CUPRINS

PREFAŢĂ................................................................................................................ 1

CAP. 1 - INTRODUCERE ÎN GENETICĂ............................................................. 31.1...................................................... Genetica - definiţie, obiect de studiu 31.2.......................................................................... Scurt istoric al geneticii 41.3............................................................. Legătura geneticii cu alte ştiinţe 81.4................................................. Metode de cercetare folosite în genetică 101.5......................................................... Materialul de cercetare în genetică 121.6............................................ Dezvoltarea geneticii vegetale în România 13

CAP. 2 - BAZELE CELULARE ALE EREDITĂŢII ŞIVARIABILITĂŢII (CITOGENETICA)’............................................. 15

2.1..................................................................... Structura celulei procariote 162.2...................................................................... Structura celulei eucariote 182.3....................................................... Organizarea genomului la eucariote 25

2.3.1.............................................................. Morfologia cromozomilor 252.3.2............................................ Structura moleculară a cromozomului 332.3.3.................................................... Tipuri particulare de cromozomi 36

2.4. Organizarea genomului la procariote (bacterii şi virusuri) 382.5............................................................................... Reproducerea celulei 39

2.5.1............................................................................................. Mitoza 392.5.2............................................................................................ Meioza 44

2.6..................................................................... Gametogeneza şi syngamia 482.6.1............................................................... Gametogeneza la animale 482.6.2......................................... Sporogeneza şi gametogeneza la plante 492.6.3........................................................................................ Syngamia 51

CAP. 3 - BAZELE MOLECULARE ALE EREDITĂŢII..................................... 539

3.1......................................................................... Proteine şi acizi nucleici 533.2...................................................... Dovezi privind rolul genetic al ADN 55

3.2.1............................................................ Transformarea la procariote

563.2.2................................................................. Transfecţia la procariote 573.2.3............................................................. Transformarea la eucariote 593.2.4............................................... Materialul genetic al ribovirusurilor 59

3.3........................................................... Acizii nucleici şi rolul lor genetic 60

3.3.1. Structura moleculară a acidului dezoxiribonucleic (ADN)......603.3.2......................................................................... Alte tipuri de ADN 633.3.3.............................................................. Acidul ribonucleic (ARN) 653.3.4.................................................... Denaturarea şi renaturarea ADN 683.3.5......................................................................... Specificitatea ADN 693.3.6.............................................................................. Replicaţia ADN 693.3.7. Replicaţia acizilor nucleici la bacterii şi virusuri 713.3.8. Sinteza acizilor nucleici "in vitro".......................................... 72

3.4............................................................................................. Codul genetic 73

3.4.1......................................................... Caracteristicile codului genetic 76

3.5............................................................................... Biosinteza proteinelor 77

3.5.1...................................................... Transcripţia informaţiei genetice 773.5.2......................................................... Translaţia informaţiei genetice 78

3.6........................................................ Reglajul genetic al activităţii genelor 80

3.6.1......................................... Reglajul activităţii genetice la procariote 813.6.2............................................ Reglajul activităţii genelor la eucariote 86

3.7................................................................. Noţiunea de genă şi evoluţia ei 89

3.7.1................................................... Gena în concepţia geneticii clasice 893.7.2............................................ Gena în concepţia geneticii moleculare 913.7.3...................................................... Gene suprapuse şi gene săritoare 93

3.8. Reproducerea şi recombinarea genetică la procariote 953.8.1............................................. Reproducerea bacteriilor şi virusurilor 953.8.2.................................................... Recombinarea genetică la bacterii 963.8.3.................................................... Recombinarea genetică la virusuri 100

CAP. 4 - NOŢIUNI DE INGINERIE GENETICĂ................................................ 1029

4.1.......................................................................... Sinteza artificială a genei 1034.2............................................................................................ Izolarea genei 1044.3...............................................................Transferul de gene (transgeneza) 105

4.3.1........................................ Principalii vectori utilizaţi în transgeneză 1094.3.2................................................... Realizări ale transgenezei la plante.............................................................................................................1094.3.3................................................. Transferul genelor fixatoare de azot.............................................................................................................110

4.4................................................................... Hibridarea celulară la animale...................................................................................................................1114.5..................................................................... Hibridarea celulară la plante...................................................................................................................1134.6........................................................ Haploidia prin androgeneză la plante...................................................................................................................115

CAP. 5 - EREDITATEA MENDELIANĂ..............................................................1175.1......................................... T erminologia folosită în genetica mendeliană...................................................................................................................1175.2................................................................ Legile mendeliene ale eredităţii...................................................................................................................118

5.2.1. Legea segregării caracterelor (legea purităţiigameţilor)..................................................................................119

5.2.2. Legea segregării independente a perechilor decaractere....................................................................................121

5.3............................... Probabilitatea şi raporturile mendeliene de segregare...................................................................................................................1235.4........................................ Mecanismul citologic al segregării caracterelor...................................................................................................................1265.5........................................................................... încrucişarea analizatoare...................................................................................................................127

CAP. 6 - INTERACŢIUNEA GENELOR............................................................. 1309

6.1. Abateri aparente de la raporturile mendeliene de segregare....130

6.1.1............................... Abateri aparente datorate interacţiunilor alelice.............................................................................................................1306.1.2........................... Abateri aparente datorate interacţiunilor nealelice.............................................................................................................138

6.2........................... Abateri reale de la raporturile mendeliene de segregare...................................................................................................................145

CAP. 7 - TEORIA CROMOZOMICĂ A EREDITĂŢII.........................................1489

7.1.................................................................................... Gene şi cromozomi 1487.2................................................... Plasarea liniară a genelor pe cromozomi 1507.3............................................. T ransmiterea înlănţuită a genelor (linkage) 1507.4.... Schimbul reciproc de gene între cromozomii omologi (crossing-over)

1527.5.............................................. Mecanismul citologic al crossing-over-ului 1537.6............................................................................. Tipuri de crossing-over 1567.7............................................... Factorii care influenţează crossing-over-ul 1607.8................................................................................. Hărţile cromozomice 1617.9....................................................................................... Hărţile citologice 163

CAP. 8 - DETERMINISMUL GENETIC AL SEXULUI......................................1658.1................................................................................................ Generalităţi...................................................................................................................1658.2...................................................... Teoria genetică a determinării sexului...................................................................................................................166

8.2.1............................................. Determinismul cromozomic al sexelor 166

8.3.................................................. Sexul în cazul înmulţirii partenogenetice...................................................................................................................1688.4............................................... Determinismul genetic al sexului la plante...................................................................................................................1698.5. Determinismul genetic al sexului la organismele inferioare... 1708.6................................................... Teoria cantitativă a determinării sexului 1718.7................................................................... Anomalii în ereditatea sexului 173

8.7.1.......................................................................... Ginandromorfismul.............................................................................................................1738.7.2................................................................................ Intersexualismul 174

8.8......................................................... Ereditatea caracterelor legate de sex...................................................................................................................175

8.8.1. Ereditatea legată de sex în cazul heterogamieisexului mascul (Drosophila).....................................................175

8.8.2. Ereditatea în cazul nondisjuncţiei cromozomilorsexului în meioză..................................................................... 177

8.8.3. Ereditatea legată de sex în cazul heterogamieisexului femel............................................................................178

8.9................................................................... Caracterele influenţate de sex...................................................................................................................1808.10...................................................................... Caracterele limitate de sex...................................................................................................................1808.11.................................................................................. Inversiunea sexului...................................................................................................................1808.12................................................................................ Raportul dintre sexe 181

CAP. 9 - EREDITATEA EXTRANUCLEARĂ.....................................................1839.1....................................... Metode de evidenţiere a eredităţii extranucleare...................................................................................................................183

9.1.1..................................................................... Fenomenul merogoniei.............................................................................................................1849.1.2.............................. Ereditatea extranucleară în hibridarea reciprocă.............................................................................................................1849.1.3........................................................................... Testul heterocarion.............................................................................................................1859.1.4................................................................. Segregarea nemendeliană.............................................................................................................185

9.2........................................................ Manifestarea eredităţii extranucleare...................................................................................................................186

9.2.1..................................................................... Ereditatea prin plastide.............................................................................................................1869.2.2. Ereditatea prin intermediul incluziunilor citoplasmatice....... 1879.2.3................................................................... Ereditatea mitocondrială 1889.2.4. Androsterilitatea citoplasmatică şi nucleo-plasmatică... 189

9.3.............................................. Aparatul genetic al eredităţii extranucleare 1929.4. Fenomene cu care se poate confunda ereditatea extranucleară....... 192

9.4.1................................................................................ Predeterminarea 1929.4.2...................................................................... Modificările de durată 1939.4.3........................................................................... Ereditatea aparentă 1949.4.4............................................................................. Alte surse de erori

1949.5.......................................... Raporturile genetice dintre genom şi plasmon...................................................................................................................1949.6..................................... Caracterele şi însuşirile influenţate de plasmotip 195

CAP. 10 - SISTEME GENETICE PENTRU CONTROLULREPRODUCERII ORGANISMELOR.............................................. 196

10.1. Ereditatea în cazul reproducerii asexuate şi sexuate 19610.2. Ereditatea în cazul unor forme particulare

de reproducere................................................................................ 19710.3...................................... Sisteme genetice pentru controlul reproducerii 19810.4................................................................ Vigoarea hibrizilor (heterozis) 200

10.4.1......................................... Teorii care explică fenomenul heterozis.............................................................................................................20110.4.2.............................................................. Manifestarea heterozisului.............................................................................................................20410.4.3. Consangvinizarea şi folosirea ei în crearea liniilor destinate

încrucişării..............................................................................20410.4.4.......................................................... Consangvinizarea la animale 207

10.5................................................................ Hibridarea sexuată îndepărtată...................................................................................................................208

10.5.1. Obţinerea şi comportarea primei generaţii hibride 20810.5.2............................... Comportarea celei de a doua generaţii hibride 21110.5.3. Rolul hibridării îndepărtate în evoluţia speciilor 211

CAP. 11 - MUTAŢIILE ŞI MECANISMUL LOR MOLECULAR. .. 21311.1............................................................................. Clasificarea mutaţiilor 21311.2............................................................................... Detectarea mutaţiilor 21511.3................................................................................... Mutaţiile spontane 21711.4.................................................................................. Mutaţiile artificiale 219

11.4.1........................................................................ Radiaţiile mutagene 22011.4.2.................................................................................... Temperatura.............................................................................................................22411.4.3....................................................... Substanţele chimice mutagene.............................................................................................................22511.4.4............................................................. Factorii mutageni biologici.............................................................................................................229

11.4.5............................................... Mecanismul molecular al mutaţiilor.............................................................................................................229

11.5............................................................... Mecanisme de reparare a ADN...................................................................................................................23111.6.............................................................................. Importanţa mutaţiilor...................................................................................................................232

CAP. 12 - MUTAŢII ÎN STRUCTURA CROMOZOMILOR................................2339

12.1. Tipuri de restructurări cromozomice şicomportarea lor în mitoză................................................................234

12.2. Restructurările cromozomice şi mecanismul meiozei 23912.3.................................................................................... Efectul de poziţie 24412.4. Restructurările cromozomice şi importanţa lor pentru evoluţie... .245

CAP. 13 - MUTAŢIILE DE GENOM....................................................................2479

13.1........................................ Clasificarea variaţiilor numeric cromozomice...................................................................................................................24813.2................................................................................................. Euploidia...................................................................................................................249

13.2.1................................................................................... Monoploidia.............................................................................................................24913.2.2...................................................................................... Poliploidia.............................................................................................................250

13.3. Modificările morfologice şi fiziologiceale poliploizilor...............................................................................254

13.4............................................... Poliploidia naturală şi rolul ei în evoluţie 25513.5............................................................................... Poliploidia artificială 25713.6............................................................................. Poliploidia la animale 25913.7............................................................................................. Aneuploidia 25913.8.................................................................................... Pseudopoliploidia 261

CAP. 14 - ELEMENTE DE GENETICA POPULAŢIILOR................................. 2639

14.1............................................................................. Noţiunea de populaţie...................................................................................................................26314.2. Metodele folosite în studiulgeneticii populaţiilor 26414.3.......................................................... Structura genetică a unei populaţii...................................................................................................................26514.4. Panmixia şi structura genetică a populaţiilor,

legea Hardy - Weinberg..................................................................265

14.5.............................................................. Frecvenţa genelor legate de sex...................................................................................................................26814.6.......................................... Frecvenţa genelor în cazul a mai multor loci...................................................................................................................27014.7.......................................... Frecvenţa genelor în cazul înlănţuirii locilor...................................................................................................................27014.8........................................... Frecvenţa genelor în cazul alelelor multiple...................................................................................................................27114.9. Factorii care modifică structura genetică a populaţiilor 272

14.9.1.......................................................................... Selecţia...................................................................................................27214.9.2.......................................................................................... Migraţia.............................................................................................................27314.9.3........................................................................................... Mutaţia.............................................................................................................27414.9.4............................................................................... Drift-ul genetic.............................................................................................................27514.9.5. Factorii care modifică frecvenţa genotipurilor

într-o populaţie.......................................................................27614.9.6............................... Homeostazia genetică şi evoluţia populaţiilor.............................................................................................................276

GLOSAR................................................................................................................ 278

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ...............................................................................295Prefaţă

9

Tot mai mulţi oameni de ştiinţă susţin că, la începutul mileniului trei, putem percepe derularea unei revoluţii genetice care, prin realizările din acest domeniu, generează optimism în unele medii ştiinţifice dar şi pesimism, în altele.

Anul 2000 a fost considerat anul genomului uman. S-a reuşit descifrarea acestuia, dar au fost raportate şi multe alte realizări în diferite domenii ale biologiei, cărora genetica le-a furnizat informaţii. În toate domeniile geneticii (microbian, vegetal, animal, uman) s-au produs "mutaţii” profunde în înţelegerea mecanismelor de stocare codificată a informaţiei şi de "traducere” a acesteia în miliardele de molecule ale unui organism.

Dacă la începuturi, genetica era "fericită” să explice ereditatea şi variabilitatea organismelor prin acel "dans al cromozomilor”, astăzi, aceste însuşiri esenţiale ale lumii vii sunt explicate la nivel molecular, printr-un "joc al moleculelor” unde hazardul are loc din ce în ce mai puţin.

Acest manual încearcă o parcurgere succintă a drumului informaţiei genetice, în limita programei analitice a cursului de Genetică vegetală, predat de autor studenţilor de la facultăţile de Agricultură şi

Horticultură pe parcursul unui semestru.Am abordat, de la început, bazele celulare şi moleculare ale

eredităţii şi variabilităţii cu gândul că tinerii studenţi, cu mintea "iscoditoare” vor accepta, în final, că toate aspectele geneticii clasice (segregarea caracterelor, recombinarea, mutaţiile, heterozisul etc.) pot fi, şi trebuie explicate, la nivel molecular.

Nu ne-am propus tratarea în detaliu a tuturor domeniilor geneticii. Complexitatea şi multitudinea lor, rapiditatea cu care se succed realizările în această ştiinţă fac imposibil acest demers.

Măsura în care am reuşit prezentarea sintetică acunoştinţelor despre microcosmosul ce-l reprezintă un organism unicelular sau multicelular, rolul fiecăruia între celelalte, ne-o va da cititorul, căruia îi mulţumim.

AutorulCAPITOLUL 1

INTRODUCERE ÎN GENETICĂ

1.1. GENETICA - DEFINIŢIE, OBIECT DE STUDIU9 7

Genetica, definită succint, este ştiinţa eredităţii şi variabilităţii organismelor.Termenul genetică provine din grecescul gennaein care înseamnă “a naşte” şi

este atribuit ştiinţei eredităţii şi variabilităţii, în anul 1905, de englezul William Bateson (1861-1926), la cea de a treia Conferinţă internaţională de hibridare şi ameliorare a plantelor de la Londra.

Ereditatea (latinescul hereditas-“moştenire”) este o însuşire esenţială a organismelor, care denotă asemănarea dintre părinţi şi urmaşi (descendenţi). Indiferent de gradul de evoluţie al organismelor (procariote sau eucariote), informaţia genetică este codificată în acizii nucleici (ADN sau ARN ), care intră în structura cromozomilor părinţilor, iar în urma proceselor de replicaţie, de tip semiconservativ, este transmisă la descendenţi.

Diviziunea celulară, replicaţia acizilor nucleici, transcripţia şi translaţia informaţiei genetice, asigură constanţa caracterelor ereditare, dar această constanţă nu trebuie apreciată la modul absolut. Ca funcţie biologică, ereditatea în general, dar mai ales a unor caractere morfo-fiziologice, biochimice şi de comportament, este influenţată, într-o măsură oarecare, de factorii de mediu. Aceste interacţiuni ale informaţiei genetice cu factorii mediului, determină apariţia unor deosebiri de ordin calitativ sau cantitativ, între indivizii aceleiaşi unităţi sistematice, totalitatea acestora, fiind denumită variabilitate.

Variabilitatea, ca însuşire generală a lumii vii, poate fi determinată de structura celulei - variabilitate intraindividuală, de diferenţele dintre indivizii unei grupări sistematice restrânse (populaţie) - variabilitatea individuală, sau de deosebirile dintre

diferite populaţii - variabilitate de grup.Variabilitatea este determinată, pe de o parte de factorii genetici (mecanismele

de recombinare intra şi intercromozomice şi prin mutanţi), dar şi de factori de mediu (fizici, chimici sau biologici). Dacă în primul caz, putem afirma că variaţiile genetice se transmit cu mare fidelitate la urmaşi, variaţiile determinate de factorii de mediu pot provoca modificări temporare, care de obicei nu se transmit în descendenţă.

Obiectul de studiu al geneticii s-a diversificat, pe măsura abordării eredităţii şi variabilităţii de la nivel individual la nivel molecular. Azi, distingem în mod curent, domenii ca: genetica clasică (fenomenologică), care studiază modul de transmitere a caracterelor de la un individ la altul; genetica moleculară, studiază ereditatea la nivel molecular, de la structura moleculară a genei, până la mecanismele de codificare şi decodificare a informaţiei genetice, dar şi mutaţiile şi recombinările genetice la acest nivel; genetica dezvoltării individuale

3

4

(ontogenetica) care îşi propune cunoaşterea începerii şi sistării activităţii genelor, a mecanismelor de diferenţiere celulară, a celor de reglaj genetic; genetica populaţiilor, studiază frecvenţa genelor şi genotipurilor în vederea realizării unui echilibru genetic, modificările acestora pe termen lung (evoluţie); ingineria genetică, care are un domeniu din ce în ce mai amplu, de la izolarea şi sinteza artificială a genelor la transferul interspecific al acestora, clonarea genelor, a organismelor, hibridarea celulelor somatice, obţinerea de organisme transgenice.

Dacă ne referim la grupe distincte de organisme, cercetările de genetică, se realizează la plante (genetică vegetală), la animale (genetică animală), la microorganisme (genetică microbiană), la om (genetică umană).

Amploarea cercetărilor de genetică moleculară depăşeşte orice imaginaţie. Nu exagerăm dacă afirmăm că, genetica a realizat o coeziune a tuturor ştiinţelor biologice, prin tratarea unitară a sistemului ereditar, care permite explicarea oricărui proces biologic.

În concluzie prin prisma geneticii moleculare, genetica se ocupă cu studiul genelor: codificarea şi decodificarea informaţiei genetice (corectă sau eronată), reglajul activităţii genice la nivel molecular şi individual, recombinările şi mutaţiile genice, identificarea şi sinteza genelor şi transferul acestora peste barierele de specie.

1.2. SCURT ISTORIC AL GENETICII

Primele observaţii referitoare la asemănările şi deosebirile dintreindivizii aceleiaşi grupări sistematice, datează din cele mai vechi timpuri.

În timp s-au conturat două concepţii diferite, ce au încercat să dea o explicaţie concretă asupra transmiterii caracterelor de la părinţi la urmaşi şi asupra variabilităţii caracterelor: transmiterea directă a caracterelor şi transmiterea indirectă a acestora.

Concepţia clasică a transmiterii directe a caracterelor, susţineaparticiparea unor substanţe sau particule, sintetizate de diferite părţi aleorganismului, la formarea şi transmiterea directă a caracterelor, de la părinţi laurmaşi.

Această concepţie o găsim formulată în diferite moduri, chiar în perioada antică, în gândirea unor filozofi, particulele materiale, responsabile de transmiterea caracterelor ereditare, primind diferite denumiri: gemule, micele, plastidule etc.

Anaxagora (500-428 î.e.n.) a formulat prima teorie preformistă, conform căreia în celulele sexuale mascule, se formează organismul în miniatură (homunculus), dezvoltarea sa ulterioară fiind simple acumulări cantitative. Hippocrates (460-377 î.e.n.), cel mai mare medic al antichităţii, în privinţa eredităţii a elaborat teoria pangenezei (panspermiei), ce susţine participarea tuturor părţilor corpului în formarea substanţei ereditare, care, se acumulează în celulele sexuale ale părinţilor. Aristotel (384-322 î.e.n.), cel mai mare filozof al antichităţii, în domeniul eredităţii, a elaborat teoria hematogenă a spermei, conform căreia, sângele stă la baza originii şi transmiterii caracterelor ereditare de la o generaţie la alta. Galenos (129-199 e.n.), anatomist, medic şi filozof grec, a observat şi demonstrat participarea în egală măsură a celor două sexe la transmiterea caracterelor la descendenţi, explicând prin acesta, apariţia unor caractere intermediare a hibrizilor, faţă de cei doi părinţi.

Sfârşitul secolului XVI este marcat, în domeniul biologiei de inventarea microscopului (Z. şi H. Jansen - 1590), ceea ce a constituit începutul apariţiei citologiei şi

5

embriologiei, cu implicaţii directe în conturarea geneticii ca ştiinţă de sine stătătoare.In anul 1667, fizicianul englez R. Hooke în lucrarea “Micrographia" descrie

pentru prima dată celula, iar în anul 1831, R. Brown, a descoperit nucleul în celulele orhideelor.

Intr-un interval de timp relativ scurt, pe baza datelor acumulate de citologie, M. Schleiden (1838) şi Th. Schwann (1839), au elaborat teoria celulară, potrivit căreia, unitatea structurală şi funcţională a corpului plantelor şi animalelor este celula. Descoperirea diviziunii mitotice (W. Flemming, 1882) şi a diviziunii meiotice la plante (L. Guignard, 1891), au permis studiul cromozomilor, denumiţi astfel de W. Waldeyer (1888).

Deşi citologia înregistra progrese în studiul structurii celulei, în domeniul strict al geneticii, secolul XIX a fost dominat de teoriile corpusculare ale eredităţii. Aceste teorii încercau o explicaţie a eredităţii, prin existenţa unor particule materiale (corpusculi), existente în fiecare celulă, ţesut sau organ, care se acumulează în celulele organismului iar în urma fecundării difuzează în noul organism. Aceste particule materiale, diferă ca mărime, structură, funcţie şi denumire, de la o teorie la alta. Charles Darwin (1809-1882), formulează teoria pangenezei (1868), conform căreia caracterele se transmit prin intermediul gemulelor, care se formează în tot corpul, apoi migrează în celulele sexuale, iar prin acestea se transmit la urmaşi.

Teoria plastidulelor, formulată de Ernst Haeckel (1834-1919) a fost elaborată în anul 1876. Plastidulele, sunt molecule complexe, care au capacitatea de a se reproduce.

Karl Wilhelm Nageli, în anul 1884, a formulat teoria miceliană, potrivit căreia, particulele materiale, denumite micele sunt prezente numai în idioplasmă (plasma ereditară), sunt capabile de autoreproducere, trofoplasma (plasma nutritivă), nefiind implicată în ereditate.

Cea mai complexă teorie corpusculară a fost teoria continuităţii plasmei germinative, formulată în anii 1875-1876, definită în anul 1902 de zoologul german August Weismann (1834-1914). A preluat de la K. W. Nageli, împărţirea corpului în două părţi distincte: ideoplasma (plasma germinativă) şi trofoplasma (plasma nutritivă). Teoria lui A. Weismann, admite existenţa unor particule materiale, de diferite mărimi, cu anumite funcţii în ereditate, prezente numai în plasma germinativă, plasma nutritivă nefiind implicată în ereditate. Plasma germinativă este structurată în particule complexe denumite idante, prezente în nucleul celulelor, acestea se structurează în unităţi mai simple, ide, iar idele conţin particule elementare numite determinanţi, care participă la formarea şi transmiterea fiecărui caracter ereditar.

Plasma germinativă se separă de cea nutritivă, chiar la prima diviziune a celulei ou (zigotului). Celulele germinale (gameţii), se formează numai din plasma germinativă, transmiţându-se, ca atare, la descendenţi, în timp ce, trofoplasma nu are decât rol nutritiv.

Teoriile corpusculare au avut meritul că au intuit un suport material al eredităţii, particulele materiale având capacitatea de a se autoreproduce şi de a se transmite la descendenţi.

Prima teorie care explică transmiterea indirectă a caracterelor ereditare a fost teoria factorilor ereditari, elaborată de Johann Gregor Mendel (1822-1884). Experienţele de hibridare la mazăre , devenite celebre, i-au permis lui G. Mendel să formuleze cele două legi ale eredităţii: legea segregării caracterelor şi legea segregării independente a perechilor de caractere. Factorii ereditari intuiţi de Mendel, sunt particule elementare,

6

responsabile de formarea şi transmiterea caracterelor, se găsesc în celulele somatice sub formă de perechi, iar în celulele sexuale, sub formă simplă. În urma fecundării gameţilor, după legile hazardului, factorii ereditari se combină, (ca apoi să se separe în procesul de meioză), rezultând o mare diversitate de indivizi.

Cercetările lui G. Mendel, sintetizate în lucrarea “Versuche uber Pflanzenhybriden” (“Experienţe asupra hibrizilor la plante"), publicate în anul 1866, au rămas necunoscute până în anul 1900, când au fost redescoperite de Hugo de Vries (1848-1935) (Olanda), Carl Correns (1864-1933) (Germania) şi Erich Tschermak (1871-1962) (Austria), independent unul de celălalt. Anul 1900, este considerat anul apariţiei geneticii ca ştiinţă biologică.

In anul 1905, William Bateson (1861-1926), propune denumirea de genetică, pentru noua ştiinţă biologică, care are ca obiect de studiu, ereditatea şi variabilitatea organismelor.

Wilhelm L. Johannsen (1857- 1917), în anul 1909, propune termenii de: genotip (totalitatea genelor unui individ), fenotip (totalitatea caracterelor şi însuşirilor unui individ) şi genă (particulă materială care determină apariţia unuia sau a mai multor caractere).

începutul secolului XX este marcat de o dezvoltare rapidă a citologiei, care precizează rolul structurilor celulare în viaţa celulelor şi a organismelor, urmând apoi, descoperirea rolului genetic al unor componente celulare, care a însemnat un nou domeniu, respectiv citogenetica.

Bazele citogeneticii, ştiinţă de contact între genetică şi citologie, au fost puse de Thomas Hunt Morgan (1866-1945), în urma elaborării teoriei cromozomice a eredităţii. Această teorie, presupunând plasarea liniară a genelor în cromozomi, transmiterea înlănţuită a genelor (linkage) şi schimbul reciproc de gene între cromozomii omologi (crossing-over), a permis apoi alcătuirea primelor hărţi cromozomice la plante şi animale.

Iată unele din marele descoperiri ale geneticii, majoritatea fiind încununate cu premiul Nobel, din perioada ultimelor decenii:

O. T. Averi, C. M. Mac Leod şi M. Mc Carty (1944) demonstrează că substanţa chimică a materialului genetic din cromozomi este acidul dezoxiribonucleic (ADN).

M. Delbruck, W. T. Bailey (1946), J. Lederberg şi E. L. Tatum (1946) descoperă recombinarea genetică, primii la bacteriofagi şi ceilalţi la bacterii.

J. D. Watson şi F. H. C. Crick (1953) descoperă structura acidului dezoxiribonucleic.

S. Benzer (1955) determină structura fină a cromozomului fagic şibacterian.

F. Jacob, J. Monod şi Andre Lwoff (1961), presupun existenţa acidului ribonucleic (ARN) mesager care transportă informaţia genetică de la ADN la ribozomii din citoplasmă şi descriu mecanismul de reglaj al biosintezei enzimelor la procariote.

S. Ochoa, W. Nirenberg şi H. G. Khorana (1966) au descifrat codulgenetic.

R. H. Holley (1968) pentru prima oară reuşeşte să izoleze gene.H. G. Khorana (1970) realizează sinteza unei gene specifice.

Earl Wilbur Sutherland Jr. - mecanismul de tip hormonal, molecula de tip AMP ciclic (AMPc) prin intermediul căreia, numeroşi hormoni, dar şi alte substanţe acţionează asupra celulei (premiul Nobel în 1971).

Albert Claude, George Emil Palade, Christian de Duve, completează prin noi descoperiri, organizarea structurală şi funcţională a celulei eucariote (mitocondriile - centrul respiraţiei celulare, ribozomii - centre de sinteză a proteinelor, biogeneza membranelor, lizozomii şi peroxizomii), (premiul Nobel în anul 1974).

Renato Dulbecco, Howard Martin Temin şi David Baltimore, descoperă interacţiunile dintre virusurile tumorale şi materialul genetic al celulei. Dogma centrală a geneticii, ADN - ARNm -proteină este modificată, descoperindu-se reverstranscriptazele, se demonstra că, ARNv poate fi transcris în ADN (premiul Nobel în 1975).

Werner Arber, Daniel Nathans şi Hamilton O. Smith, descoperă enzimele de restricţie, adevărate “bisturie moleculare” care secţionează molecula de ADN în situsuri de recunoaştere precise, deschizând etapa manipulărilor genetice, având ca efect modificarea structurii genetice a unui organism (ingineria genetică) (premiul Nobel în 1978).

Jean Dausset, George Snell şi Baruj Benacerraf, descoperă structura suprafeţelor celulare genetic determinate, care regizează reacţiile imunologice (premiul Nobel în anul 1980).

Barbara Mc Clintock, este laureată a premiului Nobel (1983) pentru descoperirea “elementelor mobile” de reglare a genomului (transpozoni), implicate în dezvoltarea organismelor; existenţa “elementelor mobile” a fost semnalată încă din anul 1950, dar această descoperire nu a atras atenţia geneticienilor vremii, care considerau că “genomul este foarte stabil, chiar rigid”.

Susumu Tonegawa, descoperă principiul genetic care generează diversitatea anticorpilor - a “descifrat unul din cele mai mari mistere ale

7“maşinăriei moleculare” din organismul uman: în timp ce întreg genomul uman conţine circa 100.000 gene, organismul este capabil să producă în jur de un bilion de tipuri deferite de anticorpi”. (premiul Nobel în anul 1987) (V. Rusu, 1996).

Michael Bishop şi Harold Varmus au descoperit originea celulară a

8

oncogenelor retrovirale (premiul Nobel în anul 1989).Erwin Neher şi Bert Sakman, descoperă tehnica patch - clamp, care permite

măsurarea activităţii individuale a canalelor ionice membranare, metodă care permite explicarea a numeroase procese celulare (excitabilitate, contractilitate, secreţia, transportul transmembranar al moleculelor, fecundarea etc.) (premiul Nobel în anul 1991).

Edmond H. Fischer şi Edwin G. Krebs, descoperă procesul de fosforilare reversibilă a proteinelor ca mecanism general de reglare biologică, conturându-se o imagine aproape completă asupra rolului fosforilării reversibile a proteinelor în funcţionarea celulei (premiul Nobel în 1992).

Richard Roberts şi Phillip Sharp, au fost laureaţi ai premiului Nobel în 1993 pentru descoperirea genelor cu structură discontinuă: genele organismelor superioare sunt alcătuite din fragmente informaţionale denumite exoni, separate de porţiuni noninformaţionale denumite introni.

In 1994, premiul Nobel a fost acordat pentru descoperirea proteinelor G, profesorilor Martin Rodbell şi Alfred G. Gillman (S.U.A.).

Edward B. Lewis, Christiane Nuesslein - Voehard şi Eric F. Wieschaus, au fost distinşi cu premiul Nobel în 1995, pentru descoperirea controlului genetic al dezvoltării precoce a embrionului; mecanismele moleculare responsabile de morfogeneza tuturor animalelor sunt universale.

Peter C. Doherty şi Ralf M. Zinkernagel, au descoperit specificitatea apărării şi imunităţii, mediate de celulă (premiul Nobel în 1996).

Stanley B. Prusiner, a fost laureat al premiului Nobel în anul 1997, pentru descoperireaprionilor - un principiu nou al infecţiei.

Guten Blobel, a descoperit că “proteinele au semnale intrinsece care guvernează transportul şi localizarea lor în celulă” (premiul Nobel în 1999).

In anul 2001, Leland Hartwell, Tim Hunt şi Paul Nurse au fost laureaţi ai premiului Nobel pentru cercetarea celulei canceroase.

1.3. LEGĂTURA GENETICII CU ALTE ŞTIINŢE

Pentru a studia problemele pe care le implică ereditatea, genetica se serveşte de o serie de discipline:

Evoluţionismul, ce studiază procesul de evoluţie în lumea vieţuitoarelor, de la apariţia lui până în ziua de astăzi, legile după care organismele vii au apărut şi s-au modificat în decursul vremurilor. Se ocupă de acea parte a biologiei care se mai numeşte şi filogenetică (de la phyle - neam, gen şi genesis - naştere, origine). Fiziologia se ocupă cu studiul fenomenelor vitale ce au loc în organismele vegetale şi animale. Intre metabolism şi procesele vitale este o strânsă legătură, iar partea de genetică care se ocupă cu modul de acţiune al

9

factorilor ereditari pentru realizarea caracterelor, se mai numeşte şi genetică fiziologică. Botanica şi zoologia se ocupă cu studiul plantelor şi a animalelor şi ne ajută să determinăm caracterele, însuşirile şi variabilitatea lor, furnizându-ne noţiuni de morfologie şi anatomie vegetală şi animală. Pe baza acestor date putem clasifica formele noi, studiul cu care se ocupă sistematica. Sistematizarea indivizilor are la bază asemănările şi deosebirile din interiorul fiecărui grup, care se menţine prin existenţa unui mecanism ereditar. Citologia studiază celula, unitatea de bază a organismelor vii. Ea ne dă posibilitatea de a descoperi baza materială a eredităţii şi structurile celulare cu rol în ereditate. Biochimia şi biofizica sunt ştiinţe care se ocupă cu procese fizice şi chimice ce au loc în materia vie şi legătura lor în cadrul metabolismului. Ele ne ajută să studiem structurile chimice şi fizice care răspund de ereditatea organismelor. O foarte strânsă legătură există între genetică şi ameliorarea plantelor şi animalelor, cea dintâi constituind baza teoretică a celei de a doua. Nu putem crea rase noi de animale şi soiuri noi de plante, dacă nu le cunoaştem legile după care se pot crea. Genetica a descoperit aceste legi pe baza cărora ameliorarea elaborează metode practice de îmbunătăţire şi creare de soiuri şi rase. Microbiologia, studiază viaţa microorganismelor. Cu ajutorul lor s-au adus contribuţii serioase la identificarea, descrierea şi funcţiile materialului genetic.

Colaborarea strânsă dintre genetică şi celelalte ramuri ale ştiinţelor a dus la apariţia de noi ramuri ale geneticii.

Din colaborarea geneticii cu citologia s-a născut citogenetica. Ea studiază structurile şi funcţiile celulare ce stau la baza fenomenelor ereditare. Din colaborarea geneticii cu fizica nucleară s-a născut genetica radiaţiilor, care cercetează influenţa radiaţiilor ionizante şi neionizante asupra bazei materiale a eredităţii. Din colaborarea geneticii cu biochimia s-a născut genetica moleculară, care studiază fenomenele biochimice ale eredităţii la nivelul molecular. Din colaborarea geneticii cu sistematica s-a născut genetica populaţiilor, al cărui obiect de studiu este structura genetică a populaţiilor de plante şi animale şi factorii care o modifică. Din colaborarea geneticii cu medicina s-a născut genetica umană, de mare importanţă pentru prevenirea şi combaterea bolilor ereditate la om.

Am enumerat principalele ramuri ale ştiinţelor cu care genetica colaborează. Mai sunt şi alte ştiinţe care aduc geneticii mari servicii, cum sunt de exemplu matematica şi altele.

Genetica are un vast câmp de activitate. În afară de agricultură, zootehnie, medicină veterinară, silvicultură, s-a interferat cu toate ramurile biologiei. După domeniile mari în care se studiază fenomenul de ereditate deosebim genetica vegetală, animală, umană, microbiană ş.a.

Simplele observaţii asupra modului de transmitere a caracterelor şi însuşirilor ereditare, au generat o multitudine de ipoteze care încercau să explice, în diferite moduri, ereditatea şi variabilitatea organismelor vii.

Iniţierea, perfecţionarea metodelor şi tehnicilor de cercetare specifice, au determinat apariţia şi extinderea geneticii ca ştiinţă, în rândul celorlalte ştiinţe biologice. Aceste metode de cercetare, cronologic vorbind, au determinat abordarea aspectelor legate de ereditate şi variabilitate, de la nivel individual, la nivel populaţional şi mergând apoi spre nivelurile celular şi molecular.

Principalele metode de cercetare folosite în genetică sunt: metoda hibridologică (hibridarea experimentală), metoda biometrică, metoda analizei genealogice, metoda

1.4. METODE DE CERCETARE FOLOSITE ÎN GENETICĂ

10

citogenetică, metoda biochimică şi biofizică, metoda ontogenetică, metoda culturilor de celule şi embrioni, metoda ADN - recombinat.

Metoda hibridologică constă în încrucişarea dintre indivizi ce posedă caractere ereditare distincte, urmată de analiza modului de manifestare a acestora, la indivizii din diferite generaţii. In generaţiile segregante (F2, F3,...Fn) se analizează statistic modul de manifestare a caracterelor luate în studiu. Hibridarea s-a utilizat de multă vreme ca metodă de obţinere a unor forme noi, dar bazele teoretice ale acesteia au fost stabilite de Johann Gregor Mendel, de aceea metoda hibridologică se mai numeşte analiză genetică mendeliană. Aşa cum a procedat şi Gr. Mendel, indivizii ce urmează a se încrucişa, sunt studiaţi în prealabil, câteva generaţii, pentru a vedea dacă caracterele luate în studiu se transmit constant, cu alte cuvinte, dacă organismele sunt homozigote pentru celelalte caractere.

Structura genetică a organismelor luate în studiu, fenomenele linkage şi crossing-over se pot stabili printr-o încrucişare analizatoare (retroîncrucişare, backcross), când hibrizii cu caractere dominante se încrucişează cu un individ homozigot recesiv (tester).

Metoda biometrică, aplicată iniţial la caracterele calitative s-a extins şi în domeniul caracterelor cantitative, în cadrul unui grup mai restrâns sau mai mare de indivizi. Legilor mendeliene ale eredităţii, le-au urmat tezele teoriei cromozomice ale eredităţii, T. H. Morgan tot pe baza statisticii, stabilind modul de interacţiune dintre gene, probabilitatea recombinărilor inter şi intracromozomice, poziţia şi distanţa dintre gene, în cadrul hărţilor cromozomice.

Metoda analizei statistice s-a extins şi în analiza modului de transmitere a caracterelor cantitative, conturându-se un domeniu foarte important al geneticii, genetica cantitativă. Pe baza măsurătorilor biometrice (mărimea şi greutatea fructelor, numărul seminţelor pe plantă, cantitatea de lapte la taurine, numărul de ouă la păsări etc.) se calculează o serie de valori biometrice, care dau indicaţii deosebit de importante privind: interacţiunea genotip-mediu în exprimarea fenotipică a acestor caractere şi tipurile de interacţiuni genice, corelaţiile dintre diferite caractere, gradul de repetabilitate a acestora pe parcursul mai multor generaţii.

Studiul matematic se aplică şi în genetica populaţiilor (naturale sau artificiale), obiectul acestei ramuri a geneticii fiind studiul frecvenţei genelor şi genotipurilor dintr-o populaţie şi cauzele ce determină modificarea echilibrului acestora.

Metoda citogenetică, studiază componenţii celulari implicaţi în ereditate, în mod direct sau indirect (cromozomii şi evoluţia lor în timpul diviziunii celulare, plastidele, mitocondriile, plasmidele etc.) şi efectul unor agenţi mutageni asupra acestor componenţi. Metoda citogenetică s-a perfecţionat pe măsura noilor cuceriri ale fizicii optice şi electronice, ce au dus la modernizarea diferitelor tipuri de microscoape (de la cele optice până la cele electronice). In ultimul timp se utilizează şi alte metode de studiu a materialului genetic: cromatografia de diferite tipuri, cristalografia, autoradiografia, citofotometria şi difracţia în raze X.

Cercetările de citogenetică corelează modificările materialului genetic la nivel celular, cu modificările caracterelor ereditare ale organismelor, aducând numeroase informaţii privind activitatea genelor, grupelor de gene, a cromozomilor sau a altor componente celulare.

Metoda biofizică şi biochimică. In ultimul timp, materialul genetic a putut fi

11

studiat în imensa sa complexitate şi din punct de vedere fizico-chimic. Arhitectura structurală deosebit de complexă a moleculelor de ADN şi ARN de diferite tipuri, a fost descifrată prin metode biofizice şi biochimice. Perfecţionarea microscopului electronic, izolarea componentelor celulare prin ultracentrifugare, analiza lor prin autoradiografie, microcinematografie, analiza componenţei atomice, moleculare şi spaţiale ale acizilor nucleici sunt realizări recente ale biofizicii şi biochimiei.

Metoda biofizică şi biochimică studiază şi efectul diverşilor agenţi mutageni asupra materialului genetic, vorbindu-se frecvent de o genetică a radiaţiilor, iar genetica moleculară constituie un domeniu fără de care, azi, nu putem explica nici un aspect la eredităţii, dacă nu acceptăm stocarea informaţiei genetice în molecule de ADN (sau ARN-v), copierea unor mesaje mai scurte sau mai lungi, în molecula de ARNm şi transmise neschimbat de la o celulă la alta, de la o generaţie la alta.

Metoda ADN recombinat. Constituie metoda cea mai modernă de studiu a geneticii care reuneşte cele mai rafinate tehnici de lucru, pentru izolarea moleculelor acizilor nucleici sau numai a unor segmente din aceşti acizi şi realizarea de molecule hibride ale acestora.

Izolarea genei, sinteza artificială a genei, inserţia genelor într-o serie de vectori genetici (virusuri şi plasmide), transferul genelor de la o specie la alta, sunt realizări recente ale unui nou domeniu al geneticii, ingineria genetică. Acestui domeniu aparţin şi tehnicile de manipulare a celulelor, embrionilor şi ţesuturilor care, pe medii nutritive, în condiţii aseptice, pot fi înmulţite, reproducând fie clone celulare sau organisme întregi (la plante).

1.5. MATERIALUL DE CERCETARE ÎN GENETICĂ

12

În cercetarea eredităţii caracterelor, o importanţă deosebită îl are materialul cu care experimentăm. De acesta depind, în foarte mare măsură, rezultatele obţinute. Alegerea lui se face în funcţie de scopul cercetării. Sunt totuşi câteva condiţii generale, de care trebuie să ţinem seama în alegerea acestui material:

- să prezinte caractere distincte, uşor de precizat şi urmărit, la părinţi şi la urmaşi;

- să aibă ciclul vital scurt;- să posede un număr mic de cromozomi;- să producă mulţi urmaşi;- să producă mutaţii, sub influenţa factorilor mutageni;- să poată fi reprodus uşor în laborator;- să menţină în descendenţă caracterele şi însuşirile ce ne interesează.

Dintre mamifere, se folosesc mult şoarecii, care au ciclul de dezvoltarede numai 2,5 luni şi sunt destul de prolifici.

Dintre insecte, a fost folosită foarte mult musculiţa de oţet, Drosophila melanogaster. Aceasta se înmulţeşte destul de repede, mutează foarte uşor, are puţini cromozomi (2n=8), iar în glandele salivare conţine cromozomi gigantici.

La plante, se aleg de obicei plante anuale ce prezintă caractere distincte, uşor de sesizat şi urmărit (culoarea pericarpului, a endospermului, culoarea spicului, a aristelor ş.a.). Se folosesc cu succes plante autogame, care pot fi reproduse, fie prin fecundare străină, fie prin autofecundare. Dintre ciuperci s-a folosit foarte mult, în ultimul timp, Neurospora crassa.

O importanţă deosebită s-a acordat în special în ultimele decenii, bacteriilor şi virusurilor, care au ciclul de viaţă foarte scurt, cu funcţii limitate, uneori numai la cea de reproducere şi infecţiozitate. Genetica moleculară şi-a clădit descoperirile cu privire la structura macromoleculară a acizilor nucleici, procesele biochimice ce stau la baza substratului material al eredităţii, structura fină a genei, folosind virusurile şi bacteriile ca material de studiu.

Pentru genetica animală, şi în special pentru genetica dezvoltării, s-a găsit un model ideal, în nematodul Caenorhabdites elegans (Cîrlan M., 2001): adulţii au dimensiuni mici, aproximativ 1 mm, o generaţie se realizează într-un ciclu de 3 zile, necesită condiţii simple de creştere, produce un număr mare de descendenţi (200-300), indivizii sunt alcătuiţi din exact 959 celule, dintre care 300 de neuroni.

În genetica umană, studiul gemenilor are o importanţă deosebită. Gemenii care se dezvoltă din acelaşi zigot (monovitelini sau monozigotici) au o ereditate identică, iar deosebirile morfo-fiziologice dintre ei se datorează în special condiţiilor de viaţă. În felul acesta, se poate distinge în mod separat contribuţia mediului sau a eredităţii asupra exteriorizării unor caractere. Nu acelaşi lucru se poate spune despre gemenii bivitelini (bizigotici), care provin din ovule diferite şi cu legături genetice asemenea fraţilor şi surorilor.

1.6. DEZVOLTAREA GENETICII VEGETALE ÎN ROMÂNIA

Primele cercetări de genetică în România au fost efectuate de Constantin Vasilescu (1840-1902), profesor la Şcoala Superioară de Medicină Veterinară Bucureşti (actuala Facultate de Medicină Veterinară), care, în urma hibridării la suine, a urmărit modul de transmitere al monodactiliei (piciorul are o singură unghie) şi al caracterului

13

normal. In urma acestor încrucişări a semnalat pentru prima dată, dominanţa şi recesivitatea caracterelor în generaţia F1 şi segregarea acestora în generaţia F2, într-un raport de aproximativ 3:1 (caracteristic monohibridării). Rezultatele cercetărilor sale au fost comunicate înaintea celor lui Gregor Mendel (1822-1884), putând fi considerat un precursor al mendelismului.

In domeniul geneticii vegetale, primele cercetări de genetică au fost iniţiate de Constantin Sandu-Aldea (1874-1927), care s-a ocupat de ameliorarea grâului, reuşind să creeze o serie de linii valoroase. Publică în anul 1915, primul tratat românesc de specialitate intitulat “Ameliorarea plantelor agricole”, cu un amplu capitol de genetică.

Gheorghe Ionescu-Siseşti (1885-1968), doctor în ştiinţe laUniversitatea din Jena, a contribuit la dezvoltarea ameliorării plantelor şi a ştiinţei experimentale agricole româneşti. In urma selecţiei individuale simple, din soiul de grâu Tenmarq, a obţinut soiul de grâu A-15, cultivat de aproape 25 de ani în ţara noastră. Infiinţarea Academiei de Ştiinţe Agricole şi Silvice, a Institutului de Cercetări Agricole a României (I.C.A.R.) şi a primei Societăţi de Genetică din România, sunt legate de activitatea acestui savant.

Genetica vegetală din România a acumulat noi realizări prin activitatea ştiinţifică de excepţie a profesorului Nicolae Săulescu (1898-1977), care, după o specializare la Institutul de Cercetări de Ereditate din Berlin, condus de Erwin Baur (1875-1933) a realizat numeroase hibridări la specia Antirrhinum majus (2n=16), a stabilit grupele de linkage a mai multor gene şi a întocmit prima hartă genetică la această specie (1925).

Studii de cariologie şi citogenetică la plante a efectuat profesorul Victor Ghimpu (1896-1952), fiind printre primii români care au abordat acest domeniu. Creatorul şcolii româneşti de citologie este considerat profesorul Dimitrie Voinov (1867-1951), când citogenetica mondială era la începuturile ei. Cercetător de mare fineţe, Dimitrie Voinov, a semnalat primul caz de aneuploidie, în anul 1912, la insecta Gryllotalpa gryllotalpa, a studiat formarea celulelor sexuale la insecte şi a demonstrat că diviziunea mitocondriei are loc independent de “regele” celulei - nucleul -, putând fi considerat şi un pionier al eredităţii extranucleare. Pentru aportul său în dezvoltarea ştiinţei, UNESCO, a comemorat în 1967, 100 de ani de la naşterea lui Dimitrie Voinov.

In domeniul hibridării la plante, în vederea realizării de noi forme, amintim contribuţia profesorului Ştefan Popescu (1888-1961), care a statornicit bazele cercetărilor ştiinţifice de genetică şi ameliorare a plantelor în Moldova, combătând viguros ideile ne ştiinţifice ale lui T. D. Lâsenko. Cursul de genetică, editat în 1947, printre primele din ţara noastră cuprindea şi o parte de citogenetică, explicând bazele citologice ale principalelor fenomene genetice.

Genetica vegetală şi ameliorarea plantelor agricole au fost impulsionate de activitatea rodnică a academicianului Nechifor Ceapoiu (1911-1992), fiind cunoscute rezultatele sale în cercetările de genetică a grâului, crearea unor soiuri noi de grâu şi cânepă, fondarea revistei “Probleme de Genetică Teoretică şi Aplicată” şi organizarea Simpozioanelor Naţionale de Genetică Vegetală şi Animală”.

Petre Raicu (1929-1997) a avut contribuţii deosebite în dezvoltarea geneticii vegetale, animale şi umane şi a învăţământului românesc de genetică. A contribuit la înfiinţarea secţiei de Genetică în cadrul Societăţii de Ştiinţe Biologice din România şi a organizat primele simpozioane naţionale de genetică din România, după înlăturarea

14

dogmei lui T. D. Lâsenko (1964, 1967).George Emil Palade (născut în 1912), laureat al premiului Nobel în 1974,

savant de origine română, stabilit în S.U.A., a perfecţionat metodele de microscopie electronică, a descoperit ultrastructura ribozomilor (granulele lui Palade) şi implicarea acestora în funcţionarea celulei. Institutul de Biologie şi Patologie Celulară, a fost înfiinţat de Nicolae Simionescu, cu sprijinul lui G. E. Palade.

Cercetările de genetică vegetală, se desfăşoară în principalele Universităţi Agronomice din România (Bucureşti, Iaşi, Timişoara, Cluj-Napoca, Craiova), în Staţiunile de Cercetări Agricole, Institutul de Cercetări pentru Cereale şi Plante Tehnice Fundulea (coordonate de Academia de Ştiinţe Agricole şi Silvice).

În ameliorarea porumbului, primele linii homozigote obţinute din haploizi artificiali, a fost realizată de C. Panfil şi C. Botez (Universitatea Agronomică Cluj-Napoca).

Soiuri valoroase de trifoi tetraploid au ca autor pe Mircea Savatti (Universitatea Agronomică Cluj-Napoca).

Lucrările minuţioase de mutageneză experimentală, s-au realizat la Universitatea din Craiova (Marghitul Valeria şi Corneanu G.), la Universitatea Agronomică Bucureşti (Nicolae I.), la Universitatea Agronomică Iaşi (Ţîrdea Gh). Genetica şi ameliorarea grâului şi orzului, au cunoscut progrese importante prin activitatea unor personalităţi în domeniu (Ceapoiu N., Mureşan T., Săulescu N. N., Drăghici L., Bude At.).

Hibridările intergenice şi interspecifice, în special pentru obţinerea de Triticale au fost coordonate de Gallia Butnaru (Universitatea Agronomică Timişoara) şi Gaşpar I. (Staţiunea de Cercetări Agricole Suceava).

În România, numeroase reviste şi publicaţii de specialitate, fac cunoscute realizările în domeniul geneticii vegetale şi animale: Probleme de Genetică Teoretică şi Aplicată (ICCPT-Fundulea), Cercetări de Genetică Vegetală şi Animală (ICCPT-Fundulea), Genetics and Evolutions (Universitatea “A.I. Cuza”-Iaşi), Evolution and Adaptation (Universitatea “Babes-Bolyai”- Cluj-Napoca).CAPITOLUL 2

BAZELE CELULARE ALE EREDITĂŢII ŞI VARIABILITĂŢII (CITOGENETICA)

Moto:"Precum istoria Pământului este înscrisă în straturile sale geologice, tot astfel istoria unui organism este înscrisă în cromozomii săi"

H. Kihara

Ereditatea, proprietate esenţială a vieţii, trebuie să fie determinată, ca şi

15

celelalte proprietăţi, de un substrat material cu o anumită localizare, structură şi funcţie.Preocupările filozofilor şi oamenilor de ştiinţă până în secolul XIX pentru a

găsi un suport material al eredităţii s-au soldat cu formularea a numeroase ipoteze, de multe ori speculative. De abia în secolul XIX, odată cu apariţia şi dezvoltarea citologiei s-a putut trece la studiul sistematic al celulei, aceasta constituind unitatea structurală de bază, comună organismelor vii, cu excepţia virusurilor.

Pentru cunoaşterea eredităţii, studiul celulei şi a mecanismelor diviziunii celulare prezintă o importanţă deosebită. Într-adevăr, cunoştinţele acumulate au permis identificarea materialului genetic, descoperirea mecanismului de transmitere a genelor de la o celulă la alta, de la un organism la altul şi a modului cum se realizează recombinarea genetică. Toate aceste fenomene sunt determinate de un complex de structuri şi funcţii celulare.

Invenţia microscopului la sfârşitul secolului al XVI-lea a deschis o nouă eră în cercetarea structurilor materiei vii. Astfel, în anul 1665 fizicianul englez R. Hooke, cu ajutorul microscopului, descoperă celula. În anul 1831, R. Brown, cercetând celulele din epiderma plantelor Orchideae şi Asclepiadeae, descoperă nucleul. Pe baza datelor acumulate despre celulă, botanistul M. J. Schleiden (1838) şi zoologul T. Schwann (1839) elaborează teoria celulară, potrivit căreia celula reprezintă unitatea structurală a materiei vii.

O mare importanţă pentru dezvoltarea geneticii a avut-o descoperirea mitozei sau diviziunii nucleare indirecte (cariokineza) la plante, de către W. Flemming (1882). La interval scurt a fost descoperită meioza şi fecundarea la animale de către E. van Beneden (1883), A. Weismann (1883) ş.a. şi la plante de către L. Guignard (1889).

Descoperirea diviziunii nucleului a permis studiul cromozomilor, denumiţi astfel de W. Waldeyer (1888), cărora, datorită proprietăţilor pe care le au, li s-a atribuit un rol esenţial în ereditate. Dependenţa fenomenelor ereditare de nucleu, respectiv de cromozomi a deschis drumul cercetărilor privind substratulmaterial al eredităţii.

În ultimele decenii, mijloacele moderne de cercetare au contribuit la mari descoperiri în domeniul citologiei. Pentru studiul celulei se foloseşte astăzi microscopul cu contrast de fază, fluorescent, electronic şi microscopul cu raze ultraviolete. Se obţin imagini mărite până la câteva sute de mii de ori. Alături de succesul din domeniul opticii, progrese însemnate s-au făcut şi în domeniul metodelor biofizice şi biochimice. Tabloul general al structurilor celulare s-a completat şi s-a complicat mereu cu elemente noi.

Pentru a rezolva multiplele probleme pe care le ridică citologia se face apel la chimie, fizică, fiziologie şi alte discipline; genetica utilizează descoperirile citologice pentru elucidarea mecanismelor eredităţii. Din colaborarea dintre genetică şi citologie s-a născut un domeniu nou al biologiei numit citogenetică.

Celula este unitatea morfo-funcţională elementară a oricărui organism procariot sau eucariot, constituind principalul nivel de organizare a materiei vii, capabil de autoreglare, autoconservare şi autoreproducere.

Celula poate fi considerată, conform organizării sistemice a lumii vii, un sistem biologic deschis, în echilibru dinamic cu mediul ambiant (celula procariotă) sau ca un subsistem, când constituie parte componentă a unui ţesut, organ sau organism pluricelular (celula eucariotă).

Celulele tuturor organismelor au acelaşi plan general de organizare, fiind

16

formate din membrană şi protoplasmă, însă analizând evoluţia aparatului genetic se disting două mari grupe de organisme: procariote şi eucariote.

2.1. STRUCTURA CELULEI PROCARIOTE

Procariotele sunt organisme cu o structură simplă, ce cuprind vieţuitoare acelulare, din care fac parte viroizii, virusurile şi micoplasmele şi vieţuitoare celulare, bacteriile şi algele albastre-verzi (cianoficeele).

Materialul genetic este reprezentat de o moleculă de ADN sau ARN, necomplexat cu proteine histonice sau nehistonice. Cromozomul procariotelor se găseşte în contact direct cu citoplasma, deoarece compartimentarea celulară şi specializarea membranelor este abia schiţată.

Viroizii sunt agenţi infecţioşi reprezentaţi de o moleculă scurtă de ARN, lipsiţi de înveliş proteic. Primii viroizi au fost identificaţi ca agenţi ce produc boala cartofilor fuziformi sau stelarea cartofilor, ulterior identificându-se în cazul mai multor boli grave. Majoritatea viroizilor se găsesc în nucleul celulei gazdă, replicarea ARN viroidal depinzând strict de complexul enzimatic al celulei gazdă.

Virusurile sunt particule infecţioase acelulare, submicroscopice, care produc bolile cunoscute sub denumirea de viroze. Virusurile atacă toate organismele, de la bacterii (bacteriofagi), până la celulele animale şi vegetale.

Virusurile sunt lipsite de complexul enzimatic necesar sintezei de substanţe energetice şi reproducerii. De aceea, virusurile folosesc mecanismele şi organitele celulei gazdă pentru reproducere, fiind considerate organisme parazite obligatoriu sau, altfel spus, parazite la nivel genetic. Celula gazdă produce şi furnizează precursorii necesari replicării moleculei de acid nucleic viral şi a proteinelor virale, care apoi se asamblează, rezultând o nouă particulă virală. Particulele virale, de obicei, lizează (distrug) membrana celulei gazdă, putând produce noi infecţii.

Structura particulei virale a fost descoperită de A.D. Hershey şi M. Chase, în anul 1952. Particula virală este alcătuită dintr-un înveliş proteic, denumit capsidă, formată dintr-o singură proteină sau din mai multe proteine stratificate, iar la virusurile mai mari se adaugă lipide şi glucide. Capsida poate avea diverse forme, în funcţie de natura subunităţilor proteice, care au fost denumite capsomere. La unele virusuri (RJ7, F2, virusul herpesului), capsida poate fi înconjurată de un înveliş proteic extern (anvelopă externă) cu ajutorul căruia fagul aderă pe membrana celulei gazdă.

În interiorul capsidei se găseşte materialul genetic reprezentat de o moleculă de ADN (dezoxiribovirusuri) sau o moleculă de ARN (ribovirusuri), de mărimi diferite, specifice fiecărui tip de virus.

La unii bacteriofagi (virusuri ale bacteriilor) capsida se continuă cu o coadă cu simetrie elicoidală, la ale cărei extremităţi sunt prezente mai multe filamente codale, ce asigură contactul cu celula parazitată (figura 2.1.).

17

Fig. 2.1. Structura celulei la procariote:A-dezoxiribovirus; B-micoplasmă; C-bacterie; D-cianoficee (mz-mezozom, rb-ribozom, p-peretele celular, pl-plasmalema, r-produs de rezervă, t-tilacoid) (după Roland şi Szollosi)

Micoplasmele sunt organisme extrem de simple, care nu au perete celular fiind delimitate de plasmalemă, în interiorul căreia se găsesc câteva sute de ribozomi şi un cromozom reprezentat de o moleculă de ADN. Deşi au o structură foarte simplă, sunt capabile să-şi sintetizeze în mod independent proteinele şi ATP necesare metabolismului. Micoplasmele produc o serie de boli atât la animale (pleuropneumonia taurinelor), cât şi la plante (stolburul solanaceelor, cloroza asterului, nanismul porumbului etc.).

Celula bacteriană. Este delimitată la exterior de un perete celular rigid, alcătuit din glicoproteine complexe (de tipul mureinelor), care, în funcţie de structura chimică, conferă acesteia caracteristicile de imunitate şi patogenitate. Plasmalema, de natură lipo-proteică este situată pe faţa internă a peretelui celular, delimitând citoplasma. Citoplasma nu este omogenă din punct de vedere structural, înglobând o serie de vezicule membranoase, microfibrile, ribozomi, glucide de rezervă etc. Zona centrală a citoplasmei cuprinde o masă densă de microfibrile, reprezentând molecula de ADN, ce constituie materialul genetic. ADN este bicatenar, circular, necomplexat cu histone, cu o lungime de aproape 1 mm. Această moleculă de ADN constituie cromozomul sau genoforul bacterian. În jurul său citoplasma este mai densă, rezultând aşa numitul nucleoid, care este lipsit de membrană şi nucleol.

Cercetarea electronomicroscopică a bacteriilor a evidenţiat o serie de invaginări tubulare sau lamelare ale plasmalemei, denumite mezozomi. Mezozomii sunt accesorii ale genoforilor implicaţi în activitatea respiratorie, replicarea semiconservativă a ADN şi diviziunea celulei (F. Jacob, 1966).

Cianoficeele (algele albastre-verzi) sunt cele mai vechi organisme cunoscute, unicelulare, de formă filamentoasă (Oscillatoria), globuloasă (Spirulina), care au o organizare destul de apropiată celei bacteriene. La cianoficee, invaginaţiile plasmalemice au forme aplatizate, grupate în pachete de vezicule membranoase, denumite tilacoide, ce conţin pigmenţi fotosintetizatori.

18

2.2. STRUCTURA CELULEI EUCARIOTE

Celula eucariotă, vegetală sau animală, delimitată de membrana celulară este alcătuită din protoplasmă, care conţine două componente fundamentale: citoplasma şi nucleul.

Citoplasma are o compartimentare strictă, conţinând organite citoplasmatice lipsite de membrană (microtubuli, centrioli, microfilamente, ribozomi), cu membrană simplă (reticul endoplasmic, aparatul Golgi, lizozomi, peroxizomi, glioxizomi, lomazomi) şi cu membrană dublă sau anvelopă (nucleu, plastide, mitocondrii) (Toma C. şi colab., 1995).

Membrana celulară. Constituie învelişul extern al celulei şi are rol de efector al controlului schimburilor de substanţe dintre conţinutul celulei şi mediul ambiant. Ea este reprezentată de stratul bimolecular fosfolipidic, care poartă pe faţa sa externă un strat proteic bogat în hidraţi de carbon, iar pe faţa sa internă un singur lanţ proteic. La microscopul electronic apare formată din două straturi, fiecare de câte 20 Â grosime, între care se află un spaţiu clar de 35 Â.

La animale, celula are la exterior doar membrana plasmatică. La plante, celulele sunt învelite în plus, la exterior, de un perete celular impregnat cu celuloză, lignină, săruri sau alte substanţe. Aceasta prezintă o mare importanţă economică, cum ar fi de exemplu în cazul plantelor textile, de la care se obţin fibre pentru industria textilă.

Structura şi funcţiile membranei plasmatice sunt determinate genetic. Ea are un rol fiziologic şi biochimic în viaţa celulei, fără a participa direct la activităţile formative şi de transmitere ereditară.

Citoplasmă. Reprezintă partea celulei situată între membrana plasmatică şi membrana nucleară. Este alcătuită dintr-o matrice citoplasmatică şi organite citoplasmatice.

Matricea constă dintr-o plasmă coloidală, reprezentând un sistem heterogen format din lanţuri macromoleculare şi agregate moleculare, precum şi enzime, substanţe metabolice de rezervă etc.

Organitele citoplasmatice, caracteristice principial pentru toate celulele sunt: reticulul endoplasmic, mitocondriile, ribozomii, corpusculii Golgi (prezente în toate celulele), cloroplastele (la speciile vegetale fototrofe), centriolii (în celulele animale, la unele alge şi ciuperci), lizozomii (în celulele animale şi, probabil, ale unor plante).

Reticulul endoplasmic. La microscopul electronic în citoplasmă a fost descoperit un sistem de cisterne, vezicule şi canalicule, denumite de K. Porter (1953) reticul endoplasmic. Canaliculele au un diametru de 500 Â, iar cisternele până la 1500 Â. Starea în care la plante şi animale ribozomii sunt ataşaţi de reticulul endoplasmic s-a numit ergastoplasmă.

Mitocondriile. Sunt organite citoplasmatice care se găsesc în mod obişnuit în toate celulele. Ele au fost studiate la animale mai mult decât la plante, deşi, în general, au aceeaşi structură şi funcţie.

Mitocondriile variază ca mărime, de la 0,2 ц (limita de rezoluţie a microscopului obişnuit) până la câţiva ц. Mitocondriile au diferite forme, după celulele din care fac parte (bastonaşe, filiforme, sferice etc.). În celula vie ele apar mobile, fiind antrenate de mişcările citoplasmice. Numărul acestor organite variază de la un ţesut la altul; astfel, se găsesc în număr mare în celulele ce aparţin unor ţesuturi cu activitate

19

intensă (celulele meristematice, miofibrile, tuburile renale etc.).Mitocondriile sunt înconjurate de o membrană dublă, asemănătoare aceleia de

la exteriorul celulei. Membrana internă formează numeroase invaginări (criste mitocondriale), care măresc foarte mult suprafaţa activă a mitocondriilor. Aceste organite constituie centrul unor trepte ale procesului de respiraţie aerobă. Ele posedă enzimele necesare cu rol în oxidarea grăsimilor şi de fosforilare.

Studiul complex al mitocondriilor a relevat existenţa unui ADN mitocondrial şi a unui aparat enzimatic propriu, ce permite sinteza unor proteine caracteristice. ADN din mitocondrii este bicatenar, circular, asemănător ADN bacterian. De asemenea, cercetările asupra ribozomilor mitocondriali au relevat faptul că aceştia sunt de tip bacterian (cu o constantă de sedimentare de 70 S). Pe această bază s-a tras concluzia că mitocondriile (ca şi plastidele) derivă din organisme procariote, care au invadat celulele eucariotelor şi s-au subordonat nucleului acestora.

Într-o mitocondrie pot exista până la 6 molecule de ADN, în cantitate de 10-6-10-7 g (Borst şi colab., 1967). Aparatul genetic mitocondrial explică localizarea unor însuşiri la nivelul citoplasmic, deoarece astăzi se ştie precis că mitocondriile au proprietatea de a creşte, de a se divide şi posedă continuitate celulară şi genetică. Genomul mitocondrial la metazoare este constant, alcătuit din 37 gene, cu diferite roluri: 13 gene codifică sinteza diferitelor proteine mitocondriale, 22 de gene responsabile de sinteza moleculelor specifice de ARNt şi 2 gene ce deţin informaţia genetică necesară sintezei subunităţilor mari şi mici ale ribozomilor (ARNr).

Genomul mitocondrial al plantelor este mult mai complex, dar, funcţional, diferă foarte puţin de cel al metazoarelor. Genele mitocondriale se transmit pe cale citoplasmatică, pe linie maternă. Mutaţiile care apar la nivelul mitocondriilor afectează în primul rând funcţiile de respiraţie. Aceste mutaţii pot să apară cu o frecvenţă relativ mare şi se transmit pe linie maternă la descendenţi.

Ribozomii. Sunt corpusculi submicroscopici cu dimensiuni cuprinse între 50-300 Â, care se găsesc în citoplasmă, cloroplaste, mitocondrii.

Ribozomii conţin acizi ribonucleici ribozomali şi proteine ribozomale în proporţie de aproximativ 1:1. Din cauza conţinutului ridicat în acid ribonucleic ribozomal (ARNr), G. E. Palade (1953), descoperitorul acestor particule, le-a denumit ribozomi. Ei se găsesc liberi în citoplasmă sau fixaţi de reticulul endoplasmic.

In celulă, ribozomii îndeplinesc un rol deosebit de important, prin participarea lor la sinteza proteinelor. Ei se găsesc în cantitate mare în ţesuturile cu diviziuni celulare intense, în care sinteza proteică se realizează, de asemenea, intens. In sinteza proteică, ribozomii devin activi prin asocierea lor cu moleculele de acid ribonucleic mesager (ARNm) împreună cu care formează poliribozomi.

Ribozomii liberi participă la sinteza proteinelor necesare proceselor de diferenţiere celulară, a unor proteine cu funcţii specifice şi de formare a organitelor citoplasmatice, în timp ce ribozomii ataşaţi reticulului endoplasmic participă la sinteza proteinelor destinate secreţiei celulare şi depozitării proteinelor sintetizate la nivelul celulei.

In ceea ce priveşte originea ribozomilor, cercetările au arătat că la nivelul nucleolului se produce sinteza componentelor de bază ale acestora (ARNr şi proteine ribozomale), care la nivelul citoplasmei se asamblează în proporţie egală.

Ribozomii au mărimi diferite şi se pot clasifica după constanta de sedimentare

20

(S) la ultracentrifugare în: categoria de 70 S (140-180 Â) prezenţi la bacterii şi alge verzi şi de 80 S (260-300 Â) prezenţi în celulele eucariotelor (plante superioare, criptogame şi animale).

Sub acţiunea ionilor de Mg2+, ribozomii se pot uni între ei formând structuri polimere sau se pot descompune în subunităţi. Aşa de exemplu, la Escherichia coli s-a descoperit că ribozomii de 100 S sunt formaţi din 2 particule ribozomale de 50 S.

Cloroplastele. Sunt organite prezente în citoplasma celulelor vegetale. Ele conţin clorofilă ce imprimă culoarea verde ţesutului în care se găsesc, iar prin implicarea lor în procesul de fotosinteză deţin rolul de producători primari.

Prezenţa cloroplastelor în celule nu este permanentă, ele se formează, ca şi mitocondriile, cu care au trăsături comune, din formaţiuni submicroscopice, cu dimensiuni de aproximativ 500 Â, numite proplastide.

Studiile de microscopie electronică au evidenţiat 3 componente structurale ale cloroplastului: membrana dublă la exterior, stroma sau substanţa fundamentală a cloroplastului şi grana, un ansamblu de structuri bogate în clorofilă.

Membrana cloroplastului este dublă, între cea externă şi cea internă fiind un spaţiu liber. De obicei, la majoritatea plantelor, cele două membrane sunt netede, însă la unele (plantele de tip C4), membrana internă prezintă o serie de cute duble, care măresc suprafaţa funcţională a acesteia. Din punct de vedere biochimic şi fiziologic, cele două membrane se deosebesc: membrana externă este permeabilă pentru moleculele cu greutate moleculară mică, iar cea internă reglează schimburile moleculare între stromă şi hialoplasmă printr-o serie de molecule transportoare ce le conţine (Toma C., 1995).

Stroma este alcătuită din substanţa fundamentală şi o serie de incluziuni, cum ar fi: granule de amidon, nucleotide grupate în fibrile de ADN, ribozomi, plastoglobule osmiofile. Substanţa fundamentală este constituită din proteine, în mare parte enzime ce participă la replicarea ADN cloroplastic, sinteza ARNm (transcripţie) şi a moleculelor specifice fotosintezei. Pe lângă proteine, substanţa fundamentală conţine un număr mare de molecule organice, din grupa zaharurilor, aminoacizilor, nucleotidelor, dar şi ioni de Mg2+ şi PO3".

Grana este un sistem membranar complex alcătuit din particule verzi denumite granum, bogate în clorofilă, de diferite tipuri, implicată în fotosinteză.

Prin constanţa şi continuitatea celulară, cloroplastul îndeplineşte caracteristicile de bază ale materialului genetic. ADN cloroplastic este o moleculă bicatenară, circulară, cu o circumferinţă de 40-50 ^, ataşat de membrana cloroplastului asemănător cromozomului bacterian. Pe lângă ADN, ce stochează informaţia genetică, cloroplastul posedă întregul complex macromolecular necesar replicaţiei, transcripţiei şi translaţiei acesteia: ADN-polimeraze, ARN- polimeraze, ARNm, ARNs, ARNr.

La plantele superioare, genomul cloroplastic este alcătuit din aproximativ 120 de gene: 4 gene pentru sinteza proteinelor ribozomale din cloroplast, gene ce codifică subunităţi ale polimerazelor, proteinele fitosistemelor I şi II, ATP-sintetazei, 30 de gene pentru ARNs şi în jur de 40 de gene ce codifică proteine cu funcţii încă necunoscute (Raicu P., 1997).

O caracteristică importantă a plastidelor, şi deci şi a cloroplastelor, este aceea că, de regulă, se transmit pe cale citoplasmatică, cel mai frecvent pe linie maternă.

Aparatul Golgi. A fost descoperit de Camillo Golgi (1844-1926), în anul 1898, mai întâi în celulele nervoase animale. Ulterior, s-a evidenţiat în toate celulele animale şi

21

vegetale.Aparatul Golgi este bine dezvoltat în toate celulele active, reducându-şi

extinderea în celulele aflate în repaus şi dispare în celulele bătrâne. Este alcătuit din unităţi morfologice şi structurale denumite dictiozomi, complexate cu vezicule golgiene.

Dictiozomii sunt formaţi din elemente de formă tubulară sau veziculară, aplatizate, curbate şi dilatate la capete, delimitate de o membrană lipoproteică. Veziculele golgiene, delimitate de membrane lipoproteice rezultă din dictiozomi, printr-un proces de înmugurire laterală a tuburilor sau veziculelor.

Cercetările recente susţin că originea aparatului Golgi este membrana nucleară (unele ciuperci şi alge brune) sau ergastoplasma (în celulele animale şi ale plantelor superioare).

Complexul Golgi este localizat în apropierea nucleului, având un rol deosebit de important în transformarea unor substanţe sintetizate la nivelul reticulului endoplasmic şi orientarea acestora spre plasmalemă, pentru a fi utilizate în alte sinteze sau pentru a fi eliminate în exteriorul celulei.

În afara rolului deţinut de aparatul Golgi în procesele de secreţie, la plante, veziculele golgiene participă la formarea fragmoplastului şi a lamelei mediane în citokineză şi chiar în regenerarea plasmalemei. După Fain-Maurel, 1992, aparatul Golgi, prin interacţiunile sale cu reticulul endoplasmic granular (ergastoplasma), unde are loc sinteza şi descompunerea proteinelor de secreţie şi biogeneza membranelor celulare, constituie "placa turnantă a metabolismului celular şi a traficului membranar" (Toma C. şi colab., 1997).

Centrozomul. Este o formaţie citoplasmică ce se găseşte în apropierea nucleului şi care apare la microscop sub forma unei zone clare, luminoase, omogene, cu un centru granular opac, alcătuit din doi centrioli. El este prezent în toate celulele animalelor şi la plantele inferioare (lipseşte la angiosperme). În jurul centrozomului se observă filamente radiare ce formează aşa-numitul aster, precum şi tubulii fusului de diviziune. Acestea apar numai în timpul diviziunii mitotice.

Centrozomul joacă rol important în diviziunea celulară. El se divide în doi centrozomi-fii, numiţi sfere directrice. În jurul fiecăruia se formează câte un aster. Sferele directrice se deplasează apoi spre cei doi poli ai celulei. Datorită autoreplicării, în fiecare centrozom se găsesc doi centrioli. Aceştia sunt înzestraţi, în general, cu continuitate genetică. Centriolii se separă în structuri duplex la începutul fiecărei noi diviziuni (profaza următoare).

În citoplasmă se află factorii ereditari responsabili pentru ereditatea extranucleară - plasmagenele.

O schemă generală a structurii celulei, alcătuită după imaginile obţinute la microscopul electronic este prezentată în figura 2.2.

NUCLEULDatorită componentelor sale principale, cromozomii, nucleului i s-a acordat o

deosebită atenţie în cercetările de genetică. De peste 200 de ani de când se studiază acest principal element al celulei s-au acumulat multe date în legătură cu structura lui fizică, chimică şi funcţională.

La organismele eucariote, în majoritatea cazurilor, nucleul are o formă ovoidă şi

22

ocupă zona centrală a celulei. La celulele cu metabolism intens, nucleul ia contururi foarte neregulate. De exemplu, nucleii din celulele endospermului leguminoaselor au formă spiralată. Forme neregulate iau şi nucleii unor ţesuturi bolnave, a căror activitate metabolică se măreşte (celula canceroasă).

Fig. 2.2. Schema unei celule alcătuită după datele obţinute cu microscopul electronic (după Brachet, 1961)

In timpul diviziunii, nucleul suferă schimbări structurale. In perioada dintre două diviziuni, în interfază, nucleul se caracterizează printr-o intensă activitate de schimb cu citoplasma, din care cauză acestei perioade i s-a dat denumirea de perioadă metabolică sau energetică.

Nucleul ocupă, de obicei, 10-20% din volumul celulei şi conţine 1525% din azotul acesteia. Excepţie fac spermatozoizii şi anterozoizii, la care citoplasma ocupă un volum foarte mic.

23

La microscopul fotonic, nucleul apare cu o structură omogenă, iar la cel electronic cu o structură mai complexă, constituită dintr-o reţea fină de fibre. Pentru a studia compoziţia chimică a nucleului, el trebuie izolat de restul celulei. Pe baza analizei cantitative s-a stabilit că nucleul conţine 14% ADN, 12% ARN, 22,5% proteine bazice şi 51,5% proteine stabile. Din proteinele bazice fac parte protaminele şi histonele, bogate în aminoacizii lizină, histidină şi mai ales arginină. ADN se găseşte în structurile cromatice, în timp ce ARN mai ales în nucleoli. În nucleu se mai găsesc enzime, lipide, ioni de Ca2+, Mg2+, Cu2+ etc.

Nucleul este delimitat la exterior de o membrană nucleară şi conţine în interior nucleoplasma, cromatina şi nucleolii.

Aşa cum s-a precizat, la procariote, reprezentate de organisme unicelulare, nucleoidul este difuz şi fără membrană. Nucleoidul nu este complexat cu proteine bazice de tipul histonelor. Acesta se divide prin amitoză.

Membrana nucleară. Datele actuale cu privire la membrana nucleului au fost obţinute cu ajutorul microscopului electronic. Ea apare formată din 2 foiţe, lipoproteice tripartite, fiecare cu o grosime de 75 Â, separate printr-un spaţiu de 100 până la 1000 Â.

Structura membranei nucleare este foarte asemănătoare cu aceea a membranei mitocondriilor. Spre deosebire de aceasta, ea este prevăzută cu un sistem de pori ce permite schimbul de substanţe între nucleu şi citoplasmă şi chiar direct cu exteriorul celulei. Marginile unui por sunt în legătură cu 8 fibre de cromatină cu diametru de 200 Â, alcătuite din ADN şi proteine histonice, dispuse sub forma unui ghem.

Ultrastructura membranei nucleare este foarte complicată şi joacă un rol tot atât de complex în schimburile nucleo-plasmatice. Mulţi cercetători consideră membrana nucleară un domeniu în care se acumulează substanţe, se organizează în structuri, de unde migrează în citoplasmă.

Cromatina. Este un complex biochimic constituit din fibre nucleoproteice (proteine şi ADN) în proporţie de aproximativ 96%, mai multe tipuri de holoproteine şi fosfolipide. Se prezintă sub forma unor aglomerări granulare, în vecinătatea membranei nucleare. Unităţile structurale ale cromatinei sunt nucleosomii, alcătuiţi din molecule de ADN şi 4 fracţii de proteine histonice (H2A, H2B, H3 şi H4). La fiecare nucleosom se asociază fracţia histonică Hu care joacă un rol important în spiralizarea fibrelor de cromatină.

Cariolimfa. In interiorul nucleului se găseşte un lichid în stare de sol numit cariolimfă, nucleoplasmă sau suc nuclear. El conţine proteine, lipoizi, enzime, acizi nucleici, o serie de cationi (Na, Ca, Mg) ş.a.

În ultimul timp s-a determinat în cariolimfă prezenţa unei structuri reticulare, asemănătoare reticulului endoplasmic, dar mult mai fină, care conţine bicatene de ADN ce formează complexe cu histonele şi cu proteinele nehistonice, reprezentând procromozomii. Filamentul de cromatină este lung şi se găseşte sub formă despiralizată.

Se cunosc puţine date în legătură cu structura filamentului de cromatină, deoarece este prea fină pentru puterea de mărire a microscopului obişnuit şi preamare pentru cea a microscopului electronic.

Densitatea şi compoziţia chimică a cariolimfei variază în funcţie de starea funcţională a celulei.

Nucleolul. Nucleolii sunt globuli refringenţi, vizibili la microscopul obişnuit sau cu contrast de fază, în interfază. Numărul lor variază în funcţie de specie, fiind însă

24

constant în celulele aceleiaşi specii. Dimensiunile nucleolilor depind de mărimea nucleului, durata interfazei, funcţia celulelor ş.a.

Nucleolii se formează în zona constricţiei secundare a cromozomilor, asociaţi cu o anumită regiune denumită organizator nucleolar.

În timpul diviziunii mitotice, nucleolii suferă un ciclu de transformări inverse acelora prin care trec cromozomii. Ei sunt vizibili în interfază, dispar în profază şi reapar la sfârşitul anafazei.

La microscopul electronic nucleolii apar constituiţi din aglomerări granulare de elemente filiforme.

Din punct de vedere chimic nucleolii cuprind două grupe de substanţe (proteine şi acid ribonucleic), care formează un complex ribonucleoproteic. Pe lângă aceste substanţe, nucleolul mai conţine şi o cantitate mare de fosfolipide şi alte lipide. El sintetizează o mare cantitate de ARN care migrează în citoplasmă.

2.3. ORGANIZAREA GENOMULUI LA EUCARIOTE

Cromozomii sunt structuri permanente în nucleul celulei şi constituie materialul genetic de bază. În cromozomi sunt localizate genele. La microscopul fotonic cromozomii devin vizibili numai în timpul diviziunii celulare. Cu ajutorul unor tehnici perfecţionate de investigaţie s-a stabilit că ei sunt prezenţi tot timpul în celulă, dar suferă unele schimbări în diferitele etape care se succed în viaţa celulei. Numărul şi structura lor genetică rămân însă constante de-a lungul generaţiilor.

2.3.1. Morfologia cromozomilor

Aspectul cromozomilor poate fi bine studiat în cursul diviziunii celulare mitotice, în metafază, când se colorează foarte intens. Ei sunt constituiţi din perechi identice, dar diferiţi ca mărime şi formă de la pereche la pereche. La speciile dioice există o pereche de cromozomi, care diferă morfologic de la un sex la altul, denumiţi heterozomi sau cromozomi ai sexului, având un rol special în determinarea sexului. Celelalte perechi de cromozomi, care alcătuiesc majoritatea cromozomilor poartă numele de autozomi. Segmentul cromozomic situat terminal faţă de constricţia secundară a căpătat denumirea de satelit. Satelitul serveşte la identificarea cromozomilor cu organizator nucleolar. Deci, numărul nucleolilor dintr-un nucleu este egal cu numărul cromozomilor cu satelit.

Fiecare cromozom este format din două cromatide unite printr-o formaţie cu diametrul mai mic decât al cromozomului numită centromer. Deoarece în zona centromerului cromozomul are diametrul mai mic, acestei zone i s-a dat denumirea de constricţie primară (spre deosebire de constricţia secundară din regiunea organizatorului nucleolar).

Centromerul are un rol important în timpul diviziunii celulare deoarece serveşte la ataşarea cromozomilor de fibrele fusului nuclear, fiind considerat motorul neurochimic ce determină deplasarea cromozomilor în mixoplasma celulei în diviziune, iar în meioză determină sinapsa cromozomilor omologi şi constituie locul ce marchează separarea cromatidelor la sfârşitul metafazei şi începutul anafazei.

Structura centromerului cuprinde trei zone: kinetocorul, situat pe faţa externă a fiecărei cromatide, o zonă centrală cu o grosime mai mare şi o zonă internă responsabilă de interacţiunea dintre cromatide în subfaza G2, profază şi metafază. Kinetocorul este un

25

complex proteic sintetizat pe baza informaţiei genetice a ADN din regiunea centromerului.Poziţia centromerului în cromozom determină formarea a două braţe egale sau

inegale, prin urmare existenţa mai multor tipuri morfologice de cromozomi:- metacentrici, centromerul este plasat la jumătatea distanţei dintre cele

două capete, braţele fiind egale;- submetacentrici, centromerul este localizat submedian, braţele fiind

inegale;- acrocentrici, centromerul este localizat subterminal, braţele fiind

accentuat inegale (figura 2.3.).Cromozomii telocentrici, cu centromerul situat strict terminal, nefiind stabili, s-

a renunţat la această grupă morfologică (Swanson şi colab., 1981, citaţi de Cîrlan M.,1996).

Fig. 2.3. Tipuri de cromozomi: a-metacentric; b-submetacentric; c-acrocentric; d-cromozomi de Lilium;P-constricţie primară; S-constricţie secundară,

zona organizatorului nucleolar

Extremităţile cromatidelor sunt delimitate de formaţiuni denumite telomere. Telomerele reprezintă zone în care cromatina este puternic condensată, asigurând stabilitatea şi individualitatea cromozomilor pe parcursul diviziunii celulare. Telomerele împiedică fuzionarea cromozomilor cap-la-cap în metafază şi anafază.

Fragmentele de cromozom fără centromer sunt capabile de a se replica, dar incapabile de a se orienta în mitoză spre polii celulelor. Unele cercetări efectuate la coccidii şi scorpioni, dar şi la plante (Luzula) au pus în evidenţă prezenţa unor centromeri dispersaţi pe toată lungimea cromozomului (centromeri difuzi). Aceşti cromozomi policentromerici, în timpul diviziunii mitotice se pot fixa prin oricare segment, de tubulii fusului de diviziune.

Centromerul este o formaţiune capabilă de autoreplicare. Diviziunea cromozomului este precedată de diviziunea centromerului, care implică replicarea ADN centromeric, ce acţionează ca un locus al formării kinetocorului. El se colorează foarte puţin şi adesea este acromatic şi Feulgen negativ.

Forma cromozomilor. Este caracteristică fiecărei specii, dar poate varia, în funcţie de specializarea celulei în ţesut, de starea fiziologică a celulei şi de influenţa diferiţilor factori externi. O celulă somatică de la Drosophila melanogaster în cursul diviziunii mitotice (figura 2.4.) are patru perechi de cromozomi şi anume: două perechi de forma literei V, o pereche de formă sferică şi o pereche heteromorfă: la masculi, alcătuită dintr-un cromozom sub formă de bastonaş şi unul sub formă de cârlig, în timp ce la femelă ambii cromozomi ai perechii sunt identici. Aceşti cromozomi au rol în determinarea sexului.

Fig. 2.4. Cromozomii somaticila Drosophila melanogaster (Ş)

În celulele somatice cromozomii sunt perechi. Cromozomii unei perechi au aceeaşi formă, mărime şi aceleaşi gene alele şi se numesc cromozomi omologi. În fiecare pereche de cromozomi omologi, unul este de provenienţă maternă, iar celălalt, paternă, caracteristică determinată de faptul că celula-ou (zigotul), rezultat al fecundării, cumulează setul haploid de cromozomi ai mamei şi ai tatălui.

În metafază, cromozomii se prind de fibrele fusului de diviziune la nivelul centromerului, luând forma de U, L, V, ş.a. Clivajul longitudinal începe întotdeauna în acelaşi loc. Toate acestea demonstrează, în plus, individualitatea pronunţată a cromozomilor.

Mărimea cromozomilor. Variază în funcţie de specie şi, într-o măsură foarte mică, de unele condiţii de mediu. Ca lungime, pot atinge valori cuprinse între 0,1-30 ^, iar ca grosime valori de 0,1-2 ^. S-ar părea, în general, că mărimea

27

lor este proporţională cu mărimea celulei şi invers proporţională cu numărul lor. De asemenea, cercetările arată că lungimea cromozomului este, în general, proporţională cu numărul de gene pe care le conţine.

Anumiţi factori de mediu pot influenţa mărimea cromozomilor. De exemplu, scăderea temperaturii face ca în celulele vegetale în plină diviziune să apară cromozomi mai contractaţi, mai scurţi. Prezenţa alcaloidului colchicină, în timpul diviziunii celulare, scurtează, de asemenea, cromozomii.

Numărul de cromozomi. Este relativ constant pentru indivizii ce alcătuiesc o specie de plante sau animale. Acest număr variază în limite mari la diferite specii, de la doi câţi întâlnim în celulele somatice la Ascarismegalocephala, până la câteva sute (Amoeba proteus).

In celulele somatice numărul lor este dublu (diploid) şi se notează cu 2n, iar în celulele sexuale este redus la jumătate (haploid) şi se noteazăcu n. Intabelul 2.1. se indică la câteva specii de plante şi animale numărul n şi 2ndecromozomi.

Tabelul 2.1.Numărul de cromozomi la diferite specii de plante şi animale

Plante n 2n Animale n 2nTriticum monococcum 7 14 Drosophila melanogaster 4 8

Triticum durum 14 28 Culex pipiens 3 6Triticum aestivum 21 42 Bombyx mori 14 28,56Zea mays 10 20 Plasmodium malariae 1 2Oryza sativa 12 24 Ascaris megalocephala 1,2 2,4Secale cereale 7 14 Cyprinus carpio 52 104Hordeum sativum 7 14 Musca domestica 6 12Medicago sativa 16 32 Blatta orientalis 24 48Medicago lupulina 16 32 Apis melifera 8,16 16,32Trifolium pratense 7 14 Rana esculenta 13 26Trifolium repens 14 28 Gallus domestica 38 76,78Trifolium hybridum 8 16 Columba liva 40 79,80Vicia sativa 6 12 Lepus cuniculus 22 44Vicia faba 6 12 Mus musculus 20 40

Pisum sativum 7 14 Cannis familiaris 39 78Solanum tuberosum 24 48 Capra hircus 30 60Helianthus annuus 17 34 Equus caballus 33 66Beta vulgaris 9 18 Sus scrofa 20 40Cannabis sativa 10 20 Ovis aries 27 54Vitis vinifera 19 38,76 Bos taurus 30 60Pyrus communis 17 34,51 Felis domestica 19 38Malus baccata 17 34 Felis tigris 19 38Neurospora crassa 7 -- Cotumix cotumix 40 80

Escherichia coli 1 -- Homo sapiens sapiens 23 46

Simbolul x indică numărul haploid de cromozomi ai speciilor diploide

strămoşeşti denumit număr de bază, număr monoploid sau genom.28

În celulele somatice cromozomii sunt perechi, iar din punct de vedere morfologic apar, în general, ca nediferenţiaţi. Deşi numărul lor reprezintă un caracter de specie, se pot întâlni specii cu acelaşi număr de cromozomi, cu toate că aparţin unor grupe îndepărtate din punct de vedere sistematic. Acest număr nu este legat deci de poziţia sistematică a speciei în lanţul filogenetic. Numărul şi morfologia cromozomilor pentru diferite forme apropiate pot însă să fie folosite ca indicaţii pentru înrudirea filogenetică a formelor de plante sau animale. Pe aceste constatări se bazează ramura sistematicii numită kariosistematica.

Constanţa numărului de cromozomi este totuşi relativă. Starea organismului şi condiţiile externe pot produce modificări asupra numărului de cromozomi în celulă. Numărul de cromozomi poate varia în funcţie de ţesutul în care se află celula. Astfel, în ficatul animalelor numărul garniturilor de cromozomi este un multiplu al numărului de cromozomi din celulele sexuale ale aceluiaşi organism (4x, 8x etc.). La speciile de plante angiosperme, nucleii din celulele endospermului, datorită fenomenului dublei fecundări, conţin trei garnituri de cromozomi, fiind simbolizat 3n.

Numărul, forma şi mărimea cromozomilor în metafază, din celulele somatice ale unui organism, sunt indicate prin noţiunea de cariotip. În figura 2.5. sunt redate cariotipurile la diferite specii.

Nu de mult s-au elaborat diferite metode pentru o identificare mai precisă a cromozomilor la diferite specii de plante şi animale. Una dintre acestea este şi metoda de bandare. In anul 1940, C. Darlington şi La Cour au elaborat o metodă de colorare a celulelor din ţesuturile meristematice prin tratarea lor cu temperaturi scăzute. Sub influenţa acestui factor pe cromozom apar benzi mai intens şi mai puţin colorate.

Principalele tehnici moderne de bandare se împart în 2 categorii:- tehnici bazate pe folosirea unor fluorocromi (quinacrina) ce se leagă de

ADN. În acest caz benzile caracteristice care apar se numesc benzi Q;- tehnici ce se bazează pe procesul de denaturare şi renaturare a ADN,

urmate de colorare cu colorantul Giemsa. Benzile care apar sunt notate cu G.În afară de benzile Q şi G au mai fost descoperite şi alte tipuri cum ar fi: C, R,

T, N.Procedeele de bandare conduc la identificarea certă a perechilor de cromozomi

şi a modificărilor lor structurale (figura 2.6.)Structura cromozomului. Cromozomii sunt formaţi din două unităţi alipite în

lungul lor numite cromatide. Cu ajutorul microscopului electronic s-a descoperit că aceste unităţi se compun, la rândul lor, din câte două subunităţi numite cromoneme. În fiecare cromozom, două cromoneme alcătuiesc câte o cromatidă. În preajma diviziunii celulare, cromonemele se spiralizează şi se scurtează. Spiralizarea este inegală, aşa că există zone cu spire mai dense şi mai puţin dense. La microscopul optic aceste porţiuni apar ca o succesiune de granule, înşirate ca mărgelele într-un şirag, denumite cromomere.

S-a crezut mult timp că aceste cromomere ar reprezenta unităţi funcţionale - genele. In realitate, aceste îngroşări vizibile sunt porţiuni de spirale mai dense ce dau aspectul de granule de culoare mai închisă. Cromomerele includ un număr variabil de gene.

Spiralizarea şi scurtarea cromozomului este maximă în metafază, când

29

cromozomii apar destul de compacţi. In telofază, începe procesul de despiralizare al cromozomilor (figura 2.7.).

Fig. 2.5. Cariotipul la diferite specii de plante 30

30

O structură importantă care joacă un rol în evoluţia cromozomului esteheterocromatina. În legătură cuparticularităţile ei s-au adunat multe date, unele contradictorii, aşa încât, până în prezent, nu s-a cristalizat o concepţie unitară asupra acestei formaţiuni. Se ştie însă precis că în toate stadiile ciclului mitotic unele sectoare ale cromozomului se colorează intens. Acestea s-au denumit sectoare heterocromatice, spre deosebire de altele eucromatice, care se colorează mai slab. Colorarea mai intensă se explică prin creşterea densităţii spirelor cromonemelor. Sectoarele cu heterocromatină se găsesc, în general, în apropierea centromerului.

Fig. 2.6. Reprezentarea diagramatică abenzilor cromozomice la om

(Maximilian C., 1978)

Ele însă, ca localizare, suferă variaţii determinate de influenţa diferiţilor factori externi. Se consideră că regiunile eucromatice conţin, în general, marea majoritate a genelor, în timp ce regiunile heterocromatice sunt practic lipsite de gene.

Heterocromatina se poate prezenta sub trei forme:- heterocromatina constitutivă este prezentă în toţi cromozomii nucleului

şi este localizată de o parte şi de alta a centromerului. Ea se aglomerează într-o masă compactă cromatică, care se numeşte cromocentru.

