Prctica No. 8

IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS DEL EXUDADO FARINGEO Y NASAL

OBJETIVOS 1.- El alumno Identificar la morfologa de las colonias desarrolladas en los medios de cultivo Agar Angre, Agar S110, Agar Mc Conkey, Agar EMB y Agar Biggy. 2.- El alumno aplicar la tcnica de tincin de Gram para identificar la morfologa bacteriana y caractersticas de tincin a partir de las colonias desarrolladas en Agar Sangre, Agar S110, agar Mc Conkey y Agar EMB. 3.- El alumno identificar la morfologa colonial de hongos y levaduras que desarrollaron en Agar Biggy, Agar Harina de Maz o Agar Saboraud. 4.- El alumno aplicar las tcnicas de tincin con azul de lactofenol e Hidrxido de potasio para identificar la morfologa de hongos o levaduras de las colonias que desarrollaron en el medio de cultivo Biggy, Harina de Maz o Agar Saboraud.

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Para el estudio de portadores de Staphylococcus y de Streptococcus, se realizan frotis y tinciones de Gram con muestras obtenidas de la orofaringe y de la parte anterior de la nariz, la morfologa bacteriana es orientadora para la eleccin de los medios enriquecidos o selectivos segn sea el gnero que se pretende aislar. El gnero Staphylococcus aureus (ver caractersticas generales prcticas I y ll). Para la investigacin de portadores nasales de Staphylococcus aureus, se deben utilizar los medios de cultivo selectivos Agar S110 y Agar Sal Manitol este ltimo resulta indispensable por la caracterstica de evidenciar a Staphylococcus aures por su capacidad de producir manitolasa como factor de patogenicidad, enzima que metaboliza manitol que primero es convertido a manosa y posteriormente a glucosa 6 fosfato. La muestra debe ser cultivada en placas de Agar con tcnica de aislamiento (estra cruzada) debiendo usarse una caja de Agar manitol salado y S110 para cada una de las muestras, sin embargo con fines de control de pacientes y administrativos generalmente dividimos por la mitad los medios de cultivo y respectivamente en cada una de ellas se siembra la toma efectuada de cada fosa nasal. Los estafilococos crecen en condiciones aerbicas o microaeroflicas a temperatura de 37C, pero forman mejor pigmento a la temperatura ambiental (20 a 25C). Las colonias en S110 slido en placa son redondas, lisas, convexas y resplandecientes que pueden ser de color amarillo dorado, verdosas o blancas. En Agar Sal Manitol se evidencia un cambio de coloracin del medio de rojo normal a amarillo por accin de la enzima manitolasa que acidifica el medio hacindose evidente por el rojo de fenol como indicador de pH.

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Los estafilococos son clulas esfricas de una micra de dimetro, distribuidas en grupos irregulares en pares, en tetradas o en cadenas. En cultivos jvenes los cocos son Gram (+), al envejecer, muchas clulas se vuelven Gram negativas.

Gnero Streptococcus (Ver caractersticas generales prctica Vl) En Agar sangre, las colonias son redondas de 0.5 a 2.0 mm de dimetro, pueden ser : mucoides, mate o lustrosas. Las colonias mucoide contienen material capsular formado con cido hialurnico, que da a la colonia un aspecto hmedo, brillante y suave. Las colonias lustrosas son mas pequeas, lisas y brillantes. Las colonias mate tienen apariencia opaca y rugosa. Los cocos individuales son esfricos Gram positivos y ovoides de 0.5 a 1 micra de dimetro y se disponen formando cadenas, crecen entre 15 a 45 C. la temperatura ptima de crecimiento es de 37 C. con pH de 7.4 a 7.6. en 24 hrs. Son anaerobios facultativos, Catalasa negativos, Oxidasa negativos y se destruyen a 60o C. o a 50 C. durante 30 minutos. Los Streptococcus del grupo A son patgenos para el hombre y producen dos hemolisinas: estreptolisina O y estreptolisina S. La primera es sensible al oxgeno y es capaz de daar a diversas clulas parenquimatosas, incluyendo clulas del corazn, estimula la produccin de anticuerpos y es altamente txica para eritrocitos y leucocitos. La estreptolisina S es estable en presencia de oxigeno, se libera poco de las clulas bacterianas y produce hemlisis por contacto directo con los eritrocitos.

96 En el medio de Agar sangre se evidencian tres tipos de hemlisis:

Alfa.- Se producen aspecto de decoloracin verdosa alrededor de la colonia con hemlisis incompleta o parcial de la sangre. Beta.- La hemlisis es clara incolora, producindose zonas amplias de lisis completa o total de los eritrocitos alrededor de la colonia. Gamma. No se observa ninguna decoloracin o alteracin en la sangre alrededor de las colonias, tambin se describe como no hemolticas. Streptococcus gamma-hemolticos. Generalmente son saprfitos. Entre ellos destacan los pertenecientes al grupo D de Lancefield, que a veces son capaces de producir alfa o beta-hemlisis y que en raras ocasiones se han descrito como patgenos farngeos como ejemplo en pacientes inmunodeprimidos por SIDA. Los Streptococcus se tien con el colorante cristal violeta por lo que son clasificados como Gram positivos, los cocos pueden encontrarse aislados, formando parejas o formando las cadenas tpicas de su gnero.

Gnero Bordetellas.- Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchisptica y Bordetella avium. Bordetella pertussis: Se investiga para el diagnstico microbiolgico de coqueluche o tos ferina.

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En la actualidad esta enfermedad est casi erradicada debido a la vacunacin a los dos meses de edad con la DTP y una inmunizacin progresiva a los 4 y 6 meses de edad. Bordetella parapertussis es capaz de ocasionar una enfermedad traqueobronquial similar a la tos ferina y Bordetella bronchisptica produce un cuadro menos complicado. Bordetella avium solo afecta aves. Para la toma de muestras se aconsejan dos tcnicas. La primera es la de hacer toser al paciente directamente sobre una placa abierta con medio de Bordet Gengou. La segunda consiste en introducir un hisopo de alambre por la nariz hasta que toque la pared farngea; En seguida, depositar la toma sobre un extremo de una placa de Bordet-Gengou y extenderla con un asa de platino. Los microorganismos tpicos son cocobacilos Gram negativos corto con medidas aproximadas de 1.5 micras de longitud por .5 micras de dimetro, contienen cpsula, es aerobio, metaboliza lactosa y glucosa de donde forma cido pero no gas, Bordetella pertussis es hemoltica.

El medio de cultivo Bordet-Gengou es el indicado para aislar Bordetellas, incluye un 15% a 20% de sangre de conejo, cordero o caballo, Agar con patata y glicerol con penicilina G en concentraciones de 5 miligramos por ml., cefalexina o meticilina para evitar el crecimiento masivo de estreptococos. La incubacin ser en aerobiosis entre 35 a 37 C durante cuatro das, las cajas de Petri deben ser protegidas con una bolsa de plstico para conservar humedad. Las colonias de Bordetella poseen forma de gotas de mercurio y la confirmacin se hace fcilmente con antisueros.

