Buffer de muestra � Bromuro de etidio � Agua tridestilada � Cámara electroforética � Fuente de poder � Micropipetas � Lámpara UV � Matraz Erlenmeyer de 250mL � Recipiente de plástico � Placa de vidrio � Tubos eppendorf

PROCEDIMIENTO

1.- Preparar el gel de agarosa al 1%

2.- Colocar el peine espaciador a una distancia aproximada de 1cm del borde del gel.

3.- Solidificar unos minutos y retirar el peine.

4.- Colocar el gel en la cámara de electroforesis y adicionar el buffer de corrimiento (frío) hasta tapar por completo el gel.

5.- En una placa preparadora de muestra se adicionará 3μL de buffer de muestra y 5μL de muestra problema a diferentes diluciones.

6.- Mezclar y adicionar 5μL en cada pozo.


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7.- Cerrar la cámara electroforética haciendo corresponder los polos. Colocar los pozos del lado negativo.

8.- Prender la fuente de poder y colocar el voltaje indicado por el profesor.

9.- Finalizado el corrimiento electroforético, colocar el gel en un recipiente con bromuro de etidio y agitar suavemente durante aproximadamente 5 minutos.

10.- Colocar el gel en una placa de vidrio para observar bajo la lámpara de UV.

CUESTIONARIO

1.- ¿Cual es la función del glicerol utilizado en el buffer de carga?

2.- Investigar las características y propiedades químicas del bromuro de etidio

3.- Explica porque se utiliza la luz UV para observar el corrimiento electroforético de ADN.

4.- ¿Porque se prefiere usar el gel de agarosa para la separación de ADN en vez de acrilamida?

5.- En base a los resultados obtenidos, ¿que cambios realizarías en el procedimiento de la practica?


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Bibliografía

1. Cole-Parmer 1999-2000. Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, IL. 1998.

2. Hackett, W.J. y Robbins, G.P. 1982. Manual Técnico de Seguridad. Representacionas y Servicios de Ingeniería, S.A., México.

3. The Merk Catalogue. Merk KgaA, Darmstadt, BRD. 1996.

4. The Merk Index. 12th ed. Merk KgaA, Darmstadt, BRD. 1996.

5. Short Protocols in Molecular Biology. 4th ed. M. Ausubel F, Brent R, et al. 1999.


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Unidad VI. Estructura Química de los Ácidos Nucléicos

Objetivo

El alumno explicara la estructura y función de las moléculas de ADN y ARN, para comprender la transmisión de la herencia en los seres vivos, cumpliendo así con el objetivo de la unidad.

Documents

Manual de Genetica Pmc Eleazar Serrano