- heterocromatina facultativă, care inactivează genele pentru unul din cromozomii X. Se ştie că la Drosophila melanogaster, la femelă, care are doi cromozomi X, numai unul este activ. În felul acesta se realizează o egalitate în funcţionarea genelor celor două sexe la mamifere, deoarece sexul mascul are numai un cromozom X activ.

- heterocromatina condensată este distribuită diferit la celulele din diferite ţesuturi şi blochează acţiunea genelor ce se găsesc în regiunea ei.

Fig. 2.7. Schema evoluţiei cromozomilor în mitoză:

1-interfaza;2,3,4-profaza;5- prometafaza;6- metafaza.

31

La unii cromozomi de porumb, în poziţii diverse, se observă prezenţa unor noduli, care se colorează puternic, cunoscuţi sub denumirea de knobi. Numărul şi poziţia knobilor sunt constante pentru anumiţi cromozomi. Nu se cunoaşte precis rolul acestor formaţiuni, dacă conţin sau nu gene. Se presupune că ar avea rol în procesul de gametogeneză.

O schemă generală privind structura microscopică a cromozomului este prezentată în figura 2.8.

Fig. 2.8. Morfologia şi structura unui cromozom (după Raicu P., 1997)

Compoziţia chimică a cromozomilor. Analiza chimică a cromozomilor a relevat faptul că ei sunt constituiţi din macromolecule de ADN şi ARN, proteine cu însuşiri bazice (histone), proteine acide (nehistone), alături de alte substanţe în cantităţi mai mici: lipide, magneziu, calciu, enzime. Complexul ADN-histone constituie substanţa structurală fundamentală a cromozomului, în timp ce ARN, care se formează la nivelul cromozomului, este transferat în citoplasmă, având rol în procesul de biosinteză a proteinelor.

Dintre toţi componenţii cromozomilor, ADN se găseşte în cantitate constantă. În celulele somatice cantitatea lui este dublă faţă de cantitatea din celulele sexuale ale aceluiaşi organism, variind însă de la specie la specie. ARN se găseşte în cromozomi în cantităţi foarte variabile, de la 3 la 35%. La fel de variabilă este şi cantitatea de proteine

JILOMEhi

■i 'H l . JHJRI . t

32

nehistonice, aceasta fiind sub dependenţa activităţii genelor.În tabelul 2.2. este prezentată compoziţia chimică a cromozomilor.

Tabelul 2.2.Compoziţia chimică a cromozomilor (%)

Sursa ADN Histone Ne-histone

ARN ADN activ în transcripţie

Embrion de mazăre 39,0 40,0 11,0 10,0 12,0Mugure de mazăre 40,0 52,0 4,0 4,0 6,0Cotiledon de mazăre 43,5 34,5 16,0 6,0 32,0Ficat de şobolan 47,0 37,0 15,0 1,0 20,0Timus de viţel 40,2 46,0 13,0 0,3 15,0Blastulă de arici de mare 39,0 41,0 19,0 1,0 10,0

Larvă de arici de mare 33,4 29,0 35,0 2,6 20,0

2.3.2. Structura moleculară a cromozomului

S-au acumulat multe date în legătură cu compoziţia chimică a cromozomilor. Nu acelaşi lucru se poate afirma despre structura moleculară a cromozomilor de la organismele eucariote, a configuraţiei structurale a elementelor ce alcătuiesc această compoziţie chimică.

Microscopia optică nu poate oferi detalii, iar microscopia electronică nu ne oferă încă imagini clare, deoarece cromozomii sunt foarte neregulaţi şi au o lungime prea mare pentru a putea fi observaţi în întregime.

Din această cauză s-a încercat a se crea diferite modele de structură, care să ţină seama de prezenţa unui număr mare de molecule de ADN, de dispunerea unui număr mare de gene pe cromozomi, de posibilitatea dublării unei singure cromatide, de stabilirea structurii cromozomice şi de replicaţia ADN. Până în prezent s-au conturat mai multe ipoteze privind modelul de structură moleculară al cromozomului:

Ipoteza polifibrilară presupune existenţa în fiecare cromatidă a unui mănunchi de fibre ce corespund macromoleculelor de ADN. Cromozomul ar avea, în acest caz, diametrul de 4000 Â, fiind format din două cromatide de câte 2000 Â. Acestea ar conţine subunităţi de dimensiunea ADN de 20 Â. Ipoteza este criticată pentru mai multe motive. Numărul mare de fibre identice ar constitui o risipă de material genetic. Se ştie că mutaţia genetică afectează o porţiune din molecula de ADN, de asemenea afectează o porţiune din lungimea cromozomului. Din moment ce afectează numai o porţiune de fibră nu mai poate fi prezentă pe tot segmentul de cromozom. Odată cu clivarea cromozomilor, în timpul diviziunii celulare, mutaţia ar fi repartizată numai la una din cele două celule care se formează; ori aceasta contravine proprietăţii mutaţiilor de a fi ereditare.

Ipoteza structurii monofibrilare a cromozomului este reprezentată de diferite modele. Potrivit modelului lui J. A. Taylor (1957, 1960, 1963) şi E. Freese (1958) fiecare cromatidă este constituită dintr-un număr mare de molecule

33

de ADN, dispuse cap la cap, legate între ele prin legături de tipul 3’, formate din resturi de fosfoserină asociate nucleotidelor terminale de ADN şi legături de tipul 5’ formate din punţi difosforice. Al treilea tip de legături între moleculele de ADN ar fi de natură peptidică (legături H), care au rolul de a asigura stabilitatea structurii cromatidei (figura 2.9.).

Un alt model presupus de J. A. Taylor (1958), susţine că în lungul cromatidei ar exista o coloană dublă la care de o parte şi de alta se leagă moleculele de ADN. Replicarea cromatidei s-ar realiza prin clivarea coloanei centrale şi separarea catenelor de ADN, după care fiecare jumătate îşi reface jumătatea complementară (figura 2.10.).

Fig. 2.9. Modelul lui Taylor şi Freese cu privire la structura monofibrilară a cromozomului

Fig. 2.10. Modelul lui Taylor privind structura moleculară a cromozomului

Ipoteza fibrei cutate a lui E. J. Du Praw (1970) consideră că fiecare cromatidă este constituită dintr-o moleculă lungă de ADN asociată cu proteine, cutată neuniform transversal şi longitudinal. În interfază, fibrele elementare se cutează, constituind cromozomul, cu ajutorul unor proteine contractate în metafază (figura. 2.11.). Această ipoteză a fost sugerată lui Du Praw de existenţa inelului de translocaţie la Oenothera, unde toţi cromozomii sunt asociaţi. Ca urmare, întregul set de cromozomi haploizi ar fi format dintr-o singură moleculă de ADN gigantică şi circulară.

Modelul nucleosomului a fost conceput pe baza cercetărilor de biochimie, de microscopie optică, electronică şi de difracţie în raze X.

34

În alcătuirea cromozomului de tip eucariot ADN este în cantitate de 1315%, ARN 12-13%, iar proteinele de 68-72%. Aceste procente diferă de la specie la specie. La aceeaşi specie însă, mărirea cantităţii de ADN se poate realiza prin

35

multiplicarea numărului de garnituri cromozomice, adăugarea unui anumit număr de cromozomi, duplicaţia genelor şi mărirea cantităţii de ADN repetitiv.

Fig. 2. 11. Modelul lui Du Praw cu privire la dispoziţia fibrelor într-o cromatidă: a-

transversală; b-longitudinală; c-combinată; d-structura cuaternară a fibrei

ADN din cromozomii de tip eucariot este format din gene structurale (secvenţe unice de nucleotide) şi porţiuni care nu deţin informaţie genetică şi au rolul de a ocupa spaţiul dintre gene. A doua categorie sunt secvenţele de nucleotide intermediar repetitive şi care se găsesc în mai multe copii. A treia categorie sunt secvenţele de nucleotide înalt repetitive ce se repetă într-un număr mare de copii şi sunt localizate în heterocromatină.

Dintre aceste categorii variaţia cantităţii de ADN din genom este datorată secvenţelor de nucleotide repetitive, care în cea mai mare măsură sunt

În afară de aceste categorii de secvenţe mai există formaţiunile denumite palindroame. Ele sunt formate din secvenţe inversate dând naştere la nişte bucle.

Privită la microscopul electronic, cromatina apare formată din granule cu diametrul de 70-100 Â, legate între ele cu o fibră de 20 Â. O granulă este de fapt un nucleosom, care cuprinde un cilindru turtit de natură histonică în jurul căruia se înfăşoară un filament de ADN format din 100-140 nucleotide.Fig. 2.12. Modelul nucleosomului

3 t> e

36

În nucleu, cromatina formează un filament de 100 Â, alcătuit din aranjarea liniară a nucleosomilor şi un filament cu diametrul de 200-300 Â format din răsucirea filamentului subţire (figura 2.12.).

2.3.3. Tipuri particulare de cromozomi

În afara tipului obişnuit al cromozomilor din celulele somatice (autozomi şi heterozomi), au fost descoperiţi în anumite celule şi alte tipuri de cromozomi: cromozomi uriaşi, cromozomi tip "perie de lampă" şi cromozomi accesorii sau de tip "B".

Cromozomii uriaşi au fost puşi în evidenţă de Balbiani (1881) în glandele salivare ale larvelor de Chironomus. Ulterior, au fost evidenţiaţi şi la Drosophila melanogaster, în glandele salivare, în celulele intestinului şi a tuburilor lui Malpighi.

Aceşti cromozomi s-au format prin multiplicarea cromatidelor de peste 1000 de ori, care au rămas însă alipite, neseparate (sinapsă mitotică) şi despiralizate, fără ca nucleul să se dividă. Din cauza numărului mare de cromatide, aceşti cromozomi se mai numesc şi polyteni.

Structura cromozomilor polyteni este aceeaşi ca a celorlalţi cromozomi somatici, deosebindu-se de aceştia prin lungimea şi grosimea lor mult mai mari. Dimensiunile lor foarte mari permit cercetarea unor detalii de structură.

Configuraţia cromozomilor uriaşi este alta comparativ cu aceea a cromozomilor somatici obişnuiţi. De exemplu, la Drosophila melanogaster formează cinci braţe lungi şi unul scurt, unite într-un singur punct, numit cromocentru. Cromozomii sexului sunt în prelungire formând un singur braţ, cromozomii perechii a doua şi a treia formează alte patru braţe, iar cromozomii perechii a patra un singur braţ, foarte scurt (figura 2.13.).

De-a lungul lor, aceste braţe formează benzi (discuri) întunecoase, care alternează cu alte benzi, luminoase. Unii autori au presupus că aceste discuri ("discurile

Fig. 2.13. Cromozomii uriaşi din glandele salivare ale larvelor de Drosophila melanogaster şi formarea "puff'-urilor: 1-cromozomii sexului; 2-cromozomii II; 3-cromozomii III; 4-cromozomii IV; a-un disc; b-formarea inelului lui Balbiani; c-un "puff"; d-ipoteza lui Beerman despre structura unui "puff".

37

lui Balbiani") ar reprezenta locul genelor. Sunt aproximativ 6000 asemenea discuri întunecoase. In anumite locuri, structura densă a lor se deslânează formând funde în jurul cromozomului, cărora li s-a dat denumirea de "puff"-uri sau "bulbi". Aici are loc sinteza ARN, sugerând activitatea intensă a genelor ce se găsesc în aceste segmente.

Cromozomii lampbrush (perie de lampă) au fost puşi în evidenţă în ovocitele vertebratelor în timpul profazei meiozei. Ating lungimea de peste 1000 p şi sunt consideraţi cei mai lungi cromozomi care se cunosc până în prezent.

Spre deosebire de cromozomii uriaşi, ei sunt foarte subţiri, ajungânduneori la limita vizibilităţii microscopice. Cromozomii perie de lampă posedă un ax central, în lungul căruia sunt înşirate cromomerele, din care ies lateral perechi de bucle filiforme, dând aspectul firelor de păr ale unei perii de lampă (figura 2.14.). Aceste bucle se presupune că sunt spirale ale cromonemei, active din punct de vedere genetic. Ele cresc în profaza I şi descresc către metafaza I a meiozei.

Nu se ştie cum au apărut aceşti cromozomi. Noua configuraţie corespunde unei activităţi intense, care contribuie la formarea de rezerve viteline în citoplasma ovocitelor.

Cromozomii accesorii se găsesc în plus faţă de cromozomii autozomi şi ai sexului. Spre deosebire de cromozomii obişnuiţi, notaţi cu "A", cromozomii accesorii se mai numesc şi "cromozomii B". Numărul lor diferă de la un organism la altul şi de la un ţesut la altul şi nu sunt omologi nici între ei şi nici cu cromozomii obişnuiţi pe lângă care se găsesc. Sunt heterocromatici, mici şi inerţi din punct de vedere genetic. În meioză şi mitoză nu se distribuie în mod egal în celulele în care se formează. Nu se cunoaşte încă originea lor, dar după toate probabilităţile s-au format din porţiunile mijlocii ale cromozomilor normali, ale

Fig. 2.14. Cromozomii perie de lampă (lampbrush) a-schema unui bivalent; b-secţiune printr-un singur cromozom; c-structura unei bucle şi a cromonemelor

38

căror extremităţi s-au ataşat altor cromozomi. Nici rolul lor nu este cunoscut. Ei pot lipsi fără a perturba viaţa organismelor. Mai curând s-ar putea considera păgubitoare existenţa lor. Astfel, la secara tetraploidă, atunci când cromozomii "B" sunt prezenţi, scade fertilitatea polenului şi viabilitatea plantelor. Cromozomii suplimentari au fost puşi în evidenţă la insecte, păsări, porumb, secară ş.a.

2.4. ORGANIZAREA GENOMULUI LA PROCARIOTE (BACTERII ŞI VIRUSURI)

Spre deosebire de eucariote, la procariote cromozomul are o organizare mai simplă, nu însă în ceea ce priveşte şi structura lui moleculară, care este aceeaşi la toate organismele. Aceasta a favorizat cercetările de genetică, virusurile şi bacteriile constituind materialul de bază pentru genetica moleculară.

Virusurile, care sunt cele mai simple forme de viaţă, conţin ca material genetic un singur cromozom, în care genele sunt dispuse liniar. Cu unele excepţii, numărul de gene este destul de mic. La bacteriofagul T4, de exemplu, sunt prezente cca 200 de gene, în timp ce la fagul 02 numărul lor este de 4-5.

La virusuri genomul viral este destul de variat fiind alcătuit fie din ADN, fie din ARN (figura 2.15.). Aceşti acizi pot fi monocatenari sau bicatenari. Volumul moleculei este aproximativ egal cu volumul particulei virale, ceea ce denotă că ea este foarte strâns torsionată. Virusurile se reproduc pe seama celulei gazdă şi din această cauză manifestă o strictă specificitate.

Lungimea moleculei de acid nucleic poate fi foarte diferită. La fagul T2 masa este de 1,3 x 108 dal, cu 166.000 pb. La fagul X masa este de 3,2 x 107 dal, alcătuit din 47000 nucleotide.

La bacterii, cromozomul este format din ADN. El este circular şi nu este separat de citoplasmă printr-o membrană, încât relaţiile lui cu citoplasma sunt directe.

Cromozomul bacterian reprezintă cea mai mare moleculă cu rol genetic şi

,E .i I.. ....... . .-J

Fig. 2.15. Cromozomul (ADN) fagului X

39

conţine 2000-3000 de gene. La bacteria Escherichia coli masa moleculei este de 2 x 109

dal, iar lungimea de 1 mm. Genele situate în moleculă constituie un grup de înlănţuire.Tot la bacterii, pe lângă cromozomul circular, mai pot exista şi alte molecule de

ADN tot de formă circulară, de dimensiuni mult mai mici, localizate în citoplasmă sau ataşate cromozomului, numite plasmide. Acestea reprezintă un material genetic accesoriu.

Există şi o clasificare a materialului genetic accesoriu în mai multecategorii:

40

- plasmide propriu-zise, constituite din unităţi genetice cu replicaţie (reproducere) autonomă, cum ar fi factorul col (care determină sinteza de colicine, cu acţiune bactericidă), factorul F (care determină sexualitatea la bacterii şi asigură capacitatea lor de conjugare), factorul R (care transferă rezistenţa la antibiotice prin conjugare) etc.

- plasmide care pot funcţiona fie sub formă autonomă, fie integrate în cromozomi;

2.5. REPRODUCEREA CELULEI

Una din caracteristicile materialului genetic este continuitatea lui celulară. Aceasta este asigurată prin reproducerea sa cu mare fidelitate, transmiţându-se de la celulă la celulă, de la părinţi la urmaşi. La eucariote, materialul din cromozomi care dictează această reproducere este ADN. Procariotele conţin în cromozomul lor fie ADN, fie ARN. Reproducerea acestor acizi nucleici dictează, în ultimă instanţă, reproducerea materialului genetic, a celulelor organismului.

2.5.1. Mitoza

Reproducerea cromozomilor are loc odată cu reproducerea celulelor. Dintre formele de reproducere celulară, mitoza este cea mai importantă şi cuprinde duplicarea cromozomilor, a centrilor mitotici şi separarea cromozomilor la cei doi poli ai celulei, în vederea formării a două celule fiice. Dintr-o celulă iniţială, prin diviziuni mitotice repetate, se formează în mod succesiv 2, 4, 8, 16 celule cu acelaşi număr de cromozomi care există în celula iniţială. Prin mitoză, materialul genetic, cromozomii, îşi menţin structura şi numărul constant. În procesul mitozei se desprind două etape de bază: diviziunea nucleului (kariokineza) şi diviziunea citoplasmei (citokineza). În perioada dintre două diviziuni succesive, nucleul se află în interkineză (interfază).

Interfaza. În interfază nucleul creşte şi se pregăteşte de o nouă diviziune. Cercetările efectuate cu izotopi radioactivi şi puse în evidenţă prin autoradiografiere au demonstrat că, în interfază, cromozomii sunt monocromatidici, iar apoi, fiecare cromatidă îşi reconstituie cromatida pereche, în urma unui proces de sinteză a elementelor ce o compun. După unele observaţii, această fază se împarte în trei perioade: Gi, în care are loc sinteza proteică, S, în care se produce dublarea cantităţii de ADN din celulă şi G2, în care încetează sinteza ADN şi se desfăşoară kariokineza. În interfază cromozomii sunt despiralizaţi şi conţin gene active.

Profaza. Este prima fază a mitozei. În nucleu, structura lui reticulară se transformă în filamente vizibile, răsucite sub forma unui ghem numit spirem. Filamentul, prin răsucire (spiralizare) în jurul axei sale, se scurtează, se îngroaşă şi prin fragmentare dă naştere la cromozomi. Încă de la începutul profazei se observă natura dublă a lor. Prin dizolvarea membranei nucleului, cromozomii rămân liberi în citoplasmă. Se disting bine cele două cromatide ca nişte benzi longitudinale, paralele sau răsucite. De asemenea, se distinge şi centromerul, ca un segment ce uneşte într-o singură structură, cele două cromatide. Către sfârşitul profazei, în celulă se formează un fus central filamentos, orientat către cei doi poli ai celulei.

În celula animală, la sfârşitul profazei are loc diviziunea centrozomului, duplicarea şi despărţirea centriolilor, care migrează către cei doi poli, după care imediat

41

începe formarea astrosferei şi a fusului de diviziune. Terminarea profazei este indicată de dizolvarea nucleolilor şi a membranei nucleare. Substanţa nucleară se răspândeşte în apropierea cromozomilor şi sunt încă controverse dacă ea se depune pe aceştia sau rămâne în apropierea lor. Această substanţă însoţeşte cromozomii în tot timpul diviziunii şi ajunge astfel în nucleii celor două celule care iau naştere. Membrana nucleară se fragmentează în particule foarte mici, care păstrează ultrastructura dublă şi porii membranei.

Se preconizează şi un stadiu intermediar între profază şi metafază, numit prometafază. Acesta ar corespunde perioadei de dizolvare a membranei nucleare, a migrării cromozomilor spre ecuatorul celulei şi a formării incomplete a fusului de diviziune.

Ansamblul polilor, asterii, fusul acromatic şi cromozomii formează aparatul mitotic. Apariţia fusului constituie cea mai importantă schimbare structurală a celulei de la sfârşitul profazei. Fusul acromatic este format din fibrile care, privite la microscopul electronic, alcătuiesc microtubuli cu diametrul de 200 Â şi din fibre cromozomice ce unesc centromerii de polii fusului. Fusul începe să se formeze în citoplasmă, când încă nucleul mai este delimitat de membrană şi probabil că structura lui este datorată orientării paralele a moleculelor proteice ce intră în compoziţia lui. Mitocondriile, microzomii şi alte organite citoplasmice nu pătrund în zona din interiorul fusului.

În ce priveşte originea fibrelor există părerea că ele se formează la poli, cresc spre cromozomi de ai căror centromeri se prind. O altă părere susţine că fibrele se formează la nivelul cromozomilor, de unde cresc către polii celulelor; această părere este mai răspândită deşi nu poate explica formarea fusului, care poate avea loc şi în lipsa cromozomilor.

Metafaza. Cromozomii se inseră pe filamentele fusului de diviziune prin câte un punct de inserţie din regiunea centromerului. Ei se dispun pe un plan perpendicular la mijlocul fusului, formând placa ecuatorială.

În metafază, planul ecuatorial se măreşte, iar odată cu el şi fusul. În acest timp, cromozomii se îndepărtează uşor unul de altul şi manifestă tendinţa de a-şi orienta braţele paralel cu axul fusului. Întotdeauna ei rămân la periferia fusului. În metafază, cromozomii pot fi bine studiaţi la microscop, deoarece sunt spiralizaţi la maximum, compacţi şi se colorează intens.

Anafaza. Cromozomii îşi despart cromatidele prin clivarea lor, după ce în prealabil s-a produs diviziunea centromerilor. Ei devin cromozomi monocromatidici şi alunecă pe fusul nuclear către cei doi poli ai săi. Simultan cu deplasarea cromozomilor, fusul se strangulează la ecuator, grăbind astfel alunecarea cromozomilor către polii celulei. Centromerii înaintează spre poli şi trag după ei braţele cromozomilor. În cazul în care un cromozom îşi pierde centromerul, el rămâne dezorientat şi produce o deviere a mitozei de la mersul normal. Un astfel de cromozom se poate păstra şi poate participa la mitoză numai dacă se alocă altui cromozom ce posedă centromer.

Nu se cunoaşte astăzi precis care este cauza şi mecanismul de mişcare al cromozomilor spre cei doi poli ai celulei. În legătură cu explicaţia acestor fenomene există diferite ipoteze, dintre care unele pot fi luate în seamă. Astfel, se consideră că fiecare cromozom se deplasează în urma unei atracţii dintre poli şi centromeri, altele că ar exista o extindere şi apoi o contracţie a fibrelor fusului, ceea ce ar contribui la deplasarea cromozomilor. Mai există şi ipoteza că aparatul mitotic ar fi un fel de gel, în care are loc contractarea fibrelor cromozomice, drept consecinţă a hidratării acestui gel. Contractarea

42

fibrelor a fost comparată de unii cercetători cu contracţia fibrelor musculare.Telofaza. În cursul telofazei, aparatul mitotic se transformă. Fibrele fusului

dispar, iar cromozomii ajung la cei doi poli, se despiralizează, reconstituind filamentele de cromatină, care se subţiază, se alungesc şi iau forma unui ghem. Fragmentele membranei nucleare migrează spre poli, se agregă în jurul filamentelor de cromatină, dând naştere câte unei membrane pentru fiecare din cei doi nuclei care se formează. În timpul acesta are loc procesul de reconstituire a nucleolilor în numărul în care au fost prezenţi în nucleul iniţial. Totodată, corpul celulei se ştrangulează şi, prin formarea unui perete despărţitor, iau naştere două celule.

În figura 2.16. este redată schema mitozei.Timpul în care are loc mitoza depinde de ţesutul în care se găseşte celula, de

starea fiziologică a organismului şi de anumiţi factori externi. Ea poate dura de la câteva minute până la 200 minute. S-a stabilit, de asemenea, că mitoza este mai activă în timpul odihnei şi somnului la animale sau întunericului la plante. Dintre toate fazele din tot ciclul mitotic, profaza este cea mai lungă (cca 60%), telofaza mai scurtă (cca 30%), iar metafaza şi anafaza sunt şi mai scurte (cca 5%).

Citokineza. Diviziunea nucleului este însoţită aproape întotdeauna şi de diviziunea citoplasmei. Se crede că aparatul mitotic ar răspunde şi de diviziunea citoplasmei, dar este greu de precizat dacă el este absolut necesar pentru realizarea ei. Deşi nu se cunosc toate procesele de legătură dintre kariokineză şi citokineză, nu trebuie să ne îndoim că ele există şi trebuie să existe. Părerea că aparatul mitotic, în special centrele mitotice de la polii fusului au un rol în citokineză pare a avea o confirmare experimentală. În cazul când se formează un singur pol, ciclul mitotic decurge în întregime în afara mişcării cromozomilor în anafază, însă niciodată celula nu se divide, nu are loc diviziunea citoplasmei.

În cursul diviziunii mitotice structura citoplasmei suferă modificări importante. Membrana nucleară dispare, conţinutul cromozomic al nucleului se dispersează în citoplasmă, iar reticulul endoplasmic îşi modifică structura, reducându-se.

Vâscozitatea celulei scade treptat, ajunge la minimum în metafază, după care creşte din nou, ajungând la starea iniţială în telofază.

43

Cercetându-se la microscop mitoza, s-a descoperit că citoplasma se mişcă în jurul fusului, la început paralel cu axul fusului, apoi perpendicular pe el. În acelaşi timp, în telofază se formează fragmoplastul la ecuatorul celulei, alcătuit din totalitatea unor porţiuni limitate de membrană. Acestea vor forma membrana ce va despărţi cele două celule rezultate în urma mitozei. Formarea peretelui despărţitor între cele două celule este

Fig. 2.16. Reprezentarea schematică a mitozei la un organism cu 2n=4 cromozomi A-profază timpurie; B-profaza; C-metafaza; D-anafaza; E-telofazaF-interfaza.

44

ajutată şi de ştrangularea celulei care se divide. Toţi constituienţii citoplasmatici se repartizează în părţi egale în cele două celule fiice.

Din punct de vedere fiziologic, în mitoză celula trece printr-o perioadă de scădere a activităţii sale. Procesul de sinteză proteică scade, după părerea unora, până la întrerupere.

Diviziunea mitotică prezintă importanţă, deoarece în timpul ei are loc procesul de dedublare a materialului genetic, iar cromozomii, care apar destul de vizibil în metafază, pot fi uşor studiaţi la microscop.

Amitoza. În afară de mitoză se observă în multe ţesuturi la plante sau animale o diviziune simplă, în care nucleul şi citoplasma se împart în două sau un multiplu de doi, formând mai multe celule. Amitoza a fost constatată în endospermul angiospermelor, în antipodele sacilor embrionari, în celulele somatice ale ţesuturilor reproducătoare, în celulele epiteliului uterin al mamiferelor etc.

Caracteristica amitozei este lipsa fusului acromatic. Este posibil ca la originea amitozei să stea dublarea sau multiplicarea cromozomilor în interiorul membranei nucleare, fenomen numit endomitoză.

În ultimul timp s-au intensificat cercetările pentru clarificarea cauzelor ce determină amitoza. Observaţiile făcute la endospermul angiospermelor arată că amitoza este prezentă nu în fazele timpurii ale dezvoltării, ci în cele târzii, deci în faza când funcţiile endospermului se reduc la acumularea de substanţe de rezervă sau la trecerea acumulării de substanţe energetice în embrion. Amitoza este caracteristică celulelor cu activitate fiziologică redusă.

Sunt date care arată că diviziunea mitotică se poate restabili la celulele care una sau mai multe generaţii s-au reprodus pe cale amitotică.

Endomitoza. Prin endomitoză se înţelege multiplicarea numărului de cromozomi în nucleu fără ca membrana nucleară să se dezorganizeze. Cromozomii rezultaţi se duplică fără a se individualiza, conţin un număr mare de cromatide şi se numesc politeni. Endomitoza este urmată de creşterea în volum atât a nucleului, cât şi a celulei.

Endomitoza se întâlneşte la celulele din diferite ţesuturi, cum ar fi acelea ce căptuşesc anterele de la Spinacea oleracea. În nucleul acestor celule se observă la microscop apariţia cromozomilor, scurtarea lor (ca şi la profaza mitozei), după care ei nu mai sunt vizibili.

Endomitoza este condiţionată de anumite stări fiziologice ale celulei, care împiedică formarea aparatului mitotic.

2.5.2. Meioza

Meioza reprezintă o formă de diviziune celulară caracteristică organismelor ce se înmulţesc pe cale sexuată şi în urma căreia din celulele somatice cu 2n cromozomi se formează celulele sexuale cu n cromozomi. Reducerea numărului de cromozomi este fenomenul invers procesului de dublare al lor, care are loc în urma fecundării. Dacă organismele ar forma celule sexuale cu acelaşi număr de cromozomi ca în celulele somatice, în fiecare generaţie numărul de cromozomi din celulele organismelor s-ar dubla.

Meioza asigură, deci, menţinerea constantă a numărului de cromozomi de-a lungul generaţiilor la organismele ce se înmulţesc sexuat.

Meioza cuprinde două diviziuni succesive: meioza primară, numită şi

45

heterotipică sau reducţională, în care din celulele diploide se formează celule haploide şi meioza secundară sau homeotipică, în care din celulele haploide se formează tot celule haploide.

În meioza primară, fazele prin care trece diviziunea celulară sunt aceleaşi ca la diviziunea mitotică, numai că profaza este mult mai complexă şi cuprinde mai multe stadii: leptonema, zigonema, pachinema, diplonema şi diachineza.

Profaza I. În stadiul de leptonema, nucleul se măreşte în volum. Cromozomii apar iniţial sub forma unor filamente foarte fine, în lungul cărora se pot distinge nişte îngroşări, cromomerele, ca urmare a unor zone mai dense de spiralizare a lor. Aparent, filamentul este format dintr-o singură cromatidă, din care cauză cromozomii se numesc monovalenţi, iar numărul lor este egal cu 2n.

Stadiul de zigonema corespunde cu împerecherea cromozomilor omologi, doi câte doi, formând perechi sau cromozomi bivalenţi. Fenomenul de alăturare a celor doi cromozomi în lungul lor poartă numele de sinapsă. În fiecare pereche se găseşte un cromozom de origine maternă şi unul de origine paternă. Sinapsa începe într-un anumit punct de pe lungimea cromozomului şi se continuă apoi în tot lungul acestuia, fiind atât de perfectă, încât toate segmentele omoloage se alătură faţă în faţă. Prin omologie se înţelege similitudinea structurală şi funcţională a cromozomilor. Dacă dintr-un cromozom lipseşte un segment, porţiunea corespunzătoare a cromozomului pereche face o buclă, asigurând sinapsa pentru celelalte regiuni ale cromozomilor.

Sinapsa are loc în două etape: în prima etapă se produce o aliniere a cromozomilor omologi, iar în a doua etapă apropierea lor fie la unul din capete sau ambele, fie în mai multe puncte pe lungimea cromozomilor, după care se continuă pe toată lungimea. Această apropiere duce la formarea aşa-numitelor complexe sinaptinemale. Apropierea cromozomilor constituie unul din cele mai importante momente ale meiozei. În legătură cu forţele ce acţionează pentru atragerea cromozomilor, există astăzi mai multe ipoteze neconfirmate. Astfel, se presupune că ele ar fi de natură electrostatică sau, datorită structurii lor moleculare, ar poseda o energie de rezonanţă.

În stadiul de pachinema, cromozomii se scurtează, se îngroaşă, iar legătura dintre perechi devine din ce în ce mai intimă, fapt care a determinat denumirea de gemeni cromozomici.

In stadiul de diplonema, la fiecare dintre membrii bivalentului se pot observa câte două cromatide surori, astfel că perechea de cromozomi este constituită din patru cromatide care alcătuiesc aşa numita tetradă cromozomică. Cromozomii omologi au tendinţa de a se îndepărta unul de altul; cromatidele ne surori sunt însă reţinute în mai multe puncte de contact numite chiasme. Chiasma este considerată ca reprezentând manifestarea citologică a crossing-over- ului. Acest fenomen va fi analizat într-un capitol următor, el prezentând o mare importanţă în studiul eredităţii.

In stadiul de diachineză, cromozomii ce alcătuiesc perechile se îndepărtează, scurtarea lor devenind şi mai accentuată. Spaţiile dintre chiasme se lărgesc, acestea se deplasează către extremităţile perechilor de cromozomi, aşa încât, la sfârşitul acestui stadiu, ei apar conectaţi numai la extremităţile lor. Cu aceasta se încheie profaza primară.

Metafaza I. Membrana nucleară dispare şi se formează fusul de diviziune. Tetradele cromozomice se repartizează în planul ecuatorial al celulei. Fiecare cromozom omolog alcătuit din două cromatide surori se ataşează la nivelul centromerului de firele fusului, pentru a conduce cromozomii la polii celulari. Odată cu îndepărtarea lor dispar şi

46

ultimele chiasme.Anafaza I. Cromozomii bicromatidici migrează la polii celulei. Ei pot diferi din

punct de vedere genetic, în urma schimbului de segmente care a avut loc în stadiile anterioare.

Telofaza I. Cromozomii ajunşi la cei doi poli ai celulei formează câte un nucleu cu un număr haploid de cromozomi. Fenomenul care duce la separarea celor două celule poartă numele de plasmodiereză, iar cele două celule haploide formează o diadă.

Odată cu încheierea acestei faze nucleii intră în interchineză. Cromozomii prezintă cromatidele perechi separate, dar unite numai prin centromeri, aspect caracteristic numai meiozei. După un interval scurt începe a doua fază a diviziunii meiotice, homeotipică, care cuprinde următoarele faze:

Profaza II şi metafaza II. Cromozomii apar formaţi din cromatide surori, care se orientează în planul ecuatorial al fusului de diviziune, ce apare la sfârşitul profazei secundare. Cromozomii se clivează imediat după clivarea centromerilor.

Anafaza II şi telofaza II. Cele două cromatide se îndepărtează spre cei doi poli, unde constituie doi nuclei. Din diada iniţială cu celule haploide s-au format, deci, patru celule haploide ce formează o tetradă celulară.

Aceste celule, în urma unor procese, vor da naştere la gameţi. In figura 2.17. este redată schema generală a meiozei.

47

Fig. 2.17. (partea I) - Schema meiozei la un organism cu 2n=4 cromozomi A-leptonem; B-zigonem; C-pachinem; D-diplonem E-metafaza I; F-anafaza I.

48

Fig. 2.17. (continuare) - Schema meiozei la un organism cu 2n=4 cromozomi G-telofaza I; H-interfaza; I-profaza II; J-metafaza II;

K-anafaza II; L-telofaza II

49

2.6. GAMETOGENEZA ŞI SYNGAMIA

2.6.1. Gametogeneza la animale

La animale, gameţii (n) sunt reprezentaţi prin ovule şi spermatozoizi, produşi în organe speciale, ovare şi, respectiv, testicule.

La originea lor se află celulele somatice (2n), care, în urma unui şir de diviziuni, dau naştere la celule sexuale primare, nediferenţiate din punct de vedere citologic. Din acestea se formează goniile, foarte asemănătoare la început pentru ambele sexe, după care, se diferenţiază în spermatogonii primare, la masculi şi ovogonii primare, la femele.

La rândul lor, acestea, prin diviziuni mitotice repetate, se dezvoltă şi devin spermatogonii şi ovogonii secundare. Urmează o altă serie de diviziuni mitotice, care duc la formarea celulelor sexuale nemature, cu un număr de cromozomi diploid, spermatocite şi ovocite.

Până la acest stadiu întreaga evoluţie s-a desfăşurat în stare de diploidie, iar ca proces de multiplicare al celulelor a fost mitoza. Procesele ce urmează în continuare şi care duc la formarea celulelor sexuale diferite sunt diferenţiate şi se vor trata în mod separat. Formarea celulelor sexuale poartă denumirea de gametogeneză.

Spermatogeneza. Spermatocitele primare suferă un proces de diviziune meiotică şi dau naştere la spermatocite de gradul doi, cu un număr haploid de cromozomi. Urmează apoi a doua diviziune, însă de tip mitotic, rezultând patru spermatide, tot haploide. În sfârşit, prin procesul spermiogenezei, destul de complex, din spermatide se formează spermatozoizii. Nucleul spermatidei devine partea voluminoasă a lor. Organitele citoplasmice devin componenţi citologici seminali ce-i asigură mişcarea şi pătrunderea în ovul (de exemplu, mitocondriile formează filamente spiralate). Citoplasma reprezintă numai o pătură foarte subţire ce înconjoară nucleul. Forma spermatozoizilor este variată şi caracteristică speciei.

Ovogeneza. Între formarea celulelor sexuale mascule, spermatozoizii şi formarea celulelor sexuale femele, ovulele, se poate face un paralelism, deşi există şi diferenţe între ele. Astfel:

- ovocitele cresc într-o perioadă de timp mai lungă decât spermatocitele, deoarece au nevoie de acumularea de materii de rezervă mai mari pentru viitoarele ovule. În această perioadă, uneori, cromozomii apar sub formă specifică numită "perie de lampă";

- ovocitul, prin două diviziuni meiotice, produce un singur gamet capabil de a participa la fecundare, celelalte trei celule fiind avortate (numite şi corpi polari);

- diviziunea I şi diviziunea a II-a meiotică din ovogeneză poate dura până în momentul când ovulul participă la fecundare sau chiar după pătrunderea spermatozoidului în citoplasma ovulului. În cazul spermatogenezei I şi a II-a, diviziunea meiotică se termină până în momentul formării spermatozoidului.

În figura 2.18. este reprezentată schema spermatogenezei, iar în figura 2.19. cea a ovogenezei.

50

Celulele sexuale provin din celule somatice nediferenţiate. Ele se pot forma în stadiul embrionar, cum este cazul la mamifere, iar la altele în stadii şi mai timpurii, ca la Ascaris megalocephala. La aceasta, primii doi blastomeri din diviziunea ovulului se deosebesc prin faptul că unul formează numai celule somatice cu 2n cromozomi, iar altul, mai mic, embrionul sexual, cu n cromozomi.

2.6.2. Sporogeneza şi gametogeneza la plante

Procesul de gametogeneză la plante se aseamănă într-o oarecare măsură cu acel al animalelor, dar prezintă o serie de trăsături specifice.

Formarea celulelor sexuale mascule la plante se aseamănă cu cea de la animale până la stadiul de spermatidă, iar formarea celulelor sexuale femele până la stadiul de oosferă nematură.

Sporul haploid rezultă în urma diviziunii meiotice, proces numit sporogeneză. Din spor se dezvoltă gametofitul, formă sub care se prezintă unele organisme în cea mai mare parte a vieţii lor, cum este la ciuperci, muşchi, ferigi. La angiosperme, faza haploidă este redusă ca timp şi gameţii se formează după ce nucleii sporului mascul şi femel suferă unele diviziuni mitotice.

Fig. 2.18. Schema spermatogenezei

51

Fig. 2.19. Schema ovogenezei

Microsporogeneza şi microgametogeneza. În zona profundă a anterelor florilor, după mai multe diviziuni mitotice repetate se formează celule- mamă ale grăunciorilor de polen. Acestea sunt analoage cu spermatocitele de ordinul I de la metazoare şi cu ele se încheie diplofaza.

Fiecare celulă-mamă a grăunciorilor de polen dă naştere în urma diviziunii meiotice la o tetradă de microspori, adică la patru grăunciori de polen haploizi. Grăunciorul de polen constituie gametofitul mascul.

Megasporogeneza şi megagametogeneza. În ovar se formează şi se dezvoltă sacul embrionar (megasporul). El poate să aibă origine diferită: din mai multe celule ale nucelei; dintr-o celulă din nucelă; dintr-o celulă din subepiderma nucelei. Se va urmări cazul al doilea, care este mai simplu şi mai general la plante.

Celula iniţială din care îşi are originea sacul embrionar se divide în două, formând o celulă superioară, care prin diviziuni repetate va da naştere la un ţesut numit calotă şi o celulă inferioară (celula-mamă a tetrasporilor).

Celula-mamă a tetrasporilor suferă două diviziuni, dintre care prima este reducţională şi din care iau naştere patru celule haploide. Una din ele creşte mai mult, devine sac embrionar, în timp ce celelalte trei se resorb.

Cu formarea megasporului se încheie megasporogeneza.Megasporul (megasporangele) suferă următoarele transformări: nucleul se

divide în doi nuclei, care se deplasează către cei doi poli ai megasporului. Fiecare se divide, dând naştere la câte patru nuclei. Câte unul din aceştia se îndreaptă spre centrul

LMlKUI

52

megasporului, unde fuzionează, dând naştere la nucleul secundar al sacului embrionar sau nucleul de fuziune.

Cei şase nuclei rămaşi se înconjoară cu citoplasmă şi devin celule; la un pol este situată oosfera şi două sinergide, iar la celălalt pol trei antipode.

O schemă mai detaliată asupra etapelor care se succed în ciclul vital la o plantă superioară (porumbul) şi în care se poate urmări sporogeneza şi gametogeneza este prezentată în figura 2.20.

Fig. 2.20. Sporogeneza şi gametogeneza la porumb

2.6.3. SyngamiaEste fenomenul prin care se unesc doi gameţi (n) pentru a forma un zigot (2n).

Ea asigură trecerea de la faza haploidă la faza diploidă în ciclul de dezvoltare a unui organism.

Când gameţii sunt diferenţiaţi din punct de vedere morfologic se spune că ei sunt heterogami sau anisogami, iar fenomenul a fost denumit heterogamie sau anisogamie. De obicei, gametul femel este mai voluminos. La metazoare poartă numele de ovul, iar la plantele superioare de oosferă. Gametul mascul este mai mic şi redus la un nucleu înconjurat de puţină citoplasmă.

El se numeşte spermatozoid la animale şi la plantele inferioare. La conifere şi angiosperme, nucleul haploid al grăunciorului de polen, după o primă diviziune, dă naştere nucleului vegetativ şi nucleului germinativ, iar după o altă diviziune a nucleului

53

germinativ rezultă două spermatii. Una din spermatii se uneşte cu oosfera, dând naştere zigotului diploid, iar a doua se uneşte cu nucleul diploid al sacului embrionar, dând naştere endospermului triploid.

La animale, gametul mascul (spermatozoidul) vine în contact cu ovulul şi prin eliberare de enzime hidrolizante dizolvă membrana ovulului, pătrunzând în interior. Apoi, cei doi nuclei, acel al spermatozoidului şi acel al ovulului realizează syngamia.

Din punct de vedere genetic, syngamia reconstituie perechile de cromozomi omologi, întrunind în acelaşi genotip eredităţile celor doi părinţi. În acelaşi timp, fecundarea asigură continuitatea materialului genetic în generaţiile următoare.CAPITOLUL 3

BAZELE MOLECULARE ALE EREDITĂŢII9

Moto:"Genetica moleculară a luat naştere când s-a recunoscut că gena este subdivizibilă"

Salvador Luria

"Structura ADN trebuie înţeleasă în raport cu toate funcţiile sale, aşa cum înţelegerea funcţiei necesită o cunoaştere a structurii. Fiecare funcţie trebuie descompusă, apoi reconstituită în detaliile sale moleculare şi, în final, orientată în arhitectura şi economia celulară"

A. Kornberg

Progresele înregistrate în genetica clasică au ridicat, ulterior, numeroase probleme legate de natura biochimică a materialului genetic, respectiv a genelor.

Identificarea şi studierea aprofundată a materialului genetic ridicau numeroase probleme, de aceea nu au putut fi rezolvate decât prin cercetări interdisciplinare de genetică, biochimie, medicină, fiziologie, fizică, matematică şi altele. Aceste cercetări constituie realizările cele mai importante ale ştiinţei contemporane şi au pus bazele geneticii moleculare, care studiază ereditatea şi variabilitatea organismelor la nivel molecular.

Complexitatea structurilor macromoleculare, interacţiunile de ordin informaţional dintre acizii nucleici şi proteine, multitudinea tipurilor de proteine ce alcătuiesc organismele, au generat structuri supramoleculare care asigură existenţa, variabilitatea şi continuitatea materiei vii.

În urmă cu trei decenii nimeni nu şi-ar fi închipuit că oamenii vor cunoaşte structura genelor şi modul lor de exprimare într-un sistem celular. Într-o perioadă scurtă de

54

timp s-a demonstrat că moleculele de acid dezoxiribonucleic şi acid ribonucleic, atât la organismele inferioare cât şi la cele superioare, conţin în mod codificat informaţia genetică pentru sinteza proteinelor. S-au descifrat mecanismele intime care stau la baza complicatelor reacţii prin care se sintetizează o proteină în organism, fenomene ce au fost reproduse apoi şi în laborator, aşa cum se va vedea într-un alt capitol referitor la ingineria genetică.

3.1. PROTEINE ŞI ACIZI NUCLEICI

Studiile de biochimie privind substratul material al eredităţii pretind o cunoaştere temeinică a componentelor chimice din celulă, precum şi a proceselor de transformare a acestora.

Din multitudinea de componente chimice ce intră în alcătuirea celulei, principalul substrat al materiei vii îl constituie proteinele şi acizii nucleici.

Proteinele sunt grupate în holoproteine, constituite numai din aminoacizi şi heteroproteine care, pe lângă aminoacizi, mai posedă o grupă prostetică. Din grupul heteroproteinelor fac parte: fosfoproteinele, glicoproteinele, cromoproteinele, lipoproteinele şi nucleoproteinele. Nucleoproteinele sunt formate dintr-o proteină şi o grupare prostetică reprezentată de nucleină.

Se cunosc mai multe tipuri de holoproteine, unele aparţinând grupului de polipeptide cu greutate moleculară mică, denumite protamine, care conţin până la 90% arginină şi sunt lipsite de aminoacizi aromatici şi cu sulf. Alte tipuri de proteine cum ar fi histonele, conţin lizină şi arginină, aminoacizi aromatici şi cu sulf, leucină, alanină, glicină şi acid glutamic. Ambele tipuri de proteine au caracter bazic şi formează săruri cu acizii nucleici, de tipul nucleoproteinelor. Un alt tip de proteină care conţine şi triptofan, îl constituie proteina fibrilară care intră în constituţia fibrelor celulare. Proteinele sunt formate din aminoacizi care sunt legaţi prin legături peptidice, alcătuind lanţuri polipeptidice, având o structură macromoleculară. Datorită faptului că proteinele conţin în molecula lor lanţuri şi catene mari, cu structuri interne diferite, pot apărea în spaţiu diferite configuraţii, grupate în mai multe niveluri de organizare: structura primară, secundară, terţiară şi cuaternară.

Structura primară a proteinelor se referă la constituţia chimică a fiecărui lanţ polipeptidic ce intră în alcătuirea lor. Specificitatea unei proteine este dată de numărul lanţurilor polipeptidice, iar specificitatea unui lanţ polipeptidic este dată de numărul, felul şi ordinea aminoacizilor ce îl constituie. În lanţurile polipeptidice, participă mai frecvent 20 de tipuri de aminoacizi, deşi numărul aminoacizilor cunoscuţi se ridică la aproximativ 100. Faptul că fiecare proteină se caracterizează printr-o anumită secvenţă de aminoacizi, orice schimbare a acestei secvenţe va atrage modificări ale proteinei şi ca atare şi a fenotipului organismelor vii.

Structura secundară se referă la orientarea spaţială a aminoacizilor, unii faţă de alţii în cadrul lanţului polipeptidic. Datorită unor forţe de atracţie necovalente sau covalente chiar, anumite porţiuni din lanţul polipeptidic se atrag, rezultând o serie de torsionări şi orientări în diferite direcţii a lanţului polipeptidic, dându-i o anumită configuraţie spaţială.

Structura terţiară se formează când între aminoacizi îndepărtaţi ai aceluiaşi lanţ polipeptidic se formează legături chimice, dând moleculei proteice o configuraţie spaţială

55

foarte neregulată.Structura cuaternară se întâlneşte la proteinele formate din mai multe lanţuri

polipeptidice, ce por fi identice sau diferite ca structură.Din cercetările efectuate de biochimişti se desprinde unul din cele mai

importante principii ale biologiei moleculare: structura secundară, terţiară şi cuaternară a unei proteine este determinată de structura primară a lanţului polipeptidic. Acest principiu a făcut posibilă cunoaşterea modului cum se realizează în celule sinteza enzimelor şi a proteinelor.

Natura şi structura proteinelor determină specificitatea biologică a organismelor, a fiecărei specii în parte, a organelor şi ţesuturilor. Numărul mare de izomeri, succesiunea diferită a aminoacizilor din macromoleculele proteice asigură tocmai individualitatea biochimică şi genetică a organismelor.

Acizii nucleici şi nucleoproteinele sunt componenţii cei mai importanţi ai celulelor vegetale şi animale. Ei participă la procesele de diviziune celulară, de creştere şi diferenţiere celulară şi determină specificitatea materiei vii.

Acizii nucleici au fost descoperiţi în anul 1871 când F. Miescher identifică în spermatozoizii peştelui somon (Salmo salar) o substanţă denumită nucleină, formată dintr-o proteină şi un acid organic ce conţine fosfor. Acest acid organic a fost identificat pentru prima dată de către R. Altmann în anul 1899 şi l-a denumit acid nucleic. Biochimistul Kossel a demonstrat că nucleina este formată din doi acizi nucleici: acidul dezoxiribonucleic (ADN) şi acidul ribonucleic (ARN). Acidul dezoxiribonucleic se găseşte în cea mai mare parte în nucleul celulelor vegetale şi animale, iar acidul ribonucleic se găseşte atât în nucleu, cât şi în citoplasmă.

Acizii nucleici, respectiv nucleoproteinele, constituie, alături de alte proteine, substanţele de bază din care este alcătuit cromozomul.

Organismele cele mai simple, cum ar fi virusurile, sunt alcătuite aproape numai din nucleoproteine.

3.2. DOVEZI PRIVIND ROLUL GENETIC AL ADN

Descoperirile care au avut loc la nivelul celulei au permis o grupare a structurilor care deţin funcţii ereditare. Ne referim la acele structuri care deţin o informaţie ereditară şi care au continuitate şi stabilitate celulară. Teoria cromozomică a eredităţii a atribuit cromozomilor şi genelor rolul principal în ereditate, deşi nu se cunoşteau încă prea multe despre structura chimică a materialului genetic.

Identificarea materialului genetic constituie imperativul geneticii în perioada de la mijlocul secolului nostru. Pentru aceasta trebuiau descoperite şi dovedite structurile chimice care deţin caracteristicile de bază ale materialului genetic: de a stoca şi transmite informaţia ereditară şi de a-şi menţine stabilitatea cantitativă şi calitativă pe parcursul diviziunii celulare.

Cercetările care s-au făcut la începutul secolului XX privind proteinele şi enzimele, au demonstrat marea diversitate şi complexitate a acestora, considerându-se că şi genele ar fi tot de natură proteică.

Problema care se pune în această etapă era dacă genele, care ar avea o natură proteică, pot să determine sinteza altor proteine şi respectiv enzime. Cercetările au demonstrat că din punct de vedere chimic, un lanţ polipeptidic nu poate servi pentru

56

propria sinteză, în primul rând datorită faptului că aminoacizii nu manifestă atracţie chimică pentru aminoacizi identici.

Prima ipoteză a legăturii dintre o genă şi sinteza unei enzime a fost elaborată în anul 1908 de către medicul englez Garrod care a studiat maladiile ereditare umane ce afectează metabolismul intermediar al fenilalaninei.

Identificarea materialului genetic a fost posibilă datorită descoperirii unor fenomene ereditare de maximă importanţă:

- transformarea bacteriană prin intermediul ADN;- transformarea la eucariote prin intermediul ADN;- recombinarea genetică în cursul reproducerii sexuate la bacterii;- transducţia bacteriană cu ajutorul virusurilor;- transmiterea informaţiei ereditare de către ARN viral.

3.2.1. Transformarea la procariote

În anul 1928, bacteriologul englez F. Griffith a efectuat mai multe experienţe cu pneumococi (Diplococcus pneumoniae), o bacterie care produce la mamifere boala numită pneumonie. Virulenţa ei este determinată de existenţa unei capsule formată din polizaharide care împiedică fenomenul de fagocitoză. Coloniile acestor bacterii sunt netede şi vâscoase, motiv pentru care s-au notat cu S (engl. smooth = neted). După reacţia imunologică, determinată de tipul de polizaharide ce alcătuiesc capsula, există mai multe tipuri de pneumococi S: SI, SII, SIII etc. Tipul S poate da naştere prin mutaţii spontane la forme lipsite de capsulă, a căror colonii au suprafaţa rugoasă, notată cu R (engl. rough = aspru, rugos), care sunt nevirulente. Pneumococii de tip R pot fi: RI, RII, RIII, în funcţie de tipul S din care provin. F. Griffith a injectat la şoareci pneumococi nevirulenţi de tip RII împreună cu pneumococi virulenţi de tip SIII, însă aceştia din urmă fuseseră omorâţi prin căldură. Surprinzător a fost faptul că şoarecii au murit de pneumonie, iar din aceştia s-a separat atât pneumococi de tip RII cât şi pneumococi de tip SIII. Concluzia care s-a desprins a fost că pneumococii de tip RII s-au transformat în pneumococi de tip SIII. Mutaţia este exclusă în acest caz deoarece tipul RII ar fi trebuit să muteze în tipul SII.

Cauza transformării pneumococilor necapsulaţi şi nevirulenţi în pneumococi capsulaţi şi virulenţi a rămas necunoscută până în anul 1944, când un grup de cercetători americani, O. T. Avery, C. M. Mac Leod şi M. Mc. Carty, au reluat experienţele făcute de Griffith cu scopul de a identifica substanţa chimică ce induce transformarea. Ei au extras ADN de la pneumococii de tip SIII şi l-au introdus în mediul de cultură al pneumococilor de tip RII. În cultură, pe lângă pneumococii de tip RII au apărut şi un număr mic de pneumococi de tip SIII, dovedindu-se că agentul transformator este ADN de la tipul donor. Această experienţă poate fi redată sintetic astfel:

RII + ADN de la SIII in vltro RII + SIII 24 oreÎnsuşirea de virulenţă sau nevirulenţă este legată de prezenţa sau absenţa

capsulei polizaharidice ce înconjoară pneumococul. ADN transformator a indus pneumococilor nevirulenţi, acapsulaţi, însuşirea de virulenţă, de formare a acestei capsule.

Cu ajutorul ADN s-au realizat transformări genetice şi pentru alte însuşiri la bacterii. Pneumococii sensibili la streptomicină (Sts) au fost transformaţi în pneumococi rezistenţi la streptomicină (Str) sub influenţa ADN extras de la pneumococii rezistenţi la acest antibiotic.

57

Fenomenul de transformare genetică s-a realizat şi la alte specii de bacterii: Bacillus subtilis, Hemophilus mfluenzae, Escherichia coli etc.

Transformarea genetică este posibilă numai dacă bacteriile receptoare prezintă o stare de competenţă, care le permite interacţiunea cu un fragment de ADN exogen, asigurând înglobarea ireversibilă a acestuia. Competenţa este o stare fiziologică tranzitorie care variază mult în cursul diferitelor faze ale ciclului de multiplicare celulară. Celulele bacteriene rămân incompetente dacă sunt cultivate la pH mai mic de 7,4, în prezenţa unor enzime proteolitice sau la densităţi celulare mici, condiţii în care proteina activator, ce induce competenţa nu este sintetizată sau este inactivată.

Proteina activator este un polipeptid endogen cu greutate moleculară mică, cationic, bogat în aminoacizi bazici şi hidrofobi, sensibil la enzimele proteolitice şi extrem de aderent la toate suprafeţele.

Starea de competenţă presupune o serie de modificări ale peretelui celular bacterian. Proteina activator determină o serie de alterări de suprafaţă prin acţiunea murein-hidrolazei, peretele celular devenind mai poros şi cu o suprafaţă intens electropozitivă, ceea ce favorizează legarea fragmentelor de ADN exogen, încărcate electronegativ (Zarnea G., 1986).

În ceea ce priveşte mecanismul de transformare genetică se afirmă că ADN exogen pătrunde în celula bacteriană printr-o regiune denumită mezozom. Cromozomul bacterian este ataşat de membrana celulară tot în zona mezozomului. Pătruns în celula bacteriei acceptor, ADN exogen realizează o sinapsă, cu o zonă cu nucleotide complementare din cromozomul acesteia. În final, ADN exogen, se integrează în cromozomul bacteriei receptoare. ADN exogen este o secvenţă de 900 de nucleotide, în medie, reprezentând, frecvent, o singură genă, mai rar două, trei gene. Integrarea ADN exogen în cromozomul bacterian, formează un ADN heteroduplex, deoarece nu se realizează o complementaritate perfectă a nucleotidelor. În replicarea ulterioară a acestui ADN, vor rezulta două molecule, una de tipul ADN receptor şi cealaltă de tip ADN transformat. (Raicu P., 1997).

3.2.2. Transfecţia la procariote

Rolul genetic al ADN a fost pus în evidenţă şi printr-o serie de experienţe cu bacteriofagi (virusuri ce atacă şi distrug bacteriile). Importante în acest sens sunt experienţele efectuate de A. Hershey şi M. Chase (1952) privind infecţia virală, constituind şi primele experienţe de transfecţie, care constă în introducerea de ADN exogen în celule receptor. Ei au folosit bacteriofagii din

58

seria T şi în special bacteriofagul T2, unul din cei mai mari bacteriofagi (24002500 Â). Bacteriofagul este constituit din cap şi coadă. Capul conţine în interior ADN iar învelişul (capsida) şi coada sunt constituite din proteine (figura 3.1). Fagii se reproduc numai în celulele bacteriene cu ajutorul aparatului enzimatic al acestora.

Infecţia virală are loc astfel: fagul se prinde cu filamentele codale de membrana bacteriei. Enzimele fagului dizolvă în acest punct membrana bacteriei, iar ADN fagic este introdus prin coada acestuia în celula bacteriană. Într-un interval de timp destul de scurt, în interiorul bacteriei se formează câteva sute de bacteriofagi, bacteria fiind distrusă (liza bacteriei) şi fagii sunt eliberaţi putând infecta alte celule. Faptul că bacteriofagii se reproduc în interiorul bacteriei, denotă că ADN fagic are capacitatea de a se autoreproduce (funcţia autocatalitică) şi în acelaşi timp deţine informaţia genetică necesară sintezei proteinelor proprii necesare constituirii capsidei pe baza aminoacizilor liberi din celula bacteriană

Se pune întrebarea dacă, pe lângă ADN fagic, în interiorul bacteriei nu pătrund şi proteinele virale. Pentru a clarifica acest aspect A. Hershey şi M. Chase au folosit izotopii radioactivi P32 şi S35. Fosforul radioactiv marchează molecula de ADN iar sulful radioactiv marchează proteinele.

S-au cultivat bacterii E. coli pe un mediu la care s-a adăugat fosfor radioactiv (P32). Dacă se infectează cultura cu bacteriofagi T2, vor rezulta bacteriofagi marcaţi radioactiv, deoarece ADN fagic incorporează izotopul P35. Cu aceşti bacteriofagi marcaţi s-au infectat alte bacterii neradioactive.

(funcţia heterocatalitică).

59

ADN fagic radioactiv a pătruns în interiorul bacteriilor, în timp ce capsida fagilor, nemarcată, a rămas la nivelul peretelui celular bacterian.

Dacă bacteriile au fost infectate cu bacteriofagi marcaţi cu S35, bacteriile nu devin radioactive pentru că în acest caz izotopul S35 s-a localizat numai lanivelul proteinei dincapsidă. Şi într-un caz şi în altul capsidele au rămas aderentede suprafaţa bacteriei, putând fi izolate prin agitare. În interiorul bacteriei pătrunde numai ADN fagic, care realizează procesul de transfecţie.

La eucariote, transfecţia s-a realizat prin mai multe metode: adiţia de cromozomi metafazici la suspensii celulare, cu ADN exogen purificat sau prin folosirea unui vector retroviral care poartă o anumită genă. Introducerea ADN exogen realizează modificări ale genomului receptor, în urma cărora se realizează

60

organisme modificate genetic, respectiv plante şi animale transgenice sau înlocuirea unor gene defective cu gene normale, ceea ce reprezintă terapia genică.

3.2.3. Transformarea la eucariote

Transformarea genetică la organismele superioare a evidenţiat rolul genetic al ADN. Primele experienţe de transformare genetică la eucariote au fost realizate în anul 1959 de J. Benoit, P. Leroy, R. şi C. Vendrely. S-a extras ADN din spermatozoizii şi eritrocitele masculilor din rasa de raţe Khaki Campbell şi s-a introdus intraperitoneal la bobocii de raţe din rasa Pekin. Adulţii din rasa Pekin, rezultaţi din bobocii trataţi au prezentat o serie de modificări morfologice privind culoarea penajului, a ciocului şi picioarelor, a taliei, realizându-se o nouă rasă denumită Blanche-neige.

În anul 1971, C. R. Merril şi colab. au transferat gene de la Escherichia coli în celulele umane. Astfel, gena ce metabolizează galactoza la E. coli a fost preluată de fagul lambda şi apoi transferată de acesta în celulele fibroblastice umane ce proveneau de la un bolnav de galactosemie (nu putea metaboliza galactoza).

Fenomenul de transformare a fost realizat şi la alte organisme superioare: Drosophila melanogaster, Bombyx mori, Petunia hybrida, Hordeum vulgare ş.a.

La noi în ţară, P. Raicu şi colab. (1963), au introdus prin vacuum infiltraţie ADN de la Triticum durum în boabe de grâu de la specia Triticum aestivum. Plantele rezultate din boabele tratate cu ADN exogen prezentau modificări privind culoarea şi ritmul de creştere.

3.2.4. Materialul genetic al ribovirusurilor

Astăzi se consideră că virusurile constituie sisteme complexe alcătuite din două componente: învelişul proteic care nu are rol genetic şi ADN sau ARN ce deţin mesajul genetic. Învelişul proteic denumit şi capsidă conţine unităţi mai simple denumite capsomere.

Există două categorii de virusuri, unele au ca material genetic ADN şi sunt denumite dezoxiribovirusuri, iar altele conţin ARN şi sunt denumite ribovirusuri. Ribovirusurile cele mai cunoscute sunt: virusul mozaicului tutunului (VMT), virusul poliomielitei, al encefalitei, bacteriofagul F2, virusul gripal, virusul sarcomului Rous (RSV), multe virusuri tumorale etc.

Rolul genetic al ARN a fost pus în evidenţă la virusul mozaicului tutunului de H. F. Conrat şi R. Williams (SUA, 1955) şi A. Gierer şi G. Schramm (Germania, 1956). Virusul mozaicului tutunului conţine aproximativ 6% ARNv şi 94% proteine. Ei au izolat ARNv de proteina virală şi au făcut infecţii cu ambele componente pe frunze sănătoase de tutun. S-a constatat că boala denumită mozaicul sau arsura frunzelor de tutun s-a manifestat numai la frunzele infectate cu ARNv. Se poate afirma că la ribovirusuri, ARNv

stochează informaţia genetică necesară sintezei proteinelor virale care vor constitui capsida virală.

3.3. ACIZII NUCLEICI ŞI ROLUL LOR GENETIC

61

3.3.1. Structura moleculară a acidului dezoxiribonucleic (ADN)

Studii detaliate asupra structurii moleculare a acizilor nucleici au fost efectuate mai ales după descoperirea rolului genetic, prin experienţele de transformare genetică efectuate la organismele procariote şi eucariote.

Structura moleculară a acidului dezoxiribonucleic (ADN) a fost descoperită în anul 1953 de cercetătorii J. D. Watson şi F. H. C. Crick care au studiat structura ADN prin difracţie în raze X. Cei doi cercetători au studiat ADN "in vitro" neştiindu-se dacă structura lui corespunde cu cea existentă în materia vie. Tot în anul 1953, M. Wilkins şi colab. au efectuat cercetări asupra ADN "in vivo" confirmând structura stabilită de Watson şi Crick.

In anul 1962, cei trei cercetători Watson, Crick şi Wilkins au fost distinşi cu premiul Nobel pentru medicină şi biologie, pentru contribuţiile aduse la elucidarea structurii moleculare a materialului purtător al informaţiei genetice.

Structura chimică a moleculei de ADNMolecula de ADN este formată din unităţi simple denumite nucleotide. In

componenţa unei nucleotide intră următoarele tipuri de molecule: o bază azotată, un zahar şi un radical fosforic (figura 3.2.).

Fig. 3.2. Bazele azotate, zaharurile şi radicalul fosforic din acizii nucleici

62

Bazele azotate ce intră în alcătuirea de ADN sunt de două tipuri: baze purinice şi pirimidinice.

Purina este o bază azotată alcătuită dintr-un heterociclu ce cuprinde cinci atomi de C şi patru atomi de N, iar pirimidina este o bază ce derivă din inelul benzenic, cuprinzând patru atomi de C şi doi atomi de N.

Bazele azotate purinice care intră în constituţia moleculei de ADN sunt adenina (A) şi guanina (G), iar bazele pirimidinice sunt citozina (C) şi timina (T).

Zaharul component al dezoxiribonucleotidului se numeşte dezoxiriboză (P - D - 2 dezoxiribofuranoză), fiind o pentoză.

Radicalul fosforic are trei hidroxili liberi care pot fi esterificaţi. In cazul acizilor nucleici se esterifică doi hidroxili, deci acizii nucleici sunt fosfodiesteri:

Prin unirea unei baze azotate purinice sau pirimidinice cu un zahar rezultă un dezoxiribonucleosid iar prin ataşarea la acesta a unui radical fosforic rezultă un dezoxiribonucleotid. Ataşarea radicalului fosforic se face în mod obişnuit prin intermediul carbonului 5' al dezoxiribozei, prin pierderea unei molecule de apă.

Radicalul fosforic al unui nucleotid, prin grupările acide libere, poate să se lege fie cu alţi radicali fosforici, fie cu alte nucleotide prin carbonul 3' al dezoxiribonucleotidului. Dacă grupările libere ale radicalului fosforic se leagă de alţi radicali fosforici, dezoxiribonucleotidele pot apare sub formă de monofosfat, difosfat sau trifosfat, purtând următoarele denumiri: adenozin 5'-fosfat (AMP), guanozin 5'-fosfat (GMP), citidin 5'-fosfat (CMP), timidin 5'-fosfat (TMP), ADP, GDP, CDP, TDP, ATP, GTP, CTP, TTP.

Când nucleotidele (dezoxiribonucleotidele) se leagă unele de altele, această legătură se realizează astfel: un nucleotid se leagă de nucleotidul vecin inferior prin C 3', iar de nucleotidul vecin superior prin C 5'. Se realizează un lanţ polidezoxiribonucleic, cu o formă de zig-zag, ce constituie structura primară sau monocatenară a moleculei de ADN.

La majoritatea organismelor molecula de ADN este constituită din două lanţuri (catene) polinucleotidice complementare, aceasta fiind structura secundară a ADN stabilită de către J. D. Watson şi F. H. C. Crick. Una din premisele importante pentru stabilirea structurii secundare a ADN a fost deducerea experimentală a regulii lui E. Chargaff (1951), conform căreia pot fi definite următoarele reguli cantitative: A+G = T+C; A+C = T+G; A = T şi C = G sau exprimat altfel, A/T = G/C = 1. Aceste relaţii dintre nucleotide a dus la concluzia că ADN este alcătuit din 2 catene. Răsucirile pe care le suferă o catenă sau

OHOR2OR1

O = P

Fosfodiester

OHO = P OH

OHRadical fosforic

63

molecula bicatenară alcătuiesc structura terţiară iar interacţiunea dintre două sau mai multe molecule bicatenare alcătuiesc structura cuaternară a acizilor nucleici.

Watson şi Crick au stabilit că macromolecula de ADN este alcătuită din două catene polinucleotidice, paralele, înfăşurate elicoidal în jurul unui ax comunimaginar, ocatenă având un sensascendent (3' ^ 5') iar cealaltă un sensdescendent (5' ^ 3').

Distanţa dintre două nucleotide succesive este de 3,4 Â iar pasul elicei este de 34 Â, ceea ce corespunde la 10 nucleotide. Diametrul macromoleculei de ADN este de 20 Â (figura 3.3.).

Molecula de ADN are dimensiuni foarte mari fiind cea mai mare moleculă biologică, cu o masă

moleculară ce poate ajunge la 12-16 x 106

daltoni (1 dalton = 1/12 din masa atomului de C).Cele două catene din molecula

de ADN se leagă între ele prinpunţi de hidrogen ce se realizează între o bază azotată purinică de pe un lanţ şi o bază azotată pirimidinică de pe celălalt lanţ.

Prin urmare, în macromolecula de ADN există următoarele tipuri de legături: adenină-timină

(A-T), timină-adenină (T-A), guanină- citozină (G-C) şi citozină-guanină (C-G).

Cele două catene polinucleotidice din molecula de ADN sunt complementare, în

sensul că ordinea nucleotidelor de pe o catenă determină ordinea nucleotidelor de pe cealaltă catenă. Legăturile de hidrogen dintre bazele azotate,

duble, întreadenină şi timină (A = T) şi triple între guanină şi citozină(G = C), deşi sunt legături slabe, sunt destul de numeroase de-a lungulmacromoleculei de ADN pentru a-i asigura stabilitatea şi coeziunea. Legăturile chimice slabe, cum sunt cele de hidrogen, sunt eficiente numai în cazul moleculelor complementare, cum este ADN şi anume când o protuberanţă a unei molecule intră într-o cavitate a altei molecule.

Luate separat, moleculele pirimidinice sunt mai mici decât cele purinice însă cuplurile purină-pirimidină sunt de aceeaşi dimensiune, conferind macromoleculei de ADN regularitate şi stabilitate. Macromolecula de ADN este stabilă la temperaturile fiziologice, datorită numărului mare de legături chimice şi faptului că moleculele de baze azotate se găsesc în interiorul moleculei contactul lor cu apa fiind limitat.

Fig. 3.3. Modelul structurii bicatenare a moleculei de ADN

64

3.3.2. Alte tipuri de ADN

Arhitectura moleculară a ADN stabilită de Watson şi Crick a fost confirmată printr-un mare număr de măsurători fizice. Modelul propus de cei doi autori presupune împerecherea A-T, C-G şi o răsucire a celor două catene în sensul acelor de ceasornic, deci o dublă elice de dreapta (dextrorsă) (ADN - D).

Cercetările recente bazate pe perfecţionarea metodelor de analiză (difracţia în raze X) şi a celor de sinteză "in vitro" a unor fragmente scurte de ADN, au dus la descoperirea mai multor tipuri conformaţionale de ADN, determinate de împerecheri "nelegitime" dintre bazele azotate (C-C, A-G), înlocuirea bazelor azotate cu analogi ai acestora sau schimbarea modului de răsucire a dublei elice. Tipurile de ADN ce au la bază dubla elice de dreapta, dar se deosebesc prin unele proprietăţi fizice au fost notate cu A, B, C şi D, iar tipul de ADN ce posedă două catene cu răsucire spre stânga s-a notat cu Z.

ADN de tip A se apropie mult de structura ADN originar, bazele azotate având însă o înclinaţie într-un unghi de 20° faţă de axul moleculei, ceea ce determină modificarea pasului elicei (2,8 Â în loc de 3,4 Â) şi a numărului de baze pe tur de elice (11 baze în loc 10).

ADN de tip B este aproape identic cu modelul originar. Cea mai mare parte din ADN celular este de tipul B.

ADN de tip C este tot o dublă elice de dreapta în care forţele de "împerechere" a bazelor azotate sunt mult mai slabe, ceea ce modifică conformaţia moleculei de ADN în lungime. Este întâlnită în unele genomuri virale.

ADN de tip D mai puţin cunoscut, este o dublă elice dextrorsă cu un unghi mare de răsucire (45°).

ADN-Z a fost descris de Rich şi Itakura în 1980 (Zarnea, G., 1986). Acest ADN posedă două catene care afectează o răsucire elicoidală spre stânga, datorită atât unor legături întâmplătoare între G-C, cât unei frecvenţe mai mari în moleculă a acestui cuplu de baze.

Diferenţele dintre ADN-B şi ADN- Z nu sunt fixe, fiind posibilă transformarea reversibilă a celor două tipuri.

Forma Z a ADN bicatenar a fost descrisă la un număr mic de specii: în cromozomii gigantici de la Drosophila melanogaster, Chironomidae şi în cromozomii umani.

Analizându-se fragmente de ADN s-a putut constata că într-un ADN-Z pot exista scurte fragmente de ADN-B, diferenţele dintre fragmente fiind uşor de depistat prin mijloace adecvate, de înaltă rezoluţie, datorită modificării pasului elicei, înclinării bazelor azotate şi a ordinii de succesiune a acestora. Aceasta face posibilă recunoaşterea acestor zone de către sistemele enzimatice implicate în reglajul activităţii genelor: schimbarea direcţiei de răsucire a ADN la începutul unei gene ar determina încetarea activităţii genei respective, controlul activităţii genelor fiind foarte riguros.

Există şi ipoteza că în aceste zone de tranziţie se pot ataşa cu o mai mare frecvenţă substanţele mutagene şi cancerigene, fapt ce ar putea explica baza moleculară a mutagenezei cu o frecvenţă mai mare.

În celulele eucariote, pe lângă ADN nuclear, există în organitele citoplasmatice ADN specific acestora: ADN mitocondrial (ADN-mt) şi ADN cloroplastic (ADN-cl).

ADN - mitocondrial (ADN - mt) este bicatenar şi de formă circulară,

65

asemănător într-o mare măsură cu ADN bacterian. ADN-mt nu este complexat cu histone, în electronografii apărând ca nişte fibrile cu un diametru de 25-30 Â. ADN-mt al metazoarelor este de tip A-T, conţinutul în G-C fiind variabil. Dublul helix de ADN-mt are o catenă grea, bogată în resturi de A şi o catenă uşoară bogată în resturi de T. ADN-mt este singurul tip de ADN circular ce are în secvenţa sa ribonucleotide covalent integrate, ceea ce-l face sensibil la uree şi ribonuclează, modificând forma moleculei şi oferind locuri speciale de recunoaştere pentru polimeraze.

Mărimea moleculei de ADN-mt variază în funcţie de specie la organismele inferioare având în medie o greutate moleculară de 107 daltoni, ceea ce corespunde la 15.000-17.000 perechi de baze.

La plantele superioare ADN-mt are o greutate moleculară mult mai mare 60-140 x 106 daltoni, iar conţinutul în G-C este uniform (45-47%). Informaţia genetică din ADN-mt este foarte compactă, neexistând secvenţe repetitive (introni). Se pare că pe parcursul evoluţiei intronii au fost eliminaţi din ADN-mt.

ADN - cloroplastic (ADN-cl). Fiecare cloroplast conţine cel puţin o moleculă de ADN-cl localizată în stroma cloroplastului (zona genoforă).

Pot exista mai multe molecule de ADN-cl separate spaţial, formând zone genofore separate, ataşate de un loc (situs) specific al membranei interne a cloroplastului.

Cercetările efectuate la plantele superioare şi inferioare au arătat că plastomul acestora este format din molecule de ADN-cl, dublu catenare, circulare, cu un perimetru de 40-50 p corespunzând unei greutăţi moleculare de 92 x 106 daltoni, respectiv 130 Kilobaze. Un cloroplast are în medie aproximativ 10-14g ADN, ceea ce înseamnă aproximativ 50 copii ale plastomului (Sitte P. şi colab., 1991, după Toma N. şi Anghel I., 1985). Prin studii de denaturare şi renaturare sau analiză biochimică directă, s-a constatat că la plantele inferioare conţinutul în G+C este inferior celui de A+T, în timp ce la plantele superioare conţinutul de G+C poate fi egal sau puţin mai ridicat faţă de cel de A+T. Experienţele de hibridare moleculară ADN-ADN au demonstrat că între ADN nuclear şi cel cloroplastic există un anumit grad de omologie.

În ceea ce priveşte replicarea ADN-cl, are loc după modelul semiconservativ, bidirecţional, independent de replicarea ADN nuclear. ADN-cl se replică o singură dată, atât în timpul gametogenezei, în gametul femel, în timp ce ADN-cl conţinut de gametul mascul nu se replică. În dezvoltarea ontogenetică, ADN-cl provenit de la genitorul matern se replică şi este deci menţinut, în timp ceADN-cl de provenienţă paternă (în cantităţi foarte mici) este degradat enzimatic; în acest fel se explică transmiterea pe linie maternă a genelor din ADN-cl.

ADN-cl cuprinde câteva sute de gene, genomul cloroplastic fiind mult mai mare decât cel mitocondrial, având şi un rol mult mai complex în formarea şi metabolismul cloroplastului şi a celulei, existând şi o cooperare complexă între acesta şi nucleu.

ADN-satelitic (ADN-S). Acest tip de ADN formează blocuri de unităţi repetitive (câteva milioane) în zona centromerului şi a satelitului. Numărul de secvenţe repetitive variază de la o specie la alta de la 1% până la 5% per genom. ADN-satelitic deţine funcţia de reglare a replicării ADN cromozomic, replicare ce presupune participarea proteinelor histonice.

ADN-bicatenar-circular este caracteristic cromozomului bacterian şi unor plasmide prezente în celulele procariote, cum ar fi plasmidele F, R sau Col. Dimensiunile

66

acestui ADN sunt variabile de la o specie la alta. Avantajele structurii circulare nu sunt cunoscute. Se presupune că această structură asigură protecţia moleculei de ADN faţă de degradarea enzimatică prin exonucleaze care acţionează asupra extremităţilor libere ale moleculei.

ADN monocatenar. Există unele virusuri a căror material genetic este reprezentat de un ADN monocatenar. Astfel, la virusul 0x174, molecula de ADN monocatenară are o greutate moleculară de 3 x 106 daltoni, are o formă circulară şi nu liniară. Ulterior s-au descoperit şi alţi bacteriofagi a căror material genetic este reprezentat de un ADN monocatenar: bacteriofagul S13 şi bacteriofagul F1.

Structura monocatenară a ADN de la aceste virusuri constituie o excepţie reprezentând o adaptare la viaţa specific parazitară a acestora.

3.3.3. Acidul ribonucleic (ARN)

Structura chimică a moleculei de ARN. Acidul ribonucleic (ARN) are o structură chimică asemănătoare cu cea a acidului dezoxiribonucleic (ADN). In structura chimică a ARN intră trei componente: bazele azotate, zaharul şi radicalul fosforic. Bazele azotate sunt: purinice, adenina (A) şi guanina (G) şi pirimidinice, citozina (C) şi uracilul (U). Deci o primă deosebire structurală între ADN şi ARN este prezenţa uracilului în locul timinei. Uracilul are o structură destul de apropiată de cea a timinei.

Zaharul care intră în structura moleculei de ARN este riboza, care are o formă ciclică. Combinarea unei baze azotate cu zaharul dă naştere unui ribonucleosid, iar prin adăugarea unui radical fosfat rezultă un ribonucleotid.

O altă deosebire importantă între ADN şi ARN este faptul că macromolecula de ARN este monocatenară, fiind formată dintr-un singur lanţ poliribonucleotidic. Acest fapt face ca bazele azotate purinice să nu fie în cantitate egală cu cele piridimice.

Ţinând seama de rolul pe care îl îndeplineşte ARN se apreciază că sunt două categorii: acidul ribonucleic viral (ARNv) şi acidul ribonucleic celular, implicat în sinteza proteinelor.

Acidul ribonucleic celular este de trei tipuri: acidul ribonucleic mesager (ARNm), acidul ribonucleic de transport sau solubil (ARNt) şi acidul ribonucleic ribozomal (ARNr).

Acidul ribonucleic viral (ARNv) constituie materialul genetic al unor ribovirusuri cum ar fi: virusul mozaicului tutunului (VMT), virusul gripal, virusul poliomielitei, virusul stomatitei veziculare, bacteriofagii F2, R17, QB şi altele.

Studiindu-se molecula de ARNv de la virusul mozaicului tutunului s-a determinat că este alcătuită din aproximativ 6.000 ribonucleotide, într-o anumită ordine, determinând conţinutul mesajului genetic. La mai multe virusuri molecula de ARNv este formată din două catene complementare înfăşurate elicoidal în jurul unui ax imaginar. Molecula de ARNv este în general liniară, cu excepţia virusului encefalomielitei şoarecilor, la care molecula de ARNv este circulară.

Aşa cum s-a arătat într-o experienţă anterioară, în momentul infecţiei virale, în interiorul celulei infectate pătrunde numai molecula de ARNv, care are capacitatea de a se multiplica, având rolul de matriţă pentru formarea unor molecule noi, deţinând şi informaţia genetică necesară sintezei proteinei virale.

Acidul ribonucleic mesager (ARNm). A fost descoperit în celulele bacteriene infectate cu bacteriofagi, apoi în toate celulele organismelor. A. D. Hershey şi colab.

67

(1953) au ajuns la concluzia că sinteza ARNm este dependentă de ADN. Ei au identificat într-o celulă bacteriană infectată, pe lângă ADN şi o mică cantitate de ARN, care era complementar ADN. Acest tip de ARN are rolul de a copia informaţia ereditară de pe o porţiune din molecula ADN şi de a o transmite în citoplasmă la ribozomi, organite citoplasmatice la nivelul cărora are loc sinteza proteinelor. De aceea acest tip de acid ribonucleic a fost denumit ARN mesager (messenger ARN), prescurtat ARNm (F. Jacob şi J. Monod, 1961).

Acidul ribonucleic mesager se sintetizează în procesul de transcripţie a informaţiei genetice.

Cercetările genetice au stabilit că ARNm are o durată foarte scurtă, fiind foarte repede sintetizat, dar şi foarte repede distrus. Molecula de ARNm se asociază cu ribozomii şi formează complexe denumite poliribozomi. Se afirmă că în perioada asocierii ARNm cu ribozomii, molecula nu este supusă degradării.

Lungimea catenei de ARNm este foarte variabilă, deci şi masa moleculară este variabilă, în funcţie de lungimea segmentului de ADN de pe care este copiată informaţia genetică.

Acidul ribonucleic solubil sau de transfer (ARNs sau ARNt). Acest tip de acid ribonucleic are o structură chimică asemănătoare cu a celorlalte tipuri de ARN. Are o greutate moleculară mică şi anume 25.000 daltoni, având 75-90 nucleotide, este solubil în soluţie de NaCl, de aceea i s-a dat numele de ARN solubil.

Rolul ARNs este de a transporta aminoacizii din citoplasmă la ribozomi, în procesul de sinteză a proteinelor.

Molecula de ARNs are la un capăt tripleta citozină-citozină-adenină (CCA), iar la celălalt capăt are un nucleotid ce conţine guanina (G). MoleculaARNs este monocatenară, dar are şi porţiuni bicatenare datorită legăturilor de hidrogen dintre A-U şi G-C, dându-i forma caracteristică a unei frunze de trifoi.

R. W. Holley de la Universitatea Corneli (SUA) a determinat, în anul 1965, ordinea nucleotidelor unui ARNs care transportă alanina la ribozomi, la drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae) (fig. 3.4.):

68

Fig. 3.4. Structura ARN-s ce transportă alanina la ribozomi la drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae)

Spre deosebire de celelalte tipuri de ARN, acidul ribonucleic solubil are o serie de particularităţi chimice: conţine o serie de nucleotide neobişnuite, baze ce au gruparea metilică cum ar fi: 1-metilguanina, N-dimetilguanina, 1- metilhipoxantina, hipoxantina, pseudouracilul şi altele.

Macromolecula de ARNs are trei regiuni distincte pentru recunoaşterea moleculelor sau structurilor celulare:

a) Regiunea pentru recunoaşterea aminoacidului este situată pe braţul cu codonul CCA de la un capăt al moleculei. Aminoacidul se fixează de această regiune cu ajutorul enzimei aminoacil - ARNs - sintetaza, care are o structură foarte variată de la un organism la altul, existând câte o enzimă pentru fiecare aminoacid.

b) Regiunea anticodonului este formată dintr-o tripletă de nucleotide complementară unui codon din ARNm. Numărul anticodonilor este egal cu cel al codonilor.

c) Regiunea pentru recunoaşterea ribozomului este alcătuită dintr-o secvenţă de cinci nucleotide: G-T-P-C-G (P-pseudouracilul). Această regiune realizează legătura cu ribozomul în timpul procesului de sinteză a proteinelor.

Sinteza ARNs este determinată de genele din cromozomi, gene care se găsesc într-un număr mare de copii. Teoretic ar trebui să existe atâtea tipuri de ARNs câte tipuri de codoni există, dar în realitate numărul lor este mai mic deoarece sunt şi codoni care servesc pentru punctuaţie sau sunt sinonimi.

Acidul ribonucleic ribozomal (ARNr). Acidul ribonucleic ribozomal (ARNr) reprezintă aproximativ 85% din cantitatea totală a ARN din celulă, fiind localizat numai în ribozomi. O caracteristică importantă a ARNr este aceea că se găseşte întotdeauna asociat cu proteinele. ARNr a fost izolat din ribozomii purificaţi de Escherichia coli şi s-a stabilit că are o greutate moleculară de 5 x 106, nefiind purtător al informaţiei genetice. Ribozomii sunt structuri submicroscopice celulare, fixate pe reticulul endoplasmatic,

69

constituind locul sintezei proteice.Structura ribozomului este foarte complexă, fiind alcătuit la procariote din două

subunităţi: o subunitate mare de 50 S şi o subunitate mică de 30 S. Subunitatea mare este alcătuită dintr-o moleculă foarte mare de ARNr, formată din aproximativ 3200 nucleotide, dintr-o moleculă mai mică cu 120 nucleotide şi 34 proteine diferite. Subunitatea mică este formată dintr-o moleculă mare de ARNr compusă din 1600 nucleotide şi 21 proteine diferite.

La eucariote, ribozomul este mai mare şi anume 80 S, subunitatea mică (40 S) are o moleculă de ARNr şi 30 de proteine diferite, iar subunitatea mare (60 S) are două fracţii de ARNr şi 37 proteine.

Acidul ribonucleic ribozomal are o structură bicatenară în proporţie de 60-70% iar restul are o structură monocatenară.

Sinteza ARNr se realizează prin genele din ADN specializate în acest sens şi a căror număr este foarte mare datorită necesităţii de a se sintetiza o cantitate mare de ARN r

într-un timp scurt. Astfel, la Drosophila melanogaster există 130 de gene ce răspund de sinteza ARNr, la Xenopus laevis 450, la Zea mays 5200, la Triticum aestivum 12700, la Hyacinthus orientalis 32000 gene.

Numărul de ribozomi din celulele procariotelor este de aproape 15000 iar la eucariote chiar mai mare, explicându-se astfel necesitatea unui număr mare de gene ce răspund de sinteza unor fracţii de ARNr.

3.3.4. Denaturarea şi renaturarea ADN

încălzirea unei soluţii de ADN la temperaturi de peste 65 °C, determină ruperea legăturilor de hidrogen dintre bazele azotate, cele două catene se separă rezultând un ADN monocatenar, iar fenomenul se numeşte denaturare.

Temperatura la denaturare variază de la o specie la alta, de exemplu la Drosophila melanogaster este de 86°C, la Escherichia coli 90°C, Mycobacterium phlei 97°C. Dacă soluţia respectivă este răcită brusc, ADN rămâne monocatenar, fiind numit ADN denaturat. Dacă soluţia se răceşte treptat, legăturile de hidrogen se refac, rezultând un ADN renaturat, iar fenomenul se numeşte renaturare.

Aceste două fenomene au o importanţă deosebită pentru realizarea de hibrizi moleculari ADN-ADN sau ADN-ARN.

Hibrizii moleculari ADN-ADN, dar de la specii diferite, ne dau informaţii despre gradul de înrudire al speciilor respective. Hibridarea ADN-ARN permite localizarea pe cromozomi a genelor ce intervin în sinteza diferitelor tipuri de ARN.

3.3.5. Specificitatea ADN

În urma determinării cantităţii de ADN din nucleul procariotelor şi eucariotelor s-a putut observa că acesta variază foarte mult de la o specie la alta. În general, procariotele au o cantitate mai mică de ADN faţă de eucariote, deoarece organismele superioare au nevoie de o cantitate mai mare de informaţie genetică pentru creştere, dezvoltare şi reproducere.

În molecula de ADN raportul dintre bazele azotate purinice şi bazele azotate pirimidinice A/T şi G/C este constant şi egal cu 1 (E. Chargaff, 1951). Deosebirile ce

70

există între ADN de la diferite specii constă în faptul că raportul dintre A+T/G+C este foarte variabil. La plantele şi animalele superioare acest raport este în favoarea bazelor A+T. La speciile înrudite şi raportul A+T/G+C este apropiat, ceea ce arată că la acestea succesiunea nucleotidelor este asemănătoare. Diferenţele privind secvenţa de nucleotide asigură deosebirile genetice dintre specii.

3.3.6. Replicaţia ADN

Una dintre însuşirile de bază ale macromoleculei de ADN este cea de replicaţie sau autoreplicaţie, constituind funcţia autocatalică a materialului genetic. La eucariote, replicarea ADN şi deci a genelor care nu sunt decât segmente de ADN, are loc în timpul diviziunii mitotice, asigurându-se transmiterea exactă de la o generaţie la alta a caracterelor ereditare.

Studiul ciclului mitotic a relevat existenţa unei variaţii regulate a cantităţii de ADN iar pe această bază ciclul celular a fost împărţit în următoarele etape: M - mitoza, G1 - perioada anterioară sintezei de ADN (gol sintetic), S - perioada sintezei de ADN şi G2 - perioada de postsinteză. După telofază în Gi cantitatea de ADN rămâne constantă şi egală cu 2C (două catene).

Biosinteza proteică ce are loc în această perioadă determină creşterea celulei, are loc sinteza de ADN şi deci a unor proteine specifice ce declanşează mitoza. În perioada S se produce replicarea ADN, care se încheie prin dublarea cantităţii de ADN, egală cu 4 C (patru catene). În timpul profazei şi metafazei mitotice, cantitatea de ADN rămâne constantă iar în anafază, când cromozomii migrează spre cei doi poli, se împarte în două, fiecare celulă având o cantitate de ADN egală cu cea din celula mamă.

Diviziunea meiotică determină o reducere la jumătate a cantităţii de ADN în gameţi. Cantitatea dublă de ADN se reface în momentul fecundării gameţilor, când rezultă zigotul diploid.

71

J. D. Watson şi F. H. Crick (1953) în urma elaborării modelului structural al moleculei de ADN au emis şi ipoteza replicării acestuia după tipul semiconservativ. Acest tip de sinteză constă în ruperea punţilor de hidrogen dintre cele două catene complementare. Fiecare catenă serveşte ca matriţă pentru sinteza unei catene noi. În final, dintr-o moleculă veche de ADN vor rezulta două molecule, dar care sunt noi numai pe jumătate.

Au mai fost emise şi alte ipoteze de replicare a macromoleculei de ADN. Un asemenea tip ar fi cel conservativ conform căruia molecula veche de ADN serveşte ca model pentru sinteza unei molecule complet noi.

O altă ipoteză consideră că replicarea ADN se realizează după tipul dispersiv. Conform acestui model, molecula de ADN se desface în părţile componente şi împreună cu nucleotidele din celulă participă la formarea a două molecule de ADN, care vor conţine atât nucleotide vechi cât şi nucleotide noi.

Modelul replicării după tipul semiconservativ propus de Watson şi Crick, asigură o mare fidelitate în sinteza noilor molecule de ADN. Termenul de replicaţie derivă de la faptul că în acest proces fiecare catenă serveşte ca matriţă pentru catenele noi sintetizate, informaţia genetică fiind transmisă fidel noilor molecule.

Sinteza ADN după tipul semiconservativ se realizează astfel: la o extremitate sau într-un punct oarecare al macromoleculei de ADN, punţile de hidrogen se rup, fenomen ce continuă pe toată lungimea moleculei, asemănător desfacerii unui fermoar. Fiecare catenă se răsuceşte în spaţiu cu 180°, prin rotirea nucleotidelor în planul exterior, în jurul radicalului fosforic. În citoplasmă se găsesc sintetizate cele patru tipuri de nucleotide care conţin bazele azotate purinice şi pirimidinice: adenină, guanină, citozină şi timină.

Pe baza fenomenului de complementaritate dintre bazele azotate purinice şi pirimidinice, o nucleotidă care conţine adenină se va lega prin punţi de hidrogen de una ce conţine timină, iar una ce conţine guanină se va lega de una ce conţine citozină. În final, paralel cu catenele vechi s-au sintetizat două catene noi, rezultând două molecule fiice, identice cu molecula mamă (fig. 3.5.). Replicarea macromoleculei de ADN se realizează în trei etape: în prima etapă are loc sinteza precursorilor nucleotidelor ce intră în alcătuirea ADN de tipul acidului uridilic şi acidului inosinic; în etapa a doua are loc sinteza nucleotidelor propriu-zise ce intră în structura ADN: dezoxiadenozintrifosfat, dezoxiguanozintrifosfat, dezoxicitidintrifosfat şi dezoxitimidintrifosfat; în etapa a treia are loc polimerizarea nucleotidelor sub controlul enzimei ADN-polimeraza. i de circa 65 Â, mult mai mare decât a moleculei tă din circa 1000 aminoacizi. Enzima ADN-

72

polimeraza determină esterificarea oxidrilului de la carbonul 3' al catenei polinucleotidice de către fosfatul ce esterifică oxidrilul de la carbonul 5' al nucleotidei, aşa încât dacă catena veche are polaritatea 5’ ^ 3', catena nou sintetizată va avea polaritatea inversă 3' ^ 5'.

S-au descoperit mai multe tipuri de polimeraze (I, II, III), unele din ele intervenind în procesul de reparare a macromoleculei de ADN, atunci când unele nucleotide au fost încatenate în mod eronat.

Pentru desfăşurarea procesului de replicaţie este necesară o anumită cantitate de energie. Această energie provine din hidroliza acidului adenozintrifosforic (ATP) în acidul adenozindifosforic (ADP) şi un radical fosforic (P). O parte din energia rezultată se pierde sub formă de căldură.

Pentru ca pierderile să fie cât mai mici, în celulă există un grup de enzime denumite transferaze, care au rolul de a transfera grupe funcţionale de la o moleculă la alta. Astfel ATP transferă energia sa către GTP care este un precursor în sinteza acizilor nucleici, devenind o moleculă activată.

In celule există o enzimă puternică denumită pirofosfatază, care rupe legătura de înaltă energie dintre radicalii de fosfor (P ~ P) eliberând-o (P ~ P ^ P + P + 7 kcal/mol). Pentru unirea a două nucleotide se consumă 0,5 kcal/mol, restul de 6,5 kcal/mol rămâne ca energie liberă ce păstrează echilibrul termodinamic al macromoleculei de ADN.

3.3.7. Replicaţia acizilor nucleici la bacterii şi virusuri

Celula bacteriană conţine un singur cromozom circular format dintr-o macromoleculă de ADN cu o lungime de aproape 1000 p. In timpul replicaţiei la bacterii macromolecula de ADN îşi păstrează forma circulară. Geneticienii M. Meselsohn şi F. W. Stahl (1958) au elucidat mecanismul de replicaţie al ADN de la bacterii prin marcarea acestuia cu izotopi radioactivi. Eu au folosit izotopul stabil al azotului N15, care se poate izola destul de uşor de azotul obişnuit N14, prin ultracentrifugare.