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Bordetella pertussis produce toxinas y enzimas llamadas factores de patogenicidad, cinco de estos factores son sintetizados en forma coordinada por el locus gentico bvg de Bordetella pertussis llamado tambin, gen de virulencia. La toxina pertussis es hemoltica, favorece la adherencia a las clulas epiteliales del husped y desencadena un respuesta inmune mediada por linfocitos. La toxina hemaglutinina filamentosa favorece tambin la adherencia a los cilios de las clulas epiteliales. La citotoxina traqueal, la toxina dermonecrtica y la toxina adenilatociclasa son otros importantes factores de patogenicidad. Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium diphtheriae: Agente causal de Diphtheria, faringoamigdalitis pseudomembranosa, aunque es un microorganismo prcticamente erradicado es de gran importancia conocer los mtodos y tcnicas de laboratorio para su diagnstico. Las muestras se toman de las pseudomembranas, para hacer un frotis y tincin con la tcnica de Gram. Si en el examen microscpico se visualizan bacterias de apariencia difteromorfa, se establecer el tratamiento inmediato y se deber continuar con el estudio bacteriolgico por siembra en medio de Loeffler, o en placa de agar chocolate con telurito y potasio. Las colonias cultivadas despus de una incubacin a 35 a 37 C mostrarn bacilos difteromorfos unidos por sus extremos, con apariencia de letras del alfabeto chino, son bacterias Gram positivas, de aproximadamente una micra de dimetro por 6 micras de longitud , aerobios no formadoras de esporas. Las especies de este gnero pueden ser cultivadas en Agar coagulado de Loeffler, en este medio crecen colonias pequeas puntiformes o granulares grisceas con bordes irregulares. En Agar sangre con telurito y potasio desarrollan colonias que varan del color gris hasta colonias color negro, debido a que los microorganismos reducen el telurito intracelularmente. Para la identificacin de especies del gnero Corynebacterium se realizan pruebas bioqumicas como el metabolismo de carbohidratos (glucosa, maltosa y sacarosa) y la produccin de ureasa. Corynebacterium diphtheriae metaboliza glucosa y maltosa pero no sacarosa y es ureasa negativa. Haemophylus influenzae Haemophylus influenzae: Bacteria Gram negativa con un alto ndice de patogenicidad, es el tercero de los microorganismos productores de faringitis y neumona en nios y adultos, despus de los virus y del Streptococcus pyogenes.

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Es un microorganismo bastante lbil que precisa de medios enriquecidos para su crecimiento. Sirve para este fin el Agar chocolate. Se diferencia de otras especies por las distintas necesidades que tienen de los factores V y X de la sangre, tcnica que puede efectuarse sobre medio Mueller Hinton. El Agar sangre humana o de cordero inhiben el crecimiento de Haemophylus. Los microorganismos tpicos son cocobacilos Gram negativos con cpsula, de 1.5 micras de largo por .5 micras de dimetro Borrelia vincentii y Fusobacterium nucleatum.- Angina fusoespiralar de Vincent, es una infeccin pseudomembranosa y ulcerativa de la boca, encas o faringe. Est causada por una espiroqueta Gram negativa (Borrelia vincentii ) y un bastoncillo Gram negativo anaerobio, recto o ligeramente curvo, de puntas agudas (Fusobacterium nucleatum). Son grmenes saprfitos de la cavidad bucal y se les relaciona con infecciones cuando su presencia es predominante Es fcil de diagnosticar directamente por coloracin de Gram a las Borrelias, observndose las formas descritas (espiroquetas de cinco a siete espiras abiertas), pueden prepararse tambin frotis teidos con colorantes de Giemsa o de Wrigth observndose las espiroquetas separadas de los eritrocitos. Los medios de cultivo indicados para su aislamiento deben contener sangre, suero o tejidos (agar sangre), sin embargo las muestras obtenidas de enfermos crecen rpidamente en embriones de pollo. Las Fusobacterias son bacilos Gram negativos, tienen forma de cigarro y se encuentran acompaadas de numerosas clulas de pus y de descamacin. En infecciones agudas predominan las espiroquetas y en las crnicas las fusobacterias.

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Candida .- A veces las levaduras del gnero Candida producen infecciones en la mucosa oral denominadas muguet, que se desarrollan sobre todo en nios pequeos y en pacientes adultos con enfermedades crnicas y compromiso inmunolgico como diabetes, cncer, SIDA, etc. La toma de muestras se efectuar de las membranas blanquecinas que se presentan adheridas a diversas partes de la mucosa oral. Las siembras se practicarn sobre Agar Sabouraud - cloranfenicol, o sobre Agar Biggy, aunque el Agar sangre tambin permite un perfecto crecimiento. Las distintas especies de Cndida se investigarn mediante pruebas morfolgicas de sus esporas y pruebas bioqumicas que incluyen el metabolismo de azcares.

Neisserias Las Neisserias tpicas son diplococos Gram negativos de una micra de largo por .8 micras de dimetro, con forma de rion y se encuentran en pares, fermentan carbohidratos produciendo cido pero no gas, producen oxidasa y dan reacciones positivas, crecen tanto en aerobiosis como en anaerobiosis. El gnero de las Neisseias agrupa por lo menos a nueve especies: N. meningitidis, N. Gonorrheae, N. Catarralis, N. Lactmica, N. Sicca, N. Subflava, N. Mucosa, N. Flavescens y N. cinerea. N. meningitidis o meningococo es el agente causal de meningoencefalitis en nios y adultos, infecta a la nasofaringe antes de su diseminacin a otros sitios, se conocen por lo menos trece serogrupos relacionados con esta enfermedad y clasificados como A, B, C, Y y W135.

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N. Lactmica y N. Catarralis producen cuadros clnicos menos severos. N. Sicca, N. Subflava, N. Mucosa, y N. Flavescens forman parte de la flora normal y en raras ocasiones se relaciona con enfermedades nasofarngeas. N. Gonorrehae es el agente causal de la gonorrea y N. Cinerea produce una enfermedad semejante. La toma de la muestra se efecta con hisopos doblados que se introducen por debajo de la vula hasta la pared de la nasofaringe, o a travs de la nariz, llegando a la pared posterior. En cualquier caso, cuando el hisopo toque fondo se le dar un ligero movimiento de rotacin, con el fin de que capte una cierta porcin de mucus, que ser el que teiremos y sembraremos en busca del microorganismo. El medio de cultivo utilizado puede ser el Agar chocolate, aunque se consiguen mejores resultados en Agar Thayer Martin o el NYC (New York City). La prueba del metabolismo de carbohidratos es til para su tipificacin. N. gonorrehae N. meningitidis N. lactamica N. sicca N. subflava N. mucosa N. flavescens N. Cinerea Bacilos coliformes La familia Enterobacteriaceae, agrupa a mas de 20 gneros y 100 especies, entre las que se encuentran los gneros Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus. Son microorganismos Gram negativos en forma de bastn, anaerobios o anaerobios facultativos, fermentan gran cantidad de carbohidratos, poseen estructuras antignicas complejas, producen toxinas y otros factores de virulencia. La familia de Enterobactericeas se caracteriza, desde el punto de vista bioqumico por la capacidad de algunos de sus miembros de reducir nitratos a nitritos, de fermentar glucosa con produccin de cido o gas, o ambos y son negativos a la oxidasa. Los medios de cultivo selectivos para el aislamiento primario de enterobacterias son Agar Mc Conkey y EMB. Glucosa + + + + + + Maltosa + + + + + Lactosa + Fructosa + ++ DNAsas +

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Escherichia coli crece en EMB formando colonias convexas, circulares, lisas, bordes bien definidos, toman un brillo metlico, los colorantes Azul de metileno y eosina inhiben el crecimiento organismos de Gram positivos y la mayora de Gram negativos. En Agar Mc Conkey Escherichia coli produce colonias color negro verdoso con brillo metlicos. La temperatura para el crecimiento ptimo de Escherichia coli de 35 C., fermenta diversos azcares como glucosa, lactosa y sacarosa produciendo cido y gas. Se destruye a 60C por 30 minutos. Son resistentes a la accin bacteriosttica de los colorantes en relacin con Gram positivos. Descarboxilan los aminocidos lisina y ornitina e hidrolisan a la escualina.