Bacteria Escherichia coli a fost cultivată pe un mediu ce conţinea clorură de amoniu marcată cu N15. După prima diviziune a bacteriilor, au fost trecute pe mediu ce conţinea N14 şi au fost lăsate să se dividă de 1-3 ori. După numărul de bacterii din cultură se poate determina numărul de diviziuni.

După aceea bacteriile au fost lizate şi introduse într-o ultracentrifugă. Sa constatat că bacteriile crescute pe mediu cu N15 aveau ADN marcat numai cu N15, iar după ce au fost trecute pe mediu cu N14, după prima diviziune exista o fracţie de ADN hibrid, având o greutate moleculară intermediară. După cea de a doua diviziune celulară, 50% din ADN conţine N14 şi 50% N15, iar după cea de a treia diviziune 75% conţinea N14 şi 25% hibrid. Aceste rezultate au demonstrat că replicarea cromozomului bacterian se realizează după modelul semiconservativ.

Procesul de replicaţie a cromozomului bacterian începe într-un punct al acestuia denumit replicator, care este ataşat de membrana celulară într-o regiune denumită mezozom.

La bacterii, fiecare diviziune a bacteriei este precedată de o singură derulare completă a cromozomului circular.

73

La virusuri s-a constatat că acest proces de derulare a cromozomului se repetă de mai multe ori, rezultând mai întâi o formaţiune liniară, lungă, care apoi se fragmentează şi rezultă cromozomi circulari.

Unele virusuri au ca material genetic o moleculă de ADN monocatenar (0x174, S 13, F etc.). La aceste virusuri, procesul de replicaţie decurge astfel: în momentul în care ADN monocatenar notat cu (+) pătrunde în celula bacteriană infectată, serveşte ca matriţă pentru sinteza unei catene complementare notată cu (-). In interiorul bacteriei infectate a rezultat un ADN dublu catenar, dar numai catena (-) serveşte ca matriţă pentru sinteza catenelor (+) ale virusului.

Există virusuri a căror material genetic este reprezentat de ARNv, care are o structură monocatenară. Replicaţia acestui ARN în cazul ribovirusurilor este asemănătoare cu replicaţia ADN monocatenar de la virusul phi x 174.

Studiindu-se, de exemplu, ciclul de viaţă al ribovirusului F2, s-a constatat că după pătrunderea ARNv monocatenar notat cu (+) în celula bacteriană, se ataşează de ribozomi, pentru a declanşa sinteza enzimei necesare desfăşurării procesului de replicaţie, ARN-polimeraza. Pe matriţa catenei (+) se formează o catenă complementară notată cu (-), iar pe matriţa acesteia se formează un număr mare de molecule de ARNv (+). O parte din aceste molecule de ARNv (+) se ataşează de ribozomi, sintetizându-se proteinele virale după care are loc unirea ARNv cu acestea rezultând un număr foarte mare de fagi ce distrug celula gazdă (liza bacteriei).

3.3.8. Sinteza acizilor nucleici "in vitro"

Sinteza artificială a acizilor nucleici a fost realizată de A. Kornberg (1954) şi S. Ochoa şi M. Grunberg-Manago (1955). A. Kornberg a fost distins cu premiul Nobel (1959) pentru această realizare. Pentru realizarea sintezei "in vitro" a macromoleculei de ADN sunt necesare următoarele componente: dezoxiribonucleotidele celor patru baze azotate, sistemul enzimatic format din ADN-polimeraza, ioni de magneziu (Mg2+) şi o cantitate mică de ADN cu un grad înalt de polimerizare folosit ca amorsă (primer) şi matriţă pentru ADN nou sintetizat. Ca amorsă poate fi folosit un ADN monocatenar sau un ADN bicatenar, dar în al doilea caz, molecula bicatenară trebuie denaturată cu ajutorul căldurii.

In condiţii favorabile de reacţie s-a sintetizat o cantitate mai mare de 10 ori de ADN decât cea folosită drept amorsă. ADN sintetizat artificial este identic cu cel folosit drept amorsă, în privinţa raportului dintre bazele azotate, însă aceste molecule au fost inactive biologic. Lipsa activităţii biologice a ADN sintetizat "in vitro" este pusă pe seama ADN-polimerazei, care conţine mici cantităţi de dezoxiribonuclează, enzimă ce degradează parţial molecula de ADN.

In anul 1968 A. Kornberg a reuşit să sintetizeze "in vitro" ADN monocatenar, activ biologic, şi anume o moleculă de ADN viral, identică cu ADN monocatenar al virusului phi x 174. Pentru aceasta, în mediul de reacţie s-au introdus: ADN-polimeraza, ADN monocatenar izolat de la virusul phi x 174, ca amorsă, precursorii dezoxiribonucleotidelor şi polinucleotidligaza, enzimă necesară realizării formei inelare a ADN viral. S-au obţinut monocatene negative (-) complementare catenelor iniţiatoare (+), care formau un helix dublu, circular. Prin utilizarea unor enzime s-au izolat o serie de catene (-), care au fost utilizate apoi ca matriţe pe sinteza unor catene (+) biologic active,

74

cu însuşirea de a iniţia multiplicarea virusului.In anul 1955 M. Grunberg-Manago şi S. Ochoa, au realizat sinteza "in vitro" şi

a macromoleculei de ARN, după aceeaşi metodă folosită pentru sinteza ADN. Elementele mediului de reacţie sunt: ribonucleotidele, enzima ADN- fosforilaza şi ioni de magneziu. Ca matriţă pentru sinteza ADN "in vitro" s-a folosit o moleculă de ADN monocatenar.

Sinteza artificială a acizilor nucleici deschide perspective mari în înlocuirea unor "gene defecte", prin segmente de ADN nou sintetizate.

3.4. CODUL GENETIC

După descoperirea structurii macromoleculei de ADN şi a însuşirii ei de a se replica cu mare fidelitate, mulţi geneticieni şi-au pus întrebarea dacă informaţia genetică nu este codificată într-un anumit fel prin secvenţa de nucleotide, ce relaţii se stabilesc între cele patru tipuri de nucleotide şi aminoacizii din lanţurile polipeptidice.

Ciberneticianul G. Gamow (1954) este primul care a descoperit legătura dintre secvenţa de nucleotide din ADN şi ordinea aminoacizilor, emiţând ipoteza că în macromolecula de ADN se găseşte codificată biochimic informaţia genetică, necesară sintezei moleculelor proteice.

In general, prin informaţie se înţelege un mesaj, mai mult sau mai puţin cuprinzător, despre o serie de fenomene care au avut loc, au loc sau vor avea loc într-un sistem biologic sau tehnic. Aceste informaţii sunt înregistrate, stocate şi apoi transmise printr-un sistem de codificare. De exemplu, codul Morse, foloseşte un sistem de linii şi puncte pentru codificarea literelor şi cuvintelor.

Proteinele sunt alcătuite din lanţuri polipeptidice formate din 20 de aminoacizi a căror succesiune este specifică pentru fiecare proteină.

Prin schemă teoretică a unui cod genetic a fost elaborată de G. Gamow (1954). Potrivit concepţiei acestuia, codificarea celor 20 de aminoacizi nu se poate realiza de un singur nucleotid (41=4) şi nici de grupe formate din câte două nucleotide (42=16), pentru că în ambele cazuri numărul total de combinaţii este mai mic decât numărul aminoacizilor. Ca urmare, el a considerat că numai secvenţe de câte trei nucleotide (4 3=64) pot realiza codificarea celor 20 de aminoacizi (tabelul 3.1.). Grupul de trei nucleotide care codifică un aminoacid a primit denumirea de codon. In cazul codului de tip triplet, numărul codonilor este 64, depăşind de trei ori numărul aminoacizilor, fapt ce conferă o mare eficienţă şi plasticitate în recunoaşterea aminoacizilor.

În perioada care a urmat, o serie de geneticieni au adus numeroase dovezi experimentale privind codificarea informaţiei ereditare, deci a relaţiei nucleotide-aminoacizi, culminând cu descifrarea în totalitate a codului genetic.

Primele dovezi experimentale ale relaţiei nucleotide-aminoacizi, au fost aduse prin studiul unor mutaţii, induse cu acid nitros, la virusul mozaicului tutunului (VMT). La acest virus capsida este formată din 2150 catene polipeptidice identice, fiecare conţinând câte 158 aminoacizi. Acidul nitros induce mutaţii de tipul tranziţiilor (înlocuirea unei baze purinice cu o bază purinică sau înlocuirea unei baze pirimidinice cu o bază pirimidinică în catena acizilor nucleici) şi anume A ^ G sau C ^ U.

Tabelul 3.1.

75

Apariţia acestor mutaţii la nivelul nucleotidelor din ARNv al virusului, care îndeplineşte rolul de ARNm, apar modificări în secvenţa aminoacizilor din catena polipeptidică. Aceste modificări sunt de tipul substituţiei unor aminoacizi: Prolină

Serină Fenilalanină sauProlină Leucină Fenilalanină

S-a dedus că prolina este codificată de un codon, la care cel puţin două nucleotide sunt fie A fie C. Tranziţia A ^ G sau C ^ U a uneia din aceste nucleotide generează codonul serinei şi respectiv al leucinei. In codonul fenilalaninei, ambele nucleotide trebuie să fie G sau U.

Studiile efectuate la mutantele induse cu proflavină la bacteriofagul T4, în cadrul genei rlIB, au demonstrat că unitatea care codifică un aminoacid este o tripletă de nucleotide (codon).

Descifrarea codului genetic a fost posibilă şi prin folosirea unor ARNm

sintetizaţi artificial, care conţineau o secvenţă cunoscută de nucleotide, pe baza cărora au fost sintetizate proteine. Experienţe de acest fel au fost realizate de M. W. Nirenberg şi J. H. Matthaei (1961). Ei au reuşit să sintetizeze o catenă de polifenilalanină, folosind un ARNm artificial care conţinea numai nucleotide cu uracil (U), dovedind că tripleta (UUU) codifică aminoacidul fenilalanină. S-au folosit apoi ARNm artificiali ce conţineau o secvenţă de două nucleotide cunoscute. De exemplu, ARN artificial ce conţine secvenţa UGUGUG, determină sinteza unui lanţ polipeptidic în care alternează cisteina şi valina, deci cisteina este codificată de codonul UGU iar valina de GUG (figura 3.6.).

Diferite tipuri teoretice de coduri

Codul monotipic (4 combinaţii)

Codul cu dublete (16 combinaţii)

Codul cu triplete (64 combinaţii)

A AA AG AC AU AAA AAG AAC AAUG GA GG GC GU AGA AGG AGC AGUC CA CG CC CU ACA ACG ACC ACUU UA UG UC UU AUA AUG* AUC AUU

GAA GAG GAC GAUGGA GGG GGC GGUGCA GCG GCC GCUGUA GUG* GUC GUUCAA CAG CAC CAUCGA CGG CGC CGUCCA CCG CCC CCUCUA CUG CUC CUUUUA* UAG* UAC UAUUGA* UGG UGC UGUUCA UCG UCC UCUUUA UUC UUC UUU

* codoni iniţiatori ai sintezei unei catene polipeptidice• codoni nonsens, care nu codifică nici un aminoacid reprezentând codonii terminali ai sintezei unei catene polipeptidice

76

Problema cea mai grea ce a trebuit rezolvată a fost precizarea poziţiei nucleotidelor în cadrul codonului, pentru că cele două nucleotide pot forma trei combinaţii: GUU, UGU şi UUG. Există mai multe căi pentru precizarea ordinii nucleotidelor în cadrul codonului, cea mai folosită fiind studiul mutaţiilor de substituţie a unor aminoacizi din unele proteine mai bine cunoscute: hemoglobina, proteina virusului mozaicului tutunului, triptofan-sintetaza din Escherichia coli ş.a.

3.4.1. Caracteristicile codului genetic

Informaţia genetică este codificată în acidul dezoxiribonucleic (ADN) sau în acidul ribonucleic viral (ARNv) la unele virusuri, sub forma unor secvenţe de trei nucleotide (codoni). Informaţia genetică este copiată prin procesul de transcripţie de către ARNm iar apoi tradusă, prin procesul de translaţie, într-o secvenţă de aminoacizi, în catena polipeptidică.

In prezent sunt cunoscuţi toţi codonii din ARNm, care codifică diferiţi aminoacizi (fig. 3.6). Codul genetic cuprinde 64 de codoni. Doi codoni marchează începutul sintezei unei catene polipeptidice şi anume AUG şi GUG iar trei codoni sunt nonsens: UAA (ocru), UAG (ambră) şi UGA (azur). Aceşti codoni au rolul de a marca terminarea sintezei unei catene polipeptidice (codoni stop).

Codul genetic are următoarele caracteristici: este universal, degenerat, lipsit de ambiguitate, neacoperit şi fără virgule.

Prima nucle- otidă a codo- nului 5'

A doua nucleotidă a codonului A treia nucle- otidă a codo- nului 3'

U C A G

U

UUU Fen UCU

Ser

UAU Tir UGU Cis UCAG

UUC UCC UAC UGC

UUALeu

UCA UAA Non 2 UGANon

3

UUG UCG UAG Non 1 UGG Tri

C

CUU

Leu

CCU

Pro

CAU His CGU

Arg

UCAG

CUC CCC CAC CGCCUA CCA CAA Glu CGA

CUG CCG CAG CGG

A

AUU

Ileu

ACU

Tre

AAUAsp

AGUSer U

CAG

AUC ACC AAC AGC

AUA ACA AAA Liz AGA ArgAUG Met ACG AAG AGG

G

GUUVal

GCU

Ala

GAU Ac.asp GGU

Gli

UCAG

GUC GCC GAC GGC

GUA GCA GAAAc.glu

GGA

GUGf-

MetGCG GAG GGG

Fig. 3.6. Codul genetic

77

Prin universalitatea codului genetic se înţelege faptul că un anumit codon, codifică acelaşi aminoacid la orice organism, indiferent de gradul său de evoluţie. Dovada cea mai evidentă a universalităţii codului genetic a fost următoarea: s-a izolat ARNm ce răspunde de sinteza hemoglobinei la iepure şi s-a injectat în ovocitele de broască. S-a constatat că în ovocitele de broască se sintetizează hemoglobina, deşi în mod normal, ovocitele nu sintetizează niciodată hemoglobină.

Codul genetic este degenerat, în sensul că mai mulţi codoni codifică acelaşi aminoacid. De exemplu, arginina este codificată de următoarele triplete: GGU, GGC, GGA, AGA şi AGG.

In ceea ce priveşte importanţa nucleotidelor din codon s-a constatat că primele două sunt cele mai semnificative, în timp ce a treia poate fi uşor înlocuită. Dacă cea de a treia nucleotidă este o bază purinică ea poate fi înlocuită tot cu o bază purinică sau dacă este o bază pirimidinică, poate fi înlocuită tot printr-o bază pirimidinică. Diferiţi codoni, care au primele două nucleotide identice, pot codifica acelaşi aminoacid. Numai metionina şi triptofanul sunt codificaţi de câte un singur codon (AUG şi respectiv UGG). Caracteristica de degenerare a codului genetic, prin care mai mulţi codoni diferiţi codifică acelaşi aminoacid, poartă numele de redundanţă, termen preluat din informatică. Redundanţa constă într- un exces de informaţie, într-un sistem, pentru a asigura transmiterea corectă a informaţiei, chiar în cazul unor perturbări (Hartl D. L. şi colab., 1989).

În mod obişnuit fiecare codon (tripletă) codifică un singur aminoacid. Sa constatat, în unele cazuri, că un codon poate codifica mai mulţi aminoacizi. Aşa este cazul codonilor GCG care codifică alanina şi arginina; CGG-prolina şi arginina; GGA-glicerina şi acidul glutamic; AGG-glicina şi fenilalanina. Se afirmă că această însuşire reprezintă un avantaj evolutiv, deoarece înlocuirea unui aminoacid cu altul printr-o mutaţie, într-o catenă polipeptidică este mai puţin dăunătoare, dacă cei doi aminoacizi au proprietăţi asemănătoare.

Codul genetic este neacoperit în sensul că doi codoni vecini nu au nucleotide comune şi este fără virgule, între doi codoni nu există spaţii sau alţi codoni care să joace rolul unor semne de punctuaţie.

S-a demonstrat că citirea mesajului genetic începe dintr-un punct fix, se realizează într-un singur sens, astfel că, absenţa unui nucleotid (deleţie) sau adăugarea altuia (adiţie), schimbă sensul mesajului.

Universalitatea codului genetic în lumea vie demonstrează pe de o parte vechimea sa şi, totodată, constanţa sa în timp.

3.5. BIOSINTEZA PROTEINELOR

Proteinele au un rol esenţial în metabolismul celular, însăşi funcţiile materialului genetic sunt condiţionate de o serie de enzime sau proteine cu rol structural.

Enzimele participă la replicarea ADN şi ARN, la transcripţia informaţiei genetice şi la sinteza proteinelor.

Proteinele structurale intră în alcătuirea cromozomului, a membranelor celulare, a componentelor celulare, participă la asamblarea ribozomilor.

Procesul de biosinteză a proteinelor este mult mai complex decât cel de sinteză a acizilor nucleici şi cuprinde două etape importante: transcripţia informaţiei genetice şi

78

translaţia informaţiei genetice.

3.5.1. Transcripţia informaţiei genetice

Transcripţia constituie fenomenul prin care informaţia genetică de pe o porţiune din catena de ADN este transcrisă (copiată) într-o moleculă de ARNm. Transcripţia mesajului genetic din molecula de ADN pe cea din ARNm se face într-o formă care serveşte ca matriţă pentru sinteza proteinelor. Sinteza ARNm este catalizată de enzima ARN-polimeraza, enzimă universală ce a fost identificată în celulele bacteriene, vegetale şi animale.

Mecanismul propriu-zis al transcripţiei informaţiei genetice din ADN în molecula de ARNm se realizează astfel: enzima ARN-polimeraza se leagă specific într-o poziţie a moleculei de ADN, ce corespunde cu începutul unei gene. Legăturile de hidrogen se rup pe porţiunea genei respective, segmentul respectiv de catenă se roteşte cu 180° în spaţiu, servind ca matriţă pentru sinteza catenei de ARNm. ARN-polimeraza asigură încatenarea corectă a ribonucleotidelor existente în nucleu. Odată cu înaintarea ARN-polimerazei de-a lungul matriţei ADN, se eliberează treptat noua catenă în citoplasmă, unde se asociază cu ribozomii formând complexe denumite poliribozomi.

După ce s-a realizat transcripţia, se refac legăturile de hidrogen între catenele moleculei de ADN.

De o foarte mare importanţă este descoperirea că procesul de transcripţie la nivelul unei gene se realizează pe o singură catenă de ADN. Aşa se explică faptul că o genă deţine informaţia genetică necesară sintezei unei singure proteine.

In ceea ce priveşte locul de pe catena de ADN unde se iniţiază procesul de transcripţie, J. D. Watson (1974) arată că ARN-polimeraza este cea care recunoaşte codonii de iniţiere.

Spre deosebire de ADN-polimeraza care este formată dintr-un singur lanţ polipeptidic, ARN-polimeraza este alcătuită din cinci lanţuri polipeptidice notate cu P', P, 5, a2 şi W, fiecare cu o masă moleculară diferită. Enzima poate să catalizeze formarea legăturilor dintre nucleotide, chiar dacă lipseşte lanţul 5, deci acest lanţ nu are rol catalitic, ci acela de a recunoaşte catena matriţă şi secvenţa de dezoxiribonucleotide, de unde se iniţiază transcripţia. Poziţia din molecula ADN unde se leagă ARN-polimeraza pentru a iniţia transcripţia se numeşte promotor. Incheierea transcripţiei ARNm este controlată de o proteină specifică numită factora.

In sens mai larg, transcripţia se referă şi la sinteza celorlalte două tipuri de ARN implicate în procesul de biosinteză a proteinelor.

Acidul ribonucleic solubil sau de transfer (ARNs) se sintetizează tot pe o matriţă de ADN. Fiecare tip de ARNs este codificat de câte o singură secvenţă de nucleotide din ADN, deci de câte o genă. Acidul ribonucleic ribozomal (ARNr) este produsul direct al mai multor gene. Detalii despre ARNs şi ARNr au fost precizate într-un paragraf anterior.

3.5.2. Translaţia informaţiei genetice

Translaţia este mecanismul prin care secvenţa codonilor din ARNm este tradusă

79

într-o anumită succesiune de aminoacizi ce intră în constituţia unui lanţ polipeptidic. Realizarea procesului de translaţie implică participarea mai multor componente celulare ce alcătuiesc un aparat de translaţie. Aparatul de translaţie cuprinde următoarele elemente: diferite tipuri de ARNs corespunzătoare tipurilor de aminoacizi, aminoacizii, ribozomii, enzimele activatoare ale aminoacizilor, cofactorii energetici, ATP şi GTP, factori de iniţiere, alungire şi terminare a sintezei lanţului polipeptidic.

Pentru sinteza celulară a proteinelor este necesară o anumită cantitate de energie, formarea unei singure legături peptidice necesitând 0,5 kcal/mol. Această energie este asigurată de acidul adenozintrifosforic (ATP) care, prin hidroliză, pune în libertate unul sau doi radicali fosforici eliberând energia corespunzătoare:

ATP + H2O « * AMP + P ~ P + 8 kcal/molSinteza proteică se desfăşoară concomitent cu hidroliza ATP în AMP şi doi

radicali fosforici, rezultând 8 kcal/mol, din care 0,5 kcal/mol sunt folosite pentru realizarea legăturii peptidice iar restul de 7,5 kcal/mol pentru menţinerea echilibrului reacţiei în favoarea sintezei proteice şi nu a hidrolizei.

O primă etapă în sinteza proteinelor o constituie activarea aminoacizilor şi formarea complexului aminoacil-ARNs. Activarea aminoacizilor se realizează cu ajutorul energiei rezultate din hidroliza ATP şi în prezenţa enzimei aminoacilsintetaza (E). Reacţia de activare a aminoacizilor poate fi redată astfel:

AAj + ATP + E -* * AAj ~ AMP ~ E + P ~ P

Aminoacizii, după ce au fost activaţi, se pot ataşa de molecula unui ARNs specific:

AA1 ~ AMP ~ E + ARNsj - *AA1 - ARNsj +

+ AMP + E

Cele două reacţii au loc succesiv, sunt catalizate de aceeaşi enzimă (aminoacilsintetaza) şi ca atare se poate scrie reacţia generală:

aminoacilsintetaza AA1 + ATP + ARNsj -4* AA1 - ARNsj +

+ AMP + P ~P

În următoarea fază complexul aminoacil-ARNs se ataşează de poliribozomi, la nivelul cărora are loc iniţierea sintezei lanţului proteic. Ribozomul asigură de aşa manieră asocierea acestor elemente încât zona anticodon a ARNs să poată recunoaşte codonul corespunzător din ARNm, ducând astfel la o descifrare corectă a mesajului genetic. După fixarea aminoacidului, ARNs devine liber putând transporta alte molecule de aminoacid la nivelul ribozomului. Încatenarea aminoacizilor se realizează de către enzima peptidiltransferaza şi constă în realizarea legăturilor peptidice între gruparea carboxil a unui aminoacid şi gruparea aminică a celuilalt (figura 3.7.).

80

Reacţia de încatenare a aminoacizilor poate fi redată astfel:

peptidiltransferaza

AAi - ARNs! + AA2 - ARNs2 + AA3 - ARNs3 +... ■* ̂

AAi - AA2 - AA3 . + ARNs1 + ARNs2 + ARNs3 + .

Fig. 3.7. Reprezentarea schematică a procesului de translaţie (după Kimball, 1978)

Încheierea sintezei catenei polipeptidice se realizează cu ajutorul a doi factori proteici care sunt activaţi în prezenţa codonilor de încheiere UAA, UAG şi UGA. Ca urmare, catena polipeptidică se detaşează de ribozomi şi de ARNs care a adus ultimul aminoacid.

În ceea ce priveşte viteza cu care se realizează biosinteza proteică, există o serie de date atât la procariote cât şi la eucariote. Transcripţia genei ce determină sinteza enzimei ce intervine în producerea triptofanului la Escherichia coli are loc cu o viteză de 28 nucleotide/sec., iar translaţia cu viteza de 7 aminoacizi/sec. O moleculă completă de hemoglobină umană este sintetizată în 35 secunde (gena ce determină hemoglobina conţine 670 nucleotide).

În prezent s-a reuşit sinteza unor substanţe proteice într-un sistem celular liber (populaţii de celule la care s-a distrus membrana celulară), folosind ARNm artificial (M. W. Niremberg, 1961).

3.6. REGLAJUL GENETIC AL ACTIVITĂŢII GENELOR5

Celula vie conţine o cantitate mare de informaţie genetică iar procesele metabolice ce au loc funcţionează cu o mare eficienţă, asigurând economisirea la maximum a energiei.

Cantitatea mare de informaţie din celulele procariotelor şi eucariotelor permite funcţionarea acestora în cele mai variate condiţii de mediu. In timp ce virusurile posedă în programul lor genetic 3-4 gene, bacteriile 2.000-3.000 gene, plantele şi animalele superioare au un program genetic foarte complex, constituit din câteva zeci de mii de gene.

Genele ce alcătuiesc programul genetic al vieţuitoarelor nu funcţionează toate deodată, ci intră în funcţie în mod succesiv, în funcţie de tipul şi cantitatea de enzime şi proteine, pe măsura dezvoltării individului. Mecanismele de reglare a activităţii genelor sunt foarte complexe atât la procariote cât şi la eucariote.

Funcţionarea celulei este dependentă de cele două laturi ale metabolismului: catabolismul (dezasimilaţia), prin care o serie de substanţe sunt descompuse şi se eliberează şi o anumită cantitate de energie şi anabolismul (asimilaţia) în urma căreia se sintetizează substanţe complexe din substanţe simple. Fiecare etapă a asimilaţiei şi

81

dezasimilaţiei este catalizată de o anumită enzimă, care la rândul ei este dependentă de informaţia uneia sau a mai multor gene.

3.6.1. Reglajul activităţii genetice la procariote

Teoria reglajului genetic la procariote a fost elaborat de geneticienii francezi Francois Jacob, André Lwoff şi Jaques Monod, în anul 1961, realizare pentru care ei au fost distinşi, în anul 1965, cu premiul Nobel. În această lucrare ei demonstrează experimental şi practic că sinteza proteinelor şi a enzimelor variază în funcţie de necesităţile celulei şi este controlată genetic. F. Jacob şi J. Monod au descoperit mai multe moduri de reglare genică a sintezei proteice:

- inducţia enzimatică;- represia enzimatică;- retroinhibiţia enzimatică.Inducţia enzimatică este fenomenul prin care celulele produc sistemul

enzimatic necesar pentru metabolizarea substanţelor care de obicei nu sunt prezente în mediu.

Proprietăţile enzimatice ale bacteriilor sunt influenţate de mediul în care cresc, fenomen denumit adaptare enzimatică, ceea ce conferă acestor organisme posibilitatea de a creşte în medii diferite. Enzimele ce intervin în catalizarea diferitelor laturi ale metabolismului au fost împărţite în două categorii: enzime adaptive a căror cantitate şi activitate variază în funcţie de condiţiile de mediu şi enzime constitutive a căror cantitate nu depinde de mediu şi se sintetizează continuu.

J. Monod (1941) a descoperit fenomenul de diauxie prin care o bacterie ce creşte pe un mediu de glucoză şi lactoză, creşte şi se înmulţeşte până ce glucoza este epuizată, iar după o perioadă de stagnare, creşte din nou şi se înmulţeşte folosind însă lactoza.

Un exemplu de inducţie enzimatică a fost descoperit la drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae) care poate să fermenteze lactoza din lapte cu ajutorul enzimei lactaza. Tulpinile de drojdie de bere, care au fost crescute mai multe generaţii pe mediu de lactoză, vor conţine în cantitate mare enzima lactaza, iar în acest caz, fenomenul de fermentaţie începe foarte repede (aproximativ o oră de la incubaţie). În cazul unor tulpini care nu au fost crescute în prealabil pe mediu de lactoză, fermentaţia nu are loc pentru că acestor tulpini le lipseşte lactaza. Dacă aceste tulpini sunt ţinute în continuare în mediu de lactoză, după aproximativ 14 ore, fermentaţia se declanşează, fapt ce arată că lactoza induce producerea lactazei de către celulele drojdiei. În acest caz lactoza ce trebuie metabolizată acţionează ca un inductor.

Inducţia enzimatică a fost ilustrată de J. Monod şi colab. la bacteria Escherichia coli, prin studierea sistemului lactoză. Acest mecanism va fi prezentat mai pe larg în cadrul modelului Jacob-Monod de reglaj genetic.

In concluzie se poate afirma că inducţia enzimatică este caracteristică sistemelor de catabolism (dezasimilaţie) fiind declanşată de substanţe denumite inductori.

Represia enzimatică este un fenomen opus inducţiei enzimatice, prin care este inhibată sinteza unei proteine datorită unui produs final al unui lanţmetabolic denumit represor.

Fenomenul de represie enzimatică a fost pus în evidenţă la bacteria Escherichia coli. Astfel, s-a demonstrat că sinteza aminoacidului triptofan este inhibată atunci când în

82

mediul de cultură se adaugă cantităţi mici de triptofan sau analogi ai acestuia. Represia enzimatică este caracteristică unor sisteme enzimatice ce intervin în anabolismul unor constituenţi cu rol esenţial în organism (aminoacizi, nucleotide). Represia enzimatică poate acţiona asupra mai multor proteine ce fac parte din acelaşi lanţ metabolic, prin intermediul represorului. Dacă un metabolit acţionează asupra represorului suprimându-i activitatea, se deblochează sinteza tuturor enzimelor din acelaşi lanţ metabolic. Efectul genetic al represorului constă în blocarea uneia sau a mai multor gene prin aceasta sistarea sintezei uneia sau a mai multor proteine specifice.

Substanţele capabile să modifice efectul de represie al represorului se numesc efectori. Efectorii pot fi inductori, când inhibă activitatea represorului şi corepresori, când intensifică activitatea de represie a represorului.

Retroinhibiţia enzimatică denumită şi inhibiţia prin feed-back sau inhibiţia prin produs final este un sistem de reglare a sintezei proteice prin cantitatea de produs final. In cazul unui lanţ metabolic, există mai multe etape, fiecare fiind catalizată de o anumită enzimă, rezultând un produs final. In cazul retroinhibiţiei enzimatice, produsul final, într-o cantitate mai mare decât cea normală, acţionează asupra enzimei din prima treaptă a lanţului metabolic şi întreg lanţul metabolic este oprit.

Fenomenul a fost studiat la bacteria Escherichia coli. Aminoacidul L- treonină se transformă într-un alt aminoacid, L-izoleucină în cinci etape, fiecare fiind catalizată de către o enzimă (figura 3.8.).

În acest exemplu, cantitatea de izoleucină poate fi reglată atât prin retroinhibiţie enzimatică cât şi prin represie enzimatică. Prin retroinhibiţie enzimatică, izoleucina în cantitate prea mare blochează activitatea primei enzime din lanţul metabolic, treonină deaminază şi întreg lanţul metabolic este oprit. Prin represie enzimatică, aminoacidul izoleucină blochează activitatea tuturor celor 5 enzime din lanţul metabolic. Prin urmare sinteza izoleucinei este controlată printr- un sistem dublu, cele două sisteme fiind

Figura 3.8. - Represia enzimatică şi retroinhibiţia enzimatică

în cazul căii metabolice ce asigură sinteza izoleucinei.

83

independente. Independenţa celor două sisteme a fost dovedită prin faptul că la E. coli s-au obţinut două mutante, una la care izoleucina nu poate să inhibe enzima treonină deaminază, iar cealaltă la care izoleucina nu inhibă nici una din cele cinci enzime ale lanţului metabolic. S-a demonstrat că cele două mutaţii sunt situate în loci diferiţi pe cromozom.

În cazurile de mai sus, produşii celulari sunt controlaţi numai de produşii finali ai liniei metabolice respective. Sunt însă şi cazuri când unii produşi celulari sunt controlaţi de produşii finali ai altei linii metabolice. De exemplu, bazele azotate purinice şi pirimidinice ce intră în alcătuirea acizilor nucleici sunt sintetizate de două linii metabolice paralele, dar cele două linii se reglează reciproc. Acest lucru are o mare importanţă deoarece cele două grupe de baze trebuie că fie într-un anumit raport în momentul replicării acizilor nucleici. Experimental s-a demonstrat că proporţia bazelor pirimidinice este controlată de produşii finali pirimidinele, dar şi de purine, astfel: pirimidinele în exces inhibă prima enzimă din lanţul metabolic al pirimidinelor, iar purinele în exces stimulează activitatea aceleiaşi enzime. Prin acest proces, bazele azotate sunt sintetizate economic, exact în cantităţile necesare replicării acizilor nucleici.

Modelul Jacob-Monod de reglare a activităţii genelorF. Jacob şi J. Monod (1961), pe baza experienţelor efectuate la Escherichia

coli asupra locusului lac (lactază), privind fenomenele de inducţie enzimatică şi represie enzimatică, au ajuns la concluzia că reglarea sintezei proteice este de natură genică. În acest proces de reglaj sunt implicate trei categorii de gene: gene structurale, gene reglatoare şi gene operatoare.

Genele structurale sunt segmente din macromolecula de ADN şi au rolul de a determina secvenţa aminoacizilor în moleculele proteice sintetizate de celulă.

Genele reglatoare sunt localizate tot pe ADN şi au rolul de a sintetiza represorii specifici ce controlează activitatea genelor structurale. Represorul nu interacţionează direct cu genele structurale, ci prin intermediul celui de-al treilea tip de gene, genele operatoare sau operator. Operatorul este o genă adiacentă genelor structurale, care are posibilitatea de a se combina sau nu cu represorul, inducând sau blocând funcţionarea genelor structurale. Gena operatoare poate fi considerată un receptor al represorului. Gena operatoare este un fel de comutator chimic care declanşează sau nu intrarea în activitate a genelor structurale. Înaintea genelor operatoare şi structurale este localizat promotorul care iniţiază procesul de transcripţie a informaţiei genetice al genelor structurale. Ansamblul format din promotor, gena operatoare şi genele structurale se numeşte operon, ocupă un fragment de cromozom şi funcţionează coordonat.

Schema modelului Jacob-Monod privind reglarea sintezei proteice prin inducţie şi represie enzimatică este dată în figura 3.9.

Interacţiunile dintre represor şi efector sau dintre represor şi operator (gena operatoare) are loc astfel: în sistemele represibile gena reglatoare determină sinteza represorului R, activ, care interacţionează cu gena operatoare şi în acest caz, gena operatoare blochează activitatea genelor structurale, fapt ce face ca ARN-polimeraza să nu poată sintetiza ARNm şi ca atare, nu se vor sintetiza proteine.

84

Figura 3.9. - Modelul Jacob-Monod privind reglarea sintezei proteice

În sistemele inductibile, un efector negativ sau inductor reacţionând cu represorul (R) îl transformă într-o formă inactivă (R') care nu poate reacţiona cu gena operatoare (O), fapt ce face ca ARN-polimeraza să iniţieze procesul de transcripţie a ARNm. În celule se pot forma molecule cu greutate moleculară mică, denumite efectori pozitivi sau corepresori, care poate transforma represorul inactiv (R') într-o formă activă (R), care reacţionând cu gena operatoare (O) opreşte transcripţia ARNm.

În ceea ce priveşte modul de transmitere a informaţiei genetice de către genele structurale dintr-un operon pentru sinteza unei proteine, s-au emis două ipoteze: una aparţine lui Jacob şi Monod (1961) care susţine că fiecare genă dintr- un operon îşi transcrie un ARMm propriu (o genă - un mesager) iar a doua ipoteză formulată de S. Spiegelman şi R. G. Martin (1963) (citaţi de C. Panfil, 1974), susţine că întreaga informaţie a unui operon este transmisă într-o singură moleculă de ARNm (un operon - un mesager).

Un exemplu concret privind modul de funcţionare al genelor în reglarea procesului de biosinteză a proteinelor îl constituie cel al operonului lac de la Escherichia coli (figura 3.10).

La această bacterie se apreciază că există între 100 şi 200 de operoni, dar numai activitatea unora este cunoscută. La bacteria E. coli utilizarea lactozei din mediu se realizează cu ajutorul a trei enzime, a căror sinteză este determinată de trei gene structurale ce alcătuiesc operonul lac. Genele respective se găsesc dispuse alăturat pe cromozomul bacterian: z+, determină sinteza enzimei P - galactozidaza, care se găseşte liberă în citoplasmă şi care desface lactoza în galactoză şi glucoză; y+ determină sinteza P - galactozid permeazei, care este localizată în membrana celulei bacteriene şi permite intrarea lactozei în celulă şi gena a+ ce determină sinteza enzimei galactozid trans-acetilaza a cărei acţiune este necunoscută.

85

Dacă lactoza lipseşte din mediu, genele structurale ce determină sinteza celor trei enzime sunt inactive. Când se adaugă lactoza în mediu, în câteva minute începe sinteza celor trei enzime, deci genele structurale sunt activate.

Activitatea celor trei gene structurale (z+, y+ şi a+) este controlată de o genă reglatoare prin intermediul unui represor. Când lipseşte lactoza, gena structurală sintetizează represorul care se cuplează cu gena operatoare ce se află înaintea genelor structurale şi activitatea celor trei gene este inhibată.

Prin testul cis-trans s-a constatat că gena reglatoare este independentă de operonul lac, plasată într-o altă regiune a cromozomului bacterian.

Operonul lac este alcătuit din următoarele subunităţi dispuse în următoarea ordine: promotorul (P), gena operatoare (O) şi cele trei gene structurale z+, y+ şi a+. Promotorul are rolul de a recunoaşte enzima ARN- polimeraza, determinând iniţierea procesului de transcripţie, gena operatoare are rolul de a se combina cu represorul sintetizat de gena reglatoare.

Cele două regiuni sunt formate din secvenţe de câte 10-30 nucleotide fiind regiuni ale operonului.

Operonul lac este, de obicei, nefuncţional, ceea ce înseamnă că în absenţa lactozei represorul este activ şi blochează activitatea genelor structurale.In prezenţa lactozei represorul îşi modifică structura şi nu mai poate reacţiona cu gena operatoare şi ca atare întreg operonul devine activ, lactoza putând fi metabolizată.

In ceea ce priveşte mărimea diferiţilor operoni şi a genelor reglatoare există o serie de informaţii la procariote, deoarece la eucariote nu au fost evidenţiaţi operoni.

La E. coli operonul lactoză (lac) este alcătuit din 5.113 perechi de nucleotide, iar gena reglatoare din 1.020 perechi nucleotide, operonul triptofan conţine 6.600 perechi de nucleotide iar operonul histidinei de la Salmonella are13.0 perechi de nucleotide.

Mărimea genei operatoare de la E. coli se pare că este alcătuită din 30 perechi de nucleotide (cu o lungime de aproximativ 100 Â). Nu se cunoaşte prea bine modul de cuplare al genelor operatoare cu represorul, dar se pare că acesta din urmă nu se ataşează decât de un ADN bacterian, deoarece denaturarea ADN blochează activitatea represorului.

Figura 3.10. - Reglajul genetic al operonului lac la Escherichia coli

86

Represorul operonului lac este o proteină formată din patru catene polipeptidice identice, cu o greutate moleculară de 150.000 daltoni.

3.6.2. Reglajul activităţii genelor la eucariote

Structura moleculară a cromozomului la eucariote este mult mai complexă decât la procariote. Cromozomii eucariotelor sunt alcătuiţi din: 13-16% ADN, 12-13% ARN şi 68-72% proteine histonice şi nehistonice. La eucariote, programul genetic este alcătuit dintr-un număr foarte mare de gene (câteva zeci de mii), gene care nu funcţionează simultan, chiar mai mult, în unele celule diferenţiate, majoritatea genelor sunt inactive. Toate aceste aspecte fac ca reglajul genetic la eucariote să fie mult mai complex, reglajul sintezei proteice realizându- se la nivelul genei şi nu la nivelul operonilor. Se poate spune că ARNm la eucariote transcrie mesajul genetic al unei singure gene, deci pentru un singur lanţ polipepidic. Acest fapt a fost demonstrat prin compararea mărimii poliribozomilor angajaţi în sinteza miozinei, hemoglobinei sau gammaglobinei.

Funcţionarea ADN al eucariotelor ca matriţă pentru sinteza ARNm este dependentă de conformaţia spaţială tridimensională a nucleohistonelor. Superspiralizarea nucleohistonelor face ca ADN să nu poată funcţiona ca matriţă pentru ARNm. Ca regulă, cromatina condensată nu poate fi transcrisă, pe când cromatina difuză permite ca ADN să funcţioneze ca matriţă pentru ARNm, sinteza acestuia realizându-se în interfază.

La eucariote, reglajul activităţii genelor are loc la trei niveluri:a) Reglajul la nivelul transcripţiei, care constă în cuplarea proteinelor

cromozomice cu un segment din macromolecula de ADN de pe care trebuie să se transcrie informaţia genetică şi în acest caz se blochează sinteza ARNm.

b) Reglajul la nivelul translaţiei, ce constă în degradarea ARNm format prin transcripţie de către enzime denumite nucleaze, localizate de o parte şi de alta a membranei nucleare.

c) Reglajul posttranslaţional ce se manifestă la nivelul catenelor polipeptidice, unde intervin o serie de factori ce împiedică agregarea monocatenelor pentru a forma stucturi cuaternare, ştiindu-se că această structură este funcţională.

În realizarea reglajului genetic la eucariote, un rol deosebit de important îl au proteinele cromozomice, histonele şi nehistonele, care împreună cu catena ADN şi ARN cromozomic formează cromatina.

Histonele sunt proteine bazice deoarece sunt bogate în aminoacizii bazici, arginina, lizina şi histidina şi complet lipsite de triptofan.

Histonele sunt lipsite de specificitate fiind grupate în cinci clase în funcţie de ponderea celor trei aminoacizi şi în funcţie de greutatea moleculară. Histonele ca şi ADN sunt sintetizate numai în faza S a interfazei, de către o serie de gene cromozomice. Histonele se caracterizează printr-o mare stabilitate în cursul evoluţiei şi o mare uniformitate de o specie la alta. De exemplu, histona H1 de la mazăre diferă numai prin doi aminoacizi faţă de aceeaşi histonă de la taurine.

Aşa cum s-a văzut într-un capitol anterior, cromozomul eucariotelor este constituit din unităţi denumite nucleosomi, în care molecula de ADN este asociată cu histone şi nehistone, fapt ce explică sinteza simultană a celor două substanţe în faza S a ciclului mitotic.

Histonele asigură stabilitatea structurii cromozomului şi sunt implicate în

87

transcripţia mesajului genetic, în mod nespecific.Nehistonele sunt proteine cromozomice foarte variate ca structură şi funcţie, cu

o greutate moleculară cuprinsă între 10.000 şi 15.000 daltoni. Din grupul proteinelor nehistonice fac parte: ADN şi ARN polimerazele, enzimele ce intervin în sinteza şi degradarea proteinelor, proteinele cu rol structural şi reglator din cromozom.

Proteinele nehistonice reacţionează în mod specific cu molecula de ADN, determinând transcripţia diferenţiată a genelor în funcţie de ţesut şi de celule, determinând ce gene vor fi transcrise, având un caracter reglator specific.

Modelul de reglaj genetic la eucariote este prezentat în figura 3.11. Conform acestui model, proteinele nehistonice se ataşează în mod specific la nivelul unei gene, care în mod obişnuit este represată de proteinele histonice. Între cele două tipuri de proteine are loc o reacţie de fosforilare, prin care se eliberează un radical fosforic, în urma căreia complexul histonă-nehistonă rămâne încărcat negativ. Acest complex este respins de molecula de ADN a cărei sarcini electrice sunt tot negative, în această zonă, ADN eliberat de histone, putându-se realiza transcripţia ARNm. În momentul în care gena respectivă încetează să mai funcţioneze, se refac moleculele de histone pe segmentul respectiv de ADN.

La organismele eucariote reglajul genetic se realizează nu numai la nivelul genelor individuale ci la nivelul segmentelor cromozomice, a cromozomilor sau chiar a genomului.

Astfel, reglajul genetic se poate realiza şi prin heterocromatinizare. Heterocromatina este de obicei localizată în jurul centromerului şi în zona

satelitului cromozomului. În zona heterocromatică, cromatina este puternic spiralizată iar ADN are o funcţionalitate redusă.

Heterocromatina este de două tipuri: constitutivă şi facultativă. Heterocromatina constitutivă conţine o cantitate mare de ADN repetitiv (redundant) formând de obicei gene nefuncţionale. Heterocromatina facultativă rezultă din heterocromatinizarea unor regiuni eucromatice. Prin transferul unui segment eucromatic în apropierea heterocromatinei constitutive, acesta se heterocromatinizează şi invers.

Un alt fenomen este heterocromatinizarea unuia din cei doi cromozomi X de la sexul femel al mamiferelor, formând cromatina sexuală, astfel încât, la ambele sexe funcţionează numai câte un cromozom X din perechea de cromozomi ai sexului. Acest fapt a fost demonstrat la multe organisme la care sexul femel este homogametic.

La Drosophila melanogaster genele ce determină culoarea galben deschis a

i iFig. 3.11. - Reglajul genetic la eucariote cu

ajutorul proteinelor histoniceşi nehistonice 88

89

ochilor este localizată pe cromozomul X, dar s-a constatat că ambele sexe produc aceeaşi cantitate de pigment. La om, gena ce determină sinteza enzimei glucoză-6-fosfat dehidrogenaza (G-6-PD) este plasată pe cromozomul X, însă ambele sexe produc aceeaşi cantitate de enzimă. Heterocromatinizarea unui cromozom X se realizează numai în celulele somatice, în celulele sexuale ambii cromozomi X sunt funcţionali.

Se poate constata că, în cazul acesta, reglajul genetic se realizează la nivelul întregului cromozom, deoarece toate genele de pe cromozomul X sunt inactive.

Reglajul genetic se poate realiza la unele organisme prin inactivitatea întregului genom sau cu ajutorul unor hormoni.

In ultimă instanţă diferenţierea celulară la eucariote este tot un proces de reglaj genetic celular, deoarece în unele celule sunt activate numai anumite gene şi anume în celulele specializate.

3.7. NOŢIUNEA DE GENĂ ŞI EVOLUŢIA EI

Rezolvarea complexelor aspecte ale eredităţii sunt legate în mod permanent de elucidarea structurii şi funcţiei genei. Pentru aceasta s-au efectuat cercetări minuţioase, care au implicat mai multe discipline: genetica, biochimia, fizica, fiziologia, care formează o disciplină complexă, biologia moleculară. Obiectivele biologiei moleculare fiind descifrarea proceselor de sinteză a produselor celulare şi dependenţa acestora de informaţia ereditară din molecula de ADN, au dus la modificarea concepţiilor despre genă, de-a lungul timpului.

Ideea de unitate ereditară este foarte veche, astfel, Maupertius (16981759) o denumeşte particulă seminală, iar Buffon (1707-1788), moleculă organică (citaţi de C. Maximilian, 1984). Darwin (1868) denumeşte aceste particule gemule, Năgeli (1884) le denumeşte micele, Hugo de Vries, pangene iar A. Weismann, determinante.

3.7.1. Gena în concepţia geneticii clasice

G. Mendel arată că în celulele există factori ereditari care determină caracterele ereditare perechi, în celulele somatice şi sub formă simplă, în celulele sexuale.

Termenul de genă (gr. genos = urmaş) a fost introdus de W. Johannsen, în anul 1903, însă nu îl consideră ca pe o unitate fizică, ci pe un corespondent al factorilor ereditari imaginaţi de G. Mendel.

In concepţia clasică gena prezintă trei caracteristici de bază: unitate funcţională, unitate mutaţională şi unitate de recombinare.

Ca unitate funcţională, gena este cel mai scurt fragment dintr-un cromozom, în interiorul căreia orice modificare afectează acelaşi caracter, deci gena este cea mai mică unitate care produce un anumit efect fenotipic.

Ca unitate mutaţională, gena este cea mai mică parte dintr-un genom, care prin mutaţie dă naştere la alela sau alelele sale, cu caracter modificat.

Ca unitate de recombinare, gena este cel mai mic segment dintr-un cromozom, care se poate transfera prin crossing-over pe cromozomul omolog şi în interiorul căruia nu are loc crossing-over (unitate indivizibilă de crossing-over).

Acest mod de a defini gena s-a dovedit a fi simplificat, deoarece chiar la începutul secolului XX s-a demonstrat că gena este o unitate genetică mult mai complexă,

90

formată din sublocusuri sau subgene.Existenţa subunităţilor de genă a fost dovedită de E. B. Lewis în anul 1951 la

locusul lozenge (lz) de la Drosophila melanogaster. Locusul lz se găseşte pe cromozomul X în poziţia 27,7 unităţi de recombinare şi determină modificări în pigmentaţia ochilor, structura faţetelor şi fertilitatea femelelor.

Heterozigoţii obţinuţi în urma încrucişărilor dintre mutante ale locusului lz, au avut fenotip mutant cu caractere intermediare. În urma analizei a peste100.0 de indivizi, Lewis a găsit şi 0,02% indivizi de tip normal (sălbatic), nemutanţi, desprinzând concluzia că între subgenele locusului lozenge a avut loc un crossing-over. Locusul lozenge cuprinde cel puţin trei unităţi între care apare un mic procent de recombinare.

Fiecare din cele trei subunităţi, când apare singură în genom, estelz ++

recesivă şi determină un fenotip normal, cu genomul: —1-----------------. Când individul+++

heterozigot cuprinde doi factori (lz1 şi lz2), ei pot fi pe acelaşi cromozom (poziţielz lz + lz ++

cis): —1—2— sau câte unul de fiecare cromozom omolog —1-------------- (poziţie trans).+++ +lz2 +

Fenotipurile sunt diferite, în primul caz este normal iar în al doilea caz este mutant.Acesta demonstrează că locusul lozenge este un locus complex, alcătuit din mai

multe subunităţi.Pe baza efectului cis-trans s-a ajuns să se stabilească dacă două mutaţii foarte

asemănătoare aparţin unei serii alelice ale aceluiaşi locus sau sunt nealele şi aparţin la doi loci diferiţi.

Două gene sunt alele, când aparţin aceluiaşi locus şi dacă heterozigotul în poziţie trans are un fenotip normal, înseamnă că genele respective sunt nealele.

Apogeul în concepţia clasică despre genă, l-a constituit ipoteza "o genă - o enzimă" elaborată de G. W. Beadle şi E. L. Tatum (1941). Conform acestei ipoteze, sinteza fiecărei enzime este determinată de informaţia unei gene, deci între gene şi enzime ar exista raportul de 1:1. Mutaţia unei gene determină blocarea sintezei unei enzime, care la rândul ei, determină oprirea întregului lanţ metabolic.

Elaborarea ipotezei "o genă - o enzimă" a fost posibilă în urma unor experienţe efectuate la ciuperca Neurospora crassa. La această ciupercă s-a elaborat o metodă rapidă de identificare a mutantelor biochimice. Metoda constă în următoarele: se iradiază conidii ale ciupercii în scopul obţinerii de mutante biochimice defective, care se cultivă apoi pe un mediu minimal, însă conidiile mutante nu vor putea creşte pe acest mediu.

Pentru ca mutantele să crească pe mediu minimal trebuie adăugat în mediu substanţa pe care mutanta nu o poate sintetiza, deoarece la mutante s-a declanşat lanţul proceselor metabolice care duc la sinteza acelui produs.

Dacă se analizează schema de mai jos, a unei căi metabolice, ipoteza "o genă - o enzimă" demonstrează că fiecare enzimă care intervine într-un proces metabolic este controlată de o genă:

Gena A Gena B Gena CI I I

Enzima A Enzima B Enzima C

91

I . .. I . . ISubstrat --------► Produsul A Produsul B Produsul C

Studiul mutantelor de Neurospora, a bacteriilor şi algelor a dovedit că blocarea unei etape dintr-un lanţ metabolic este legată de mutaţia unei gene care inactivează o enzimă.

Deşi ipoteza "o genă - o enzimă" nu poate fi înţeleasă în sensul strict că o genă determină sinteza unei singure enzime, a constituit un pas important în evoluţia conceptului de genă şi pentru elucidarea funcţiilor acesteia.

3.7.2. Gena în concepţia geneticii moleculare

Studiile de genetică moleculară, metodele moderne de cercetare, folosirea intensă a virusurilor şi bacteriilor, au permis o analiză genetică foarte fină a genei, în urma căreia s-a constatat că gena este o unitate foarte complexă, alcătuită din subunităţi între care pot avea loc recombinări intragenice şi pot fi modificate prin mutaţii.

Structura fină a genei a fost realizată de S. Benzer (1957) la gena rII a fagului T4 ce infectează bacteria Escherichia coli. Gena rII este alcătuită din două regiuni denumite cistroni şi notaţi cu A şi B. Mutaţiile dintr-un grup sunt complementare numai cu mutaţiile din celălalt grup. Când între doi bacteriofagi cu câte o mutaţie în regiunile A şi B are loc recombinarea, apar indivizi de tip normal, r+, care produc distrugerea (liza) bacteriei. Metoda de detectare a recombinării este foarte sensibilă deoarece dă posibilitatea identificării unui recombinant, chiar dacă a apărut cu o frecvenţă de numai 0,0001%. Acest fenomen permite identificarea recombinărilor chiar între regiuni extrem de apropiate ale genei.

Cercetările mai noi au demonstrat că unitatea mutaţională este perechea de nucleotide, care, în acelaşi timp este şi cea mai mică unitate de recombinare genetică.

92

Prin numeroase cercetări s-a ajuns la concluzia că secvenţa nucleotidelor dintr-o genă determină secvenţa aminoacizilor din catena polipeptidică, fenomen denumit colinearitate.

Gena, în concepţia geneticii moleculare, este definită drept un segment din macromolecula de ADN (sau ARN în cazul unor virusuri), format dintr-o secvenţă anumită de nucleotide, care acţionează ca o unitate funcţională şi care conţine informaţia genetică ce determină secvenţa nucleotidelor dintr-o moleculă de ARN (transcripţie genetică) şi, respectiv, a aminoacizilor într-o catenă polipeptidică (translaţie genetică).

S. Benzer (1958-1961) a denumit muton, cea mai mică unitate a genei în care poate avea loc o mutaţie, independentă de alta, recon cea mai mică unitate în care are loc recombinarea genetică şi cistron cel mai mic segment de ADN (sau genă) care poate funcţiona unitar şi ale cărui limite pot fi stabilite prin testul cis-trans (testul de complementaritate).

Se poate afirma că gena este identică cu cistronul.În concepţia geneticii moleculare, gena poate fi definită succint astfel: o genă

sau cistron - o catenă polipeptidică.Din punct de vedere funcţional, genele pot fi clasificate după Paigen şi

Ganschow (1965) (citaţi de P. Raicu, 1980) în patru tipuri: gene structurale, ce determină secvenţa aminoacizilor într-o catenă polipeptidică; gene reglatoare, ce controlează sinteza proteinelor prin intermediul unui represor; gene arhitecturale, care determină integrarea proteinelor sintetizate în structuri celulare şi gene temporare, care activează cele trei tipuri de gene, în timp, pe baza unui program genetic, pentru realizarea fenomenului de citodiferenţiere.

Genetica moleculară a adus noi elemente de detaliu şi asupra structurii genei. La eucariote gena este constituită dintr-o secvenţă lineară de nucleotide, continuă, ce codifică o secvenţă de nucleotide informaţionale denumite exoni, separate prin segmente noninformaţionale (ADN silenţios) denumite introni. De exemplu, gena ovalbuminei la găină este formată din opt exoni şi şapte introni (figura 3.12).

î!™ 1 1 6 T

AD-H —râ Esâ— *-Trr«w~^U h Z n ţ P

iHTIDrl | im,-hi-ii _

^

VNT I | TI I 'C*i

prH ■: LTJ c-r

-rmin f i i :ar l r t '

Fig. 3.12. - Structura genei ovalbuminei, formată din exoni şi introni

93

Pentru a se realiza fenomenul de transcripţie a ARNm, se formează mai întâi un ARN precursor care determină eliminarea segmentelor noninformaţionale (introni), sintetizându-se apoi un ARNm care copie informaţia genetică numai a exonilor (R. J. Roberts şi A. Ph. Sharp 1993).

Se pare că secvenţele noninformaţionale au un rol important în evoluţia materialului genetic.

În genomul eucariotelor numărul de gene este relativ mic, comparativ cu cantitatea de ADN. La om, în funcţie de mărimea genelor şi de cantitatea de ADN, ar trebui să existe un număr de 3 x 106 gene. În realitate numărul de gene este mult mai mic, 5 x 104, ceea ce înseamnă că o mică parte din ADN este informaţional, iar restul este noninformaţional, îndeplinind alte roluri în genom.

Genele au două funcţii esenţiale: funcţia autocatalitică şihetorocatalitică.

Funcţia autocatalitică constă în capacitatea genelor, deci şi a macromoleculei de ADN, de a se replica cu mare fidelitate, după modelul semiconservativ, aşa încât celulele fiice vor moşteni aceleaşi gene ca celulele mamă.

Funcţia heterocatalitică a genelor, constă în capacitatea acestora de a determina, prin secvenţa de nucleotide ce o posedă, sinteze specifice de proteine, enzime, biomolecule, informaţia genetică fiind deci decodificată şi transformată într-o secvenţă de aminoacizi, în catene polipeptidice.

Cele două funcţii ale materialului genetic au dus la formularea dogmei centrale a geneticii, care poate fi redată sintetic prin următoarea relaţie:

ADN ^ ARN ^ proteine

În cazul unor ribovirusuri s-a descoperit că poate fi un transfer de informaţie de la ARN la ADN. Fenomenul a fost descoperit de Howard Temin (1972) la virusul ce provoacă sarcomul Rous la păsări, care este un virus ARN- ADN, în sensul că ARN v se replică prin intermediul ADN.

Descoperirea făcută de Temin constituie o excepţie de la dogma centrală a geneticii, prin care s-a dovedit că ARN poate determina sinteza ADN.

3.7.3. Gene suprapuse şi gene săritoare

În cadrul cromozomului bacterian şi viral, genele sunt dispuse linear, într-o anumită ordine, alcătuind o singură grupă de linkage.

Destul de recent, la fagul 0x174 s-au descoperit aşa numitele gene suprapuse, ceea ce înseamnă că o anumită secvenţă de codoni poate fi decodificată de mai multe ori, realizându-se sinteza a două catene polipeptidice diferite.

Structura genomului fagului 0x174 a fost descifrată integral, fiind constituită din nouă gene, deoarece s-a constatat că prin infecţia bacteriei E. coli sunt produse nouă proteine diferite. Identificarea tuturor nucleotidelor din genomul virusului a permis delimitarea celor nouă gene ce au fost notate astfel: A, B, C, D, E, J, F, G, H. Există porţiuni de ADN noninformaţional care separă aceste gene între ele.

Genele A şi B determină sinteza a două proteine diferite. S-a constatat că gena B reprezintă partea terminală a genei A care este mult mai mare, deci genele A şi B sunt

94

suprapuse, gena B fiind translată dintr-un punct de iniţiere intern. Genele D şi E sunt de asemenea gene suprapuse. Suprapunerea genelor înseamnă, pe de o parte economie de material genetic, dar pe de altă parte poate fi şi un dezavantaj, deoarece apariţia unei mutaţii într-o genă determină modificarea şi celorlalte gene suprapuse. Gene suprapuse s-au observat şi la alţi fagi: S13, G4, SV40 etc.

Genele săritoare (jumping genes) sunt acele gene care se pot include în diferite regiuni ale cromozomului. Fenomenul a avut la bază observaţia că fagul X se poate integra într-un loc specific a cromozomului bacterian cu o frecvenţă de 100%. Acest sistem s-a determinat şi pentru unele segmente de ADN, care nu au origine fagică. De exemplu, la bacterii s-au identificat segmente de ADN alcătuite din 800-2.000 nucleotide, care se pot insera în diferite regiuni ale cromozomului şi pot provoca mutaţii. Aceste segmente au fost denumite segmente de inserţie (insertion sequences) şi au fost notate: ISi, IS2, IS3 şi IS4.

Factorul de fertilitate F, precum şi unele plasmide, prezintă în structura lor normală fragmente IS. De exemplu, factorul de fertilitate F are segmentele de inserţie IS 2 şi IS3, ce determină capacitatea acestuia de a se integra în cromozomul bacterian.

Unele segmente de ADN ce determină rezistenţa la antibiotice pot "sări" dintr-un locus în altul, găsindu-se la nivelul unui plasmid, apoi în genomul fagului, apoi în cromozomul bacterian şi apoi iar în plasmid. Aceste gene săritoare sunt denumite şi transpozoni, fiind unităţi independente, în funcţie de rezistenţa pe care o determină (streptomicină, penicilină, kanamicină, tetraciclină, cloramfenicol etc.).

La eucariote, încă din anul 1951, Barbara Mc Clintock, studiind culoarea boabelor de porumb de-a lungul mai multor generaţii, a arătat că anumite structuri din masa genetică "sar" câte 1-2 generaţii, însă observaţia respectivă nu a atras atenţia oamenilor de ştiinţă. După aproape două decenii s-a descoperit că este vorba de o genă structurală ce deţinea informaţia genetică şi alte două tipuri de gene ce controlau strict elementele de disociere la nivel cromozomic.

In anul 1983, Barbara Mc Clintock a primit laurii Premiului Nobel, iar pe baza descoperirii sale s-au formulat noi ipoteze privind geneza cancerului.

In general, se consideră că transpozonii (sau genele săritoare) determină o mare frecvenţă de rearanjamente moleculare la nivelul macromoleculei de ADN (inversii, deleţii, duplicaţii, transpoziţii, inserţii etc.) cu un rol esenţial în evoluţia şi, se pare, că şi în procesul de citodiferenţiere.

3.8. REPRODUCEREA ŞI RECOMBINAREA GENETICĂ LA PROCARIOTE

Procariotele (gr. pro = înainte, karyon = nucleu) sunt organisme primitive extrem de simple, de obicei unicelulare, fără nucleu, cu o structură genetică simplă, o singură macromoleculă de ADN ce alcătuiesc cromozomul. Principalele tipuri de procariote sunt: viroizii, virusurile, micoplasmele, bacteriile şi cianoficeele.

Virusurile sunt agenţi infecţioşi consideraţi fie organisme extrem de rudimentare, fie molecule foarte complexe, de aceea, în mod obişnuit, nu sunt incluse în grupul procariotelor.

Pentru genetica moleculară, bacteriile şi virusurile au constituit obiectele de studiu de mare importanţă, deoarece au o structură foarte simplă şi se reproduc într-un timp foarte scurt. Descoperirile structurii materialului genetic, a mecanismului a informaţiei genetice, au fost posibile datorită folosirii ca material de cercetare a bacteriilor şi

95

virusurilor.

3.8.1. Reproducerea bacteriilor şi virusurilor

Celula bacteriană este alcătuită din citoplasmă înconjurată de omembrană citoplasmatică, care la exterior are o membrană rigidă, iar la unele bacterii, de acest perete se ataşează o capsulă formată din polizaharide sau polipeptide. În citoplasmă se găseşte o regiune mai densă denumită nucleoid, un număr mare de ribozomi (15-20.000), o formaţiune denumită mezozom ce se formează prin invaginarea membranei celulare, de care se ataşează cromozomul circular bacterian.

După J. D. Watson (1965) în celula bacteriană ar exista între 3.000 şi6.0 substanţe chimice, de la cele mai simple la cele mai complexe, pentru sinteza

cărora sunt necesare numeroase căi metabolice, ce alcătuiescmetabolismul celular al bacteriei.

Bacteriile posedă un singur cromozom circular, format din ADN dublu catenar, cu o lungime de 700-900 p, care formează un singur grup de linkage.

Bacteriile se reproduc amitotic, deci prin simplă fisiune sau prin alte forme de reproducere asexuată, uneori şi prin înmulţire sexuată. Ciclul celular cuprinde trei perioade: de pregătire (creştere) pentru iniţierea procesului de replicaţie a ADN, de replicaţie propriu-zisă, urmată de diviziunea celulei.

Bacteriile sunt haploide numai în stadiul de spori, în rest sunt parţialdiploide datorită procesului de replicaţie, deoarece, uneori, înaintea terminăriiunui ciclu de replicaţie începe un al doilea ciclu de replicaţie sau chiar al treilea.

Pe lângă cromozomul bacterian există şi un alt material genetic reprezentat prin plasmide, alcătuite tot din ADN, dar mult mai mici decât cromozomul propriu-zis. Principalele tipuri de plasmide sunt: factorul de fertilitate (F) ce creează deosebiri de sex între indivizi, factorul colicinogenic (Col), care se găseşte la unele bacterii (Col+) ce elaborează o substanţă toxică, colicina, un grup mai mare de factori ai transferului de rezistenţă (RTF). Se consideră că originea plasmidelor ar fi exogenă şi anume virusuri, care au dobândit un înalt grad de echilibru cu celula bacteriană, pe care nu o mai pot distruge.

Virusurile sunt alcătuite dintr-un înveliş proteic denumit capsidă, constituită dintr-un număr variabil (dar caracteristic pentru fiecare tip de virus) de unităţi mai mici denumite capsomere. În interiorul capsidei se găseşte macromolecula de ADN (dezoxiribovirusuri) sau ARN (ribovirusuri).

Virusurile pot fi definite ca macromolecule nucleoproteice, care au capacitatea de a se autoreplica într-un sistem reprezentat de celula vie.

Ciclul de viaţă al virusurilor cuprinde următoarele etape: adsorbţia la suprafaţa celulei, infectarea celulei prin pătrunderea acizilor nucleici virali în celulă, faza de eclipsă în care virusul este descompus în elementele sale devenind provirus. În faza de eclipsă ADN al celulei gazdă este depolimerizat cu ajutorul dezoxiribonucleazei produsă de virus. Începe sinteza acizilor nucleici virali şi a proteinelor virale, are loc asamblarea lor pe baza aparatului enzimatic al celulei gazdă, iar faza se numeşte virus vegetativ. În faza de virus matur, particulele virale părăsesc celula infectată în mod activ, prin străbaterea porilor membranei celulare sau în mod pasiv, prin distrugerea sau liza celulei gazdă. Ciclul de viaţă descris mai sus se numeşte ciclul litic.

La bacteriofagi, virusuri ce infectează celulele bacteriene, pe lângă

96

ciclullitic, determinat de aşa numiţii bacteriofagi virulenţi, există şi un ciclulizogenic, produs de bacteriofagi temperaţi. În ciclul lizogenic materialul genetic al bacteriofagilor temperaţi se integrează în cromozomul bacterian, se replică sincron cu acesta şi celula bacteriană nu mai este lizată. Materialul genetic al fagului integrat în cromozomul bacteriei poarte numele de profag.

Ciclul lizogenic poate să se transforme în ciclul litic fie spontan, fieartificial prin iradieri cu raze X, ultraviolete sau tratamente cu azot-iperită.Fenomenul de lizogenie prezintă următorul avantaj: celula bacteriană ce posedă un profag integrat în cromozomul său nu mai este distrusă de o nouă infecţie a fagului respectiv. Acest fenomen a dus la descoperirea unui tip de recombinare genetică la bacterii, realizat cu ajutorul bacteriofagilor temperaţi, denumit transducţie.

3.8.2. Recombinarea genetică la bacterii

Recombinarea genetică la bacterii se realizează pe următoarele căi: transformare, conjugare, sex-ducţie şi transducţie.

Transformarea. Prin transformare se înţelege transferul intracelular al unui segment de ADN de la o bacterie donor, în genomul unei bacterii receptor. Frecvenţa cu care se realizează transformarea este foarte redusă, sub 1%, iar dimensiunea minimă a segmentului de ADN transformant este de 450 perechi de nucleotide.

Procesul de transformare se realizează atunci când este o cantitate mare de ADN implicată în proces şi în starea de competenţă a celulelor bacteriene (modificări ale membranei ce permit pătrunderea ADN).

După ce ADN exogen de la tipul donator a pătruns în bacteria receptoare are loc un fenomen de sinapsă între cele două molecule de ADN, în zona complementară, apoi ADN exogen se integrează în cromozomul bacteriei receptor, în procesul de replicaţie al acestuia.

Transformarea realizează de obicei transferul unei singure gene, iar în cazuri mai rare, două sau trei gene linkage, în cel din urmă caz dovedindu-se că genele respective sunt dispuse alăturat pe cromozom.

Transformarea genetică se realizează cu o frecvenţă mai mare la suşe diferite ale aceleiaşi specii de bacterii şi mai rar între specii diferite, dar înrudite. Transformarea genetică poate oferi informaţii privind gradul de înrudire filogenetică a unor specii. Tot cu ajutorul transformării genetice s-au putut localiza unele gene pe cromozomul bacterian.

Conjugarea. Fenomenul de conjugare a fost descoperit în anul 1946 de J. Lederberg şi E. L. Tatum, fiind considerat un fenomen de parasexualitate, similar oarecum cu reproducerea sexuată de la organismele eucariote. Conjugarea se realizează numai între două bacterii de sex opus, iar sexul este determinat de o plasmidă, denumită factor de fertilitate sau sex factor, notat cu F. Celulele care posedă acest factor sunt "mascule", notate cu F+ iar cele ce nu posedă acest factor sunt "femele", F -. Factorul de fertilitate se poate găsi liber în citoplasmă şi în acest caz se replică independent de cromozomul bacteriei, dar în acest caz fenomenul de conjugare se produce cu o frecvenţă destul de redusă, şi anume de 10-5. În unele cazuri, factorul de fertilitate poate fi integrat în cromozomul bacterian, iar aceste celule mascule au fost notate cu Hfr (high frequency of recombination). Între celulele Hfr şi celulele F-, conjugarea are loc cu o frecvenţă mult mai mare, şi anume 10-1.

Factorul de fertilitate are o serie de caracteristici structurale şi funcţionale:

97

- are o formă circulară, conţinând în jur de 100.000 perechi de nucleotide, fiind deci mult mai mic decât cromozomul bacterian;

- factorul F are capacitatea de a se replica mai repede decât cromozomul bacterian, astfel că, dacă într-o cultură de celulele F- se introduce o singură celulă F+, întreaga cultură devine într-un timp scurt F+;

- prin conjugarea între celulele F+ şi F- se transmite de obicei numai factorul F+, dar frecvenţa conjugării este redusă, în timp ce conjugarea între bacterii Hfr şi F- are loc cu o frecvenţă mare, iar între cele două celule poate avea loc şi un transfer total sau parţial al cromozomului de la bacteria donatoare;

- în urma conjugării, factorul de fertilitate este cel care se transferă ultimul în celula receptoare, el orientând direcţia de transfer al cromozomului, în funcţie de locul unde este integrat.

Conjugarea a fost studiată la microscopul electronic, descoperindu-se că bacteriile Hfr şi F+ posedă un apendice filamentos, denumit F-pilus care este absent în celulele femele (F-). Aceşti F-pilus (sau sex-pili) realizează legătura dintre două bacterii de sex opus, fiind un fel de tuburi prin care materialul genetic al unei bacterii (F+ sau Hfr) trece total sau parţial în celulele F".

Fenomenul de conjugare a fost studiat şi printr-o altă tehnică: procesul de transfer al materialului genetic este întrerupt prin agitare. Prin această metodă s-a putut determina poziţia lineară a genelor pe cromozomul bacterian, precum şi corelaţia precisă ce există între frecvenţa recombinărilor şi timpul cât durează conjugarea.

F. Jacob şi E. L. Wollman (1961) studiind conjugarea la două suşe de E. coli, au determinat timpul necesar pentru transferul fiecărui locus în parte, ajungând la concluzia că întregul cromozom bacterian este transferat în 89 minute. Pe această cale s-au alcătuit la unele bacterii, harta genetică, deoarece lungimea cromozomului poate fi măsurată în unităţi de timp, în care o unitate este egală cu 1 minut.

Fenomenul de conjugare este strâns legat de sinteza ADN.Replicarea ADN bacterian începe într-un anumit locus pentru o anumită suşă.

După ce celulele Hfr şi F- vin în contact, în celula Hfr începe sinteza ADN, astfel că, în celula F- migrează un ADN dublu catenar, format după modelul semiconservativ. Ambii cromozomi ai bacteriei donator (Hfr), cel care rămâne în celula Hfr şi cel care se transferă sunt ataşaţi de membrana bacteriană într-un punct denumit mezozom. În cursul transferului de material genetic, cromozomul circular de la bacteria Hfr devine linear şi migrează în această formă. Ruperea cromozomului bacterian în vederea conjugării se realizează într-un punct denumit replicator, care de cele mai multe ori este locul unde este inserat factorul de fertilitate F. La bacterii existând diferite suşe Hfr, ruperea cromozomului se realizează în diferite puncte, acest lucru constituind un avantaj în alcătuirea hărţilor genetice, având în vedere că genele localizate în jurul factorului F sunt transferate ultimele.

Sex-ducţia, denumită şi F-ducţia sau transducţia F-mediată, este o altă cale de recombinare genetică la bacterii, descoperită de F. Jacob şi E. L. Wollman (1960).

Cercetările care au dus la descoperirea acestui tip de recombinare s-au făcut la E. coli, la o suşă Hfr, care avea factorul de fertilitate inserat lângă gena lac+. În procesul de conjugare dintre o bacterie Hfr lac+ şi alta Flac- ar fi trebuit să apară recombinanţi pentru gena lac+, foarte târziu, aproape de sfârşitul transferului de material genetic. S-a constatat că au apărut câţiva recombinanţi lac+, foarte devreme. Concluzia a fost următoarea: factorul F este eliberat din cromozomul bacterian dar printr-un proces de crossing-over,

98

între cromozom şi factorul F are un schimb de material genetic, rezultând un factor de fertilitate recombinat, notat cu F' (figura 3.13).

Prin trecerea factorului F' într-o celulă F-, el poate fi inclus în cromozomul bacterian într-o regiune omoloagă cu regiunea cromozomică pe care o poartă, orientând procesul de conjugare la fel ca în cazul bacteriei Hfr iniţiale.

Sex-ducţia poate fi definită ca fiind procesul prin care gene ale cromozomului bacterian sunt încorporate în factorul de fertilitate F şi pe care le transferă la celulele F - prin procesul de conjugare.

Fig. 3.13. - Formarea factorului de fertilitate recombinat F'

În factorul F pot fi incluse diferite gene, deoarece factorul F poate fi integrat în diferite regiuni ale cromozomului.

Celulele bacteriene ce prezintă factorul F' pot fi transformate în celule Hfr, prin inserţia factorului F' în cromozomul bacterian.

Fenomenul de recombinare prin intermediul sex-ducţiei s-a realizat şi între specii diferite de bacterii. Astfel, factorul F este absent la speciile de Salmonella, Shigella, Pasteurella, dar poate fi transferat la acestea de la E. coli.

Transducţia este procesul prin care bacteriofagii temperaţi realizează transferul de informaţie genetică de la o bacterie la alta. Acest fenomen a fost descoperit de N. D. Zinder şi J. Lederberg în anul 1952, la bacteria Salmonella typhimurium, cu ajutorul bacteriofagului P32. Experienţa efectuată de cei doi cercetători a constat în următoarele: într-un tub Davis, separat la mijloc printr-un filtru de sticlă poroasă ce permite trecerea bacteriofagilor, dar nu şi a bacteriilor, a introdus în cele două braţe două suşe bacteriene diferite (figura 3.14).

Fig. 3.14. - Evidenţierea transducţiei bacteriene

99

100

Suşa LA22 este auxotrofă, dar cu genotipul fen-tri-met+hia+, deci prezintă concomitent două mutaţii biochimice, neputând sintetiza aminoacizii fenilalanină şi triptofan, iar suşa LA2 este tot auxotrofă, dar cu genotipul fen+tri+met-his- pentru alte două gene, neputând sintetiza aminoacizii metionină şi histidină. Suşa LA22 este lizogenă, în sensul că, în cromozomul său era integrat profagul P22. Unii bacteriofagi sunt eliberaţi din cromozomul bacteriei şi produc liza acesteia. Bacteriofagii pot trece prin filtrul de sticlă, produc liza bacteriei LA2, apoi pot reveni în tubul în care se găseşte bacteria LA22 cu care pot stabili din nou relaţii lizogene în urma cărora pot apare indivizi recombinaţi prototrofi (de tip sălbatic)pentru toate cele patru gene, fen+tri+met+his+.

Explicaţia acestui fenomen este următoarea: bacteriofagul P22 producând liza bacteriei LA2 include, cu o mică frecvenţă, 1 la 105-107, segmentul de cromozom cu genele fen+tri+ de la această suşă. Stabilind relaţii lizogene cu suşa LA22, bacteriofagul P22 transferă acest segment în cromozomul acestuia rezultând recombinanţi genetici de tip sălbatic (fen+tri+met+his+).

Cercetările privind transducţia au arătat că de obicei se transferă o singură genă, în cazuri rare două gene şi niciodată trei gene. În cazul transferului a două gene, se demonstrează că cele două gene sunt foarte apropiate pe cromozomul bacteriei, servind la stabilirea precisă a locilor acestora, deci la alcătuirea hărţilor genetice cu ajutorul transducţiei.

Transferul concomitent a două gene prin fenomenul de transducţie a fost denumit cotransductie.

9

Transducţia este de două tipuri: transducţie specializată, când un bacteriofag transferă numai o anumită genă şi generalizată când un bacteriofag poate transfera oricare genă dintr-un cromozom bacterian.

Transducţia specializată a fost observată la bacteriofagul X ce infectează E. coli. Acest bacteriofag este inclus sub formă de profag în cromozomul bacteriei numai alături de locusul gal (gena ce determină metabolizarea galactozei). Bacteriofagul X poate transfera numai gena gal+ de o suşă bacteriană la alta. Dacă o cultură lizogenă cu bacteriofagul X este tratată cu raze UV, bacteriofagul X se eliberează din cromozomul bacterian şi produce liza bacteriei, putând infecta apoi bacterii gal-, care se transformă cu o anumită frecvenţă în bacterii gal+.

În cazul transducţiei generalizate se poate realiza transferul oricărei gene de la o bacterie donor la o bacterie receptor, deci bacteriofagul transductant poate încorpora oricare genă şi o transferă altei bacterii.

3.8.3. Recombinarea genetică la virusuri

Recombinarea genetică la virusuri se realizează în cazul unor infecţii mixte, cu două sau mai multe tipuri de bacteriofagi. În urma lizei bacteriei pot apare fagi recombinaţi.

Primele cercetări care au pus în evidenţă recombinarea genetică la virusuri au fost realizate de A. D. Hershey şi R. Rothman (1940) la bacteriofagul T2 de la E. coli.

101

S-au folosit două caractere ale acestui fag: forma plajelor de liză (r) şi şirul de gazde (host range) notat cu h. Bacteriofagii de tip sălbatic (r+) în momentul în care infectează bacteria formează zone sau plaje mici ce au un halou difuz. Apariţia acestui halou se datorează suprainfecţiei provocate de generaţiile succesive ale bacteriofagului T2, existând un număr mare de bacterii suprainfectate, dar nelizate, formând pe marginea plajei un halou difuz.

Bacteriofagii mutanţi r- determină o liză rapidă a bacteriilor, fără ca suprainfecţia să inhibe sau să întârzie liza, astfel că, aceste plaje sunt mai mari şi fără halou, cu marginile clare.

Tipul sălbatic h+ poate liza suşa B de E.coli, dar nu poate liza suşa B2. Dacă un amestec de bacterii B şi B2 sunt infectate cu bacteriofagi h+ întreaga cultură apare tulbure din cauză că unele bacterii au fost lizate iar altele nu. Mutanta h - a bacteriofagului T2 lizează ambele suşe B şi B2 ale bacteriei, producând plaje de liză obişnuite, cu halou.

Dacă se fac infecţii mixte cu două suşe ale bacteriofagului T2, cu genotipurile h"r+ şi h+r" s-a constatat că în cultură apar şi bacteriofagi recombinaţi h"r" şi h+r+ datorită unui schimb de material genetic între genomurile fagilor.

Dacă în experienţa respectivă se introduce şi o a treia mutantă, poate fi stabilită ordinea şi distanţa dintre genele bacteriofagului pe baza procentului de recombinare.NOŢIUNI DE INGINERIE GENETICĂ

9

Moto:“E adevărat că misterul, nu este comod, te nelinişteşte.Dar dacă misterul ar fi absent, neliniştea metafizică a cunoaşterii ar dispărea şi omul ar deveni mineral.”

Petre Ţuţea

Aprofundarea cunoştinţelor de genetică moleculară, cunoaşterea structurii fine a genelor şi a cromozomilor, a deschis noi posibilităţi de izolare şi sinteză a genelor, de transfer de la o specie la alta, uneori chiar îndepărtate filogenetic, de cultură “in vitro” a celulelor şi de hibridare a acestora.

Ingineria genetică poate fi definită ca un ansamblu de metode şi tehnici moderne prin care este posibilă manipularea materialului genetic la nivel celular şi molecular.

La nivel celular, ingineria genetică a însemnat extinderea hibridărilor celulare în afara graniţelor determinate de specie, obţinându-se hibrizi celulari între diferite specii de procariote şi eucariote, între celule vegetale şi animale.

La nivel molecular, ingineria genetică a însemnat izolarea genei, sinteza artificială a genei, realizarea ADN recombinat şi transferul de gene de la o specie la alta. În sens strict, ingineria genetică constă în crearea de ADN hibrid sau ADN recombinat, derivat de la două specii diferite, integrarea şi clonarea acestuia într-o celulă bacteriană,

CAPITOLUL 4

102

unde poate funcţiona normal, realizându-se în felul acesta transferul de gene, nu pe cale sexuată, ci pe baza ADN recombinat. În felul acesta se deschide calea transformării dirijate a eredităţii organismelor la nivel molecular, acţionându-se direct asupra bazei moleculare a eredităţii.

În sens mai larg, tot ingineriei genetice îi aparţin şi tehnicile de modificare a structurii şi numărului cromozomilor prin mutaţii, putându-se transfera fie cromozomi întregi de la o specie la alta, fie segmente de cromozomi, domeniu al ingineriei genetice denumit chirurgie cromozomică. În acest domeniu, de remarcat sunt rezultatele obţinute de J. G. O'Mara (1940), care a reuşit să combine caracterele a două specii prin transferul unuia sau a câtorva cromozomi de la diferite specii. S-a reuşit transferul unor cromozomi în cadrul unor hibridări intergenerice, grâu x secară sau grâu x pir, transferându-se gene ce conferă rezistenţa la rugina galbenă şi neagră de la secară şi respectiv pir, la grâu.

Primul transfer de gene a fost realizat în 1928 de către E. Griffith, prin experienţele de transformare genetică, urmat de transferul de gene cu ajutorul unui ADN purificat, realizat în 1944 de O. T. Avery şi colaboratorii, cu o eficienţă mult mai mare.

Din multitudinea de aspecte ale ingineriei genetice, vor fi prezentate aspecte privind sinteza artificială a genei, hibridarea celulară la animale şi plante, haploidia prin androgeneză, importanţa cercetărilor de inginerie genetică.

4.1. SINTEZA ARTIFICIALĂ A GENEI

Sinteza artificială a genelor a fost precedată de o altă mare realizare şi anume sinteza artificială a ADN de la virusul 0x174 de către Arthur Kornberg, laureat al premiului Nobel (1959) fiind descrisă în capitolul anterior.

H. G. Khorana, genetician american de origine indiană, împreună cu o echipă de cercetători din Massachusetts, a realizat în 1970, prima sinteză artificială a unei gene şi anume gena ce determină sinteza unui ARN s ce transportă aminoacidul alanina la nivelul ribozomilor, la Saccharomyces cerevisiae. Această genă este destul de mică, formată din 77 nucleotide, iar tehnica folosită a fost următoarea: s-au sintetizat pe cale chimică, segmente de ADN formate din 10-14 nucleotide. Cu ajutorul enzimei ligaza s-au asamblat aceste segmente rezultând segmente bicatenare mai lungi. S-au obţinut 3 segmente mai lungi cu ajutorul enzimei polinucleotid-kinaza, care au fost legate între ele rezultând segmentul de ADN, corespunzător genei ARNs ce transportă aminoacidul alanina la ribozomi. Această genă nu era funcţională biologic.

În anul 1973, geneticianul D. Agarwal, a sintetizat artificial o genă de la bacteria E.coli, ce determină sinteza ARN s ce transportă aminoacidul tirozina la ribozomi. Această genă s-a dovedit a fi funcţională biologic. În anul 1975 geneticianul A. Efstradiatis şi echipa sa de la Universitatea Harvard, au sintetizat artificial genele ce intervin în sinteza hemoglobinei la iepure, fiind prima sinteză artificială a unei gene de la mamifere. În anul 1976 H. Köster, a sintetizat gena pentru hormonul angiotensina, care reglează tensiunea arterială şi contracţia musculară la om, fiind prima genă umană sintetizată artificial.

În ultimii ani s-au sintetizat artificial genele ce determină sinteza hormonului de creştere, somatostatina şi a insulinei.

În prezent tehnica de sinteză artificială a genei utilizează ARNm, care cu ajutorul enzimei reverstranscriptaza, determină sinteza de ADN complementar şi deci de gene.

Sinteza artificială a genelor prezintă o importanţă deosebită. Dacă genele sunt

103

inserate în virusuri sau plasmide, acestea le pot transfera în celulele bacteriene. Celulele bacteriene vor putea sintetiza o serie de enzime, hormoni, antibiotice şi, deoarece bacteriile se pot creşte uşor, va fi o cale foarte eficientă de producere a acestor substanţe. Genele sintetizate artificial vor putea fi integrate în cromozomii celulelor, în locul genelor cu defecte, combătându-se astfel, cauza unor maladii ereditare şi nu efectul lor.

A fost efectuată pentru prima dată de J. Beckwith de la Universitatea Harvard din SUA, în anul 1969. Izolarea primei gene s-a realizat la bacteria E.coli, cu ajutorul fenomenelor de transducţie specializată şi sex-ducţie. Mai întâi s-a izolat întregul operon lac. Genele care constituie acest operon sunt: genele structurale (z, a şi y), gena reglatoare (i), promotorul (p) şi operatorul (o).

Prin cartarea acestui operon s-a stabilit că ordinea acestor gene în operon este: a y z o p i.

Etapele mai importante ale izolării genei lac sunt redate în fig.4.1. In prima etapă prin transducţie specializată fagul X s-a detaşat de cromozomul bacteriei alături de gena gal, iar alături de acesta s-a ataşat un factor de fertilitate F ce conţinea gene ale operonului lac. In etapa a doua, operonul lac a fost inserat în cromozomul bacteriei, în mijlocul genei gal, iar fagul X într-o regiune alăturată, dar separată printr-un segment din cromozom. In cea de a treia etapă s-au separat bacteriile la care s-a pierdut segmentul dintre gena lac şi fagul X astfel că fagul X este plasat adiacent genei lac. Fagul X capătă mai întâi o formă circulară, având inclus şi operonul lac (etapa 5), iar în ultima etapă prin iradieri cu raze U.V. fagul s-a eliberat de cromozomul bacterian, şi-a recăpătat forma lineară având inclus în interiorul său operonul lac.

Fig.4.1. Etapele izolării operonului lac la bacteria Escherichia coli

CAPITOLUL 4

104

Operaţiile descrise mai sus s-au efectuat şi cu un alt fag, 080, ce realizează transducţia specializată. ADN al fiecărui fag are o catenă cu o greutate moleculară mai mare (catenă “grea”) şi o catenă cu o greutate moleculară mai mică (catenă “uşoară”). Prin denaturare, catenele fagilor s-au izolat una de alta, iar prin ultracentrifugare s-au separat catenele “grele” de cele “uşoare”. Catenele grele s-au pus împreună şi prin procesul de renaturare, între ele, se refac legăturile de hidrogen, dar numai în zona operonului lac, acolo unde cele două catene au nucleotide complementare, în rest catenele rămân distanţate. Cu ajutorul enzimelor ce hidrolizează ADN monocatenar, s-au eliminat catenele libere, rămânând doar operonul lac, bicatenar.

Izolarea genelor a avut o importanţă deosebită pentru că a deschis calea spre studiul aprofundat al materialului genetic “in vitro”, dar mai ales spre transferul de gene de la un organism la altul.

4.3. TRANSFERUL DE GENE (TRANSGENEZA)

În natură se realizează pe mai multe căi: la organismele superioare, în procesul de fecundare sau prin transducţie cu ajutorul virusurilor, iar la organismele inferioare (procariote) transferul de gene se realizează prin intermediul fenomenelor de transformare, conjugare, sex-ducţie şi transducţie.

Transferul de gene între speciile îndepărtate filogenetic are la bază tehnica ADN recombinat, care constă în realizarea de hibrizi moleculari ADN, ce provin de la cele două specii.

Perfecţionarea tehnicii ADN recombinat nu a fost posibilă decât după descoperirea unor enzime care rup molecula de ADN în anumite puncte, denumite endonucleaze de restricţie (restrictaze) şi a ADN-ligazelor care resudează molecula de ADN, în vederea realizării de ADN hibrid.

Enzimele de restricţie se găsesc în număr foarte mare, fiecare fiind specifică unei anumite secvenţe de nucleotide, deci unei gene. Recunoscând secvenţa specifică, restrictazele determină tăieturi la nivelul ambelor catene de ADN, fragmentând molecula.

Restrictazele constituie adevărate bisturie biologice, cu ajutorul cărora se poate desprinde din molecula de ADN, o genă ce urmează a fi transferată. Genele ce trebuiesc transferate pot fi sintetizate “in vitro”.

În realizarea transferului interspecific al genelor, prima problemă ce trebuie rezolvată este izolarea unei gene, prin una din tehnicile descrise şi găsirea unui vector sau vehicul. Rolul de vehicul îl poate avea atât ADN plasmidial, cât şi ADN al unor virusuri cum ar fi, X, SV40. În general vehiculele sunt molecule de ADN circular.

În anul 1973, A. Chang şi S. Cohen, au reuşit să obţină plasmide hibride care conţineau genele de la două bacterii şi anume gena pentru rezistenţa la tetraciclină, de la E. coli şi gena pentru rezistenţa la penicilină de laStaphylococcus aureus.

O altă cale prin care se realizează transferul de gene este folosirea ca vectori a virusurilor temperate, care la un moment dat se găsesc integrate în cromozomul bacterian, sub formă de profagi. La un moment dat, profagii se eliberează din cromozomul bacterian şi produc liza bacteriei. In acest caz, bacteriofagii pot lua o genă din cromozomul bacteriei şi la o nouă infecţie o pot transfera într-o altă bacterie.

In anul 1971, geneticianul C. Merril a reuşit să transfere gena ce răspunde de

105

metabolizarea galactozei de la bacteria E. coli în celulele umane. Pentru realizarea acestui transfer s-a procedat astfel: bacteriile E .coli au fost infectate cu bacteriofagul X, care se inseră adiacent genei gal din cromozomul bacterian. Se provoacă liza bacteriei şi se vor elibera fagi X care posedă gena gal. Aceşti fagi recombinaţi au fost introduşi într-o cultură de celule umane, ce proveneau de la un individ ce prezenta maladia ereditară galactosemia (lipsa genei ce determină enzima necesară metabolizării galactozei, în glucoză). După un timp s-a constatat că celulele umane au început să metabolizeze galactoza. Se poate spune că bacteriofagii se comportă în mod similar cu plasmidele, putând încorpora în cromozom gene străine, pe care le poate transfera în alte celule pe care le infectează.

Aceste transferuri de gene deschid mari perspective mai ales în cazul transferului de gene de la plante sau animale în celulele bacteriene, care ar putea să producă pe medii relativ simple, mari cantităţi de enzime, hormoni, proteine, de care are nevoie omenirea.

In acest sens se poate menţiona transferul genei ce determină sinteza ovalbuminei, proteină din oul de găină, la E. coli K12 (X). S-a izolat mai întâi ARNm ce codifică ovalbumina din ovocitul găinilor. Folosind fenomenul de complementaritate s-a sintetizat ADN, respectiv gena ovalbuminei care a fost inclusă apoi într-un plasmid recombinat, care prin fenomenul de conjugare a fost transferat în celula bacteriană. In urma acestui transfer, celulele bacteriene au început să producă între 30000-90000 molecule de ovalbumină, ceea ce reprezintă în jur de 0,5-1% din cantitatea totală de proteine a bacteriei. A. Riggs (citat de P. Raicu, 1980) a reuşit să transfere gena ce determină sinteza insulinei umane în pancreas, la o bacterie care a început să sintetizeze insulina. Insulina umană este formată din două catene polipeptidice alcătuite din 21 şi 30 de aminoacizi. In experienţa amintită A. Riggs a folosit o genă sintetizată artificial.

In anul 1977 s-a reuşit să se transfere gena ce determină sinteza hormonului de creştere somatostatina, produs de hipotalamus, pancreas, stomac şi intestine, din celulele umane în celulele bacteriene care au început să sintetizeze acest hormon.

O altă realizare a ingineriei genetice este transferul genelor ce determină sinteza interferonului din celulele umane în celula bacteriei E.coli.

Interferonul este o proteină cu rol antiviral şi este produs de leucocitele umane din sânge. Cercetările Institutului de Oncologie şi Imunogenetică din Villejuif arată că interferonul este capabil să vindece şoarecii bolnavi de diferite tipuri de cancer, ce nu păreau induse de virusuri, că această substanţă stimulează globulele albe, denumite NK (natural killers - celule ucigaşe), o linie de apărare împotriva celulelor canceroase.

Producerea interferonului prin infectarea leucocitelor cu virusuri, pentru a stimula fabricarea de interferon, era foarte scumpă şi se obţineau cantităţi infime de substanţă. La începutul anului 1980, Charles Weismann de la Institutul de biologie moleculară din Zurich, a realizat sinteza interferonului, cu ajutorul bacteriei E. coli.

Astăzi se ştie că interferonul are următoarele funcţii: inhibă creşterea celulelor în general, reglează activităţile imunitare, măreşte activitatea celulelor albe (ce recunosc şi distrug celulele tumorale), stimulează celulele macrofage ce distrug virusurile, bacteriile şi alte particule.

Se poate spune că interferonul este un mediator celular, deoarece acţionează ca un activator al celulelor specializate în distrugerea virusurilor şi a celulelor canceroase şi nu un antibiotic antiviral.

Transgeneza, transferul de gene sau fragmente de ADN de la un organism

CAPITOLUL 4

106

(donor) la altul (receptor) se poate realiza fie prin metoda directă (introducerea moleculei de ADN în celule receptor), fie prin metode indirecte (ADN este introdus în receptor printr-un vector).

Prin metoda directă, ADN exogen poate fi transferat în celule gazdă prin mai multe tehnici: endocitoză, electroporare, microinjecţie, macroinjecţie şi biolistic (Butnaru Gallia, 1999).

Endocitoza presupune obţinerea mai întâi a protoplaştilor, celule vegetale cărora li s-a îndepărtat peretele celular rigid, pectocelulozic, cu ajutorul enzimelor (pectinaza, celulaza) sau pe cale mecanică.

ADN transformant este adsorbit la suprafaţa celulelor receptoare, iar apoi este inclus în celule. Această metodă presupune protejarea moleculei de ADN prin includerea sa în lipozomi, prin tratare cu polietilenglicol şi fosfat de calciu şi existenţa a mai multor molecule de ADN transformant pentru ca transferul să se realizeze cu o frecvenţă cât mai mare.

Electroporarea constă în transferul moleculelor de ADN în protoplaşti cu ajutorul unor impulsuri electrice de scurtă durată sau cu ajutorul razelor laser (porare laser). Se apreciază că eficienţa transformării genetice este destul de mică fiind dependentă de greutatea moleculară a ADN, concentraţia polietilenglicolului, durata şi intensitatea impulsului electric, starea fiziologică a celulei receptor (Butnaru Gallia, 1999).

Microinjecţia este o metodă mult mai precisă, deoarece o moleculă cunoscută (ADN, ARN, proteine) se introduce cu o microseringă din sticlă montată pe un micromanipulator, într-un receptor (protoplast, celulă animală), fixat pe o lamă de sticlă, în gel de agaroză.

Metodele biolistice constau în introducerea unui ADN exogen într-un receptor prin intermediul aşa numitului tun de particule sau cu ajutorul arcului electric.

Cu ajutorul tunului de particule, microparticule de aur sau tungsten asociate cu molecule de ADN donor sunt direcţionate într-o celulă sau grup de

celule. Celulele sau ţesuturile bombardate cu aceste microparticule, crescute pe un mediu de cultură vor regenera plante, transformate genetic.

Transgeneza indirectă presupune izolarea unui segment de ADN (o genă), clonarea genei respective şi transferul într-o celulă receptor prin intermediul unui vector (Butnaru Gallia, 1999).

Gena ce trebuie transferată a primit denumirea de pasager; de obicei pasagerul, pătruns într-o celulă receptor este degradat de sistemul enzimatic al acesteia. Pentru a evita această degradare, gena (pasagerul) se asociază cu un vector, iar împreună constituie o macromoleculă complexă, de ADN recombinant.

Izolarea ADN de la diferite organisme procariote sau eucariote se realizează prin diferite metode fizico-chimice (centrifugare, tratare cu diferite enzime etc.). Deoarece fragmentul de ADN izolat poate conţine mai multe gene este necesară fragmentarea acestuia, pentru izolarea genei (pasagerului) ce trebuie transferată. Pentru izolarea unei gene de interes se foloseşte ARNm al genei respective, care în prezenţa reverstranscriptazei se va transforma într-o moleculă de ADN complementar (ADN-c) monocatenar. În prezenţa ADN-polimerazei I, ADN-c îşi va sintetiza catena complementară, devenind ADN bicatenar, care va avea înscrisă informaţia nucleotidică din ARNm.

Genele ce urmează a fi transferate nu vor fi funcţionale dacă nu au ataşate promotorul, intensificator sau atenuator ai transcripţiei informaţiei genetice, care intră în structura genelor şi reglează activitatea acestora.

În procesul de transgeneză sunt absolut necesare enzimele de restricţie (endonucleaze de restricţie), produse în mod natural de bacterii, cu rol imunitar, respectiv de a distruge moleculele de ADN exogen ce pătrund în acestea. Sunt cunoscute în prezent peste 500 de tipuri de endonucleaze de restricţie care acţionează ca nişte “bisturie” moleculare, secţionând moleculele de ADN, în secvenţe scurte între două baze azotate adiacente cunoscute (“ţintă”).

Cele mai cunoscute endonucleaze de restricţie sunt: EcoR1 (izolată de la Escherichia coli), Hpa I (din Haemophilus paramfluenzae), Alu I (din Arthriobacter luteus) etc.

Aceste enzime acţionează asupra unor secvenţe de nucleotide constituite din 4, 5 sau 6 nucleotide, fie pe axul de simetrie al acestora sau de o parte şi de alta a acestuia. Astfel, EcoR1 secţionează ADN în secvenţă hexanucleotidică 5’- GAATTC-3’ între nucleotidele G şi A, pe ambele catene ale moleculei, în timp ce Alu I acţionează la nivelul tetranucleotidului 5’-AGCT-3’ între nucleotidele A şi G (Cîrlan M., 1996).

Fiecare enzimă are un mod particular, unic, de acţiune, de aceia sunt nelipsite în operaţiunile de fragmentare a moleculelor de ADN.

Transgeneza necesită folosirea unui alt grup de enzime şi anume ADN- ligazele, care leagă fragmentele de ADN ce trebuie transferat, de ADN al unui vector.

Trebuie avut în vedere şi receptorul în care trebuie transferat ADN exogen, care poate fi o bacterie, o celulă vegetală sau animală.

Între receptor şi vector trebuie să fie o compatibilitate perfectă, aşa încât, un vector este funcţional numai la un anumit receptor.

1084.3.1. Principalii vectori utilizaţi în transgeneză

Vectorii sunt molecule mici de ADN ce încorporează genele ce trebuie transferate (pasagerul). Vectorii trebuie să aibă capacitatea de a pătrunde într-o celulă

108

gazdă, iar gena ce trebuie transferată să fie marcată genetic cu un marker specific, pentru a putea fi recunoscută.

Ingineria genetică foloseşte un număr mare de vectori, funcţie de pasager şi de receptor.

Plasmidele bacteriene, cromozomi miniaturali, care pot include gene străine sunt utilizate frecvent ca vectori: plasmida pBR322, plasmida pUC, plasmida Ti, plasmida Ri ş.a.

Ca vectori pentru celulele vegetale, în vederea obţinerii plantelor transgenice se folosesc plasmidele Ti (tumor inducing) de la Agrobacterium tumefaciens şi Ri (root inducing) de la Agrobacterium rhizogenes .

Mărimea plasmidelor, exprimată în kilobaze (1000 de perechi de baze) este în jurul a 200 kb şi pot include şi transfera segmente de ADN de 8-10 kb.

Un alt grup de vectori îl reprezintă bacteriofagii.Fagul X, care conţine 48500 pb poate transfera secvenţe de ADN mai mari de

40 kb.Cosmidele sunt vectori hibrizi realizaţi între fagul X şi plasmide, combinând

însuşirile plasmidelor şi a fagului, în sensul că sunt funcţionale, exprimându-se fenotipic, fără să se integreze în cromozomul celulelor gazdă. Se folosesc frecvent pentru clonarea şi transferul fragmentelor de ADN de la eucariote, fragmente de aproximativ 45 kb, care în mod normal nu pot fi incluse în fagul X.

Fagii monocatenari au ca material genetic o singură catenă de ADN notată convenţional cu (+). Această catenă pătrunde în celula gazdă, în momentul infecţiei, constituind matricea pentru sinteza unei catene complementare, notată cu (-). Împreună cu catena (+) va forma o moleculă bicatenară de ADN, care poate fi izolată şi folosită pentru clonarea ADN.

Există şi alţi vectori, cum ar fi vectorii de expresie, a căror gene pot fi transcrise şi translate în proteine, virusul SV 40 (Simian Virus 40), vectorii YAC (Yeast Artificial Chromosome) - cromozomi artificiali ai drojdiei de bere, vectorii BAC (Bacterial Artificial Chromosome) etc.

4.3.2. Realizări ale transgenezei la plante

În ultimii ani s-au realizat plante transgenice, denumite şi plante modificate genetic.

Aşa cum s-a specificat anterior, la plantele superioare se folosesc ca vectori ai genelor “de interes” plasmidele Ti de la Agrobacterium tumefaciens, care în mod natural dau naştere la tumori şi plasmidele Ri de la Agrobacterium rhizogenes, care dau naştere la rădăcini filiforme.

Plasmidele Ti, datorită regiunii denumite ADN-T funcţionează ca transpozoni (elemente genetice mobile). Numai această regiune se integrează în cromozomul celulei gazdă.

Bacteriile din genul Agrobacterium oferă singurul exemplu de inginerie genetică naturală, deoarece în urma infecţiei, bacteria transferă în nucleul celulei vegetale o mică porţiune din ADN al plasmidei, care determină transformarea celulei infectate în celulă tumorală. Prin eliminarea genelor tumorale (oncogenelor) şi asocierea acestei plasmide “dezarmate” cu o plasmidă ce conţine gena “de interes”, clonată în bacteria

109

Escherichia coli se obţine un vector de transformare foarte eficient pentru dicotiledonate (în condiţii naturale Agrobacterium nu atacă monocotiledonatele).

Indiferent de metoda de transfer, frecvenţa de integrare a genelor în genomul celulei vegetale este destul de redusă. Din această cauză, genei “de interes” îi este asociată o genă marker, care permite selecţia celulelor transformate. Se folosesc frecvent ca gene marker, genele care conferă rezistenţă la un antibiotic sau la un erbicid, care-i va permite celulei transformate să supravieţuiască pe un mediu de cultură ce posedă antibioticul sau erbicidul.

Cele mai importante plante transgenice aflate deja în cultură sunt soia Roundup Ready, tolerantă la erbicidul total Roundup (care are ca principiu activ glifosat) şi porumbul Bt, rezistent la atacul sfredelitorului (Ostrinia nubilalis), urmând a se obţine plante tolerante la doi sau mai mulţi factori (rezistenţă la un erbicid asociată cu rezistenţa la o insectă, androsterilitate asociată cu rezistenţa la un erbicid etc.).

O altă realizare a ingineriei genetice o constituie tomatele, la care s-a modificat procesul de coacere a fructelor, denumite Flavr Savr, fructele menţinându-şi prospeţimea timp îndelungat. În acest caz, s-a folosit tehnologia ARN antisens, blocându-se sinteza uneia din enzimele ce degradează pereţii celulari ai fructului sau a hormonului etilenă (cel care accelerează procesul de coacere, aceasta fiind întârziată).

O altă direcţie a ingineriei genetice este transferul genelor nif de la plantele leguminoase la plantele cerealiere.

4.3.3. Transferul genelor fixatoare de azot

Plantele din familia Leguminoase (mazărea, fasolea, bobul, soia etc.) au capacitatea să fixeze N atmosferic cu ajutorul unor bacterii cu care trăiesc în simbioză. Bacteriile fixatoare de azot pătrund în ţesuturile rădăcinilor, formând aşa numitele nodozităţi, iar din această simbioză beneficiază ambele specii: plantele obţin azotul atmosferic iar bacteriile obţin de la plante compuşii organici de care au nevoie. Există şi alte plante, în afară de cele leguminoase, care trăiesc în simbioză cu bacterii fixatoare de azot: unele graminee (Digitaria), chiar unii arbori cum ar fi aninul (Alnus).

Azotul atmosferic poate fi fixat de unele bacterii din genurile: Rhizobium, Azotobacter, Desulfovibrio, Hydrogenomonas etc. sau de unele alge verzi-albastre.

Mecanismul fixării azotului atmosferic a fost descifrat în 1960, în laboratoarele Du Pont de Nemours (SUA). La bacteria Clostridium pasteurianum s-a izolat enzima nitrogenaza, care catalizează fixarea azotului atmosferic. Această enzimă este formată din două molecule proteice, una cu greutate moleculară mare (220.000 daltoni) şi cealaltă cu greutate moleculară mică (55.000 daltoni). Molecula mare conţine atomi de fier, sulf şi molibden, iar molecula mică doar fier şi sulf. Cele două molecule sunt active împreună şi numai în absenţa oxigenului atmosferic. Protejarea moleculei de nitrogenază împotriva oxigenului atmosferic este asigurată de un pigment denumit leghemoglobină care se combină cu oxigenul şi protejează astfel enzima.

Sinteza enzimei nitrogenaza este determinată de un grup de gene notate cu nif care sunt localizate pe cromozom alăturat de gena his, ce determină metabolismul histidinei. Se pare că este vorba de două gene nif: una ce determină sinteza moleculei mari a nitrogenazei şi alta ce determină sinteza moleculei mici.

Transferul genelor nif de la bacteriile fixatoare de azot la altele nefixatoare se

110

poate realiza pe căile cunoscute de recombinare la bacterii: transformare, conjugare, sex-ducţie şi transducţie. Geneticianul R. Dixon de la Universitatea din Sussex (Anglia) a transferat genele nif şi his de la bacteria F+ de Klebsiella pneumoniae, la bacteria F- de E. coli.

Tot Dixon în 1974 a obţinut un factor de fertilitate recombinat care includea în el şi genele nif, denumite FN 68. Acest factor de fertilitate, introdus în mediul de cultură a unor bacterii incapabile să fixeze azotul atmosferic (ex. E.coli), a produs transformarea acestora în bacterii fixatoare de azot.

Pentru transferul genelor nif se pot folosi ca vectori şi bacteriofagii în procesul de transducţie. S. Stroicher a folosit fagul P1 pentru transferul genelor nif.

Transferul genelor nif de la o bacterie la alta a creat premisele realizării unor simbioze a acestor bacterii nu numai cu leguminoasele, ci şi cu alte plante care nu au capacitatea de a fixa azotul atmosferic.

În viitor se preconizează transferul acestor gene nif în cromozomul plantelor sau în cromozomul cloroplastelor, situaţie în care plantele nu ar mai avea nevoie de simbioze cu bacteriile, plantele fixându-şi direct azotul atmosferic.

4.4. HIBRIDAREA CELULARĂ LA ANIMALE

Hibridarea celulară “in vitro” a fost realizată pentru prima dată în 1960 de cercetătorul francez G. Barski. A cultivat pe un mediu artificial celule ce proveneau de la două specii de şoareci şi a observat că unele celule au fuzionat rezultând celule hibride, care însumează cromozomii de la celulele iniţiale şi au însuşiri morfologice, fiziologice şi biochimice diferite de ale celulelor iniţiale.

Fuzionarea spontană a celulelor se realizează cu o frecvenţă foarte mică. Pentru a mări frecvenţa celulelor hibride s-au căutat o serie de agenţi inductori care să favorizeze hibridarea celulară. Virusul Sendai inactivat s-a dovedit a fi un bun inductor, capabil să mărească foarte mult frecvenţa celulelor hibride. S-au identificat o serie de substanţe chimice care stimulează hibridarea celulară: un analog al isoleucinei, polietilenglicolul etc.

O altă problemă ce a condiţionat hibridarea celulară a fost modul de separare sau selectare a celulelor hibride de restul celulelor din mediul de creştere. S-au elaborat aşa numitele medii selective, în care celulele hibride se înmulţesc în timp ce celulele parentale sunt eliminate.

Folosind tehnicile prezentate mai sus, s-au reuşit hibridări celulare între celule de la specii foarte diferite: celule de hamster chinezesc x celule de şoarece, celule umane x celule de şoarece, celule umane x celule de ţânţar, celule de şoarece x celule de găină.

Celulele hibride nu pot regenera organisme hibride complet dezvoltate, dar se înmulţesc până la un anumit moment, rezultând clone celulare hibride. Obţinerea acestor clone celulare hibride are un rol foarte important în cercetările de genetică.

Dacă ne referim la hibridările dintre celulele umane x celule de şoarece (fig.4.2.), s-a constatat că celulele hibride conţin iniţial toţi cromozomii (46 de la om + 40 de la şoarece). În momentul când încep să se dividă, celulele hibride pierd câte un cromozom ce aparţine unei specii. In cazul hibridării celule umane x celule de şoarece se pierd o parte din cromozomii umani.

111

Această particularitate a celulelor hibride, a fost folosită în alcătuirea hărţilor cromozomice, deoarece eliminarea a câte unui cromozom se manifestă prin lipsa sau prezenţa în plus a uneia sau a mai multor enzime, putându-se localiza unele gene pe cromozomi. Pentru localizarea mai precisă a genelor în diferite regiuni ale cromozomului se folosesc pentru hibridare celule umane ce provin de la indivizi ce prezintă anumite restructurări cromozomice. S-au realizat hibrizi celulari între leucocitele ce produc interferon şi celulele tumorale, rezultând celule de tip hibridoma, ce produc o cantitate mult mai mare de interferon.

4.5. HIBRIDAREA CELULARĂ LA PLANTE

Hibridarea celulară la plante s-a putut realiza numai după ce s-au obţinut aşa numiţii protoplaşti, care sunt celule vegetale cărora li s-a îndepărtat membrana rigidă pecto-celulozică. Îndepărtarea membranei pecto-celulozice s-a realizat la început pe cale mecanică iar mai târziu, după anul 1960, prin metode chimice, folosind o serie de enzime cum ar fi: celulaza, pectinaza, macerozima. În anul 1971, francezul J. P. Nitsch a obţinut o plantă complet dezvoltată, prin regenerarea protoplaştilor (fig. 4.3.). În ultimii ani s-au izolat protoplaşti şi s-au regenerat plante întregi la: soia, morcov, petunia, bob, mazăre, grâu etc. (Raicu P., 1980).

Vkul Smdl l

Fig.4.2. Hibridarea celulară la animale

112

Fig. 4. 3. Obţinerea enzimatică a protoplaştilor

Fuzionarea protoplaştilor ridică aceleaşi probleme ca şi fuzionarea celulelor animale: mărirea frecvenţei celulelor hibride şi selectarea acestora. Pentru a mări frecvenţa de fuzionare a protoplaştilor se folosesc: polietilenglicolul, nitratul de sodiu, ionii de Ca la un pH ridicat, ser proaspăt de iepure etc.

Selectarea celulelor fuzionate se realizează prin folosirea de medii selective, care elimină celulele nefuzionate păstrându-le pe cele hibride. La plante s-a constatat că mediile de cultură ce nu posedă substanţe de creştere (citochinină şi auxină) elimină celulele parentale, în timp ce celulele hibride se pot dispensa de aceste substanţe.

P. S. Carlson (1972) a obţinut plante hibride întregi, prin fuzionarea protoplaştilor de la speciile de tutun, Nicotiana glauca (2n=24) şi N. langsdorffii (2n=18). Plantele rezultate erau amfiploizi ce aveau 2n=42 cromozomi, identici cu hibrizii obţinuţi pe cale sexuată (fig.4.4.)

Această metodă de obţinere a hibrizilor a permis însă obţinerea de hibrizi celulari între speciile îndepărtate filogenetic care în mod obişnuit nu se pot hibrida sexuat: morcov x tutun, porumb x ovăz, porumb x soia, morcov x petunia.

Fig. 4.4. Hibridarea celulară la plante 114

114

115

Un aspect foarte important este acela că protoplaştii pot include molecule de ADN străine, existente în mediu, particule străine(virusuri) şi alte molecule. Fenomenul a fost numit transgenoză, iar pe această cale se pot transfera gene sau chiar organite citoplasmatice de la un organism la altul.

Din punct de vedere genetic, protoplaştii prezintă o serie de avantaje:- permit înmulţirea rapidă a unor genotipuri valoroase;- se pot obţine hibrizi celulari între două specii îndepărtate din punct de

vedere filogenetic, care nu se pot încrucişa sexuat;- se pot obţine forme cu grade diferite de poliploidie;- se pot induce mutaţii la nivelul protoplaştilor haploizi sau diploizi;- se pot transfera gene, cromozomi sau cloroplaste;- protoplaştii pot regenera plante libere de viroze.In ultimii ani cercetările privind hibridarea celulară a luat o mare amploare,

reuşindu-se hibridarea unor celule animale cu celule vegetale. In anul 1976 A. Lima de Faria (Suedia) a reuşit fuzionarea unor celule tumorale umane de tip HeLa cu protoplaşti de morcov, folosind polietilenglicolul ca agent inductor.

Aceste hibridări urmăresc combinarea unor genotipuri extrem de diferite, depăşindu-se limitele impuse de reproducerea sexuată.

4.6. HAPLOIDIA PRIN ANDROGENEZĂ LA PLANTE

Dezvoltarea partenogenetică a unui embrion sau a unei plante dintr-un microspor haploid poartă numele de androgeneză iar dezvoltarea unui organism haploid dintr-o oosferă sau un nucleu secundar al sacului embrionar se numeşte ginogeneză.

In anul 1964 cercetătorii indieni S. Guha şi S. C. Maheswari au cultivat pe un mediu artificial, antere de Datura innoxia şi au obţinut numeroşi embrioizi. Cu doi ani mai târziu s-au obţinut plante haploide complet dezvoltate la tutun (Nicotiana tabacum) (Raicu P., 1980).

Androgeneza este de două tipuri: directă şi indirectă (fig.4.5.). Androgeneza directă constă în faptul că programul normal al microsporului este deviat sub influenţa unor stimuli externi, având loc o evoluţie particulară a nucleului haploid, care prin diviziuni mitotice devine embrioid şi apoi plantă matură. In cazul androgenezei indirecte, se formează mai întâi un ţesut nediferenţiat denumit calus, din care se pot diferenţia apoi plante haploide cu diferite grade de poliploidie.

Obţinerea unor plante haploide prin androgeneză este condiţionată de numeroşi factori, cum ar fi vârsta anterelor, temperatura, lumina, compoziţia mediului de cultură, fapt ce a făcut ca numai la unele specii să se poată obţine haploizi pe această cale.

Pentru genetică, haploizii obţinuţi prin androgeneză prezintă o mare importanţă. In primul rând se demonstrează că în nucleul celulelor vegetale există toată informaţia ereditară a organismului, inclusiv programul embriogenezei, deoarece dintr-o singură celulă se regenerează un organism întreg.

Plantele haploide sunt pure din puncte de vedere genetic, deoarece sunt hemizigote, existând o corespondenţă completă între genotip şi fenotip.

Prin dublarea numărului de cromozomi se obţin plante diploide, complet homozigote, aşa numitele linii izogene, într-un timp foarte scurt, de o importanţă deosebită pentru ameliorare. Dacă prin metodele clasice liniile homozigote la plantele

116

alogame se obţin în 8-9 generaţii de consangvinizare, prin haploidie liniile homozigote se obţin într-o singură generaţie.

La plantele haploide se manifestă toate genele recesive iar mutaţiile se pot detecta foarte uşor.

Haploizii s-au dovedit utili în studiile de embriogeneză experimentală, de citologie, citogenetică, de mutageneză, de fiziologie şi biochimie, de citodiferenţiere, datorită faptului că expresivitatea genelor la plantele haploide, care sunt hemizigote, este totală, într-o singură generaţie.

EREDITATEA MENDELIANĂ

Moto:". . . Gregor Mendel, o figură cu care

se poate mândri întreaga omenire...”

C. Sandu Aldea

Fig. 4.5. Haploidia prin androgeneză directă şi indirectă

117

“Odată cu Mendel, fenomenele biologiei au dobândit dintr-odată rigoarea matematicienilor. Metodologia, tratarea statistică şi reprezentarea simbolică, impun eredităţii o întreagă logică internă”

Francois Jacob

Apariţia lucrării “Versuche uber Pflanzenhybriden” în 1866, a naturalistului şi matematicianului ceh Gregor Johann Mendel (1822-1884), a constituit un moment important în istoria biologiei. Gregor Mendel este considerat unul din fondatorii geneticii, datorită teoriei factorilor ereditari, sinteză a celor două legi ale eredităţii: legea segregării caracterelor (legea purităţii gameţilor) şi legea segregării independente a perechilor de caractere (legea liberei combinaţii a factorilor ereditari).

Unui prieten, Gregor Mendel i-a spus: “Timpul meu va veni” şi într- adevăr a venit, după redescoperirea legilor eredităţii, la începutul secolului XX de Hugo de Vries (Olanda), Carl Correns (Germania) şi Erich Tschermack (Austria).

Redescoperirea legilor lui Mendel a dus la retipărirea lucrării şi traducerea ei în mai multe ţări. In limba română, lucrarea lui Mendel a fost tradusă în anul 1945 din iniţiativa doctorului A. Piescu.

5.1. TERMINOLOGIA FOLOSITĂ ÎN GENETICA MENDELIANĂ

In cercetările sale, Gr. Mendel a folosit în mod deosebit mazărea, Pisum sativum, plantă autogamă, care prezintă caractere distincte de la o varietate la alta. Caracterele luate în studiu au fost următoarele: talia plantelor (înaltă sau pitică), culoarea păstăilor nemature (galbenă sau verde), culoarea cotiledoanelor (verde sau galbenă), suprafaţa seminţelor (netedă sau zbârcită), culoarea tegumentului boabelor (albă sau cenuşie), poziţia florilor (axială sau terminală), forma păstăilor (dreaptă sau gâtuită între seminţe). Aceste perechi de caractere au fost numite mai târziu alelomorfe (de W. Bateson şi E. R. Saunders, 1902), din care a rezultat termenul de alele. Determinanţii ereditari au fost numiţi şi factori ereditari (indicaţi ulterior prin noţiunea de genă).

înainte de a analiza mecanismul de transmitere a caracterelor în procesul de hibridare este necesar să fie definite câteva noţiuni de bază care vor servi pentru înţelegerea lui.

Hibridarea este încrucişarea dintre doi indivizi care se deosebesc prin una sau mai multe perechi de caractere. Hibridul este rezultatul hibridării. Părinţii (genitorii) se notează cu P (lat. parentes = părinţi) iar urmaşii (descendenţii) se notează cu F (lat. fillii = copii).

în funcţie de numărul de perechi de caractere prin care se deosebesc părinţii, există mai multe tipuri de hibridare: monohibridarea (o pereche de caractere), dihibridarea (două perechi de caractere) etc.

în concepţia lui Gregor Mendel, determinanţii genetici au fost numiţi factori ereditari, în genetica modernă fiind înlocuiţi prin termenul de gene.

118

Gena este unitatea elementară ce deţine informaţia genetică a unui caracter ereditar, transmis de părinţi la urmaşi. Gena ocupă un loc precis în cromozom (locus). în celulele somatice, cromozomii omologi, unul de origine maternă, celălalt de origine paternă, vor avea şi loci omologi, ocupaţi de gene alele. Dacă alelele sunt identice (AA sau aa) indivizii se numesc homozigoţi pentru această pereche de gene, iar când alelele sunt diferite (Aa) indivizii sunt consideraţi heterozigoţi. Ereditatea mendeliană presupune, în principal, interacţiunea dominanţă-recesivitate între genele alele; alela care se manifestă fenotipic la hibrizii F1 este dominantă, iar perechea sa, care nu se exteriorizează prin caracterul respectiv, este recesivă.

Hibridările, de orice nivel, oferă posibilitatea unei duble analize: sub aspect genotipic şi sub aspect fenotipic.

Genotipul reprezintă totalitatea genelor unui individ sau constituţia genetică a acestuia. Noţiunea de genotip se utilizează însă şi în sens restrâns, numai pentru una sau câteva perechi de gene alele (AA, Aa, aa, AABB, AaBb etc.).

Fenotipul reprezintă totalitatea caracterelor morfologice, fiziologice, biochimice şi comportamentale ale individului, care rezultă din interacţiunea genotipului cu mediul.

5.2. LEGILE MENDELIENE ALE EREDITĂŢII9

în lucrările şi manualele care s-au ocupat de opera lui Mendel, rezultatele la care a ajuns el, au fost prezentate de diferiţi autori în mod diferit. în legătură cu legile lui Mendel sunt menţionate diferite formulări: legea uniformităţii hibrizilor în prima generaţie, legea dominanţei, legea purităţii gameţilor, legea segregării caracterelor, legea liberei combinări a caracterelor numită şi legea independenţei caracterelor. După părerea noastră din lectura lucrării lui Mendel “Experienţe asupra hibrizilor de plante”, se desprind două legi:

1. Legea segregării sau a disjuncţiei caracterelor în generaţia a doua hibridă (F2) (datorită separării sau segregării în meioza hibridului F1 a

119

alelelor dominante şi recesive şi unirii întâmplătoare a gârneţilor pentru formarea generaţiei F2).

2. Legea combinării libere a caracterelor sau a segregării independente a acestora (apariţia la încrucişarea polihibridă, în urma segregării şi combinării libere a caracterelor, a unor noi combinaţii la descendenţi).

5.2.1. Legea segregării caracterelor (legea purităţii gameţilor)

Gregor Mendel a efectuat un număr impresionant de mono, di şi trihibridări la mazăre (Pisum sativum L.) şi la alte specii din genurile: Phaseolus, Mirabilis, Cirsium, Melandrium, Zea, Antirrhinum, Hieracium etc.

Segregarea caracterelor ereditare a fost formulată, în urma analizei fenotipice şi genotipice a unor monohibridări, dar poate fi demonstrată şi-n cazul celorlalte tipuri de hibridare.

Gregor Mendel a încrucişat o varietate de mazăre cu seminţe galbene, cu o varietate cu seminţe verzi, ambele homozigote (pure din punct de vedere genetic). In generaţia Fi, au rezultat numai plante cu seminţe galbene. Caracterul culoare galbenă a fost numit dominant, iar perechea sa, culoare verde, recesiv (lat. recessere = ascuns).

In urma autofecundării plantelor din generaţia F i a rezultat generaţia F2, în care s-au obţinut două grupe fenotipice: % (75 %) seminţe galbene şi % (25%) seminţe verzi, prin urmare un raport de segregare fenotipică de 3:1.

Notând caracterul culoare galbenă cu A, iar verde cu a, în figura 5.1. se pot analiza sub aspect fenotipic şi genotipic, părinţii, generaţiile F1, F2 şi F3.

Fig. 5.1. - Structura genotipurilor şi a fenotipurilor în cazul monohibridării

120

Gregor Mendel a explicat segregarea factorilor ereditari astfel: în celulele somatice, factorii ereditari se găsesc sub formă de pereche (AA, Aa, aa). In urma meiozei, factorii ereditari segregă, astfel că gameţii vor avea numai câte un singur reprezentant din fiecare pereche (A sau a), deci sunt puri din punct de vedere genetic.

Părinţii sunt homozigoţi (AA şi aa) şi vor produce câte un singur tip de gameţi (A sau a). In generaţia Fi toţi indivizii sunt identici fenotipic (seminţe galbene) şi genotipic (Aa). Indivizii generaţiei F1, heterozigoţi, vor forma două tipuri de gameţi pentru fiecare sex: 50% A şi 50% a. Combinarea probabilistică a gameţilor de sex diferit face ca în F 2 să rezulte trei combinaţii genotipice, 1/4 (25%) AA, 2/4 (50%) Aa şi 1/4 (25%) aa (raportul de segregare genotipică 1:2:1) şi două grupe fenotipice % (75%) seminţe galbene şi % (25%) seminţe verzi (raportul de segregare fenotipică 3:1).

R. C. Punnett imaginează un şah de combinaţii a gameţilor celor două sexe, dând posibilitatea identificării rapide a tuturor genotipurilor şi fenotipurilor din generaţia F2:

Gameţi Ş Gameţi ^50% A 50% a

50% A 25% AA 25%Aa50% a 25% Aa 25% aa

Gregor Mendel a efectuat monohibridări şi cu alte perechi de caractere, constatând acelaşi lucru: în generaţia F1 au rezultat indivizi asemănători unui părinte, iar în generaţia F2, segregarea s-a realizat într-un raport foarte apropiat de 3:1 (tabelul 5.1.).

Tabelul 5.1.Rezultatele monohibridărilor la mazăre (obţinute de Gregor Mendel)

Caracterul

ÎnsuşiriRaportul

D/rDominante(D)

Recesive(r)

Dominante Recesive

Formaseminţelor

Netedă Zbârcită 5.474 1.850 2,98:1,01

Culoareacotiledoanelor

Galbenă Verde 6.022 2.001 3,01:0,99

Culoareategumentului

Colorată Albă 705 224 3,03:0,96

Consistenţapăstăilor

Tare Moale 862 299 2,98:1,02

Culoareapăstăilor

Verde Galbenă 428 152 2,95:1,05

Dispoziţiaflorilor

Axilară Terminală 651 207 3,03:0,96

Forma plantei Inaltă Pitică 187 277 2,95:1,04Total - - 14.949 5010 2,99:1,01

Monohibridările efectuate de Gregor Mendel au fost denumite mai târziu monohibridări de tip Pisum.

După redescoperirea legilor mendeliene, imediat după anul 1900, s-au realizat monohibridări şi la diferite specii de animale. Obţinându-se rezultate asemănătoare celor de la plante, s-a demonstrat universalitatea

121

legilor mendeliene.în anul 1901, W. Bateson a încrucişat diferite rase de găini, care se

deosebeau prin forma crestei: „mazăre”, „trandafir” şi simplă. Formele de creastă „mazăre” şi „trandafir” sunt dominante faţă de forma simplă, iar în generaţia F2 segregarea s-a produs în raportul de 3:1 (Raicu P., 1980).

Zoologul francez L. Cuenot (1902) a încrucişat şoareci cu blană de culoare gri cu şoareci de culoare albă, obţinând în generaţia F1 şoareci gri, iar în generaţia F2 segregarea s-a produs în raportul de 3:1.

Experienţe similare s-au făcut apoi la foarte multe specii de animale, întărind ideea de universalitate a legilor mendeliene.

5.2.2. Legea segregării independente a perechilor de caractere

Cea mai simplă formă de polihibridare este dihibridarea, termen introdus în genetică de către Hugo de Vries (1900). în acest caz sunt urmărite două perechi de caractere.

La încrucişarea a două soiuri de mazăre: plante cu seminţe galbene şi netede cu plante cu seminţe verzi şi zbârcite, în Fi, G. Mendel a obţinut plante cu seminţe galbene şi netede. în F2 perechile de caractere analizate separat au segregat după raportul 3:1 şi anume: 75% seminţe galbene şi 25% seminţe verzi, şi 75% seminţe netede şi 25% seminţe zbârcite. Analizând însă modul cum apar împreună cele două perechi de caractere, G. Mendel a constatat că raportul dintre ele este:

56,25% seminţe galbene şi netede;18,75% seminţe galbene şi zbârcite;18,75% seminţe verzi şi netede;6,25% seminţe verzi şi zbârcite.

Din această analiză, ajunge la concluzia că pentru fiecare pereche de caractere segregarea se produce independent, iar raportul fenotipic pentru ambele caractere este de 9:3:3:1. Caracterele s-au separat în timpul formării gameţilor şi s-au combinat în timpul fecundării în toate modurile posibile, formând cele patru grupe fenotipice.

Aceste rezultate i-au permis lui Mendel să emită legea independenţei caracterelor sau a liberei combinări a factorilor ereditari. După părerea lui, cei doi gameţi care participă la fecundare nu-şi contopesc caracterele în hibrid, ci ele stau alăturate unele de altele, pentru ca apoi să se despartă din nou în meioză, producând prin fecundare, generaţia a doua (F2).

Pe baza celor arătate la monohibridare se poate alcătui, în mod analog, un şah de combinaţii luând în considerare de data aceasta, două perechi de caractere care se pot nota după cum urmează:

A = neted B = galben a = zbârcit b = verde

Mecanismul şahului devine simplu dacă se are în vedere faptul că în gameţi numărul de cromozomi, respectiv de caractere alele, este pe

122

jumătate decât în celulele somatice.Pentru încrucişarea mazării cu seminţe netede şi galbene cu mazăre

cu seminţe zbârcite şi verzi, având în vedere că individul este rezultatul fecundării a doi gameţi, formula părinţilor va fi: AABB x aabb.

Gameţii părinţilor formaţi prin reducerea cromatică vor avea formula AB şi ab. Din combinarea lor se va naşte generaţia Fb cu formula AaBb.

Hibridul Fj formează patru tipuri de gameţi: AB, Ab, aB, ab, din combinarea cărora, rezultă generaţia F2. Gameţii se formează în număr egal atât pentru sexul femel, cât şi pentru sexul mascul. Din combinarea întâmplătoare a celor patru tipuri de gameţi apar 16 combinaţii genotipice, 9 genotipuri şi 4 fenotipuri (fig. 5.2.).

Fenotipurile apar în raportul de 9:3:3:1:9/16 indivizi - neted - galben (AABB, AABb, AaBb, AABb, AaBb,

AaBB, AaBb, AaaBb);3/16 indivizi - neted verde - (AAbb, Aabb, Aabb); 3/16 indivizi - zbârcit - galben (aaBB, aaBb, aaBb); 1/16 indivizi - zbârcit - verde (aabb). Din analiza celor 16 combinaţii de caractere rezultă că acestea

reprezintă 9 genotipuri care segregă în raportul: 1/16 AABB : 2/16 AABb : 2/16 AaBB : 4/16 AaBb : 1/16 AAbb : 2/16 Aabb : 1/16 aaBB : 2/16 aaBb : 1/16 aabb (sau 1:2:2:4:1:2:1:2:1).

Ceea ce îi atrage atenţia lui G. Mendel în mod deosebit în această experienţă este apariţia combinaţiilor noi de caractere AAbb si Aabb (seminţe netede şi verzi), precum şi aaBB şi aaBb (seminţe zbârcite şi galbene). Acesta este motivul care îl conduce la formularea celei de a doua legi, cu privire la independenţa caracterelor sau combinarea liberă a caracterelor.

Aceleaşi constatări se pot face analizând o trihibridare. Dacă se consideră că părinţii au genotipurile AABBCC şi aabbcc, hibridul din Fj cu genotipul AaBbCc va forma 8 tipuri de gameţi: ABC, ABc, AbC, Abc, aBC, aBc, abC, abc.

Grupând combinaţiile hibride în F2 se constată că cele 64 de combinaţii genotipice segregă în opt grupe fenotipice, după cum urmează:

27 posedă trei caractere dominante (A, B, C)9 posedă două caractere dominante şi unul recesiv (A, B, c)9 posedă două caractere dominante şi unul recesiv (A, b, C)9 posedă două caractere dominante şi unul recesiv (a, B, C)3 posedă un caracter dominant şi două recesive (A, b, c)3 posedă un caracter dominant şi două recesive (a, B, c)3 posedă un caracter dominant şi două recesive (a, b, C)1 posedă trei caractere recesive (a, b, c).

Rezultă deci opt fenotipuri, repartizate în raportul 27:9:9:9:3:3:3:1. Rezultatele obţinute în urma trihibridării de tip Pisum confirmă legea segregării independente a caracterelor.

123

F © * &AAHH' . JAlill

\ / rji'iiiivii Vj ©

V?N

№ AL 36 Jt.

AU © AAimO ©

A-HH

©AHRII

AL 0Mfib

•,'V'liL

Q•UI

GB QAnLIIJ

0AGRII

©ţţHB

0

ibGrr..iHli

©i'i.iliL

0II.IMII

*jjtib

Fig. 5.2. - Dihibridare între un soi de mazăre cu bobul galben-rotund şi unul cu bobul verde-zbârcit

5.3. PROBABILITATEA ŞI RAPORTURILE MENDELIENE DESEGREGARE

Pe baza legilor eredităţii descoperite de Gregor Mendel se pot indica rezultatele care se obţin într-o hibridare. Raporturile mendeliene de segregare depind de numărul perechilor de caractere. Astfel, la monohibridare, raportul fenotipic în F2 este de 3:1; la dihibridare de 9:3:3:1; la trihibridare de 27:9:9:9:3:3:3:1 ş.a.m.d. Începând cu generaţia F3, aceste raporturi se calculează ţinându-se seama de homozigoţia şi heterozigoţia indivizilor, heterozigoţii fiind singurii care segregă în descendenţă.

Dacă se analizează termenii care alcătuiesc raporturile de segregare se observă că ei se obţin prin ridicarea binomului 3:1 la puterea numărului perechilor de caractere: (3+1)1, (3+1)2, (3+1)3. Pentru n perechi de caractere, binomul se ridică la puterea n, (3+1)n

Rezultatele obţinute în diferite tipuri de hibridări pot fi anticipate, dacă se aplică o regulă simplă de calcul a probabilităţilor: şansa apariţiei concomitente a două fenomene este egală cu produsul probabilităţilor lor separate [P(A şi B) = P(A) x P(B)].

Dacă în mai multe monohibridări raporturile mendeliene sunt 3:1, 3/4 (A) x 3/4 (B), deci 9/16 (AB). Calculul poate fi realizat pentru orice combinaţie de caractere ce segregă independent.

În exemplele analizate s-a urmărit cum se comportă în hibridări un număr mic de factori alelomorfi. De exemplu, pentru o pereche de factori, numărul de combinaţii în F2, a fost de (21)2=4, pentru două perechi de factori de (22)2=16, pentru trei perechi de factori de (23)2=64, ş.a.m.d.

Este uşor de înţeles că în cazul în care se analizează un număr mare de perechi de caractere, numărul acestor combinaţii este enorm. De exemplu, pentru 10 perechi de factori, numărul combinaţiilor hibride se ridică la peste un milion. Cu atât mai complicată apare şi analiza genetică privind formarea şi gruparea combinaţiilor la un şir de generaţii.

Tabelul 5.2. dă posibilitatea de a calcula numărul combinaţiilor obţinute, în funcţie de numărul perechilor de factori pe care îi urmărim. De asemenea, permite a se deduce şi numărul tipurilor de gameţi şi a genotipurilor ce se vor obţine.

Numărul mare de forme pe care îl întâlnim la vieţuitoare asigură într-o mare măsură diversificarea speciilor şi procesul de evoluţie a acestora.

Tabelul 5.2.Segregarea la hibridările de tip Pisum în funcţie de numărul perechilor de alele

Numărulperechilor

decaractere

Numărul tipurilor de

gameţi produşi în

F1

Numărul combinaţiilor de gene în F2

Numărul genotipurilor

în F2

Numărul genotipurilor

homozigote în F2

Numărul grupelor fenotipice şi raporturi de

segregare în F2

1 21=2 41=4 31=3 21=2 3:12 22=4 42=16 32=9 22=4 9:3: 3:13 23=8

’-tIIm

33=27 23=8 27:9:9:9:3:3:3:14 24=16 44=256

00II''3- 24=16 (3+1)4

5 25=32 45=1024 35=243 25=32 (3+1)5

n 2n 4n 3n 2n (3+1)n

În cercetările pe care le-a efectuat Gregor Mendel cu privire la dihibridare s-au urmărit caracterele neted-zbârcit şi galben-verde, iar datele sunt prezentate în tabelul 5.3.

Diferenţele dintre valorile experimentale şi cele teoretice, deduse din calcul, pot fi mai mari sau mai mici. Pentru a stabili dacă ele nu depăşesc pragul segregării de tip mendelian, dacă segregarea are un caracter întâmplător sau este urmarea unei legi, se calculează testul X (chi pătrat).

124

125

Tabelul 5.3.Grupele fenotipice obţinute de Mendel într-o dihibridare faţă de grupele

fenotipice rezultate din calcul

ValoriNumărul de seminţe:

Netede-galbene

Netede-verzi

Zbârcite-galbene

Zbârcite-verzi

Total

Experimentale 315 10S 101 32 556Calculate teoretic 312,75 104,25 104,25 34,75 556Diferenţa (d) -2,75 -3,75 +3,75 +2,75 0

Testul x2 (chi pătrat) permite compararea distribuţiei teoretice a grupelor fenotipice cu rezultatele experimentale el se calculează după formula:

2 I d2 i X ="==—, in care: e

E este semnul însumării;d - diferenţa între valoarea teoretică şi valoarea experimentală a

fenomenului cercetat;e - valoarea teoretică.

Aplicând formula pentru datele din tabelul privind estimarea probabilităţilor în cazul diferitelor valori ale lui x2 şi diferite grade de liberate se obţine:

- 2,252 - 3,752 3,252 2,752

+312,75 104,25 104,25 34,75

Pe baza unor tabele speciale se poate aprecia dacă raporturile de segregare se abat semnificativ sau nesemnificativ de la tipul mendelian de segregare. In tabelul 5.4. după R. A. Fisher, sunt redate datele necesare extinderii probabilităţilor în funcţie de valorile lui X şi gradele de libertate.

Tabelul 5.4.Valorile de estimare a probabilităţii, după R. A. Fisher

GL Valorile P (în %)0,99 0,95 0,90 0,80 0,70 0,50 0,30 0,10 0,05 0,01

1 0,0002 0,0004 0,016 0,064 0,15 0,46 1,1 2,7 3,8 6,62 0,02 0,10 0,21 0,45 0,71 1,39 2,4 4,6 6,0 9,23 0,12 0,35 0,58 1,01 1,42 2,37 3,7 6,3 7,8 11,34 0,3 0,71 1,06 1,65 2,20 3,36 4,9 7,8 9,5 13,35 0,55 1,14 1,61 2,34 3,00 4,35 6,1 9,2 11,1 15,16 0,87 1,63 2,20 3,07 3,83 5,35 7,2 10,6 12,6 16,87 1,24 2,17 2,83 3,82 4,67 6,35 8,4 12,0 14,1 18,5S 1,65 2,73 3,49 4,59 5,53 7,4 9,5 13,4 15,5 20,19 2,09 3,32 4,17 5,38 6,39 8,35 10,6 14,7 16,9 21,7

10 2,56 3,94 4,87 6,18 7,27 9,34 11,8 16,0 18,3 23,2

+

126

127

Gradele de libertate (GL) se calculează scăzând 1 din numărul claselor (grupelor) fenotipice. In exemplul dat, gradele de libertate vor fi 4-1=3.

In tabelul 5.4. valoarea 0,47, pentru 3 grade de libertate este situată între valorile 0,35 şi 0,58. Aceasta corespunde unei probabilităţi P, de la 0,95% la 0,90%, adică la repetarea încrucişării, există şansa de 90-95% de a se obţine raportul de segregare 9:3:3:1. In statistică se consideră că probabilitatea este semnificativă când fenomenul se repetă la cel puţin 95% din cazuri, când există diferenţe mici între valorile experimentale şi cele teoretice. In exemplul folosit, valoare de 0,47 este destul de apropiată de valoarea 0,35 din dreptul lui P=0,95 pentru 3 grade de libertate.

5.4. MECANISMUL CITOLOGIC AL SEGREGĂRII CARACTERELOR

Gregor Mendel a cercetat comportarea caracterelor în descendenţa hibridă, considerând factorii ereditari drept unităţi materiale. In celulele somatice, ei se găsesc sub formă de perechi, în timp ce în celulele sexuale sub formă simplă. Segregarea caracterelor era condiţionată de segregarea factorilor, odată cu formarea celulelor sexuale, iar combinarea lor în diferite moduri se baza pe întâlnirea întâmplătoare a gameţilor în procesul de fecundare. Cercetătorii care urmează după Gregor Mendel caută să explice independenţa şi segregarea caracterelor făcând uz de cunoştinţele citologice.

Din momentul în care s-a descoperit că factorii ereditari sunt localizaţi în cromozomi, s-a înţeles că segregarea caracterelor este determinată de segregarea cromozomilor în meioză şi recombinarea lor în procesul de fecundare.

W. S. Sutton (1902) a stabilit că o specie conţine în fiecare cromozom câte un grup de factori ereditari şi că fiecare factor dintr-un grup se comportă independent faţă de factorii situaţi în celelalte grupe. Numărul grupelor de caractere corespunde cu numărul perechilor de cromozomi omologi.

Se ştie că celulele sexuale, înainte de a suferi reducerea cromozomală, au un număr de 2n cromozomi (fiecare cromozom cu omologul său). In urma diviziunii meiotice, cromozomii se despart şi se formează celule haploide (gameţii). In procesul de fecundare se reface numărul normal de cromozomi pereche, aşa fel încât în fiecare pereche se repartizează un cromozom de la mamă şi unul de la tată.

In cazul când mama şi tata prezintă acelaşi caracter, în aceşti cromozomi există factori identici (în doză dublă), iar individul este homozigot; în cazul în care părinţii prezintă caractere diferite, individul rezultat este heterozigot.

Când individul heterozigot va forma celule sexuale, acestea vor diferi între ele, căci într-un gamet va trece un cromozom, iar în celălalt, perechea lui, care diferă. In acest fel, gametul luând cu sine numai jumătate din cromozomii omologi, pierde caracterul hibrid pe care îl avea zigotul şi devine pur. Factorul ereditar, care stătea alături de omologul său, devine independent, iar într-o nouă fecundare se va întâlni fie cu unul identic, fie cu altul diferit, producând în cel deal doilea caz segregarea caracterelor.

În mod schematic, mecanismul cromozomic al disjuncţiei se poate vedea în figura 5.3.

În cele de mai sus s-a dat o explicaţie mecanismului segregării caracterelor mendeliene. În natură însă, nu întotdeauna asemenea procese se desfăşoară exact conform celor arătate, iar cercetătorii au obţinut date care nu se încadrează în raporturile stabilite de

128

Gregor Mendel.Explicaţia dată mai sus este valabilă în cazul în care caracterele cercetate sunt

produse de un singur locus (caractere monofactoriale), iar locii implicaţi sunt situaţi în cromozomi diferiţi.

Fig. 5.3. - Schema mecanismului cromozomic al disjuncţiei pentru o pereche de caractere

5.5. ÎNCRUCIŞAREA ANALIZATOARE

În experienţele pe care le-a executat Gregor Mendel la încrucişarea mazărei cu seminţe de culoare galbenă cu mazărea cu seminţe de culoare verde sau obţinut în F2, aşa cum s-a arătat, seminţe de culoare galbenă şi seminţe de culoare verde în raportul 3:1. Seminţele de culoare galbenă din Fj au produs, deci, în F2 plante cu seminţe atât de culoare galbenă, cât şi de culoare verde. Aceasta dovedeşte că ele aveau structură genetică heterozigotă. Pentru a analiza structura genetică a descendenţilor hibrizi cu fenotip dominant se foloseşte retroîncrucişarea sau backcrossarea cu părintele recesiv sau cu un tester recesiv, metodă care poartă numele de testcross. În fond, testcross-ul ajută la descoperirea tipurilor de gameţi formaţi de un individ dominant, precum şi dacă el este homozigot sau heterozigot pentru anumite caractere. Homozigoţii dominanţi produc o descendenţă cu fenotipul parental, în timp ce heterozigoţii dominanţi în descendenţa testcross segregă.

În figura 5.4. sunt prezentate schematic rezultatele obţinute în

129

urma aplicării testcross-ului în funcţie de genotipul individului dominant testat. In cazul retroîncrucişării indivizilor homozigoţi dominanţi (AA) cu părintele homozigot recesiv (aa) se obţine un singur tip de indivizi cu acelaşi genotip (Aa) şi cu acelaşi fenotip (culoare galbenă). Prin retroîncrucişarea indivizilor heterozigoţi (Aa) cu părintele homozigot recesiv (aa) rezultă două tipuri de indivizi în proporţii egale, 50% cu genotipul Aa de culoare galbenă şi 50% cu genotipul aa de culoare verde. Deci, la retroîncrucişare se pot obţine două tipuri de rezultate: 1) dacă raportul de segregare între cele două caractere este de 1:1, înseamnă că ascendentul dominant testat a fost heterozigot, deoarece a produs două tipuri de gameţi; 2) dacă toţi urmaşii sunt la fel, înseamnă că ascendentul dominant testat a fost homozigot, deoarece a format un singur tip de gameţi.

Fig. 5.4. Schema segregării în cazul testcross-ului unor descendenţi hibrizi cu fenotipdominant (AA sau aa)

Testcross-ul unui hibrid constă în încrucişarea descendenţilor dominanţi Fi cu un părinte dublu recesiv. Dacă hibridul F! este heterozigot, AaBb, va da naştere la patru tipuri de gameţi şi în consecinţă prin testare rezultă genotipurile AaBb, Aabb, aaBb, aabb, care segregă fenotipic în raport de 1:1:1:1.

Testcross-ul este folosit şi în lucrările de ameliorare, atunci când se urmăreşte relevarea alelelor recesive. Prin retroîncrucişări (backcrossuri) repetate se pot restabili în hibrid caracterele părintelui care a fost folosit la încrucişare.

tmiit-ipfLjpcrf fanDtl^C [ 1

130

Cu fiecare generaţie de retroîncrucişare se reduc heterozigoţii şi creşte numărul homozigoţilor pentru caracterele părintelui cu care s-a încrucişat.

**

Aşa cum a reieşit, mendelismul a constituit o importantă etapă în dezvoltarea geneticii. Cercetările ulterioare, la nivelul celular şi molecular, au confirmat deplina valabilitate a rezultatelor şi concluziilor lui Gregor Mendel. Legile eredităţii descoperite de el constituie fundamentul geneticii clasice, fără de care nu se pot înţelege cele mai noi probleme legate de studiul eredităţii din punct de vedere teoretic cât şi practic. Meritele deosebite pe care le are Mendel în fundamentarea geneticii ca ştiinţă îl situează, pe drept cuvânt, la rangul de fondator al geneticii.

*

CAPITOLUL 4

INTERACŢIUNEA GENELOR9

Moto:"Variabilitatea este o calitate inseparabilă de natura însăşi a viului, de structura programului, de modul în care acesta este recopiat la fiecare generaţie”

F. Jacob

Cercetările hibridologice efectuate după redescoperirea legilor mendeliene au relevat cazuri în care, între genele alele pot exista relaţii de dominanţă incompletă, diferite tipuri de interacţiuni dintre gene sau gene şi mediu ş.a. Toate acestea duc la obţinerea unor raporturi de segregare care se abat de la cele obţinute de G. Mendel.

6.1. ABATERI APARENTE DE LA RAPORTURILE MENDELIENE DE SEGREGARE

Abaterile aparente, au fost astfel numite, deoarece la prima vedere raporturile fenotipice obţinute în urma hibridării nu se încadrează în rezultatele obţinute de G. Mendel (3:1, 9:3:3:1 etc.). Analiza genotipurilor şi fenotipurilor, folosind tabelele de combinaţii, explică însă în mod mendelian formarea lor.

Abaterile aparente de la raporturile mendeliene de segregare se datorează atât interacţiunilor dintre genele alele (dominanţa incompletă, supradominanţa, codominanţa, genele letale şi polialelia), cât şi interacţiunilor dintre genele nealele (epistazia, poligenia, gene cu interacţiune reciprocă, gene modificatoare) sau a efectului complex al unei gene (pleiotropia).

6.1.1. Abateri aparente datorate interacţiunilor alelice

6.1.1.1. Dominanţa incompletăÎn cazul experienţelor lui G. Mendel, datorită fenomenului de dominanţă

completă (totală), heterozigoţii (Aa) prezentau acelaşi fenotip ca şi organismele homozigote (AA). În alte cazuri, însă, fenotipul organismelor heterozigote (Aa) se deosebeşte de cel al organismelor homozigote (AA).

Monohibridarea de tip Zea. C. Correns, în încrucişarea Mirabilis jalapa alba (cu flori albe) cu Mirabilis jalapa rosea (cu flori roşii) obţine în Fj plante cu flori de culoare intermediară, roz. încrucişând între ele, plantele din Fb obţine, în F2, 25% plante cu flori de culoare roşie, 25% plante cu flori de culoare albă şi 50% plante cu flori de culoare roz. în cazul de faţă raportul de dezbinare este de 1:2:1. Cultivând separat, fiecare categorie de indivizi din F2, obţine în F3,

130din cei 25% produşi cu flori albe numai generaţii cu flori albe, din cei 25% produşi cu flori roşii numai generaţii cu flori roşii, iar din cei 50% indivizi cu flori roz, o segregare identică cu cea din F2, în raport de 1:2:1 (fig. 6.1).

CAPITOLUL 4

Fig. 6.1. Schema monohibridării de tip Zea

Situaţii asemănătoare cu aceleaşi raporturi de segregare se întâlnesc şi la încrucişările care fac la Zea mays (plante cu boabe albastre x plante cu boabe galbene produc în F1 plante cu boabe violete), de unde şi numele de ereditatea de tipul Zea. La animale s-au obţinut rezultate analoge în experienţele cu fluturi de mătase. Încrucişându-se varietatea ce formează gogoşi albe, cu fluturi ce formează gogoşi galbene s-au obţinut fluturi ce formează gogoşi galben deschis şi care în F2 au produs o segregare a caracterelor de 1:2:1.

La găini, prin încrucişarea unor rase cu penajul negru, cu rase cu penajul alb, se obţin în F1 păsări cu penajul albastru (găini andaluze). În F2 se produce segregarea indivizilor în raport de 25% cu penajul negru, 25% cu penajul alb şi 50% cu penajul albastru.

Rezultatele se pot interpreta ţinând cont tot de principiile stabilite de G. Mendel. În acest caz notăm cu Ă caracterul culoare roşie şi cu a caracterul culoare albă a florilor de Mirabilis jalapa.

Indivizii cu flori de culoare roşie vor avea formula ĂĂ Indivizii cu flori de culoare roz vor avea formula Ăa Indivizii cu flori de culoare albă vor avea formula aa Se formează în F2 trei genotipuri corespunzătoare cu trei fenotipuri diferite, în proporţiile 1:2:1. Segregarea caracterelor se datorează separării factorilor Ă şi a în gameţi diferiţi.

În cazul monohibridării de tipul Zea, caracterul intermediar se explică prin relaţiile de dominanţă incompletă a unui caracter faţă de perechea lui de pe cromozomul omolog care îşi manifestă numai parţial dominanţa.

Indivizii din F1 formează gameţi Ă şi gameţi a. Din combinarea lor rezultă 25% indivizi homozigoţi cu flori de culoare roşie (ĂĂ), 50% heterozigoţi cu flori de culoare roz (Ăa) şi 25% heterozigoţi cu flori de culoare albă (aa). Aceste rezultate sunt prezentate în şahul de combinaţii de mai jos:

Gameţi Ş Gameţi 3

50% Ă 50% a

CAPITOLUL 4

50% Ă 25% ĂĂ 25% Ăa50% a 25% Ăa 25% aa

Polihibridarea cu dominanţă incompletă. Fenomenul de dominanţă incompletă se poate manifesta şi în cazul dihibridării, fie numai la una din perechile de caractere, fie la ambele.

Un exemplu de dominanţă incompletă, la o singură pereche de caractere, îl întâlnim la o experienţă a lui E. Baur. El a încrucişat Antirrhinum majus cu flori de culoare roşie şi zigomorfe (R R ZZ) cu altă varietate cu flori de culoare albă şi actinomorfe (rrzz). Obţine în F1, plante cu flori de culoare roz şi zigomorfe (RrZz). Deci culoarea roşie (R) este parţial dominantă faţă de culoarea albă (r), iar forma zigomorfă (Z) total dominantă faţă de forma actinomorfă (z).

În F2 se vor obţine următoarele posibilităţi de combinare, conform şahului din tabelul 6.1.

Din cele 16 combinaţii posibile apar:

3/16 plante cu flori de culoare roşie şi zigomorfe (R RZZ, R RZz, R RZz);

6/16 plante cu flori de culoare roz şi zigomorfe (R rZZ, R rZz, R rZz, R rZz

RrZz, RrZz);

1/16 plante cu flori de culoare roşie şi actinomorfe (R Rzz);

2/16 plante cu flori de culoare roz şi actinomorfe (R rzz, R rzz);3/16 plante cu flori de culoare albă şi zigomorfe (rrZZ, rrZz, rrZz);1/16 plante cu flori de culoare albă şi actinomorfe (rrzz);

Tabelul 6.1.Şah de combinaţii pentru două perechi de caractere dintre care una prezintă dominanţă

incompletă (R) şi alta (Z) completă

Gameţi 3

? RZ Rz rZ rz

RZ R R Z Z R R Z z RrZZ R rZz

Rz R RZz R R zz R rZz R rzz

rZ RrZZ R rZz rrZZ rrZz

rz R rZz R rzz rrZz rrzzSegregarea indivizilor în şase clase fenotipice este o abatere de la raportul de

9:3:3:1 care, în cazul de faţă, s-ar putea scrie (3+6):(1+2):3:1.Totalul de 16 ne arată că este vorba de dihibridare.

Pentru a explica dominanţa incompletă pentru ambele perechi de caractere vom

recurge la experienţa privind încrucişarea dintre Fragaria vesca cu fructe de culoare roşie

şi caliciu normal ( R R N N ) şi o varietate cu fructe de culoare albă şi caliciu foliar

(rrnn). În F1 se obţin plante cu fructe roz şi caliciu intermediar ( R r N n ) . Caracterele

parţiale dominante sunt culoarea roşie R şi caliciul normal N.În F2 se obţine o segregare conform şahului de combinaţie din tabelul 6.2. Aceste 16 combinaţii se pot separa în următoarele grupe de plante:

1/16 plante cu fruct roşu şi caliciu normal ( R R N N ) ;

CAPITOLUL 4

2/16 plante cu fruct roz şi caliciu normal ( R r N N , R r N N ) ;

2/16 plante cu fruct roşu şi caliciu intermediar (R R Nn, R R Nn);

4/16 plante cu fruct roz şi caliciu intermediar (R r N n , R r N n, R r N n, R r N n); 1/16

plante cu fruct roşu şi caliciu foliar (R R nn);

2/16 plante cu fruct roz şi caliciu foliar (R rnn, R rnn);

1/16 plante cu fruct alb şi caliciu normal (rrN N);

2/16 plante cu fruct alb şi caliciu intermediar (rrN n, rrN n);1/16 plante cu fruct alb şi caliciu foliar (rrnn);

Tabelul 6.2.Şah de combinaţii pentru două perechi de caractere, ambele prezentând

dominanţă incompletă

Gameţi

? R N Rn rN rn

R N R R N N R R N n R r N N R r N n

R n R R N n R R n n R r N n R r n n

r N R r N N R r N n r r N N r r N n

r n R r N n R r n n r r N n rrnn

În acest exemplu, cele 9 clase fenotipice constituie o abatere de la raportul 9:3:3:1 şi care s-ar putea scrie: (1+2+2+4):(1+2):(1+2):1. Totalul de 16 ne arată că este vorba de o dihibridare.

Dominanţa incompletă, ca de astfel şi dominanţa completă, se referă la relaţiile alelice ale factorilor şi ea produce abaterile de la segregarea mendeliană pe care le-am analizat.

6.1.1.2. SupradominanţaEste interacţiunea dintre două gene alele, în urma căreia indivizii heterozigoţi

(Aa) sunt superiori celor homozigoţi (AA, aa) în privinţa unor caractere ereditare, fenomen cunoscut sub numele de heterozis. Teoria supradominanţei a fost formulată de G. H. Shull şi E. M. East (1908). Ei consideră că cele două gene alele, A şi a, au funcţii oarecum diferite, iar în stare heterozigotă se completează una pe alta, ceea ce poate fi redat astfel:

AA<Aa>aa

Când starea de heterozigoţie este determinată de o singură pereche de gene (Aa) fenomenul se numeşte heterozigoţie monogenică, putând exista însă şi interacţiuni poligenice, când se numeşte heterozigoţie poligenică (Butnaru Gallia, 1985).’

Supradominanţa determină un raport de segregare de 1:2:1 în mod deosebit la unele caractere ale plantelor (numărul de ramificaţii ale tulpinii, greutatea inflorescenţelor, producţia de seminţe) şi animalelor (robusteţe, vigoare, viabilitate, talie).

6.1.1.3. Codominanţa9

Este interacţiunea dintre două gene alele, care însă, în stare heterozigotă,

CAPITOLUL 4

ambele sunt funcţionale, rezultând un fenotip nou. Această interacţiune poate fi considerată un tip particular de dominanţă incompletă în care genele A şi a, sintetizează proteine diferite ca structură şi funcţie, însă la indivizii heterozigoţi vor fi prezente ambele proteine.

Un exemplu clasic de codominanţă îl întâlnim în cazul determinismului genetic al grupelor sangvine la om şi la alte mamifere. Cele patru tipuri de grupe sangvine la om (O, A, B, AB) sunt determinate de trei gene polialele notate LA, LB şi 1. Genele LA şi LB

sunt dominante faţă de gena 1, însă când se găsesc în acelaşi genotip, ambele sunt funcţionale, rezultând un nou fenotip, respectiv grupa sangvină AB. Cunoscând aceste aspecte, putem reprezenta fenotipurile şi genotipurile posibile astfel:

Fenotipul (grupa sangvină)Genotipurile

A LALa, La1B LBLB,LB1

AB LALB

O 11

Modificarea raportului mendelian de segregare se poate observa dintr-un exemplu simplu: dacă într-o familie cei doi părinţi au grupele sangvine A şi respectiv B, homozigoţi, segregarea se realizează astfel:

P(2n) LALA x LBLB

4 4G(n) LA LB

Fi(2n) LALB (grupa AB)

F2(2n)

â?

LA LB

LA LALA LALB

LB LALB LBLB

În generaţia F2 au rezultat: 1/4 (gr. A) : 2/4 (gr. AB) : 1/4 (gr. B). Cunoaşterea modului de transmitere a grupelor sangvine la om, prezintă o importanţă deosebită în realizarea transfuziilor sangvine şi în stabilirea paternităţii.

Fenomenul de codominanţă este întâlnit şi la plante, în cazul pigmentării frunzelor şi florilor, în acumularea unor fracţii proteice (Crăciun T., 1981).

6.1.1.4. Genele letaleAlele letale sunt mutante dominante sau recesive care, în stare homozigotă,

provoacă moartea indivizilor. Fenomenul de letalitate schimbă proporţia în care are loc disjuncţia caracterelor în urma hibridărilor.

La încrucişarea unor şoareci de culoare galbenă, L. Cuenot a obţinut în F 1, pe lângă indivizi de culoare galbenă şi indivizi de culoare neagră. Raportul de segregare a fost de 2:1. Explicaţia dată, arată că, faţă de raportul genotipic 1:2:1, lipsesc 1/4 din genotipuri, respectiv fenotipuri, a căror zigoţi au murit în uterul femelelor înainte de naştere. Notând cu Ay gena mutantă letală şi cu a gena normală, rezultă că genotipul părinţilor şi ale combinaţiilor descendente este:

CAPITOLUL 4

P(2n) Aya x AyaG(n) Ay a Ay aF^2n) AYAY AYaAYa aa

Genotipurile aa (1/4) produc culoarea neagră şi indivizii sunt viabili, normali: genotipurile Aya (2/4) produc culoarea galbenă şi sunt heterozigoţi; genotipurile AyAy

(1/4) sunt letale. În cazul de faţă, genele letale exercită o acţiune de dominanţă parţială, manifestându-se numai în stare homozigotă.

Acţiunea letală a genelor de acest fel s-a mai constatat la descendenţii produşi prin încrucişarea crapului cu solzi cu crapul fără solzi (crapul galiţian); 1/4 din indivizii homozigoţi dominanţi nu sunt viabili, 2/4 sunt heterozigoţi, fără solzi şi viabili, iar 1/4 homozigoţi recesivi, cu solzi şi viabili.

O problemă de letalitate ce preocupă pe zootehnicieni se referă la oile brumării din rasele Karakul şi Ţurcană. Din împerecherea între ei a indivizilor din oile brumării, întotdeauna rezultă atât miei de culoare brumărie, cât şi miei de culoare neagră. Din mieii brumării o parte mor după naştere, la diferite vârste, până la un an. Cercetările au arătat că la aceştia apar tulburări ale aparatului digestiv. Este vorba de acţiunea unei alele mutante letale (S) care, în stare homozigotă, duce la producerea acestor fenomene; 2/4 din descendenţi sunt heterozigoţi (Ss), 1/4 homozigoţi recesivi (ss), iar 1/4 homozigoţi dominanţi (SS) care mor (Cîrlan M., 1996).

Alături de alelele mutante letale dominante pot exista şi alele mutante letale recesive care, de asemenea, provoacă moartea descendenţilor. Acestea se pun în evidenţă mai greu, deoarece nu au un efect vizibil în stare heterozigotă. Ele se pot evidenţia după naştere.

La plante se cunosc mutaţii letale recesive care, în stare homozigotă, împiedică formarea clorofilei, fără de care o plantă nu poate supravieţui. Seminţele acestor plante germinează şi dezvoltă o plantulă care trăieşte până în momentul când substanţele de rezervă din endosperm se epuizează.

Antirrhinum majus are unele varietăţi cu frunze de diferite culori. Formele aurea (cu frunzele verde-gălbui) nu pot exista decât în stare heterozigotă. Aceasta se explică prin faptul că tipul aurea prezintă defecte clorofiliene.

Letalitatea nu este totdeauna un fenomen absolut; el poate prezenta şi aspecte negative asupra organismului, dar nu mortale.

Caracterul letal poate depinde şi de condiţiile de viaţă ale indivizilor. Aceeaşi genă, care în condiţii nefavorabile de viaţă acţionează ca letală, în condiţii bune, poate acţiona ca semiletală. Între caracterul şi posibilitatea de a vieţui pot exista şi trepte intermediare.

Letalitatea sau semiletalitatea se manifestă la un anumit stadiu de dezvoltare a organismului, fie în funcţie numai de acţiunea alelei mutante letale, fie în funcţie de acţiunea ei, combinată cu influenţa condiţiilor de mediu.

Alelele letale apar datorită unor mutaţii şi determină defecte de structura morfofiziologică a organismelor. Din această cauză, modificările îmbracă forme variate, variate fiind şi cauzele care pot provoca moartea organismelor: defecte în structura anatomică, incapacitatea de a sintetiza sau folosi substanţele energetice în procesul de metabolism, lipsa sau slaba dezvoltare a unor structuri celulare cu importanţă vitală ş.a.

6.1.1.5. Polialelia (Alele multiple)Fenomenul de polialelie apare în cazul când trei sau mai multe gene alele sunt

CAPITOLUL 4

plasate în acelaşi locus pe cromozom, la indivizi diferiţi şi determină variaţii ale aceluiaşi caracter. Acest fenomen se numeşte şi alelomorfism multiplu sau alelism.

Genele alele apar prin mutaţie din alela originară sau “tipul sălbatic”, cu care ocupă acelaşi locus. Alela de “tip sălbatic” se consideră dominantă şi se notează cu A sau cu a+. În funcţie de această notare, seria de alele care apare prin mutaţie se notează cu aceleaşi litere, la care se adaugă un indice de ordine numerică sau alfabetică, A1,A2,A3, respectiv a1, a2, a3. Genele alele pot fi notate cu prima literă a caracterului pe care îl determină şi cu indicele de ordine în care au apărut. S-a constatat că într-o serie de alele raportul dominanţă/recesivitate este determinat de ordinea apariţiei lor.

Seria de alele pentru culoarea ochilor la Drosophila melanogaster a fost pusă în evidenţă de T. Morgan şi colaboratorii săi. Drosofila de tip sălbatic are ochi de culoare roşie determinată de alela normală w+. S-a constatat însă că descendenţii homozigoţi au ochi de culoare foarte diferită, cu o intensitate care variază între roşu şi alb. La formele heterozigote, gama culorilor se multiplică prin nuanţe intermediare care apar între culorile formelor parentale. S-a ajuns astfel la concluzia că genei de tip normal w+, îi corespund mai multe gene alele care determină culoarea diferită a ochilor. Aceste alele constituie o serie. Fiecare se notează cu simbolul genei de origine, la care se adaugă ca indice prima sau primele litere ale caracterului pe care îl determină: w+ roşu închis (tipul sălbatic); ww-roşu intens; wsat-rubiniu închis; wco-rubiniu intens; wbl-galben rubiniu; we-roz- gălbui; wch-roz puţin gălbui; wcol-purpuriu; wa-roz apricot; wh-galben de miere; wbf-galben diluat; wt-roz foarte deschis; wp-alb perlat; wi-alb ivoriu; wec-alb ocru; w-alb.

Prin încrucişarea indivizilor purtători ai acestor gene, s-a stabilit că gena dominantă este cea de tip sălbatic (w+), care determină culoarea roşie, iar gena recesivă este cea care determină culoarea albă (w).

Seria alelelor R la porumb. Această serie de alele a fost pusă în evidenţă de L. J. Stadler (1951) observând că o serie de alele plasate în locusul R de pe cromozomul 10 determină culoarea roşie-purpurie (antocianică) a diferitelor părţi ale plantei.

Efectul fenotipic al genelor din seria polialelă se manifestă diferit, în diverse organe ale plantei: pericarpul şi aleurona seminţei, tulpină, frunze şi antere. Pentru acest considerent efectul seriei de alele de pe locusul R determină dominanţa în mozaic sau mozaicismul.

In locusul R a fost pusă în evidenţă o serie de peste 20 alele. Cele mai cunoscute sunt acelea care au o putere mai mare de manifestare şi concomitentă în mai multe organe ale plantei (tabelul 6.3.).

Tabelul 6.3.Seria de alele de pe locusul R la porumb şi efectele fenotipice

Alela Expresia fenotipică în:sămânţă plantule antere

Rr Culoare roşie închisă, când este în 2 sau 3 doze şi mozaicat închisă, când este într-o doză

roşii verzi

Rg Culoarea roşie închisă, când este în 2 sau 3 doze şi mozaicat într-o doză

verzi verzi

Rst Pestriţă (stippled) verzi verziRmb Marmorată (marbled) verzi verziRsc Autocolor (self-colored) verzi verzirr Necolorată roşii roşiirg Necolorată verzi verzi

Din datele cuprinse în tabelul de mai sus, reiese că, alela rg este recesivă şi

CAPITOLUL 4

controlează culoarea verde a plantelor şi anterelor şi celelalte alele determină un grad diferit de pigmentaţie.

Intensitatea cu care este determinată culoarea seminţei depinde de doza în care se află genele Rr sau Rg în endosperm. Endospermul, fiind triploid, poate avea trei doze diferite ale alelei Rr care-i determină culoarea şi anume: doză triplă (RrRrRr), când se încrucişează între ele două linii pure pentru factorul R r, linia Rr ca mamă şi linia Rr ca tată; doza dublă (RrRrr),când se încrucişează o linie Rr ca mamă şi una r ca tată şi doză simplă (Rrrr), când se încrucişează o linie r ca mamă şi una R r ca tată. Dominanţa va fi gradată, în funcţie de numărul de alele care participă la determinarea caracterului.

Comportarea diferită a aceleiaşi alele în diferite organe ale plantelor i-a determinat pe L. J. Stadler şi M. H. Emerling (1956) să le considere ca fiind compuse din două părţi cu funcţii particulare. De exemplu, alela Rg este dominantă în bob, unde determină formarea antocianului, dar este recesivă în plantă şi antere, deoarece acestea rămân verzi. De fapt, aceasta este explicaţia apariţiei mozaicului la plante.

6.1.2. Abateri aparente datorate interacţiunilor nealelice

6.1.2.1. EpistaziaS-a arătat că dominanţa poate să se manifeste între alele perechi: A domină pe

a, B domină pe b etc. Un tip aparte de relaţii de dominanţă-recesivitate poate exista şi între gene nealele: AA domină pe Bb, bb domină pe A, aa domină pe B etc. Acest fenomen a fost numit epistazie. Genele care inhibă acţiunea unor gene nealele se numesc gene epistatice, iar genele inhibate se numesc gene hipostatice. Pot fi epistatice sau hipostatice atât alelele dominante, cât şi alelele recesive. În funcţie de alela epistatică, epistazia poate fi dominantă, de recesivitate, de dominanţă şi recesivitate etc.

Prin epistazia de dominanţă atât gena epistatică cât şi gena hipostatică sunt reprezentate de gene nealele dominante. Se cunosc asemenea exemple atât din domeniul vegetal cât şi din cel animal.

Raportul de segregare în cazul epistaziei de dominanţă este 12:3:1. Un exemplu îl oferă încrucişarea între ovăzul cu glume negre şi ovăzul cu glume albe. În F1 se obţin indivizi care au glume negre, iar în F2 are loc segregarea astfel: 12/16 indivizi cu glume negre; 3/16 indivizi cu glume cenuşii; 1/16 indivizi cu glume albe.

Acest raport nu este tipic mendelian, dar amintindu-ne de raportul mendelian 9:3:3:1 se poate deduce că grupa de 12 se compune din 9+3. Deducem, de asemenea, că ovăzul cu glume negre conţine două gene dominante, ovăzul cenuşiu o singură genă dominantă, iar cel alb nici una, fiind recesiv.

Notând cu N gena producătoare a culorii negre (epistatică), cu C gena producătoare a culorii cenuşii (hipostatică), cu n şi c alelele lor, producătoare a culorii albe, se pot scrie genotipurile părinţilor, gameţilor şi ale hibridului din Fp

P(2n).................NNCC x nnccGameţi(n)............NC nc

F1(2n)........................NnCcGameţi(n).........NC Nc nC nc

Din şahul de combinaţii rezultă: combinaţiile care conţin pe N vor da boabe negre, cele ce conţin C cu n vor da boabe cenuşii, iar cele care conţin nncc produc boabe albe. Deci raportul va fi:

CAPITOLUL 4

(9 + 3): 3 :1 12 negre: 3 cenusii: 1 alb

Gena N are deci o acţiune epistatică asupra genei C.Epistazia de dominanţă şi recesivitate. Se manifestă la încrucişarea între rasele

de găini albe, Leghorn x Wyandotte. În F1 se obţin găini albe (cu unele pete negre), iar în F2 un raport de 13/16 indivizi albi: 3/16 indivizi negri.

Totalul de 16 combinaţii indică acţiunea a două perechi de gene. Din analiza generaţiei F2 s-a dedus că la rasa Leghorn, în genotip, alături de gena dominantă ce determină culoarea, mai există o genă epistatică care inhibă manifestarea acesteia. Rasa Wyandotte posedă alela recesivă c, care, la rândul ei este epistatică asupra genei I ce produce culoarea. Culoarea neagră apare numai în prezenţa genei dominante ce produce culoarea şi a genei recesive ii.

Notând cu I gena epistatică şi cu C gena hipostatică, rezultă:Leghorn x Wayndotte

P....................................IICC iiccF1 IiCc (alb)F2...........12/16 indivizi de culoare albă determinată de gena epistatică I

3/16 indivizi de culoare neagră

Aceste rezultate sunt prezentate în figura 6.2.Gena epistatică I inhibă acţiunea genei hipostatice C care determină culoarea,

iar gena cc inhibă acţiunea genei ii care produce culoarea.Prin epistazia genei recesive se înţelege acţiunea unei gene recesive în stare

homozigotă ce inhibă acţiunea genelor dominante sau recesive din alte perechi de alele; de exemplu, aa inhibă pe B sau aa inhibă pe bb.

Fenomenul se poate evidenţia la încrucişarea unor şoareci albi cu şoareci negri. Tipul albinotic este genetic de tip sălbatic, deoarece posedă gena A, care însă nu se manifestă din cauza prezenţei genei epistatice recesive cc care inhibă formarea oricărui pigment:

P(2n) şoareci albi şoareci negriAAcc x aaCC F1şoareci agouti (AaCc) (cu blana

de tip sălbatic)F2 9/16 indiviziagouti (AC);

3/16 indivizi negri (Caa);4/16 indivizi albi (Acc şi aacc).

143

Deci, în acest caz, epistazia s-a manifestat din partea genei cc asupra genei A. Şoarecii cu genotipul Acc erau albi, deoarece gena c în stare homozigotă a împiedicat manifestarea genei A, ce produce pigment.

Fig. 6.2. Epistazia genei dominante şi a genei recesive asupra culorii penajului.

6.1.2.2.

Interacţiunea complementară a genelor (Epistazia recesivă reciprocă)

Constă în acţiunea unor gene nealele, care, în stare homozigotă sau heterozigotă dominantă, conlucrează pentru apariţia unui caracter nou. Dacă una din aceste gene dominante lipseşte din genotip caracterul nu se exteriorizează fenotipic.

Acest tip de interacţiune a fost descoperit prima dată la Lathyrus odoratus, plantă care are, în general, flori de culoare roşie, dar şi varietăţi cu flori albe. Încrucişându-se două varietăţi cu flori de culoare albă, s-au obţinut în F1 plante cu flori de culoare roşie, prin autopolenizarea cărora în F2 au rezultat plante ce au segregat în raportul 9:7 (9/16 plante cu flori roşii :7/16 plante cu flori albe).

144

Raportul de segregare arată că, este vorba de o dihibridare. Explicaţia nu poate fi decât următoarea: culoarea roşie este condiţionată de prezenţa a două gene dominante A şi B. Dacă există numai o genă din acestea, nu se produce culoarea roşie în F1. Părinţii vor trebui să aibă genotipurile: AAbb şi aaBB, iar hibrizii din Fi sunt AaBb. În a doua generaţie se produce segregarea genelor nealele, în raport de 9/16 AB; 3/16 Abb; 3/16 aaB; 1/16 aabb. Culoarea se manifestă numai în genotipul AB, care determină elaborarea pigmenţilor antocianici. Restul indivizilor (7/16), care nu conţin aceste două gene dominante sau conţin numai una din ele, au florile de culoare albă.

Din acest exemplu se poate constata că genele aa inhibă acţiunea genelor BB, iar genele bb, pe cea a genelor AA. Genotipurile aa şi bb “se ajută” reciproc pentru realizarea fenotipului comun, corespunzător genotipului aabb. Acest tip de interacţiune se mai numeşte epistazie recesivă reciprocă.

Un raport de segregare diferit faţă de cel mendelian rezultă şi în cazul încrucişării unor forme de porumb cu boabe de culoare albă. În F1 se obţin plante cu boabe de culoare roşie, iar în F2 un raport de segregare de 27/64 plante cu boabe roşii; 37/64 plante cu boabe necolorate.

În cazul de faţă, producerea antocianului se datorează interacţiunii dintre alelele dominante a trei perechi de gene nealele AACCRR. Boabele necolorate aparţin plantelor din al căror genotip lipseşte cel puţin una din aceste gene dominante (aaCCRR, AaccRR şi AACCrr). De exemplu, din încrucişarea plantelor cu boabe necolorate cu genotipul aaCCRR, cu plante tot cu boabe necolorate AAccRR, vor rezulta plante cu boabele colorate, care conţin genele AaCcRR. În F2, aceste două caractere segregă în raportul de 27 colorate : 37 necolorate. Rezultate identice se obţin când se încrucişează plante cu genotipul AAccRR sau plante cu genotipul aaCCRR sau plante cu genotipul aaccRR cu plante cu genotipul AACCrr.

Acţiunea acestor gene a fost sesizată şi în ereditatea culorilor la şoareci, la găini ş.a.

La găini, creasta de tip mazăre, ca şi creasta de tip trandafir, manifestă dominanţa faţă de cresta simplă, prezentă la rasa Leghorn. La încrucişarea rasei Wyandotte cu creasta tip trandafir (RRbb) cu rasa Brahma cu creasta tip mazăre (rrBB), în F1 indivizii aveau un nou tip de creastă, nuciformă, rezultată din interacţiunea complementară între cele două gene dominante (RrBb). Încrucişarea indivizilor din F1 a determinat formarea generaţiei F2, în care 9/16 dintre indivizi aveau creastă nuciformă, iar 7/16 alte tipuri de creastă (3/16, trandafir Rbb; 3/16 tip mazăre rrB şi 1/16simplă rrbb) (figura 6.3.).

De aici se vede că în prezenţa genelor dominante în sistemele de gene complementare, acestea funcţionează producând un caracter deosebit de cel manifestat la părinţi. În exemplele de mai sus (culoarea roşie a florilor la Lathyrus odoratus, culoarea boabelor la Zea mays, cât şi forma crestei de găini), caracterul nou este produs numai prin acţiunea comună a tuturor genelor dominante din genotip. Aceste gene nealele, în mod separat, nu pot determina apariţia caracterului respectiv.

n Crnfib nudfuinii

află

\H£l Ah iB rb ,

H $ 481 $

Rli

M

rtJ m A A

$ A H

Fig. 6.3. Acţiunea complementară a genelor în cazul încrucişării raselor de găini Wyandotte cu Brahma

Acţiunea complementară a genelor a fost pusă în evidenţă şi prin experienţe efectuate cu amestecuri de extracte de la microorganisme diferite. S-a constatat că folosirea separată a acestor extracte nu produce o activitate enzimatică, însă utilizarea lor în comun manifestă activitate enzimatică.

6.I.2.3. Poligeniaîncă din secolul XVIII, J. Kolreuter a remarcat că prin încrucişarea a două

varietăţi de tutun, una pitică iar cealaltă înaltă, în generaţia Fi, hibrizii au o talie intermediară între genitori, iar în F2 are loc o segregare a indivizilor, cu o graduare continuă a înălţimii, de la tipul pitic până la tipul înalt.

Cercetările lui H. Nilsson-Ehle în Suedia, la grâu, şi ale lui E. M. East în S.U.A., la porumb, în perioada 1910-1913, au dus la descoperirea fenomenului de poligenie, care explică modul de segregare a caracterelor cantitative.

Poligenia (polimerie sau interacţiune aditivă) constă în conlucrarea mai multor gene nealele, dar echivalente, dominante sau recesive, pentru exteriorizarea fenotipică a unui caracter.

142

146

În general, se consideră că în cazul fenomenului de poligenie, genele individuale au un efect redus asupra unui caracter şi ca atare, pot fi greu evidenţiate. Numai efectul cumulativ sau aditiv al poligenelor produce modificări cantitative evidente. Fenotipul unui caracter cantitativ, determinat de gene aditive, se manifestă cu atât mai puternic, cu cât este determinat de mai multe gene nealele dominante. Când în genotipul unui individ, pentru un anumit caracter cantitativ, vor fi mai multe gene recesive, fenotipul va fi mai puţin expresiv.

H. Nilsson-Ehle a demonstrat existenţa fenomenului de poligenie, încrucişând o varietate de grâu cu boabe roşii (AABB), cu alta cu boabe albe (aabb). În generaţia F 1 au rezultat indivizi cu boabe de culoare intermediară (AaBb). În generaţia F2 segregarea s-a produs în raportul 15/16 boabe de diferite nuanţe de roşu la 1/16 boabe albe. Prin urmare culoarea boabelor de grâu este determinată de două perechi de gene nealele. Cu cât în genotip se vor găsi mai multe alele dominante, cu atât expresia fenotipică va fi mai puternică.

Un exemplu de efect cumulativ al genelor în moştenirea caracterelor cantitative îl constituie ereditatea culorii pielii la om, determinată de pigmentul melanină, care variază cantitativ la diferite rase (C. B. Davenport, după Raicu P., 1980). Cantitatea de pigment din piele este determinată de efectul cumulativ al genelor Pi şi P 2, care la negri se află în stare homozigotă (P^P^), la mulatri închişi există trei gene pentru pigmentare (P1p1P2P2, sau P1P1P2p2), la mulatri propriu-zişi există două gene (P1p1P2p2, P1P1p2p2 sau p1p1P2P2), la mulatri deschişi o singură genă pentru pigmentare (P1p1p2p2 sau p1p1P2p2), iar la rasa albă există un genotip homozigot recesiv (p1p1p2p2).

Exemple de ereditate poligenică există la tot pasul, deoarece majoritatea caracterelor cantitative au acest determinism genetic.

6.1.2.4. PleiotropiaAnaliza modalităţilor de acţiune a genelor a scos în evidenţă şi fenomenul prin

care una şi aceeaşi genă poate să contribuie la formarea mai multor caractere. Aceste gene au fost denumite pleiotrope, iar fenomenul determinat de ele, pleiotropism.

În cercetările pe care le-a executat G. Mendel la mazăre, a observat că acelaşi factor ereditar a afectat atât culoarea florilor cât şi culoarea seminţelor şi a produs pete roşii pe nervurile frunzelor.

H. Nilsson-Ehle (1909) a dedus că, modificarea formei aristelor, pilozitatea tulpinilor şi fragilitatea acestora, sunt datorate unei singure gene.

Cercetări numeroase în această privinţă au fost efectuate la Drosophila. Alela mutantă “vestigial”, (vg), care reduce mărimea aripilor, micşorează în acelaşi timp fecunditatea, reduce numărul de ouă, modifică poziţia perişorilor de pe corp ş.a.

Alela mutantă “ivory”, care răspunde de culoarea deschisă a ochilor, are acţiune negativă asupra tuburilor lui Malpighi şi modifică forma spermateciilor.

Genele pleiotrope determină, în mare parte, corelaţiile dintre diferite caractere şi menţin aceste corelaţii de-a lungul generaţiilor. Astfel de corelaţii, determinate de gene pleiotrope, poartă numele de corelaţii genotipice. În afară de efectul lor, uşor de evidenţiat, acţiunea lor este multiplă şi de o mare însemnătate, deoarece majoritatea genelor manifestă, într-o măsură mai mare sau mai mică, influenţă asupra altor gene.

147

6.1.2.5. Acţiunea modificatoare a genelorExistă gene cu acţiune de bază în determinarea unui anumit caracter, altele,

interacţionează cu alte gene, influenţând acţiunea acestora. Asemenea gene au primit numele de gene modificatoare. Atunci când o genă slăbeşte expresia fenotipică a altei gene nealele se numeşte reducătoare, iar când întăreşte expresia fenotipică a altei gene nealele se numeşte amplificatoare.

Acţiunea acestor gene poate fi evidenţă, uneori, destul de discretă; de aceea şi studiu lor este anevoios. Dificultăţi se manifestă şi la distribuirea indivizilor în clase fenotipice distincte. Ori de câte ori acţionează, ele modifică proporţiile mendeliene de segregare. Astfel, există o genă la Drosophila (“tetraptera”) care poate să transforme balansierele în aripi de dimensiuni mari. O altă genă, tot la Drosophila, numită “erupt”, determină dezvoltarea unui tars în ochi.

6.1.2.6. Influenţa factorilor externi asupra acţiunii genelorManifestarea acţiunii genelor poate fi influenţată şi de condiţiile de mediu, care

modifică proporţiile fenotipice faţă de cele teoretice. Influenţele pot produce modificări foarte variate, atât de ordin cantitativ, cât şi calitativ.

Larvele de Drosophila cu aripi vestigiale, crescute la temperaturi ridicate, produc aripi aproape normale. Temperatura ridicată, nu influenţează genele respective decât la o anumită vârstă a larvelor, care coincide cu perioada sensibilă pentru dezvoltarea aripilor.

La porumb, există gene mutante, care determină caracterul plantă pitică. Dacă unei astfel de plante i se administrează acid giberelinic, planta se dezvoltă asemănător cu cea normală.

La iepurele de Himalaia culoarea neagră a extremităţilor este realizată de alela ch Acest tip de iepure crescut la temperaturi de peste 30°C este complet alb; crescut la temperaturi în jurul a 25°C capătă culoarea neagră la extremitatea botului, picioarelor şi urechilor. Dacă se smulge o porţiune din părul alb şi iepurele este crescut la temperaturi sub 25°C, pe acest loc va apărea păr negru. Culoarea părului în cazul acestor experienţe depinde de anumite reacţii biochimice care duc la elaborarea pigmentului. Temperatura interferă cu acţiunea genei, care, la rândul ei, dirijează elaborarea acestor pigmenţi.

La plante există, de asemenea, gene a căror acţiune asupra culorii florilor poate fi modificată de anumite temperaturi. Astfel, Primula, crescută la temperatura de 30-35°C şi umiditate mare produce flori albe, iar la temperaturi mai scăzute produce flori roşii.

Intervenţia factorilor de mediu poate schimba raporturile de dominanţă dintre diferite gene, când acestea se găsesc în stare heterozigotă. La tipul sălbatic de Drosophila există o genă dominantă ce determină prezenţa unor benzi negre la limita dintre segmentele abdomenului. Dacă este crescută într-un mediu umed, benzile negre dispar.

Un tip de interacţiune dintre gene şi factorii de mediu îl constituie fenocopiile. Individul normal, în timpul dezvoltării lui, supus unui tratament special cu factori fizici sau chimici, dă naştere la unele anomalii specifice acţiunii unor gene. Injectând insulină, în ouă de găină în stare de incubaţie, se obţin indivizi cu monstruozităţi (polidactilism sau absenţa crupionului). Aceste anomalii pot fi produse şi de acţiunea genotipului în condiţii normale de dezvoltare a indivizilor.

Există gene cu manifestare foarte variabilă la influenţa condiţiilor de mediu, dar

148

care afectează numai o parte din indivizi, aparent cu acelaşi genotip. Aşa este cazul genelor “erupt” sau “tetraptera”, care determină un efect fenotipic numai la maximum 10% din indivizi. La cobai, o genă recesivă determină până la 27,7% monştri cu cap mic, neviabili. Fenomenul poartă numele de penetranţă.

Uneori gena afectează numai o parte din organism. Gena “eyeless” care reduce suprafaţa ochiului la Drosophila, poate afecta numai un ochi la aceeaşi musculiţă. Aceste accidente rămân încă, în mare parte, inexplicabile; alteori, influenţa mediului se poate resimţi în mod diferit, în ceea ce priveşte intensitatea de manifestare a caracterului. În cazul de faţă, fenomenul poartă numele deexpresivitate.

Varietatea factorilor de mediu, intensitatea cu care acţionează ei şi timpul când intervin în cursul dezvoltării organismului, constituie o gamă foarte complexă de influenţe asupra acţiunii genelor. De la efectul primar al genei şi până la efectul ei aparent există un lanţ întreg de acţiuni şi interacţiuni între gene şi între gene şi mediu.

6.2. ABATERI REALE DE LA RAPORTURILE MENDELIENE DE SEGREGARE

Principalele cauze ce determină abaterile reale de la raporturile mendeliene de segregare sunt: segregarea preferenţială a cromozomilor în meioză, non-disjuncţia cromozomilor în meioză şi formarea nerandomizată a zigoţilor.

1. Segregarea preferenţială a cromozomilor sau genelor în meiozăDe obicei, în diviziunea meiotică, cromozomii omologi se distribuie în mod

întâmplător în celulele-fiice, în raport de 1:1.Uneori, însă, în ovogeneză sau macrosporogeneză, un cromozom sau un

segment de cromozom trece cu preferinţă în ovul sau, respectiv, în oosferă, în timp ce omologul lui trece în nucleii polari sau în nucleii din sacul embrionar. Aceşti cromozomi nu participă la formarea zigoţilor.

Un caz de segregare preferenţială a fost studiat la porumb, de către diferiţi autori: M. M. Rhoades (1942, 1952), A. E. Longley (1945), G. Y. Kikudome (1959), M. M. Rhoades şi M. H. Emerling (1959). S-a constatat că la mai multe soiuri de porumb din America de Sud şi sud-estul Statelor Unite, cromozomul 10 se deosebeşte de omologul său din alte soiuri printr-o porţiune terminală în plus, heterocromatică, în care se găseşte un knob. Segregarea cromozomilor în meioză are loc în funcţie de felul cromozomilor 10. Când aceştia

sunt normali |, segregarea are loc în raport de 1:1. Când unul dinl10n )

cromozomii 10 este normal, iar omologul său posedă knob în10a V /

megasporogeneză are loc o segregare preferenţială, în favoarea cromozomului cu knob (aproximativ 70% gameţi cu 10 a şi 30% gameţi cu 10 n).

Acest fenomen a fost pus în evidenţă urmărindu-se cum se transmite la descendenţi gena R, care dictează formarea pigmentului antocianic la seminţe şi la plante. S-a încrucişat o linie de porumb cu cromozomii 10 a cu knob şi purtători al alelelor

149

recesive rr, cu o linie de porumb cu cromozomii 10 n, dar purtători ai alelelor dominante RR. în F1 s-au obţinut plante cu boabe de culoare roşie, cu genotipul Rr. Prin retroîncrucişarea hibridului cu părintele cu caracterul recesiv (rr) s-au obţinut 70,2% indivizi cu boabe necolorate şi 29,8% indivizi cu boabe roşii. în mod normal ar fi trebuit să se obţină indivizi cu boabe necolorate şi boabe de culoare roşie în proporţie de 1:1. Din cauza segregării preferenţiale a cromozomilor cu knob, procentul a fost modificat în favoarea acestuia.

Fenomenul de segregare preferenţială a cromozomilor în meioză a fost pus în evidenţă şi la Drosophila melanogaster. S-a observat că la unele femele, cromozomii X sau cromozomii perechi a Il-a şi a IlI-a nu sunt egali ca mărime. S-a constatat o segregare preferenţială a cromozomilor mai scurţi, în sensul că din ovule circa 70% dau naştere la indivizii care posedă cromozomi mai scurţi (normali).

2. Nesepararea (non-disjuncţia) cromozomilor în meiozăDe obicei, în meioză toate perechile de cromozomi se despart şi se repartizează

în celule haploide care se formează. Uneori, prin nesepararea unor perechi de cromozomi în meioză, la prima diviziune se formează o celulă cu un cromozom în plus şi o celulă cu un cromozom în minus. Celulele sexuale care se formează din acestea vor produce, în procesul fecundării, zigoţi cu 2n + 1 şi 2n - 1 cromozomi.