Pruebas bioqumicas TSI.- Es un medio de cultivo slido en tubos inclinados de color rojo normal por el indicador de pH rojo de fenol. Cuando el medio de cultivo se acidifica por el metabolismo de los tres carbohidratos que contiene lactosa en la superficie, sacarosa y glucosa en el fondo del tubo, con produccin de cido pirvico y cido lctico, el medio cambia al color amarillo por la accin del indicador rojo de fenol. Si el medio se conserva alcalino no hay cambio de color, conservndose el medio de cultivo de color rojo. Escherichia coli fermenta los tres azcares por lo que todo el medio de cultivo, tanto el pico de flauta como el fondo, cambiarn al color amarillo. SIM.- Medio de cultivo slido en tubos de color mbar transparente, algunas bacterias son capaces de degradar aminocidos azufrados como cistena y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre de estos compuestos para formar cido sulfhdrico H2S en forma gaseosa gracias a la accin de enzimas bacterianas como la cistena desulfhidrasa y tiosulfato reductasa, este medio contiene Sulfato de Amonio Ferroso y Tiosulfato de sodio, este ltimo es el primer sustrato que utiliza la enzima tiosulfato reductasa bacteriana para formar cido sulfhdrico incoloro el cual reacciona con el Sulfato de Amonio Ferroso para formar sulfuro ferroso que forma un precipitado negro en el medio. Escherichia coli no produce H2S2 por lo que el medio conserva su color original.

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INDOL.- El alto contenido de trypticase (triptfano) en el medio SIM, lo hace ideal para la produccin de indol. El triptfano puede ser desaminado por la accin de la enzima triptofanasa que producen algunas bacterias utilizando como coenzima al fosfato de piridoxina (vitamina B6) dando origen a tres metabolitos indlicos (indol, metilindol y cido indolactico) y liberando una molcula de amoniaco. La inmediata aparicin de un anillo de color rojo cuando se agregan cinco gotas del reactivo de Kovac (Alcohol amlico o butlico + Dimetilaminobenzaldehdo + HCL concentrado) al medio de cultivo incubado durante 24 horas indica la presencia de Indol y se considera una prueba positiva. Eschericia coli produce Indol por lo que al agregar 5 gotas del reactivo de de Kovac, se forma un anillo rojo en la superficie del medio SIM. Movimiento positivo en el medio SIM.- Gracias a sus flagelos pertricos, Escherichia coli se desplaza alejndose de la picadura dando un aspecto de remolino o turbidez alrededor de la picadura. Otras pruebas bioqumicas tiles para la identificacin de especie son: Lisina y ornitina descarboxilasa positivas en LIA y MIO. Citrato de Simmons negativo. Ureasa negativa. Gnero Salmonella Son bacilos rectos de 0.7 a 1.5 micras de dimetro por 2 a 5 de largo. Gram negativos. Mviles por tener flagelos pertricos. Anaerobios facultativos. Reducen nitratos a nitritos. Fermentan la glucosa con produccin de gas. No fermentan lactosa. Producen sulfuro de hidrgeno. El citrato comnmente es utilizado como nica fuente de carbono. Descarboxilan la lisina y la ornitina (positivas). Ureasa negativo. Indol Positivo o negativo (segn especie). Resistentes a ciertos productos qumicos (verde brillante, tetrationato de sodio y desoxicolato de sodio) que inhiben a otras bacterias intestinales. Medios de cultivo EMB Las colonias de Salmonella son de color mbar, transparentes o incoloras. En Agar Mac Conkey las colonias de Salmonellas son de forma convexa, circulares de 2 mm . de dimetro aprox., transparentes o incoloras. El medio de Sulfito de Bismuto permite identificacin rpida de S. typhi donde se presentan colonial negras por produccin de sulfuro de hidrogeno. El Agar Desoxicolato con lactosa permiten identificacin rpida de fermentadores y no de lactosa. Salmonella tiphy no fermenta lactosa.

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Otros medios selectivos de cultivo selectivos son Agar SS, Agar Hektoen, Agar citrato y desoxicolato, este ltimo favorece el crecimiento de Salmonella y Shigella sobre otra enterobacterias Pruebas bioqumicas TSI.- Medio slido en tubos con pico de flauta color rojo. Los miembros del gnero salmonella son positivos a la glucosa que se encuentra en el fondo del medio y negativos a la lactosa que se encuentra en el pico de flauta, por lo que la acidificacin del fondo se indicar por el color amarillo, mientras que el pico de flauta con lactosa conservar el color rojo en los tubos de Agar TSI. SIM.- Azfre H2S2.Positivo, SIM.- Medio de cultivo slido en tubos de color mbar transparente, .- Algunas especies del gnero Salmonella degradan aminocidos azufrados como cistena y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre para formar cido sulfhdrico H2S en forma gaseosa por accin de enzimas bacterianas como la cistena desulfhidrasa y tiosulfato reductasa, este medio contiene Sulfato de Amonio Ferroso y Tiosulfato de sodio, este ltimo es el primer sustrato que utiliza la enzima tiosulfato reductasa bacteriana para formar cido sulfhdrico incoloro el cual reacciona posteriormente con el Sulfato de Amonio Ferroso para formar sulfuro ferroso que forma un precipitado negro en el medio SIM. Indol positivo.- El triptfano puede ser desaminado por la accin de la enzima triptofanasa de las Salmonellas produciendo Indol que se manifiesta por la aparicin de un anillo de color rojo cuando se agregan cinco gotas del reactivo de Kovac al medio de cultivo de SIM incubado durante 24 horas lo que indica la presencia de Indol y considerndose una prueba positiva Movimiento positivo en el medio SIM.- Los flagelos pertricos de las Salmonellas le permiten desplazarse y alejarse del sitio de inoculacin dando un aspecto de remolino o turbidez alrededor de la picadura. LIA.- Lisina descarboxilasa positiva.- Las especies del gnero Salmonella (94.6% positiva a la accin de la lisina descarboxilasa), metabolizan a la glucosa del medio, con lo que se acidifica el medio, propiciando la accin de descarboxilacin de la lisina liberando aminas que alcalinizan el medio convirtindolo en color prpura por accin del indicador prpura de bromocresol. Sin embargo, el medio de cultivo ahora alcalino es susceptible para la formacin de H2S Acido Sullfhdrico en forma gaseosa, que se convierte en sulfuro ferroso, precipitado de color negro. La prueba de la lisina descarbixilasa se considera positiva cuando el pico de flauta es de color prpura y el fondo es de color prpura, con produccin o no de H2S.

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La Identificacin final de Salmonellas principalmente tiphy y paratiphy se hace mediante pruebas de aglutinacin en laminilla con sueros especficos como la prueba de Widal (ver reacciones febriles mdulo cardiovascular). La identificacin de enterobacterias deben ser acompaadas de pruebas de sensibilidad a antibiticos, debido a que las especies del gnero de enterobacterias presentan resistencia a antibiticos. Gnero Shigiella Las Shigellas pertenecen a la gran familia enterobactereaceae, bacilos Gram negativos anaerobios facultativos, que miden de 1 a 2 micras de largo por .5 de dimetro. Son capaces de producir gastroenteritis aguda y disentera bacilar, existen 4 especies patgenas para el hombre: S.dysinteriae, S.flexneri, S.boydii, S.sonnei.

Medios de cultivo para Shigellas Agar EMB.- Medio de cultivo con Agar slido en placas. Se siembra con tcnica de aislamiento (estra cruzada).- Las colonias de Shigellas son de forma convexa, circulares de 2 mm . de dimetro aprox., de color mbar, transparentes o incoloras crecen a temperatura ptima de 35 C en 18 a 24 hrs. Mac Conkey.- Medios con Agar slidos en placas, se siembra con tcnica de aislamiento (estra cruzada). Forman colonias convexas, circulares, transparentes, crecen a temperatura ptima de 35 C en 18 a 24 hrs. Agar SS.- Medios con Agar slidos en placas. Se siembra con tcnica de aislamiento (estra cruzada). Las especies de Shigella muestran inhibicin variable y sus colonias incoloras no presentan ennegrecimiento. Crecen a temperatura ptima de 35 C en 18 a 24 hrs.