La Drosophila melanogaster non-disjuncţia afectează mai mult perechile cromozomilor sexului sau perechi a IV-a (punctiformi).

Aceste anomalii se întâlnesc mai frecvent la organismele triploide şi mai puţin la organismele diploide.

3. Formarea nerandomizată a zigoţilorDe regulă, în procesul fecundării, gameţii se întâlnesc între ei în mod

întâmplător, adică randomizat. Uneori, gameţii nu se întâlnesc la întâmplare, ci după anumite preferinţe (nerandomizat). Acest fenomen este favorizat de viabilitatea inegală a celulelor sexuale mascule şi de capacitatea de formare şi de maturizare inegală a stigmatului.

La porumb există gene care controlează creşterea tubului polinic în stil. Polenul care conţine alela dominantă a genei S dezvoltă tubul polinic mai repede şi formează un număr mare de zigoţi cu această genă.

TEORIA CROMOZOMICĂ A EREDITĂŢII9

Moto:"Biologia seamănă mai mult cu istoria decât cu fizica; accidentele, erorile şi întâmplările fericite din trecut prefigurează în mare măsură prezentul”

Carl Sagan

7.1. GENE ŞI CROMOZOMI

Elaborarea teoriei celulare de către M. J. Schleiden şi T. Schwann (1838) a

150

marcat începutul unor noi descoperiri la nivel celular. După descoperirea şi descrierea mecanismului mitozei (W. Fleming, 1882) şi a meiozei (E. van Beneden, 1883), W. Waldeyer (1888), descoperă că în momentul diviziunii nucleului, acesta se împarte într-un anumit număr de corpusculi pe care i-a numit cromozomi.

Cercetările efectuate de W. S. Sutton (1902) la cosaş (Brachystola magna), aduc dovada localizării factorilor ereditari mendelieni pe cromozomi, constatând că fiecare cromozom are o anumită caracteristică, care se păstrează constantă în timpul mitozei şi meiozei. Sutton a fost primul citolog care a atras atenţia asupra asemănării dintre disjuncţia cromozomilor în meioză şi segregarea caracterelor alelomorfe în procesul de formare a gameţilor.

In 1902, T. Boveri face aceleaşi constatări la ariciul de mare (Paracentrotus lividus). El studiază şi evoluţia ovulelor fecundate concomitent de 2 spermatozoizi din care rezultă gameţi triploizi (2n=54), constatând că numai indivizii diploizi (2n=36) sunt normali. Boveri ajunge la concluzia că dezvoltarea normală a indivizilor este condiţionată de prezenţa unor garnituri complete de cromozomi, pe care se află localizaţi factorii ereditari.

Un alt fenomen descoperit de W. S. Sutton în anul 1903 a fost recombinarea cromozomilor materni şi paterni în timpul meiozei, fenomen care dă posibilitatea formării unui număr enorm de combinaţii genotipice şi determină o mare variabilitate genotipică a indivizilor aceleiaşi specii.

Descoperirile referitoare la mecanismul cromozomic al determinării sexului au constituit noi dovezi a localizării factorilor ereditari intuiţi de Mendel.

H. Henking (1891) a identificat la insecta Pirrochoris apterus două tipuri de gameţi, unii care posedau un corpuscul necunoscut ce l-a notat cu X, iar alţii lipsiţi de acest corpuscul, arătând că sexul ar putea fi determinat chiar de această diferenţiere a gameţilor.

E. B. Wilson (1905) studiind meioza la insectele din genul Protenor, constată că la masculi 2n=13 cromozomi, iar femelele posedă în celulelesomatice 2n=14 cromozomi. Femelele vor produce gameţi identici cu n=7, în timp ce masculii vor avea două tipuri de gameţi, cu n=7 şi n=6. Dacă un ovul va fi fecundat de un spermatozoid cu 7 cromozomi, va rezulta o femelă, iar când spermatozoidul are n=6 cromozomi va rezulta un mascul.

Aceste constatări au dovedit că sexul organismelor este determinat ereditar, de gene localizate în anumiţi cromozomi.

Explicaţiile date de Mendel, pentru segregarea factorilor ereditari constituie încă un argument în sprijinul ipotezei că genele sunt plasate în cromozomi. Mendel arată că, factorii ereditari se găsesc sub formă de pereche în celulele somatice şi câte unul singur din fiecare pereche, în celulele sexuale.

Prin descoperirile lor, W. S. Sutton (1902) şi T. Boveri (1902) au stabilit legătura dintre factorii ereditari mendelieni şi cromozomi ca purtători ai acestora. Aceşti geneticieni formulează aproape concomitent ipoteza localizării genelor pe cromozomi, evidenţiind faptul că numărul caracterelor distincte ale unui organism este mult mai mare decât numărul de cromozomi, astfel că, pe o pereche de cromozomi sunt mai mulţi factori ereditari.

T. H. Morgan (profesor la Universitatea Columbia din New York) şi şcoala sa a

151

preluat această ipoteză, dezvoltând-o şi aprofundând-o, formulând o teorie unitară denumită teoria cromozomică a eredităţii pentru care a fost distins cu premiul Nobel, în anul 1933.

T. H. Morgan şi colaboratorii săi, C. B. Bridges, A. H. Sturtevant şi H. J. Müler au folosit ca material biologic, musculiţa de oţet (Drosophila melanogaster), insectă la care au descris peste 500 forme mutante. Prin numeroase încrucişări între diferite mutante cu tipul sălbatic, sau a mutantelor între ele, s-a stabilit modul de transmitere a genelor pe parcursul mai multor generaţii.

În concepţia lui Morgan, genele sunt plasate în cromozomi în anumite poziţii denumite loci (singular locus), sub formă de pereche, determinând însuşiri contrastante ale aceluiaşi caracter.

Prin mutaţia unei gene normale (sau de tip sălbatic) a apărut o genă nouă, dar care ocupă acelaşi locus în cromozomii omologi. Acest cuplu de gene ce determină însuşirea normală şi cea mutantă a unui caracter, a primit denumirea de gene alele. Genele ce determină caracterul normal se notează cu literă mare sau cu literă mică şi cu semnul + (de exemplu A sau a+ ) iar gena alelă cu literă mică (a).

Gena este considerată unitate ereditară funcţională, mutaţională şi de recombinare genetică. Studiind un număr mare de masculi şi femele de Drosophila melanogaster, Morgan a arătat că femelele au o pereche de cromozomi identici (XX) iar masculii, un singur cromozom X sub formă de bastonaş şi unul neomolog numit cromozom Y sub forma unui bastonaş frânt. Descoperirea cromozomilor sexului constituie o altă dovadă că genele sunt plasate în cromozomi.

Tot la Drosophila melanogaster, s-a constatat că la unii indivizi poate lipsi un cromozom sau poate exista un cromozom în plus. Aceasta fiind corelată cu absenţa unui caracter sau prezenţa unui caracter, constituie încă un argument că genele sunt plasate în cromozomi (C. B., Bridges, 1921).

In urma acestor rezultate experimentale s-au elaborat cele trei teze ale teoriei cromozomice a eredităţii:

1. - plasarea liniară a genelor în cromozomi;2. - transmiterea înlănţuită a genelor( linkage);

3. - schimbul reciproc de gene între cromozomii omologi (crossing-over).

7.2. PLASAREA LINIARĂ A GENELOR PE CROMOZOMIIn experienţele sale, Mendel a analizat, în mod întâmplător, caractere ce erau

localizate în perechi diferite de cromozomi, fapt ce permite segregarea şi combinarea independentă a caracterelor. Morgan a urmărit într-un număr foarte mare de încrucişări, transmiterea de la o generaţie la alta a unor gene localizate în acelaşi cromozom.

S-a constatat că există un număr mult mai mare de gene decât cromozomi, chiar dacă, în unele cazuri, o genă poate determina mai multe caractere. Rezultatele analizelor genetice nu se pot explica decât dacă se admite că genele sunt plasate liniar în cromozomi, ocupând un loc precis denumit locus.

152

7.3. TRANSMITEREA ÎNLĂNŢUITĂ A GENELOR (LINKAGE)

Segregarea independentă a caracterelor şi libera combinare a acestora rezultă din faptul că, în timpul meiozei, cromozomii omologi se despart şi se distribuie întâmplător, într-un gamet sau altul. Potrivit acestor legi, genele alele sunt localizate în perechi diferite de cromozomi.

In anul 1906, W. Bateson şi R. C. Punnett vrând să confirme rezultatele mendeliene, au efectuat o dihibridare la planta Lathyrus odoratus (sângele voinicului). Ei au luat în studiu următoarele caractere: culoarea florilor şi forma polenului. încrucişând plante cu flori purpurii şi polen alungit cu plante cu flori roşii şi polen rotund, în generaţia F1 hibrizii erau uniformi, cu flori purpurii şi polen alungit, aceste caractere fiind dominante. In generaţia F2 segregarea nu s-a produs în raportul de 9:3:3:1, ci au rezultat într-o proporţie mai mare plantele ce se asemănau cu părinţii (flori purpurii - polen alungit, flori roşii - polen rotund), fenomen pe care l-au denumit cuplare şi într-o mică proporţie indivizii recombinaţi (flori purpurii - polen rotund, flori roşii - polen alungit) fenomen numit repulsie.

T. H. Morgan şi colaboratorii săi au efectuat o experienţă la Drosophila melanogaster (fig. 7.1). S-a încrucişat o femelă cu corp gri şi aripi normale (b+vg+/b+vg+) cu un mascul ce prezenta caractere mutante, corp negru şi aripi vestigiale (bvg/bvg) In prima generaţie au rezultat indivizi cu corp gri şi aripi normale.

Dacă un mascul heterozigot din generaţia Fi este retroîncrucişat cu o femelă homozigotă dublă mutantă, în generaţia F2 au rezultat numai două grupe fenotipice de indivizi, ca în cazul unei monohibridări, în raport de 1:1 şi nu patru câte ar fi trebui sa apară, în raport de 1:1:1:1. Rezultatele acestei experienţe au arătat că genele ce determină culoarea corpului şi forma aripilor sunt plasate pe acelaşi cromozom şi se transmit împreună la descendenţi, fenomen pe care în denumeşte linkage.

În acest exemplu se poate vorbi de un linkage complet fenomen rar întâlnit în natură. La Drosophila melanogaster, la mascul, fiind sexul heterogametic (XY), nu are loc recombinarea genetică deoarece cromozomii X şi Y nu sunt omologi, iar între ceilalţi cromozomi somatici nu se realizează în profaza meiozei chiasme (C. D. Darlington, 1935).

Fenomenul acesta se mai întâlneşte şi la alte specii de diptere la care sexul mascul este heterogametic sau la unele specii de lepidoptere, la care sexul femel este heterogametic.

153

Fig. 7.1. Înlănţuirea completă a genelor la Drosophila melanogaster

Cele peste 500 de mutante de la Drosophila, studiate de T. Morgan, manifestă tendinţa de a se grupa în patru grupe: grupa I - 141 mutante; grupa II - 228 mutante; grupa III - 156 mutante şi grupa IV - 12 mutante.

Existenţa a patru grupe de înlănţuire este încă o dovadă că genele sunt plasate în cromozomi şi în plus, există o corelaţie evidentă între lungimea cromozomilor şi numărul de gene pe care le conţin.

Linkage constituie o teză de bază a teoriei cromozomice a eredităţii, conform căreia genele localizate pe acelaşi cromozom se transmit la descendenţi în bloc, formând o singură grupă de linkage.

Fenomenul linkage se manifestă numai pentru genele localizate în acelaşi cromozom, în timp ce pentru genele ce se găsesc în cromozomi diferiţi transmiterea lor se face conform legilor mendeliene.

Transmiterea înlănţuită a genelor are o serie de implicaţii teoretice şi practice deosebit de importante în alcătuirea hărţilor cromozomice, ameliorarea plantelor şi animalelor, sfaturile genetice şi ingineria genetică.

7.4. SCHIMBUL RECIPROC DE GENE ÎNTRE CROMOZOMII OMOLOGI (CROSSING-OVER)

Bateson şi Punnett au elaborat teoria cuplării şi repulsiei, prin care căutau să demonstreze că în procesul de hibridare pot avea loc fenomene de cuplare şi recombinare a genelor. T. H. Morgan a înlocuit termenul de cuplare cu cel de linkage iar cel de repulsie cu termenul de crossing-over.

154

Fenomenul prin care se realizează schimbul de gene alele sau segmente cromatidice nesurori între cromozomii omologi în timpul meiozei se numeşte crossing-over. Existenţa acestui fenomen dovedeşte că linkage nu este întotdeauna complet, ca atare, crossing-over-ul este un linkage incomplet.

Pentru a demonstra schimbul de gene între cromozomii omologi, Morgan a folosit următoarea experienţă: a încrucişat un mascul de culoare neagră şi cu aripi vestigiale cu o femelă cu corpul de culoare gri şi aripi normale (figura 7.2).

In generaţia Fi a obţinut o descendenţă uniformă fenotipic, cu corpul de culoare gri şi aripi normale şi genotipic heterozigotă. Dacă se retroîncrucişează o femelă din generaţia Fi cu un mascul cu ambele caractere mutante, rezultă în generaţia F2 patru grupe fenotipice: două grupe fenotipice parentale şi două grupe fenotipice noi, în următoarele proporţii: corp gri-aripi normale - 41,5%, corp negru-aripi vestigiale - 41,5%, corp gri-aripi vestigiale - 8,5%, şi corp negru-aripi normale - 8,5%.

Se observă că raportul de segregare nu este cel aşteptat în urma unei retroîncrucişări 1:1:1:1. Formele noi, rezultate în proporţie mult mai mică decât cele parentale, sunt determinate de schimbul de gene între cromatidele nesurori ale cromozomilor omologi, fiind denumite şi forme recombinate.

Raportul de segregare, deosebit de cel mendelian, se datorează faptului că femela heterozigotă formează patru tipuri de gameţi, două de tip parental (b+vg+ şi bvg)şi două de tip nou (b+vg şi bvg+), care se fecundează cu unicul tip de gameţi ai masculului (bvg).

Valoarea crossing-over-ului se exprimă în % şi ne arată forţa de înlănţuire a

95S B# №%Fig.7.2.-Fenomenul crossing-over la Drosophila melanogaster

155

genelor. Cu cât aceasta este mai mică, frecvenţa crossing-over-ului este mai mare. Valoarea procentuală cu care se manifestă crossing-over-ul se mai numeşte şi valoare de schimb sau forţa înlănţuirii.

7.5. MECANISMUL CITOLOGIC AL CROSSING-OVER-ULUI

Morgan a studiat efectele crossing-over-ului în funcţie de rezultatele obţinute în urma hibridărilor . El a presupus că la nivel citologic, în prima diviziune meiotică, când cromozomii omologi se apropie şi se înfăşoară unul în jurul celuilalt, se produc rupturi şi sudări între diferite segmente cromatidice.

Dovezi citologice ale crossing-over-ului au fost aduse de C. Stern în 1931 la Drosophila melanogaster şi apoi de H. B. Creighton şi Barbara Mc. Clintock, la Zea mays, când s-a putut urmări trecerea unor segmente dintr-un cromozom în altul.

C. Stern a încrucişat două linii de Drosophila care aveau structura genetică diferită. El a obţinut o femelă la care cromozomii X erau diferenţiaţi morfologic şi genetic: un cromozom X era fragmentat în două segmente aproximativ egale, din care un segment avea centromer iar al doilea cromozom X avea ataşat un segment din cromozomul Y. Pe segmentul fără centromer al

primului cromozom X sunt localizate genele c (camation) şi B (bar). Gena c determină culoarea roşie a ochilor iar gena B determină reducerea suprafeţei ochilor.

Pe al doilea cromozom X de la femelă se găsesc genele de tip normal, C (carnation), ce determină culoarea roşie a ochilor şi b (bar), ce determină forma normală a ochilor (figura 7.3). Se observă că cromozomii X de la femelă erau foarte diferiţi morfologic şi genetic şi puteau fi urmăriţi uşor în timpul diviziunii meiotice.

Fig. 7.3. Explicaţia citologică a fenomenului crossing-over (după C. Stern, 1931)

Stern a încrucişat o femelă de tipul descris mai sus cu un mascul pe a cărui cromozom X se găseau genele recesive c (ochi roşii) şi b (ochi de mărime normală).

Femela produce două tipuri normale de gameţi (cB şi Cb) şi două tipuri noi, recombinate, în procesul de crossing-over, (Cb şi cb). Din combinarea acestor patru tipuri de ovule cu spermatozoizi ce conţin cromozomul X cu genele cb ce proveneau de la mascul însă celălalt cromozom X diferă de la o grupă la alta. Apariţia indivizilor recombinaţi se datorează schimbului de gene între cromozomii X de la femelă.

Pentru a cunoaşte mecanismul citologic al crossing-over-ului, este necesar să analizăm mai întâi când şi unde se produce el. Studiul diviziunii meiotice uşurează înţelegerea modului cum se produce crossing-over-ul.

154

157

În profaza I a meiozei, în stadiul de zigonema, cromozomii omologi se împerechează şi formează cromozomi bivalenţi. În diplonema fiecare cromozom clivează longitudinal, rezultând tetrada cromozomică. Între cromatidele celor doi cromozomi pot exista unele întretăieri realizându-se unul sau mai multe puncte de contact denumite chiasmata (pluralul de la chiasmă). Când centromerii cromozomilor din tetrada cromozomică se îndepărtează unii de alţii, la nivelul chiasmelor se poate realiza un schimb de segmente cromatidice, fenomen denumit crossing-over.

Chiasma reprezintă modalitatea citologică de producere a crossing-over- ului. Cercetările citologice au demonstrat că, chiasmele se realizează numai între cromatidele nesurori şi deci două din cele patru cromatide îşi păstrează structura iniţială.Aşa se explică faptul că numărul de recombinaţii nu depăşeşte frecvenţa de 5 0 % ( f i g . 7.4.). ’

Fig. 7.4. Chiasma afectează două din cele patru cromatide. În urma meiozei doi gameţi vor fi recombinaţi iar doi nerecombinati

Pentru explicarea mecanismului citologic al crossing-over-ului s-au elaborat două teorii: teoria chiasmatipiei şi teoria copierii selective a cromatidelor în timpul sintezei materialului cromozomic.

Teoria chiasmatipiei a fost elaborată de F. A. Jannsen (1909-1924) şi perfecţionată de C. D. Darlington şi Belling (1931, 1935). Această teorie susţine că, crossing-over-ul se realizează înaintea fazei de diplonema, în profaza diviziunii heterotipice, când între cromozomii omologi are loc un schimb de segmente egale. Acest schimb de segmente cromatidice se realizează cu ajutorul chiasmelor. O chiasmă nu afectează decât două din cele patru cromatide ale tetradei cromozomice. Acest aspect poate fi pus în evidenţă la Neurospora crassa, deoarece ascosporii acestei ciuperci pot fi studiaţi individual.

Între cromatide se pot realiza mai multe chiasme, de aceea, pe lungimea unei perechi de cromozomi, se pot produce mai multe schimburi de segmente cromatidice, existând din acest punct de vedere mai multe tipuri de crossing-over: crossing-over simplu, crossing-over dublu, crossing-over triplu etc.

Teoria chiasmatipiei a fost completată de K. Mather (1937), prin cercetările citologice efectuate la lăcustele din genul Stenobothrus, la care cromozomii sunt foarte diferiţi ca mărime. El a ajuns la concluzia că există o corelaţie pozitivă între lungimea cromozomului şi numărul de chiasme ce se formează. În ceea ce priveşte repartizarea chiasmelor de-a lungul cromozomului s-a constatat că între centromer şi prima chiasmă este o distanţă mai mică la cromozomii scurţi şi mai mare la cromozomii lungi, aceasta numindu-se distanţă

158

diferenţială. Celelalte chiasme de pe braţele cromozomilor sunt separate de distanţe constante pentru o specie oarecare, denumite distanţe de interferenţă.

Teoria chiasmatipiei a fost verificată cu ajutorul izotopilor radioactivi, de către J. H. Taylor (1957, 1958, 1963) dar rămâne nelămurită care este natura forţelor care determină ruperea cromatidelor şi realizarea schimbului de segmente cromatidice. C. D. Darlington (1932) arată că, în stadiul de zigonema, cromozomii omologi sunt strâns răsuciţi unul în jurul celuilalt, creându-se o tensiune mai mare la cromatidele externe. Aceste cromatide se rup, se derulează şi se resudează, la nivelul aceleiaşi cromatide (crossing-over-ul nu se produce) sau la cromatida pereche. M. J. D. White (1942), pentru a explica acelaşi fenomen, arată că în timp ce are loc sinapsa cromozomilor omologi, între cromatidele acestora are loc o atracţie. Odată cu clivarea cromozomilor, această atracţie se transformă în repulsie. În stadiul de diachineză, când cromozomii omologi se îndepărtează mult unul de altul, prezintă o serie de bucle a căror fisurare este împiedicată de prezenţa chiasmelor. De aceea, se pot întâlni zone în care are loc atracţia, ce se suprapun cu zone în care are loc repulsia cromatidelor. De data aceasta cromatidele interne sunt supuse unor tensiuni mai mari, se pot rupe şi se ataşează la cromatidele nesurori.

Teoria copierii selective a cromatidelor, cunoscută şi sub denumirea de “copy choice theory” susţine că, fenomenul de crossing-over are loc în timpul replicării materialului genetic, în perioada S din ciclul celular. Pentru a înţelege mecanismul presupus, este necesar să precizăm că procesul de sinteză replicativă a macromoleculei de ADN, cât şi a cromozomului în ansamblu, se realizează după modelul semiconservativ. Se presupune că în timpul acestui proces, replicaţia cromozomului nu se face numai după propriul model, ci unele cromatide nou sintetizate copie secvenţa nucleotidică de pe un segment din cromatidele celuilalt cromozom. Această teorie nu este acceptată de geneticieni deoarece s-a demonstrat că fenomenul de crossing-over are loc şi în afara perioadei S.

7.6. TIPURI DE CROSSING-OVER

Crossing-over-ul este un fenomen întâmplător ce se produce cu o anumită probabilitate în unul sau mai multe puncte de pe cromozomii omologi. În funcţie de numărul segmentelor cromatidice ce se pot schimba între cromozomii pereche, crossing-over-ul poate fi: simplu, când se realizează schimbul unui singur segment sau gene între cromozomii omologi; dublu, când se produc două schimburi de segmente sau gene, caz în care trebuie să existe cel puţin două chiasme între cromozomii omologi şi multiplu, când între cromozomii omologi se realizează mai multe schimburi de gene sau segmente cromatidice (fig. 7.5). Începând cu crossing-over-ul dublu, există mai multe posibilităţi de realizare a crossing-over-ului între cele patru cromatide ale tetradei cromozomice.

Aşa cum a fost prezentat fenomenul de crossing-over, se înţelege că segmentele ce fac schimb între cromozomi omologi, sunt egale. Nu întotdeauna procesul decurge astfel. Se poate întâmpla ca, cromatidele să se rupă în puncte

159

diferite şi atunci segmentele ce se schimbă să nu mai fie egale ca lungime. Acest fenomen se numeşte crossing-over inegal şi are drept consecinţă dublarea sau triplarea unei gene pe un cromozom iar la celălalt cromozom lipsa locusurilor respective (deficient).

Efectul crossing-over-ului inegal a fost sesizat la Drosophila melanogaster, de către Sturtevant şi Morgan (1923). Pe cromozomul X în regiunea 16 A este localizată gena Bar, genă mutantă care are ca efect reducerea suprafeţei ochiului, prin diminuarea numărului de omatidii. Multă vreme s-a crezut că, gena Bar, prin mutaţie de reversie poate reveni la forma normală sau să determine un nou fenotip dublu - Bar. Dar fiindcă mutaţia de reversie şi apariţia fenotipului dublu - bar era însoţită de un crossing-over în vecinătatea regiunii 16 A s-a tras concluzia că tipul Bar este efectul unei duplicaţii a regiunii 16 A, determinată de un crossing-over inegal.

Odată cu descoperirea cromozomilor gigantici din glandele salivare ale larvelor de Drosophila s-a constatat, într-adevăr, de către Bridges că micşorarea suprafeţei ochiului este corelată pozitiv cu dublarea sau triplarea unor porţiuni de cromozom ca urmare a unui crossing-over inegal.

Crossing-over-ul mitotic. Crossing-over-ul este un fenomen specific diviziunii meiotice. Destul de rar, acest fenomen poate avea loc şi în celulele somatice, în profaza mitozei, numindu-se în acest caz crossing-over mitotic sau somatic. Fenomenul apare foarte rar la plantele şi animalele superioare, însă destul de frecvent la unele microorganisme, la care hărţile cromozomice s-au întocmit pe baza crossing-over-ului mitotic.

Fig. 7.5. Tipuri de crossing-over:1- cromozomi normali;2- crossing-over simplu;3- crossing-over dublu4- crossing-over multiplu

160

Bridges, a observat apariţia unor caractere mozaicate la femelele de la Drosophila atât pe corp cât şi pe ochi.

Studiind mai detaliat cauzele acestor mozaicuri de la Drosophila de către C. Stern (1936) şi la porumb de D. F. Jones (1937) s-a demonstrat că fenomenul se datorează unui crossing-over între cromatidele cromozomilor omologi în timpul diviziunii mitotice.

La Drosophila s-au luat în studiu două caractere: culoarea galbenă a corpului, produsa de gena Y şi caracterul “peri arşi” determinat de gena Sn.

161

Femelele heterozigote pentru aceste caractere aveau următorul genotip: YSn+ / Y+Sn.Cele două gene se găsesc pe cromozomul X, foarte apropiat una de alta. Petele

ce se observă pe corpul insectei pot fi simple sau duble, în funcţie de locul de pe cromozom unde se produce crossing-over-ul. Dacă crossing-over-ul se produce între centromer şi gena Sn, apar pete duble, iar dacă se produce între gena Sn şi Y, petele sunt simple. În anafaza mitozei cromozomii cu genele YSn+ vor migra la un pol al celulei, iar cromozomul cu genele Y+Sn la celălalt pol. Din cele două celule se dezvoltă două ţesuturi unde genele recesive Y şi Sn vor fi homozigote, realizându-se următoarele genotipuri: YSn+ / YSn+ şi Y+Sn / Y+Sn determinând pe corpul cenuşiu al Drosophilei cele două pete: o pată de culoare galbenă şi cu perişorii normali şi alta de culoare gri şi cu peri arşi. Crossing-overul între genele Y şi Sn are loc foarte rar, deoarece cele două gene sunt localizate foarte aproape una de alta pe cromozomul X, în acest caz apărând petele simple.

Crossing-over-ul somatic poate avea loc atât între cromozomii sexului cât şi între cromozomii autozomi.

Crossing-over-ul mitotic a fost pus în evidenţă şi la unele microorganisme, cum ar fi la Aspergillus nidulans. La această ciupercă hifele sunt haploide însă, uneori hifele a două suşe pot fuziona şi dau naştere la un heterocarion, iar după unirea nucleilor rezultă spori diploizi care pot fi izolaţi. Aceşti spori diploizi pot fi heterozigoţi pentru o anumită genă, şi ca urmare, între anumite gene se poate produce fenomenul de crossing-over. De exemplu, la această ciupercă s-a identificat o mutantă care determină rezistenţa la acriflavină (Acr), substanţă ce provoacă moartea tipului sălbatic. (acr+).

Indivizii heterozigoţi (acr+/Acr) sunt parţial rezistenţi la acriflavină, deoarece gena mutantă Acr este semidominantă asupra tipului sălbatic (acr+). Dacă a avut loc fenomenul de crossing-over mitotic (la indivizii diploizi), pot apare indivizi cu genotipul Acr/Acr, ce sunt rezistenţi la acriflavină. În acest mod, dacă în mediul de cultură se va adăuga acriflavină, se vor îndepărta uşor toate celelalte tipuri, selectându-se numai recombinaţii, oricât de rar ar apărea.

J. H. Taylor (1957) folosind metoda autoradiomicrografiei la planta Bellevalia romana (2n=8) a dovedit citologic existenţa crossing-over-ului mitotic. Pentru aceasta, a ţinut rădăcinile tinere ale acestei plante timp de 8 ore în soluţie nutritivă în care a adăugat timidină marcată cu tritiu (H3). Apoi, rădăcinile au fost scoase şi puse într-un mediu fără timidină marcată, adăugându-se colchicină, care blochează diviziunea celulelor, dar nu şi a cromozomilor. În felul acesta s-au determinat câte diviziuni ale cromozomilor au avut loc.

J. H. Taylor a constatat că în prima metafază după scoaterea rădăcinilor din mediul marcat, ambii cromozomi ai unei perechi erau radioactivi. În a doua diviziune unul era marcat, iar perechea sa nu. La unii cromozomi care erau în întregime radioactivi erau segmente terminale neradioactive, dovedind un schimb de segmente între cromozomi.

Crossing-over-ul intragenic. În concepţia geneticii clasice, genele sunt unităţi elementare ale eredităţii, care sunt, în acelaşi timp, unităţi funcţionale şi de recombinare. În acest caz, nu se poate pune problema subunităţilor de genă care să poată fi schimbate prin crossing-over.

Cercetările ulterioare, efectuate după anul 1950, au evidenţiat cazuri în care genele se comportă ca şi cum ar fi alcătuite din mai multe subdiviziuni denumite subgene.

La microorganisme s-a demonstrat că crossing-over-ul poate avea loc şi în interiorul genei, în diferiţi subloci ai acesteia, numindu-se, în acest caz, crossing-over

162

intragenic. Avantajul utilizării în diferite cercetări a microorganismelor, derivă din faptul că, se pot studia într-un timp scurt un număr enorm de indivizi, de ordinul milioanelor.

Un caz bine studiat este bacteriofagul T4, fag ce parazitează unele suşe ale bacteriei Escherichia coli (S. Benzer, 1955). La acest bacteriofag, genele mutante, adiacente, r II A şi r II B, determină un ciclu de viaţă mai scurt al acestuia determinând plaje mai mari de liză (zone cu bacterii distruse) decât tipul sălbatic. Notarea cu r, arată că genele respective determină liza rapidă a celulei gazdă.

Bacteriofagul T4 de tip normal, poate parazita atât pe suşa B cât şi pe suşa K.12 (X) de E. coli. Bacteriofagii cu genele mutante r II nu pot creşte decât pe suşa B. În cazul unor infecţii simultane ale suşei K.12 (X) cu ambele mutante ale genei r II, numai tipul sălbatic provenit din recombinarea celor două gene, poate infecta bacteria. În acest caz, chiar dacă frecvenţa indivizilor recombinaţi este de 1/10.000.000 ei pot fi uşor identificaţi.

La genele r II A şi r II B s-au identificat peste 3000 de mutante, folosite pentru evidenţierea crossing-over-ului intragenic. Pentru a determina existenţa crossing-over-ului intragenic se procedează astfel: cu două mutante r II A ale fagului T4 se infectează simultan suşa B de E. coli, iar între ele se produce crossing-over-ul intragenic.

Bacteriofagii rezultaţi se folosesc pentru infectarea suşei K.12 (X). În urma acestei infecţii se vor putea identifica bacteriofagii cu gene de tip normal, deoarece numai ei pot creşte pe suşa K.12 (X). Identificarea a 1000-1500 de recombinaţii a demonstrat existenţa crossing-over-ului intragenic, putându-se alcătui şi harta genetică a regiunii r II.

Se pune întrebarea: de ce se consideră că genele r II A şi r II B sunt diferite? Acest lucru poate fi dedus din următoarea experienţă: dacă se infectează suşa K.12 (X) simultan cu T4 r II A şi T4 r II B, rezultă descendenţi, în timp ce, dacă această suşă este infectată separat cu două mutante T4 r II A sau T4 r II B, nu se produc descendenţi, din cauza frecvenţei foarte mici a recombinărilor intragenice. În concluzie, genele r II A şi r II B determină funcţii diferite, ambele însă necesare pentru reproducerea bacteriofagului T4

pe suşa K.12 (X). Testul prin care se dovedeşte că două mutante aparţin aceleiaşi gene sau unor gene diferite, se numeşte test de complementaţie.

Crossing-over-ul intragenic s-a pus în evidenţă şi la organismele superioare: la Drosophila melanogaster s-a descoperit că locii white, forked şi lozenge din cromozomul X, locusul star din cromozomul II, sunt complecşi, fiind alcătuiţi din mai multe subgene. De asemenea, loci complecşi au fost identificaţi la porumb, bumbac, şoarece, om şi la alte specii.

l.l. FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ CROSSING-OVER-UL

Stabilitatea structurală a cromozomilor şi a locilor ce ocupă poziţii bine definite fac ca linkage şi crossing-over-ul să se manifeste ca fenomene constante de la o generaţie la alta, putându-se afirma că cele două fenomene sunt controlate genetic.

Ca orice proces genetic, crossing-over-ul este supus influenţei a două categorii de factori: interni şi externi. Dintre factorii interni studiaţi până acum sunt: sexul, structura cromozomilor, aberaţiile cromozomice şi numerice, vârsta organismului, iar dintre factorii externi: temperatura, nutriţia.

Sexul. Cercetările efectuate de C. B. Bridges (1933) la Drosophila melanogaster, au evidenţiat faptul că la masculi, fenomenul de crossing-over nu se

163

produce sau este foarte rar. Lipsa crossing-over-ului a fost semnalată şi la Bombyx mori, la sexul femel, care este heterogametic XY.

Absenţa crossing-over-ului la sexul heterogametic al unor specii se datorează faptului că, în procesul de gametogeneză (spermatogeneză şi ovogeneză), deşi cromozomii omologi fac sinapsă formând bivalenţi, între cele patru cromatide nu se formează chiasme şi deci nu se poate realiza nici crossing- over-ul.

La alte specii, la care sexul se realizează cu ajutorul heterozomilor (la mamifere), s-a constatat că cromozomii se asociază cap-la-cap, în timp ce autozomii se asociază normal, latură-pe-latură. In acest caz între cromozomii somatici are loc crossing-over-ul, dar nu şi între cromozomii sexului.

Chiar la organismele la care crossing-over-ul se produce la ambele sexe, s-au observat diferenţe privind frecvenţă crossing-over-ului de la un sex la altul. In aceste organisme, de obicei, la sexul heterogametic, frecvenţa crossing-over- ului este mai mică. La unele plante monoice sau dioice s-au observat diferenţe între sexe, în ceea ce priveşte frecvenţa crossing-over-ului. Astfel, la porumb, frecvenţa acestuia este mai mare la gameţii masculi.

In ceea ce priveşte structura cromozomilor, frecvenţa crossing-over- ului este influenţată de poziţia centromerului şi localizarea heterocromatinei. In regiunea centromerului frecvenţa crossing-over-ului este redusă, datorită interferenţei manifestate de centromer asupra genelor din vecinătatea sa şi datorită faptului că genele sunt foarte apropiate una de alta. Tot în zona centromerului sunt prezente zonele heterocromatice ale cromozomului, care reduc schimbul de gene între cromozomii omologi.

Aberaţiile cromozomice şi în special inversia şi translocaţia, precum şi unele tipuri de poliploidie, determină o modificare a frecvenţei crossing-over-ului.

Procentul de crossing-over depinde şi de vârsta organismului. Astfel, la Drosophila, după ce femelele au atins maturitatea sexuală, în următoarele două zile, frecvenţa crossing-over-ului a atins valoarea maximă, iar după 10-11 zile, frecvenţa acestuia este minimă.

Dintre factorii externi, un rol important în modificarea frecvenţei crossing-over-ului îl are temperatura. Efectuându-se diferite hibridări între diferite mutante la Drosophila şi crescându-se descendenţii în condiţii diferite de temperatură, s-a putut constata că la unii cromozomi sau chiar la unele segmente cromozomice frecvenţa crossing-over-ului se modifică. Astfel, după Grubard (1932) (citat de T. Crăciun, 1978), unele regiuni ale cromozomului II de la Drosophila formează mai multe recombinări la temperatura 14-160C, iar în alte regiuni, la temperatura de 25-300C.

7.8. HĂRŢILE CROMOZOMICE9

Tezele teoriei cromozomice a eredităţii au constituit baza teoretică şi practică pentru elaborarea hărţilor cromozomice sau genetice.

Hărţile cromozomice constituie reprezentarea grafică a cromozomilor şi a genelor care alcătuiesc diferite grupe de linkage, genele fiind plasate pe cromozomi la distanţe relative exprimate în procente de crossing-over.

Alcătuirea hărţilor cromozomice presupune trei etape de lucru:- obţinerea mutantelor de la caracterul normal sau sălbatic;- stabilirea grupelor de linkage;

164

- determinarea ordinii şi distanţelor dintre gene în cadrul fiecărei grupe de linkage.

După ce s-au realizat un număr cât mai mare de forme mutante, genele respective se repartizează în grupe de înlănţuire. Pentru a stabili aceste grupe se efectuează un număr mare de încrucişări şi retroîncrucişări între indivizi normali şi mutanţi sau între indivizi mutanţi. Dacă segregarea se realizează după raporturile mendeliene, se trage concluzia că genele respective se găsesc în grupe diferite de înlănţuire, iar dacă în urma retroîncrucişărilor se obţin în proporţie mai mare fenotipurile parentale, între genele respective se manifestă linkage, complet sau incomplet, deci ele sunt plasate în acelaşi cromozom.

Pentru determinarea ordinii şi distanţei dintre gene s-a plecat de la constatarea că frecvenţa crossing-over-ului este o funcţie direct proporţională cu distanţa dintre gene. Distanţele dintre gene se exprimă în unităţi de recombinare, denumite unităţi Morgan sau morganide. Fiecare unitate de recombinare corespunde cu 1% crossing-over, iar 1% crossing-over este egal cu 1 unitate de pe harta cromozomică.

De exemplu, dacă la Drosophila melanogaster se consideră trei gene mutante recesive, b - corp negru, vg - aripi vestigiale şi c - aripi îndoite, pentru a stabili distanţa dintre ele şi ordinea lor pe cromozom, se fac următoarele încrucişări: indivizii normali cu indivizi ce prezintă mutaţiile b şi c, rezultând un procent de 27% crossing-over, indivizi normali cu indivizi ce prezintă mutaţiile c şi vg în urma căreia au rezultat 8,5% indivizi recombinaţi. Se poate afirma că distanţa dintre locii b şi c este de 27 unităţi iar între locii c şi vg distanţa este de 8,5 unităţi. Pentru a determina poziţia genei vg faţă de celelalte gene este obligatorie şi a treia încrucişare, între indivizi normali şi indivizi cu genele b şi vg, caz în care frecvenţa crossing-over-ului a fost de 18,5%, deci distanţa dintre aceşti loci este de 18,5 unităţi pe harta genetică, ca în schema de mai jos:

In acest caz, gena vg este plasată între genele b şi c, deoarece dacă ar fi fost plasată dincolo de gena c ar fi trebuit să se obţină un procent de crossing-over de 35,5%.

Când două gene de pe acelaşi cromozom sunt situate al distanţă mai mare, între ele poate apare crossing-over-ul dublu, care reduce frecvenţa crossing- over-elor simple. Atunci când într-un punct al cromozomului are loc un crossing- over, în vecinătatea sa, probabilitatea ca să se producă un alt crossing-over se reduce, iar fenomenul a primit denumirea de interferenţă. S-a constatat că dacă distanţa dintre două gene este de minimum 12 unităţi de recombinare (morganide), în acest segment de cromozom nu mai are loc un alt crossing-over. In alcătuirea hărţilor cromozomice s-a constat că există o diferenţă între valoarea reală a crossing-over-ului şi cea calculată statistic. Această diferenţă se apreciază cu ajutorul coeficientului de coincidenţă, care este raportul dintre valoarea experimentală a crossing-over-ului şi cea teoretică. Coeficientul de coincidenţă are valori cuprinse între 0 şi 1 şi este o valoare inversă interferenţei: are valoarea maximă (1) când interferenţa este absolută şi valoarea minimă (0) când interferenţa este mare.

Prima hartă cromozomică s-a întocmit la Drosophila melanogaster iar apoi la

165

Zea mays, Antirrhinum majus, Lathyrus odoratus, Hordeum vulgare etc. In figura 7.6. sunt redate parţial hărţile cromozomice la Drosophila melanogaster şi Zea mays.

Frecvenţa crossing-over-ului nu poate depăşi valoarea maximă de 50%. Dacă se observă cele două hărţi cromozomice, se constată că pe hartă apar şi distanţe mai mari de 50 unităţi. Acest lucru se explică astfel: între genele îndepărtate apar crossing-overe duble şi în acest caz distanţele mari se calculează prin însumarea distanţelor mai mici dintre genele intermediare.

In concluzie, distanţa dintre gene figurată pe harta cromozomică nu corespunde cu procentul de crossing-over decât în cazul genelor apropiate între care nu pot avea loc crossing-overe duble.

J-.V.L-V.,

Fig. 7.6. Hărţi cromozomice: a-la Drosophila melanogaster (după Bridges);

b-la Zea mays (după Rhoades)

7.9. HĂRŢILE CITOLOGICE

Localizarea genelor pe cromozomi s-a putut stabili prin determinarea procentului de crossing-over, alcătuindu-se hărţile cromozomice. Se pune întrebarea dacă nu se pot localiza genele pe cromozom, folosind elementele de structură ale acestuia, mai precis, diferenţele de structură ce apar de-a lungul lui şi care să corespundă genelor. Acest lucru a devenit posibil prin descoperirea şi studierea cromozomilor gigantici din celulele glandelor salivare ale larvelor de Drosophila melanogaster, deoarece au dimensiuni mari şi pot fi studiaţi uşor în interfază.

La aceşti cromozomi, s-au evidenţiat microscopic o serie de benzi transversale, unele heterocromatice (dense) şi altele eucromatice (clare). La nivel molecular, cromozomii gigantici pot fi priviţi ca o multiplicare de câteva sute sau mii de ori a macromoleculei de ADN, locii suprapunându-se în paralel şi deci, un locus de pe aceşti cromozomi reprezintă o amplificare a unicului locus de pe fibra de ADN din cromozomii somatici. Acest lucru a permis studierea amănunţită a

163

■/?, «4l-p’^wkr

AflJW■ !■ L"—**-J «rVfü- ' C>"c¥Vi»r

"iPţ, IIP

r'&WiT^dMr

IM

•7+ fl**6

■ T1 h

- rir \LJ

'rflVWff'■ ti-v-E

1[Ml,l'-''r' *r ‘i r*Lţzr™ sE*^"rJh- -‘f>■ 'I "J- h «r_>*r < i **w ^rl ur j.r__. LrB

^ij.Bj'HÎ .'I *1 Jrf'ViJÄPW

x L . ^ i T * 1q|it

J , f > V _

‘l >■!.-* p r* ■*

* h-t t»rt-

«seJ*|- ■ Htâmf

I ÎT. LK.Tkii

T ■*! P-tn*1

*<,1 ÜiJxrr.,*r>

-7.-J.JTfy*

164

cromozomilor gigantici, la care s-au identificat peste 5000 de benzi transversale, iar fiecare fiind alcătuită din 16 puncte. Localizarea acestor benzi este constantă pe cei patru cromozomi, fapt ce a permis identificarea şi numerotarea lor.

Lungimea totală a cromozomilor gigantici (1180 ^) a fost împărţită în 100 de diviziuni, repartizate astfel: cromozomul I, 0 - 20 diviziuni; cromozomul II, 20 - 60 diviziuni; cromozomul III, 60 - 100 diviziuni. Cromozomul IV fiind foarte mic nu a intrat în această împărţire. Fiecare diviziune a fost împărţită în şase subdiviziuni notate cu literele: A, B, C, D, E, F. Fiecare subdiviziune cuprinde un anumit număr de benzi transversale.

C. B. Bridges (1944) a stabilit o corespondenţă între genele localizate pe cromozomii obişnuiţi şi benzile transversale de pe cromozomii gigantici (figura 7.7.).

Distanţa dintre genele de pe harta cromozomică şi cea citologică nu coincide întotdeauna, mai ales în regiunile centromerice.

Hărţile genetice au o importanţă deosebită din punct de vedere teoretic şi practic. Elaborarea hărţilor genetice a permis să se cunoască o serie de aspecte cum ar fi: neomogenitatea funcţională liniară a cromozomilor, explicarea unor aberaţii cromozomice, importanţa genetică a fiecărui cromozom, în funcţie de tipul genelor şi numărul lor.

Cunoaşterea precisă a locilor genelor pe cromozomi deschide perspective mari în cunoaşterea modului de transmitere a unor caractere şi în modificarea constelaţiei genetice a organismelor pin metode de manipulare a materialului genetic.

DETERMINISMUL GENETIC AL SEXULUI

Moto:"Cei doi părinţi divorţează în celulele sexuale ale

copilului" Carl Sagan

Fig. 7.7. Segment din harta citologică a cromozomului X la

Drosophila melanogaster

165

8.1. GENERALITĂŢI 9

Sexualitatea a apărut pe o anumită treaptă a evoluţiei plantelor şi animalelor, prezentând o serie de avantaje: asigură reproducerea organismelor, recombinarea genetică, vigoarea hibridă a descendenţei şi trecerea de la starea haploidă la cea diploidă. Aspectele pe care le ridică acest domeniu al biologiei sunt pe cât de variate, pe atât de complexe. Este vorba de biologia, de transmiterea şi diferenţierea sexului, precum şi de posibilitatea de dirijare a raportului dintre sexe.

Determinarea şi dirijarea sexelor prezintă un interes deosebit pentru practică. Deşi s-a lucrat mult în direcţia găsirii unor posibilităţi pentru a putea dirija raportul dintre sexe, s-au făcut puţine progrese. Cât de important ar fi pentru noi să putem dirija raportul dintre sexe la plante sau animale, după necesităţi de ordin economic? Să putem, de exemplu, reduce la animale numărul de masculi, mărind numărul de femele în scopul înmulţirii mai rapide a acestui sex (pentru producţia de lapte, ouă ş.a.). Pentru plantele de cultură ar prezenta importanţă, de exemplu, transformarea unor plante dioice în plante monoice sau invers.

Diferenţierea sexelor, atât în regnul vegetal cât şi animal este strâns legată de complementul cromozomic, existând şi excepţii. Din punct de vedere al modului de reproducere, organismele se pot clasifica în:

- organisme unisexuate, cu diferenţe exclusiv masculină şi feminină;- organisme bisexuate (hermafrodite) cu diferenţiere ambigenă, care

produc atât gameţi masculi cât şi femeli;- organisme pseudohermafrodite cu diferenţiere ambigenă, care, deşi

posedă organe pentru reproducerea gameţilor de ambele sexe, produc gameţi numai de un sex.

Sub aspectul diferenţierii sexuale, lumea vie este atât de variată, încât o încercare de clasificare a lor nu este chiar atât de uşoară.

Deosebirea dintre sexe se numeşte gonochorism, fiind implicate două categorii de caractere: caracterele sexuale primare şi caracterele sexuale secundare. Primele sunt datorate prezenţei gonadelor, care produc un anumit tip de celule sexuale, diferite la mascul faţă de femelă şi anexele glandelor sexuale (caractere legate de sex). Caracterele sexuale secundare sunt diferenţierile morfologice şi fiziologice dintre sexe; sunt determinate de hormonii secretaţi de

165glandele sexuale şi nu asigură direct procesul gametogenezei, dar au un anumit rol în reproducerea sexuată.

Caracterele sexuale secundare, spre deosebire de cele primare, apar într- o anumită perioadă, în cursul dezvoltării individuale. Totalitatea caracterelor sexuale care generează deosebirile dintre cele două sexe, poartă numele de dimorfism sexual.

Dimorfismul sexual este mai accentuat la organismele inferioare decât la cele superioare. Un caz interesant este viermele marin Bonellia viridis: femela are corpul de

166

forma unui sac, cu o prelungire sub formă de trompă şi o lungime de aproximativ 30 cm; masculul are forma unui filament de 1-2 mm şi trăieşte ca parazit în esofagul sau oviductul femelei.

În general, la speciile inferioare şi la unele insecte, femela este mai bine dezvoltată decât masculul. La peşti şi reptile, dimorfismul sexual este aproape imperceptibil. El se accentuează în favoarea masculului la vertebratele superioare. La păsări, deosebirile sunt determinate de culoare, formă, mărime etc.; la mamifere aceste deosebiri se referă la mărime, păr, coarne etc.

8.2. TEORIA GENETICĂ A DETERMINĂRII SEXULUI

Determinismul genetic al sexelor are loc în cursul ontogeniei organismului, în diferite faze ale ciclului de înmulţire. Se cunosc trei tipuri de determinism: progamic, singamic şi epigamic.

Tipul progamic are loc în organismul matern odată cu procesul de maturare a ovulului. La unele animale, cum ar fi, de exemplu, Rotataria, Philoxera vastatrix şi Dinophylus, din ovule mari se dezvoltă femele, iar din cele mici masculi.

Mai răspândit este tipul singamic la care determinarea sexului are loc în momentul fecundării (peşti, păsări, mamifere ş.a.).

La tipul epigamic determinarea sexului are loc după procesul de fecundare, în timpul dezvoltării individuale a organismelor (Bonellia viridis ş.a.).

8.2.1. Determinismul cromozomic al sexelor

Observaţiile cu privire la proporţia dintre sexe, atât la plante cât şi la animale, au dus la acumularea de date, din care s-a dedus că în natură indivizii masculi şi femeli sunt în număr aproximativ egal.

Chiar din perioada mendeliană s-a încercat stabilirea unei legături între segregarea caracterelor şi segregarea indivizilor după sex. S-a constatat că segregarea indivizilor după sex, care este aproape 1:1, corespunde cu segregarea de tip Zea, când se încrucişează o formă homozigotă recesivă aa cu o formă heterozigotă Aa.

Într-adevăr, în experienţa lui C. Correns, cu plante din genul Mirabilis sau obţinut următoarele rezultate: Mirabilis jalapa cu flori albe încrucişată cu Mirabilis jalapa cu flori roşii au dat în Fi plante cu flori de culoare roză, care posedă cuplul de gene Aa. Aceste plante produc la rândul lor gameţi de tipul A şi

166

167

a, în mod egal pentru ambele sexe. In F2 se obţin indivizi homozigoţi pentru culoarea roşie şi albă şi indivizi heterozigoţi pentru culoarea roz în proporţie de 1 AA : 2 Aa: 1 aa. La încrucişarea dintre indivizii heterozigoţi Aa din F2 cu indivizii homozigoţi aa se obţin 50% plante cu flori roze şi 50% plante cu flori albe. Segregarea se face deci după raportul de 1 Aa : 1 aa. Conform legilor mendeliene, genele A şi a trebuie să se afle în aceeaşi pereche de cromozomi, pentru ca să aibă loc o astfel de segregare.

Prin analogie, s-a dedus că şi la segregarea indivizilor după sex, unul este heterogametic, iar altul homogametic. Cercetările lui C. Correns (1907) cu plante din genul Brionia şi ale lui D. Dankaster (1906) cu fluturele Abraxas grossulariata au confirmat această presupunere.

La sfârşitul secolului trecut, cercetându-se meioza la unele insecte, s-a constatat că există o distribuire neuniformă a cromozomilor (spermatozoizii aveau un număr inegal de cromozomi). Această repartiţie inegală a substanţei cromatice în unele celule germinale a fost sesizată de Henking (1891), Mac Clung (1901), Castle (1903) şi Wilson (1905-1940). Ei şi-au exprimat totodată părerea că cromozomul impar, deosebit ca formă şi mărime, este implicat în determinarea sexelor.

Repartiţia inegală a substanţei cromatice duce la stabilirea raportului de 1:1 între sexe, iar mecanismul de distribuire inegală a cromozomilor este o problemă ereditară. Din cauza distribuirii inegale a cromozomilor, în meioză nu toţi au pereche sinaptică. Cromozomul unic migrează singur la unul din polii celulei fără ca la celălalt pol să meargă omologul său. Din această cauză se nasc celule sexuale cu un număr par sau impar de cromozomi.

Cromozomii sexului pot alcătui în celulele somatice perechi în care unul să fie diferit sau la fel cu celălalt: la Drosophila unul este drept, iar celălalt puţin curbat. Cromozomii normali au fost notaţi cu litera X, iar cei curbaţi cu Y (figura 8.1).

Sexul care are cei doi cromozomi sexuali identici s-a notat cu XX, iar celălalt, la care ei sunt inegali, cu XY sau XO când Y lipseşte. În procesul de gametogeneză sexul XX formează un singur tip de gameţi (cu cromozomul X) şi este denumit sex homogametic, iar sexul XY sau XO formează două tipuri de gameţi (cu cromozomul X sau Y sau cu cromozomul X şi fără cromozomul sexual Y) şi este denumit heterogametic.

Se cunosc două tipuri principale de determinare cromozomică a sexelor: tipul Drosophila şi tipul Abraxas.

Tipul Drosophila. Aşa cum arată şi numele, acest tip cromozomic de determinare a sexului a fost studiat mai întâi la Drosophila. El se întâlneşte însă şi la alte insecte, viermi, moluşte, echinoderme, peşti, batracieni, mamifere şi la unele plante.

*

Fig. 8.1. Cariotipul la Drosophila melanogaster pentru ambele sexe

168

La organismele ce se încadrează în acest tip de determinare a sexului, când are loc reducerea cromatică în timpul maturaţiei celulelor sexuale, toate ovuleleprimesc un cromozom X, pe când spermatozoizii, 50% primesccromozomul X, iar 50% cromozomul Y. Oul ce va rezulta din fecundare cu un spermatozoid ce posedă cromozomul X va fi femel (XX), pe când din ovulul fecundat de un spermatozoid cu cromozomul Y va rezulta un mascul (XY). Schematic, aceasta se poate reprezenta în felul următor:

Pj Ş XX X S XYGameţi X X şi YF1 Ş XX şi S XYTipul Drosophila cuprinde trei subtipuri:- Subtipul Lygaeus, la care femela posedă doi cromozomi XX, iar

masculul, unul X şi altul Y. Este de fapt tipul clasic, cunoscut sub numele de tipul Drosophila;

- Subtipul Protenor, la care femela posedă cei doi cromozomi XX, iar masculul un singur X. Se întâlneşte la ortoptere, miriapode, la viermii nematozi ş.a.;

- Subtipul Ascaris, la carefemelele posedă doi cromozomi XX, iar

masculii un singur X care nu este independent ci ataşat autozomilor.Tipul Abraxas - numele vine de la genul de fluturi la care s-a descoperit şi

studiat acest tip de determinare a sexului. În acest caz, sexul femel este heterogametic XY, iar cel mascul homogametic XX. Femelele (XY) formează ovule cu X şi ovule cu Y, în timp ce masculii un singur fel de spermatozoizi care primesc câte un cromozom X. După cum spermatozoidul, care posedă un cromozom X, va întâlni un ovul cu X sau Y va lua naştere un mascul (XX) sau o femelă (XY).

Determinarea schematică a sexului se poate nota astfel:P1 Ş XY X S XXGameţi X şi Y XF1 Ş XY şi S XX

Tipul Abraxas cuprinde şi el două subtipuri:- Subtipul clasic descris mai sus, la care femelele sunt heterogametice

XY şi masculii homogametici XX;- Subtipul deficiens - la sexul femel lipseşte cromozomul Y şi rămâne un

singur X; masculii posedă cromozomii XX;Acest tip de determinare al sexului îl întâlnim la păsări, fluturi, frag ş.a. şi este

mult mai rar decât primul. Se mai numeşte şi tipul pasăre.Aceste două tipuri de determinare cromozomică a sexului au fost studiate mai

bine. În afară de ele au mai fost descrise şi alte tipuri întâlnite mai rar. Astfel, la unele insecte au fost descrise până în prezent un număr mare de subtipuri.

8.3. SEXUL ÎN CAZUL ÎNMULŢIRII PARTENOGENETICE9

S-a arătat anterior ce se înţelege prin partenogeneză: dezvoltarea din ovul a unui individ, fără o fecundare prealabilă. S-a arătat, de asemenea, că la albină, din ovulele nefecundate rezultă masculi, iar din cele fecundate regine (mătci) şi albine lucrătoare.

Determinarea sexului în cazul de faţă se face prin întreaga serie de cromozomi autozomi: n = S, 2n = Ş. În procesul de formare a celulelor sexuale, reducerea numărului

169

de cromozomi se face numai la femele, de la 32 la 16.Pentru partenogeneză, determinarea sexului pentru femele s-a numit

diplogenotipică, iar pentru masculi haplogenotipică.

8.4. DETERMINISMUL GENETIC AL SEXULUI LA PLANTE

Majoritatea plantelor superioare sunt hermafrodite, iar formarea elementelor sexuale este dictată de genele care se găsesc pe cromozomii autozomi.

La Zea mays, plantă tipic unisexuat monoică, s-au identificat mai multe gene care determină sexul. W. R. Singleton şi D. F. Jones (1930) au identificat gena ms 1 situată pe cromozomul 6, ce determină androsterilitatea. Studiile ulterioare de genetică a porumbului au avut ca rezultat descoperirea altor gene implicate în determinarea sexului: - gena normală Ts determină formarea paniculului normal în timp ce gena recesivă mutantă ts în stare homozigotă (tsts), inhibă formarea florilor mascule, paniculul transformându-se într-o inflorescenţă cu flori femele; - gena Sk, controlează formarea pistilului, alela sk în stare homozigotă (sksk) inhibă formarea acestuia; - gena Ba răspunde de formarea ştiuletelui, iar alela sa, ba, în stare homozigotă (baba) supresează formarea ştiuletelui.

Prin combinarea acestor gene pot rezulta o serie de genotipuri şi fenotipuri, unele având importanţă deosebită în procesul de ameliorare a porumbului. De exemplu, genotipul Ts2ts2sksk produce plantă masculă cu panicul normal, ştiulete steril, fără pistile; genotipul Ts2Ts2baba, plantă masculă cu panicul normal dar fără ştiulete; ts2ts2sksk, plantă femelă cu pistile în panicul şi ştiulete fără pistile; ts2ts2baba - plantă femelă cu pistile în panicul şi fără ştiulete.

Dioicizarea plantelor monoice poate avea o importanţă teoretică şi practică deosebită.

La plantele dioice însă, mecanismul care asigură determinarea sexelor, separate pe indivizi, deosebiţi, este asemănător animalelor. La baza acestuia stă prezenţa cromozomilor sexului, descoperiţi pentru prima dată de C. E. Allen (1917) la specia de muşchi dioică Sphaerocarpus donelli. Indivizii femeli posedă în celulele somatice 14 cromozomi autozomi şi cromozomii sexului XX, în timp ce masculii 14 cromozomi autozomi şi cromozomii sexului XY.

Mai târziu, cromozomii sexului au fost puşi în evidenţă şi la plantele superioare, cum sunt: Melandrium album, Humulus lupulus, Elodea gigantea, Rumex acetosella ş.a.

În ceea ce priveşte repartizarea cromozomilor sexului la cele două sexe, plantele se pot clasifica în mai multe categorii. După Westergaard (1958) mecanismele determinării sexelor se pot încadra în următoarele tipuri:

- Plante cu sexul mascul heterogametic (XY) şi sexul femel homogametic (XX), situaţie întâlnită la tipul Drosophila. Din acest tip fac parte specii ca: Melandrium album, Cannabis sativa, Humulus lupulus ş.a.;

- Plante cu sexul mascul heterogametic (XO) şi sexul femel homogametic (XX) întâlnit la speciile Discorea sinuata, Vallisneria spiralis ş.a.;

- Plante cu sexul mascul heterogametic, cu un cromozom în plus faţă de cel femel, întâlnit la speciile Phoradendron villosum, Phoradendron flavescens ş.a.;

- Plante cu sexul femel heterogametic (XY) şi sexul mascul homogametic (XX) aparţinând speciei Fragaria elatior.

170

- Plante cu sexul mascul heterogametic şi sexul femel homogametic cu un cromozom sexual compus din mai mulţi cromozomi legaţi sub formă de lanţ cu formula XYiY2 şi XX, întâlnit la speciile Humulus japonicus, Rumex hastatulus ş.a..

Faţă de cele arătate mai sus, trebuie menţionat că unisexualitatea plantelor superioare nu este absolută. O analiză în acest sens a fost făcută de C. Correns (1907) folosind două specii de Bryonia: B. dioica cu sexul femel XX şi sexul mascul XY şi B. alba, hermafrodită, cu formula XX.

Din încrucişarea intraspecifică a plantelor femele de Bryonia dioica cu plantele mascule de Bryonia dioica a obţinut raportul de 1:1 (plante femele : plante mascule). Aceasta a dus la concluzia că la Bryonia dioica un sex este homogametic şi altul heterogametic.

încrucişând Bryonia alba (hermafrodită) ca formă maternă cu Bryonia dioica, ca formă paternă, a obţinut în descendenţă plante dioice în raport de 50% plante femele şi 50% plante mascule. Din încrucişarea inversă, folosind Bryonia dioica ca formă maternă şi Bryonia alba ca formă paternă, au rezultat aproape exclusiv numai plante femele.

Rezultatele acestor încrucişări demonstrează că la Bryonia dioica sexul femel este homogametic, iar cel mascul heterogametic.

Spre deosebire de animale, şi în special la animalele superioare, unde există o strictă determinare a sexelor, la plantele superioare există specii dioice la care raportul de segregare între sexe variază în limite relativ mari. Aşa de exemplu, la Humulus japonicus sau la Humulus lupulus predomină indivizii femeli. La cânepă, în anumite condiţii, apare fenomenul de dublă sexualitate. Raportul dintre sexe poate fi favorabil unuia sau altuia dintre ele. Analizându-se inflorescenţele la cânepă s-a constatat că plantele mascule pot forma şi flori femele sau diferite forme tranzitorii între cele două sexe.

8.5. DETERMINISMUL GENETIC AL SEXULUI LA ORGANISMELE INFERIOARE

Organismele inferioare, vegetale sau animale, sunt supuse unor mecanisme diferite de determinare a sexelor, fie subordonate reproducerii sexuate sau asexuate, fie ambelor. Ca urmare, există diverse tipuri de sexualitate, ceea ce atestă faptul că la aceste organisme mecanismul este mai puţin specializat.

La Paramecium aurelia coexistă reproducerea asexuată cu cea sexuată. Conjugarea are loc prin formarea unei punţi de citoplasmă între doi parameci, prin care se face schimbul de nuclei. La Paramecium bursaria există mai multe tipuri care se pot încrucişa între ele prin conjugare, sexualitatea în cazul de faţă fiind numită sexualitate multiplă.

La alga Chlamydomonas eugametos, între gameţii care sunt morfologic identici, există diferenţe din punct de vedere sexual. Aceste diferenţe sunt determinate de substanţa chimică dimetilcrocetina, care are izomeri în diferite concentraţii. Aceste concentraţii duc la formarea a opt tipuri de gameţi care se pot fecunda între ei, fenomen numit sexualitate relativă.

Tot la genul Chlamydomonas există şi specii la care gameţii sunt diferenţiaţi morfologic, cei masculi mobili şi cei femeli imobili.

La plantele şi animalele inferioare există o întreagă gamă de forme de sexualitate cu diferite forme de tranziţie între înmulţirea sexuată şi asexuată.

La bacterii, fenomenul de conjugare care are loc între indivizi "masculi" notaţi cu F+ şi indivizii “femele” notate cu F", F reprezintă factorul de fertilitate şi pentru conjugare trebuie să fie prezent în mod obligatoriu în celulele mascule.

Cromozomii sexului pot îndeplini următoarele funcţii genetice:- cromozomul X poate avea gene care se găsesc localizate numai în

zonele heterologe şi care nu conjugă cu cromozomul Y. Aceste gene pot fi considerate total înlănţuite cu sexul.

- cromozomul Y posedă gene care sunt localizate numai în porţiunile sale heterologe şi care nu conjugă cu cromozomul X. Aceste gene sunt total înlănţuite cu sexul mascul şi se numesc holandrice, moştenindu-se numai pe linie masculă.

- cromozomii X şi Y pot avea gene care se găsesc localizate în zonele lor omogene, zone care pot realiza sinapsa cromozomică putând fi parţial înlănţuite cu sexul.

8.6. TEORIA CANTITATIVĂ A DETERMINĂRII SEXULUI

Cercetările au arătat că în determinarea sexului un rol important îl pot avea şi autozomii. C. B. Bridges (1925) a descoperit întâmplător o femelă triploidă de Drosophila melanogaster. Încrucişând-o cu un mascul normal obţine în descendenţă o gamă de indivizi cu diferite raporturi între numărul de autozomi (A) şi heterozomi (X). În tabelul 8.1. sunt redate aceste rezultate.

Analizând acest tabel, se constată lipsa de importanţă a cromozomului Y în determinarea sexului la Drosophila melanogaster şi faptul că raportul X/A constituie factorul ce determină sexul. Femelele sunt determinate de raportul 1,0 iar masculii de raportul 0,5. Între raportul de 1,0 şi 0,5 apar intersexe (indivizi cu caractere de mascul şi femelă). Valorile mai mici de 0,5 (0,33) determină apariţia supermasculilor, iar raportul mai mare (1,5), apariţia superfemelelor (indivizi cu organele de reproducere foarte dezvoltate). Concluzia care se poate trage din aceste cercetări este că la Drosophila melanogaster sexul este determinat de raportul dintre cromozomii sexului X şi autozomi.

171

Sexul Cromozomi sexualiCromozomi

autozomiRaportul X/A

Tabelul 8.1.

172

Superfemelă XXX 2A 1,5Femelă XX 2A 1,0Femelă XXY 2A 1,0Femelă XXX 3A 1,0Femelă XXXX 4A 1,0Intersex XXX 4A 0,75Intersex XX 3A 0,67Intersex XXY 3A 0,67Mascul X 2A 0,5Mascul XY 2A 0,5Mascul XYY 2A 0,5Mascul XX 4A 0,5

Supermascul X 3A 0,33

La Melandrium album, specie dioică, raportul dintre cromozomii X şi Y are importanţă pentru determinarea sexului. Plantele femele au formula 22A + XX, iar cele mascule 22A + XY. In cazul de faţă, genele pentru determinarea sexului femel sunt plasate pe cromozomul X, iar cele pentru sexul mascul, pe cromozomul Y.

Prin tratarea plantelor de Melandrium album cu colchicină, pentru multiplicarea cromozomilor, s-au obţinut diferite tipuri de plante din punct de vedere al sexului. In tabelul 8.2. sunt redate aceste tipuri de plante.

Tabelul 8.2.Raportul X/Y a Melandrium album şi determinarea sexului

SexulCromozomi

autozomiCromozomi

XCromozomi

YRaportul

X/YFemel 2A XX - 0,0Mascul 2A X YY 0,5

Mascul2A X Y

1,03A X Y4A X Y

Mascul 4A XXX YY 1,5

Masculi ocazionali cu flori S şi Ş

2A XX Y

2,03A XX Y4A XX Y4A XXXX YY

Masculi ocazionali cu flori S şi Ş

3A XXX Y3,04A XXX Y

Plante Ş şi S ocazional cu flori S şi Ş

4A XXXX Y 4,0

In cazul de faţă, sexul este determinat de prezenţa cromozomului Y care este aproximativ egal cu patru cromozomi X.

173

8.7. ANOMALII ÎN EREDITATEA SEXULUI

8.7.1. GinandromorfismulPrin ginandromorfism se înţelege însumarea unor caractere de mascul şi femelă

la acelaşi individ. Fenomenul se manifestă destul de rar şi este sesizabil când părinţii prezintă un pronunţat dimorfism sexual.

După repartiţia spaţială a caracterelor celor două sexe,ginandromorfismul se poate clasifica în mai multe tipuri:

- lateral, când o jumătate laterală a corpului conţine însuşirile externe şi organele de reproducere ale sexului femel, iar cealaltă jumătate, însuşirile externe şi organele de reproducere a sexului mascul;

- antero-posterior, caracterizat prin aceea că partea anterioară a corpului prezintă caracterele unui sex, iar partea posterioară, caracterele celuilalt sex;

- mozaicat, pe o mare parte din corp organismul prezintă însuşirile unuia dintre sexe, şi pe mici porţiuni, însuşirile celuilalt sex. Această repartizare asimetrică poate avea loc în toate părţile corpului: cap, aripi, trunchi etc.

Ginandromorfismul se întâlneşte mai frecvent la Bombyx mori, piţigoi, fazani, şoareci ş.a. Poate să apară şi în unele încrucişări artificiale la diferite specii. Astfel, din încrucişarea unor masculi de Drosophila cu ochi albi cu femele cu ochi roşii poate să apară, în rare cazuri, ginandromorfismul lateral; indivizi ce posedă jumătate de corp cu caractere de femelă şi cu ochiul roşu, iar cealaltă jumătate de corp cu caractere de mascul şi cu ochiul alb (figura 8.2).

Cercetările citologice la aceşti indivizi dovedesc că o jumătate de corp posedă cromozomii

Fig. 8.2. Ginandromorfismul lateralla Drosophila melanogaster

174

XX, iar cealaltă jumătate numai un singur X (XO). De aceea, pe o jumătate de corp se găsesc caractere de femelă, iar pe cealaltă caractere mascule (prezenţa unui singur cromozom X produce fenotip de mascul). Repartiţia inegală de substanţă cromatică are loc după fecundare, în primele faze de diviziune ale oului. Datorită unor condiţii deosebite unul din cromozomii sexului X care poartă gena culorii roşii se pierde în una din celulele fiice. Ca urmare, se naşte o celulă cu un singur X, iar cea de a doua cu XX.Dacă eliminarea unuia dintre cromozomii sexului are loc în una din cele patru celule ale embrionului, atunci numai % din corpul femelei va avea caractere de mascul. În procesul de diviziune al oului, cu cât această pierdere se produce mai târziu, cu atât mai puţin va fi neprezentată partea cu caractere mascule.

175

În afară de pierderea cromozomilor sexuali, mai există şi alte cauze ce pot determina apariţia ginandromorfismului. Un exemplu a fost descris la fluturele Bombyx mori. Oul poate conţine doi pronuclei, unul cu cromozomul X, iar celălalt cu cromozomul Y. Prin fecundarea lor cu spermatozoizi purtători ai cromozomului X, pot rezulta ginandromorfi laterali (XX/XY)

8.7.2. IntersexualismulPrin intersexualism se înţelege repartiţia mozaicată a caracterelor sexuale

primare, în descendenţa unor hibrizi. În unele cazuri, variaţiunile merg atât de departe încât femelele seamănă foarte mult cu masculii şi invers. La Drosophila se cunosc asemenea forme intersexuale, care sunt triploide.

Spre deosebire de ginandromofism, intersexualismul se caracterizează prin însumarea caracterului mozaicat şi nu în mod distinct sau simetric. Ginandromorfii alcătuiesc un mozaic sexual dezvoltat în suprafaţă, caracterele sunt alăturate, pe când intersexualii alcătuiesc mozaicuri sexuale dezvoltate în timp. Organismul îşi începe dezvoltarea având caracterele unui sex dominant, după care, pe parcursul dezvoltării, şi-o continuă dobândind caracterul celuilalt sex.

Observaţiile care s-au acumulat cu privire la cauzele care duc la apariţia intersexelor au dus la presupunerea că sexul organismelor poate fi determinat de mai multe gene ce se află atât în cromozomii sexului cât şi în autozomi şi dezvoltarea lui poate fi influenţată de condiţiile de mediu. De asemenea, s-a întărit şi ideea că zigotul are o bisexualitate potenţială care poate evolua într-una din direcţiile celor două sexe.

Intersexualitatea este explicată prin două teorii: teoria cantitativă (sau a echilibrului genetic), formulată de C. B. Bridges şi teoria fiziologică fundamentată de R. Goldschmidt.

Teoria cantitativă a determinării sexului explică apariţia diferitelor forme sexuale la Drosophila. Intersexele se dezvoltă atunci când raportul X/A are valoare de 0,67, intermediară raporturilor ce duc la formarea de masculi (0,5) şi de femele (1,0).

Teoria fiziologică a determinării sexului a fost formulată de R. Goldschmidt. Punctul de plecare a fost ipoteza că organismele, la începutul dezvoltării lor, din punct de vedere genetic sunt bisexuate, posedând factorii ambelor sexe: M pentru sexul mascul şi F pentru sexul femel. Aceşti factori ar aparţine unor perechi de cromozomi diferiţi.

Cercetările în această direcţie s-au bazat pe unele forme intersexuate obţinute în urma unor încrucişări reciproce între două specii de fluturi, îndepărtate geografic: Lymantria dispar (europeană) şi Lymantria japonica (japoneză). S-a folosit pe rând ca mamă şi ca tată cele două specii:

1. P1 Ş Lymantria dispar X S Lymantria japonicaF1 Ş intersexuate S normali

raport 1 : 12. P2 Ş Lymantria japonica X S Lymantria dispar

F1 Ş normale S normaliraport 1 : 1

Rezultatele obţinute depind de modul în care cele două specii sunt folosite ca

176

mamă şi ca tată.Concluzia este că specia europeană este considerată “slabă”, iar cea japonica

“puternică”. Aceasta se bazează pe faptul că femelele speciei europene când sunt încrucişate cu masculii speciei japoneze, în F1 se dezvoltă indivizi intersexuaţi de tip femel.

8.8. EREDITATEA CARACTERELOR LEGATE DE SEX

La hibridări, în general, nu are importanţă dacă un caracter homozigot urmărit se găseşte în autozomii mamei sau tatălui. Autozomii nu afectează într-un anumit mod segregarea caracterelor în descendenţă.

În cazul în care aceste caractere (gene) se găsesc în cromozomii sexului, caracterul eredităţii şi al segregării este condiţionat de modul de comportare al cromozomilor sexului în meioză şi, mai apoi, în procesul fecundării.

Deoarece cromozomul Y este aproape inert - nu conţine gene - genele care se găsesc în cromozomul X nu au pereche alelică. Ca urmare, distribuirea lor este legată de distribuirea acestor cromozomi.

Moştenirea caracterelor care sunt localizate în cromozomii sexului se mai numeşte şi ereditate legată de sex şi ea se comportă diferit după cum organismele se încadrează în diferite tipuri de determinare a sexelor: Drosophila sau Abraxas.

8.8.1. Ereditatea legată de sex în cazul heterogamiei sexului mascul (Drosophila)

Pentru a ilustra în ce constă la organismele care au sexul mascul heterogametic şi sexul femel homogametic, mecanismul de transmitere a caracterelor legate de sex, ne vom folosi de o experienţă efectuată de Morgan laDrosophila.

El încrucişează masculi cu ochi albi (o formă mutantă) cu femele cu ochi roşii (de tip sălbatic) şi obţine în prima generaţie în proporţii egale, masculi şi femele cu ochi roşii, caracter dominant, culoarea albă fiind recesivă. Încrucişaţi între ei, indivizii din F 1

produc în F2 o segregare, după sex, 50% femele şi 50% masculi, iar după caracterul studiat, la 3/4 indivizi cu ochi roşii se obţine 1/4 masculi cu ochi albi (raportul 3:1). Notând cu w+ culoarea roşie a ochilor, cu w culoarea albă a ochilor, iar cu linii verticale cromozomii sexului, rezultatele sunt redate în următoarea schemă (figura 8.3 A).

Faptul că în această experienţă apar masculi atât cu ochi roşii cât şi cu ochi albi, dovedeşte că ei sunt heterogametici şi formează două tipuri de gameţi.

177

Să vedem ce se întâmplă când se încrucişează femelele cu ochi albi, cu masculii cu ochi roşii. Segregarea are loc deja în F1; unde se produc toate combinaţiile posibile. Raportul între sexe pentru culoarea ochilor a fost de 1:1. Prin încrucişarea între ei a indivizilor din F1, apar în F2 femele şi masculi, 50% cu ochi roşii şi 50% cu ochi albi (figura 8.3 B).

În experienţele descrise se poate sesiza că genele care determină culoarea ochilor sunt situate în cromozomii X.

w ;| |” * j\.

•I - M' r\ x j

M I1 * i fc*X V- 1 r

1A Iî

v ir~* , ■

Iţ

a- ti 1lf*

A BFig. 8.3. Ereditatea caracterelor cuplate cu sexul (culoarea ochilor) în cazul heterogamiei

sexului mascul (A-încrucişarea directă; B-încrucişarea reciprocă)

Din schemele prezentate reiese că dacă femela este homozigotă pentru gena dominantă a ochilor roşii aflată în cromozomul X, atunci culoarea roşie a ochilor se transmite în F1 şi masculilor. Femelele din F1 primesc cromozomul X cu gena recesivă a culorii albe a ochilor de la tată, iar de la mamă al doilea cromozom ce conţine gena dominantă a culorii roşii. Sub influenţa genei ce produce culoarea roşie a ochilor toate femelele au ochii roşii. În F2 prin combinarea diferită a gameţilor apar combinaţiile arătate la prima experienţă.

În cazul celei de-a doua experienţe (încrucişare reciprocă), femelele primesc de la tată un cromozom cu gena dominantă a culorii roşii a ochilor şi de la mamă un cromozom cu gena recesivă a culorii albe a ochilor. Din această cauză femelele din F 1 au ochii roşii. Masculii din F1 au ochii albi, deoarece primesc de la tată cromozomul Y care este inert, iar de la mamă un cromozom ce conţine gena recesivă a culorii albe a ochilor. Gena, deşi este recesivă, se exteriorizează, nefiind dominată de alela sa. Ea se găseşte într-o singură doză, stare numită hemizigotă.

Moştenirea caracterelor legate de sex, de la mamă la fiu şi de la tată la fiică, poartă denumirea de “criss-cross”. Schemele pentru ereditatea culorii

ochilor cuplate cu sexul la Drosophila, sunt valabile şi pentru alte caractere, şi la alte specii, a căror gene sunt situate pe cromozomul X, la organismele la care sexul heterogametic este masculul. Au fost studiate asemenea cazuri la insecte, peşti, păsări, mamifere. La om se cunosc unele însuşiri cuplate cu sexul: daltonismul, hemofilia ş.a. Deoarece sexul mascul la om este heterogametic, aceste boli se manifestă frecvent la acest sex. Să considerăm cazul hemofiliei, boală dată de caracterul recesiv (h) situat pe cromozomul X. Femelele normale vor avea caracterul NN (normal), iar masculii hemofili, caracterul h în stare hemizigotă.

8.8.2. Ereditatea în cazul nondisjuncţiei cromozomilor sexului în meioză

În cea de-a doua experienţă cu Drosophila, când s-au încrucişat femelele cu ochi albi cu masculii cu ochi roşii raporturile din F2 de 50% femele cu ochi roşii şi 50% masculi cu ochi albi nu sunt perfecte.

În experienţa lui C. B. Bridges (1913) la Drosophila, prin încrucişarea dintre femele cu ochi albi şi masculi cu ochi roşii., el obţine:

Ş 47,5% ochi roşii şi 2,5% ochi albi S 47,5% ochi albi şi 2,5% ochi roşii

Raportul dintre sexe rămâne neschimbat, de 1:1, dar apar unele forme neaşteptate: 2,5% femele cu ochi albi şi 2,5% masculi cu ochi roşii. Care este explicaţia dată de C.B. Bridges?

În timpul meiozei, la unele femele cromozomii X nu se separă. Ca urmare a acestui fenomen se formează două tipuri de gameţi: unii cu XX, iar alţii fără cromozomii sexului. Nesepararea aceasta a fost denumită de Bridges “nondisjuncţie primară”, iar rezultatul este apariţia acelor procente de 2,5% femele cu ochi albi şi 2,5% masculi cu ochii roşii (figura 8.4.).

Se constată că cromozomii X de origine paternă conţin gena pentru culoarea

Fig. 8.4. Ereditatea caracterelor cuplate cu sexul la Drosophila melanogaster în cazul non-disjuncţiei

cromozomilor x 177

179

roşie a ochilor iar cromozomii X de origine maternă gena pentru culoarea albă a ochilor. Se mai constată de asemenea, că indivizii ce conţin XXX sau numai Y, mor datorită homozigotării genelor.

Se mai constată că, în cazul de faţă, nu numai prezenţa cromozomului Y este aceea care determină sexul mascul ci şi numărul cromozomilor X. In cazul a doi cromozomi X, sexul este femel, în cazul unui singur cromozom X, sexul este mascul şi steril.

Dacă se continuă experienţa citată mai sus şi se încrucişează o femelă cu ochi albi XXY (obţinută prin nondisjuncţie primară) cu un mascul cu ochi roşii, descendenţele din Fb segregă în ceea ce priveşte sexul şi culoarea ochilor, în raport de 1:1. Apar însă şi forme neaşteptate, mascul cu ochi roşii, asemenea tatălui şi fiice cu ochi albi, asemenea mamei.

Femela poate forma gameţi în două moduri:- prin disjuncţia celor doi cromozomi XX care duce la formarea unor

ovule cu formula XX sau XY, fenomen numit “homeosinapsis”.- prin segregarea cromozomilor XX sau a cromozomilor XY care duce la

formarea a patru tipuri de ovule X, XX, XY sau Y, fenomen numit“heterosinapsis”.

Apariţia formelor neaşteptate se datorează, după Bridges, fenomenului numit de el “nondisjuncţie secundară”.

8.8.3. Ereditatea legată de sex în cazul heterogamiei sexului femei

Este cazul tipului Abraxas, femelele fiind heterogametice (XY) şi masculii homogametici (XX).

Primii cercetători care s-au ocupat cu această problemă au fost Dancaster şi Rayner. Ei au plecat de la unele observaţii asupra fluturelui Abraxas. La acest fluture există foarte rar în natură o varietate de culoare albă, lacticolor, iar atunci când se întâlneşte, toţi indivizii sunt femele. Mai frecvent, se întâlneşte varietatea Abraxas grossulariata de culoare alb-cenuşie, cu pete brune. In laborator se pot obţine atât masculi cât şi femele de tipul lacticolor.

S-au făcut încrucişări între aceste două varietăţi urmărind raportul dintre sexe şi culoarea corpului în descendenţă. Rezultatele sunt prezentate schematic în figura 8.5. A.

Din experienţa de mai sus reiese că “grossulariata” este dominant, iar “lacticolor” recesiv. In F1 s-au obţinut 50% femele de tip lacticolor şi 50% masculi de tip grossulariata, iar prin încrucişare între ei s-a obţinut în F2 o segregare între sexe şi culori de 1:1. Se constată totodată, că tipul lacticolor este un caracter linkat cu sexul femel. Dacă se încrucişează reciproc aceste două tipuri, se obţin rezultatele din figura 8.5. B.

180

Indivizii din Fj, de ambele sexe, au fost de tipul grossulariata. încrucişaţi între ei, în F2 raportul de segregare a fost de % indivizi de tipul grossulariata şi % indivizi de tipul lacticolor, numai de sex femel. Caracterul de culoare este cuplat cu sexul femel.

Fig. 8.5. Ereditatea caracterelor cuplate cu sexul (culoarea aripilor) la fluturele Abraxas (A-încrucişarea directă; B-încrucişarea reciprocă)

Experienţe analoge s-au făcut cu rase de găini, ce au culoarea penajului diferită. Peral şi Surface încrucişează găini negre din rasa Indian-Same cu găini pestriţe din rasa Plymouth-Rock; Morgan şi Goodale încrucişează găini cu penaj negru din rasa Langsham cu găini pestriţe din rasa Plymouth-Rock. La încrucişările dintre femele cu penajul negru cu masculii homozigoţi cu penaj pestriţ (dominant) s-a obţinut întotdeauna generaţia Fi cu penaj pestriţ. Din încrucişările lor cu părintele cu caracter recesiv (culoare neagră) se obţine raportul de segregare de 50% găini cu penaj negru şi 50% cocoşi cu penaj pestriţ. De aici se observă că femelele pestriţe sunt heterozigote şi formează două tipuri de ovule (ca la Abraxas), atât pentru caracterul culoare, cât şi pentru sex. Masculii sunt homozigoţi pentru ambele caractere.

Importanţa practică a eredităţii legate de sex. Problema eredităţii legată de sex prezintă importanţă pentru practică, deoarece caracterele cuplate cu sexul pot să ne dea indicaţii privind separarea indivizilor după sex, la o vârstă tânără. Trebuie însă bine precizat mecanismul corelaţiilor dintre sex şi caracter, la specia unde vrem să aplicăm asemenea procedee.

în avicultură se foloseşte procedeul separării celor două sexe după unele caractere exterioare ale puilor de găină abia eclozaţi.

La fluturele Bombyx mori, se pot separa cele două sexe chiar din stadiul de ou, după culoarea lui.

B

A

181

8.9. CARACTERELE INFLUENŢATE DE SEX9

Caracterele influenţate de sex sunt caractere determinate de gene prezente la ambele sexe, dar care se manifestă în funcţie de sex.

La oi şi capre, dimorfismul sexual se manifestă şi prin prezenţa coarnelor la masculi şi absenţa lor la femele. Rasa de oi Dorset prezintă coarne atât la masculi cât şi la femele; în schimb la rasa de oi Suffolk, ambele sexe sunt fără coarne.

S-a considerat că rasa Dorset posedă o genă dominantă C, în timp ce rasa Suffolk deţine gena recesivă c. Din încrucişarea celor două rase CC x cc, la indivizii din prima generaţie, masculii au coarne, iar femelele nu. Prin încrucişarea între ei a heterozigoţilor din prima generaţie, se obţin în F2 atât masculi cât şi femele cu coarne şi fără coarne şi anume: masculi cu coarne (25% CC + 50% Cc) şi fără coarne (25% cc) şi femele cu coarne (25% CC) şi fără coarne (50% Cc + 25% cc).

Din analiza acestor încrucişări se poate trage concluzia că gena C se manifestă în mod diferit la mascul şi femelă: la masculi ea este dominantă, iar la femele recesivă. Această constatare reiese din faptul că heterozigoţii Cc din Fi, toţi cu aceeaşi formulă genetică, formează coarne numai la mascul. Gena C este influenţată în acţiunea ei de hormonii secretaţi de glandele sexuale. Masculii heterozigoţi castraţi nu au coarne.

8.10. CARACTERELE LIMITATE DE SEX

Unele trăsături care determină dimorfismul sexual pot să se manifeste numai la unul dintre sexe. Fenomenul poartă numele de sex-limitare. De exemplu, producţia de lapte sau de ouă priveşte numai sexul femel. Deşi aceste caractere se manifestă numai la un sex, ele sunt purtate şi transmise de ambele sexe. Producţia de lapte este o însuşire ereditară pe care o transmite şi taurul provenit din vaci cu producţie mare de lapte. Aceste caractere şi însuşiri se realizează prin genele situate pe cromozomii autozomi, dar se manifestă numai la un sex.

8.11. INVERSIUNEA SEXULUI

Prin inversiunea sexului se înţelege schimbarea sexului în cursul ontogeniei. Aceasta este o confirmare în plus asupra stării de bisexualitate a organismului în primele stadii de dezvoltare.

Cazuri de inversiune sexuală se întâlnesc atât în lumea plantelor cât şi a animalelor. Ele pot fi naturale cât şi artificiale, iar cauzele pot fi multiple: condiţiile de viaţă (în special hrana), activitatea hormonală (legată de sex), vârsta ş.a.

Spre bătrâneţe sexele tind să capete unele caractere ale sexului opus. Femelele de fazan încetează a mai oua, penajul are caracterele masculului. Sunt peşti care la tinereţe sunt masculi, iar la bătrâneţe produc icre. Peştele sabie (Xiphophorus - crescut în acvarii) are dimorfismul sexual distinct: masculul are o prelungire a înotătoarei codale în formă de sabie, care la femelă lipseşte. Uneori femelele bătrâne se transformă în masculi şi le creşte aripa codală în formă de sabie. Unii batracieni, imediat după metamorfoză sunt femele, iar mai târziu, la unele, ovarul se transformă în testicule, devenind masculi.

S-a vorbit mai înainte de un caz evident de dimorfism sexual, la viermele marin Bonellia viridis. Baltzer a studiat îndeaproape viaţa acestui vierme. El trăieşte în Mediterana, pe fundul apei, printre pietre. Masculii trăiesc ca paraziţi în esofagul şi

182

oviductul femelei. Când larvele acestui vierme trăiesc libere în apă, ele devin femele. Dacă ele se fixează pe trompa unei femele adulte, în timp de câteva zile se transformă în masculi. În cazul fixării, ele primesc de la femelă substanţe chimice capabile să diferenţieze larvele în masculi. Aceasta a dovedit-o W. Nowinski (1934), ţinând larvele de Bonellia viridis libere, în extract de trompă sau intestin de femelă. Ele au devenit masculi.

Fenomenul de inversiune poate apare la gemenii uterini, la animale care nasc de obicei un singur pui. Cercetările pe care le face F. R. Lillie (1916) la taurine au arătat că în cazul gemenilor uterini de sexe diferite, sexul mascul este normal, iar cel femel este steril. Femelele capătă tuburi seminale sterile şi în plus şi canale deferente proprii organelor de reproducere a masculilor. Restul organelor genitale propriu-zise împreună cu glandele mamare sunt normale.

Aceste rudimente ale sexului mascul există în mod normal la femele, dar ele nu se dezvoltă când există o sarcină cu un singur embrion. În cazul gemenilor uterini de sexe opuse, dezvoltarea embrionară a masculului decurge mai repede. Prin sistemul vascular ce leagă cei doi gemeni, secreţiile hormonale ale masculului stimulează dezvoltarea rudimentelor de la organul genital mascul şi opreşte în acelaşi timp dezvoltarea unor părţi ale organului genital propriu.

Cazurile de inversiune sexuală se întâlnesc rar în natură, ceva mai frecvent la organismele inferioare. Experimental ele se pot obţine, dar nu în toate cazurile. De multe ori, după încetarea acţiunii factorului pentru inversarea sexului, organismul revine la sexul iniţial. Inversiunea sexului poate să aibă loc şi la plante. S-au făcut unele cercetări cu hormoni vegetali din grupa auxinelor sau chiar cu hormoni animali. V. Preda (1968) şi C. Panfil (1972) au reuşit să feminizeze plantele de porumb, care produceau fructe în inflorescenţa masculă, prin tratarea plantelor cu hormon animal gonadotrop corial.

8.12. RAPORTUL DINTRE SEXE

În general, în natură, raportul dintre sexe este de 1:1. Segregarea după sex este asigurată de mecanismul cromozomic de determinare a sexului şi se mai numeşte şi raport primar.

Acest raport poate fi schimbat într-o măsură mai mare sau mai mică în timpul ontogeniei, datorită influenţei mai multor factori, numindu-se raport secundar. În general, raportul secundar se schimbă mai frecvent în favoarea sexului femel, care este mai dotat cu calităţi de rezistenţă faţă de condiţiile nefavorabile de viaţă.

După datele statistice ale populaţiei umane, în diferite ţări s-a constatat că raportul între femei şi bărbaţi scade în favoarea femeilor pe măsură ce creşte vârsta: la vârsta şcolară 103/100, la pubertate 100/100, la 50 de ani 100/85, iar la 85 de ani 100/50. Cauzele sunt atât biologice cât şi sociale.

La unele specii de Drosophila s-au descoperit femele monosexuate, care dau în descendenţă numai femele. Monosexualitatea în cazul de faţă se datorează incompatibilităţii dintre citoplasma ovulelor şi genele cromozomului Y. Mor astfel 50% dintre zigoţii de sex masculin.

Schimbarea raportului între sexe poate să survină şi în cazul când apar, prin mutaţii, gene letale în cromozomii sexului. Aceste mutaţii sunt legate de sex şi au permis elaborarea unor metode de detectare a mutaţiilor.

In problema determinării sexelor s-au obţinut unele rezultate şi la plante. A. A.

183

Avachian constată că unele soiuri de pepene galben, cultivat în condiţii de zi lungă, formează numai flori bărbăteşti, florile femeieşti se scutură şi se usucă. De asemenea, el constată că dacă porumbul imediat după ce a răsărit este pus în condiţii de zi scurtă, formează inflorescenţe femele în locul celor mascule.

Alte experienţe au arătat că numărul de flori femele poate fi mărit la castraveţi prin afumarea plantelor sau tratarea lor cu oxid de carbon.

La noi în ţară, P. Raicu şi T. Crăciun au făcut observaţii privitoare la modificarea inflorescenţei de porumb în raport cu intensitatea luminozităţii.

V. Preda şi A. Ghişa au efectuat experienţe de dirijarea sexului la Urtica dioica prin administrarea de hormon gonadotrop corial. S-a mărit procentul de plante cu inflorescenţe femele.

Schimbarea raportului dintre sexe nu se bazează pe schimbarea mecanismului cromozomic sau a genelor care răspund de determinarea sexului. Factorii interni sau externi despre care s-a vorbit modifică raportul, favorizând într-un anumit mod întâlnirea lor în momentul fecundării. In cazul în care cromozomii sexuali lipsesc, influenţa factorilor interni sau externi se manifestă asupra anumitor gene de pe autozomi, care intervin în determinarea sexului.

CAPITOLUL 9 EREDITATEA EXTRANUCLEARĂ

Moto:"Oul fecundat este cea mai specializată celulă de sub soare. Ea conţine toată informaţia necesară pentru a produce viaţa umană”

Jerome Lejeune

Încă din secolul XIX, cercetările au arătat că alături de nucleu şi citoplasmă prezintă un rol important în transmiterea caracterelor ereditare.

O serie de geneticieni ca: E. Baur şi C. Correns (1909), A. Winkler (1934), E. Wettstein (1937), J. M. Sirks (1938), T. M. Sonneborn (1950), P. Michaelis (1954), R. Hagemann (1959) ş.a. au întreprins cercetări în acest domeniu, evidenţiind multe aspecte legate de ereditatea citoplasmatică sau extranucleară.

Prin fenomenul de ereditate extranucleară se înţelege moştenirea caracterelor şi însuşirilor organismului prin elementele citoplasmatice.

Pentru a pune în evidenţă rolul citoplasmei în ereditate, trebuie să arătăm ce structuri posedă aceste însuşiri, dacă au sau nu proprietatea de a se reproduce, de a se modifica şi transmite aceste modificări la generaţia următoare şi care sunt metodele de cercetare.

S-a arătat într-un capitol anterior, că în citoplasma celulei se găsesc diferite structuri care au rol genetic, fără a analiza în ce constă acest rol şi cum poate fi pus în evidenţă. Vom căuta să lămurim aceste probleme în capitolul de faţă.

184

9.1. METODE DE EVIDENŢIERE A EREDITĂŢII EXTRANUCLEARE

Ereditatea extranucleară se evidenţiază prin mai multe metode:- fecundarea unui ovul anucleat de la o specie, cu un spermatozoid de la

altă specie (merogonie);- hibridarea reciprocă;- prin intermediul incluziunilor şi organitelor citoplasmatice;- testul heterocarion;- segregarea nemendeliană;9.1.1. Fenomenul merogoniei

Prin merogonie se înţelege formarea unui embrion prin fecundarea unui ovul anucleat cu un spermatozoid normal. Din fecundarea unui ovul anucleat cu un nucleu străin, rezultă un zigot haploid, deoarece posedă nucleul patern, haploid şi citoplasmă maternă. In astfel de cazuri, nu se obţin organisme mature deoarece zigoţii, din cauza perturbării raportului dintre nucleu şi citoplasmă, mor într-un stadiu timpuriu.

Primele indicaţii asupra existenţei acestui fenomen au fost experienţele embriologului T. Boveri (1899). El a folosit ovule de arici de mare pe care le-a centrifugat puternic, astfel încât membrana lor s-a rupt, nucleul fiind expulzat. Aceste ovule anucleate au fost fecundate cu spermatozoizi de la o specie înrudită - crinul de mare. Larvele obţinute erau haploide şi conţineau pe lângă caracterele tatălui şi caracterele materne, transmise prin intermediul citoplasmei ovulului.

In afară de metoda centrifugării, nucleii din ovul pot fi îndepărtaţi şi cu ajutorul micromanipulatorului, prin operaţii de microdisecţie, sau cu ajutorul unei micropipete, prin aspirare.

O altă metodă folosită este distrugerea nucleilor din celulă cu ajutorul şocurilor de temperatură, a radiaţiilor ionizante, a razelor ultraviolete sau a unor substanţe chimice.

Folosind unele din aceste metode I. Danielli şi colab. (1957) au înlocuit nucleii de la Amoeba discoides, cu nucleii de la Amoeba proteus. Nucleii transplantaţi au suferit influenţa citoplasmei străine, modificându-şi forma în sensul nucleilor de la Amoeba discoides.

Cercetări interesante de acest gen s-au efectuat şi cu specii din genul Triton (Triton palmatus şi Triton cristatus) de către Paula Hertwig (1936, 1942), V. Curry (1931) ş.a., în care nucleii din ovule au fost distruşi prin iradiere. Ereditatea citoplasmatică a fost pusă în evidenţă la embrionii proveniţi prin fecundarea acestor ovule cu nucleii de la altă specie. Embrionii însă se dezvoltau numai până în faza de blastulă, apoi mureau.

Elveţianul E. Hadorn (1955) a reuşit să înlăture acest neajuns procedând în felul următor: fecundează ovule anucleate de Triton palmatus cu spermatozoizi de la specia Triton cristatus. Din embrionii rezultaţi a desprins o porţiune de epidermă şi a transplantat-o pe embrionii speciei Triton alpestris. Indivizii rezultaţi aveau porţiunea de epidermă transplantată asemănătoare ca aspect şi culoare cu cea de la Triton palmatus. Citoplasma ovulului de Triton palmatus şi-a imprimat deci caracterele epidermei transplantate, la embrionul nou format.

185

9.1.2. Ereditatea extranucleară în hibridarea reciprocă

In încrucişările formelor îndepărtate (interspecifice şi intergenerice), apare foarte frecvent fenomenul de matroclinie, prin care se înţelege transmiterea evidentă a unor caractere materne. De aceea, la astfel de hibridări nu este indiferent care dintre cele două specii constituie forma maternă sau paternă.

Practica a demonstrat că la hibridarea dintre Equus caballus şi Equus asinus se obţin hibrizi a căror mărime şi constituţie este asemănătoare formei materne. Din hibridarea dintre Ş Equus caballus şi S Equus asinus rezultă catârul (Equus mullus), de mărimea şi conformaţia lui Equus caballus, iar din hibridarea dintre Ş Equus asinus şi S Equus caballus rezultă bardoul (Equus hinnus) de mărimea şi conformaţia lui Equus asinus. Cei doi hibrizi se deosebesc foarte mult ca mărime, culoare, forţă ş.a., deşi, în celulele somatice au acelaşi număr de cromozomi, (2n = 63).

9.1.3. Testul heterocarion

Prin heterocarion se înţelege o celulă în care, pe lângă nucleul propriu, mai există inclus un nucleu străin. În urma includerii unui nucleu străin se formează un dicarion, o celulă cu doi nuclei. Fenomenul a fost pus în evidenţă la ciupercile inferioare, care se înmulţesc asexuat.

Realizări în această direcţie au fost obţinute de către R.E. Wright şi J. Lederberg (1957) la drojdia de bere, Saccharomyces cerevisiae. Dacă notăm, la o primă celulă nucleul cu A şi citoplasma cu a, iar la a doua celulă nucleul cu B şi citoplasma cu P, dicarionul, format prin transferul nucleului B în celula a va deveni AB. În descendenţa acestuia vor rezulta celulele cu A a şi B p. Cu această ocazie se constată că celulele B manifestă caracteristici ale celulei A. Rezultă că, aceste caracteristici sunt transmise prin citoplasma a şi nu de nucleu (figura 9.1).

Fig. 9.1. Schema formării celulelor heterocarion

9.1.4. Segregarea nemendelianăExistă la drojdia de bere, Saccharomyces cerevisiae, o mutantă determinată de

o genă recesivă homozigotă “petite” şi care determină formarea unor colonii mici autosterile. Prin fuzionarea unor celule haploide mutante cu celule haploide normale se formează celule heterocarion, fertile, ce se înmulţesc prin înmugurire şi formează colonii normale. În anumite condiţii celulele haploide mutante şi normale pot fuziona pe cale sexuată dând naştere unei asce cu patru ascospori haploizi, doi cu gene normale şi doi cu gene mutante. Cu toate acestea, toţi cei patru ascospori, prin înmulţire sexuată, au dat

186

naştere la colonii normale. Lipsa de segregare care ar fi trebuit să se producă în raport de 1:1 dovedeşte că expresia fenotipică a celor patru ascospori este de natură citoplasmatică.

Tot la drojdia de bere B. Ephrussi, H. Hottingner şi H. Roman (1955) au studiat o altă mutantă denumită “suppressive petite”. Din fuzionarea unei celule mutante cu o celulă normală s-au obţinut în descendenţă asce cu ascospori normali şi mutanţi în proporţie egală, deşi ambele conţin acelaşi genotip. Aceasta dovedeşte că segregarea nemendeliană a fost influenţată de către citoplasmă.

Segregarea somatică se manifestă în cazul înmulţirii vegetative şi se explică prin distribuirea inegală a structurilor citoplasmatice implicate în determinarea unor caractere. Această situaţie imprimă la organisme un aspect de pestriţ sau vărgat.

Un exemplu ni-l oferă segregarea plastidelor în cazul plantei Mirabilis jalapa var. “albomaculatus” la care, plante pestriţe conţin plastide verzi şi albe.

Acestea se repartizează prin mitoză în mod întâmplător în citoplasma celulelor fiice. Când din astfel de celule se formează celulele mamă ale megasporilor şi în continuare celule sexuale, acestea vor conţine proplastide verzi, albe sau de ambele tipuri. În urma fecundării se vor dezvolta plante verzi, albe sau pestriţe.

9.2. MANIFESTAREA EREDITĂŢII EXTRANUCLEARE9

Tipurile de manifestare a eredităţii extranucleare îmbracă diferite forme şi ele depind de structurile din citoplasmă care poartă şi transmit anumite caractere.

9.2.1. Ereditatea prin plastide

Primii cercetători care au pus în evidenţă ereditatea prin plastide au fost C. Correns (1909) şi E. Baur (1910).

E. Baur a studiat ereditatea culorilor mozaicate, la Pelargonium zonale. Această plantă posedă frunze pestriţe (alb-gălbui cu verde). Observând la microscop secţiuni din aceste frunze, se constată existenţa unor grupe de celule cu plastide necolorate în epiderma şi sub epiderma frunzei, în timp ce în partea centrală a ei se găsesc plastide verzi (cloroplaste). La această plantă pot să apară, uneori, atât ramuri cu frunzele pestriţe, cât şi ramuri cu frunze verzi sau albe. Executând hibridări între flori de pe ramuri cu frunze diferite, el obţine seminţe care produc în majoritatea cazurilor plante ce au caracterele frunzelor de la forma mamă.

Aceste încrucişări ne arată că transmiterea cloroplastelor la urmaşi se realizează prin citoplasma celulei ou şi într-o mică măsură de către spermatie, care are o cantitate mică de citoplasmă.

C. Correns, descrie un caz de ereditate citoplasmatică la Mirabilis jalapa. Această plantă are ramuri cu frunze verzi, albe şi mozaicate. El a efectuat polenizarea florilor de pe ramurile verzi, albe şi pestriţe, cu polenul de la florile acestor trei tipuri. Plantele pe care le-a obţinut din seminţe au avut caracterul mamei în ceea ce priveşte culoarea frunzelor. Fenomene asemănătoare au fost observate la Anthirrinum sp., Plantago sp., Humulus sp. ş.a.

186O dovadă certă că într-adevăr cloroplastele se transmit numai pe cale

citoplasmatică este faptul că ele posedă un mecanism de autoreproducere şi continuitate celulară. Plantele la care au fost distruse plastidele dau urmaşi fără plastide, nefiind capabile de a le sintetiza “de novo”.

188

9.2.2. Ereditatea prin intermediul incluziunilor citoplasmatice

În afară de mitocondrii sau plastide, prin citoplasmă se transmit şi particule submicroscopice ce au proprietatea de a se reproduce odată cu diviziunea celulei. Aceste particule nu sunt deocamdată elemente separabile ale celulei vii, dar pot fi responsabile pentru transmiterea unor însuşiri pe linie maternă.

Un exemplu de acest fel este transmiterea din generaţie în generaţie a sensibilităţii Drosophilei la CO2. Cercetătorul francez Ph. L'Héritier şi colaboratorii (1937), au descoperit linii de Drosophila sensibile la CO2. De obicei, Drosophila care trăieşte în atmosfera de CO2 rezultat în urma fermentaţiilor (de fructe, struguri etc.) este rezistentă la acest gaz. Pentru a verifica ipoteza că sensibilitatea la CO2 se transmite prin citoplasmă, autorii au înlocuit cromozomii de la aceste linii cu cromozomii normali de la muştele normale. Pentru aceasta, au efectuat încrucişări între femelele sensibile la CO 2, cu masculi rezistenţi la CO2. Au realizat indivizi sensibili la CO2. În cazul când s-au încrucişat masculi sensibili la CO2 cu femele rezistente la CO2 au realizat indivizi normali. Femelele hibride sensibile la CO2 au fost din nou încrucişate cu masculi normali. Descendenţii femeli au fost din nou încrucişaţi cu masculi normali. După mai multe retroîncrucişări au rezultat forme materne cu nucleul de la forma paternă. Cu toate acestea, descendenţele prezentau sensibilitate la CO2. Însuşirea de sensibilitate la CO2 s-a transmis prin citoplasmă.

Concluzia acesta a fost verificată prin metoda injectării de hemoglobină de la Drosophila sensibilă la CO2 la femelele de Drosophila normale. Acestea au produs indivizi sensibili la CO2.

Toate acestea demonstrează că sensibilitatea la CO2 se transmite prin particule din citoplasmă care au fost denumite “sigma”.

Alte experienţe efectuate de T. Sonneborn şi colaboratorii (1944, 1959) au pus în evidenţă acţiunea unor particule citoplasmatice la Paramecium aurelia. Există două tipuri de indivizi în această specie; unul secretă o substanţă specifică în jurul lui, denumită paramecină (tipul Killer). Paramecii ce produc această substanţă nu suferă de pe urma ei, dar paramecii din celălalt tip, în contact cu această substanţă, mor (tipul non-killer).

Capacitatea de a produce paramecină se datorează unor particule din citoplasmă denumite “Kappa”, prezente numai la tipul ce produce paramecină şi care conţine în nucleu gena dominantă K. Tipul nou-killer conţine gena homozigotă kk.

La un individ se găsesc circa 400 particule Kappa vizibile la microscop, deoarece au diametrul de 0,2 - 0,8 p. Aceste particule conţin ADN.

Prin diviziunea directă a infuzorilor ce produc paramecină apar întotdeauna indivizi ce produc paramecină. Prin aplicarea unei tehnici specifice, pot fi încrucişate cele două tipuri de infuzori (conjugare). Dacă conjugarea durează un timp scurt, se produce schimbul numai între nucleii celor două tipuri şi prin înmulţire asexuată fiecare vor reproduce tipul iniţial. Dacă conjugarea durează mai mult, se realizează în plus şi un schimb de citoplasmă între cei doi indivizi, astfel că ambii vor conţine particule Kappa. Prin înmulţirea asexuată se produce în descendenţă o segregare de 50% indivizi ce conţin particule Kappa şi 50% care nu conţin aceste particule (figura 9.2).

189

Cercetările acestea arată că un element citoplasmatic poate transmite o anumită însuşire. Particulele Kappa conţin ADN, care asigură autoreproducerea lor şi transmiterea în generaţiile ulterioare.

9.2.3. Ereditatea mitocondrială

Primele dovezi asupra localizării unor structuri ereditare la nivelul mitocondriilor de la Neurospora crassa aparţin lui Mitchell (1952), iar la Saccharomyces cerevisiae lui Ephrussi (1953) şi Slonimski (1953). Ulterior s-au descoperit şi alte mutante, cum ar fi cele ce conferă rezistenţă la antibiotice la Saccharomyces cerevisiae.

Au fost studiate mai bine două mutante şi anume: “petite” la Saccharomyces şi “poky” la Neurospora. Aceste mutante se caracterizează printr- o creştere insuficientă a coloniilor, din cauza unor alterări ale enzimelor din mitocondrii, implicate în procesul de respiraţie.

Analiza genetică a mutantelor de tip petite a dus la constatarea că în cazul de faţă acţionează un factor citoplasmatic R (normal) sau r (deficienţă respiratorie) şi un factor nuclear P (normal) sau p (deficienţă respiratorie). Aceşti factori acţionează împreună. În stare normală o celulă haploidă va conţine RP. După constituţia lor genetică, coloniile petite pot fi de două tipuri: “petite vegetative ” (rP) şi "petite segregante " (Rp, rp). Primele, în stare diploidă nu formează ascospori dar hibrizii formaţi din încrucişarea haploizilor normali şi haploizi de tipul petite vegetative se comportă normal şi dau ascospori fără a da prin segregare tipul petite. S-a explicat acest rezultat presupunându-se că în citoplasma celulelor normale se găsesc factori ce lipsesc din citoplasma celulelor cu deficienţa respiratorie. Hibridul haploid primeşte aceşti factori de la tipul normal; al doilea tip de colonii se numeşte “petite segregante”. În acest caz coloniile au fenotip identic cu acelea vegetative, dar ele s-au format prin mutaţiile genei nucleare P şi au genotipul Rp sau rp. Prin încrucişarea unui haploid normal cu un haploid mutant petite prin formarea sporilor se produce o segregare de două celule normale la două celule petite. Fenomenul poate fi explicat presupunând că factorul Rp din citoplasma celulei respective în prezenţa genei nucleare p este nefuncţional, iar în prezenţa genei dominante P devine funcţional. O genă nucleară influenţează deci genele extranucleare.

Fig. 9.2. Ereditatea citoplasmatică la Paramecium aurelia: a-2 tipuri de Paramecium dintre care numai A produce paramecină; b-conjugarea fără schimb de citoplasmă; c-conjugarea cu schimb de citoplasmă

190

9.2.4. Androsterilitatea citoplasmatică şi nucleo-plasmatică

Androsterilitatea (sterilitatea masculă) este însuşirea plantelor de a nu produce polen, sau de a produce polen steril. Fenomenul acesta a fost studiat foarte mult la porumb şi are importanţă pentru producerea hibrizilor simpli şi dubli, obţinuţi din încrucişarea liniilor consangvinizate.

Se cunosc trei tipuri de androsterilitate: nucleară, citoplasmatică şi nucleo-plasmatică. Prima se cunoaşte de multă vreme şi a fost sesizată la multe plante. La porumb, Emerson, Beadle şi Frase (1935) comunicau existenţa a mai mult de 25 gene ce produc androsterilitatea.

Această sterilitate nu a putut fi folosită în lucrările de ameliorare deoarece din cauza segregării, în descendenţă, apar şi plante fertile.

Androsterilitatea ce se moşteneşte pe calea citoplasmei se transmite în descendenţă de către partenerul femel şi ea se foloseşte în lucrările de ameliorare. A fost descoperită la o plantă sterilă de porumb de Peru de către Rhoades (1931, 1933). Încrucişând descendenţele cu aceeaşi formă paternă, nu s-a modificat în descendenţă caracterul de androsterilitate. S-a ajuns la concluzia că în acest caz, androsterilitatea este determinată exclusiv de citoplasmă.

Totuşi, Rhoades dă unele date care ne arată că în unele cazuri, în urma polenizării libere la porumb, pot apărea în descendenţă şi plante fertile sau parţial fertile. Deci acest caracter depinde şi de genele nucleare care intră în acţiune cu genele din citoplasmă (ereditatea nucleo-plasmatică).

Numeroase linii care posedă polen fertil, prin încrucişare produc forme cu polen steril. In aceste cazuri, genotipul nu influenţează caracterul de androsterilitate, moştenirea realizându-se pe cale citoplasmatică. Au fost totuşi găsite linii cu factori genotipici capabili de a restabili fertilitatea polenului în urma încrucişării cu forme androsterile citoplasmatic.

191

Tipurile de androsterilitate se deosebesc după gradul de sterilitate şi după comportarea lor la încrucişarea cu diferite linii fertile. Se pot obţine descendenţe fertile, parţial fertile sau sterile.

Dintre numeroasele tipuri descrise de diferiţi autori, cităm câteva mai importante: tipul 5 descris de Jenkins (1948); tipul F (jalap) descris de Rhoades (1950); tipul brazilian descris de Jones, Strinson şi Khoo (1957); tipul Kya descris de Schwartz (1951); tipul Vg descris de Edwardson (1956) şi Briggle (1957); tipul T (Texas) descris de Rogers şi Edwardson (1952); tipul M (moldovenesc) descris de staţiunea experimentală din Kuban ş.a. Dintre toate aceste tipuri mai bine studiate sunt tipurile T şi M.

Restaurarea fertilităţii. Se întâlnesc rare cazuri când androsterilitatea5

la porumb se moşteneşte numai prin citoplasmă, în mod independent faţă de genotip. Există cazuri când genotipul inhibă acţiunea citoplasmei ce produce sterilitatea polenului, precum şi cazuri când din contra, citoplasma poate influenţa genotipul provocând androsterilitatea nucleară. Caracterul de androsterilitate este condiţionat deci de interacţiunea dintre genotip şi citoplasmă. Această interacţiune este studiată cel mai bine la tipul T (Texas).

Cercetătorii Jones (1950), Rogers (1954), Eckardt (1954), Thomas şi Johnson (1956), au emis ipoteza că restabilirea fertilităţii polenului la timpul Texas se datorează prezenţei a două gene dominante existente la linia care restabileşte fertilitatea.

Fig. 9.3. Cele trei tipuri de androsterilitate: nucleară (I), citoplasmatică (II) şi nucleo-citoplasmatică (III)

192

193

După comportarea lor faţă de liniile sterile, liniile consangvinizate pot fi clasificate:

1. linii fixatoare de sterilitate;2. linii restauratoare de fertilitate;3. linii semirestauratoare de fertilitate (semifixatoare de sterilitate).Trebuie menţionat că liniile consangvinizate de porumb se comportă în

mod deosebit faţă de diferite tipuri de sterilitate. Uneori, aceeaşi linie poate fi restauratoare pentru un tip de androsterilitate şi fixatoare pentru alt tip.

Pentru a urmări comportarea plantelor faţă de androsterilitate în funcţie de acţiunea genelor din citoplasmă şi nucleu vom nota cu S gena ce produce sterilitatea, cu F gena ce asigură fertilitatea şi cu R gena restauratoare de fertilitate (figura 9.3).

În această figură se poate urmări modul de acţiune a genelor la cele trei tipuri de androsterilitate.

Folosirea androsterilităţii în producerea de hibrizi reduce lucrările de castrare a plantelor şi cheltuielile de producţie. Pentru producţie se lucrează la obţinerea de linii consangvine, acestea se încrucişează şi formează hibrizi simpli, iar aceştia din urmă încrucişaţi produc hibrizi dubli cultivaţi în producţie.

În figura 9.4. este redată schema pentru obţinerea de hibrizi dubli pe bază de androsterilitate.

Fig. 9.4. Schema pentru obţinerea de hibrizi dubli pe bază de androsterilitate

194

195

9.3. APARATUL GENETIC AL EREDITĂŢII EXTRANUCLEARE9

Existenţa unui aparat al eredităţii extranucleare a fost dovedită în primul rând prin prezenţa, rolul şi funcţiile acizilor nucleici în organitele citoplasmatice, cloroplaste şi mitocondrii. S-a admis, în general, că în citoplasmă se găsesc plasmagene spre deosebire de genele nucleare numite cromogene.

ADN din citoplasmă prezintă unele caracteristici care-i conferă proprietatea de a înmagazina şi transmite o informaţie ereditară. Pe lângă ADN, organitele celulare conţin şi ribozomi, enzime, ARNr şi ARNs. Acestea constituie un aparat genetic care poate funcţiona relativ independent faţă de cel nuclear.

ADN din organite are o structură bicatenară ca şi cel nuclear, dar diferă prin greutate moleculară (60-70 x 106 dal cel din mitocondrii) şi este de 100 ori mai mult în cloroplaste. Diferenţe se constată şi în ceea ce priveşte raportul de baze, timpul de denaturare şi renaturare. Din această cauză nu se pot obţine hibrizi moleculari între ADN citoplasmatic şi cel nuclear. ADN din organite se replică independent de ADN nuclear.

O altă deosebire constă în faptul că în cloroplaste şi mitocondrii ADN are formă circulară, se replică după tipul semiconservativ, independent de ADN nuclear.

Deosebirile ADN din cloroplaste şi mitocondrii faţă de acel nuclear şi asemănarea lui cu ADN întâlnit la bacterii, alge albastre ş.a., au dus la presupunerea că aceste organite, cândva, au dus o viaţă independentă ca procariote şi cu timpul, pătrunzând în celule, au realizat o simbioză. Ele au stabilit unele relaţii cu celula, în afara căreia nu mai pot exista. Descoperirile din acest domeniu au dus la formularea unei teorii privind originea exogenă a organitelor citoplasmatice.

Tot în celulă se mai găsesc şi alte structuri cu rol genetic, cum ar fi particulele Kappa, sigma şi alte plasmagene, încă nelocalizate. La unele din ele a fost pusă în evidenţă prezenţa ADN. Şi pentru aceste structuri există părerea că ar avea o origine exogenă, dar cercetările care s-au întreprins nu au lămurit complet structura şi funcţia unui aparat genetic propriu.

9.4. FENOMENE CU CARE SE POATE CONFUNDA EREDITATEA EXTRANUCLEARĂ

Pentru studiul cazurilor de ereditate extranucleară este necesar să se aibă în vedere diferite situaţii care mimează unele manifestări a acestui tip de ereditate.

9.4.1. Predeterminarea

Acest fenomen a fost pus în evidenţă la melcul de apă dulce, Limnaea peregra. Acesta este hermafrodit şi se poate înmulţi atât prin fecundare străină cât şi prin autofecundare.

Cuprinde două tipuri: unul care are cochilia răsucită spre dreapta (dextral) şi alta care are cochilia răsucită spre stânga (senestral). Caracterul dextral (D) este dominant, iar caracterul senestral (d) este recesiv. La încrucişarea: ŞDD x ^dd hibridul Fj moşteneşte caracterul matern al cochiliei (dextral). La încrucişarea Şdd x ^DD hibridul moşteneşte tot caracterul matern al cochiliei (senestral) (fig. 9.5).

Înmulţite pe cale asexuată, ambele categorii de indivizi din Fj reproduc în continuare şi în F2 şi F3 caracterele materne.

Cercetându-se cauzele acestor fenomene s-a explicat că răsucirea cochiliei se datorează răsucirii fusului nuclear în prima diviziune a zigotului care, la rândul său, determină distribuirea blastomerelor în spirală la stânga sau la dreapta.

9.4.2. Modificările de durată

Prin modificări de durată înţelegem modificarea unor caractere sub influenţa unui anumit agent, care se menţin un număr de generaţii până când organismul recapătă caracterul iniţial.

Jollos (1932, 1935) descrie un asemenea caz la Drosophila. Larvele crescute la temperaturi ridicate au avut dimensiuni foarte mici (nanism). încrucişate între ele modificarea se menţine până în F5.

193Hoffmann tratează seminţele de fasole cu cloral hidrat şi obţine modificarea

Fig. 9.5. Încrucişarea între Limnaea peregra tipul dextral cu Limnaea peregra tipul senestral (după Plagge,

1938, modificat)

197

frunzelor. Această modificare s-a menţinut numai şase generaţii după care forma frunzei a revenit la cea iniţială.

Explicaţia modificărilor de durată se referă la adaptarea enzimatică, acestea fiind sintetizate în prezenţa unui anumit substrat care are rol de inductor. După dispariţia inductorului sinteza enzimei încetează sau se mai prelungeşte un timp.

9.4.3. Ereditatea aparentă

În citoplasma celulelor unui organism se găsesc diferiţi simbionţi sau paraziţi care produc modificări ale unor caractere sau însuşiri. La şoareci, în descendenţa unor indivizi, s-a constatat apariţia cancerului mamar şi transmiterea lui pe cale maternă. S-a crezut la început că este vorba de o însuşire transmisă prin citoplasmă. Bittner (1938) a descoperit că este vorba de un virus oncogen transmis prin laptele femelelor.

9.4.4. Alte surse de erori

În afară de aceste cazuri, erori în interpretarea eredităţii citoplasmatice mai pot surveni şi în reproducerea partenogenetică la care ereditatea este de tip matern, în cazul eredităţii legată de sexul femel sau în cazul înmulţirii asexuate.

9.5. RAPORTURILE GENETICE DINTRE GENOM ŞI PLASMON

Nucleul şi citoplasma constituie un sistem genetic organizat, între ele existând o foarte strânsă legătură. Este greu de stabilit care este partea de contribuţie a fiecăreia. De multe ori acelaşi caracter este determinat atât de genele cromozomice, cât şi de genele citoplasmatice.

Genele cromozomice pot influenţa acţiunea unor componenţi citoplasmatici. Aşa de exemplu, gena iojap din cromozomul VII al porumbului, în stare homozigot recesivă produce caracterul dungat al frunzelor. Prin polenizarea unor plante cu frunze verzi, cu polen de la astfel de plante toţi descendenţii au avut frunze de culoare verde. În cazul în care plante mamă de tip iojap au fost polenizate cu polen de la plante normale, în Fj au rezultat plante cu frunze de culoare verde, alb-verzuie şi dungate deşi genotipul a fost acelaşi. În concluzie, gena iojap este o mutantă ce produce o modificare ireversibilă în citoplasmă.

Un alt tip de relaţii dintre genom şi plasmon se referă la acţiunea inhibitoare a mutaţiilor genice asupra unor caractere moştenite pe cale citoplasmatică. S-au dat exemple în acest sens când s-a analizat androsterilitatea nucleo-plasmatică.

Acţiunea citoplasmei asupra caracterului nucleului este o dovadă în plus a relaţiilor între cele două componente. Nucleul de formă sferică de la Amoeba proteus, introdus în citoplasma unei amoebe din specia discoides capătă forma de disc. Dar atât genele din nucleu cât şi cele din citoplasmă pot acţiona pentru producerea aceloraşi caractere (cazul aspectului pestriţ al frunzelor, al androsterilităţii ş.a.

Aceste relaţii dintre nucleu şi citoplasmă atestă interdependenţa genetică care există între cele două componente celulare la eucariote. Elementul comun care dictează această interdependenţă o constituie acizii nucleici purtători de informaţie genetică, prezenţi atât în nucleu, cât şi în citoplasmă.

198

9.6. CARACTERELE ŞI ÎNSUŞIRILE INFLUENŢATE DE PLASMOTIP

Din cercetările multiple şi îndelungate s-a constatat că aproape toate caracterele suferă o influenţă mai mare sau mai mică din partea genelor din citoplasmă.

După Hagemann (1964), aproape toate caracterele organismelor sunt determinate şi influenţate în timpul ontogeniei (dezvoltării individuale) atât de genom cât şi de plasmon. O influenţă mare exercită genele citoplasmatice asupra următoarelor caractere: germinaţia seminţelor, creşterea tubului polinic, creşterea embrionului şi a plantei, ramificarea tulpinilor, perozitatea tulpinii şi a frunzei, forma şi nervaţiunea frunzei, forma, mărimea şi culoarea florilor, formarea şi vitalitatea celulelor sexuale, formarea şi structura plastidelor ş.a. La animale citoplasma influenţează puternic greutatea corporală, rezistenţa la unele boli (cum ar fi leucoza) ş.a.

In legătură cu problemele mari ale evoluţiei lumii organice există ipoteza că genele nucleare ar fi determinat, în mare măsură, variabilitatea intraspecifică, iar cele citoplasmatice, caracterele legate de gen şi specie.

SISTEME GENETICE PENTRU CONTROLUL REPRODUCERII ORGANISMELOR

Moto:"Natura nu face nimic incorect. Orice formă, frumoasă sau urâtă, îşi are cauza ei: şi din câte fiinţe există, nici una măcar nu e aşa cum n-ar trebui să fie”

D. Diderot

Comportarea şi transmiterea caracterelor ereditare la eucariote depind foarte mult de modul de reproducere al organismelor. Există două moduri, principale de reproducere: reproducerea asexuată, în care se poate include şi înmulţirea vegetativă şi reproducerea sexuată.

10.1. EREDITATEA ÎN CAZUL REPRODUCERII ASEXUATEŞI SEXUATE

În cazul înmulţirii asexuate, în general, toate caracterele organismelor se transmit ca atare la descendenţi. Descendenţele poartă numele de clone sau suşe. În rare cazuri, se pot produce şi modificări ereditare prin mutaţii de genă, genom sau restructurării cromozomale, care se transmit la urmaşi. Acest mod de înmulţire, prezintă unele avantaje pentru producţie, deoarece, pot perpetua la urmaşi, caractere constante (pomi, viţă de vie, cartof ş.a.).

Ereditatea în cazul reproducerii sexuate îmbracă forme mai complexe, deoarece indivizii rezultaţi pe această cale, reprezintă organisme în care au loc, atât o continuitate genetică cât şi o recombinare de caractere. Reproducerea sexuată se realizează cu ajutorul gameţilor, produşi de un singur organism (hermafrodite sau monoice), sau de organisme de sex diferit (bisexuate sau dioice).

199

Hibridarea sexuată constituie o importantă metodă de analiză genetică. Cu ajutorul acesteia, se evidenţiază modul de transmitere a caracterelor de la o generaţie la alta. Pentru ameliorarea plantelor şi animalelor, constituie o importantă metodă de ameliorare deoarece se pot întruni într-un organism nou (hibrid), caracteristici ereditare, de la doi părinţi cu eredităţi diferite.

Hibridarea ca metodă de înmulţire şi creare de forme noi, se practică de mult timp. Cercetări în această direcţie, din partea oamenilor de ştiinţă, se fac de abia de la sfârşitul secolului al XVII-lea. Începând cu a doua jumătate a secoluluial XIX-lea, în urma descoperirii unor legi cu privire la modul de transmitere a caracterelor, hibridările încep să se aplice în mod ştiinţific, întocmindu-se totodată, o evidenţă genealogică a ascendenţilor şi descendenţilor.

Există multe criterii de clasificare a hibridărilor; cele mai importante, fiind următoarele:

1. Ţinând seama de factorii care contribuie la realizarea hibridării, deosebim: hibridarea naturală şi hibridarea artificială.

2. Din punct de vedere al gradului de înrudire a formelor parentale, deosebim: hibridarea apropiată, în care părinţii aparţin unor soiuri sau varietăţi botanice apropiate şi hibridarea îndepărtată, în care ele aparţin unor specii sau chiar genuri diferite.

3. După numărul formelor parentale care participă la încrucişare, deosebim o hibridare simplă (A x B), dublă (A x B) x (B C), triplă (A x B) x C sau complexă etc.

În cele ce urmează ne vom referi la diferite forme de hibridare, precum şi la unele forme de interes teoretic şi practic.

10.2. EREDITATEA ÎN CAZUL UNOR FORME

PARTICULARE DE REPRODUCERE

La unele plante şi animale embrionul nu este rezultatul unui proces de fecundare la care participă cei doi gameţi, ci el poate lua naştere din elementele nefecundate ale sacului embrionar sau din celulele nucelei sau integumentelor, fenomen numit apomixie. Dintre formele apomictice fac parte partenogeneza şi apogamia.

Partenogeneza poate fi accidentală sau permanentă, haploidă, cu n cromozomi sau diploidă atunci când celula din care ia naştere embrionul este diploidă. Embrionul poate să se formeze dintr-un ovul nefecundat (ginogeneză) sau dintr-o celulă masculă (androgeneză). Partenogeneza duce la moştenirea caracterelor numai de la părintele din care a luat naştere. Starea haploidă prezintă unele avantaje în cercetările de genetică deoarece genele nu au pereche alelică, sunt hemizigote, ceea ce permite analiza lor şi, totodată, prin diploidizare se pot obţine organisme perfect homozigote. Asemenea caracteristici prezintă şi reproducerea apogamică când embrionul se formează dintr-o sinergidă sau antipodă.

Polispermia este fenomenul prin care o celulă sexuală femelă este fecundată de mai mulţi gemeţi masculi. Gameţii pot fecunda celula sexuală femelă sau se pot resorbi în citoplasmă. Individul care se naşte poartă caracterele mai multor forme paterne.

Poliembrionia ia naştere prin dezvoltarea unor embrioni suplimentari, fie din celulele terminale ale proembrionului sau din sinergide şi antipode în interiorul sacului embrionar (poliembrionia de gameţi), fie din celulele nucelei şi integumentelor care

200

pătrund în sacul embrionar (poliembrionie de metamorfoză). Fenomenul este mai frecvent la citrice, rosacee, trifoi ş.a. Ereditatea lor depinde atât de forma maternă cât şi de forma paternă, care au participat la formarea zigoţilor.

Xenia este fenomenul prin care nucleul spermatic care fecundează nucleul secundar al sacului embrionar imprimă unele caractere ale formei paterne. Un exemplu îl constituie formarea pe ştiuletele de porumb a unor boabe de altă culoare decât cea a soiului matern.

10.3. SISTEME GENETICE PENTRU CONTROLUL

REPRODUCERII

Plante autogame se polenizează cu polen propriu, fenomen care nu afectează vitalitatea plantelor şi determină un grad avansat de homozigoţie. Procentul de polenizare între plantele autogame, în mod natural, este foarte mic. Artificial, ele pot fi hibridate prin intervenţia omului.

Plantele alogame şi unele plante sau animale hermafrodite pretind o polenizare sau fecundare străină. Modul de reproducere alogam asigură vigoarea descendenţei.

La microorganisme, cum ar fi la ciuperci, contopirea hifelor haploide genetic diferite are loc numai atunci când există între ele diferenţe notate cu + şi - (sistem heterotalic). Diferenţele sunt condiţionate de o pereche de alele ce ocupă un singur locus (J.L. Brewbaker, 1964). La bacterii conjugarea nu poate să aibă loc decât atunci când una din ele, conţine un factor de fertilitate (F+) şi care lipseşte la cea de a doua (F-).

La plantele superioare există mai multe sisteme de incompatibilitate ce împiedică autofecundarea:

- Incompatibilitatea heteromorfică depinde de structura florii (staminele ies mult în afară corolei sau rămân mult în interior, în timp ce, stilul se găseşte la distanţă mare). O altă cale constă în înflorirea nesincronă a inflorescenţelor mascule şi femele: protandrie când înfloresc mai întâi inflorescenţele mascule (porumb) sau protoginie când inflorescenţele femele înfloresc primele. Alături de aceste căi mai există diferite complexe, cum ar fi complexul entomofil (culoarea florii şi prezenţa parfumului şi a nectarului pentru a atrage insectele ce transportă polenul) sau complexul anemofil (prezenţa unor saci cu aer în polen, pentru a putea pluti în aer).

- Incompatibilitatea genetică este dictată de o serie de gene alele care împiedică autofecundarea (genele autosterilităţii). Acesta poate fi gametofitică sau sporofitică.

- Incompatibilitatea gametofitică - în acest caz polenul nu poate germina dacă în el şi în ţesuturile ovarului, stilului şi stigmatului se găsesc aceleaşi alele, de exemplu S1S2 (figura 10.1.a). Când incompatibilitatea se referă numai la unii grăunciori de polen căzuţi pe stigmat în timp ce alţii, de pe acelaşi stigmat, germinează, ea poartă numele de semi-incompatibilitate. De exemplu, polenul are constituţia S1S3 iar ovarul, stilul şi stigmatul S1S2. În acest caz, numai polenul S3 germinează şi nucleul său spermatic produce fecundarea unindu-se cu S2 (figura10.1. b). A treia situaţie o formează alelele compatibile care fiind heterozigote S1S2 în ovar şi S3S4 în polen, fecundarea este posibilă (figura 10.1.c).

Sistemele genetice de incompatibilitate au fost studiate la Trifolium,

201

Oenothera, Prunus, Gramineae, Solanaceae ş.a- Incompatibilitatea sporofitică. Acest sistem este mai puţin răspândit la plante,

la circa 1/3 din ele. Şi în acest caz este implicat locusul S cu o serie de alele. Comportarea polenului nu depinde de constituţia genetică a polenului ci de genotipul diploid al plantei care îl produce. Intre alelele din polen şi stil există relaţii de dominanţă şi recesivitate. De exemplu, dacă în polen S1 manifestă dominanţă faţă de S2, polenul va avea reacţia alelei S1 şi va fi capabil să germineze şi să străbată stilul cu reacţia S2. Acest sistem a fost studiat la tutun, varză ş.a.

a b c

Fig. 10.1. Reprezentarea grafică a reacţiei autoincompatibilitate-compatibilitate în sistemul gametofitic pentru controlul polenizării: a-polenizare autoincompatibilă; b-polenizare

semicompatibilă c-polenizare compatibilă

Sistemele de alele ale incompatibilităţii prezintă importanţă pentru crearea unor noi genotipuri. La plantele alogame, ce se reproduc prin seminţe nu se urmăreşte obţinerea unor forme autocompatibile deoarece consangvinizarea reduce vigoarea plantelor. La speciile pomicole, care se înmulţesc vegetativ se urmăreşte crearea unor forme autocompatibile pentru a nu mai fi nevoie să introducem în apropiere alte soiuri bune polenizatoare. Obţinerea formelor autocompatibile se poate realiza prin mutaţii în locusul S, deleţia (îndepărtarea) acestui locus şi poliploidie (multiplicarea garniturilor de cromozomi).

Fenomenul vigorii hibride a fost observat şi descris încă din secolul al XVIII-lea şi prima jumătate a secolului al XlX-lea.

Iosef Gottlieb Kolreuter (1763) a executat printre primele hibridări artificiale la plante. încrucişând diferite specii de Nicotiana semnalează vigoarea sporită a descendenţilor faţă de formele parentale.

Andrew Knight (1787) constată că hibrizii obţinuţi la diferite specii pomicole, soiuri de mazăre şi cartof, se caracterizează prin vigoare, care întrece pe aceea a părinţilor şi că ea scade treptat în generaţiile următoare.

Charles Darwin studiază peste 10 ani autofecundarea şi fecundarea încrucişată la diferite soiuri de plante (Brassica, Dianthus, Pisum, Primula, Zea ş.a) şi ajunge la concluzia că fecundarea străină duce la o constituţie mai viguroasă (constituţional vigour). Observaţiile şi rezultatele le-a publicat în lucrarea “Efectele încrucişării şi autofecundării

202

la plante" (1876).Fenomenul de vigoare la hibrizi a fost sesizat şi la animale. Se cunoaşte din

practică că hibrizii obţinuţi între diferite rase se deosebesc prin unele calităţi faţă de părinţi. Darwin arată că animalele obţinute prin încrucişare sunt mai viguroase, au talie şi greutate mai mari.

în perioada 1908-1914 cercetătorii americani G. H. Shull, E. M. East şiH. K. Hayes întreprind studii asupra consangvinizării (autopolenizării) şi hibridării la porumb şi elaborează metodele de consangvinizare şi hibridare la plantele agricole. Termenul de “heterozis” a fost introdus de G. H. Shull în 1914, înţelegând prin el dezvoltarea luxuriantă a hibrizilor din F1.

Heterozisul se întâlneşte atât la plante autogame cât şi la plantele alogame. La plantele alogame vigoarea este mult mai puternică decât la cele autogame. Acest fenomen diferă şi de la plantă la plantă şi este mai pronunţat la hibridările în interiorul speciei decât între specii sau genuri. Există însă şi excepţii, cum ar fi de exemplu hibrizii între genurile Raphanus - Brassica, Triticum - Secale sau speciile Triticum dicoccum - Triticum aestivum.

După clasificarea făcută de A. Gustafsson (1951) se deosebesc trei categorii de heterozis:

a) heterozisul somatic, care se referă la creşterea evidentă a părţilor vegetative ale plantelor;

b) heterozisul reproductiv, ce determină o dezvoltare sporită a organelor de reproducere, a fructelor şi a seminţelor;

c) heterozisul adaptiv, caracterizat prin vitalitate mai mare şi rezistenţă mai bună la condiţiile nefavorabile de viaţă. Pentru producţie, importanţă are aşa numitul “transheterozis”, care duce la un excedent de producţie.

Fenomenul de heterozis prezintă o deosebită importanţă atât pentru cercetările de genetică cât şi pentru lucrările de ameliorare la plante sau animale. O preocupare importanţă a geneticii este explicarea mecanismelor intime care stau la baza lui, în scopul fixării heterozisul din F1, pentru generaţiile următoare. S-aulămurit multe aspecte în legătură cu această problemă, dar multe din ele constituie încă probleme de viitor.

10.4.1. Teorii care explică fenomenul heterozis

Teoria dominanţei. În anul 1910, în perioada de înflorire a mendelismului, A.B. Bruce emite o teorie asupra naturii heterozisului, bazată pe calculele matematice, “Teoria factorilor dominanţi”.

Conform acestei teorii, numărul total de caractere dominante, cu acţiuni favorabile, în populaţiile hibride este mai mare decât la formele parentale. Teoria demonstrează existenţa unei corelaţii pozitive, între numărul de factori dominanţi din genotip şi gradul de manifestare a heterozisului fenotipic. Dacă de exemplu, cei doi părinţi ar conţine câte trei perechi de factori dominanţi, AABBCCddeeff x aabbccDDEEFF, hibridul rezultat va deţine şase loci cu gene dominante AaBbCcDdEeFf

Ipoteza lui Bruce a fost împărtăşită şi de alţi cercetători.Genele ce acţionează favorabil sub influenţa selecţiei naturale devin dominante,

iar genele nefavorabile, recesive. Prin autofecundare, genele recesive trec în stare

203

homozigotă. Prin încrucişare ele devin heterozigote şi inhibate de alelele dominante favorabile.

Această ipoteză explică consecinţele nefavorabile ale consangvinizării şi restabilirea vigorii prin încrucişare, însă nu şi efectul heterozis în general. Nu toate însuşirile recesive sunt dăunătoare. Uneori se găsesc şi forme homozigote dominante, inferioare părinţilor. Această teorie nu poate explica fenomenul de heterozis în cazul poligeniei (polimeriei), care se caracterizează prin lipsa de dominanţă.

Teoria heterozigoţiei. G. H. Shull (1909 - 1914) elaborează o teorie a heterozisului, care se bazează pe corelaţia pozitivă dintre vigoarea hibridului şi gradul de diferenţiere între gameţii ce iau parte la fecundare. Diferenţierea gameţilor ar fi un stimulent pentru o creştere mai intensă. Din această cauză, teoria lui a mai fost numită “ipoteza stimulării fiziologice”.

Ideile lui Shull au fost dezvoltate în lucrările altor cercetători:E. M. East şi H. K. Hayes (1912) au admis părerea lui Shull. Ei arătau că

vigoarea hibrizilor F1, se datorează revenirii organismelor la starea heterozigotă. Prin încrucişarea formelor homozigote se obţine hibridul F1 în care se acumulează gene dominante ce anihilează acţiunea dăunătoare a alelelor recesive. În F2 vigoarea scade în urma segregării genelor.

Încrucişarea creează heterozigoţia iar consangvinizarea duce la homozigoţie şi descreşterea vitalităţii.

Sunt însă şi cazuri când în Fj nu se manifestă fenomenul de heterozis sau micşorarea heterozigoţiei nu este însoţită totdeauna de scăderea productivităţii. Hibrizii simpli pot depăşi uneori hibrizii complecşi, deşi sunt mai puţini heterozigoţi. S-a mai constatat că, la autogame, de foarte multe ori, hibrizii nu depăşesc formele parentale, homozigote. Toate aceste fenomene nu pot fi explicate cu această teorie.

Următoarea etapă a dezvoltării ideilor lui Shull, East şi Hayes a fost apariţia lucrării lui Castle (1926), care susţine că încrucişarea duce la creşterea metabolismului, iar heterozisul, ar fi urmarea diferenţierii chimice din gameţi.

Teoria înlănţuirii (factorilor dominanţi), a fost elaborată de D.F. Jones, urmare a dezvoltării teoriei dominanţei. După această teorie, heterozisul s-ar datora înlănţuirii genelor dominante (grupe de gene înlănţuite), localizate pe diferiţi cromozomi.

Este însă greu de admis rămânerea în stare cuplată a factorilor dominanţi, care presupune un schimb foarte mare de gene. De asemenea, deoarece genele dominante sunt înlănţuite cu cele recesive, nefavorabile, este imposibilă eliminarea acestora fără ca, în acelaşi timp, să nu se elimine şi genele dominante.

Teoria alelomorfismului multiplu. A fost elaborată de E. M. East în anul 1936. Această teorie susţine că heterozisul s-ar datora influenţei unor alele multiple ce determină funcţii fiziologice favorabile. O alelă normală A1 poate da naştere prin mutaţii alelelor A2, A3, A4... Cu cât o asemenea alelă este mai îndepărtată de alela normală, cu atât şi efectul ei ar fi mai mare.

Dar şi această teorie prezintă dificultatea că nu poate admite acţiunea genelor normale şi neagă dominanţa şi recesivitatea.

Teoria supradominanţei a fost elaborată de G. H. Shull (1945 - 1946). Această teorie este o dezvoltare a teoriei privind efectul stimulator al heterozigoţiei. Din cauza aceasta, a mai fost numită şi teoria heterozigoţiei propriu-zise. Autorul afirmă că, în unele combinaţii, interacţiunea între membrii aceleaşi perechi de alele poate duce la faptul

204

că heterozigotul Aa va depăşi ca vigoare ambii homozigoţi AA şi aa. Se presupune că amândouă alelele heterozigote execută funcţiuni întrucâtva diferite, completându-se una pe alta. Heterozigoţia este determinată de o singură pereche de alele spre deosebire de vechea teorie a heterozigoţiei (a stimulării de azi) unde heterozigoţia este determinată de mai multe alele.

Teoria heterozigoţiei structurale a fost elaborată de Dobzhansky. Autorul susţine că acţiunea alelelor dominante favorabile asupra alelelor recesive nefavorabile poate fi înlocuită de inversiuni. Drept argument se aduce existenţa a 70,3% de indivizi ce prezintă inversii heterozigote la Drosophila tropicalis, ce trăieşte în America Centrală. Efectul de heterozis produs de această restructurare a fost denumit euheterozis balansat în sensul că echilibrează polimorfismul biologic al populaţiei.

Teoria homoplasmiei este susţinută de N.H. Nilson (1937). Depresiunea la linii consangvinizate s-ar datora omogenităţii citoplasmei. Prin încrucişare se produce o diferenţiere biochimică şi funcţională a ei. Această teorie nu are adepţi deoarece este greu de susţinut că numai citoplasma să răspundă de fenomenul de heterozis.

Teoria echilibrului genetic. Ipoteza a fost elaborată de C. Bridges (1922), K. Mather (1943) şi N. V. Turbin (1961), încercând o sinteză a celorlalte teorii.

Prin echilibru genetic se înţelege complexitatea de legături între factori ereditari şi mediu. Dezvoltarea fiecărui caracter ar fi determinată de influenţa corelativă asupra lui a numeroşi factori cu acţiune diferită: unii acţionează în mod stimulator, alţii în mod inhibitor. Caracterul apare ca o rezultantă a unor tendinţe opuse.

După această ipoteză, dezvoltarea caracterelor ar fi deci rezultatele echilibrului genetic realizat. în cadrul acestei ipoteze diferite forme de interacţiune a factorilor ereditari menţionaţi în ipotezele arătate mai înainte sunt termenii componenţi ai acestui echilibru.

Realizarea echilibrului genetic diferă la plantele autogame de cele alogame. în cadrul plantelor autogame echilibrul se stabileşte în cadrul fiecărui sortiment haploid de cromozomi. Gameţii sunt echilibraţi, fapt care asigură vitalitatea la descendenţi. La speciile alogame echilibrul se stabileşte în relaţiile dintre organisme, a genotipurilor diferite. La aceste plante, în cazul consangvinizării, descendenţa nu menţine echilibrul genetic, iar vitalitatea şi prolificitatea scade. Heterozisul este un fenomen opus consangvinizării şi el apare la organisme ca rezultat al unui echilibru genotipic optim între frecvenţele alelelor homo şi heterozigote.

Cercetarea fenomenului de heterozis în cadrul concepţiei de echilibru genetic nu exclude posibilitatea studierii în mod izolat a diferitelor tipuri de interacţiuni a factorilor ereditari ce constituie componenţi ai echilibrului genetic şi care determină heterozisul.

în afară de aceste componente ale bilanţului genetic ce determină mărimea heterozisului, trebuie adăugată şi interacţiunea dintre nucleu şi citoplasmă şi între gene şi mediu.

Pentru a înţelege cum acţionează diferitele cauze care duc la dezvoltarea caracterelor concrete ce manifestă heterozisul este nevoie clarificarea componentele echilibrului genetic de care depinde mărimea acestor caractere.

Teoria mitocondrială. A fost formulată de D. F. Jones (1952) şi J. B. Hanson şi colab. (1960), (după Butnaru Gallia, 1985). Cercetările efectuate la porumb au evidenţiat o corelare pozitivă între intensitatea heterozisului şi activitatea mitocondrială.

205

Aceste corelaţii au fost sesizate şi la alte plante: sorg, grâu, secară, triticale, mazăre, bumbac etc.

Mitocondriile sunt implicate în menţinerea homeostaziei intracelulare, în felul acesta explicându-se marea stabilitate fenotipică a hibrizilor, în condiţii foarte diferite de mediu. Nu se cunoaşte prea bine care este evoluţia populaţiilor mixte de mitocondrii, în celulele organismelor hibride. Micşorarea diversităţii mitocondriilor, după părerea specialiştilor, ar explica declinul multor soiuri obţinute prin hibridare după un anumit număr de generaţii.

Dacă aruncăm o privire de ansamblu teoriilor expuse putem, desprinde următoarele concluzii:

- heterozisul este un fenomen complex, la realizarea lui contribuind, în primul rând genotipul organismului, iar în al doilea rând, condiţiile de viaţă;

- diferitele teorii explică numai unele laturi ale fenomenului de heterozis fără să descopere toate cauzele;

206

- merită să ne oprim atenţia, în primul rând, asupra teoriei stimulării (heterozigoţiei) şi a teoriei dominanţei, teorii care, de fapt, se pot completa una pe alta; cercetări multiple, confirmă prin date, cele susţinute de aceste teorii.

Nu trebuie neglijate nici celelalte teorii care explică în parte sau în cazuri speciale manifestarea heterozisului.

Importanţa practică a heterozisului impune o intensificare a cercetărilor teoretice şi practice în acest domeniu.

10.4.2. Manifestarea heterozisului

Sesizarea fenomenului heterozis a plecat de la constatarea că, în majoritatea cazurilor indivizii obţinuţi din încrucişări, se caracterizau printr-o vigoare sporită faţă de părinţii din care au provenit. Faptul că această vigoare este însoţită de o creştere a capacităţii de producţie la plantele agricole sau animalele domestice, a făcut ca fenomenul să fie amplu cercetat, atât în ceea ce priveşte cauzele lui cât şi a efectelor ce le produce.

Din cercetările de morfofiziologie s-a desprins concluzia că hibrizii se deosebesc de formele parentale prin următoarele însuşiri: au embrionii de dimensiuni mai mari; au o creştere a organelor vegetative mult mai rapidă; posedă o activitate mai intensă a ţesuturilor meristematice; au o fotosinteză mai intensă; posibilităţi mai bune de a absorbi substanţele nutritive; capacitate mai mare de a sintetiza stimulatori de creştere.

Manifestarea vigorii hibride depinde de ereditatea celor doi părinţi: este mai pronunţată la hibrizii intraspecifici, la hibrizii obţinuţi din linii consangvinizate (homozigote), decât la hibrizii dintre soiuri sau rase.

Heterozisul se manifestă şi la animale, folosindu-se în producţie unii hibrizi, fie între rase, fie între linii consangvinizate (fluturele de mătase, păsări, porci ş.a.). Produşii dovedesc o mai mare capacitate de producţie (lapte, carne, ouă etc.).

Fenomenul de heterozis îmbracă manifestări foarte variate, el prezintă o importanţă covârşitoare pentru producţie, iar aspectele privind tehnica producerii lui vor fi tratate în cursul de ameliorarea plantelor.

10.4.3. Consangvinizarea şi folosirea ei în crearea liniilor

destinate încrucişării

Organismele alogame, fie monoice, dioice sau hermafrodite se reproduc în mod natural prin fecundare străină. Artificial, noi putem forţa această categorie de organisme să se autofecundeze prin polenizare cu polen propriu, fenomen numit consangvinizare. La animale, consangvinizarea are loc prin încrucişarea între indivizi cu grad de rudenie apropiat. Consangvinizarea nu este tot una cu autofecundarea de la plantele autogame, unde constituie un mod normal de reproducere.

Asupra plantelor alogame, consangvinizarea are următoarele efecte:

1. Scăderea vitalităţii organismelor. în urma consangvinizării, plantele alogame îşi micşorează capacitatea de creştere. Dimensiunile lor se micşorează atât în ceea ce priveşte înălţimea, lungimea şi lăţimea frunzelor, diametrul tulpinii, cât şi mărimea şi greutatea fructelor; de asemeni, prezintă şi o fertilitate scăzută. La porumb, majoritatea liniilor consangvinizate dau o producţie cu mult sub cea a soiurilor din care au fost extrase.

Această depresiune biologică se manifestă foarte intens în prima generaţie consangvină, pentru ca în generaţiile următoare să scadă şi să se oprească la o anumită limită de stabilitate numită şi “minimum de consangvinizare”.

Nu toate plantele răspund în acelaşi mod la scăderea vigorii în procesul de consangvinizare; faţă de porumb la care este foarte accentuată, la secară, lucernă, floarea-soarelui este numai accentuată, iar la dovleac şi mai puţin.

Depresiunea biologică îşi găseşte explicaţia în faptul că, în populaţia supusă consangvinizării creşte procentul de genotipuri homozigote în defavoarea celor heterozigote. în stare homozigotă, genele nefavorabile organismului îşi evidenţiază acţiunea. Aceste urmări pot fi explicate într-o oarecare măsură de teoria dominanţei sau supradominanţei.

Gradul de homozigotare a indivizilor creşte odată cu repetarea consangvinizării la descendenţi şi el se poate afla calculându-se coeficientul de consangvinizare (Cn);m711 — iCn =, în care:

n - reprezintă generaţiile de consangvinizare, iar m - numărul perechilor de alele care se homozigotează.

1

FÎ̂ nl

£ 1, wx1

V\

L

5 /i

%

f» 4 ' a

Fig. 10.2. Reducerea heterozigoţiei şi creşterea homozigoţiei prin efectul consangvinizării 205

2“ -1

2

208

Fig. 10.3. Efectul

consangvinizării asupra heterozigoţiei şi homozigoţiei în funcţie de numărul perechilor de alele în diferite generaţii de consangvinizare

În figura 10.2 este redată creşterea homozigoţiei şi scăderea heterozigoţiei în funcţie de numărul de generaţii în care s-a aplicat consangvinizarea şi gradul de homo şi heterozigoţie, în procente.

În figura 10.3. curbele redau procentul de homo şi heterozigoţie în funcţie de numărul perechilor de alele şi numărul de generaţii de consangvinizare. Numărul perechilor de alele homozigote sunt invers proporţionale cu numărul generaţiilor consangvinizate.

2. Desfacerea populaţiei în biotipuri. Plante alogame au o structură ereditară heterozigotă. Caracterele şi însuşirile lor se găsesc în diferite raporturi, de dominanţă şi recesivitate. Multe din defecte sau calităţi nu se pot manifesta prezentându-se sub forma recesivă. Prin consangvinizare, acestea devin homozigote şi se manifestă producând o desfacere a populaţiei în biotipurile (liniile) componente. Dintre însuşirile rece sive, ce se manifestă fenotipic, unele constituie defecte, altele din contra, sunt valoroase pentru practică (unii indivizi posedă rezistenţă la boli, la ger, precocitate, un conţinut ridicat în proteină, grăsimi ş.a). În afară de caracterele homozigote recesive favorabile sau defavorabile apar şi caractere homozigote dominante pozitive, care se pot folosi cu succes în ameliorare.

3. Scăderea variabilităţii. In prima generaţie consangvină variabilitatea formelor apărute este foarte mare. Reproducându-le prin autofecundare, fiecare formă în parte, mai multe generaţii, variabilitatea lor în cadrul descendenţilor scade până se ajunge la linii consangvinizate, care nu mai segregă, fiind foarte uniforme şi stabile. Acestea sunt liniile homozigote. La porumb se obţin astfel de linii în generaţiile 7 - 8 de consangvinizare. Nu se poate afirma însă că s-a ajuns la o homozigoţie absolută.

Liniile consangvinizate obţinute, sunt diferenţiate genetic şi destul de diferenţiate din punct de vedere fenotipic. Ele nu se utilizează ca atare deoarece dau producţii mici. Prin încrucişarea lor se obţin însă hibrizi, foarte valoroşi, cu producţii mari faţă de formele iniţiale din care au fost extrase. La porumb, astfel de hibrizi, aduc sporuri de 50 - 70%.

10.4.4. Consangvinizarea la animale

Prin consangvinizare la animale se înţelege împerecherea între indivizi cu grad de rudenie apropiat. Gradul de rudenie poate fi mai apropiat sau mai îndepărtat, după cum strămoşii comuni sunt mai apropiaţi sau mai îndepărtaţi. La animale, consangvinizarea este o veche metodă de reproducţie care s-a practicat şi se practică pentru ameliorarea raselor. După gradul de înrudire a indivizilor, consangvinizarea poate fi:

- incest, în cazul în care la împerechere iau parte fraţi cu surori, părinţi cu copii, bunici cu nepoţi;

- consangvinizare strânsă, în care se împerechează rude ceva mai îndepărtate: strănepoţi cu strănepoţi, veri cu veri;

- consangvinizare moderată, când are loc împerecherea între rude şi mai îndepărtate, până la limita când ea încetează.

In figura 10.4 se pot observa efectele consangvinizării la animale în funcţie de generaţia de consangvinizare şi gradul de înrudire.

Ca şi la plante, consangvinizarea la animale se foloseşte cu scopul de uniformizare a raselor, pentru reconstituirea caracterelor homozigote, mai ales a celor dominante, pentru fixarea unor calităţi dorite sau pentru fixarea mutaţiilor valoroase.

Şi la animale consangvinizările au urmări depresive: degenerare, slăbirea rezistenţei la boli, infecunditate, albinism, anomalii ş.a. Cauzele ce determină aceste neajunsuri sunt în general aceleaşi ca şi la plante. Pentru înlăturarea lor se folosesc: metoda împerecherii cu reproducători străini, de aceeaşi rasă, creşterea animalelor înrudite care urmează a se încrucişa în condiţii cât mai diferite de mediu pentru a le provoca diferenţieri biologice, asigurarea unor condiţii optime de hrană şi îngrijire a produşilor obţinuţi, aplicarea unei selecţii atât pentru reproducători cât şi în cadrul descendenţei.

207

Prin încrucişarea liniilor consangvinizate la diferite rase de animale se pot obţine hibrizi cu productivitate sporită faţă de cea a părinţilor. Se aplică acest sistem, cu succes, la găini, porci şi la alte animale domestice.

Fig. 10. 4. Efectul consangvinizării la animale în funcţie de generaţia de consangvinizare şi gradul de înrudire a părinţilor

210

10.5. HIBRIDAREA SEXUATĂ ÎNDEPĂRTATĂ

Hibridarea îndepărtată are loc între specii sau chiar genuri diferite. Din cauza unor dificultăţi care însoţesc această formă de hibridare, folosirea ei este mult mai restrânsă faţă de hibridarea în interiorul speciei. Mai poartă numele de hibridare interspecifică.

Hibridarea sexuată îndepărtată se cunoaşte, de sute de ani, fie ca fenomen natural, fie ca metodă practică folosită de om pentru obţinerea de forme noi de plante şi animale.

J. Kolreuter, la începutul sec. XVIII, vorbea despre astfel de hibrizi la plante şi îi numea “catâri vegetali” după denumirea noţiunii de catâr, hibrid animal obţinut pe cale artificială înainte de a se obţine astfel de hibrizi la plante.

Hibridarea îndepărtată este şi un criteriu pentru determinarea speciilor. In cazul când nu se pot obţine indivizi în urma unei asemenea hibridări sau, deşi se obţin sunt sterili, se afirmă că cei doi părinţi care au luat parte la hibridare aparţin unor specii diferite. Nu trebuie însă să considerăm că hibridarea îndepărtată este singurul criteriu pentru determinarea speciilor.

Ch. Darwin a observat că în obţinerea hibrizilor îndepărtaţi se întâmpină greutăţi şi a căutat să analizeze amănunţit unele condiţii de care depinde uşurinţa încrucişării între formele îndepărtate. El descrie următoarele situaţii: - apropierea sistematică este într-adevăr un factor determinant în reuşita încrucişării, dar nu singurul; - sunt cazuri când două varietăţi aparţinând aceleaşi specii nu se pot încrucişa şi din contra, în alte cazuri când două specii diferite, se pot încrucişa între ele. In cazul când nu se pot încrucişa, Darwin arată că: fecundarea nu poate avea loc în cazurile când tuburile polinice nu pot ajunge până la ovul din cauza stilului prea lung; tuburile polinice nu pot străbate stigmatul de la plantele altei specii; gametul mascul ajunge la oosferă, dar dezvoltarea embrionului nu are loc; fecundarea poate avea loc, embrionul începe să se formeze, dar piere în scurt timp.

Observaţiile lui Darwin sunt juste, dar nivelul cunoştinţelor din vremea lui nu i-au permis să cerceteze şi din punct de vedere genetic cauzele ce îngreuiază realizarea hibrizilor interspecifici. Aceasta a fost posibil mai târziu, odată cu dezvoltarea geneticii.

10.5.1. Obţinerea şi comportarea primei generaţii hibride

In general, hibrizii interspecifici se obţin cu greutate, iar reuşita depinde în mare măsură şi de speciile pe care le folosim. Există totuşi anumite specii de plante care, încrucişate, posedă facultatea de a produce hibrizi fertili. In schimb, la animale, aplicarea hibridării îndepărtate întâmpină mai multe dificultăţi.

Delimitarea speciilor cu diferenţieri de la una la alta, atât din punct de vedere genetic, cât şi fenotipic a determinat izolarea lor sistematică şi genetică şi a creat dificultăţi la încrucişarea dintre ele.

Aceste dificultăţi sunt datorate incompatibilităţii de ordin genetic sau morfologic, privind structura florii, a incompatibilităţii dintre embrion şi endosperm şi perturbări în formarea celulelor sexuate.

La animale, atunci când se obţin hibrizi, defectele se manifestă de obicei la unul din sexe, în special la sexul heterogametic. La încrucişarea dintre femele de Drosophila pseudoobscura cu masculi de Drosophila miranda, în Fb se obţin femele

sterile. În cazul când se inversează părinţi, în F2 se obţin ambele sexe, dar masculii sunt anormali. La încrucişarea dintre o femelă de Bos taurus şi un mascul de Bizon americanus, numai hibrizii femeli ajung la maturitate.

Mecanismul genetic care duce la dezvoltarea numai a indivizilor de un singur sex este mai uşor de explicat dacă ne gândim la diferenţele de ordin genetic ce se întâlnesc la cele două sexe. Deşi genotipul celor două specii conţine genele corespunzătoare, dispoziţia acestor gene poate fi pe cromozomi diferiţi: la una din specii ele pot să fie situate pe autozomi, la cealaltă pe cromozomii sexuali. În afară de aceasta se pot ivi şi diferenţe în structura cromozomilor autozomi omologi sau ai sexului.

Când se obţin totuşi hibrizi interspecifici, aspectul lor fenotipic este în general intermediar între cei doi părinţi şi numai în unele cazuri se manifestă o dominanţă din partea unuia din părinţi.

Fenomenul obişnuit de vigoare, constatat la hibrizii intraspecifici caracterizează uneori şi hibrizii interspecifici (hibridul între Raphanus sativum x Brassica oleracea sau hibridul Equus caballus x Equus asinus - catârul). Adesea, o anumită grupare a genelor pe cromozomii omologi favorizează acţiunea genelor letale sau semiletale şi atunci hibrizii sunt letali, sau prezintă fenomene de debilitate.

Unii hibrizi interspecifici, prezintă şi anomalii sexuale (intersexuali). Aceştia, au aspectul exterior al unui sex dar posedă organe sexuale, ale celuilalt sex. De obicei ei sunt sterili.

Fenotipul hibrizilor interspecifici depinde şi de modul în care se folosesc ca mamă sau ca tată, cele două specii, la care există diferenţele morfologice tranşante între femele şi masculi. Catârul are conformaţia foarte apropiată de cea a mamei , Equus caballus, în timp ce bardoul (hibridul reciproc) are conformaţia mamei de Equus asinus, Equus caballus fiind în acest caz tată. Este cazul influenţei citoplasmei materne, a fenomenului de matroclinie.

O caracteristică principală, destul de frecventă a hibrizilor interspecifici este sterilitatea lor. Ea se manifestă de obicei la sexul heterogametic, cu diferite intensităţi şi se împarte în mai multe tipuri:

- gonadele, în cazul animalelor sau florile plantelor nu se dezvoltă sau avortează, la hibrid. Această situaţie este mai frecventă la animale;

- dezvoltarea gonadelor şi a florilor este normală dar, perturbările încep odată cu meioza. Cele două garnituri de cromozomi diferă prin structură sau prin număr. Aceste anomalii fac ca meioza să nu se poată desfăşura normal sau

209

212

încetează într-un stadiu timpuriu, iar în cazul în care se formează gameţi, ei sunt improprii pentru fecundare.

Când ambii părinţi deţin genomuri omoloage, dar diferă prin numărul de cromozomi, conjugarea cromozomilor în meioză decurge normal, dar în loc de bivalenţi se formează polivalenţi. în alte cazuri, părinţii deţin o parte din genomuri omoloage, dar restul sunt omoloage numai parţial. Cromozomii parţial omologi rămân ca univalenţi. în acest caz, celulele sexuale sunt sterile. Când părinţii deţin genomuri neomoloage, cromozomii nu fac sinapsă, repartiţia la cei doi poli ai celulei este neregulată şi ca atare, apar gameţi sterili. Pentru înlăturarea sterilităţii pot fi folosite mai multe metode: retroîncrucişarea individului F1, cu unul din părinţi; multiplicarea numărului de cromozomi prin tratamente cu colchicină etc.

Aceste metode asigură genomuri care dau posibilitatea de conjugare a cromozomilor în meioză.

Dificultăţile de obţinere a hibrizilor îndepărtaţi, pot fi de ordin cantitativ şi calitativ.

Diferenţele cantitative se referă la numărul de cromozomi ai celor doi părinţi. Atunci când ele depind de germinarea polenului şi creşterea tubului polinic, hibridarea decurge mai bine, când forma maternă are un număr mai mare de cromozomi decât forma paternă (de exemplu între speciile genului Datura, Galeopsis, Nicotiana). La o altă categorie de plante, creşterea tubului polinic decurge mai bine când forma maternă are un număr mai mic de cromozomi decât forma paternă (de exemplu între speciile genului Helianthus, Triticum, Rosa). A treia categorie o reprezintă plantele indiferente privind raportul cromozomic (de exemplu, între speciile genului Brassica).

Perturbări pot să apară şi odată cu formarea seminţelor. La plantele angiosperme diploide, dezvoltarea normală a embrionului are loc când în embrion există 2n cromozomi, în endosperm 3n cromozomi, iar în ovar 2n cromozomi. Când raportul acesta se schimbă din cauza numărului modificat de cromozomi, perturbările apar mai întâi în endosperm, în care are loc o sistare a fluxului de hrană care duce la sufocarea lui. Este vorba de o sterilitate somatoplastică care duce la moartea embrionului. Acest fenomen poate fi evitat dacă în primele stadii de dezvoltare a embrionilor ei sunt detaşaţi şi cultivaţi pe medii nutritive.

într-un stadiu mai târziu, perturbările pot apărea în procesul de dezvoltare a seminţelor, afectând capacitatea lor de germinare.

Diferenţele calitative a genomurilor celor doi părinţi constituie cazuri mai frecvente. Ele se pot produce în cazul unui număr egal de cromozomi şi genomuri omoloage (A x A sau AB x AB) sau un număr diferit de cromozomi şi genomuri parţial omoloage (A x AB). în sfârşit, se mai pot întâlni situaţii în care numărul de cromozomi a formelor parentale să fie egal, dar genomurile neomoloage (A x B).

Toate aceste diferenţe de ordin cantitativ şi calitativ dintre formele parentale, produc perturbări în procesul de fecundare sau de formare a seminţelor, de dezvoltare sau de formare a celulelor sexuale.

In meioză, în asemenea cazuri, conjugarea şi segregarea cromozomilor nu decurge normal şi nu se formează celule sexuale sau acestea sunt sterile.

10.5.2. Comportarea celei de a doua generaţii hibride

Se poate obţine a doua generaţie la hibridarea îndepărtată numai atunci când

213

hibridul F1 este cel puţin parţial fertil. Când numai unul din sexe este steril, cel fertil poate fi încrucişat cu părintele de sex opus.

Descendenţa hibrizilor îndepărtaţi se caracterizează printr-o puternică segregare, care în general nu se încadrează în normele mendeliene. Pot să apară forme asemănătoare tatălui , mamei, intermediare sau aberante. In unele cazuri, în urma segregării toţi indivizii seamănă numai cu unul din părinţi.

In generaţiile următoare, la hibrizii parţial fertili se măreşte procentul de fertilitate. Prin repetarea unui backcross se observă o revenire evidentă la formele parentale.

10.5.3. Rolul hibridării îndepărtate în evoluţia speciilor

Hibridarea îndepărtată prezintă importanţă, pentru apariţia de specii noi de plante şi posibil, şi de animale inferioare.

Se observă în natură, existenţa unor forme ce au caractere comune pentru două genuri sau specii diferite, cum este hibridul dintre Sorbus sibirica şi Cotoneaster melanocarpa. Acesta a moştenit gustul şi coloraţia fructelor, forma frunzelor, culoarea argintie a frunzelor, forma mugurilor de la Sorbus sibirica, iar structura fructului, forma inflorescenţei, caracterul pubescenţei, de la Cotoneaster melanocarpa.

Ca urmare a hibridării îndepărtate, apar uneori organisme amfidiploide (ce însumează numărul de cromozomi somatici ai părinţilor), cu genotipuri echilibrate, constante şi care prin încrucişare pot reproduce tipul din care fac parte. Dacă noua formă se dovedeşte adaptată ea se răspândeşte. O condiţie pentru menţinerea ei o constituie izolarea reproductivă de speciile înrudite.

Orice individ obţinut prin hibridarea îndepărtată este începutul unei specii noi. Pe de o parte, trebuie să ţinem seama de unele trăsături esenţiale ce caracterizează specia autentică: specificul morfologic, lipsa indivizilorintermediari speciilor parentale, capacitatea de a se reproduce, fertilitatea deplină în cazul încrucişării şi izolarea reproductivă totală de alte specii. Pe de altă parte, acestor forme le lipsesc unele trăsături esenţiale ce sunt caracteristice speciilor naturale: arealul geografic, locul ocupat în relaţiile biocenotice, numărul de indivizi ş.a. Aşa că, asemenea hibrizi nu pot fi consideraţi specii noi, ci mai degrabă “forme specifice”. O specie nouă se formează într-un proces îndelungat, pe baza selecţiei naturale.

Prin metoda hibridării îndepărtate au fost sintetizate multe forme, foarte asemănătoare cu speciile răspândite în natură. Muntzing (1930) a realizat prin hibridări îndepărtate sinteza unei forme asemănătoare speciei Galeopsis tetrahit (2n = 32 cromozomi). A încrucişat Galeopsis pubescens cu Galeopsis speciosa. Hibridul, încrucişat cu una din formele parentale, Galeopsis pubescens, era greu de deosebit de Galeopsis tetrahit.

La plante, posibilitatea de o obţine hibrizi îndepărtaţi diferă de la un gen la altul. Există genuri ale căror specii se hibridează destul de uşor (Dianthus, Triticum, Prunus, Pirus etc.) dar şi genuri a căror specii nu se hibridează, chiar dacă sunt destul de înrudite (Liliacee, Umbelifere, Leguminoase etc.).

Există şi genuri care se hibridează cu destulă uşurinţă, cum ar fi: Triticum x Secale, Triticum x Aegilops, Raphanus x Brassica etc.

Studiul citogenetic al hibrizilor îndepărtaţi, oferă posibilitatea stabilirii cauzelor ce determină sterilitatea totală sau parţială a acestora.

214

În ameliorarea plantelor, hibridările îndepărtate, chiar dacă necesită condiţii de lucru deosebite, s-au extins, deoarece oferă posibilitatea obţinerii de hibrizi cu cromozomi de adiţie (Triticale) sau cu cromozomi de substituţie, aceste recombinări genetice, permiţând o diversificare mai mare a materialului biologic.

MUTAŢIILE ŞI MECANISMUL LOR MOLECULAR

Moto:“Pentru producerea unui mare salt evolutiv sunt necesare îndeplinirea a trei exigenţe minimale: evenimentul, ireversibilitatea şi coerenţa”

Ilya Prigogine

Noţiunea de mutaţie a fost introdusă de Hugo de Vries (1901), înţelegând prin aceasta, o schimbare bruscă a însuşirilor ereditare. E. Baur (1919) o defineşte drept o modificare ereditară care a apărut în afara hibridării, iar E. Guyenot, o variaţie bruscă şi ereditară ce poate apare spontan sau sub influenţa unor factori experimentali.

Mutaţia este o însuşire a materialului genetic şi este tot atât de importantă ca şi stabilitatea lui. Ea apare la toate organismele şi alături de recombinarea genetică este principala sursă de variabilitate.

Omul poate obţine mutaţii, acţionând asupra organismelor cu diferiţi factori mutageni. Modificările obţinute afectează diferite caractere morfologice sau însuşiri fiziologice şi biochimice. Mutaţia este una din metodele principale folosită în ameliorare, pentru obţinerea de soiuri sau linii noi.

Apariţia spontană a mutaţiilor a fost sesizată de mult, iar concepţia care s-a format asupra lor a avut un rol important în explicarea evoluţiei. Evoluţia, în concepţia de astăzi, nu este altceva decât o rezultată a procesului de modificare ereditară a organismelor şi acţiunea selectivă a mediului. Mutaţia poate determina direcţii de evoluţie atunci când modificarea este utilă organismului, reprezentând un avantaj în perpetuarea speciei la care a apărut.

11.1. CLASIFICAREA MUTAŢIILOR9

Mutaţiile se pot clasifica în mai multe tipuri, fiecare având un anumitcriteriu.

1. După modul de apariţie, ele se împart în mutaţii naturale şi mutaţii artificiale:

- mutaţiile naturale numite şi spontane apar în condiţiile din natură fără intervenţia omului. Datorită faptului că mediul totalizează o mare complexitate de factori ce influenţează organismul este foarte greu de precizat care sunt cauzele ce determină apariţia acestor mutaţii;

- mutaţiile artificiale, numite şi induse, sunt provocate de om cu ajutorul diferiţilor agenţi mutageni.

2. După capacitatea de expresie fenotipică ele pot fi: mutaţii mari (macromutaţii) ce se deosebesc prin caracterul lor net vizibil, uşor sesizabile; mutaţii mici (micromutaţii), care spre deosebire de primele, sunt greu perceptibile, dar mai frecvente şi

215

cu rol important în evoluţie.3. După acţiunea genei mutante, mutaţiile pot fi: morfologice, fiziologice

sau biochimice; mutaţiile morfologice afectează caracterele morfologice ale organismelor (formă, mărime, culoare etc.) şi sunt uşor detectabile; mutaţiile fiziologice produc schimbări în procesele fiziologice, (ritmul de creştere, perioada de vegetaţie, rezistenţa la boli ş.a.); mutaţiile biochimice determină modificarea cantitativă sau calitativă a componenţilor chimici din organism, (substanţe de rezervă, principii activi, enzime etc.).

4. După natura substratului material al eredităţii mutaţiile sunt: genice, cromozomice, de genom, citoplasmatice; mutaţiile genice (punctiforme) provoacă modificarea genei fără a produce o schimbare în morfologia cromozomului. Ele se referă la schimbările de structură chimică. O alelă se transformă în alta, fără a-şi schimba locus-ul în cromozom. Cea mai mică unitate mutaţională, este perechea de nucleotide, mutaţie denumită punctiformă, fiind o mutaţie intragenică. Mutaţiile cromozomice se referă la restructurările ce pot avea loc în cromozom (deficienţă, deleţie, inversie, translocaţie, translaţie). Mutaţiile de genom afectează întregul genom sau numai un anumit număr de cromozomi (poliploidia şi aneuploidia). Mutaţiile citoplasmatice se referă la modificările pe care le pot suferi cloroplastele şi mitocondriile şi odată cu ele şi caracterele de care răspund.

5. După originea lor mutaţiile pot fi: germinale şi somatice. Mutaţiile germinale apar în celulele sexuale şi se manifestă în zigoţii la a căror formare participă. Mutaţiile somatice apar în celulele somatice. Cu cât apar mai devreme în ontogeneză, vor afecta o porţiune mai mare din organism. La organismele cu înmulţire vegetativă ele se pot menţine pe cale vegetativă şi pe cale sexuată când din ţesuturile somatice afectate se dezvoltă celule sexuale.

6. După direcţia de manifestare a mutaţiilor: mutaţia directă (forward mutation) şi de reversie (back-mutation). Când o genă normală (de tip sălbatic) se transformă într-o alelă diferită, mutaţia este directă, iar când o genă se retransformă în tipul iniţial, mutaţia este de reversie.

Frecvenţa acestor mutaţii este diferită, mai mare pentru cele directe, comparativ cu mutaţiile de reversie.

7. În funcţie de locul de plasare a genelor, mutaţiile pot fi: mutaţii autozomale plasate pe autozomi, mutaţii heterozomale plasate în cromozomii sexuali (manifestând sex-linkage) şi mutaţii extranucleare, ale genelor din citoplasmă.

8. După modul de manifestare a genelor mutante, mutaţiile pot fi dominante, codominante, semidominante sau recesive. La organismele diploide, mutageneza a creat relaţii de alelism între gene, exprimându-se fenotipic cele dominante, în timp ce la organismele haploide orice mutaţie se exteriorizează fenotipic.

9. Funcţie de modul de reacţie a indivizilor purtători ai unei mutaţii, mutaţiile pot fi viabile, subletale şi letale.

10. Un tip special de gene mutante, sunt genele mutatoare, care măresc frecvenţa mutaţiilor altor gene.

11.2. DETECTAREA MUTAŢIILOR9

Mutaţiile pot fi identificate, după modificările fenotipice ereditare sau după schimbările suferite în structura sau numărul cromozomilor, indiferent dacă acestea sunt

216

sau nu însoţite momentan de modificări fenotipice.Cel mai uşor pot fi descoperite mutaţiile somatice sau cele germinale,

dominante, vizibile, care deşi în stare heterozigotă, apar chiar în prima generaţie. Mutaţiile recesive se pot evidenţia mai greu şi este nevoie de o analiză genetică efectuată în mai multe generaţii. Numai în cazul când este homozigotă, mutaţia recesivă se evidenţiază în prima generaţie.

Majoritatea mutaţiilor sunt rece sive şi pentru determinarea lor se fac hibridări şi autofecundări. Pentru Drosophila se folosesc cromozomi marcaţi prin gene dominante şi purtători ai inversiilor ce împiedică crossing-over-ul.

Mutaţiile fiziologice se pot sesiza uşor atunci când sunt letale sau semiletale, deoarece organismele ce posedă astfel de mutaţii se dezvoltă slab sau pier. Există însă multe mutaţii ce manifestă mici schimbări în procesele fiziologice sau biochimice şi sunt foarte greu de sesizat. Este imposibil de sesizat apariţia tuturor mutaţiilor naturale sau artificiale oricât de minuţios s-ar lucra.

La organismele diploide mutaţiile dominante, foarte rare, se manifestă imediat şi pot fi detectate. Mutaţiile recesive se menţin în genotip mai multe generaţii (perioadă de lag) până devin homozigote, moment când, se manifestă fenotipic. Cea mai eficientă metodă pentru depistarea lor este autofecundarea urmată de depistarea lor, după un număr de generaţii (M1, M2, M3...). Mutaţiile care se produc în endosperm, cum ar fi cele care-i afectează culoarea sau alte aspecte, se identifică uşor, prin polenizarea plantelor cu polen ce posedă mutanta respectivă şi care, datorită dublei fecundări, o va manifesta. Mutaţiile recesive se pot menţine numai prin autogamie şi consangvinizare.

La plantele haploide, starea de hemizigoţie face posibilă detectarea mutaţiilor chiar din momentul apariţiei lor. Aceste mutaţii pot fi menţinute şi prin înmulţire vegetativă.

Cercetări multiple s-au efectuat la microorganisme, la care mutaţiile pot fi detectate analizându-se diferite caracteristici ale aspectului şi mărimii plajelor, cerinţele faţă de factorii de creştere ş.a. Metodele de detectare au fost elaborate de mai mulţi biochimişti, printre care mai importanţi sunt: S. W. Beadle şi E. L. Tatum (1941, 1945) pentru Neurospora crassa şi J. Lederberg (1952) pentru bacterii.

Se folosesc metode de inducere a mutaţiilor care perturbă sinteza unor anumiţi metaboliţi la bacterii, ciuperci inferioare şi alte microorganisme haploide. Formele parentale sunt supuse acţiunii unui agent mutagen, sunt crescute apoi pe medii minimale sau complete şi prin separarea indivizilor se obţin descendenţe (clone), dintre care unele mutante.

La bacteriofagi, mutantele afectează morfologia plajelor din culturile de bacterii pe suportul cărora se reproduc.

Mutaţiile cu efect letal în stare homozigotă pot fi detectate foarte uşor. Din încrucişarea a doi indivizi heterozigoţi, ce posedă o genă letală recesivă raportul genetic de segregare nu va fi 1:2:1 ci, 2:1 deoarece % din indivizii homozigoţi pentru această genă mor, fie în stadiul embrionar sau post embrionar.

Pentru depistarea genelor mutante letale de pe cromozomii sexuali au fost elaborate diferite metode numite şi teste. Aşa este metoda ClB elaborată de H. J. Müller care permite recunoaşterea mutaţiilor letale localizate pe cromozomul X la Drosophila melanogaster. Femelele ClB au un cromozom X normal şi unul la care regiunea centrală a suferit o inversie care opreşte un eventual crossing- over pe această porţiune. Pe acest

217

cromozom se găseşte o alelă mutantă l şi o alelă dominantă B (ochi bar). Alela B îndeplineşte rolul de marker (identificator). Femelele ClB au fost încrucişate cu masculi de tip normal. Dacă la mascul a apărut o mutaţie letală recesivă, atunci femelele cu ochi bar vor prelua de la mamă şi tată câte un factor letal. În generaţia următoare toţi masculii vor muri fie că au moştenit factorul letal ClB, fie mutaţia care a apărut la cromozomul X (figura 11.1).

O altă metodă pentru determinarea mutaţiilor letale la Drosophila melanogaster este şi metoda Müller 5, în care se folosesc femele la care cromozomul X este marcat cu o alelă recesivă pentru culoarea apricot a ochilor. Pentru tipul Abraxas această metodă se poate folosi, dar în cazul de faţă letalitatea se manifestă la sexul femel.

11.3. MUTAŢIILE SPONTANE 9

Apariţia spontană a unor indivizi deosebiţi în cadrul unei populaţii, cu posibilităţi de a transmite modificarea lor la urmaşi, a fost sesizată de foarte mult timp. Unele mutaţii mai deosebite au fost descrise în diferite lucrări. O mutaţie descoperită în sec. XVI, de către farmacistul german Sprenger, din Heidelberg, la planta Chelidonium majus avea frunzele şi petalele laciniate (spintecate); caracterul a apărut spontan şi s-a transmis ca atare la descendenţi. Noua formă a fost denumită Chelidonium laciniatum şi a fost menţinută prin autofecundare. La frag, există o mutaţie descoperită de Duchesne (1763) care are frunza compusă dintr-o singură foliolă, numită fragul monofil.

Darwin, în lucrarea sa “Variaţia animalelor şi plantelor sub influenţa domesticirii" (1868), descrie diferite mutaţii pe care le-a denumit sporturi. A descris piersicul cu fructe netede, prunul cu fructe de culoare galbenă ş.a. La animale, citează numeroase mutaţii: rasa de vite Niatos, cu maxilarul superior mai scurt decât cel inferior,

Fig. 11.1. Testul ClB de detectare a mutaţiilor letale ce afectează gene localizate în cromozomul

sexului X la Drosophila melanogaster

218

asemănător câinilor buldogi, rasa de oi Ancona cu picioare foarte scurte, păunul cu umeri, cu pene de culoare neagră ş.a.

In afara acestor mutaţii, există foarte multe exemple acumulate în literatura de specialitate: câinii basseţi, cunoscuţi cu 3000 de ani înaintea erei noastre, merinosul de Mauchamp cu lâna puţin ondulată, dispariţia coarnelor la oi, taurine şi capre, porcii solipezi, care au o singură copită şi nu se îmbolnăvesc de febră aftoasă, rasa de oi chineză Yang-ti, fără urechi, porumbeii rotaţi, guleraţi, moţaţi, fluturi de culoare neagră ş.a.

Un studiu sistematic al mutaţiilor spontane l-a realizat Hugo de Vries (1848 - 1936). El a pus bazele teoriei mutaţioniste. Teoria lui încearcă să explice că evoluţia se face exclusiv pe baza mutaţiilor. Lucrarea sa de bază este “Teoria mutaţiilor"" (1901 - 1903).

După De Vries, în viaţa speciilor sunt anumite perioade sensibile, care fac să apară aceste mutaţii. El precizează însă că, nu mediul provoacă propriu-zis apariţia acestor mutaţii. Mutaţiile sunt determinate de cauze interne, iar mediul nu face altceva decât să declanşeze apariţia perioadei sensibile a speciei. Mutaţiile nu substituie speciile vechi din care au apărut, ci continuă să trăiască, mai departe, alături de ele. Transformările acestea, spune De Vries, nu au o direcţie bine definită faţă de organism. Ele pot fi folositoare organismului după cum pot fi şi nefolositoare, putând chiar periclita existenţa speciei nou apărute.

De Vries a studiat amănunţit speciile genului Oenothera, plantă caracterizată printr-un polimorfism accentuat, originară din America şi care fusese introdusă de curând în Olanda, unde lucra De Vries. El a remarcat că numeroase forme noi, erau ereditare. Unele experienţe păreau să demonstreze că Oenothera lamarckiana, la origine provine din încrucişarea a două forme deosebite. Mai târziu, s-a demonstrat că anumite specii, cum ar fi Oenothera gigas, sunt poliploide.

Teoria mutaţiilor s-a dezvoltat prin lucrările lui T. H. Morgan. Mecanismele cromozomice descoperite de acesta privind transmiterea caracterelor, cuplarea şi recombinarea genelor, mecanismul de apariţie a aberaţiilor cromozomice, au constituit o bază ştiinţifică pentru fundamentarea procesului mutaţional.

Procesul mutaţional se caracterizează printr-o anumită frecvenţă a mutaţiilor. Este rar, atunci când luăm în considerare o singură genă şi mult mai frecvent atunci când se iau în considerare toate genele şi toate mutaţiile posibile de la un anumit organism. În primul caz raritatea se explică prin aceea că din perechile de alele mutează de obicei numai una singură, iar în al doilea rând ele sunt în majoritate recesive şi nu se exteriorizează decât în stare homozigotă. Există factori ce influenţează frecvenţa mutaţiilor spontane.

În primul rând, frecvenţa mutaţiilor genice, depinde de specie şi de gena respectivă. Există unele aprecieri privind frecvenţa lor, calculată în raport cu numărul de gameţi studiaţi. După Wagner şi Mitchell (1955) mutaţiile spontane la diferiţi loci la porumb, sunt cuprinse între 0,001 şi 0,110 la 10000 gameţi, iar la Drosophila între 0,29 şi 1,5 la 10000 gameţi. După alte date ale unor autori, reiese că una şi aceeaşi genă de la diferite linii de porumb mutează diferit. Aşa de exemplu gena R r formează mutante r1 cu frecvenţe diferite la aceste linii: la una de 6,2 la 10000 gameţi, la cealaltă de 18,2 la 10000 gameţi. Se presupune că aceste diferenţe se datorează existenţei unor gene speciale, care influenţează frecvenţa mutaţiilor altor gene (gene mutatoare).

Numărul de mutaţii ce se acumulează în celule este proporţional cu vârsta lor. În seminţele plantelor care sunt depozitate un număr mai mare de ani, creşte numărul de mutaţii faţă de seminţele de curând recoltate. H. Stubbe a constatat la seminţele de Antirrhinum majus o creştere a procentului de mutaţii de la 1,5% la 14% pentru o perioadă de la 5 la 10 ani. Astfel de observaţii s-au făcut şi asupra mutaţiilor letale spontane, înlănţuite cu sexul, în spermatozoizii precoci şi tardivi de la Drosophila melanogaster. Aceste constatări au dus la formularea unei păreri generale că, numărul de mutaţii este proporţional cu vârsta celulei deşi există şi excepţii.

Descoperirea mutaţiilor naturale cu ajutorul unora dintre metodele şi tehnicile cunoscute face posibil calculul procentului de mutante în sânul unei populaţii de indivizi. Este însă foarte greu de stabilit prin acest calcul în mod exact proporţia mutaţiilor, din mai multe motive:

- în primul rând, mutaţiile au apărut în decursul timpului, odată cu formarea populaţiilor şi multe din ele pot fi considerate caractere normale;

- multiplicarea celulelor mutante poate fi mai lentă sau mai rapidă decât acea a celulelor nemodificate;

- acţiunea genelor sau a genotipurilor mutante poate fi favorabilă sau letală organismelor;

- toate acestea fac ca numărul de mutaţii să sufere mereu modificări.Numărul de mutaţii, fiind foarte mare, este greu de determinat frecvenţa

fiecăreia în parte. De aceea, se poate face o apreciere cantitativă a lor după numărul de gameţi care posedă mutaţii. Această apreciere globală se referă de fapt

218numai la frecvenţa unei singure gene mutante sau a unei clase oarecare de mutaţii. Mai trebuie adăugat că mutaţia germinală nu se produce întotdeauna în gameţi, ci şi în gonii, care în urma diviziunilor celulare produce gameţi mutanţi. Dacă folosim metoda unei

220

clase de mutaţii trebuie să subliniem că mutaţiile letale nu reprezintă o clasă omogenă; ele pot să apară sub influenţa a mai multor cauze: mutaţii genice, cromozomice, efecte de poziţie etc.

In afară de factorii analizaţi mai sus, frecvenţa mutaţiilor este influenţată şi de hibridare; la organismele hibride, faţă de cele homozigote, pentru acelaşi locus frecvenţa mutaţiilor este mai mare. De asemenea, procesul mutaţional spontan este influenţat şi de starea fiziologică şi biochimică a organismului.

11.4. MUTAŢIILE ARTIFICIALE 5

Odată cu descoperirea unor factori ce pot fi folosiţi de om în obţinerea de mutaţii, interesul oamenilor de ştiinţă pentru studiul acestora şi a efectelor pe care le produc asupra organismelor a crescut foarte mult. Paralel cu aceste studii s-au elaborat şi s-au perfecţionat metodele pentru producerea de mutaţii artificiale, denumite şi induse.

Dintre factorii mutageni folosiţi de om pentru prima dată, au fost razele X. In anul 1925, G. A. Nadson iradiind ciupercile inferioare cu raze X a obţinut mutaţii morfo-fiziologice.

Acţiunea mutagenă a razelor X a fost demonstrată de H. J. Müller în 1927 şi 1928 la Drosophila. Rezultatele le publică în lucrarea “Transmutaţia artificială a genei", (laureat Nobel în 1946). Tot în această perioadă, L. J. Stadler între 1927 şi 1929, obţine cu ajutorul radiaţiilor, mutaţii la orz, porumb şi tutun.

Fig. 11.2. Indivizi normali de Drosophila melanogaster (a) şi diferite mutante (b, c, d)

Descoperirea efectului mutagen al radiaţiilor a deschis calea unor ample cercetări ştiinţifice, importante atât din punct de vedere teoretic, cât şi practic. T. H. Morgan şi şcoala sa, au obţinut la Drosophila peste 500 de forme mutante (figura 11.2).

Ulterior, metodele producerii experimentale a mutaţiilor la plante, au fost folosite din plin de A. Gustafsson (1954), J. MacKey (1956), H. Stubbe (1959), C. F. Konzak (1957) ş.a.

Dintre agenţii mutageni folosiţi de om şi mai bine studiaţi fac parte: radiaţiile, temperatura şi unele substanţe chimice.

11.4.1. Radiaţiile mutagene

Radiaţiile electromagnetice au o gamă de lungimi de undă foarte întinsă, care variază de la 10-3 m cât au razele gamma până la peste 1 m, cazul undelor hertziene. Între aceste limite se găsesc razele X, razele ultraviolete, razele infraroşii.

Radiaţiile mutagene sunt radiaţiile care produc mutaţii şi din ele fac parte: 1) radiaţii ionizante electromagnetice (raze X şi gamma); 2) radiaţii ionizante corpusculare (radiaţii a, protoni, neutroni, raze P, diferite particule grele); 3) radiaţii neionizante (raze ultraviolete).

Razele X şi gamma, prin energia absorbită, provoacă ionizări în ţesuturile plantei şi modifică metabolismul celular. Razele X sunt foarte mult folosite, deoarece aparatele Roentgen sunt uşor utilizabile. Pentru iradierea cu raze gamma se foloseşte cobaltul radioactiv. Razele gamma sunt mai penetrante decât razele X.

Razele Beta (P) sunt formate din electroni eliberaţi de radioizotopii de P32 şi S35. Cu aceştia se realizează soluţii radioactive, în care se introduc seminţe uscate sau germinate.

Neutronii sunt particule neutre din punct de vedere electric, rezultaţi din dezintegrarea atomilor. Ei acţionează prin curentul dens şi ionizant de protoni de hidrogen. Efectul iradierii cu neutroni este mai puternic, cu cât elementele celulei au o structură mai densă (plastide, nuclei şi cromozomi).

Razele ultraviolete fac parte din spectrul solar invizibil, sunt constituite din fotoni, cu o lungime de undă între 136 Â şi 4.000 Â. Absorbite în organism, transformă energia lor în reacţii chimice, provocând diferite efecte genetice. Ele au o mai mică putere de pătrundere şi sunt absorbite la suprafaţa ţesuturilor.

În lucrările de genetică se foloseşte mai frecvent acţiunea mutagenă a razelor X, gamma şi a neutronilor termici. Studiul şi folosirea radiaţiilor în genetică a dus la fundamentarea unei noi ramuri a biologiei - radiogenetica - care în ultimul timp a căpătat o amploare foarte mare.