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Caractersticas fisicoqumicas Resisten a la accin bactericida de los del Azul de metileno del medio de cultivo EMB Anaerobios facultativos pero crecen mejor en medio aerobio. Fermentan glucosa. Forman cido a partir de los carbohidratos. Rara vez produce gas. Lactosa negativos No producen cido sulfhdrico H2S. Indol variable, segn especie. Citrato negativo. Material tubos con medio de SIM. tubos con plasma citratado 1:4 2 tubos con caldo manitol con rojo de fenol. 2 tubos con Agar Hierro Kigler KIA 2 tubos con caldo urea. 2 tubos con Agar Citrato de Simmons. 2 Placas con Agar Cerebro Corazn o TSA. Discos impregnados con antibiticos. Colorantes de Gram. Asa bacteriolgica. Portaobjetos Mechero de Bunsen Microscopio. Procedimiento En caso de crecimiento en los medios de cultivo S110 o Agar Sal Manitol, selectivos para Staphylococcus, Tomar una asada para tincin de Gram y otra asada para realizar la prueba de la coagulasa en portaobjetos (ver prctica 2). Reportar los resultados obtenidos. Reportar la las 24 Hrs de incubacin, las caractersticas de las colonias que desarrollaron en Agar sangre as como el tipo de hemlisis. En caso de haber desarrollo de colonias en los medios selectivos para enterobacterias EMB y Agar Mc Conkey, sembrar en medios diferenciales para pruebas bioqumicas: 1 1

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Tomar una asada de una colonia y sembrar por agitacin en el medio lquido Caldo Urea, con la finalidad de observar la produccin de ureasa. Los microorganismos que poseen la enzima ureasa hidrolizan urea, liberan amoniaco y producen un cambio de color rojo rosa en el medio. Debe hacerse notar que existen diferencias importantes entre el caldo con urea de Stuart y el agar con urea de Christensen. El caldo de Stuart est fuertemente amortiguado con sales de fosfato con un pH de 6.8. El microorganismo en estudio debe formar cantidades relativamente grandes de amonaco para superar el sistema buffer y llevar el pH por encima de 8 para producir un cambio de coloracin de indicador. Sembrar por picadura en el medio de SIM .- Motilidad bacteriana, produccin de cido sulfhdrico e indol.- Los medios para motilidad tienen concentraciones de Agar de 0.4% o menos. Con mayores concentraciones, el gel es lo suficientemente firme para impedir que los microorganismos se dispersen libremente, por lo que solo podrn hacerlo aquellos que tienen flagelos. La prueba de motilidad se interpreta por medio de un examen macroscpico del medio, en el que se busca una zona difusa de crecimiento que se ensancha a partir de la lnea de inoculacin dando un aspecto de remolino o enturbamiento del medio alrededor de la picadura. La produccin de cido sulfhdrico se observa en el medio SIM por la presencia de un color negro en las zonas en donde hay desarrollo bacteriano. La produccin de Indol se observa adicionando el reactivo de Kovac o el reactivo de Erlich al medio de cultivo SIM y se forma un anillo rojo en el medio, la prueba se considera Indol positiva. Prueba de sensibilidad a antibiticos 1.- De una de las cajas con medio de cultivo en donde hubo desarrollo de colonias, tomar una asada y realizar una siembra con tcnica de estra simple el medio BHI o en el medio TSA, tratando de cubrir todo el medio de cultivo con espacios regulares entre las estras, es decir ni muy cerrados ni muy abiertos. 2.- Colocar los discos impregnados con antibiticos, dejando un buen espacio entre disco y disco con la finalidad de delimitar las zonas de inhibicin de crecimiento bacteriano de cada uno de los discos. 3.- Incubar los cultivos a 37 C durante 48 hrs. 4.- Reportar los resultados indicando la inhibicin (sensibilidad) o de resistencia de cada uno de los antibiticos.

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CUESTIONARIO 1.- Mencione las caractersticas morfolgicas, de tincin, cultivo y pruebas especficas para la identificacin del Gnero Streptococcus. 2.- Mencione Las caractersticas morfolgicas de tincin y de crecimiento para la identificacin de Haemophylos influenzae. 3.- Mencione dos medios de cultivo selectivos y dos diferenciales para el crecimiento e identificacin de enterobacterias. 4.- Explique en que consiste la prueba del Indol en el medio SIM y en que momento se considera positiva. 5.- Explique en que consiste la prueba de la Urea y cuando se considera positiva.

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZAMETODOS Y TECNICAS BASICAS PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Prctica No. 9

CICLO ll DE LA CARRERA DE MEDICINA

M.C. MARIO MARTINEZ ROBLES Q.F.B CLAUDIA MARTINEZ CARRERA

109 Prctica No. 9 IDENTIFICACIN DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

OBJETIVOS. 1.- El alumno aplicar la tcnicas de tincin de Ziehl Neelsen. 2.- El alumno identificar las caractersticas morfolgicas del gnero Mycobacterium 3.- El alumno conocer los medios de cultivo para el aislamiento del gnero Introduccin La incidencia de tuberculosis haba ido descendiendo paulatinamente en las ltimas dcadas, de forma tal que en Estados Unidos la prevalencia en 1986 era slo de 9,4 por 100.000 habitantes y se haba conseguido un descenso anual del 5 a 6 % que auguraba la erradicacin de la enfermedad para comienzos del siglo XXI. En Espaa, del 80 al 90 % de la poblacin universitaria en 1940 mostraba reactividad cutnea a la tuberculina, lo cual era reflejo de la prevalencia de la infeccin por M. tuberculosis en la poblacin general. Este porcentaje se redujo al 25% en la dcada de los ochenta. Sin embargo, la aparicin del SIDA ha supuesto un resurgimiento excepcional de esta enfermedad en todo el mundo. Se estima que la mitad de la poblacin mundial est infectada por M. tuberculosis, que hay 30 millones de enfermos en el mundo y que se producen al menos 10 millones de nuevos casos al ao. Unos 3 millones de personas al ao fallecen por tuberculosis, de manera que aproximadamente el 6 % de todas las muertes en el mundo son debidas a esta enfermedad. En algunos pases la incidencia llega a ser de 400 por 100.000 habitantes. Aunque no existen datos globales de tuberculosis, se estima que la incidencia es probablemente superior a 70 por 100.000 habitantes, aunque sin duda ser mucho mayor en ciertas rea y grupos de riesgo. La pobreza y la tuberculosis siempre fueron fenmenos paralelos. El SIDA ha favorecido el desarrollo de tuberculosis en pacientes de las clases ms desfavorecidas y en grupos de personas jvenes en las etapas ms productivas de su vida. La coinfeccin VIH y tuberculosis ha conducido a un gran desarrollo en tcnicas de microbiologa clnica, para su diagnstico y para el diagnstico de la resistencia a frmacos antimicobacterianos

110 Las tcnicas de tipificacin de los bacilos de la tuberculosis con fines epidemiolgicos son de gran importancia debido a que las infecciones ocasionadas por micobacterias atpicas diferentes a las del complejo tuberculosis o lepra son cada da ms frecuentes y por reaparecer en pases desarrollados, como los Estados Unidos de Amrica. La infeccin por el VIH ha creado el sustrato que ha conducido en estos ltimos aos, a la descripcin de numerosas nuevas especies de micobacterias atpicas patgenas. EL GNERO MYCOBACTERIUM El gnero Mycobacterium incluye ms de 100 especies que pueden clasificarse en seis grupos desde el punto de vista bacteriolgico, pero con fines didcticos se dividen en tres grupos: 1.- Complejo tuberculosis Incluye las especies M. tuberculosis, Mycobacterium bovis (incluida la cepa BCG) y Mycobacterium africanum, productoras todas ellas de tuberculosis. Se incluye tambin Mycobacterium microti, productor de tuberculosis en ratas. 2.- Complejo lepra En el que se incluyen las especies M. leprae, productor de la lepra humana, y Mycobacterium lepraemurium, que produce lepra en roedores. 3.- Otras Micobacterias Micobacterias no comprendidas en los dos grupos anteriores. Slo algunas de ellas suelen ser patgenas, otras pueden ser patgenas oportunistas y finalmente otras suelen ser saprofitas. Producen las denominadas micobacteriosis. Morfologa del Gnero Mmycobacterium tuberculosis Si bien las micobacterias en general pueden variar mucho en su morfologa, desde formas cocoides pequeas a largos filamentos, M. tuberculosis suele tener una morfologa caracterstica, es un bacilo delgado de forma recta o ligeramente curvada en frotis teidos, y su tamao suele ser de 1-4 micras de largo por 0,3-0,5 micras de ancho. Son bacilos cido-alcohol resistentes por lo que la tincin de Ziehl Neelsen es til para la coloracin de estos microorganismos obtenidos de muestras clnicas o de cultivo.