Efectele iradierii asupra plantelor. Efectele produse de radiaţii sunt directe şi imediate. Seminţele tratate cu doze maxime, de obicei nu supravieţuiesc, iar embrionii lor, cercetaţi la microscop conţin numeroase zone de ţesut necrotic. Tratamentele cu doze mai mici duc la apariţia de mutaţii.

Unele substanţe au o acţiune de protecţie a organismelor, diminuând efectul distructiv al razelor X, cum sunt, de exemplu, substanţele reducătoare din grupul sulfhidrelor. Seminţele uscate, iradiate cu raze X, într-un mediu de hidrogen sulfurat, nu manifestă perturbări în celulele lor, întrucât acest mediu anihilează într-o măsură oarecare, acţiunea radicalilor oxidanţi produşi de radiaţii.

222

Spre deosebire de acţiunea razelor X, iradierea cu neutroni provoacă tulburări mai evidente şi o sterilitate pronunţată a indivizilor în descendenţă. S-a emis ipoteza conform căreia, neutronii ar acţiona direct asupra nucleului, iar razele X asupra celorlalte elemente din celulă.

Deşi plantele provenite din iradierea seminţelor cu neutroni manifestă tulburări profunde, dând naştere la porţiuni de ţesuturi necrotice, răsăritul lor este mai uniform, cu un procent ridicat de plante, deoarece în urma iradierii cu neutroni, celulele seminţelor rămân viabile într-o proporţie mai mare şi au o turgescenţă normală.

Razele ionizante au o influenţă dăunătoare asupra organismelor deoarece ele descompun apa din ţesuturi în radicali liberi. În organismele care conţin o cantitate apreciabilă de apă, supuse tratamentului cu radiaţii, apa este descompusă în elemente componente. Acestea intră în acţiune cu restul substanţelor biologice din celule şi provoacă modificări oxidante pronunţate. Bacteriile ce atacă plantele şi animalele, supuse iradierii într-un mediu cu o concentraţie mai redusă de oxigen, devin mai rezistente după acţiunea razelor ionizante.

Perturbările din celulele iradiate sunt datorate şi sistării, într-o oarecare măsură a activităţii enzimelor, care suferă o puternică oxidare.

Acţiunea razelor ionizante modifică şi structura nucleo-proteinelor din organism. Vom vedea mai departe că acizii nucleici, atât ADN cât şi ARN suferă modificări structurale importante şi determină modificări fenotipice.

Studiile citogenetice arată că în organismele iradiate, celulele îşi modifică mersul diviziunii. Se produc ruperi la nivelul centromerilor, cromozomilor şi cromatidelor, perturbări în formarea fusului sau aglutinarea cromozomilor.

Ruperile cromozomice duc la restructurări cromozomice, iar frecvenţa acestora este proporţională cu doza de radiaţii. Acest lucru este valabil numai în cazul unei singure rupturi. În cazul a două rupturi frecvenţa lor este proporţională cu pătratul dozei.

Ruperile cromozomice depind de faza în care se găseşte celula. In ultimele stadii ale mitozei, cromozomii nu par să sufere asemenea rupturi. In interfază şi începutul profazei ruptura se produce la nivelul ambelor cromatide. In profază, fiecare cromatidă poate să sufere în mod independent acţiunea radiaţiilor. Numărul de rupturi este proporţional cu lungimea cromozomului. Regiunile heterocromatice sunt cele mai sensibile la rupturi.

In urma tratamentului cu radiaţii suferă nu numai cromozomii ci şi citoplasma celulei. Nucleul izolat de citoplasmă prin microdisecţie şi supus unei doze maxime de iradiere (25.000 - 65.000 r), prezintă aceleaşi proprietăţi chimice şi fizice ca şi nucleul extras dintr-o celulă neiradiată. Nucleul izolat de citoplasmă

221devine radiorezistent. Dacă un nucleu neiradiat este inclus într-un mediu citoplasmic iradiat vor apare toate radioleziunile caracteristice, fapt ce justifică legătura dintre citoplasmă şi nucleu.

Seminţele uscate sau umectate, se supun diferitelor doze de iradiere cu raze X, în aparate speciale. Iradierea materialului biologic cu neutroni se face în reactori, ciclotroni şi betatroni nucleari.

Iradierea plantelor în cursul vegetaţiei se face în câmpuri special amenajate în acest scop. Plantele sunt aşezate în cercuri concentrice şi după distanţa faţă de sursa de iradiere primesc diferite doze. Doza de iradiere exprimă numărul perechilor de ioni ce se

formează într-un anumit volum de aer.Unitatea de iradiere, denumită Roentgen (r) corespunde formării într-un cm3 de

aer uscat, la o temperatură de 0oC şi la presiunea de 760 mm coloană mercur, a unui număr de 2,1 x 109 perechi de ioni sau într-un gram de aer a unui număr de 1,6 x 1012

perechi de ioni.Există deja stabilită doza critică de iradiere pentru seminţele unor plante de

cultură. Prin doza critică (DL 50%), se înţelege doza la care supravieţuiesc 50% din indivizii trataţi (tabelul 11.1).

Sensibilitatea organismelor faţă de acţiunea mutagenă a radiaţiilor depinde de mai mulţi factori: starea fiziologică a celulei, vârsta ţesutului, temperatura mediului extern, specie, varietate, soi sau individ ş.a. Deoarece sensibilitatea plantelor este diferită de la specie la specie s-au stabilit pentru seminţele diferitelor plante cultivate şi tratate cu raze X doza critică de iradiere. Sau găsit de exemplu 5.000 r pentru seminţele de floarea soarelui, 9.000 r pentru seminţele de mac şi muştar, 15.000 - 20.000 r pentru grâu şi ovăz, 8.000 pentru fasole etc.

Tabelul 11.1.Doza critică pentru diferite specii de plante

Specia de plante Doza în rTriticum aestivum 15.000 - 20.000Helianthus annuus 2.000 - 5.000Cannabis sativa 7.000Phaseolus vulgaris 8.000Hordeum vulgare 10.000 - 15.000Secale cereale 10.000 - 15.000Avena sativa 15.000 - 20.000Brassica napus 25.000 - 35.000Solanum lycopersicum 30.000 - 40.000Linum usitatissimum 40.000 - 50.000Sinapis alba 100.000

Frecvenţa mutaţiilor induse este mai mare în cazul tratării seminţelor vechi, păstrate un interval de ani, decât la cele proaspete. Plantele tinere sunt mai sensibile decât cele mature, celulele în diviziunea meiotică sunt mai sensibile decât celulele în diviziunea mitotică, iar cele mai sensibile stadii din cursul meiozei sunt profaza avansată şi metafaza.

Poliploizii sunt mai rezistenţi la iradiere comparativ cu formele diploide înrudite. Astfel, apariţia mutaţilor clorofiliene este mai mică la speciile de grâu şi orz cu un număr mai mare de cromozomi.

Organismele care au o structură ereditară heterozigotă tratată cu radiaţii produc un număr mai mare de mutaţii decât cele homozigote.

Mutaţia este urmarea unor complicate procese morfofiziologice şi biochimice în organism, pentru care îşi dau concursul o diversitate de factori interni şi externi. Pentru studiul complex al acestor factori s-au întreprins multiple cercetări, dintre care vom menţiona pe cele care prezintă mai mult interes.

S-a studiat acţiunea radiaţiilor ionizante, în funcţie de anumite temperaturi la care au fost ţinute organismele înainte, în timpul şi după tratament. Aşa de exemplu, scăderea temperaturii de la 20 - 30oC la 4oC în perioada tratamentului cu radiaţii creşte

224

frecvenţa mutaţiilor (aberaţiilor cromozomice) la Tradescantia şi a translocaţiilor şi mutaţiilor letale la Drosophila. Aplicarea unei temperaturi ridicate (37 oC) la o oră după iradiere, de asemeni creşte frecvenţa mutaţiilor letale la Drosophila.

Lipsa oxigenului sau diminuarea procentului de oxigen din aer în timpul expunerii organismului la iradiaţii reduce frecvenţa mutaţiilor letale şi a translocaţiilor la Drosophila, a mutaţiilor la bacterii şi diferite aberaţii cromozomice la diferite plante (porumb, ricin ş.a.).

Tratamentul combinat al razelor X cu raze ultraviolete sau cu raze infraroşii sau a substanţei etilamina, duce la o creştere efectivă a mutaţiilor.

Prin acţiunea în complex a factorilor mutageni şi a factorilor de mediu, se poate dirija într-o măsură oarecare obţinerea de mutaţii artificiale, cu valoare pentru practică. W.R. Kaplon (1953) a descoperit că prin tratarea seminţelor de orz cu bioxid de carbon şi amoniac înainte de iradiere s-a redus procentul de plante sterile. Se ştie că aplicarea colchicinei înainte de iradiere, sporeşte frecvenţa de mutaţii. F. D. Amato şi A. Gustafsson (1948) au tratat seminţe de orz cu colchicină, după care le-au supus tratamentului cu raze X. Prin acest procedeu au reuşit să modifice frecvenţa unor mutaţii clorofiliene. A scăzut frecvenţa mutaţiilor de tip albino-viridis şi a crescut procentul mutaţiilor de tip xantha alboviridis.

Deşi s-a cercetat acţiunea multiplă a factorilor mutageni şi a celor externi, foarte multe rezultate rămân încă disparate fără prea multe posibilităţi de generalizare. Aceasta se datorează necunoaşterii în suficientă măsură a tuturor manifestărilor care stau la baza procesului de apariţie a mutaţiilor.

Pe lângă seminţe, se pot iradia polen, muguri, tuberculi, rizomi, butaşi etc. In toate aceste cazuri, se aplică doze mai mici de iradiere, în funcţie de natura speciei de plante supuse iradierii. Prin experienţe s-a stabilit că, în medie, dintr-o 1000 spice de grâu, apar 3-7 mai rezistente la cădere, la boli sau mai precoce.

In lucrările de genetică şi selecţie, prima generaţie şi generaţiile următoare se notează cu litera iniţială a sursei de iradiere, indicând anul respectiv de studiu. Astfel, generaţiile seminţelor iradiate cu raze X se notează X1, X2, X3

223

225

etc.; cele iradiate cu neutroni nb n2, n3, etc.; în ultimul timp s-a admis notarea generală a generaţiilor cu litera M, care reprezintă acţiunea oricărei surse a factorilor mutageni (M b

M2, M3 etc.).Plantele din prima generaţie, provenite din seminţele iradiate prezintă uneori

modificări teratologice, sunt sterile şi au o fertilitate redusă. Modificările morfologice din prima generaţie nu se moştenesc şi poartă denumirea de radiomorfoze. Variaţiile ereditare se observă foarte rar în prima generaţie, deoarece mutaţiile sunt în cea mai mare parte recesive şi se manifestă numai în generaţiile ulterioare. Plantele primei generaţii iradiate au un pronunţat caracter de himere, deoarece se dezvoltă din grupe de celule în care apar diferite leziuni şi modificări provocate de radiaţii.

Experienţele întreprinse pentru obţinerea unor mutante au dus la crearea de forme cu valoare agronomică superioară la orz, ovăz, mazăre, soia, in, muştar alb, rapiţă şi altele.

Radiaţiile ultraviolete sunt mai puţin folosite în radiogenetică, deoarece şi modificările genetice pe care le produc sunt mai puţin importante. Ele produc mai ales mutaţii genice şi foarte rar restructurări cromozomice. Provoacă toate tipurile de mutaţii. Acţionează mai eficace atunci când lungimea lor de undă este în jur de 2.600 Â. Razele cu această lungime de undă au o acţiune mai mare asupra structurii moleculei de ADN, alterând structura normală a bazelor azotate. S-a constatat că bazele pirimidinice sunt mai sensibile faţă de acţiunea UV decât bazele purinice. Cu cât ne îndepărtăm spre stânga sau spre dreapta acestei lungimi de undă eficacitatea lor scade. Eficacitatea razelor ultraviolete, în funcţie de lungimea de undă de 2.600 Â, coincide de fapt cu spectrul de absorbţie al ADN.

Razele ultraviolete au o acţiune germicidă şi de aceea în doze mari, aplicate la microorganisme omoară o parte din germeni. Microorganismele sunt însă destul de sensibile la UV. Uneori numai simpla iradiere a mediului de cultură înainte ca el să fie însămânţat, provoacă mutaţii.

11.4.2. Temperatura

Temperatura este un agent mutagen slab. Acţiunea ei a fost sesizată în special la Drosophila. Odată cu ridicarea temperaturii la care sunt menţinute muştele, frecvenţa mutaţiilor creşte. Creşterea sau scăderea treptată a temperaturii determină o creştere nesemnificativă a frecvenţei mutaţiilor.

Mult mai eficace sunt şocurile de temperatură, aplicate pentru o perioadă scurtă de timp. Prin tratarea larvelor de Drosophila cu temperaturi de 36-380C, timp de 12 - 14 ore, frecvenţa mutaţiilor letale creşte de două ori faţă de cea a larvelor crescute la temperaturi normale. Dacă şocul termic este de -6oC timp de 25' - 40', frecvenţa mutaţiilor creşte de trei ori faţă de cea a larvelor crescute la temperaturi normale.

S-au făcut încercări pentru a pune în evidenţă efectul variaţiilor de temperatură asupra mutabilităţii diferitelor specii de plante şi animale, dar nu s-au putut formula concluzii generale.

11.4.3. Substanţele chimice mutagene

Acţiunea mutagenă a unor substanţe a fost pusă în evidenţă mai ales în ultimele decenii. Oehlkers, în 1943 (după Serra A. J., 1968) descoperă acţiunea de dezintegrare a cromozomilor de Oenothera prin tratarea acesteia cu uretan. Cercetări sistematice

226

fuseseră iniţiate încă din 1940 de către C. Auerbach şi J. M. Robson Primele rezultate s-au obţinut prin tratarea Drosophilei cu iperită (gaz muştar), obţinându-se peste 24% mutaţii letale sex-linkate. Ulterior s-au obţinut rezultate şi la plantele superioare, la ciuperci şi microorganisme.

In prezent, se cunosc un număr foarte mare de substanţe chimice cu efect mutagen. Dat fiind structura lor, de la cea mai simplă, la cea mai complexă, este greu de clasificat după un anumit criteriu. Modificările produse de ele sunt asemănătoare cu cele ale mutaţiilor spontane. Nici una nu posedă specificitate pentru inducerea unui anumit tip de mutaţie (tabelul 11.2.).

Tabelul 11.2.Substanţe mutagene şi eficacitatea lor la câteva specii

Nr

crtSubstanţa mutagenă Drosophila

Cromozomiplante

Bacterie Neurospora

1. Iperita + + + +2. Apa oxigenată ? - + +3. Oxizi organici + + ? +4. Formaldehidă + + + +5. Diazometan + - ? +6. Propiolactonă ? + ? +7. Cazeină ? + + +8. Uretan + + + -9. Fenoli + + + -10 Etilenimină + + ? +11 Cetonă + ? ? -12 Epoxizi şi diepoxizi + + ? +13 Penicilină ? + ? ?14 Carcinogene ? ? + -15 Dezoxicolat de Na ? ? + -16 Acriflavină ? + + ?17 Clorură de fier - ? + ?18 Clorură de mangan ? ? + ?19 Clorură de aluminiu ? + ? ?

Substanţele chimice se administrează în raport cu specia de plantă sau animal. De exemplu, la Drosophila s-a acţionat asupra larvelor prin soluţii administrate sub formă de aerosoli. Substanţele pătrund în trahee şi de aici ajung în gonade. Substanţele se pot introduce direct, în căile genitale a femelei. Prin contact direct cu soluţia se pot trata sporii de ciuperci, polenul, meristemele vegetale.

Acţiunea acestor substanţe provoacă în organismul în care au pătruns modificări biochimice şi fiziologice. La nivelul cromozomilor, se produc ruperi cromozomice şi ca urmare reconstrucţii de diferite tipuri, corelate cu modificări fenotipice. La nivelul genei se produc mutaţii genice. Întreaga acţiune a substanţelor depinde de foarte mulţi factori pe care-i vom analiza în cele ce urmează.

În primul rând, o anumită substanţă poate avea o influenţă mutagenă asupra unei specii, iar asupra alteia să nu exercite nici un fel de influenţă. Aşa de exemplu, apa oxigenată exercită o influenţă mutagenă la bacterii sau Neurospora, dar nu are nici un efect asupra plantelor. Penicilina constituie factor mutagen numai pentru plante.

227

Tabelul 11.3.Factorii mutageni care blochează sinteza bazelor azotate __ (după Freese, 1963) ____________

Factorii mutageniBazele azotate a căror

sinteză este blocatăSpeciile la care s-a observat

efectul mutagen5 - aminouracil timina Escherichia coli

azaserina adenina Escherichia coliguanina

benzimidazol adenina Escherichia coliguanina

cofeina adenina Escherichia coliguanina Drosophila melanogaster

8 - etoxicofeina timina -

etiluretan adenina Oenothera lamarckianaguanina Drosophila melanogaster

6 - merkaptopurina adenina Escherichia coliguanina

5 - nitroxinoxalina adenina Escherichia coliguanina

paraxantina adenina Escherichia coliguanina

acid tetrametiluric adenina Escherichia coliguanina

teobromina adenina Escherichia coliguanina

teofilina adenina Escherichia coliguanina

insuficienţa timinei - Escherichia coliexcesul de uracil - Escherichia coli

Acţiunea mutagenă a substanţelor depinde şi de stadiul de dezvoltare a celulelor sexuate sau embrionare. De exemplu, uretanul are acţiune numai asupra celulelor sexuate mascule de Drosophila deja formate şi nu influenţează spermatogoniile.

228

Formaldehida acţionează numai asupra gameţilor masculi, când ei se găsesc în stadiu timpuriu de dezvoltare. Asupra femelelor, indiferent de stadiul în care se găsesc, această substanţă nu are nici o influenţă asupra genelor din ovule.

In afară de factorii menţionaţi mai sus, pot exista şi diferiţi factori exteriori, care în combinaţie cu agenţii mutageni pot mări sau diminua eficacitatealor.

Substanţele chimice mutagene care provoacă modificări în structura acizilor nucleici sunt foarte variate. Variată este şi acţiunea lor. Ne vom opri asupra unora dintre ele. Există o gamă de substanţe, precursori ai ADN, care au o structură analogă bazelor azotate, care blochează formarea nucleotidelor şi în consecinţă sinteza ADN. In tabelul 11.3 sunt menţionate câteva cu această însuşire. Dintre ele, azaserina s-a dovedit eficientă în blocarea bazelor purinice. Adenina induce aberaţii cromozomice atât la plante cât şi la animale, producând rupturi şi schimburi cromatidice.

Unii analogi ai bazelor purinice şi pirimidinice pot fi încorporaţi în molecula acizilor nucleici în locul bazelor azotate normale. Ei au constituţia nucleilor purinici sau pirimidinici la care s-a adăugat sau substituit anumite grupări funcţionale sau atomi. Cei mai frecvent folosiţi sunt derivaţii halogenaţi ai uracilului (5-bromuracil, 5-cloruracil, 5-floruracil, 5-ioduracil) sau derivaţi aminaţi ai purinei (2 amino-purina şi 2,6 diamino-purina).

Derivaţii halogenaţi ai uracilului înlocuiesc timina, un analog al acestuia. Aceasta se vede şi din constituţia lor (figura 11.3.).

Fig. 11.3. Formula structurală a timinei şi a unui derivat halogenat al uracilului

Bacteria Escherichi coli, fiind cultivată pe un mediu ce conţine 5-bromuracil a produs mutante, la care perechea de baze adenina-timina a fost înlocuită cu perechea guanina-citozina, în felul următor: adenina-timina-adenina- 5-bromuracil-guanina-5-bromuracil-guanina-citozina. Mai întâi, adenina se leagă de 5-bromuracil în loc de timină, dintr-o eroare 5-bromuracil se leagă de guanină în locul adeninei, iar, în final, guanina se leagă în mod normal de citozină.

In mod analog, 2 amino-purina înlocuieşte adenina în încorporare, prinîmperechere cu timina: adenina-timina-2-amono-purina-timina-aminopurina-citozina-guanina-citozina.

Incorporarea analogilor bazici a fost studiată la fagi şi bacteriidemonstrându-se că încorporarea analogilor are loc numai într-o singură catenă.

O altă categorie de substanţe (acidul nitros, hidroxilamina, hidrazina ş.a.) au o acţiune primară asupra acizilor nucleici acţionând fie numai asupra

uI mina

H

5-bromuracil

229

bazelor azotate fără a modifica lanţul glucido-fosforic, sau modifică atât bazele azotate cât şi lanţul glucido-fosforic (alkilanţii, peroxizii organici, clorura feroasă şa.).

Agenţii alkilanţi, dintre care face parte şi iperita (gaz muştar) se numesc astfel, deoarece conţin un radical numit alkil (metil, etil, propil), care poate fi transferat nucleotidelor. Majoritatea lor opresc diviziunea mitotică, de aceea sunt folosiţi şi în tratamentul cancerului. Ei intră în reacţie cu molecula de ADN unde pot produce modificările următoare: ruperea coloanei glucido- fosforice, alkilarea bazelor purinice şi pirimidinice, depurinizarea moleculei de ADN, blocarea mitozei prin formarea unei legături transverse intercatenare. Efectul mutagen al agenţilor alkilanţi a fost pus în evidenţă la bacterii, Drosophila melanogaster, Neurospora crassa, Vicia faba ş.a. Substanţele alkilante acţionează în perioada S a ciclului mitotic.

Acidul nitros (HNO2) este un agent mutagen care acţionează asupra bazelor purinice şi pirimidinice, dezaminându-le. Prin tratarea ARN din virusul mozaicului tutunului cu acid nitros, se produce dezaminarea bazelor azotate şi adenina a trecut în hipoxantină, guanina în xantină iar citozina în uracil (figura11.4.).

Aceste treceri au repercusiuni asupra blocării biosintezei unei enzime şi în consecinţă asupra unei proteine.

Acidul nitros produce mutaţii şi la fagii T4, la Escherichia coli, la stafilococi ş.a.

Hidroxilamina (NH2OH) acţionează în special asupra citozinei care face parte din bazele pirimidinice. Ea provoacă o dezaminare a citozinei şi transformarea ei în uracil. A fost experimentată asupra virusului mozaicului tutunului, asupra fagului T4.

Acridinele sunt coloranţi bazici care produc mutaţii, acţionând asupra moleculelor de ADN, dar ale căror mecanisme nu sunt însă bine elucidate.

În afară de substanţele arătate mai sus se mai cunosc şi altele cu acţiune mutagenă: hidrazina, formaldehida, clorura de mangan, peroxizi organici, apă oxigenată, clorură feroasă ş.a.

230

11.4.4. Factorii mutageni biologici

Cercetările care s-au efectuat în ultimii ani la microorganisme au scos în evidenţă că virusurile şi micoplasmele produc mutaţii la plante şi animale. Se cunosc ribovirusurile care produc sarcomul la găini şi leucemia la păsări şi mamifere. Dintre dezoxiribovirusuri pot fi menţionate: virusul poliomei sau virusul oncogen. Teoria virotică a cancerului uman câştigă tot mai mult teren. Este vorba de ribovirusuri defective care se integrează în cromozomii umani. Dar pătrunderea virusurilor în celulă determină restructurări cromozomice, pulverizări cromozomice. Sunt citate chiar şi apariţii de mutaţii genice.

Micoplasmele, cele mai mici organisme, de dimensiuni cuprinse între cele mai mici virusuri şi cele mai mici bacterii, capabile şi de viaţă independentă, introduse în culturi de celule produc restructurări şi pulverizări cromozomice. La nivel molecular, sinteza ADN micoplasmic opreşte sinteza ADN în celula gazdă.

11.4.5. Mecanismul molecular al mutaţiilor 9

Deoarece un anumit tip de secvenţă nucleotidică este purtătoarea unei anumite informaţii ereditare, orice schimbare a acesteia schimbă şi conţinutul informaţiei. In procesul de diviziune celulară, această schimbare se va transmite şi celulelor fiice.

Se cunosc astăzi unele substanţe chimice, care venind în contact cu organismele sau numai cu acizii nucleici extraşi din ele, modifică structura acestora şi fac să apară mutaţii. Schimbările se produc în anumite regiuni ale moleculei şi nu au nimic comun cu restructurările cromozomice ce se produc în cromozomi.

Schimbarea secvenţei nucleotidelor se referă de fapt la schimbarea bazelor azotate, acestea constituind elementul mobil. Există mai multe modalităţi de schimbare a lor: substituţia, deleţia, adiţia şi inversia.

Prin substituţie, se înţelege înlocuirea unei baze purinice sau pirimidinice printr-o altă bază purinică sau pirimidinică. Dacă această înlocuire are loc numai într-o catenă, odată cu replicarea moleculei, înlocuirea se va transmite şi în catena complementară. Inlocuirea este şi ea de două tipuri: a) când o bază purinică este înlocuită cu o bază purinică, iar una pirimidinică tot cu una pirimidinică, ea poartă numele de tranziţie (de exemplu se înlocuieşte adenina cu guanina sau timina cu citozina); b) când o bază purinică este înlocuită cu o bază pirimidinică sau invers, poartă numele de transversie.

Deleţia este pierderea uneia sau mai multor nucleotide, modificând mesajul genetic.

Adiţia este adăugirea uneia sau mai multor nucleotide în cadrul secvenţei iniţiale.

Inversia este schimbarea ordinii unui număr de baze într-un segment al catenei din molecula ADN.

Schematic, cele patru tipuri de schimbări a secvenţei bazelor din molecula de ADN se pot prezenta astfel (figura 11.5.).

231

Pentru a da o explicaţie diferitelor tipuri de modificări structurale a ADN, Watson şi Crick au emis teoria copierii greşite în procesul de replicaţie a ADN. Schimbarea de secvenţă a unei baze va comanda în procesul de sinteză baza corespunzătoare cu care se va lega catena nouă, complementară. Această nouă ordine va fi copiată şi la o nouă replicaţie a moleculei de ADN.

Mutaţii ale acizilor nucleici s-au obţinut prin acţiunea cu diferiţi agenţi mutageni, fie asupra organismului, fie direct asupra acizilor nucleici. In cazul radiaţiilor ionizante, mecanismul de obţinere a mutaţiilor la nivel molecular nu este încă complet elucidat. Există ipoteze, care susţin că acestea produc ruperi ale moleculei de ADN, urmate de realipirea fragmentelor în diferite poziţii. Razele ultraviolete cu lungimea de undă de 2600 Â acţionează asupra bazelor purinice şi pirimidinice. S-a demonstrat acest lucru acţionându-se direct asupra acestor baze. S-a constatat că acestea sunt sensibile la tratamentul cu raze ultraviolete şi se descompun în mod diferenţiat. Temperaturi anormale pot produce alterări în molecule de ADN: disocierea catenelor şi depurinizarea catenelor de ADN.

Molecula de ADN are o mare stabilitate datorită modului său de replicare şi a sistemului enzimatic, care repară eventualele erori de încatenare a nucleotidelor.

Prin reparaţie genetică, se refac unele leziuni la nivelul moleculei de ADN, integritatea materialului genetic fiind protejată.

Sistemele de reparare a ADN, sunt destul de diverse, grupându-se în două categorii: reparare prereplicativă şi reparare postreplicativă.

Repararea prereplicativă are loc înaintea replicării macromoleculei de ADN realizându-se fie pe cale fotoenzimatică, fie prin excizie (Butnaru Gallia, 1999).

Repararea fotoenzimatică se realizează în prezenţa unei fotoenzime care poate desface dimerii pirimidinici, formaţi în urma iradierii cu raze U.V., fără eliminarea de

Fig. 11.5. Diferite tipuri de schimbări ale bazelor azotate din ADN

232

nucleotide. Această enzimă acţionează la întuneric, ataşându-se de molecula de ADN, în jurul dimerului timină, iar energia necesară pentru catalizarea clivării ambelor legături ale dimerului provine de la radiaţia albastră, din spectrul vizibil. De aceea, când se utilizează radiaţiile U.V. ca agent mutagen, frecvenţa mutaţiilor se reduce, datorită procesului reparator.

Repararea prin excizie constă în înlăturarea unor nucleotide lezate şi sintetizarea unui nou segment de ADN, proces care are loc atât la întuneric cât şi la lumină şi presupune participarea mai multor enzime, ce acţionează succesiv. Endonucleaza, recunoaşte leziunile existente şi hidrolizează legăturile fosfodiesterice 5' -3'. Repararea ADN se realizează cu ajutorul enzimelor de tipul polimerazelor care înlocuiesc nucleotidele excizate şi a ligazelor care sudează lanţul glucido - fosforic. Acest proces a fost descris atât la procariote, cât şi la eucariote.

Repartiţia postreplicativă, are loc după replicarea macromoleculei de ADN , afectat de radiaţiile UV. La bacterii, când în furca de replicare se întâlneşte un dimer neexcizat, se formează o lacună în molecula de ADN la una dintre catene, iar cealaltă cuprinde dimerul. Aceste lacune sunt completate postreplicativ printr-un proces de recombinare genetică, prin care, între catenele nou sintetizate se pot produce schimburi reciproce de nucleotide.

Pentru repararea postreplicativă prin recombinare este necesară prezenţa a cel puţin două molecule de ADN identice, pentru ca repararea să se facă cu mare fidelitate (Raicu P., 1997).

Un alt sistem de reparare este cunoscut sub numele de sistem SOS. Acest sistem intră în funcţie, atunci când în molecula de ADN s-au format un număr mare de leziuni, care nu pot fi reparate prin celelalte mecanisme. In acest caz, are loc sinteza unei ADN polimeraze speciale, care tolerează leziunile şi permite replicarea ADN modificat. De aceea, numeroşi agenţi carcinogeni fizici şi chimici, sunt şi mutageni datorită inducerii sistemului de reparare SOS.

Procesele de reparare a ADN sunt foarte complexe şi ele au apărut foarte timpuriu în procesul de evoluţie a speciilor, atunci când organismele erau supuse unor doze mari de radiaţii UV. Se afirmă că aceste procese reparatorii au apărut chiar în cursul trecerii de la genele de tip ARN la cele de tip ADN, fapt ce a permis creşterea dimensiunilor moleculei de ADN, implicit a cantităţii de informaţie genetică.

11.6. IMPORTANTA MUTAŢIILOR9 9

În natură, supravieţuiesc formele mutante care favorizează individul şi deci şi specia căreia îi aparţine. Ele pot constitui puncte de plecare pentru formarea de noi specii. Mutaţia are, deci, rol în evoluţie.

Mutaţiile artificiale se obţin cu ajutorul unor metode ce depind de specie, factorul cu care se acţionează, momentul în care se aplică tratamentul ş.a. Dat fiind efectul foarte variat, puţine mutaţii prezintă interes pentru amelioratorul de plante sau animale. De aceea, este necesar pentru obţinerea de mutaţii valoroase la plantele de cultură să se folosească un număr foarte mare de indivizi. De multe ori se opresc drept genitori, mutante care posedă multe caractere şi însuşiri defectuoase, dar care conţin una, două însuşiri valoroase. Prin hibridare şi selecţie, aceste calităţi pot fi transmise la descendenţi, realizându-se noi soiuri.

233

La animalele de producţie, s-au folosit şi se folosesc puţin mutaţiile artificiale deoarece formele mutante, cu defecte letale cer cheltuieli care întrec beneficiile. În general, foarte rar s-a reuşit să se obţină mutante valoroase.

O importanţă deosebită o constituie obţinerea de mutaţii la microorganisme. Mutaţia şi recombinarea, după părerea unor microbiologi, sunt singurele mecanisme prin care bacteriile pot deveni rezistente sau sensibile la antibiotice. Microorganismele oferă multiple posibilităţi de studiu al procesului mutaţional, la diferite niveluri de organizare a materiei vii, de la individ până la moleculă.

Una din direcţiile actuale de cercetare a mutaţiilor este de a găsi posibilităţile de a induce mutaţii după dorinţa omului. Problema nu va putea fi rezolvată prin studierea mutaţiilor cromozomice, care înseamnă schimbarea unor segmente mari, de cele mai multe ori cu caracter letal, ci prin mutaţiile punctiforme ce se produc în structura moleculelor de acizi nucleici. Aceste schimbări modifică biosinteza proteinei şi în consecinţă fenotipul.

MUTATII ÎN STRUCTURA CROMOZOMILOR9

Moto:„A manipula natura este privilegiul nostru şi va fi poate sfârşitul nostru. Dar dacă noi nu suntem produsul unei mutaţii letale, gloria noastră va rămâne prin substituirea hazardului cu raţiunea. Până în prezent, evoluţia noastră a fost dominată de hazard. ”

Cristian de Duve

Modificările de structură, restructurările sau aberaţiile cromozomice constituie obiectul unor importante cercetări citogenetice, ele fiind strâns legate de modificările eredităţii. La început, existenţa lor a fost numai presupusă. C. B. Bridges a bănuit că la Drosophila ar exista o genă recesivă legată de sex, care s-a manifestat numai în momentul când porţiunea din cromozomul omolog ce conţinea alela dominantă a fost îndepărtată. Acest fenomen, alături de alte rearanjamente ale porţiunilor din interiorul cromozomilor sau între cromozomi diferiţi au fost considerate de către Bridges şi A. H. Sturtevant, drept ipoteze pentru a explica diferite manifestări genetice.

Prima dovadă a unor astfel de restructurări cromozomice a fost adusă în anul 1930 prin cercetările Barbarei Mc. Clintock asupra cromozomilor de porumb în stadiul de pachiten. Cromozomii de la această plantă au avantajul că prezintă în lungul lor nişte noduli ce se colorează foarte intens (cromozomi heteropicnotici). Cu ajutorul lor au putut fi identificate porţiunile de cromozomi restructurate. Autoarea a demonstrat existenţa a patru feluri de modificări: deficienţă, dedublare, inversiune şi translocaţie.

O confirmare a existenţei restructurărilor cromozomice s-a putut face şi prin cercetarea cromozomilor gigantici din glandele salivare de la Drosophila. Starea în care se găsesc aceşti cromozomi, în perechi şi continuă sinapsă somatică, face posibilă sesizarea modificărilor suferite de un membru al unei perechi.

Diferenţele de structură pe lungimea acestor cromozomi sunt figurate prin prezenţa unor discuri (benzi) corespunzătoare într-o oarecare măsură localizării genelor.

234

Restructurările cromozomice apar sub influenţa radiaţiilor ionizante, substanţelor chimice mutagene şi a unor factori de mediu, fie că acţionează liber în natură, fie că sunt dirijaţi de om. Ele au fost descoperite mai întâi la Drosophila, Zea mays, Datura, păsări, şobolani. Mecanismul lor de formare pare să fie universal.

12.1. TIPURI DE RESTRUCTURĂRI CROMOZOMICE ŞI COMPORTAREA LOR ÎN MITOZĂ

Restructurările cromozomice pot avea loc în două etape:- declanşarea uneia sau mai multor rupturi cromozomice;- pierderea sau realipirea fragmentelor rupte, fie la locul unde s-a produs,

fie într-un alt loc, care schimbă ordinea locilor de pe cromozomi. În primul caz fenomenul trece neobservat, deoarece realipirea realizează integritatea iniţială a cromozomului; în cel de al doilea caz se produce o restructurare a cromozomului, cu un nou aranjament de gene.

Posibilităţile de restructurare a cromozomilor ce au suferit una sau mai multe rupturi se pot clasifica în diferite tipuri pe care urmează să le descriem:

Deficienţa este pierderea sau inactivitatea unei porţiuni terminale (apicale) din cromozom. Unii geneticieni o mai numesc şi deleţie terminală.

Partea de cromozom rămasă, care posedă centromerul, poate participa la mitoză ca un cromozom normal, centromerul fiind elementul activ în migrarea lui spre unul din cei doi poli ai fusului. El devine în acest caz un cromozom stabil şi se comportă ca atare şi în mitozele următoare. În alte cazuri, la capătul cromozomului unde s-a produs ruptura, cele două cromatide se pot uni formând un izocromozom cu doi centromeri. În anafază, centromerii se îndepărtează spre polii fusului, iar cromozomul este întins formând o aşa zisă punte cromatică. Această punte poate împiedica formarea celor doi nuclei şi în consecinţă celula moare. Adesea, puntea se rupe şi anafaza îşi urmează cursul normal. Aceşti cromozomi repetă acest fenomen şi în diviziunile următoare. Dar cu cât creşte numărul de diviziuni, cu atât aceşti cromozomi devin din ce în ce mai anormali. În alte cazuri extremităţile rupte îşi pierd puterea de adeziune, iar cromozomul se comportă normal. Ruptura poate să se producă în diferite puncte ale izocromozomului. In figura 12.1. a, b, c, d, se pot vedea diferite tipuri de deficienţe.

Fenomenul de rupere a izocromozomului a fost observat în celulele din albumenul bobului de porumb. Interpretarea definitivă a procesului de realipire a cromatidelor la nivelul la care s-a produs ruptura, s-a observat la unii cromozomi ce au suferit un număr de asemenea cicluri în gametofit, după care, în urma fecundaţiei intră în componenţa nucleului diploid a sporofitului. O astfel de structură devine deci stabilă şi se transmite ca atare de-a lungul mitozelor.

Fragmentele de cromozomi fără centromeri, când nu se realipesc unui cromozom oarecare, rămân dezorientate în placa ecuatorială şi nu pot fi incluse în nici unul din cei doi nuclei ce se formează spre sfârşitul mitozei. Ele rămân în citoplasmă unde, prin dezagregare, dispar.

235

Pierderi de fragmente terminale se pot produce la ambele capete ale cromozomului. Foarte adesea, în aceste cazuri, capetele cromozomului se pot suda între ele, formând în timpul mitozei un cromozom inelar.

După mărimea fragmentului pierdut, deficienţele se clasifică în mari şi mici. Deficienţele mici se pot sesiza numai în cromozomii gigantici. Ele se păstrează de obicei în stare homozigotă şi produc efecte asemănătoare mutaţiei genelor. Deficienţele mari acţionează ca letale dominante atunci când se găsesc în stare heterozigotă. In această stare se pot păstra. Cromozomii cu deficienţe care posedă centromeri, îşi păstrează proprietatea de autoreproducere.

Deficienţe mari au fost puse în evidenţă, atât pe cale citologică, cât şi prin metode de analiză genetică. Ele au fost constatate pentru prima dată la Drosophila de către Bridges (1916). El încrucişează un mascul cu ochi albi şi de formă ”bar” cu femele cu ochi roşii şi de formă normală. Culoarea albă a ochilor şi forma normală sunt însuşiri recesive. In F1 obţine indivizi ce posedau însuşirile dominante, ochi roşii si de formă „bar”, dar şi un individ cu ochi roşii şi de formă normală. Autorul consideră că forma normală s-a moştenit fenotipic în lipsa sau inactivitatea unei porţiuni ce conţinea alela dominantă a genei „bar”. O astfel de manifestare poartă numele de pseudodominanţă.

Tot la Drosophila se mai cunoaşte un caz analog, în care s-a urmărit acţiunea de trei perechi alele: culoarea galbenă sau cenuşie a corpului produsă de gena Y şi Y+, culoarea albă sau roşie a ochilor, produsă de gena w şi w+ şi prezenţa sau absenţa perilor bifurcaţi produşi de gena f sau f+. Prin încrucişarea femelelor de tip sălbatic cu mascul ce poartă cele trei gene menţionate mai sus au apărut în F1 indivizi la care, pe lângă caracterele dominante, a apărut culoarea albă a ochilor şicaracterul păr

bifurcat. Explicaţia este că gena w şi gena dinimediata apropiere a ei, care produc bifurcarea părului, se găseau pe un segment din cromozomul omolog ce a fost suprimat. S-au evidenţia în acest caz, alelele recesive.

Există o genă (rv) la şoarece care, în stare homozigotă, produce mişcări de rotire în jurul unui picior posterior (şoareci dansatori sau valseuri). Prinîncrucişarea unei femele purtătoare a acestei gene în stare homozigotă cu un mascul normal, se obţin indivizi normali, dar şi unii care valsează. Analiza citologică la aceşti indivizi a arătat că este vorba de o deficienţă cromozomică.

Deleţia este tot o deficienţă, dar a unui fragment cromozomic din interiorul lui. Ea se mai numeşte şi deficienţă intercalară. (fig. 12.1. e). Pentru producerea ei sunt

Fig. 12.1. Diferite tipuri de deficienţe

236

necesare două rupturi în cromozom. Eliminarea fragmentului atrage după sine scurtarea cromozomului. Dacă cromozomul nu pierde şi centromerul, poate deveni stabil şi se multiplică ca un cromozom normal. Fragmentul fără centromer îşi sudează capetele luând forma unui inel, care în cele din urmă dispare. Dacă fragmentul posedă centromer, el ia forma unui inel cu posibilităţi de perpetuare a acestui fenomen în cursul mitozelor următoare. În diviziune, cele două cromatide ale inelului se pot uni. Cei doi centromeri, având tendinţa de a se îndepărta la poli, în anafază formează o punte ce împiedică formarea celor doi nuclei. Dacă ea se rupe, cromatidele surori vor reconstitui inelele în diviziunea următoare şi fenomenul se va repeta fie până la moartea celulei, fie până la dispariţia totală a cromozomului.

Dacă asemenea rupturi se produc la doi cromozomi diferiţi restructurarea ce poate să apară are loc prin schimbul de fragmente între cei doi cromozomi. Când sunt implicaţi trei cromozomi, combinaţiile care pot să apară prin schimb sunt din ce în ce mai complexe.

Duplicaţia este dublarea unei porţiuni din cromozom cu un stoc de gene identice fig. (12.1. f.). Odată cu pierderea unui fragment dintr-un cromozom poate apare prin alipirea acestuia la omologul său, o duplicaţie. Fenomenul provoacă schimbări fenotipice oarecum uşor de sesizat, dar greu de pus în evidenţă din punct de vedere cariologic. Duplicaţia poate să apară şi în urma unui crossing-over inegal.

Bridges (1919) a obţinut asemenea restructurări prin tratarea drosofilei cu raze X. Reducerea suprafeţei ochilor la Drosophila (forma „bar”) este urmarea multiplicării porţiunii de cromozomi care răspunde de numărul de omatidii ale ochiului. Există o relaţie cantitativă între mărimea ochiului şi multiplicarea segmentului 16A din cromozomul gigantic. Când este în cantitate dublă produce fenotipul bar, iar când este în cantitate triplă, fenomenul ultrabar (fig. 12.2.).

Apariţia de aripi păroase la Drosophila este urmarea dublării porţiunii terminale a celui de-al doilea cromozom.

Inversia constă în ruperea unui segment netelomeric din cromozom şi realipirea fragmentului după o rotaţie de 1800. Fragmentul aparţine unei porţiuni din interiorul cromozomului, separat prin două rupturi. Inversii terminale nu pot să apară deoarece partea terminală a cromozomului nu are proprietatea de a se suda la nivelul unei rupturi. Inversiile pot fi homozigote şi heterozigote (fig.12.3. ). Când sunt homozigote şi au un caracter recesiv letal nu se păstrează şi de aceea pot fi descoperite numai în stare heterozigotă. Pot fi de asemenea observate în cromozomii gigantici sau în studiul de pachiten al meiozei. Se întâlnesc la plantele şi animalele din natură şi se pot obţine artificial prin tratamente cu radiaţii ionizante sau substanţa chimice.

237

Inversia poate constitui un criteriu de determinare a varietăţilor din interiorul speciilor. De exemplu la Drosophila

pseudoobscura varietăţile se pot deosebi după o inversie. Geneticienii consideră că fenomenul inversiei are un rol important în geneza speciilor.

La porumb, inversia prezintă importanţă pentru crearea de linii cu polen steril. Sterilitatea este urmarea perturbărilor ce apar în meioză datorită unor restructurări şi despre acest fenomen vom vorbi când se va descrie comportarea cromozomilor restructuraţi în meioză.

Norma! Bor Dublu bar

Fig. 12.2. Diferite tipuri de ochi la Drosophila în funcţie de multiplicarea segmentului 16A din cromozomul X

Fig. 12.3. Inversia: a)-cromozomi omologi normalib) -inversie heterozigotăc) -inversie homozigotă

a 6 c

238

Translocaţia este fenomenul de transferare a unor segmente cromozomice între cromozomi neomologi. Acest tip de restructurare este destul de frecvent şi cuprinde mai multe tipuri:

- translocaţia simplă, când segmentul detaşat de la un cromozom se intercalează în ruptura unui cromozom neomolog,

- translocaţia reciprocă este prezenţa a două rupturi în doi cromozomi diferiţi şi schimbul de segmente lipsite de centromeri. Dacă cele două rupturi se produc la doi cromozomi omologi, în puncte omoloage, atunci schimbul de segmente este echivalent cu schimbul produs prin crossing - over. Când unul din cele două segmente posedă centromer iar celălalt nu, se formează doi cromozomi, unul cu doi centromeri, iar celălalt lipsit de centromer. Acesta din urmă nu este viabil şi se pierde, celălalt în schimb poate să participe la un număr oarecare de mitoze, formând punţi cromatice ca şi în cazurile descrise anterior. În figura 12.4. se poate vedea o translocaţie heterozigotă şi alta homozigotă între două perechi de cromozomi.

Fig. 12.4. Translocaţia: a)-cromozomi omologi normalib) -translocaţia heterozigotăc) -translocaţia homozigotă

Translocaţia are drept urmare schimbarea ordinii genelor în grupele de linkage. Această particularitate ne ajută la descoperirea fenomenului. Se fac încrucişări între indivizi care au bine precizate grupele de gene cuplate şi pe care noi le putem identifica prin anumite gene.

Prima dovadă citologică a translocaţiei a fost adusă de C. Stern (1931) care a urmărit în paralel aspectul genetic şi citologic al translocaţiei reciproce la Drosophila. Este vorba de o translocaţie între cromozomii sexului X şi Y.

Translocaţia este însoţită de modificări fenotipice şi de aceea prezintă un rol important în evoluţia naturală a speciilor. O putem induce şi pe cale artificială, cu ajutorul factorilor mutageni. Prin selecţie, putem separa şi înmulţi formele de plante şi animale utile. Există genuri de plante în care, translocaţia are loc foarte frecvent: Oenothera, Datura, Campanula ş. a.

239

Translaţia (transpoziţia) este transferul unui segment dislocat, într-o altă poziţie (fisură), a aceluiaşi cromozom. Segmentul translat, se poate intercala, în poziţie normală sau inversată. Această restructurare nu modifică numărul genelor/genom, modificându-se însă, ordinea (poziţia) genelor. În mitoză, citogenetic, este dificil de evidenţiat.

12. 2. RESTUCTURĂRILE CROMOZOMICE ŞI MECANISMUL MEIOZEI

Restructurările, numite şi aberaţii cromozomice apar în anumite celule, se pot multiplica odată cu multiplicarea acestora, prin mitoză. În general, numai unul din cromozomii omologi ai celulelor somatice este afectat şi ca urmare, ele au o structură heterozigotă. Important de ştiut este comportarea acestor cromozomi în procesul de formare a celulelor sexuale. Studiind comportarea cromozomilor în meioză, putem identifica diferite tipuri de restructurări.

Absenţa unui fragment (deficienţă sau deleţie) atunci când este homozigotă nu împiedică conjugarea cromozomilor în meioză, dar organismele cu astfel de deficienţe nu sunt viabile decât dacă segmentele respective aveau un număr mic de gene şi de mică importanţă pentru viaţa individului.

Deficienţa sau deleţia sunt fenomene greu de sesizat. Numai în cazul în care, fragmentul pierdut este destul de mare, se poate determina prin măsurători.

Cromozomii gigantici din glandele salivare de la Drosophila constituie un material propice pentru studiul citologic al acestora. Se ştie că aceşti cromozomi omologi sunt conjugaţi în celulele somatice (conjugare somatică). S-a observat la ei prezenţa unor deleţii care obligă cromozomul complet să descrie un fel de buclă în dreptul unde partenerul este lipsit de un fragment (figura 12.5.). Aceasta are loc numai în cazul stării heterozigote, când porţiunea cromozomilor normali nu are porţiune omoloagă corespunzătoare. Fenomenul dovedeşte în plus exactitatea sinapsei omologilor în zigonema.

Fig. 12.5. Conjugarea a doi cromozomi omologi în meioză când unul dintre ei a suferit o deleţie

uhuD E F

A a c o [ f ..............................

i ' i

A $ 0 f F

240

Deleţia heterozigotă, chiar dacă suferă sau nu un crossing-over în timpul meiozei, va duce la formarea a două tipuri de gameţi în proporţii egale: unii cu cromozomi normali şi alţii purtători ai deleţiei. La organismele autogame, prin autofecundare se obţin % homozigoţi normali, '/2 heterozigoţi şi % homozigoţi pentru deleţie, dar care nu sunt viabili.

Spre deosebire de deleţie, duplicaţia homozigotă produce modificări, care însă nu afectează decât în unele cazuri viaţa individului. Ea se transmite la urmaşi fără a produce perturbări în meioză. Duplicaţia heterozigotă duce însă la perturbări în conjugarea cromozomilor în meioză, iar gameţii formaţi pot deveni sterili.

Inversia heterozigotă în zigonema face ca ambii omologi să formeze câte o buclă în care cromozomii parcurg sensuri diferite pentru asigurarea omologiei genelor alele.

Să urmărim cum decurge meioza în cazul când chiasma este situată în interiorul buclei de inversie. Se pot ivi două situaţii: bucla conţine sau nu centromerul.

In prima situaţie, când bucla include centromerul, în meioză se formează patru tipuri de gameţi: doi dintre ei conţin cromozomi normali, iar ceilalţi doi cu structuri modificate şi neviabili (fig. 12.6.).

Fig. 12.6. Conjugarea cromozomilor în cazul unei inversii heterozigote când centromerul este situat în interiorul buclei

În cea de-a doua situaţie, crossing-over-ul produs în interiorul buclei duce la formarea a două cromatide aberante, dintre care una posedă doi centromeri, iar cealaltă nici unul (figura 12.7.). Şi în cazul acesta singurii gameţi viabili sunt cei cu cromozomi nerecombinaţi.

Se poate trage concluzia că inversia heterozigotă poate avea ca urmare blocarea crossing-over-ului la fragmentul respectiv şi nu şi la celălalt braţ al cromozomului. Nu trebuie însă să considerăm că inversia este singura cauză a blocării crossing-over-ului. Mai pot exista şi mutaţii genice ce pot împiedica crossing-over-ul.

tiişat-tn /JrtrAv/f/î 4/№fbzaJ Antrftrzu U

241

Fig. 12.7. Conjugarea cromozomilor în cazul unei inversii heterozigote când centromerul se găseşte în afara buclei

La inversiile homozigote viabile, meioza decurge normal deoarece şi conjugarea cromozomilor este normală. De asemenea şi crossing-over-ul, în acest caz, decurge normal.

In funcţie de lungimea segmentului inversat şi de numărul de crossing- overe ce au loc, apar direct proporţional mai mulţi sau mai puţini gameţi neviabili.

Translocaţiile complică şi mai mult mersul meiozei. Să urmărim cum decurge meioza la un organism heterozigot pentru o translocaţie reciprocă dintre doi cromozomi neomologi.

Conjugarea segmentelor omoloage în profaza meiozei duce la aranjamentul cromozomilor în formă de cruce (fig. 12.8.).

Evoluţia mai departe a cromozomilor va depinde de localizarea chiasmelor în diferite părţi ale cromozomului:

- dacă cele două segmente translocate vor fi foarte scurte, între perechile omoloage ale acestora nu se vor forma chiasme, iar în metafază cei patru cromozomi vor segrega şi vor forma grupe de câte doi. Ei vor conduce la formarea a patru tipuri de gameţi, din care doi sunt dezechilibraţi, posedând cromozomi cu porţiuni translocate (fig. 12.8. a şi b), zigoţii rezultaţi din astfel de gameţi nefiind viabili.

- dacă cele două segmente translocate vor fi lungi, între perechile omoloage ale acestora se vor forma chiasme care, deplasându-se spre capetele cromozomului, vor forma în metafază o figură în formă de inel (fig. 12.8. b), care poate lua şi forma de 8 (opt), aşa cum reiese din figură.

242

Fig. 12.8. Conjugarea şi comportarea ulterioară a cromozomilor în meioză, în cazul unei translocaţii heterozigote:

a) . porţiunile translocate sunt scurte;b) . porţiunile translocate sunt lungi.

În primul caz, în anafază, cromozomii se despart, migrând la fiecare pol câte un cromozom normal şi unul translocat. Gameţii care se vor forma vor fi dezechilibraţi, neviabili, deoarece prezintă duplicaţii sau deficienţe. În cel de-al doilea caz, când cromozomii se dispun în formă de 8, jumătate dintre ei - cei normali - migrează către un pol, iar cealaltă jumătate - cei translocaţi - către celălalt pol.

După cum este firesc, în primul caz se vor forma gameţi fertili, iar în cel de-al doilea caz, gameţi sterili. Forma de inel sau de 8 depinde de lungimea segmentelor translocate, de poziţia centromerului, precum şi de dispoziţia chiasmelor.

Unele translocaţii heterozigote au devenit stabile şi constituie elemente ce diferenţiază structural cromozomii speciilor apropiate. Ele constituie o stare normală în genotip la genurile Oenothera, Datura, Campanula ş. a. După numărul perechilor de cromozomi ce au suferit translocaţie, se formează: inele din patru elemente - când există o translocaţie reciprocă, inele cu şase elemente - când există o translocaţie între trei perechi de cromozomi. Asemenea formaţii perturbă combinaţia liberă a cromozomilor şi segregarea genelor.

Analiza cromozomilor în meioză ne ajută la identificarea translocaţiilor. Când se observă dispoziţia în cercuri a patru cromozomi vom şti că este vorba de o translocaţie homozigotă. Ea se obţine încrucişând indivizi heterozigoţi şi homozigoţi prin translocaţie şi analizând apoi meioza la hibrizii obţinuţi. Prin încrucişarea între ei a indivizilor heterozigoţi prin translocaţie se va produce treicategorii de indivizi: homozigoţi normali, heterozigoţi prin translocaţie, homozigoţi prin translocaţie reciprocă. Indivizii heterozigoţi prin translocaţie reciprocă la plante se mai pot identifica analizând viabilitatea polenului. Există o translocaţie când numai 50% din polen este viabil.

Să analizăm acum influenţa pe care o are translaţia asupra mersului meiozei.

243

Vom considera o pereche de cromozomi la care unul din ei a suferit o translaţie. Împerecherea locilor omologi face ca cei doi cromozomi să facă două bucle situate la niveluri diferite. După poziţia centromerilor se pot ivi două situaţii. (figura 12.9.).

Să considerăm că în una din situaţii centromerii se găsesc în porţiunea dintre două bucle, aşa cum arată fig. 12.9. a.

În meioză vor apărea patru tipuri de cromozomi. Dacă nu se produce nici un crossing-over în regiunea cuprinsă între bucle, apar două tipuri de cromozomi normali. Dacă crossing-over-ul are loc în această regiune, apar două tipuri de cromozomi, dintre care unul poartă o duplicaţie şi altul o deleţie.

A doua situaţie corespunde prezenţei centromerilor în interiorul celor două bucle(fig. 12.9. b). Un crossing-over, ce s-ar produce în regiunea dintre bucle va da naştere la cromozomi nefuncţionali, deoarece unul va conţine doi centromeri, iar celălalt nici unul. În caz contrar vor apărea cromozomi funcţionali. O translaţie poate împiedica crossing-over-ul într-un segment ce a suferit această deplasare.

Fig. 12.9. Conjugarea cromozomilor cu structură heterozigotă în cazul unei translocaţii: a- centromerul se găseşte între cele două bucle; b- centromerul se găseşte în interiorul buclei.

12.3. EFECTUL DE POZIŢIE9

In cursul acţiunii lor, genele se influenţează una pe alta. Intr-un capitol anterior s-a studiat tocmai această interacţiune dintre gene. Este logic să admitem că schimbarea ordinii de cuplare a genelor, datorită restructurărilor cromozomice modifică acţiunea

244

genelor şi, în consecinţă, şi fenotipul. Efectul pe care-l produce o genă în funcţie de poziţia ei pe cromozom s-a numit efect de poziţie.

Termenul a fost introdus de A. Sturtevant (1925) şi tot el a fost cel care l-a demonstrat. Este vorba de o formă mutantă de Drosophila ce prezintă o reducere a numărului de omatidii (faţete), însuşire numită „bar”.

însuşirea „ bar” este legată de o genă semidominantă B, localizată pe cromozomul X. Cercetările de astăzi pun la îndoială prezenţa, în cazul de faţă, a unui efect de poziţie. Efectul „bar” este datorat unor duplicaţii a regiunii 16 A, notată astfel pentru cromozomii uriaşi din glandele salivare la Drosophila. Un crossing-over în această regiune produce o triplare a segmentului, iar efectul de reducere ochiului este şi mai puternic şi se numeşte „ultrabar”. S-ar părea că numărul de doze a genei pot să mărească intensitatea fenomenului. Dar la acelaşi număr de doze, câteodată, efectul nu este exact acelaşi. Diferenţele sunt puse pe seama efectului de poziţie a genei.

Dacă exemplul de mai sus a pus unele semne de întrebare, fiind greu să se delimiteze efectul duplicării de efectul de poziţie al genei, exista la Drosophila alte exemple, unde efectul de poziţie este mai sigur: efectul împestriţării (panaşurii).

La Drosophila, prin încrucişarea dintre femele homozigote pentru gena white (ochi albi) cu masculi ce posedă alela normală w+ (ochi roşii), dar supuşi unui tratament cu raze X, se obţin indivizi cu ochi normali (roşii). Generaţiile ce se obţin din aceştia prezintă însă omatidii ce au diferite nuanţe de roşu. însuşirea aceasta este însoţită întotdeauna de restructurări cromozomice în apropierea locusului genei white. Explicaţia fenomenului s-a făcut cu ajutorul a două ipoteze:

a) odată cu restructurarea cromozomului s-a produs o mutaţie genică;b) poziţia genei white îşi păstrează locusul, dar este influenţată de genele din

apropiere, nou venite odată cu restructurarea cromozomului. A doua ipoteză pare mai verosimilă.

O dovadă şi mai convingătoare îl oferă exemplul clasic ce priveşte acţiunea genei recesive hairy (h), localizată în braţul stâng al cromozomului 3 la Drosophila. In stare homozigotă, această genă determină apariţia perişorilor numai pe unele părţi ale corpului, mai ales pe scutelum. Ea acţionează în stare heterozigotă numai când are loc o translocaţie între cromozomii III şi IV. In cazul revenirii în cromozomul III, unde este localizată normal, ea îşi restabileşte acţiunea iniţială. Această constatare a evidenţiat, în plus, faptul că efectul de poziţie poate fi reversibil.

Efectul de poziţie este mai bine cunoscut pentru acţiunea unor gene la Drosophila şi mai puţin cunoscut pentru alte organisme. Fenomenul împestriţării (panaşurii) la Oenothera blandina (obţinută de De Vries prin mutaţie din O. lamarckiana) sau Zea mays se pare că nu este străin de efectul de poziţie a genei ce răspunde de această însuşire.

La Zea mays, efectul de poziţie a fost semnalat de Barbara Mc Clintock (1950-1955), identificând doi loci care pot dirija efectul unor gene. Locusul Ac este activator şi se comportă dominant, locusul Ds -de disociere - este recesiv, nefiind funcţional. În absenţa lui Ac, B. Mc Clintock a demonstrat experimental că activitatea genelor depinde de tipul de cromatină a cromozomului. La porumb multe gene cu expresie fenotipică diferită sunt limitate de acţiunea genelor Ac şi Ds, schimbându-şi penetranta şi expresivitatea. Genele Ac şi Ds, dar şi altele, îşi pot schimba locusul în interiorul cromozomului, dar şi între cromozomi neomologi, fenomen denumit transpoziţie, iar genele respective, gene

245

transpozabile sau transpozoni.Lumea ştiinţifică a privit cu neîncredere existenţa elementelor transpozabile

(mobile) în genom, dar timpul a demonstrat realitatea, B. Mc Clintock fiind laureată a Premiului Nobel în anul 1983.

12.4. RESTRUCTURĂRILE CROMOZOMICE ŞI IMPORTANTA LOR PENTRU EVOLUŢIE

9 9

Restructurările cromozomice sunt determinate în majoritatea cazurilor de influenţa agenţilor externi, fizici sau chimici, precum şi de o anumită stare fiziologică a organismelor. Ele se produc în două etape: ruperea unor fragmente din cromozomi şi reunirea lor într-un anumit mod, la acelaşi sau la alţi cromozomi. Atunci când au loc în interfază, se numesc cromozomice, iar când au loc în timpul diviziunii, în stadiul de două cromatide ale cromozomului, cromatidice. După modul de fragmentare şi alipire, există mai multe tipuri de restructurări (aberaţii) pe care le-am descris anterior.

Oricare ar fi tipul de restructurări, ele stau la baza schimbării ordinii genelor în grupele de cupare, modifică transmiterea normală a genelor la urmaşi şi modifică fenotipul organismelor.

Restructurările cromozomice, având rol în mecanismele de recombinare a genelor, contribuie la evoluţia speciilor în natură şi la formarea unor forme de plante şi animale cu însuşiri valoroase. Selecţia naturală, în luptă pentru existenţă, şi selecţia artificială, de interes economic, va alege şi va perpetua indivizii care poseda reconstrucţii cromozomice, fie în interesul individului din natură, fie în interesul omului.

Reconstrucţiile cromozomice produc variaţii în cadrul speciei. Noua succesiune a genelor în grupele de linkage aduce modificări în acţiunea lor, iar imposibilitatea conjugării cromozomilor în meioză, asigură izolarea noilor forme.Bineînţeles că nu toate aceste forme supravieţuiesc şi că este vorba numai de cele viabile şi adaptabile la condiţiile de existenţă.

Se ştie că, spre deosebire de autozomi, cromozomii sexului nu sunt omologi, decât în unele mici porţiuni. Cromozomul Y este de obicei mai mic şi aproape inert din punct de vedere genetic. Neomologia acestor cromozomi este atribuită astăzi restructurărilor cromozomice, care au avut loc în interiorul genomului pe parcursul evoluţiei.

Concluzia logică ar fi că, prin translocaţie au fost transportate porţiuni din autozomi în cromozomii sexului. De aceea, la unele specii, numărul cromozomilor sexului se măreşte. Cromozomii sexului împiedică încrucişarea indivizilor din specii sau varietăţi străine.

MUTAŢIILE DE GENOM9

Moto:"Natura nu are nici un respect pentru viaţă. Natura tratează viaţa ca şi cum ar fi lucrul cel mai neînsemnat din lume. Produsă de milioane de ori, ea este în cea mai mare parte anihilată rapid sau aruncată ca o pradă, pentru ca o altă viaţă

246

să se poată hrăni. <Să nu chinui, să nu pedepseşti>. Natura ignoră această poruncă. Făpturile sale depind de torturile pe care şi le aplică reciproc în lupta eternă"

Erwin Schrödinger

Speciile de plante şi animale posedă în mod obişnuit un număr constant de cromozomi, în celulele somatice 2n, iar în cele sexuale, n. Numărul de cromozomi a speciilor eucariote variază în limite foarte mari: Ascaris megalocephala var. univalens are 2n = 2, în timp ce radiolarul Aulacantha 2n = ± 1600.

În cadrul unor genuri, s-a constatat că unele specii au un număr de cromozomi ce reprezintă un multiplu al unui număr de cromozomi de bază sau genom, care se notează cu x. De exemplu, în cadrul genului Triticum, există specii ce posedă 14, 21 şi 42 de cromozomi, deci, un multiplu al genomului x = 7; în cadrul genului Rosa, speciile pot avea 14, 21, 28, 35, 42, 56 cromozomi, genomul în acest caz fiind x = 7 ş.a.

Celulele sexuale, conţinând câte un set cromozomic, sunt haploide. Numărul haploid de cromozomi (n) nu corespunde întotdeauna cu numărul de cromozomi de bază (x). De exemplu, la Triticum monococcum x = 7 şi n = 7, pe când la Triticum aestivum, x = 7 dar n = 21. Când numărul haploid de cromozomi corespunde cu numărul de cromozomi de bază (genomul sau numărul monoploid), numărul cromozomilor din celulele somatice corespunde cu starea diploidă a organismului, iar când în celulele somatice există un multiplu al numărului monoploid, determină starea poliploidă.

Fenomenul de multiplicare a numărului de genomuri se numeşte poliploidie. Poliploidia este considerată o mutaţie de genom.

Există cazuri când variaţia numărului de cromozomi se manifestă chiar la nivelul unor ţesuturi diferite ale aceluiaşi individ. Astfel, în cazul spanacului (Spinacea oleracea) care are 2n = 12, în celulele meristematice ale rădăcinilor sau identificat în celule cu 2n = 24, 48 şi 96 cromozomi, iar la mamifere, în ficat, sunt celule cu număr dublu sau quadruplu de cromozomi.

CAPITOLUL 13

247

13.1. CLASIFICAREA VARIAŢIILOR NUMERIC CROMOZOMICE

Ţinând seama de multitudinea de tipuri de variaţii numeric cromozomiale, este necesară clasificarea acestora, folosindu-se nomenclatura din literatura de specialitate. Această clasificare este redată în figura 13.1.

Euploidia se împarte în: monoploidie, când celulele somatice ce posedă un număr de cromozomi egal cu cel al genomului (x) şi poliploidie, când celulele somatice au un multiplu al numărului de genomuri.

monoploidia perisoploidiaautopoliploidia poliploidia artioploidia

alopoliploidia (amphiploidia)

Variaţii numeric cromozomice

nulisomia (2n-2)hipoploidia

monosomia (2n-1)Aneuploidia

\ trisomia (2n+1)hiperploidia

tetrasomia (2n+2)

Fig.13.1 Clasificarea variaţiilor numeric cromozomice

În funcţie de numărul garniturilor cromozomice poliploizii pot fi triploizi (3x), tetraploizi (4x), pentaploizi (5x), hexaploizi (6x) etc., observându-se că unii conţin un număr par de genomuri şi se numesc artioploizi (4x, 6x, 8x etc.), iar alţii un număr impar de genomuri, denumiţiperisoploizi (3x, 5x, 7x, 9x etc.).

În funcţie de originea garniturilor cromozomice poliploidia poate fi de mai multe tipuri: autopoliploidia, când organismele posedă mai multe garnituri omoloage, rezultate prin multiplicarea genomului propriu; alopoliploidia, când organismul are mai multe garnituri cromozomice, dar de origine diferită, rezultate în urma hibridărilor interspecifice. Organismele care înglobează genomurile a două sau mai multe specii, urmată de o dublare a numărului de cromozomi, se numesc amphiploide.

Poliploidia este urmată de o mărire a cantităţii de ADN per nucleu. Există specii la care, deşi are loc o multiplicare a numărului de genomuri, cantitatea de ADN nu se modifică acestea fiind denumite pseudopoliploide.

Modificarea numărului de cromozomi dintr-o garnitură cromozomică, prin absenţa unuia sau a mai multor cromozomi sau prezenţa în plus a unuia sau

248

248

mai multor cromozomi, se numeşte aneuploidie. Mărirea numărului de cromozomi în cadrul genomului se numeşte hiperploidie, iar micşorarea numărului de cromozomi, hipoploidie.

Aneuploidia este însoţită de modificarea cantităţii de ADN per nucleu, există însă şi fenomenul de pseudoaneuploidie, când numărul de cromozomi din genom variază, însă cantitatea de ADN rămâne constantă.

13.2. EUPLOIDIA

13.2.1. MonoploidiaDenumită şi haploidia adevărată sau euhaploidie, constă în faptul că

organismele posedă în celulele somatice un număr de cromozomi egal cu numărul de cromozomi de bază sau un genom (2n = x).

Având un singur genom în celulele somatice, monoploizii au o serie de caracteristici morfologice şi biologice, cum ar fi: sunt aproape complet sterili, ceea ce îi face inutilizabili în practică. Avantajul monoploizilor constă în faptul că, în urma studiilor genetice, dacă prezintă caracteristici avantajoase, numărul cromozomilor poate fi dublat, obţinându-se linii complet homozigote. După testarea capacităţii combinative a liniilor respective, unele pot fi folosite ca genitori în obţinerea de hibrizi. Utilizarea monoploizilor scurtează foarte mult timpul de obţinere a liniilor total homozigote, de la 6-8 ani după metoda clasică, la numai doi ani.

În mod natural, monoploizii apar cu o frecvenţă redusă, de la 0,01% până la 6%, pe următoarele căi:

a) ginogeneză, când embrionii se dezvoltă din oosfere nefecundate;b) androgeneză, când embrionii rezultă din celule mascule (fără

fecundare);c) apogamie, când embrionii rezultă din sinergide sau antipode.Având în vedere importanţa monoploizilor, monoploidia a fost indusă

prin iradierea polenului cu raze X sau UV, pentru a distruge unul din cei doi nuclei spermatici şi în felul acesta, reducându-se posibilitatea fecundării oosferei, creşte şansa apariţiei monoploizilor sau inactivarea ambilor nuclei spermatici cu diferite substanţe chimice, caz în care, oosfera nefecundată poate forma un embrion monoploid.

Din punct de vedere morfo-fiziologic, monoploizii, comparativ cu formele normale din care au provenit, au o vigoare redusă, creştere lentă, grad ridicat de sterilitate.

Diviziunea mitotică la organismele monoploide prezintă mari modificări, dar mai ales meioza, pe parcursul căreia, nerealizându-se sinapsa cromozomilor, deoarece nu există omologie între cromozomi, nu se formează celule sexuale sau cele ce se formează sunt neechilibrate genetic, ceea ce determină sterilitatea monoploizilor.

Haploidia este fenomenul de reducere la jumătate a numărului de cromozomi în celulele somatice. După modul cum rezultă din diploizi, tetraploizi, hexaploizi etc., haploizii pot fi: monoploizi, diploizi, triploizi etc. Haploidia corespunde numai într-un singur caz cu monoploidia, atunci când reducerea la jumătate a numărului de cromozomi are loc la organismele diploide (2n = 2x).

Haploidia poate fi întâlnită ca fenomen natural, la unele Bryophitae şi Talophitae, la masculii unor insecte (albine, viespi, termite), la unele metazoare şi

249

ciuperci (Aspergillus, Fusarium etc.) şi în gametofitul plantelor superioare.Când haploidia este utilă, este provocată prin androgeneză sau prin eliminarea

de cromozomi.Haploizii şi monoploizii au o deosebită importanţă teoretică şi practică:- având un singur set de cromozomi, studiul fiecărui cromozom a furnizat

informaţii asupra valorii genetice a unui genom;- din punct de vedere citologic, monoploizii oferă posibilitatea cunoaşterii

modului de segregare a cromozomilor neperechi, în meioză, realizarea sau nu a sinapsei, arată gradul de înrudire dintre specii;

- diploidizarea monoploizilor duce la realizarea liniilor complet homozigote, într-un timp scurt;

- monoploizii androgeni oferă posibilitatea studiului efectului citoplasmei străine asupra genotipului, transformarea într-un timp scurt a liniilor consangvine normale în linii androsterile. În ultimul timp, studiul acestor forme preocupă colective mari de geneticieni şi amelioratori, deoarece obţinerea de hibrizi pe calea monoploidiei este simplificată şi de scurtă durată.

13.2.2. PoliploidiaPrimele cercetări referitoare la fenomenul de poliploidie au fost efectuate de I.

I. Gherasimov (1889) care a dublat numărul de cromozomi la alga Spyrogira, prin scăderea temperaturii în timpul metafazei.

Denumirea de poliploidie a fost introdusă de G. Winkler (1916), pentru a desemna plantele ce posedau un număr multiplicat de genomuri.

În funcţie de originea garniturilor cromozomice, poliploidia poate fi de două feluri: autopoliploidia (autoploidia) şi alopoliploidia (aloploidia).

13.2.2.1. Autopoliploidia este multiplicarea garniturilor de cromozomi pe seama aceluiaşi număr de bază al unei specii. Multiplicarea este cauzată de tulburări în procesele de diviziune mitotică sau meiotică şi anume:

- În diviziunea meiotică, din cauza nereducerii cromatice se formează gameţi cu acelaşi număr de cromozomi, egal cu cel din celulele somatice. Un asemenea gamet diploid, în procesul de fecundare cu un al doilea gamet, normal, haploid, va forma un zigot, respectiv un organism triploid (2n = 3x). Dacă ambii gameţi sunt diploizi se va forma un organism tetraploid (2n = 4x).

- În diviziunea mitotică pot interveni cauze care să oprească formarea fusului nuclear, migrarea cromozomilor spre cei doi poli ai celulei ne mai având loc. Ca urmare, nu se mai formează celulele fiice, cromozomii, în număr dublu, rămân în aceeaşi celulă. Dacă fenomenul are loc la începutul formării zigotului, organismul devine tetraploid iar gameţii pe care îi va forma vor fi diploizi. Aceştia vor menţine mai departe autotetraploidia.

- În diviziunea mitotică într-un singur organ, de exemplu al unei plante, se va produce la o celulă fenomenul de dublare a numărului de cromozomi. Dintr-o astfel de celulă, cu un număr dublu de cromozomi, poate lua naştere o formaţiune vegetativă, o ramură, care va forma în flori gameţi diploizi. Prin autofecundare vor apărea forme tetraploide.

Mai recent J. A. Serra (1968) consideră ca prim factor al formării

250

autopoliploizilor endomitoza, în care nu se formează fusul de diviziune, membrana nucleară nu se fragmentează, astfel că un nucleu diploid devine 4n, 8n, 16n etc.

Se întâlnesc două tipuri de plante autopoliploide:Perisoploide, cu un număr impar de garnituri cromozomice (3x, 5x, 7x). Din

cauza numărului impar de genomuri repartiţia echilibrată a cromozomilor în gameţi nu este posibilă, astfel de plante vor produce gameţi sterili, supravieţuind numai prin reproducerea vegetativă.

Artioploide, cu un număr par de garnituri cromozomice (2x, 4x, 6x). La aceste plante meioza decurge normal. Cu toate acestea, cromozomii omologi, în profaza meiozei, se asociază în mod diferit, formând univalenţi. Dacă polivalenţii au un număr impar de cromozomi, repartiţia regulată a cromozomilor la cei doi poli ai celulei devine imposibilă şi, ca urmare, gameţii formaţi sunt sterili.

Prezenţa sterilităţii la un număr mare de plante autopoliploide a determinat pe unii autori să considere că există o corelaţie între autopoliploide, sterilitate şi înmulţirea vegetativă a plantelor. La genurile Chrysanthemum, Polygonum şi Discorea, formele diploide nu au rizomi, în timp ce cele tetraploide, hexaploide şi octoploide au. Din cauza sterilităţii ele s-au menţinut pe cale vegetativă.

Meioza la autotetraploizi este variabilă, putând decurge normal, dar existând şi posibilitatea apariţiei multor anomalii. Aceste anomalii se datorează prezenţei în profaza I a câte patru cromozomi omologi, deci în stadiul de zigonemă vor forma sinapsă patru monovalenţi, nu doi (bivalenţi). În zigonema pot rezulta următoarele asocieri: tetravalenţi, trivalenţi + univalent, bivalenţi + doi univalenţi, patru univalenţi.

În meioza autotetraploizilor, datorită asocierii întâmplătoare a cromozomilor, are loc o segregare fenotipică şi genotipică, diferită de cea a diploizilor. La un diploid heterozigot Aa, în F2 segregarea genotipică este 1/4 AA : 2/4 Aa : 1/4 aa, iar cea fenotipică, % dominant, % recesiv. În descendenţa autogamă a unui tetraploid AAaa, în funcţie de repartiţia alelelor în cei patru cromozomi, pentru acelaşi locus pot apare cinci genotipuri: AAAA (quadruplex), AAAa (triplex), AAaa (duplex), Aaaa (simplex), aaaa (nulliplex).

Gameţii produşi de un autotetraploid duplex AAaa (în lipsa crossing- over-ului), pot avea următoarea structură genotipică şi frecvenţă: 1 AA : 4 Aa : 1 aa. Întâlnirea întâmplătoare a acestor gameţi, în cazul autopolenizării, în F2 segregarea genotipică va fi: 1 AAAA : 8 AAAa : 18 AAaa : 8 aaaA : 1 aaaa, iar cea fenotipică, 35 A : 1 a.

Din cauza deficienţelor ce apar în meioză, autopoliploizii nu au, în general, şanse de a supravieţui, aşa că rolul lor în evoluţie este mai puţin important. Există specii ale unor genuri care au apărut totuşi pe calea autopoliploidiei: în genul Chrysanthemum, specii ce au 18, 36, 54, 72, şi 90 de cromozomi, în genul Solanum, specii ce au 24, 36, 48, 60, 72, 96, 108, 120 şi 144 cromozomi precum şi alte specii ale genurilor Medicago, Arachis, Phleum, Festuca, Poa ş.a.

13.2.2.2. Alopoliploidia (amphipoliploidia) este tipul de poliploidie care apare în urma hibridării între specii, prin adiţia de garnituri cromozomice străine. Diferenţa dintre genomuri face ca între garniturile de cromozomi a alopoliploizilor să nu existe omologie. Acestea sunt diferite atât ca număr de cromozomi cât şi ca tip de gene. Când alopoliploidul însumează cele două garnituri cromozomice somatice ale părinţilor, el se numeşte amphidiploid.

251

Alopoliploizii sunt în majoritatea cazurilor sterili. Din cauza neomologiei dintre cromozomi, în profaza meiozei fiecare cromozom se comportă independent, ca univalent. În anafaza meiozei, ei se distribuie în mod neregulat la cei doi poli, aşa încât în game ţi va apărea un număr diferit de cromozomi. Gameţii vor fi sterili, în afară de cazul unei omologii parţiale, când fertilitatea lor va fi scăzută.

Alopoliploizii care însumează cele două garnituri diploide de cromozomi a celor două specii parentale se numesc amphidiploizi. Ei sunt fertili deoarece fiecare cromozom având omologul său, are cu cine să se conjuge în meioză şi formează bivalenţi pentru cromozomii fiecărei specii în parte.

Dacă din gameţii care participă la fecundare unul este haploid iar celălalt diploid, se va forma un alotriploid. Acesta este steril deoarece cromozomii unei specii va forma bivalenţi, dar a celeilalte vor rămâne univalenţi şi se vor distribui neuniform în meioză la polii celulei.

Amphidiploidia prezintă importanţă atât pentru menţinerea ei în natură cât şi pentru activitatea practică a omului. Sunt citate în literatura de specialitate numeroase exemple privind apariţia spontană sau dirijată de om a amphidiploizilor.

L. Dicby (1912) descrie apariţia unui amphidiploid, Primula kevensis (cu 2n = 36) prin încrucişarea dintre Primula floribunda (2n = 18) cu Primula verticillata (2n = 18).

G. D. Karpecenko (1927) obţine un amphidiploid Raphanobrassica (2n = 36) prin încrucişarea dintre Raphanus sativus (2n = 18) cu Bras sica oleracea (2n = 18) (figura 13.2.).

J. Gregar şi F. Sansome (1930) obţin un amphidiploid Phleum pratense hexaploidum (2n = 42) încrucişând Phleum pratense (2n = 14) cu Phleum alpinum (2n = 28).

A. Muntzing (1932) obţine amphiploidul Galeopsis tetrahit (2n = 32) din

l l f

JU4-IH irP-mtl t r 4

Fig. 13.2. Fructul şi cromozomii de la Raphanus sativum (A) şi Brassica oleracea (B) şi a câtorva poliploizi (C,D,E,F,G) obţinuţi prin încrucişarea dintre A şi B.

252

încrucişarea lui Galeopsis pubescens (2n = 16) cu Galeopsis speciosa (2n = 16).H. A. Jones şi A. E. Clarke (1942) încrucişând Allium cepa (2n = 16) cu

Alliumfistulosum (2n = 16) au obţinut amphidiploidul cu 2n = 32 (fig. 13.3.).

Acestea constituie câteva exemple prin care omul, folosind amphidiploidia poate obţine forme noi de plante. Dacă formele noi prezintă avantaje pentru producţie, ele pot fi utilizate ca soiuri.

Amphidiploidia naturală poate constitui puncte de plecare în geneza unor specii noi, dar numai în cazul în care ea modifică ereditatea în avantajul perpetuării lor. În caz contrar, dispar fără a lăsa urme.

Alopoliploizii se pot obţine din încrucişarea a două, dar şi a mai multor specii de plante. De obicei, hibrizii dintre două specii sunt sterili, numai cei amphidiploizi sunt fertili. Aceştia, încrucişaţi cu o altă specie diploidă produc un hibrid alotriploid, care de asemenea este steril. Hibridul alotriploid poate deveni fertil în cazul în care reuşim să-i dublăm garnitura de cromozomi prin autopoliploidie.

In funcţie de modul cum ia naştere, amphidiploidia poate fi de trei tipuri: amphidiploidie genomică, amphidiploidie segmentală, autoalopoliploidia.

Amphiploidia genomică sau clasică este rezultatul hibridării între specii cu genomuri diferite (ex. AA x BB) şi ca urmare, cromozomii uneia nu realizează sinapse cu cromozomii celeilalte, planta fiind sterilă. Prin dublarea numărului de cromozomi a hibridului din generaţia Fi se obţin amphidiploizi fertili.

Amphidiploidia segmentală este tipul de amphidiploidie care provine din hibridarea unor specii cu genomuri parţial sau complet omoloage, astfel că, după ce se realizează dublarea numărului de cromozomi, în meioză cromozomii nu se împerechează normal, ci formează tetravalenţi, trivalenţi şi univalenţi, determinând un anumit grad de sterilitate.

Autoalopoliploidia este fenomenul prin care se dublează numărul de cromozomi la un amphidiploid. De exemplu, amphidiploidul AABB poate deveni un autoalooctoploid, AAAABBBB.

Alopoliploidia poate determina diferite grade de sterilitate, deoarece tipurile de abateri de la mersul normal al meiozei sunt foarte variate. Pentru a putea înţelege mai bine cum decurge meioza la alopoliploizi este necesar să descriem două fenomene: autosindeza şi alosindeza.

Prin autosindeză sau autoconjugare se înţelege procesul de conjugare, între ei,

A B <3Fig. 13.3. Amphiploidia la Allium cepa: A-cromozomii la Allium cepa;

B-cromozomii la amphiploid; C-cromozomii la Allium fistulosum (după Jones şi Clarke, 1942)

253

a cromozomilor de la fiecare părinte în parte. Să presupunem că un aloploid ar poseda un genom format din garniturile celor doi părinţi, AA şi BB. La o autosindeză A se conjugă cu A şi B cu B.

Prin alosindeză se înţelege conjugarea cromozomilor care provin de la părinţi deosebiţi. Folosindu-ne de genomul notat mai sus AABB, o parte din cromozomii speciei A se conjugă cu cromozomii speciei B.

13.3. MODIFICĂRILE MORFOLOGICE ŞI FIZIOLOGICE ALE POLIPLOIZILOR

Poliploidia atrage modificări fenotipice foarte variate. Variate ca proporţie, începând cu unele foarte discrete, greu de sesizat şi terminând cu altele foarte vizibile, până la gigantism; variate ca efect vital, producând debilitatea organismului sau vigoarea lui sporită. Modificările pot afecta întregul organism sau numai o parte din el. La plante, tetraploizii prezintă foarte frecvent organe vegetative şi de reproducere mult mai mari în comparaţie cu diploizii din care sau format. In unele cazuri efectul este însă invers aşa cum este la tomate unde tetraploizii sunt de dimensiuni mai mici decât plantele diploide.

O caracteristică generală a poliploizilor este creşterea în dimensiune a celulelor. Este un caracter după care se poate pune în evidenţă gradul de poliploidie al plantelor. Stomatele, în general, sunt mai mari la plantele tetraploide decât la cele diploide. La Crepis capilaris (2n = 6) există o corelaţie directă între mărimea celulelor şi numărul de garnituri cromozomice ce se găsesc în nucleul acestora.

Creşterea în dimensiune a celulelor atrage după sine, în unele cazuri, scăderea numărului de celule din ţesutul respectiv. Acest fapt s-a observat, de exemplu, în frunzele muşchiului Funaria.

Mărirea volumului celulelor atrage după sine şi modificarea raportului dintre substanţele care se găsesc în celule şi de aici şi modificări de ordin fiziologic.

Frunzele plantelor poliploide pot prezenta modificări vizibile în ceea ce priveşte forma lor, mărimea sau culoarea. La tetraploizi, în general, frunzele sunt mai groase, mai late şi de o culoare mai închisă. Creşterea în dimensiuni a frunzei este însoţită foarte adesea de scăderea numărului de frunze pe plantă.

Creşterea în mărime a ligulei la graminee, face posibilă distingerea plantelor poliploide de cele diploide normale.

Există de asemenea, o corelaţie directă între gradul de poliploidie a plantei şi dimensiunea grăunciorilor de polen şi a numărului porilor germinativi ai polenului. Pe această constatare se bazează şi una din metodele de determinare a gradului de poliploidie la plante.

Tulpinile plantelor poliploide prezintă de asemenea în numeroase cazuri dimensiuni mai mari şi o ramificare mai abundentă.

O altă caracteristică, poate cea mai des întâlnită a plantelor poliploide, este creşterea dimensiunilor florilor şi seminţelor. Paralel cu aceasta, scade numărul lor pe plantă.

Toate modificările morfologice observate la poliploizi sunt corelate de modificări fiziologice şi genetice. Faptul că poliploizii apar în natură în condiţii neobişnuite, la limitele de răspândire a arealului ocupat de diferite genuri, ei sunt dotaţi cu anumite însuşiri de rezistenţă la factorii nefavorabili.

254

13.4. POLIPLOIDIA NATURALĂ ŞI ROLUL EI ÎN EVOLUŢIE

Hugo de Vries (1901) a studiat îndeaproape specia Oenothera lamarckiana şi a constatat că ea se caracterizează printr-un polimorfism accentuat. Una dintre aceste forme, cu dimensiuni foarte mari a denumit-oOenothera gigas.

Gates, în 1909 a constatat că această formă avea un număr dublu de cromozomi (28) faţă de specia iniţială.

H. Nilsson Ehle (1935) descoperă un plop gigantic, care un an mai târziu este determinat de Muntzing ca triploid.

Scherz a observat un caz de poliploidie la viţa de vie, Riesling de Mosela cu 4n = 76 cromozomi faţă de soiul Riesling, ce avea 2n = 38 cromozomi. Noul soi se prezintă ca o mutantă cu struguri cu boabe mari, cu coacere mai timpurie şi cu procent de zahăr mai mare.

Navasin (1929) face o legătură între fenomenul de poliploidie şi arealul ocupat de anumite specii şi ajunge la concluzia că poliploizii apar mai frecvent la

indivizii care au depăşit arealul speciei.Unii autori au căutat să stabilească cu aproximaţie procentul de plante

poliploide, răspândite în natură.Astfel, Tischler susţine că formele poliploide sunt foarte răspândite în natură.

Studiind aproape 90% din flora Europei centrale, constată că, din 652 de genuri, erau diploide 35,8% iar 64,2% genuri erau poliploide. Tot Tischler ajunge la concluzia că poliploizii au o răspândire geografică mai frecventă în regiunile nordice, regiunile arctice, deşerturi, regiuni alpine. Socolovscaia şi Strecova, cercetând flora alpină a Pamirului şi Arcticei observă că 85% din plante sunt forme poliploide pentru zona alpină a Pamirului şi 92,4% pentru condiţiile din Arctica.

Prin determinarea numărului de cromozomi, s-a constatat că diferite specii ale unor genuri, nu sunt altceva decât serii poliploide care au apărut în mod natural.

La genul Triticum, se observă că speciile au ca număr de cromozomi un multiplu de 7:

Triticum monococcum 2n = 14cromozomiTriticum durum 2n = 28cromozomiTriticum aestivum 2n = 42cromozomi

La genul Rumex, speciile au un multiplu de 10 cromozomi: Rumex alpinus 2n=10 cromozomiRumex domesticus 2n=20 cromozomiRumex patientia 2n=30 cromozomiRumex cardifolius 2n=40 cromozomiRumex hymenosepalus 2n= 50cromozomi.

La genul Aegilops şi Hordeum găsim specii cu un număr de 7, 14, 21 cromozomi, la genul Agropyron - 7, 14, 21, 28, 35, la genul Solanum - 12, 24, 36, 48, 60, 72 etc.

Poliploidia este deci foarte frecventă în natură. Totuşi plantele de cultură prezintă mai des cazuri de poliploidie decât cele sălbatice. Această constatare i-a făcut pe unii cercetători să tragă concluzia că evoluţia plantelor de cultură de la formele sălbatice s-a făcut prin multiplicarea numărului de cromozomi. Apariţia procesului sexual a făcut ca primul zigot să constituie prima celulă poliploidă (diploidă), iar endospermul angiospermelor este un triploid.

A. Muntzing arată că, în general, la speciile perene există un număr mai mare de cromozomi decât la speciile anuale ale aceluiaşi gen. De aici, trage concluzia că un număr mare de specii au provenit din forme anuale, cu un număr mai mic de cromozomi. De asemenea, el trage concluzia că există o corelaţie pozitivă între numărul de cromozomi şi durata vieţii unei plante. De exemplu, porumbul autotetraploid obţinut pe cale experimentală este peren, în timp ce formele anuale sunt diploide. Sorgul anual (Sorgum sudanensis) are n = 10 cromozomi, pe când sorgul peren (Sorgum hallepense) are n = 20 cromozomi. Formele anuale de Taraxacum sunt diploide, în timp ce formele perene sunt

256poliploide. Sunt însă şi excepţii, când la speciile perene numărul de cromozomi este egal sau chiar mai mic decât la speciile anuale.

In evoluţia plantelor autogame şi a animalelor care se înmulţesc asexuat, un rol important l-a jucat autopoliploidia. La plantele alogame sau la animalele ce se reproduc

256

sexuat, acest rol l-a jucat alopoliploidia. Tranziţiile între auto şi alopoliploidie sunt continui şi de aceea este greu să le descoperim originea. Numai autopoliploidia poate fi absolută, în timp ce la alopoliploidie genomurile nu pot fi întotdeauna complet diferite. Indicaţii pentru descoperirea lor le poate da analiza meiozei: dacă la o specie tetraploidă există quadrivalenţi în meioză, este vorba de autopoliploidie, dacă există numai bivalenţi, este prezentă alopoliploidia. Alopoliploidia a jucat în evoluţie un rol mult mai mare decât autopoliploidia.

O dovadă că într-adevăr unele specii noi îşi au originea în alopoliploidizarea unor specii vechi sunt resintezele de specii, pe care omul le poate face pe cale artificială.

A. Müntzing (1932) a resintetizat, pe cale artificială, specia Galeopsis tetrahit (2n = 32), încrucişând Galeopsis pubescens (2n = 16), cu Galeopsis speciosa (2n = 16). Hibridul a fost numit Galeopsis pseudotetrahit şi este un alotetraploid. E. S. Mac Fadden şi E. R. Sears (1944) încrucişând Triticum dicoccoides (2n = 28) cu Aegylops squarrosa (2n = 14) au resintetizat specia Triticum spelta (2n = 42). H. Kihara şi F. Lilienfeld (1949) au resintetizat specia Triticum aestivum (2n = 42), încrucişând speciile Triticum persicum (2n = 28) cu Aegylops squarrosa (2n = 14). In literatura de specialitate se întâlnesc numeroase exemple de acest fel.

13.5. POLIPLOIDIA ARTIFICIALĂ

Cunoaşterea fenomenului de poliploidie a contribuit la elaborarea unor metode speciale pentru obţinerea pe cale artificială a poliploizilor. Oricare ar fi metoda, scopul este de a acţiona asupra diviziunii celulelor sau prin procesul de hibridare, pentru a provoca multiplicarea garniturilor de cromozomi.

Nu toate plantele se comportă la fel la poliploidizare. Acesta depinde de metodă, specie, soi sau chiar individ. Dau rezultate mai bune:

- plantele cu un număr mic de cromozomi;- plantele alogame;- plantele folosite mai mult pentru masă verde, decât pentru fructe;- plantele ce se înmulţesc pe cale vegetativă;Poliploizii obţinuţi pe cale experimentală prezintă inconvenientul de a nu putea

fi folosiţi imediat în producţie. De obicei, au o fertilitate scăzută, produc fructe puţine. Mulţi nu sunt rezistenţi la condiţiile adverse ale mediului, la atacul dăunătorilor sau au un ritm de creştere lent. Unii, din contra, prezintă modificări valoroase şi utile pentru practica agricolă şi horticolă, cum ar fi de exemplu un procent ridicat de morfină la mac, de mentol la mentă, un procent mai mare de masă verde la trifoiul roşu tetraploid sau un procent ridicat de zahăr la sfecla triploidă.

Metode de inducere a poliploidiei. Există astăzi diferite metode pentru producerea poliploizilor: metode chimice, fizice şi biologice.

- Metoda altoirii, costă în altoirea a două plante din genuri sau specii deosebite şi apoi secţionarea locului de concreştere. Din secţiune apar muguri şi apoi lăstari, din care unii sunt tetraploizi. Metoda a fost elaborată de H. Winkler (1916), W. A. Greenleaf (1938) la genul Nicotiana şi E.W. Lindstrom şi K. Koos (1931) la tomate (după Raicu P., 1980).

- Metoda centrifugării plantelor a fost elaborată de D. Kostoff (1937). Ea se bazează pe acţiunea forţei de centrifugare asupra celulelor în diviziune, fiind

257

împiedicaţi cromozomii să migreze la polii celulei. Se aplică pe cale restrânsă deoarece este greoaie şi dă rezultate slabe.

- Metoda acţionării cu unele insecte parazite asupra vârfurilor de creştere a plantelor. Se folosesc diferite insecte care se hrănesc prin înţeparea vârfurilor vegetative a plantelor. Acţiunea mecanică, înţepăturile, produc perturbări în diviziunea celulelor din ţesuturi. Metoda se aplică pe cale restrânsă.

- Metoda şocurilor de temperatură se foloseşte cu scopul de a influenţa zigotul plantelor în primele stadii ale diviziunii. A fost elaborată de L. F. Randolph (1932) şi aplicată la porumb. Imediat după fecundare, planta de porumb a fost ţinută circa 24 ore la temperaturi de 440 C. Nici această metodă nu se foloseşte pe scară largă.

Folosirea substanţelor chimice (alcaloizi, narcotice etc.) a dus la elaborarea metodelor chimice folosite şi astăzi intens la obţinerea poliploizilor. Acestea îşi manifestă acţiunea, fie blocând cromozomii în metafază, fie oprind formarea membranelor ce ar trebui să separe celulele aflate în diviziune. Din prima categorie fac parte în primul rând colchicina, acenaftenul, monobromnaftenul ş.a.; din a doua categorie fac parte, paradiclorbenzen, monoclorbenzen ş.a. Dintre toate, cea mai folosită este colchicina.

A. F. Blakeslee şi A. S. Avery (1937) au elaborat diferite tehnici de aplicare a tratamentului cu colchicină la plante şi au obţinut rezultate remarcabile la genurile Nicotiana, Mirabilis, Trifolium ş.a. In general se folosesc soluţii foarte slabe de colchicină, administrate la diferite organe sau părţi din acestea.