111 Con esta tincin, los bacilos aparecen de color rojo brillante sobre un fondo azul. Los bacilos tuberculosos tienen un crecimiento muy lento incluso en condiciones ptimas y requiere de 10 a 20 das de incubacin a 37C. Aunque la proliferacin puede tener lugar a un pH que oscila entre 6 a 7.6, el pH ptimo de crecimiento es de 7.

El tiempo de duplicacin de M. tubercusosis en condiciones ptimas de cultivo es de 15 a 18 horas, tardando varias semanas (1 a 3) en aparecer colonias visibles en medios de cultivo. Los bacilos tuberculosos son difciles de teir con la tincin de Gram, en tal caso, se observan como bacilos Gram positivos con tincin irregular. El mecanismo fundamental de transmisin de la tuberculosis es por va respiratoria. La tuberculosis causada por M. bovis, transmitida por va digestiva mediante la ingestin de leche contaminada. El bacilo de la tuberculosis se transmite mediante pequeas partculas de menos de 10 micras emitidas al estornudar, hablar o toser. Con la tos pueden emitirse unas 3.000 partculas potencialmente infecciosas, igual nmero puede eliminarse al hablar 5 minutos y muchas ms al estornudar. Cada una de estas partculas infecciosas suele contener una o pocas bacterias que pueden permanecer viables suspendidas en el aire durante varios minutos, permitiendo que el contagio se realice incluso en ausencia del individuo fuente de la infeccin, especialmente si la habitacin donde estuvo ha permanecido cerrada y sin luz solar, ya que M. tuberculosis es sensible a la accin de la luz ultravioleta. La mayora de los pacientes tuberculosos excretan pocos bacilos, por lo que generalmente se requiere un contacto continuado y fundamentalmente la convivencia domiciliaria, para infectarse.

112 La mayora de la micobacterias y entre ellas M. tuberculosis, se desarrollan de forma adecuada en medios simples que contienen una fuente de carbono, una de nitrgeno con iones de metales esenciales entre ellos hierro y magnesio. Para el aislamiento primario de muestras clnicas, se requiere un medio mas complejo que contenga una base de patata, huevo o una base de Agar suero. Son bacilos aerobios estrictos y no crecen en ausencia de oxgeno. Las micobacterias son muy resistentes a la desecacin. El medio ambiente en el que se encuentran constituye un factor muy importante para su viabilidad. Cuando se exponen a la luz solar directa, los bacilos tuberculosos de los cultivos son destruidos en 2 horas, pero si estos estn presentes en el esputo, pueden permanecer viables durante periodos ms largos. La estructura celular de M. tuberculosis consta de un gruesa pared, separada de la membrana celular por el espacio periplsmico, con cuatro capas. La mas interna es el glicopptido o peptidoglicano con molculas de N-acetilglucoamina y cido-N-glucolilmurmico (en lugar del habitual N-acetilmurmico) con cortas cadenas de alanina, a diferencia de M. leprae que posee glicina. Esta capa es el esqueleto de la bacteria que le da forma y rigidez. Externamente, hay otras capas compuestas una por polmeros de arabinosa y galactosa, otra formada por cidos miclicos que son cidos grasos derivados, de gran importancia taxonmica en micobacterias y otros gneros relacionados como Nocardia. Otra capa superficial formada por lpidos como los sulfolpidos, el cord factor, llamado as por su aparente asociacin con la forma acordonada con que se agrupan las micobacterias virulentas, y los micsidos que son al igual que el anterior glicolpidos. Antgenos Los principales antgenos de las Mycobacterias pueden dividirse en dos grandes grupos: A).- Solubles o citoplasmticos. B).- Insolubles ligados a la pared celular. A).- Antgenos solubles 1).- De naturaleza polisacrida, comunes a todas las Mycobacterias y constituidos por arabinomananos, arabinogalactanos, glucanos.

113 2).- Protenas.- Entre ellas la denominada tuberculina vieja (OT) o el Dervado Proteico Purificado (PPD). Tambin el antgeno 5 o el de 65 Kda. 3).- Lipdica, los monsidos de fosfatidil inositol (PIM) constituyen una familia de lpidos polares que se encuentran en la membrana plasmtica de las micobacterias. Entre ellos podemos citar los glicolpidos fenlicos, bastante especficos para M. leprae (PGL-1), para M. kansaii (PGL-kl) y para M. tuberculosis (PGL-Tbl). 4).- El denominado antgeno 60 (Ag 60) es un complejo proteico lipopolisacrido procedente del citoplasma y de la membrana celular de M. bovis BCG y es comn a M. tuberculosis. M. bovis y otras micobacterias. Estudiando a estos antgenos en doble difusin en gel se han establecido 4 grandes grupos con mayor o menor especificidad: Grupo I: compuesto de antgenos comunes compartidos por todas las micobacterias e incluso algn otro gnero bacteriano como Nocardia y Corynebacterium. Grupo II: seran antgenos propios de las micobacterias de crecimiento lento. Grupo III: lo formaran antgenos de micobacterias de crecimiento rpido y nocardias. Grupo IV: constituido por antgenos propios de cada especie. B).- Antgenos insolubles Los antgenos insolubles ligados a la pared se han usado con fines taxonmicos mediante aglutinacin por especies no rugosas como M. avium, establecindose serotipos, pero no son tiles en M. tuberculosis por producir autoaglutinacin. Clasificacin de las Mycobacterias Todas las Mycobacterias no comprendidas dentro del "complejo tuberculosis" ni del complejo M. leprae han recibido a travs de los tiempos muy diferentes nombres en un intento de agruparlas a todas. Actualmente deben de individualizarse y denominarse cada una segn su nombre binominal aceptado cientficamente. A la visin microscpica en una baciloscopa pueden parecer idnticas a Mycobacterium tuberculosis y confundirse con l, pero si se estudian desde el punto de vista bacteriolgico de manera ms detallada, muestran una serie de diferencias mediante las cuales han sido clasificadas unas cien especies diferentes a M. tuberculosis, de las que se aceptan internacionalmente ms de 50.

114 Estas se clasifican en varios grupos desde el punto de vista bacteriolgico, basados en su velocidad de crecimiento (rpido o lento, segn sea inferior o superior a una semana en medio slido) y en la produccin de pigmento en presencia o ausencia de luz (fotocromgeno o escotocromgeno). Algunas se han descrito como patgenas, otras pueden ser patgenas oportunistas y otras que, aunque pueden encontrarse en productos patolgicos humanos, suelen ser saprofitas. Grupos de crecimiento lento Grupo I.- Fotocromgenas Grupo II Escotocromgenas Grupo III No cromgenas Fotocromgenas Pigmento amarillo limn.- M. Kansaii. Pigmento rosa-rojo: Intermedium. M. Avium, M. intracellulare, M. Asiaticum, M. Lactis, M.