Se pot trata seminţe, prin îmbibarea lor în soluţii de colchicină 0,02% - 0,05%, timp de 24-48 ore. Soluţia de diferite concentraţii poate fi administrată pe vârfurile vegetative de tulpină sau rădăcină. Cu soluţie de colchicină, se pot trata şi plante mici, tuberculi, butaşi etc. Cu ajutorul metodelor chimice, în diferite ţări, s-au obţinut forme foarte valoroase care se folosesc în cultură; în Suedia s-au obţinut două soiuri de trifoi. In Germania au fost create linii poliploide la Galega şi Seradela (plante de nutreţ). In Japonia se cultivă un pepene verde triploid; în diferite ţări, şi la noi, se cultivă sfeclă pentru zahăr triploidă; de asemenea, există în cultură forme valoroase poliploide de secară, hrişcă, bumbac; la plante horticole rezultate bune s-au obţinut la plante ornamentale (narcise, stânjenei, dalii, cyclamen ş.a), pomi (măr, păr, lămâi ş.a) şi viţă de vie.

Spre deosebire de regnul vegetal, în regnul animal poliploidia e mai puţin răspândită. Ea se observă mai ales la animale ce se înmulţesc pe cale partenogenetică sau asexuată. La animalele cu înmulţire sexuată, poliploizii care apar prin încrucişare cu formele diploide revin la forma diploidă.

Analizându-se numărul de cromozomi la speciile unor genuri de animale s-a demonstrat evoluţia lor prin poliploidie.

La mamifere (şoareci sau iepuri de casă), cu ajutorul şocurilor de temperatură se pot obţine ovule diploide. Zigoţii ce se formează sunt triploizi, se dezvoltă până în stadiul de blastulă, după care mor.

La hârciog, speciile Cricetus şi Cricetulus griseus au 2n = 22 cromozomi, iar Mezocricetus euratus 2n = 44. Aceasta din urmă nu este altceva decât un tetraploid care a apărut pe cale naturală din primele.

La crustacee, există la aceeaşi specie Daphnia pulex forme sexuate cu 2n = 8 cromozomi şi forme partenogenetice cu 2n = 24 cromozomi.

La Philopode, Artemia salina prezintă forme partenogenetice facultative cu 42

258

şi 48 cromozomi şi altă formă numai partenogenetică cu 2n = 168 cromozomi.La fluturi, s-au obţinut amphidiploizi la genul Bombyx prin încrucişarea

speciilor Bombyx mori cu Bombyx mandarina. Mai întâi s-au obţinut autopoliploizi partenogenetici femeli la Bombyx mori care au fost apoi încrucişaţi cu masculi din specia Bombyx mandarina.

La genul Ascaris există specii diploide univalens şi tetraploide bivalens: Ascaria megalocephala univalens are 2n = 2, iar specia bivalens 2n = 4; specia Ascaris lumbricoides univalens are 2n = 24, iar specia bivalens 2n = 48.

În prezent, cercetările privind poliploidia la animale ocupă o extindere mare. Se lucrează la elaborarea unor tehnici corespunzătoare pentru obţinerea poliploizilor. Mulţi cercetători se ocupă de animale inferioare cum sunt de exemplu infuzorii ş.a.

13.7. ANEUPLOIDIA

Aneuploidia numită şi heteroploidie sau polisomie este modificarea numărului diploid de cromozomi prin adăugarea sau lipsa unuia sau a mai mulţi cromozomi. După numărul de cromozomi în plus sau în minus, ea se clasifică astfel:

- nulisomie 2n-2- monosomie 2n-1- trisomie 2n+1

- tetrasomie 2n+2- dublă trisomie 2n+1+1

Apariţia de celule aneuploide se explică prin abateri de la segregarea normală a perechilor de cromozomi în timpul diviziunii. Ele apar atât în celulele somatice cât şi în cele sexuale, de aceea aneuploidia poate fi atât mitotică cât şi meiotică. Mai frecventă este aceea meiotică, bivalenţii putând fi repartizaţi numai într-o celulă, iar în alta lipsind.

Când garnitura diploidă are un cromozom în plus, aneuploidul va avea formula 2n+1, când va avea un cromozom în minus va avea formula 2n-1. În alte cazuri aneuploidul 2n+1 (trisom) mai poate primi un cromozom suplimentar şi atunci va avea formula 2n+2 (tetrasomi). Dacă adăugarea de cromozomi suplimentari se face în două perechi de cromozomi atunci se formează un dublu trisom 2n+1+1. Când se pierde o pereche de cromozomi omologi se formează un nulisom 2n-2.

Primul studiu de aneuploidie la plante a fost făcut în 1924 de către Blakeslee şi Belling la Datura stramonium. Această plantă are 2n = 24 cromozomi, deci un trisom, cu 24 + 1 cromozomi. Spre deosebire de plantele obişnuite, avea capsulele mai mici, şi ţepi mai mici. Executând diferite încrucişări au obţinut 12 tipuri de trisomi, adăugând pe rând câte un trisom pentru fiecare pereche de cromozomi. Toate aveau fenotipuri bine distincte.

La animale, aneuploidia a fost descoperită la Drosophila de către Bridges. Cazul a fost citat la capitolul referitor la ereditatea sexului, unde s-a prezentat un caz de aneuploidie datorat nondisjuncţiei primare în meioză a cromozomilor sexului. Din încrucişarea drosofilei femele cu ochi albi cu masculi cu ochi roşii, au apărut forme neaşteptate, femele cu ochi roşii şi masculi cu ochi albi. Aceasta din cauză că în urma nondisjuncţiei cromozomilor X au apărut ovule ce aveau XX şi altele nici unul. Primele, fecundate cu spermatozoizi normali, au produs trisomi XXX şi XXY. Zigoţii cu autosomi normali dar cu un singur X sau Y au fost monosomi, primii, masculi sterili, ultimii

259

neviabili.În aceste cercetări, Bridges a arătat că se pot adăuga cromozomi suplimentari şi

la cromozomii autosomi. Lipsa cromozomilor mari II şi III determină letalitatea, a celor din perechea a IV-a, foarte mici, influenţează în sens negativ insecta, fără a provoca neapărat moartea. După cum se adaugă un cromozom la autosomii IV sau lipsesc, aneuploidul se numeşte triplo IV sau haplo IV. Modificările acestea atrag modificări fenotipice: Drosophila haplo IV este de dimensiuni mai mici decât tipul sălbatec şi cu fertilitate scăzută; Drosophila triplo IV, din contra, are dimensiunile corpului mai mari.

Astfel de forme aneuploide au fost studiate şi la alte organisme, în special la plante: ciumăfaie, tutun, porumb, tomate, cereale. Foarte multe forme aneuploide nu sunt viabile sau, unele viabile sunt mai greu de sesizat.

Cercetările din domeniul aneuploidiei au o mare importanţă teoretică şi deschid perspective largi pentru ameliorarea plantelor. înlocuirea unor cromozomi duce la cunoaşterea importanţei lor ereditare şi a genelor ce le conţin. Prin aneuploidie se schimbă numărul de cromozomi dar nu şi grupele de înlănţuire. Modificarea genomului, corelată cu modificările fenotipice constituie o cale de obţinere a unor noi soiuri.

Aneuploidia ajută şi la înlocuirea sau adăugarea unor cromozomi de la unele soiuri de plante de cultură, cu cromozomi de la alte soiuri ce conţin gene valoroase. S-au obţinut în acest sens diferite forme de cereale superioare unora existente în cultură. La grâu, s-au transmutat cromozomi de la alte specii ce conţineau gene răspunzătoare de anumite însuşiri (rezistenţă la boli, secetă ş.a.) de la secară, Aegilops ş.a. La tutun s-au transferat cromozomi de la alte specii apropiate pentru a imprima rezistenţa la viroza tutunului.

In general, se folosesc forme monosomice sau nulisomice care se încrucişează cu formele ce deţin calităţile ce ne interesează din punct de vedere economic.

Pseudoaneuploidia. Este o variaţie a numărului de cromozomi ce se realizează cu ajutorul unui mecanism de fuzionare-fisionare a cromozomilor însoţit de un proces de translocaţie reciprocă, fără să se modifice cantitatea de ADN per nucleu. Prin fisionarea centromerului unui cromozom metacentric, submetacentric sau subtelocentric se formează cromozomi acrocentrici. Prin fuzionarea a doi cromozomi acrocentrici rezultă cromozomi metacentrici, submetacentrici sau subtelocentrici.

Fenomenul a fost pus în evidenţă de W.R. Robertson în anul 1916. Speciile înrudite, care au un număr variat de cromozomi, dar acelaşi număr fundamental (NF) de braţe cromozomice formează o serie robertsoniană. Un exemplu bine studiat este în cadrul genului Drosophila, la care cariotipul primar de la Drosophila virilis (2n=12) s-a transformat prin translocaţia şi fuzionarea centromerilor, dând naştere la mai multe specii: D. texana (2n=10) la care au fuzionat perechile 2 şi 3 de cromozomi, D. littoralis (2n=10) la care au fuzionat perechile 3 şi 4, D. americana (2n=10) la care au fuzionat perechile 2 şi 3 şi cromozomii X cu perechea a IV-a.

Fenomenul aneuploidiei se poate manifesta chiar în cadrul aceleaşi specii, ducând la apariţia aşa-numitului polimorfism cromozomial. Acest fenomen a fost semnalat la Spalax leucodon (orbetele), specie cu posibilităţi reduse de migrare. La indivizii răspândiţi în Caucaz, 2n=48, cei din Bulgaria au 2n=54, iar la noi în ţară, în Transilvania au 2n=50, iar cei din Dobrogea şi Moldova 2n=56.

Aceste serii robertsoniene sugerează existenţa unui proces de evoluţie a cariotipului, proces favorizat de posibilităţile reduse de migrare şi deci formarea de

260

populaţii distincte.

13.8. PSEUDOPOLIPLOIDIA

Fenomenul de pseudopoliploidie este descoperit relativ recent, iar denumirea lui propusă pentru prima dată de E. Bataglia în anul 1956. Este vorba de o multiplicare a numărului de genomuri fără dublarea cantităţii de cromatină- respectiv ADN.

Fenomenul de pseudopoliploidie a fost sesizat la unele specii care posedă cromozomi ce au mai mulţi centromeri sau aceştia sunt localizaţi difuz, pe toată lungimea lor. Apariţia pseudopoliploizilor se datorează regrupării substanţei

261

cromatice într-un alt număr de cromozomi fără o multiplicare a ei, din punct de vedere cantitativ.

Există specii pseudopoliploidie la genul plantei Luzula: Luzula purpurea cu 2n=6, Luzula glabrata cu 2n=12, Luzula campestris cu 2n=12, Luzula parviflora cu 2n=24, Luzula sudetica cu 2n=48; la genul Tatera: Tatera brantsii draco cu 2n=26, Tatera indica ceylonica cu 2n=72. Mai întâlnim pseudopoliploizi şi la genurile de plante Spirogyra, Carex, ş.a. sau la cele de animale Ascaris, Thyanta (hemipter) ş.a.

Identificarea pseudopoliploizilor se poate face folosindu-se mai multecăi:

- Încrucişându-se speciile pseudopoliploide ale aceluiaşi gen se pot urmări la hibrizii F1 cromozomii atât în diviziunea somatică cât şi în cea meiotică: în diviziunea somatică apare un număr de cromozomi 2n + 2n fiecare garnitură păstrându-şi mărimea şi forma cromozomilor respectivi. De exemplu, încrucişând Luzula sudetica cu 2n = 48 cromozomi, mici, cu Luzula campestris cu n = 12 cromozomi, obţinem în Fi un hibrid cu 2n = 30 cromozomi dintre care 24 cromozomi sunt mici şi 6 mari. În meioza plantelor din F1 cei 30 de cromozomi se conjugă în felul următor: la cromozomii mari se asociază cei 24 cromozomi mici formând 6 cromozomi mari.

- Lungimea totală a cromozomilor de la speciile diploide trebuie să fie egală cu cea a speciilor pseudopoliploide, deoarece cromozomii formelor pseudopoliploide s-au format prin fragmentarea cromozomilor speciilor diploide.

Cea mai sigură metodă pentru identificarea pseudopoliploizilor este determinarea cantităţii de ADN din celulele acestora. Multiplicarea numărului de cromozomi trebuie să fie corespunzătoare multiplicării cantităţii de ADN.

În figura 13.4. este reprezentată schematic lungimea cromozomilor unor specii diploide (a) şi lungimea cromozomilor de la două specii pseudopoliploide (b şi c), provenite prin fragmentarea cromozomilor speciei diploide (a).

Fig. 13.4. Pseudopoliploidia: a-specie diploidă cu 6 cromozomi; b-specie pseudopoliploidă cu 12 cromozomi; c-specie pseudopoliploidă cu 24 cromozomi

(Specia b a provenit din specia a şi specia c a provenit din specia b)

CAPITOLUL 4ELEMENTE DE GENETICA POPULAŢIILOR

9

Moto:“Natura nu poate fi învinsă decât supunându-ne

ei” F. Bacon

14.1. NOŢIUNEA DE POPULAŢIE 9 9

În încercările sale, Mendel şi cei care au urmat imediat după el au urmărit repartiţia şi transmiterea genelor alele pe generaţii, referindu-se la grupe mici de indivizi. După expresia fenotipică a genelor şi structura genotipurilor au stabilit diferite rapoarte de segregare genotipică şi fenotipică.

Când vrem să analizăm structura genetică la grupe mari de indivizi, la care înmulţirea indivizilor are loc nedirijat şi unde pot să apară factori care modifică mereu tipul şi frecvenţa genelor şi a genotipurilor metodele de studiu sunt altele. Acestea constituie obiectul unui domeniu aparte al geneticii, genetica populaţiilor.

În primul rând este necesar să se precizeze ce se înţelege prin noţiunea de populaţie. Termenul de populaţie a fost introdus de W. Johannsen în 1903. În lucrarea sa “Uber Erblichkeit in Populationem und in reinen Linieri’ el analizează structura genetică la o populaţie de fasole luând în considerare mărimea seminţelor. Separând după mărime trei categorii de seminţe, reproducându-le generaţiei de generaţie, ajunge la aşa-numitele “linii pure” cu boabe uniforme şi care în descendenţă îşi păstrează acest caracter. A descompus deci populaţia iniţială, heterogenă, în componentele sale.

Populaţiile aparţin, din punct de vedere sistematic, diferitelor specii de plante sau animale. Noţiunea de specie nu trebuie confundată cu cea de populaţie. Specia este o noţiune abstractă şi ea însumează trăsăturile generale în care trebuie să se încadreze diferite grupe de indivizi, populaţiile. În natură nu există specii ci indivizi. Populaţia este forma concretă de existenţă a speciei. Este o unitate naturală a structurii ecologice a speciei.

Populaţiile răspândite în natura spontană sunt formate din grupe de indivizi heterogeni din punct de vedere ereditar, care au aceeaşi origine, se aseamănă şi se înmulţesc între ei fără amestecul altor indivizi şi ocupă un areal cu condiţii ecologice comune. În condiţiile de cultură a plantelor şi de creştere a animalelor, soiurile de plante şi rasele de animale sunt considerate tot populaţii.

Pentru genetică, au importanţă populaţiile mendeliene sau panmictice. Acestea sunt populaţii care se înmulţesc sexuat, fiecare individ având posibilitatea să se încrucişeze cu oricare altul din populaţia respectivă. În felul acesta, se realizează o circulaţie a informaţiilor genetice între indivizi şi se menţine un

263oarecare echilibru în genofondul populaţiei. Nu acelaşi lucru se întâmplă în populaţiile care se reproduc asexuat sau partenogenetic, unde nu este posibilă circulaţia informaţiei genetice, chiar dacă descendenţii cu ascendenţă comună sau apropiată, evoluează paralel.

Populaţiile pot să aibă dimensiuni foarte variabile. Cele care conţin sub 100 de

CAPITOLUL 4indivizi se numesc populaţii mici, cu câteva sute de indivizi, populaţii mijlocii, cu câteva

mii, populaţii mari, iar peste 10.000 de indivizi, populaţii foarte mari. Numărul de indivizi al unei populaţii are o deosebită importanţă pentru cercetările de genetică, deoarece datele folosite în asemenea cercetări au un caracter probabilistic. Cu cât numărul lor este mai mare şi datele obţinute prin calcule sunt mai exacte.

După fenotipul şi genotipul indivizilor, populaţiile se pot clasifica în:- populaţii polimorfe, în care, pe lângă trăsăturile comune, indivizii

manifestă diferenţe vizibile fenotipic (ex. specia umană, specii de ortoptere);- populaţii criptopolimorfe, alcătuite din indivizi cu diferenţe fenotipice

foarte mici, dar cu diferenţe în ceea ce priveşte conţinutul genelor (ex. populaţiile de Drosophila melanogaster). Aceasta se explică prin structura lor heterozigotă şi cu un genofond mare de gene rece sive;

- populaţii aparent uniforme, în care indivizii prezintă mici deosebiri fenotipice şi genotipice, aşa cum sunt rasele de animale şi unele soiuri de plante.

14.2. METODELE FOLOSITE ÎN STUDIUL GENETICII POPULAŢIILOR

9

În studiul populaţiilor genetice se folosesc două metode: metoda descriptivă şi metoda genetică.

Metoda descriptivă constă în caracterizarea fenotipică a indivizilor din cadrul unei populaţii şi stabileşte raporturile care există între diferitele clase de indivizi. Pentru a cunoaşte structura genetică a indivizilor este necesar să urmărim la descendenţii lor modul cum se transmit caracterele. Aceasta se poate realiza prin urmărirea unui număr mic de indivizi, ceea ce contravine celor arătate mai sus. Un al doilea aspect negativ al metodei este faptul că în populaţie există mulţi indivizi ce manifestă aceleaşi caractere, deşi structura lor genetică poate fi diferită. Această metodă nu satisface decât în parte cercetările de acest gen.

Metoda genetică se bazează pe cunoaşterea fondului genetic al populaţiei. Ea se sprijină pe marile descoperiri ale lui Gr. Mendel cu privire la legile eredităţii. Primul om de ştiinţă care a făcut un studiu ştiinţific asupra populaţiilor, folosind metode statistice a fost W. Johannsen (1903). Cercetările care au fost efectuate de către matematicianul G. Hardy în Anglia (1908) şi de medicul W. Weinberg în Germania, pe baza calculelor statistice, au deschis un drum nou în acest domeniu. La acestea s-au adăugat şi cercetările lui R. A. Fischer (1918), J. B. Haldane (1924 - 1932) şi S. Wright (1921).

Pe baza unor metode de calcul se poate aprecia astăzi structura genetică a unei populaţii, precum şi modificarea acesteia în urma acţiunii unor factori.Aceasta are o importanţă enormă pentru explicarea unor aspecte legate de genetica populaţiilor şi evoluţia lor în timp. Foarte important este studiul populaţiilor în activitatea de ameliorare a plantelor şi animalelor, în urma căruia putem crea sau ameliora soiuri de plante şi rase de animale.

14.3. STRUCTURA GENETICĂ A UNEI POPULAŢII9

O populaţie de indivizi însumează un număr enorm de gene care constituie

CAPITOLUL 4genofondul ei. Dacă ne referim la indivizi, la conţinutul de gene a fiecăreia în parte,

deosebim diferite genotipuri. Ele s-au format prin întâlnirea genelor din populaţie în procesul de fecundare. A analiza structura genetică a populaţiei înseamnă a determina tipul şi frecvenţa genelor precum şi tipul şi frecvenţa genotipurilor.

De exemplu, pentru un cuplu de alele Aa, se pot forma trei genotipuri (3 1): AA, Aa, aa; pentru două cupluri, nouă genotipuri (32); pentru zece cupluri 60.000 genotipuri (310) ş.a.m.d. Dar aceste cifre sunt foarte mici faţă de numărul de cupluri de alele existente în populaţii şi o analiză a tuturor este imposibil de realizat. În afară de aceasta, trebuie să arătăm că sub influenţa unor factori, frecvenţa lor se modifică neîncetat. În cercetările care se fac, se iau de obicei un număr mic de gene şi se calculează frecvenţa celor două alele pentru fiecare locus.

În ceea ce priveşte tipul şi frecvenţa genotipurilor dintr-o populaţie, ele depind de tipul şi frecvenţa genelor, de modul cum segregă în gameţi şi de modul cum se întâlnesc în procesul de fecundare. În consecinţă şi numărul şi tipul lor sunt enorm de mari. În cazul genelor şi a genotipurilor pot interveni factori care să modifice frecvenţa lor.

14.4. PANMIXIA ŞI STRUCTURA GENETICĂ A POPULAŢIILOR LEGEA HARDY - WEINBERG

Se poate considera, în mod teoretic, că în procesul reproducerii fiecare individ formează acelaşi număr de gameţi, iar întâlnirea dintre ei să se facă în mod întâmplător. Cu alte cuvinte, în acest caz, fiecare individ ar participa în mod egal la procrearea descendenţilor în generaţiile următoare. Acestui mod de reproducere i s-a dat numele de panmixie, iar populaţiei respective, populaţie panmictică.

Desigur că această situaţie nu este în natură, dar ea se poate apropia în anumite limite de cazurile reale. Aşa este cazul populaţiilor care ocupă o arie geografică restrânsă şi izolată, cum ar fi de exemplu o populaţie de păsări sau insecte de pe o insulă oceanică. Panmixia nu poate fi perfectă deoarece este afectată de numeroşi factori care vor fi trataţi ulterior.

Să analizăm structura genetică a unei populaţii panmictice. Mai întâi ne vom referi la cazul simplu al unei populaţii homozigote pentru două alele (A, a) ale unei gene. Această populaţie va produce un număr egal de gameţi masculi şi femeli cu alelele respective: 0,5% A şi 0,5% a.

Indivizii purtători ai acestor alele încrucişându-se la întâmplare vor produce în Fj combinaţiile (figura 14.1):

0,5% A 0,5% a

0,5% A 0,25% AA 0,25% Aa

0,5% a 0,25% aA 0,25% aa

Fig. 14.1 Frecvenţa genelor într-o populaţie panmictică

În cadrul acestor combinaţii din Fj remarcăm că homozigoţii dominanţi AA apar cu o frecvenţă de 0,25%, homozigoţii recesivi aa cu frecvenţă de 0,25%, iar

CAPITOLUL 4heterozigoţii Aa cu o frecvenţă de 0,5%.

Considerând în generaţia următoare acelaşi mod de formare a gameţilor şi întâlnirea lor liberă, se obţine frecvenţa genotipurilor prezentată în şahul de combinaţie următor (figura 14.2).

În acest tablou frecvenţele genotipurilor sunt următoarele:Genotipul AA însumează 8/32;Genotipul Aa însumează 16/32;Genotipul aa însumează 8/32.

Aceste cifre reprezintă de fapt aceeaşi proporţie între frecvenţa genelor pe care am întâlnit-o mai sus: 0,25% AA, 0,50% Aa, 0,25% aa. Într-o populaţie panmictică frecvenţa genotipurilor este proporţională cu aceea a gameţilor care participă la formarea lor. Gameţii, în cazul de faţă se produc în mod egal, pentru fiecare sex, atât pentru alela A cât şi pentru alela a. Această situaţie face să presupunem că, de la o generaţie la alta, structura genetică a populaţiei nu se schimbă atât timp cât nu intervin factori ce pot modifica frecvenţa genelor,

Să notăm cu p frecvenţa alelei A şi q frecvenţa alelei a. Frecvenţele p şi q reprezintă în mod egal, proporţiile homozigoţilor şi heterozigoţilor aşa cum urmează în tabelul din figura 14.3.

Structura genotipică a populaţiilor de faţă se mai poate scrie:

AA Aa aap2 2pq q2

Nu este greu de observat că frecvenţele în cazul de faţă, se obţin prin dezvoltarea binomului (p+q)2.

Această distribuţie privind frecvenţa genelor şi a genotipurilor într-o populaţie panmictică este cunoscută sub denumirea de legea Hardy - Weinberg, după numele celor doi cercetători, G. Hardy din Anglia şi W. Weinberg din Germania, care în anul 1908, independent unul de altul, au ajuns la aceeaşi concluzie.

Fig. 14.2. Frecvenţa genotipurilor într-o populaţie panmictică

Gameţi masculi

alela alela A afrecvenţa p q

A p AA Aa

CAPITOLUL 4Gameţi A p2 pq

femeli

a q

Aa

pq

aaq2

Fig. 14.3. Frecvenţa genelor (p şi q) într-o populaţie panmictică

Proporţia p2, 2pq, q2, în cazul unei populaţii panmictice, se menţine constantă de-a lungul generaţiilor şi reprezintă aşa numita stare de echilibru a ei. Un astfel de calcul există numai ca ipoteză teoretică şi se foloseşte cu succes ca punct de orientare la aprecierea structurii genetice a populaţiilor în care indivizii se înmulţesc sexuat, alogam.

Conform legii Hardy - Weinberg, frecvenţa unei alele se calculează după formula: p=1-q sau q=1-p, deoarece p+q = 1. Presupunând că s-a stabilit pentru o genă A frecvenţa de 75%, frecvenţa alelei perechi a va fi de p = 1-0, 75 = 0,25 adică de 25%.

J. Rendel (1952) constată că dintr-un efectiv de 2681 viţei de rasă Shorthorn, 1234 au avut culoarea roşie (aa), 1215 culoarea galbenă (Aa) iar 232 culoarea albă (AA). Ţinând seama că fiecare viţel purta câte două alele, câte una pe fiecare cromozom omolog, se poate spune că cei 2681 viţei purtau în total 5362 alele. Dintre acestea 1215 + (2 x 232) = 1679 au fost A, iar restul 1215 + (2

x 1234) = 3683 au fost a. Frecvenţa alelei A, (notată p) este de 1679 = 0,31, iar a5362

3683alelei a, (notată q) este de = 0,69 sau cu 1-0,31 = 0,69.

5362Introducând aceste date în formula pentru calcularea genotipurilor rezultate din

libera combinare a celor două gene vom obţine structura celor trei genotipuri:(0,31 + 0,69)2 = 0,0961 AA + 0,4278 Aa + 0,4761 aa = 1

Cifrele obţinute prin dezvoltarea binomului exprimă raportul între cele trei fenotipuri de viţei din populaţia analizată.

În cazul populaţiilor cu reproducere autogamă echilibrul genetic se modifică, în sensul descreşterii heterozigoţiei în favoarea homozigoţiei. Ritmul scăderii heterozigoţilor şi a creşterii homozigoţilor în procente în funcţie de o pereche de alele se poate observa în tabelul 14.1.

14.5. FRECVENTA GENELOR LEGATE DE SEX9

Structura genetică analizată mai sus se referă la unele perechi de alele plasate în cromozomii omologi. Cu totul alta este comportarea genelor legate de sex, care nu dispun decât de un locus la sexul heterogametic.

Dacă frecvenţa celor două alele A şi a este aceeaşi la ambele sexe, atunci la sexul homogametic vor apare trei genotipuri corespunzător formulei p2 + 2pq + q2. La sexul heterogametic vor apare numai două genotipuri, iar frecvenţele p şi q vor coincide cu frecvenţele celor două alele care se întâlnesc în populaţie.

Tabelul 14.1.Descreşterea heterozigoţiei şi a creşterii homozigoţiei în fUncţie de numărul de generaţii

Generaţia Autofecundare Fraţi x surori

CAPITOLUL 4AA Aa Aa AA Aa aa

1 0,00 100,00 0,00 0,00 100,00 0,002 25,00 50,00 25,00 25,00 50,00 25,003 37,50 25,00 37,50 25,00 50,00 25,004 43,75 12,50 43,75 31,25 37,25 31,255 46,88 6,25 46,88 34,38 31,24 34,386 48,44 3,12 48,44 37,50 25,00 37,507 49,22 1,56 49,22 39,85 20,30 39,858 49,60 0,80 49,60 41,80 16,40 41,809 49,80 0,40 49,80 43,36 13,28 43,3610 49,90 0,20 49,90 44,63 10,74 44,6311 49,95 0,10 49,95 45,65 8,70 45,65

n 50,00 0,00 50,00 50,00 0,00 50,00

Situaţia este mai complexă când frecvenţa celor două alele diferă, la mascul şi femelă. Echilibrul nu se stabileşte la fiecare generaţie aşa cum se întâmplă cu alelele situate pe autozomi, ci după un oarecare număr de generaţii. Dacă notăm cu p 1 frecvenţa unei alele A pentru sexul heterogametic şi cu p2 frecvenţa aceleiaşi alele pentru sexul homogametic, iar cu q1 şi q2 frecvenţele pentru alelele corespunzătoare a, se poate alcătui şahul de combinaţie din figura 14.4.

Din acest şah se vede că la sexul heterogametic alelele A şi a reiau valorile p 2

şi q2 ca şi în generaţia precedentă. La sexul homogametic alelele A şi a se distribuie la fel ca şi la alelele situate pe autozomi (şahul precedent), dar

pi -p2intervalul de timp între cele două sexe este redus la jumătate —2-----------------------------.

Distribuirea genelor din cromozomi se face după tipul criss - cross, adică de la mamă la fiu şi de la tată la fiică.

Ph. L. Héritier (1954) consideră un caz extrem, când sexul heterogametic ar fi omogen pentru alela A, p1 = 100%, iar celălalt sex pentru alela a, p2 = 0%. În tabelul dat de autor sunt necesare opt generaţii pentru a ajunge la starea de echilibru a populaţiei pentru aceste gene la ambele sexe (tabelul 14.2.).

Tabelul 14.2.Realizarea echilibrului genetic pentru o pereche de gene legate de sex la cele două sexe în

opt generaţii

Gena Gena A aFrecvenţa P2 q2

SexulA Pi

AA

P1P2Aa

Piq2homogametic

a qiAa aa

P2qi qiq2Sexul A a

heterogametic P2 q2Fig. 14.4. Frecvenţa genelor legate de sex într-o populaţie panmictică

CAPITOLUL 4

GeneraţiaSexul

homogameticSexul

heterogametic Diferenţa0 0,0 100,0 100,01 50,0 0,0 50,02 25,0 50,0 25,03 37,0 25,0 12,54 31,0 37,0 6,25 34,3 31,2 3,16 32,7 34,3 1,67 33,5 32,7 0,8

8 33,1 33,5 0,4

14.6. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL A MAI MULTOR LOCI9

274

Realizarea unui echilibru în frecvenţa genotipurilor, după o generaţie de hibridare la întâmplare priveşte toţi locii de pe cromozomii autozomi consideraţi separat. Atunci când se consideră simultan doi sau mai mulţi loci, echilibrul nu mai poate fi realizat.

Drept exemplu, să considerăm o populaţie formată dintr-un număr egal de indivizi pentru genele AiAjBjBj şi A2A2B2B2. Frecvenţa genei considerată pentru ambii loci este de Din împerecherea lor la întâmplare, în prima descendenţă nu vor apare toate genotipurile. Genotipurile absente vor apare în descendenţele ulterioare refăcând echilibrul.

Li (1955) ia în considerare doi loci fiecare cu câte două alele şi frecvenţa celor patru tipuri de gameţi formaţi în populaţia iniţială după cum urmează:

gameţi___________AtBt___________Â|B2__________A2Bi____________A2B2_______frecvenţa r s t u

După combinaţia alelelor populaţia va fi în echilibru când ru = st.Depărtarea faţă de echilibru este dată de ru - st. Ea scade, înjumătăţindu-se cu fiecare generaţie succesivă.

Dacă numărul de loci luaţi în considerare este mai mare de doi,apropierea de echilibru are loc cu atât mai lent, cu cât

numărul locilor este maimare.

14.7. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ÎNLĂNŢUIRII LOCILOR

Înlănţuirea genelor încetineşte realizarea echilibrului în condiţiile hibridării la întâmplare şi ea este cu atât mai lentă cu cât forţa de înlănţuire este mai mare.

Echilibrul se realizează când cuplarea şi schimbul dintre loci sunt la fel de frecvente.

Apropierea de echilibru a genelor a doi loci înlănţuiţi poate fi demonstrată ca şi în cazul anterior:

d = ru - st, în care:ru este frecvenţa heterozigoţilor cu gene înlănţuite, iar st frecvenţa

heterozigoţilor în care genele au suferit crossing-over.Dacă notăm şi cu c frecvenţa de recombinare între cei doi loci şi cu t generaţia

respectivă se poate scrie:dt = (1-c) x dt -1

Dacă în urma încrucişării se obţin 20% indivizi recombinaţi pentru doi loci, aceasta înseamnă că diferenţa se reduce cu 1/5 (20%) pentru fiecare generaţie pentru a se ajunge la echilibru pentru genele din aceşti loci.

Aplicarea legii pentru două alele se poate extinde şi când la un locus există mai mult decât două. În asemenea situaţie se ia în considerare o singură alelă, iar toate celelalte alele de la acest locul pot fi considerate ca şi când ar constitui o singură grupă - o singură alelă.

Dacă interesează diferite alele de la acelaşi locus, atunci se ia în considerare

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

275

fiecare alelă pe rând, celelalte formând o grupă corespunzătoare celei de a doua alelă. Echilibrul frecvenţelor acestor alele este realizat după o generaţie de hibridare.

Un exemplu privind frecvenţele unor alele multiple poate fi dat de grupele sangvine la om.

Vom considera genele A, B şi O referitoare la stabilirea grupelor sangvine din sistemul A.B.O. Frecvenţa acestor trei gene le vom nota p, q şi r, iar conform legii Hardy-Weinberg

p + q + r = 1Din componenţa diferitelor grupe sangvine fac parte diferite genotipuri,

figurate în tabelul care va urma. Race şi Sanger (1954) au făcut observaţii la 190177 aviatori din Anglia. Repartizarea lor pe grupe se poate vedea tot în tabelul 14.3.

Tabelul 14.3.Grupele sangvine, genotipurile care le determină şi frecvenţa lor

Genotipul AA AO BB BO O O ABGrupa sangvină A B O AB

Frecvenţaaşteptată

p2 + 2pr q2 + 2qr r2 2pq

Frecvenţa observată %

41,716 8,560 46,684 3,040

Calcularea frecvenţei genelor se poate face în felul următor:- Frecvenţa genei O este rădăcina pătrată a frecvenţei grupului O, de unde r =O, O fiind grupul O.

- Suma frecvenţelor grupelor B şi O este q2 + 2qr + r2

= (q + r)2 =(1 -p)2, iar p = 1 B + O, B şi O fiindfrecvenţele grupelor sangvine B şi O.

- Suma frecvenţelor Aşi O este p2 + 2pr + r2 = (p + r)2 =(1 - q)2 iar q =1 - Ă + O, Ă şi O fiind grupele sangvine A şi O.

Calcularea frecvenţei celor trei gene prin această metodă a dus la următoarele rezultate:

gena A = 0,2567 gena B = 0,0598 gena O = 0,6833

Total = 0,9998Pe baza lui p şi q se poate calcula şi frecvenţa pentru grupa sangvină AB.

Rezultatul este 3,070%, proporţia care se apropie foarte mult de aceea menţionată în tabelul de mai sus (3,040).

14.9. FACTORII CARE MODIFICĂ STRUCTURA GENETICĂ APOPULAŢIILOR

9

Constatarea faptului că în sânul populaţiilor se manifestă o inerţie în menţinerea structurii genetice (homeostazie) nu înseamnă că populaţiile nu pot fi

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

276

modificate. Modificările sunt îndreptate spre găsirea unui nou echilibru, util organismului sau omului, după cum selecţia o face natura sau omul. Ştiinţa care se ocupă cu modificarea structurii genetice a populaţiilor în interesul omului, poartă numele de ameliorare.

Există două categorii de factori ce contribuie la modificarea structurii genetice a populaţiei: prima categorie se referă la modificarea frecvenţei genelor (selecţia, migraţia, mutaţia, acţiunea întâmplării) şi a doua categorie, la modificarea frecvenţei genotipurilor (homogamia şi consangvinizarea).

14.9.1. Selecţia9

Selecţia este procesul de supravieţuire a indivizilor ce prezintă unele calităţi şi de eliminare a acelora mai puţin înzestraţi. Deoarece selecţia este de două tipuri, naturală sau artificială şi sensul noţiunii de “calitate” diferă.

Efectul pe care îl are selecţia asupra frecvenţei genelor se exprimă prin doi indicatori: coeficientul de selecţie, care se notează cu S şi valoarea selectivă. Să presupunem că la efectuarea unei analize genetice s-au găsit la 100 de indivizi cu alele dominante AA şi Aa, 99 de indivizi cu alelele recesive aa. Valoarea selectivă a alelelor dominante se notează cu 1. În acest caz valoarea alelei recesive va fi de 0,99, iar coeficientul de selecţie S = 1,00 - 0,99 = 0,01. Dacă în această situaţie introducem unele valori extreme putem obţine următoarele rezultatele:

a) când genotipurilor conţin alelele dominante sau recesive ce produc sterilitatea sau moartea indivizilor S = 1-0 = 1;

b) când raportul dintre cele două genotipuri este egal, la cele două categorii de indivizi S = 1 - 1 = 0. Selecţia este în acest caz nulă.

Valoarea selectivă este sinonimă cu valoarea adaptivă şi se apreciază prin numărul de descendenţi pe care-l realizează faţă de genotipurile normale.

Referindu-ne în continuare la genele A şi a, în care gena A este dominantă şi gena a recesivă şi la coeficientul de selecţie notat împotriva lui aa va fi s, contribuţia genotipurilor împotriva cărora acţionează selecţia va fi s-1 (tabelul 14.4).

Tabelul 14.4Situaţia genotipurilor şi a frecvenţei genelor în urma acţiunii selecţiei

Genotipurile AA Aa aa TotalFrecvenţele

iniţialep2 2pq q2 1

Capacitatea 1 1 1-s -Contribuţia

genetică p2 2pq q2(1-s) 1-sq2

Genele nefavorabile duc la îndepărtarea indivizilor ce le posedă, din sânul populaţiei. Odată cu aceasta, numărul genelor favorabile creşte.

Viteza cu care sunt îndepărtate genele dominante şi recesive din populaţie este diferită. Unele gene, care au caracter letal sau de sterilitate pot elimina indivizii chiar din prima generaţie în care au apărut. Alteori ele, deşi micşorează vitalitatea sau prolificitatea se pot menţine mai multe generaţii. Unele mutaţii recesive, prin acumulare îndelungată

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

277

pot constitui mari rezerve de gene. Deşi unele mutaţii recesive cu efect letal sunt îndepărtate din populaţie, indivizii heterozigoţi pentru aceste gene, le pot menţine timp de zeci şi sute de generaţii.

Studiul factorilor de selecţie în legătură cu modificarea frecvenţei genelor într-o populaţie are o mare importanţă pentru ameliorare. Se va urmări multiplicarea descendenţelor cu gene care interesează. Trebuie însă să ţinem seama de diferitele tipuri de relaţii între aceste gene (dominanţă, epistazie, aditivitate ş.a).

Pentru caracterele cantitative se fac studii statistice, iar selecţia se face prin deplasarea valorii medii a caracterului studiat spre una din valorile extreme.

14.9.2. Migraţia

Migraţia este procesul de îndepărtare sau introducere a unui fond genetic străin, într-o anumită populaţie. În primul caz se numeşte emigraţie, iar în cel de al doilea imigraţie. Gradul de modificare a frecvenţei genelor prin migraţie depinde de numărul de indivizi ce au emigrat sau imigrat şi de numărul de gene native a populaţiei respective.

Notăm cu:m - gene imigrante în fiecare generaţie 1-m - restul indivizilor din populaţie qm - frecvenţa unei gene imigrante q0 - frecvenţa unei gene native (existente în populaţie) q1 - frecvenţa acestei gene în întreaga populaţie, care va fi următoarea: qi = mqm + (1 - m) qo = m (qm - qo) + qo Modificarea frecvenţei după o generaţie (Dq) va fi:

Dq = qi - qo = m (qm - qo)Reiese că ritmul de schimb a genei supusă imigrării este corelat cu ritmul de

imigrare şi de diferenţa dintre genele imigrante şi cele existente iniţial în populaţie.In ameliorare, imigrările au importanţă şi ele constau în încrucişarea indivizilor

dintr-o populaţie cu indivizi străini, pentru formarea de soiuri sau rase noi.

14.9.3. Mutatia9

Mutaţia modifică structura genetică a populaţiilor în măsura în care ea este izolată sau repetată, recesivă sau dominantă, folositoare sau nefolositoare organismelor, directă sau reversibilă.

Mutaţiile izolate prezintă o mai mică importanţă pentru evoluţie. Dacă sunt recesive se pot menţine mult timp în populaţie şi fiind în stare heterozigotă foarte rar se evidenţiază sub aspect fenotipic. Dacă sunt dominante, ceea ce se întâmplă foarte rar, produc modificări, adeseori evidente şi soarta lor depinde de avantajul sau neajunsul pe care îl prezintă în perpetuarea individului.

De obicei, alelele de tip sălbatic produc mutaţii recesive. Din această cauză, acestea din urmă se acumulează în populaţie şi sunt mai greu de eliminat prin selecţie, doar când devin homozigote. Frecvenţa lor scade atunci când au o acţiune dăunătoare şi creşte atunci când, din contra, au o acţiune favorabilă.

Răspândirea mutaţiilor în populaţie este condiţionată şi de efectul pe care-l produc asupra vitalităţii şi prolificităţii individului mutant.

Să presupunem că gena A suferă un proces de mutaţie şi se transformă în gena

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

278

a cu o frecvenţă u pe generaţie.Să notăm frecvenţa ei cu p0, iar frecvenţa noilor gene mutante cu up0.

Frecvenţa nouă a genei A devine p0-up0.Să urmărim acum ce se întâmplă când mutaţia se produce în ambele sensuri: de

la A la a şi de la a la A. Pentru frecvenţa mutaţiei inverse, de la a la A să folosim notaţia v iar a genei a iniţiale q0.

In primul caz, atunci când gena A trece în gena a se va produce un câştig de gene a egal cu up0 şi o pierdere, datorită mutaţiei inverse egală cu vq0. Cele afirmate mai sus se pot nota

Ritmul de mutaţie: u’ A----------------------->a

<----------------------v

Frecvenţa iniţialăa genelor po qo

Frecvenţa celor două gene se va modifica până se va ajunge la un echilibru: pu = qv sau

p v u— = — sau q =----------q u u + v

Dacă mutaţia inversă nu se produce, se poate observa din formulă că echilibrul nu se realizează decât dacă gena A este eliminată din populaţie.

Tot din formula de mai sus se poate observa că frecvenţa genelor mutante directe este mai mare decât frecvenţa genelor mutante inverse. Aceasta ar însemna că alelele mutante ar deveni, cu timpul, mai numeroase decât cele de tip sălbatic. În realitate, situaţia este tocmai inversă, deoarece majoritatea alelelor mutante sunt eliminate din populaţie prin acţiunea selecţiei.

Posibilitatea genei mutante de a rămâne în stare heterozigotă sau de a deveni homozigotă depinde şi de numărul de indivizi din populaţia care participă la încrucişări. Cu cât acest număr este mai mic, cu atât există şanse mai mari ca gena recesivă să devină homozigotă şi să se evidenţieze.

14.9.4. Drift-ul genetic

Drift-ul genetic numit şi derivă genetică este modificarea frecvenţei genelor la populaţiile mici, datorită unor factori întâmplători. Aşa după cum o corabie lipsită de cârmă şi motor este dusă de valuri şi vânt (mers în derivă), tot astfel şi indivizii unor populaţii mici îşi modifică structura genetică în direcţii neprevăzute, fără o acţiune a factorilor despre care s-a vorbit anterior.

Din numărul mare de gameţi produşi de un organism, nu toţi participă la fecundare. Din această cauză frecvenţa genelor care se află întâmplător în gameţii ce participă la fecundare creşte, în timp ce cele din gameţii care se pierd o face să scadă. Evoluţia organismului în funcţie de prezenţa unor anumite gene, în acest caz este întâmplătoare.

În populaţiile mari acest fenomen nu prezintă importanţă deoarece există şanse mai mari ca genele să fie repartizate în toate combinaţiile posibile. S-a arătat că pentru o

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

279

pereche de alele într-o populaţie panmictică 25% au genotipul AA, 25% aa şi 50% Aa. La un număr mic de indivizi s-ar putea să apară numai genotipul AA sau aa.

Drift-ul genetic prezintă o importanţă mare pentru amelioratorii de animale care se ocupă de un număr redus de indivizi. Acest grup evoluează în diferite direcţii, după cum are loc o creştere a frecvenţei unor gene, care se găsesc în gameţii care au contribuit la formarea indivizilor, sau o pierdere a altor gene, de la gameţii care nu au participat la formarea lor.

Intrarea unui efectiv de animale în drift poate fi pusă în evidenţă calculând Ne, adică numărul efectiv de indivizi ce se împerechează liber şi nu dirijat.

4Nm x NfNe =----------------

4Nm + NfS-a notat cu Nm numărul de masculi şi cu Nf numărul de femele.

14.9.5. Factorii care modifică frecvenţa genotipurilor într-o populaţie

Încrucişările libere, întâmplătoare între indivizi, contribuie la menţinerea structurii genetice constante a populaţiilor. Orice factor care ar dirija încrucişările într-un anumit sens, modifică schimbul de gene şi formează fenotipuri noi. Unii factori geografici (munţi sau ape), ecologici (pedoclimatici, macro sau microclimatici), biologici (genetici sau fiziologici) asigură izolarea reproductivă, oprind total sau parţial schimbul de gene între populaţii.

Două mari categorii de factori sunt capabili să modifice structura genotipică a populaţiilor:

- încrucişarea consangvină la animale, în care indivizii ce se împerechează sunt înrudiţi;

- autopolenizarea forţată a plantelor alogame.Pentru a ne da seama de efectele genetice al consangvinizării, să considerăm

mai întâi cazul unei populaţii panmictice care este supusă autofecundării. Prin autofecundare formele homozigote se menţin mai departe tot homozigote, iar acele heterozigote segregă în raport de o,25 AA : o,5 Aa : o,25 aa. Numărul de heterozigoţi se înjumătăţeşte la fiecare generaţie. În acest timp creşte numărul homozigoţilor. Autofecundarea, într-un timp foarte scurt, face ca genotipurile să fie homozigote pentru toate genele componente.

Oricare ar fi sistemul de reproducere consangvină ce acţionează în populaţie, efectul este desfacerea ei în linii homozigote şi scăderea heterozigoţilor. Homozigoţii recesivi ce formează fenotipuri cu defecte sunt eliminaţi de selecţie. Când prezintă totuşi unele calităţi pentru amelioratori asemenea homozigoţi pot fi reţinuţi, iar prin încrucişarea liniilor se obţine efectul de heterozis.

14.9.6. Homeostazia genetică şi evoluţia populaţiilor

Oricare ar fi nivelul de organizare a materiei vii, celular, individual şi populaţional există o capacitate a acesteia de a-şi menţine între anumite limite, constante, structurile şi funcţiile. Populaţiile îşi menţin echilibrul genetic prin heterozigoţie, polimorfism şi o anumită direcţie a procesului mutagen. Acest echilibru, care le imprimă

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

280

o relativă stabilitate genetică poartă numele de homeostazie genetică.În populaţiile panmictice, deşi indivizii par foarte asemănători, ei ascund o

mare diversitate genetică. Heterozigoţia asigură adaptarea organismelor la diferite condiţii de mediu, imprimă organismului plasticitate ecologică.

Prin polimorfism se înţelege existenţa în populaţie a unor forme ce se deosebesc după unele caractere şi funcţii ce le îndeplinesc în colectivitate. Aici se pot încadra împărţirea în sexe, heterostilia, diviziunea funcţiilor în colectivitate (furnici, albine ş.a).

Intr-o populaţie, există un număr enorm de mutanţi recesivi, a căror frecvenţă se modifică, în funcţie de numărul de indivizi, condiţiile externe şi interne. Aceste mutaţii constituie mari rezerve de variabilitate genetică. O anumită schimbare a condiţiilor de viaţă permite organismului să folosească din această rezervă, unele însuşiri, care în vechile condiţii nu s-au manifestat.

In capitolul de faţă s-au arătat care sunt factorii ce modifică structura genetică a populaţiilor şi cum acţionează ei. Mutaţia şi recombinarea constituie surse de variabilitate; selecţia este forţa care dirijează evoluţia şi menţine formele cele mai bine adaptate; izolarea geografică separă populaţiile şi face posibilă izolarea reproductivă şi formarea de noi specii.

Aspectele complexe pe care le îmbracă mecanismul de evoluţie a populaţiilor naturale, a animalelor domestice şi plantelor de cultură, fac să rămână în prezent încă multe probleme nerezolvate. Sarcina de viitor constă în a găsi modalităţi noi, prin care interacţiunea dintre factorii genetici şi mediu determină schimbarea organismelor, evoluţia lor. Aceasta are o importanţă deosebită atât pentru studierea procesului de evoluţie din natură, cât şi pentru producerea de forme noi de plante cultivate sau animale domestice.

G L O S A R de termeni ştiinţifici

Aberaţie (anomalie) cromozomică - modificare a numărului de cromozomi, caracteristic fiecărei specii (a. numerică) sau a structurii unuia sau mai multor cromozomi (a. structurală).

Adaptare (lat. adaptare-a potrivi) - proces de schimbări evolutive prin care un organism sau o specie supravieţuiesc şi se reproduc într-o nişă ecologică.

Adenină (6-aminopurină) - bază azotată pirimidinică prezentă în acizii nucleici.

Adenozin-trifosfat (ATP) - nucleotid alcătuit dintr-o bază azotată (adenina), un zahar (riboza) şi trei grupări fosfat, ataşate de carbonul 5 al zaharului; desfacerea legăturilor de fosfor, prin hidroliză eliberează cantităţi mari de energie.

Albinism (lat. albus) - tulburare metabolică, caracterizată prin deficienţa tirozinazei, care intervine în transformarea tirozinei în melanină, ceea ce face ca părul, pielea, irisul, să fie albe, la animale; la plante, albinismul se datorează unei deficienţe a cromoplastelor.

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

281

Albomaculatus (lat. albus - alb; maculatus - pătat)- pe frunzele plantelor alternează zone cu pigmentaţie normală cu altele cu pigmentaţie anormală (albă sau galbenă).

Alchilanţi - substanţe care înlocuiesc un atom de hidrogen, cu o grupare alchil, într-un compus organic.

Alelă (prescurtare de la alelomorf; gr. allelon - dintr-una în alta; morphe - formă) - fiecare din formele sub care poate exista o genă de pe un locus dat, apărând prin mutaţie şi îndeplinind aceeaşi funcţie. Când cele două alele de pe cromozomii omologi sunt identice, individul este homogametic (homozigot), iar când alelele sunt diferite, individul este heterogametic (heterozigot).

Alofenic (gr. allos - altul; phainen - a apărea) - animal rezultat din fuziunea a doi embrioni şi a cărui ţesuturi sunt diferite genetic.

Alogamie (gr. allos - altul; gamos - căsătorie) - încrucişare între indivizi diferiţi genetic, un mascul şi o femelă, care produc gameţi masculini şi respectiv feminini. Numeroase plante - porumb, ceapă, morcov, secară - şi majoritatea animalelor, sunt alogame.

Amber (arab. ambar - chihlimbar) - nume dat codonului UAG, unul din codonii STOP, denumit şi codon non-sens.

Amfidiploid (gr. amphi - amândoi; diploos - dublu; eidos - formă)- poliploid rezultat prin dublarea numărului de cromozomi a unui hibrid interspecific diploid.

Aminoacid -compus organic ce conţine o grupare amino (NH2), un grup carboxil (O=C-OH), un atom de hidrogen şi un radical care-i conferă specificitate.

Aminoacil - ARNt-sintetaza - enzimă care catalizează activarea aminoacizilor printr-o reacţie cu adenozin-5 -trifosfat.

Amitoza (gr. a - fără; mitos - filament; osis - condiţie) - diviziune celulară directă, caracterizată prin fragmentarea nucleului şi apoi a citoplasmei, fără participarea fusului nuclear.

Amplificare genică - mărirea numărului de copii a unei gene.

Androgeneză (gr. andros - bărbat; genesis - naştere) - dezvoltarea unui organism care conţine numai genomul patern.

Androsterilitate (gr. andros - bărbat; lat. sterilitas - sterilitate) - sterilitate masculină, determinată de absenţa gameţilor, sau formarea gameţilor nefuncţionali.

Aneuploid (gr. an - fără; eu - bine; haploos - odată; eidos - formă)- organism cu unul sau mai mulţi cromozomi în plus sau la care lipsesc unul sau

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

282

mai mulţi cromozomi (2n+1, 2n+2, 2n-1, 2n-2 etc.).

Anticodon - secvenţă de trei nucleotide din ARNt ,complementarăunui codon.

Antigen (gr. anti - împotriva; genos - gen, familie) - substanţă capabilă să inducă formarea de anticorpi, după pătrunderea sa în organism.

Aparat mitotic - complex de structuri(asterii şi fusul nuclear), care asigură migrarea cromozomilor, în timpul diviziunii celulare.

Apogamie (gr. apo - fără; gamos - căsătorie) - dezvoltare a embrionului dintr-o altă celulă a sacului embrionar, exceptând oosfera.

Apoptoza - moarte celulară programată genetic, într-un ţesut sau organ în dezvoltare.

Autofecundare (gr. autos - însuşi; lat. fecundare - a fertiliza) - fuziune a doi gameţi de sex diferit, produşi de acelaşi individ (ex. plantele hermafrodite).

Autopoliploidie (gr. autos - însuşi; polys - mulţi; haploos - odată; eidos - formă) - multiplicarea numărului de genomuri, pe baza unui genom propriu.

Autotrof (gr. autos - însuşi; trophe - hrană) - organism care foloseşte drept sursă de carbon, bioxidul de carbon, nefiind dependent de substanţele organice din mediul extern.

Autozom.(gr. autos - însuşi; soma - corp) - oricare din cromozomi, în afara celor ce determină sexul.

Autoradiografia - tehnică fotografică ce permite detectarea substanţelor radioactive într-o structură celulară sau într-o macromoleculă. Imaginea este produsă pe o emulsie fotografică, ca urmare a emisiei de raze beta , de către materialul radioactiv.

Auxotrof (gr. auxein - a creşte; trophe - hrană) - formă mutantă a unui microorganism, care creşte numai într-un mediu suplimentat cu factori de creştere specifici.

* * *

Backcross (engl. back - înapoi; cross - încrucişare) - încrucişarea unui individ cu structură genetică necunoscută, cu un părinte homozigot (de obicei, recesiv pentru una sau mai multe perechi de gene). Se mai numeşte retroîncrucişare sau încrucişare analizatoare.

Bacteriofag (gr. bacterion - bastonaş; phagein - a mânca) - virus ce se multiplică în celula bacteriană.

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

283

Baze minore - baze azotate prezente în ADN sau ARN, în cantităţi foarte mici (ex. 5-metil-citozina, 6-aminopurina, N-dimetil-guanozina etc.).

Bivalent (lat. bis - de două ori; valens - tare, puternic) - complex format din doi cromozomi omologi, fiecare cu câte două cromatide (tetradă cromozomică).

* * *

Capsidă (lat. capsa - cutie) - învelişul proteic al unui virus (sin. anvelopă virală).

Cariotip (gr. karyon - nucleu; typos - tip) - totalitatea cromozomilor unei specii, clasificaţi în funcţie de formă, mărime şi alte particularităţi.

Centimorgan - unitate de măsură a distanţei dintre gene, egală cu 1% recombinări prin crossing - over.

Chiasma (gr. chiasma - în formă de cruce) - zonă de suprapunere a cromatidelor nesurori ale cromozomilor omologi, în stadiile zigonema - pachinema, fiind expresia citologică a crossing-over-ului.

Chinetocor (gr. kinein - a mişca; chorion - loc) - structură localizată la nivelul constricţiei primare, prin care, cromozomul se ataşează de fibrele fusului nuclear.

Citochinine (gr. kytos - cavitate; kinein - a mişca) - factori de creştere vegetali, ce stimulează diviziunea celulară.

Clon (gr. klon - ramură mică) - populaţie de dimensiuni variabile, rezultată dintr-un singur organism (bacterii) sau dintr-o singură celulă având aceeaşi structură genetică.

Cloroplast (gr. chloros - verde; plastos - formaţiune) - organit citoplasmatic delimitat de o membrană dublă, cu rol în fotosinteză.

Cod genetic - triplete de nucleotide din ADN sau ARNm ce codifică aminoacizii existenţi într-un lanţ polipeptidic.

Codon - secvenţă de trei nucleotide din ARNm ce codifică unul sau mai mulţi aminoacizi.

Colinearitate (lat. cum - cu; linea - linie) - corespondenţa dintre succesiunea nucleotidelor dintr-un lanţ polinucleotidic şi succesiunea aminoacizilor unui lanţ polipeptidic.

Consangvinizare (lat. consangvineus - înrudit prin sânge; engl. inbreeding - reproducere prin căsătorie între rude) - încrucişare între indivizi înrudiţi.

Corepresor (lat. cum - cu; repressus - oprit) - produs final al unui lanţ metabolic, de natură proteică, care intervine în sistarea propriei sinteze, prin combinarea

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

284

sa cu un represor, codificat de o genă reglatoare.

Cromatidă (gr. chroma - culoare) - una din subunităţile longitudinale ale cromozomului, rezultată în urma replicării acestuia, rezultând două cromatide surori, respectiv, doi cromozomi monocromatidici.

Cromatină (gr. chroma - culoare; tainia - filament) - agregarea macromoleculei de ADN cu proteinele histonice, mici cantităţi de ARN, constituind structuri ale cromozomilor interfazici la eucariote.

Cromocentru (gr. chroma - culoare; kentron - centru) - corpuscul, rezultat prin fuzionarea centromerului şi a regiunii heterocromatice a mai multor cromozomi.

Cromomeră (gr. chroma - culoare; meros - parte) - nume dat benzilor mai intens sau mai slab colorate, dispuse succesiv, în cromozomi.

Cromonema, pl. chromonemata (gr. chroma - culoare; nema - filament) - subdiviziune longitudinală a cromatidei.

Cromozom (gr. chroma - culoare; soma - corp) - structură nucleară, nucleoproteică, purtător al informaţiei genetice prin genele sale.

Crossing-over (gr. crossing - încrucişare; over - peste) - schimb reciproc de segmente omoloage între cromatidele nesurori ale cromozomilor omologi.

* * *

Degenerare (lat. de - lipsit de; generare - a genera) - caracteristică a codului genetic, prin care, un aminoacid este codificat de mai mulţi codoni (triplete).

Deleţie (lat. deletio - pierdere) - tip de aberaţie cromozomică, determinată de pierderea unui segment dintr-un cromozom, iar la nivel molecular, pierderea unui nucleotid sau a unui grup de nucleotide din ADN.

Diachineză (gr. dia - prin; kinesis - mişcare) - subfază a profazei I a meiozei, în care bivalenţii sunt condensaţi, chiasmele localizate spre capetele acestora, conferindu-le un aspect caracteristic.

Diada (gr. dias - doi) - cele două celule fiice rezultate în urma meiozei primare(heterotipică).

Diauxie (gr. di - dublu; auxein - a creşte) - capacitatea microorganismelor de a se dezvolta în medii de cultură ce conţin doi carbohidraţi diferiţi.

Dihaploid (gr. dis - de două ori; haploos - simplu; eidos - formă) - organism cu două seturi de cromozomi, rezultat prin reducerea la jumătate a numărului de cromozomi ai unui organism tetraploid.

Dihibridare (gr. dis - de două ori; hybrida - metis) - încrucişare între

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

285

părinţi (genitori) ce se deosebesc prin două perechi de caractere.

Dimorfism (gr. dis - de două ori; morphe - formă) - două forme diferite morfo-fiziologic, în cadrul aceleiaşi specii.

Dioică (gr. dis - de două ori; oikos - casă) - plantă unisexuată, cu florile mascule şi femele, pe indivizi diferiţi.

Diploid (gr. diploos - dublu; eidos - formă) - celulă sau organism cu două seturi de cromozomi, 2n, caracteristică celulelor somatice.

Diplonema (gr. diploos - dublu; nema - fir) - stadiu din profaza I a meiozei, când la fiecare bivalent, se disting cele patru cromatide (tetradă cromozomică).

Disjuncţie (lat. disjunctio - separare) - separarea cromozomilor omologi sau a cromatidelor unui cromozom în urma clivării longitudinale a acestuia.

Dominanţă (lat. dominare - a domina) - manifestarea fenotipică a unei gene sau a caracterului fenotipic corespondent, în stare heterozigotă.

Duplicaţie (lat. duplicare - a dubla) - aberaţie cromozomică în care, un segment cromozomic sau o genă se găsesc în două exemplare, în acelaşi cromozom.

Endomitoză (gr., endon - înăuntru; mitos - filament) - tip particular de diviziune, pe parcursul căreia, replicarea cromozomilor, nu este însoţită de diviziunea nucleului şi citoplasmei.

Endonuclează - enzimă care desface legăturile fosfo-diesterice din cadrul unui lanţ polinucleotidic, intervenind în procesele de reparaţie, în rupturile monocatenare, fiind specifice pentru ADN şi ARN

Enucleare (lat. enucleare - a scoate sâmburi) - îndepărtarea experimentală a nucleului.

Enzimă de restricţie - enzimă care secţionează macromolecula de9 >

ADN, într-un loc specific.

Epistasia (gr. epi - pe; stasis - stare, poziţie) - interacţiunea dintre două gene nealele, prin care una inhibă activitatea celeilalte.

Eucariot (gr. eu - adevărat; karyon - nucleu) - organism unicelular sau pluricelular, cu nucleu delimitat de membrană nucleară, în interiorul căruia se găseşte materialul genetic.

Eucromatina (gr. eu - adevărat; chroma - culoare) - regiune a cromozomului, care în interfază este nespiralizată, cu gene structurale active.

Exon (engl. expressed - exprimat) - segment informaţional al unei gene,

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

286

transcris şi translat într-o secvenţă de aminoacizi.

Explant (lat. explantare - a sădi în afară) - fragment de ţesut vegetal sau animal, transferat pe un mediu artificial de creştere.

* * *

Fenocopie (gr. phaino - apariţie; copia - abundenţă) - modificare morfo-fiziologică produsă de un factor de mediu, care imită o modificare similară, condiţionată genetic.

Fenotip (gr. phaino - apariţie; typos - model) - totalitatea caracterelor morfologice, fiziologice, biochimice şi comportamentale, rezultate din interacţiunea genotipului cu mediul.

Filogenie (gr. phylon - rasă; genesis - naştere) - totalitatea relaţiilor evolutive dintre grupe sistematice de plante sau animale, stabilite pe criterii genetice.

Fragmoplast (gr. phragmos - gard; plastos - format) - membrană separatoare a celor două celule fiice, ce rezultă în urma mitozei.

* * *

Gamet (gr. gamete - soţie; gametes - soţ) - celulă sexuală matură, ce poate fi fecundată de alta de sex opus, rezultând celula ou sau zigotul.

Gametogeneză (gr. gametes - soţ; genesis - naştere) - procesul de formare a gameţilor.

Genă (gr. genos - urmaş) - secvenţă nucleotidică din ADN sau ARNv, ce deţine informaţia genetică pentru sinteza unui lanţ polipeptidic, a unei molecule de ARN t

sau a unei molecule de ARN r la nivel cromozomic, ocupând un loc bine definit, denumit locus.

Genofond (gr. genos - urmaş; fr. fond - fond) - totalitatea genelor unei populaţii vegetale sau animale.

Genom (gr. genos - urmaş) - totalitatea genelor dintr-o celulă sau dintr-un virus; la eucariote, totalitatea genelor dintr-un set haploid de cromozomi.

Genotip (gr. gennaein - a produce; typos -tip, model) - constituţia (structura) genetică a unui organism; în sens restrâns, genotipul, se referă la tipul alelelor, uneia sau mai multor gene luate în studiu.

Gonocorism (gr. gonos - urmaş; chorisma - separare) - separarea indivizilor unei specii, în cele două sexe, pe baza caracterelor sexuale primare şi secundare.

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

287

Guanină (2- amino -6- oxipurină) - bază azotată purinică, prezentă în unul din cele patru tipuri de nucleotide din ADN şi ARN.

* * *

Haploid (gr. haploos - odată; eidos - formă) - stare în care o celulă sau un organism posedă un singur set de cromozomi(n); în gameţi, haploidia este o caracteristică normală, în urma fecundării , restabilindu-se structura diploidă (2n), caracteristică speciei.

Hemizigot (gr. hemi - jumătate; zygotos - înjugat, împerecheat) - individ diploid care într-un anumit locus, a unei perechi de cromozomi, poseda numai una din cele două alele, cum este cazul sexului heterogametic XY.

Heritabilitate (engl. heritability - ereditar) - indice statistic, care exprimă măsura în care un caracter ereditar este determinat de genotip sau de factorii de mediu.

Heterocarion (gr. heteros - altul; karyon - nucleu) - celulă cu doi sau mai mulţi nuclei diferiţi.

Heterocromatină (gr. heteros - altul; chroma - culoare; tainia - filament) - regiune a cromozomului , adiacentă centromerului şi telomerelor, intens condensată în interfază, inactivă genic, fiind alcătuită din ADN repetitiv.

Heterocromozom (gr. heteros - altul; chroma - culoare; soma - corp) - unul din cei doi cromozomi X , ai unui organism homogametic XX, care în interfază formează cromatina sexuală.

Heterozigot (gr. heteros - altul; zygotos - împreună) - individ diploid sau poliploid, care, într-un locus sau mai mulţi , posedă gene alele diferite.

Heterozis (gr. heterosis - schimbare) - superioritatea hibrizilor faţă de fiecare genitor, privind unul sau mai multe caractere ereditare (vigoare hibridă).

Hexaploid (gr. hexa - şase; haploos - simplu; eidos - formă) - celulă sau organism, cu şase seturi complete de cromozomi (2n=6x).

Hfr (engl. high frequency of recombination -înaltă frecvenţă de recombinare) - suşă bacteriană cu factorul de fertilitate integrat în cromozomul propriu zis, care realizează procesul de conjugare cu o frecvenţă foarte mare.

Hibridoma (lat. hybrida - metis; gr. oma - sufix cu sensul de tumoră) - cultură de celule hibride care produc anticorpi monoclonali.

Histone - proteine bazice ce realizează cu ADN, complexul nucleo- histonic; cele cinci tipuri principale de histone sunt: Hu H2A, H2B, H3 şi H4.

Holandric (gr. holos - tot; ander - bărbat) - caracter determinat de o genă localizată pe cromozomul Y, sex-linkată cu sexul heterogametic XY.

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

288

Homeostazie (gr. homoios - asemănător; stasis - stare) - însuşire adaptativă a unui organism, de a-şi menţine integritatea genetică, între anumite limite, în condiţii de mediu variabile.

Homozigot (gr. homos - acelaşi; zygotos - împreunat) - individ diploid sau poliploid, având aceleaşi gene alele la un anumit locus, în cromozomi omologi.

Idiogramă (gr. idios - propriu; gramma - desen) - reprezentare grafică a cromozomilor unei specii, la o anumită scară, ce redă numărul, forma, mărimea şi alte particularităţi ale acestora.

Incompatibilitate (fr. incompatibilite - incompatibilitate) - incapacitatea gameţilor de sex diferit de a se fecunda, pentru a da naştere la un zigot viabil.

Inductor (lat. inducere - a duce la ) - substanţă care inactivează un represor, care la rândul său, nu mai blochează gena operatoare, operonul este funcţional şi genele structurale fiind activate, determină sinteza enzimelor catabolizante.

Inducţie enzimatică - sinteza unei enzime în prezenţa unui metabolit, de obicei, a propriului substrat ce trebuie catabolizat

Interferenţă (lat. interferire - a se împotrivi) - tendinţa unui crossing-over, ca pe o anumită distanţă, exprimată în unităţi de recombinare, să modifice frecvenţa cu care se produce un alt crossing-over.

Intron (engl. intragene - în genă) - secvenţă nucleotidică noninformaţională, de 100-1000 nucleotide, care poate fi situată la capetele unei gene sau în interiorul acesteia, separând exonii.

Inversie (lat. inversio - răsturnare) - aberaţie cromozomică, constând în ruperea unui segment cromozomic, răsucirea lui cu 180° şi reataşarea în acelaşi loc, ducând la inversarea ordinii unui grup de gene.

In vitro (lat. vitrum - sticlă) - experienţă efectuată în condiţii de laborator(în afara organismului).

In vivo (lat. vivum - viu) - procese şi experienţe ce se realizează în organisme vii.

IS (engl. insertion sequence - segmente de inserţie) - secvenţe scurte de ADN, conţinând 800-2000 nucleotide, care se pot integra în diferite locuri ale genomului, fiind denumite şi transpozoni.

Kilobază (kb) - unitate de măsură, egală cu 1000 de nucleotide, din molecula de ADN sau ARN.

Kilodalton (Kdal) - unitate de masă, egală cu 1000 de daltoni (dal.).

Knob (engl. knob - nod) - zonă heterocromatică prezentă la unii cromozomi

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

289

ai unor specii vegetale sau animale, detectabilă în interfază şi folosită ca marker genetic.

* * *

Leptonema (gr. leptos - subţire; nema - fir) - stadiu din profaza primară a meiozei, când cromozomii, în număr diploid(2n), au aspectul unor filamente extrem de subţiri şi foarte lungi, datorită gradului maxim de despiralizare a comatinei.

Linkage (engl. linkage - legătură, înlănţuire) - asocierea a două sau mai multe gene nealele, situate în acelaşi cromozom, care se transmit cu o frecvenţă mai mare în această stare, decât să segrege independent

Liză (gr. lysis - dizolvare) - distrugere sau dizolvare a unei celule de un agent fizic, chimic sau biologic.

Lizogenizare (gr. lysis - dizolvare; gennaein - a produce) - multiplicarea materialului genetic al fagilor, în urma integrării cromozomului fagic, în cromozomul bacterian.

Lizozom (gr. lysis - dizolvare; soma - corp) - organit citoplasmatic, specific celulei animale, produs de aparatul Golgi, ce conţine enzime denumite hidrolaze.

Locus pl. loci (lat. locus - loc) - poziţia unei gene într-uncromozom.

* * *

Marker (engl. marker - care indică) - secvenţă nucleotidică din ADN, genă cu efect fenotipic detectabil, al cărui locus este cunoscut, folosit pentru localizarea altor gene; un cromozom cu o anumită particularitate morfologică(ex. cromozomii cu knob).

Meioză (gr. meion - mai puţin; osis - condiţie) - diviziune specifică celulelor sexuale, pe parcursul căreia, dintr-o celulă cu 2n cromozomi, rezultă patru celule fiice cu n cromozomi.

Merogonie (gr. meros - parte; gone - descendent) - formarea unui embrion, prin fecundarea unui ovul anucleat, de un spermatozoid normal.

Mitoză (gr. mitos - filament; osis - condiţie) - diviziune caracteristică celulelor somatice, în urma căreia, dintr-o celulă celulă iniţială cu 2n cromozomi, rezultă două celule fiice identice, cu acelaşi număr de cromozomi şi aceeaşi structură genetică.

Modificaţie (lat. modificatio - măsurare) - caracter a cărui modificare a fost determinată de mediu, nefiind ereditară.

Monoploid (gr. monos - singur; haploos - simplu; eidos - formă) - individ care posedă în celulele somatice, un număr haploid de cromozomi, provenind dintr-o specie diploidă (2n=2x); sin. haploid adevărat.

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

290

Monosomie (gr. monos - singur; soma - corp) - absenţa unui cromozom dintr-o pereche (2n-1), la o celulă sau la un individ.

Mutaţie (lat. mutatio - schimbare) - orice modificare în structura materialului genetic, la orice nivel de organizare a acestuia (subgenă, genă, cromozom, genom), care se transmite ereditar.

Muton - cea mai mică unitate din molecula de ADN, ce poate suferi o mutaţie, echivalentă unei perechi de nucleotide.

* * *

Nucleoid (lat. nucleus - sâmbure) - zonă mai densă în celula procariotă, formată din ADN spiralizat, înconjurat de mici cantităţi de proteine.

Nulisomie (lat. nullus - nici unul; gr. soma - corp ) - absenţa unei perechi de cromozomi dintr-o celulă sau din celulele unui organism (2n-2).

* * *

Okazaki - fragmente Okazaki - secvenţe de 400 - 2000 nucleotide ale ADN împreună cu scurte secvenţe de ARN la un capăt (50 - 100 ribonucleotide), care participă la sinteza replicativă a ADN. Existenţa lor a permis explicarea modului în care are loc sinteza a două lanţuri polinucleotidice, cu polaritate opusă (3 -5 ; 5 -3 ), de către o singură enzimă, ADN - polimeraza III, care acţionează într-o singură direcţie

Operon (lat. operare - a opera) - unitate funcţională din genomul bacterian, alcătuită din promotor, gena operatoare şi mai multe gene structurale, ce intervine în reglajul activităţii genice.

Ovogeneză (lat. ovum - ou; gr. genesis - naştere) - procesul în urma căruia se formează celulele sexuale femele.

* * *

Pachiten (gr. pachys - gros; tainia - filament) - stadiu din profaza primară a meiozei, în care cromozomii bivalenţi sunt într-o sinapsă completă, puternic răsuciţi unul în jurul celuilalt încât, aparent, numărul lor este haploid.

Panmixie (gr. pan - tot; mixis - amestec) - caracteristică ce presupune că un individ dintr-o populaţie are aceeaşi şansă de a se încrucişa cu oricare individ de sex opus din populaţia respectivă.

Partenogeneză (gr. parthenos - virgin; genesis - naştere) - formarea unui embrion, dintr-o celulă sexuală femelă (ginogeneză) sau dintr-o celulă sexuală masculă (androgeneză).

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

291

Pericentric (gr. peri - în jur; kentron - centru) - restructurare cromozomică, care implică un segment ce include centromerul.

Perisoploid (gr. perissos - impar; haploos - simplu; eidos - formă) - poliploid cu număr impar de garnituri cromozomice (3x, 5x, 7x etc. )

Poliploidie (gr. polys - mulţi; haploos - odată; eidos - formă) - multiplicarea numărului de seturi cromozomice.

Polizom (gr. polys - mulţi; soma - corp) -complex structural, format prin asocierea mai multor ribozomi cu o moleculă de ARNm, a cărei informaţie genetică urmează a fi tradusă (translată) într-o secvenţă polipeptidică.

Primer (engl. primer - primul) - secvenţă scurtă de nucleotide (ADN sau ARN), cu care începe sinteza lanţurilor polinucleotidice.

Procariote (gr. pro - înainte; karyon - nucleu) - organisme simple, unicelulare, care nu au nucleu, materialul genetic, fiind în contact direct cu citoplasma.

Profag (gr. pro - înainte; phagein - a mânca) - bacteriofag integrat în cromozomul bacteriei infectate, replicându-se odată cu replicarea cromozomului bacteriei gazdă.

Protoplast (gr. protos - primul; plastos - format) - celulă procariotă sau eucariotă, a cărei membrană externă, de obicei rigidă (peretele celular), a fost îndepărtată.

Puf (engl. puff - puf de pudrieră) - modificare structurală a cromozomilor politeni, în care se sintetizează ARN şi proteine.

* * *

Rad (prescurtare de la Radiation absorbed dose - doză de radiaţie absorbită) - doza de radiaţii echivalentă cu o energie de 100 de ergi, absorbită de 1g de substanţă iradiată.

Radiogenetică (lat. radius - rază; gr. gennaein - a naşte) - ramură a geneticii care studiază efectele mutagene ale radiaţiilor electromagnetice (razele X, gamma) şi corpusculare (raze beta, protoni, neutroni etc.).

Receptor (lat. receptor - care primeşte) - proteină localizată pe membrana celulară sau în citoplasmă, care se poate lega specific de o proteină din afara celulei.

Recombinare (lat. re - din nou; combinare - a uni două lucruri) - apariţia genotipurilor noi la descendenţi, comparativ cu genotipurile părinţilor (recombinare cromozomică, recombinare genică, conversie genică).

Replicare semiconservativă (lat. replicare - a îndoi, a împături) - formarea a două molecule bicatenare de ADN, dintr-o moleculă bicatenară iniţială; după ruperea

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

292

punţilor de hidrogen dintre catenele moleculei iniţiale, fiecare devine matriţă pentru sinteza unei catene noi, complementare.

Ribozom (gr. ribos - boabă; soma - corp) - organit citoplasmatic, la nivelul căruia are loc sinteza proteinelor.

* * *

Segregare (lat. segregare - a separa) - separarea cromozomilor omologi în meioză şi implicit segregarea genelor alele.

Semidominanţă (lat. semi - jumătate; dominans - dominant) - interacţiune între genele alele, în urma căreia, indivizii heterozigoţi (Aa) manifestă un fenotip intermediar între fenotipurile parentale (AA şi aa).

Sex - ducţie (lat. sexus - sex; ducere - a duce) - transferul unei gene de la o bacterie la alta, cu ajutorul factorului de fertilitate recombinat, F .

Sex - ratio (lat. sexus - sex; ratio - raport) - raportul dintre numărul de masculi şi numărul de femele.

Sex - linkage (lat. sexus - sex; engl. linkage - legătură) - tip special de transmitere a caracterelor, determinate de gene localizate pe heterozomi (X sau Y).

Sinapsă (gr. synapsis - unire) - gruparea cromozomilor omologi în profaza I a meiozei prin complexul sinaptinemal.

Sinergidă (gr. synergos - colaborator) - una din cele două celule haploide din apropierea oosferei, prezentă la plante în sacul embrionar.

Singamie (gr. syn - împreună; gamos - căsătorie) - fuzionarea completă a gameţilor de la cele două sexe, rezultând celula ou sau zigotul.

Soma (gr. soma - corp) - totalitatea celulelor unui organism, cu excepţia celulelor sexuale (gameţi).

Spermatocit (gr. sperma - sămânţă; kytos - cavitate) - celulă animală, rezultată prin mitoza unei spermatogonii.

Spermatogeneză (gr. sperma - sămânţă; genesis - naştere) - procesul de formare a gameţilor masculi.

Statmochineză (gr. stathmos - oprire; kinesis - mişcare) - mitoză anormală, determinată de blocarea formării fusului nuclear, ceea ce determină dublarea numărului de cromozomi (nucleu de restituţie).

* * *

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

293

Telofază (gr. telos - capăt; phasis - fază) - ultima fază a mitozei sau meiozei, ce coincide cu formarea celor doi nuclei fii şi a celulelor fiice.

Telomer (gr. telos - capăt; meros - parte) - segment terminal al cromatidei unui cromozom.

Test - cross (engl. încrucişare de probă) - metodă de hibridare ce permite stabilirea structurii genetice a unui individ cu genotip necunoscut, prin încrucişare cu un individ homozigot recesiv (tester).

Tetradă (gr. tetras - patru) - tetradă cromozomică - cele patru cromatide ale cromozomilor bivalenţi din meioză; tetradă celulară - grup de patru celule haploide ce rezultă în urma meiozei.

Tetraploid (gr. tetras - patru; haploos - simplu; eidos - formă) - celulă sau organism, cu patru seturi haploide de cromozomi (2n = 4x).

Tetrasomie (gr. tetras - patru; soma - corp) - prezenţa a doi cromozomi suplimentari la una din perechile de cromozomi omologi (2n+2).

Timina ( 2,6-oxi -5- metil -pirimidina) - bază pirimidinică prezentă în dezoxiribonucleotide.

Transcripţie (lat. transcriptio - transcriere) - copierea informaţiei genetice de pe o porţiune a unei catene de ADN, într-o moleculă de ARN m, în prezenţa enzimei ARN - polimeraza.

Transducţie (lat. transducere - a transfera) - transferul uneia, rar două şi foarte rar trei gene, de la o bacterie la alta, cu ajutorul unui fag temperat.

Transgresie (lat. transgressio - trecere dincolo de....) - apariţia în generaţia a doua sau mai târziu, a unor fenotipuri ce se abat de la limitele de variaţie ale genitorilor şi a celor din generaţia Fi.

Translaţie (lat. trans - de cealaltă parte; locus - loc) - traducerea secvenţei ribonucleotidice din ARNm, într-o secvenţă de aminoacizi, la nivelul polizomilor.

Translocaţie (lat. trans - dincolo de; locatio - închiriere) - trecerea unui segment dintr-un cromozom, într-o ruptură a altui cromozom neomolog.

Transpozon (lat. trans - dincolo de; positio - poziţie) - secvenţă nucleotidică de ADN care-şi poate schimba poziţia în genom.

Triploid (gr. triploos - triplu; haploos - simplu; eidos - formă) - celulă sau organism cu trei seturi de cromozomi (2n=3x).

Trivalent (gr. tria - trei; lat. valens - puternic) - asocierea a trei cromozomi omologi în meioză.

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

294

* * *

Unisexuat (lat. unus - unul; sexus - sex) - animal sau plantă care produc numai gameţii unui sex.

Unitate Morgan - măsura distanţei relative dintre genele aceluiaşi cromozom, exprimată prin frecvenţa recombinărilor dintre cromozomii omologi.

Uracil (2 - dioxipirimidina) - bază pirimidinică, componentă a ribonucleotidelor (ARN).

* * *

Variabilitate (lat. variabilis - variabil) - deosebirile dintre indivizii unei populaţii sau specii, ce nu sunt determinate de sex sau vârstă.

Varianţă - gradul de dispersie a valorilor individuale în jurul mediei aritmetice, ce exprimă gradul de variabilitate al unui caracter ereditar.

Viroid (lat. virus - otravă; oid - asemănător) - agent infecţios subviral, format dintr-o moleculă de ARN, cu greutatea moleculară de 75-100.000 daltoni, fără capsidă.

Virus (lat. virus - otravă) - procariot extrem de simplu, ce conţine o moleculă de ADN (dezoxiribovirus) sau ARNv (ribovirus), înconjurate de un înveliş proteic (capsidă).

* * *

Xenie (gr. xenos - străin) - prezenţa unor caractere paterne în endospermul seminţelor.

* * *

Zigot (gr. zygotos - împreunat) - celulă diploidă ce rezultă în urma fecundării gameţilor haploizi, a celor două sexe.

Zigonema (gr. zygon - împerecheat; nema - fir) - stadiu din profaza I a meiozei, în care are loc sinapsa cromozomilor omologi, rezultând cromozomi bivalenţi.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. ANTOHI, St., GAVRILA, L., 1981, Progrese în genetica moleculară. Edit. Ştiinţifică şi enciclopedică, Bucureşti.

2. BăRA, I., CORNEANU, G., 1989, Elemente de radiobiologie vegetală, Edit. Ceres, Bucureşti.

3. BECKWITH, JR., ZIPSER, D., 1970, The lactose Operon. New Zork. Cold Spring

14.8. FRECVENTA GENELOR ÎN CAZUL ALELELOR MULTIPLE9

295

Harbor Laboratory.4. BENOIT, J., LEROY, P., VENDRELY, R., VENDRELY, C., 1959, Modification

des caractères raciaux du canard Pékin par l'DNA du canard Kaki Campbell et leur transmission a la descendence. Liége, Col. Int. DNA.

5. BENZER, S., 1962, The structure of the gene. In: “Sci. Amer”.6. BRESCH, C., 1965, Klassische und molekulare Genetik. Berlin, Springer - Verlag,

Heiselberg, New-York.7. BREWBAKAR, J.L., 1964, Agricultural Genetics. Englewood Cliffs N.J.: Prentice-

Hall.8. BUTNARU, GALLIA, 1985, Genetica, vol. I şi II, Lito., Inst. Agronomic,

Timişoara.9. BUTNARU, GALLIA., NICOLAE, I., TĂMAS, ELENA, 1999, Genetica

moleculară, Edit. Mirton, Timişoara.10. CEAPOIU, N., 1976, Genetica şi evoluţia populaţiilor biologice. Edit. Academiei

R.S.R., Bucureşti.11. CELIS, E.J., 1994, Cell Biology, a laboratory handbook, vol.1, Academic Press,

London12. COLES, N., 1974, Genetica. Craiova, Lito universitate.13. CRĂCIUN, T., 1970, Genetica. Edit. Didactică şi pedagogică, Bucureşti.14. CRĂCIUN, T., 1972, Haploidia în cercetările de genetică şi în ameliorarea plantelor.

Probleme de genetică teoretică şi aplicată, I.C.C.P.T., Fundulea, vol. IV,b.15. CRĂCIUN, T., CRĂCIUN, V., 1976, Mic dicţionar de biologie. Edit.Albatros,

Bucureşti.16. CRĂCIUN, T., PATRASCU, MINODORA, 1978, Mecanismele eredităţii. Edit.

Albatros, Bucureşti.17. CRĂCIUN, T., TOMOZEI, I., COLES, N., NASTA, A., 1978, Genetica. Edit.

Didactică şi pedagogică, Bucureşti.18. CRĂCIUN, T., 1981, Genetica plantelor horticole. Edit. Ceres, Bucureşti.19. CRĂCIUN, T., TOMOZEI, I., COLES, N., BUTNARU, GALLIA, 1991, Genetica,

Edit. didactică şi pedagogică, Bucureşti.20. CÎRLAN, M., 1996, Elemente de genetică animală normală. Edit. Polirom, Iaşi.

21. CÎRLAN, M., CREANGĂ, ŞT., 2001, Evoluţia determinismului genetic al sexelor, Edit. Sedcom Libris, Iaşi.

22. CORNEANU, MIHAELA, 2001, Genetică. Edit. Sitechi, Craiova.23. CRICK, F.H.C., 1962, The genetic code. Sci. Am. 10.24. DARVASI, A., SOLLER, M., 1993, A Simple Method to Calculate Resolving Power

and Confidence Interval of QTL Map Location Behavior Genetics, vol. 27, No. 225. DARVASI, A., SOLLER, M., 1994, Selectiv DNA Pooling for Determination of

Linkage Between a Molecular Marker and a Quantitative Trait Locus, Genetics 138, 1365-1373

26. DIACONU, P., 1971, Ereditatea şi factorii mutageni. Edit. Ceres, Bucureşti.27. DIACONU, P., 1974, De la factorii ereditari la codul genetic. Edit. Ceres, Bucureşti.28. DRACEA, I., 1972, Genetica. Edit. Didactică şi pedagogică, Bucureşti.29. DRACEA, I., 1973, Genetica. Edit. Didactică şi pedagogică, Bucureşti.30. DUBININ, N.P., 1965, Genetica moleculară şi acţiunea radiaţiilor asupra eredităţii.

Edit. Agro-Silvică, Bucureşti.31. DUBININ, N.P., 1977, Mişcarea eternă. Edit. Politică, Bucureşti.32. DUDLEY, J.W., 1993, Molecular Markers in Plant Improvement:

Manipulation of Genes Affecting Quantitative Traits, Crop Sci. 33: 660-66833. DU PRAW, E.J., 1970, DNA and Chromosomes. New York Holt. Rinehart and

Winston.34. FREIFELDER, D., 1987, Microbial genetics, Jones and Barlett Publishers, Boston,

London.35. GARDNER, E.J., 1967, Principles of Genetics. New York, John Wiley and Sons.

Inc.36. GAVRILĂ, L., DABALA, I., 1975, Genetica diviziunii celulare. Edit. Dacia, Cluj-

Napoca.37. GAVRILĂ, L., DABALA, I., 1981, Descifrând tainele eredităţii. Edit. Dacia, Cluj-

Napoca.38. GIOSAN, N., SĂULESCU, N., 1972, Principii de genetică. Edit. ştiinţifică,

Bucureşti.39. GRIFFITHS, J.F.A., şi colab., 1999, Modern Genetic Analysis, W.H. Freeman and

Co, New York.40. HAGGIS, G.H., MICHIE, D., MUIR, A.R., ROBERTS, K.B., WALKER, P.M.B.,

1967, Introducere în biologia moleculară. Edit. Ştiinţifică, Bucureşti.41. HARTL, L.D., FREIFELDER, D., SNYDER, A.L., 1994, Basic Genetics, Jones and

Bartlett, Publishers, Boston.42. JACOB, F., MONOD, J., 1961, Genetic regulator mechanism in the synthesis of

proteins. In rev. “J. Mol. Biol.” nr.3.43. JACOB, F., 1970, Logica viului. Edit. Ştiinţifică şi enciclopedică, Bucureşti.44. JONES, N., OUGHAM, HELEN, THOMAS, H., 1997, New Phytol., 137, 165-17745. KEARSEY, M.J., FARQUHAR, A.G.L., 1998, QTL Analyses in Plants; where are

we now? Heredity, 80, 137-142296

46. KING, R.C., 1962, Genetics. Oxford University Press, New York47. KNAPP, S.J., 1991, Using molecular markers to map multiple quantitative trait loci:

model for backcross, recombinant inbred and doubled haploid progeny, Theor. Appl.

297

Genet., 81; 333-33848. LANDER, E.S., BOTSTEIN, D., 1989, Mapping Mendelian Factors Underlying

Quantitative Traits Using RFLP Linkage Maps, Genetics, 121, 185-19949. LEVINE, R.P., 1962, Genetics. New York, Holt, Rinehart and Winston.50. LEWIN, B., 1994, Genes V, Oxford University Press, New York.51. LIU, Z.W., BIYASHER, RM., SAGHAI MAROOF, M.A., 1996, Theor. Appl.

Genet., 93: 869-87652. LINTS, F., 1991, Genetique 3, Office International de Librairie Bruxelles, Technique

et Documentation, Paris.53. MANLY, K.F., OLSON, M. JANE, 1999, Manager QT, Mammalian Genom, 10,

327-33454. MAXIMILIAN, C., 1982, Genetica umană. Edit. Ştiinţifică şi enciclopedică,

Bucureşti.55. MAXIMILIAN, C., IOAN, DOINA MARIA, 1984, Dicţionar enciclopedic de

genetică. Edit. Ştiinţifică şi enciclopedică, Bucureşti.56. MENDEL, GR., 1945, Experienţe asupra hibrizilor de plante. Buletinul cultivării şi

fecundării tutunului. Nr. 3-4.57. MORARU, I., ANTOHI, ST., 1966, Introducerea în genetica moleculară. Edit.

Medicală, Ed. a. 2-a, Bucureşti.58. MORGAN, T.H., 1938, Bazele ştiinţifice ale evoluţiei. Bucureşti, Imp. centrală.59. NEGRUŢIU, E., PETRE, A., PIPERNEA, A., 1969, Genetica şi ameliorarea

animalelor. Edit. Didactică şi pedagogică, Bucureşti.60. NICOLAE, I., 1978, Mutageneza experimentală, Edit. Ceres, Bucureşti.61. OPRESCU, S., 1983, înaintaşi ai geneticii în România. Edit. Ceres, Bucureşti.62. PANFIL, C., 1974, Genetica. Edit. Didactică şi pedagogică, Bucureşti.63. PANFIL, C., 1980, întrebări şi răspunsuri din genetică. Edit. Dacia, Cluj- Napoca.64. PATERSON, A.H., LANDER, E.S., HEWITT, J.D., PETERSON, SUSAN,

LINCOLN, S.E., TANKSLEY, S.D., 1988, Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by using a complete linkage map of restriction fragment length polymorphisms, Nature, vol. 335.

65. PETIT, C., PREVOST, G., 1967, Génétique et evolution. Hermann Collection, Paris.66. POPA, L., REPANOVICI, RODICA, 1982, Tehnologia ADN recombinat. Edit.

Ştiinţifică şi enciclopedică, Bucureşti.67. POPESCU, St., 1947, Genetică, Edit. Politehnicii “Gh. Asachi”, Iaşi.68. POPESCU - VIFOR, St., PIPERNEA, N., PETRE, A., VINTILĂ, I., 1979, Genetica

animală. Edit. Didactică şi pedagogică, Bucureşti.69. PORTOCALA, R., POPA, L., 1966, Acizii ribonucleici celulari şi virali. Edit.

Academiei R.S.R., Bucureşti.70. RAICU, P., 1980, Genetica. Edit. Didactică şi pedagogică, Bucureşti.71. RAICU, P., GORENFLOT, R., 1980, Cytogenetique et evolution. Edit. Academiei

R.S.R., Bucureşti.72. RAICU, P., STOIAN, VERONICA, 1989, Gene şi cromozomi. Edit. ştiinţifică şi

enciclopedică, Bucureşti.73. RAICU, P., 1997, Genetică generală şi umană, Edit. Humanitas, Bucureşti.74. RIEGER, R., MICHAELIS, A., GREEN, M.M., 1976, Glossary of genetics and

cytogenetics. Gustav Fischer Verlag, Jena.

298

75. RUSU, V., 1996, Nobel, retrospectivă 1901-1995, Edit. Omnia, Iaşi.76. SERRA, J.A., 1965, Modern Genetics, vol.1, vol.2, 1968, vol.3. Academic Press,

London, New York.77. SINGLETON, R.W., 1967, Elementary genetics, 2nd Editions, Van Nostrand

Regional Offices, New York.78. SRB, A.M., OWEN, R.D., EDGAR, R.S., 1965, General Genetics. Freeman and Co.,

San Francisco and London.79. STRĂJERU, SILVIA, MURARIU, DANELA, POPA, MIRELA,

PLĂCINTĂ, DOMNICA, 2001, Conservarea şi utilizarea resurselor genetice vegetale, Tipogr. Univ. Suceava

80. TANKSLEY, S.D., 1993, Mapping Polygenes, Annu. Rev. Genet, 27, 20523381. TAYLOR, J.H., 1963, The replication and organisation of DNA in

chomosomes. In “Molecular genetics”, Academic Press, New York.82. TAYLOR, J.H., 1967, Molecular Genetics, Part II, Academic Press, New York.83. TINKER, N.A:, MATHER, D.E., Methods for QTL analysis with progeny replicated

in multiple environments84. TOMA, C., NIŢĂ, MIHAELA, 1995, Celula vegetală. Edit. Universităţii “Al.

I. Cuza”, Iaşi.85. TOMOZEI, I., 1967, Curs de genetică. Lito Ins. Agron. Iaşi.86. TOMOZEI, I., ŢÎRDEA, GH., 1985, Genetica. Lito inst. Agron. Iaşi.87. TUDOSE, I. GH., 1992, Genetica, vol.1, Edit. Univ. “Al. I. Cuza”, Iaşi.88. TUDOSE, I. GH., 1993, Genetica, vol.2, Edit. Univ. “Al. I. Cuza”, Iaşi.89. ŢÎRDEA, GH., 1996, Genetica, Lito, UAMV Iaşi.90. WATSON, J.D., CRICK, F.H.C., 1953, The structure of DNA. Cold Spring Harbor

Symp., Quant. Biol., 18.91. WATSON, J.D., 1974, Biologia moleculară a genei. Edit. ştiinţifică, Bucureşti.92. WILKINS, M.H.F., 1961, The molecular structure of DNA. J. Chim. Phys.

58.93. WILKINS, M.H.F., 1963, Molecular configuration of nucleic acids. Science, 140.94. ZARNEA, G., 1986, Tratat de microbiologie generală, vol. III, Edit. Academiei

R.S.R., Bucureşti.95. ZOLYNEAK, C.C., 1967, Radiogenetica. Fasc. I. Îndrumător de laborator. Lito.,

Iaşi.96. ZOLYNEAK, C.C., 1968, Radiogenetica. Fasc. a II-a Îndrumător de laborator. Lito.,

Iaşi.97. ZOLYNEAK, C.C., 1968, Genetica. Lito. Universitatea Iaşi.98. ZOLYNEAK, C.C., 1978, Dicţionar de genetică. Xerox, Univ. “Al.I. Cuza” Iaşi.99. ZOLYNEAK, C.C., 1982, Genetica şi ameliorarea plantelor şi animalelor. Partea I.

Xerox, Univ. “Al.I. Cuza” Iaşi.* * ** * *