Pigmento amarillo-naranja: M. Gastri, M. Gordonae, M. Trrea, M. Scrofulaceum, M. Agri, M. Duvalii, M. Chitae, M. Gadium, M. Moriokaiense, M. Neoaurum. M. confluentis, M. gilvum, M. Mucogenicum, M. obuense, M.rhodesiae, M. aichiense, M. chubuense, M. tokaiense. Pigmento irregular, M. Phle, M. Vaccae, M. Thermoresistibile, M. Parafortuitum, M. Diernhoferi, M. Smegmatis, M. austroafricanum No se incluyen en esta clasificacin especies que no suelen aislarse de productos patolgicos humanos, como: M. alvei, M. brumae, M. chlorophenolicum, M. farcinogenes, M. hiberniaie, M. holderi, M. komosense, M. lepraemurium, M. madagascariense, M. mageritense, M. microti, M. porcium, M. poriferae, M. pulveris, M. senegalense, M. Sphagni, que son ambientales. Morfologa Mycobacterium Kansaii.- Los bacilos de M. Kansaii habitualmente son ms largos y ms anchos que los de M. Tuberculosis, con la coloracin para cido-alcohol resistencia, de manera caracterstica se tien de forma desigual para dar un aspecto en bandas o en rosario. Lo habitual es que los microorganismos se dispongan en cordones curvos.

115 M. Kansaii es fotocromgeno. Las colonias, que son visibles despus de 1 a 2 semanas de incubacin en la oscuridad, en medios de glicerol-huevo, en general son lisas de y de color marfil. Si se desarrollan en la luz son de color amarillo limn. Mycobacterium avium - Mycobacterium intracellulare.- Se emplea el trmino complejo M. Avium - M. intracellulare (MAC) para referirse a estas Mycobacterias. M. avium est constituido por tres serotipos diferentes por aglutinacin, mientras que M. intracellulare contiene unos 25 serotipos. En las muestras clnicas, los microorganismos son pleomrficos, pero en los medios de cultivo habitualmente se presentan como bacilos cortos con grnulos cido-alcohol resistentes bipolares. Casi todas las cepas de M. avium virulentas, crecen mejor a 44 C que a 37 C, en tanto que la mayor parte de las cepas de M. intracellulare prefieren la temperatura inferior. Las cepas aviarias se pueden adaptar a un buen desarrollo a 37 C y entonces son indistinguibles de las cepas avirulentas de M. intracellulare por las pruebas habituales. Las colonias de los aislamientos primarios son predominantemente delgadas, traslcidas y lisas. En la actualidad la infeccin por M. Avium M.intracellulare se reconoce como a una de las complicaciones del SIDA. Mycobacterium malmoense y Mycobacterium haemophilum.- Son especies no fotocromgenas con propiedades bioqumicas similares a M. avium, M. malmoense parece inducir un serotipo aglutinante diferente y se asocia con enfermedad pulmonar. M. haemophilum es la nica micobacteria de crecimiento lento, incapaz de multiplicarse en ausencia de hemina. Requiere temperaturas entre 30 a 32 C. y no crece a 37 C. Es probable no sea aislado de muestras clnicas debido a que no se emplean los medios y las condiciones de cultivo adecuadas. Mycobacterium scrofulaceum.- M. scrofulaceum es un microorganismo ms largo, ms grueso y con una disposicin en rosario ms grosera que M. tuberculosis. En medios lquidos, los microorganismos se distribuyen al azar y no presentan evidencias de formacin de cordones. M. scrofulaceum es escotocromgeno, y produce colonias compactas en forma de cpula, las cuales son amarillas a anaranjadas cuando se proliferan en la oscuridad pero desarrollan una pigmentacin anaranjada rojiza con una exposicin continua a la luz.

116 Mycobacterium simiae.- M. simiae se aisl en 1965 a partir de monos enfermos, desde entonces ha sido encontrado en asociacin con enfermedad humana. Tambin se lo ha aislado del medio ambiente de suministros de agua. El microorganismo es fotocromgeno y produce colonias pequeas que al comienzo presentan un colorante pero que gradualmente se vuelven amarillas por exposicin a la luz. Su propiedad ms caracterstica es la produccin de niacina, un rasgo que no se observa en las otras micobacterias atpicas. M. simiae es muy resistente a los frmacos antituberculosos. Mycobacterium szulgai.- M. szulgai se parece a M. scrofulaceum y al no patgeno M. gordonae, pero se diferencia de ellos tanto bioqumica como serolgicamente. El microorganismo debe ser diferenciado de M. gordonae, un escotocromgeno de crecimiento lento que se asla con frecuencia del esputo de pacientes que no presentan infecciones micobacterianas. Se comporta como escotocromgeno cuando se incuba a 37C y fotocromgeno si es incubado a 27C. Mycobacterium ulcerans.- M. ulcerans produce una enfermedad cutnea destructiva principalmente tropical en ciertas reas de frica, Nueva Guinea, Amrica del Sur y Norte de Australia, tambin se han descrito en otros lugares. Si no se trata en una etapa temprana, provoca ulceras crnicas con centros necrticos. En los cultivos, los bacilos miden 0.5 micras de ancho y 1.5 a 3 micras de largo, pero en cortes histolgicos habitualmente son ms grandes y con aspecto en rosario. La temperatura ptima para el desarrollo es de 30 a 33 C. y no proliferan a 25 C. ni a 37 C. Su multiplicacin es muy lenta y se requieren de 6 a 12 semanas para el aislamiento primario. En el medio de Lowenstein-Jensen, se desarrollan colonias rugosas y cupuladas de color amarillo limn. Mycobacterium xenopi.- El primer aislamiento ser realiz en un animal de sangre fra, el sapo Xenopus laevis, requiere temperaturas de 42-45C. Para el aislamiento primario, se necesitan de 3 a 4 semanas o ms. Las colonias caractersticas son muy pequeas y granulares y cuando se las observa con el microscopio presentan una red perifrica de hifas. En la incubacin prolongada, se desarrolla de forma gradual una pigmentacin amarilla. En las tinciones, los bacilos son ms largos y delgados que lo habitual y con frecuencia se disponen formas arqueadas tpicas en nidos de pjaros. M. Xenopi ha sido aislado del agua, tanto fra como caliente.

117 Mycobacterias de crecimiento rpido Mycobacterium marinum.- M. marinum es una especie fotocromgena implicada en una enfermedad cutnea granulomatosa conocida habitualmente como "granuloma de las piscinas". M. marinum crece con rapidez a 30-32C en cualquiera de los medios que a menudo se emplean para micobacterias pero no lo hace si se le incuba a 37C. En el medio de Lowentein-Jensen las colonias son blancogrisceas con estras de color amarillo plido pero expuestas a la luz temperatura ambiente, desarrolla una intensa pigmentacin amarillo-anaranjada. Las lesiones se presentan en el sitio de abrasiones menores, en especial en los codos y en las rodillas. La infeccin habitualmente comienza 2 a 3 semanas despus de la exposicin como una pequea ppula, que poco a poco aumenta de tamao, se ulcera y segrega pus que contiene microorganismos cido-alcohol resistentes. Se encuentra presente en el agua dulce y salada y en los peces de estas aguas. Mycobacterium fortuitum y Mycobacterium chelonae.- En la actualidad, M. fortuitum y M. chelonae son especies bien definidas, pero debido a que comparten una serie de caractersticas similares y a que con frecuencia se las encuentra en los mismos tipos de infeccin, anteriormente recibieron el nombre de complejo M. fortuitum-M. chelonae. Los microorganismos de este grupo son pleomrficos y presentan diferentes grados de cido-alcohol resistencia. En pus se observan formas largas y filamentosas. Las colonias que se desarrollan despus de 72 horas de incubacin a 37 C en el medio 7H 10 son no pigmentadas y habitualmente grandes y rugosas, pero en algunos medios tambin se desarrollan colonias creas y lisas. Algunas cepas de M. fortuitum pueden tener aspecto similar y ser identificadas de forma incorrecta como M. tuberculosis si los cultivos no son inspeccionados durante las 3 a 4 semanas siguientes a la incubacin. Una manifestacin clnica frecuente es un absceso que se presenta en el sitio del traumatismo, en general en el sitio de la inyeccin de productos supuestamente estriles. La infeccin pulmonar por M. fortuitum no se puede diferenciar radiolgicamente de la tuberculosis.

118 ESPECIES DE MICOBACTERIAS QUE PUEDEN PRODUCIR ENFERMEDADES EN EL HOMBRE Especie de Micobacteria M. avium-intracellulare M. celatum M. genavense M. haemophilum M. kansaii M. malmoense M. marinum M. scrofulaceum M. simiae M. szulgai M. ulcerans M. xenopi Enfermedad ms frecuente Enfermedad pulmonar, linfadenitis cervical en nios. Enfermedad diseminada (SIDA) Enfermedad pulmonar similar a tuberculosis. Enfermedad diseminada SIDA Enfermedad diseminada similar a MAC (SIDA). Ndulos cutneos, Enf. Diseminada (SIDA). Enfermedad pulmonar similar a tuberculosis. Enfermedad diseminada (SIDA). Enfermedad pulmonar crnica. Infeccin cutnea. Linfadenitis cervical en nios Enfermedad pulmonar crnica Enfermedad pulmonar similar a tuberculosis Ulceras cutneas (lcera de Buruli en Africa, lcera de Baimsdale en Australia) Enfermedad pulmonar crnica.

Rpidos crecedores.- (M. fortuitum, M. chelonae, M. abscessus) : Infecciones de partes blandas, osteomielitis, enfermedad diseminada, infeccin de herida quirrgica. Diagnstico El diagnstico definitivo de tuberculosis slo puede establecerse cuando se cultiva M. tuberculosis. Sin embargo, existen otras pruebas diagnsticas, que ayudan a plantear el diagnstico de esta enfermedad. Pruebas microbiolgicas. Las caractersticas de tincin de M. tuberculosis permiten su rpida visualizacin (baciloscopa) en muestras clnicas mediante el uso de diferentes tcnicas de tincin. En la tcnica de Ziehl-Neelsen, se emplea como colorante fucsina fenicada calentada, decolorada con cido-alcohol y contrateida con azul de metileno. La tincin de Kinyoun es similar a la de Ziehl-Neelsen, pero no utiliza el calor para favorecer la captacin de la tincin.

119 La baciloscopa ser positiva en una tercera parte, aproximadamente, de los pacientes en los que el cultivo de esputo es positivo, pero este porcentaje puede aumentar hasta el 69 o 70 % si se hace un mayor nmero de baciloscopas, aunque raras veces es necesario recoger ms de 3 esputos para conseguir una baciloscopa positiva. En general, la rentabilidad de la baciloscopa del esputo depender del tipo de lesin pulmonar. Son necesarios 10.000 bacilos por ml. de esputo para que la baciloscopa sea positiva. Por lo tanto, en las lesiones pulmonares pequeas, poco bacilferas, pueden necesitarse mayor nmero de esputos; por el contrario, si un paciente tiene una gran caverna y la baciloscopa es negativa, se debera ir pensando en un diagnostico alternativo. Si el paciente no expectora, puede inducirse el esputo o realizar una broncoscopa o un aspirado traqueal. El jugo gstrico es una buena muestra para investigar la presencia de micobacterias digeridas desde las vas respiratorias Las tcnicas flurocrmicas con auramina-rodamina se basan en el mismo principio bsico, pero permiten una ms rpida y ms cmoda visualizacin de las micobacterias que muestran una llamativa fluorescencia amarilla anaranjada cuando se observan con microscopio de campo oscuro. TOMA DE MUESTRAS Esputo inducido 1.- Haga que el paciente se enjuague la boca con agua. 2.- Con ayuda de un nebulizador haga que el paciente inhale aerosoles de una solucin salina estril del 3 al 10 %. 3.- Colecte el esputo inducido en un envase estril de boca ancha. Aspirado Traqueal 1.- Colecte el espcimen a travs de una intubacin endotraqueal o por traqueotoma. 2.- Pase el catter o sonda a travs del sitio de entrada a la trquea. 3.- Aspire el material de la trquea utilizando una jeringa o succionador intermitente. 4.- Descargue la muestra en el medio de cultivo o de transporte. 5.- Retire la sonda. 6.- Enve al laboratorio. 7.- No refrigerar la muestra.

120 Muestra por broncoscopa Colecte el espcimen va broncoscopio. El cepillado bronquial es preferido al lavado, ya que el lavado es ms diluido. Anestesie el rea con Lidocaina tpica al 2% preferiblemente. Haga que el paciente inhale por la boca y exhale por la nariz. Lubrique ambas fosas nasales con Xylocaina en jalea. El paciente pudiera necesitar Demerol intravenoso para tolerar el broncoscopio. Lubrique el broncoscopio con Xylocaina al 2% en jalea, evitando tocar la punta distal. Introduzca el broncoscopio intranasalmente. Para cepillado bronquial Utilice un broncoscopio de doble lumen. Inserte la brocha citolgica dentro del canal abierto del broncoscopio y avance. Empuje la brocha fuera de su protector y realice el cepillado. Jale la brocha hacia dentro de su protector y remueva la unidad de brocha completa. Coloque la brocha dentro del tubo de transporte conteniendo solucin salina o Ringers lactato. Recuerde que la brocha se seca al aire rpidamente, lo cual es negativo para el cultivo. Enve al laboratorio inmediatamente. Si desea estudio por micobacterias, puede colocar la brocha dentro de un tubo conteniendo 10 ml de caldo de Middlebrook 7H9. Para lavado bronquial Sujete una trampa de Lukens al broncoscopio. Introduzca 10 ml de solucin salina no bacteriosttica a travs del canal abierto. Succione el material desde afuera. Selle el tubo de la trampa y enve al laboratorio TINCION DE ZIEHL NEELSEN Los microorganismos cido alcohol resistentes son aquellos que despus de haber sido teidos con algn colorante, son capaces de resistir la decoloracin con cidos (sulfrico y ntrico) y alcoholes. La resistencia a la decoloracin es debida a los lpidos estructurales de las membranas que forman la pared de estos microorganismos. Las especies del gnero Mycobacterium son el prototipo

121 Tcnica 1.- Preparar un frotis con la muestra (contenido de material orgnico con Mycobacterias). 2.- Cubrir el frotis con fucsina fenicada. 3.- Calentar hasta emisin de vapores durante 5 minutos ( el exceso de calor destruye a los microorganismos). Colocar el portaobjetos sobre la malla de alambre y mueva el mechero de Bunsen acercando o alejando la flama, segn requiera calor para emisin de vapores. 4.- Lavar con agua corriente para eliminar el exceso de colorante. 5.- Decolorar con alcohol cido, hasta que las capas finas de colorante adherido al portaobjetos se vuelvan incoloras. 6.- Lavar con agua corriente para eliminar y neutralizar la accin del alcohol cido. 7.- Agregar Azul de metileno y retenerlo en el frotis durante 30 segundos. 8.- Lavar con agua. 9.- Secar al aire a temperatura ambiente o con calor suave en la flama del mechero de Bunsen. Interpretacin Las Mycobacterias cido alcohol resistentes se observan en forma de bastones ligeramente curvos de color rojo en un fondo azul marino. MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA Tincin con auramina rodamina La microscopa de fluorescencia se basa en los mismos principios de ptica que la microscopa comn, con diferencias en la generacin y transmisin de rayos luminosos con longitudes de onda adecuadas para visualizar los fluorocromos ya sean propios de la muestra o de la coloracin utilizada. Generalmente requiere luz con longitudes de onda cortas, en el UV cercano (lmpara de halgeno-cuarzo, arcos de mercurio, etc.)

122 Las lentes deben ser de algn material (generalmente fluorita) que transmita esas longitudes de onda y el aceite de inmersin no debe ser fluorescente. Se encuentran diversos ejemplos de fluorocromos naturales tales como algunas vitaminas, esteroides, porfirinas, etc. Un ejemplo de estudio de bacterias por visualizacin directa de fluorocromos naturales es la observacin de bacterias metanognicas con luz Ultra Violeta. Estas fluorescen con luz UV en preparaciones sin coloracin debido al la presencia de coenzimas fluorescentes F 420 y F 350, relacionadas con el metabolismo del C y la metanognesis. Otros compuestos que fluorescen como rodamina, auramina, fluorescena, colorantes de acridina, etc., se utilizan en distintas tcnicas de tincin; por ejemplo la tincin de microorganismos cido-resistentes con auramina-rodamina en muestras de tejido y esputo. Tambin se utilizan en las tcnicas de inmunofluorescencia que consiste en la aplicacin a la muestra, de una solucin de un anticuerpo marcado con una sustancia fluorescente; si la muestra tiene el Antgeno que se busca, este reaccionar con el Ac fluorescente y as se localizar el Ag. Solucin de auramina-rodamina Auramina O .............. 1.50 g Glicerol ..................... 75.0 mL Agua destilada ......... 50.0 mL Rodamina B ............. 0.75 g Fenol ......................... 10 mL

Mezclar y dejar toda la noche. Filtrar con lana de vidrio para clarificar. Esta solucin se mantiene varios meses a 4C o a temperatura ambiente. Almacenar en frasco oscuro. Solucin decolorante HCl conc. ............... 5 mL Etanol 70% .............. 100 mL Solucin de contraste KMnO4 ................... 0.5 g Agua destilada csp ...... 100 mL Guardar en frasco oscuro.

123 Tcnica ("Procedures for the isolation and Identification of Mycobacteria", Public Health Service Publication N 1995, 1969) . 1.- Preparar un frotis 2.- Fijar al calor entre 65 a 75 C durante, por lo menos 2 horas. 3.- Cubrir con solucin de auramina-rodamina y dejar 15 min a temperatura ambiente. 4.- Lavar con agua. 5.- Cubrir con solucin de KMnO4 0.5% (solucin de contraste) y dejar no ms de dos a cuatro minutos . 6.- Lavar con agua. 7.- Secar al aire y observar con microscopio de fluorescencia. Interpretacin Con este sistema los organismos cido-resistentes emiten una fluorescencia amarillo-naranja. Las partculas fluorescentes no especficas son, usualmente de color amarillo plido.

Prueba tuberculnica. La prueba tuberculnica es una reaccin cutnea de hipersensibilidad que indica la existencia de infeccin tuberculosa previa. La prueba se lleva a cabo con un extracto proteico purificado (PPD) de M. tuberculosis. En Espaa se usa el lote RT-23 del PPD, que debe administrarse por va intradrmica (intradermorreaccin de Mantoux) aplicando en la cara anterior del brazo 0,1 ml que contienen 2 unidades de PPD RT-23, que son equivalentes a 5 unidades del antgeno de referencia (denominado PPD-S).

124 Las reacciones deben leerse midiendo el dimetro transverso de la zona de induracin a las 48-72 horas. En Espaa, un Comit Nacional de Expertos ha recomendado que la prueba se considere positiva a partir de 5 mm. Conviene recordar que la prueba tuberculnica puede ser positiva si el paciente ha tenido contacto con otras micobacterias no tuberculosas. Por ello, en los pases con una alta incidencia de otras micobacteriosis, para considerar que un paciente ha tenido contacto con M. tuberculosis se exigir un mayor tamao de la prueba tuberculnica. En los pacientes que han sido vacunados contra la tuberculosis con BCG, la prueba tuberculnica puede ser positiva durante un perodo aproximado de 10 aos. En los vacunados, la reaccin se considerar positiva cuando sea mayor de 14 mm. Medios de cultivo M. tuberculosis necesita de 5 a 20 horas para duplicarse por lo que el cultivo de esta micobacteria exige un tiempo muy prolongado, entre 4 y 8 semanas, en los medios de cultivo convencionales de Lwenstein-Jensen o de Middelbrook. Medios slidos El mtodo tradicional de cultivo para micobacterias incluye la inoculacin de varios medios slidos o lquidos con y sin antibiticos. Un medio con base de huevo, glicerol, papa, aminocidos y citrato como el Lowenstein Jensen es el ms conocido. Tambin los medios sin base de huevo como el Middlebrook 7HlO y 7Hll. Mtodos lquidos de lectura manual El sistema Septi-Chek MB (Becton Dickinson) consiste en un medio bifsico de 20 ml. de caldo Middlebrook 7H9, enriquecido con CO2, suplementando con factores de crecimiento y antibiticos, al que se le acopla un dispositivo en la parte superior despus de la inoculacin de la muestra. Este dispositivo tiene tres medios de cultivo, por un lado un agar Middlebrock 7H11 no selectivo, que permite el crecimiento de la mayora de las micobacterias y por otro lado, dos secciones, una con un medio modificado de Lowenstein-Jensen, y otra con Agar chocolate para detectar contaminaciones. El medio lquido es vertido sobre la fase slida inicialmente y a intervalos durante la incubacin. El sistema se revisa visualmente. El crecimiento se detecta tanto en el medio lquido como en la fase slida.

125 El medio de cultivo Mycobacterial Growth Indicador Tube (MGIT) (Becton Dickinson), utiliza tambin un caldo de Middlebrook 7H9 al que se incorpora un sensor fluorescente sensible al O2 formado por un compuesto de rutenio pentahidratado sobre una base de silicona. A medida que se produce crecimiento bacteriano se consume O2 y esto permite observar fluorescencia en el tubo mediante el uso de un transiluminador de luz ultravioleta de 362 nm. Este medio en la actualidad est automatizado Desarrollo de la prctica Material Mechero de Bunsen. Microscopio. Asa bacteriolgica. Portaobjetos. Aceite de inmersin. Alcohol cido al 39% Fucsina de Ziehl Procedimiento 1.- Tomar una asada de la cepa y sembrar en los medios de cultivo. 2.- Incubar a 37 C durante 4 das. 3.- Hacer una tincin de Mycobacterium sp. con tcnica de Ziehl Neelsen. 4.- Realizar la prueba de la catalasa para Mycobacterium sp. Reportar los hallazgos microscpicos. Reportar la morfologa colonial del crecimiento en los medios de cultivo. Azul de metileno 1 Tubo con cepa Mycobacteriun sp. 1 Tubo con medio de cultivo Lowestein Jensen 1 Caja con Agar glicerol telurito. Perxido de Hidrgeno.

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CUESTIONARIO 1.- Describa las caractersticas morfolgicas del gnero Mycobacterium complejo tuberculosis. 2.- Mencione dos medios de cultivo as como su contenido, para el aislamiento del Gnero Mycobacterium complejo tuberculosis. 3.- Describa una tcnica para la toma de la muestra bronquial. 4.- Describa la tcnica de tincin de Ziehl Neelsen. 5.- Describa el fundamento de las tinciones fluorescentes

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Estimado lector, deseo comunicarte que esta obra la estamos iniciando con grandes esfuerzos y muchas carencias, por lo que pedimos tu comprensin por las deficiencias que en ella puedas encontrar y te hacemos una cordial invitacin para que sumes esfuerzos para continuarla y que no quede inconclusa ya que en nuestra carrera de Medicina carecemos de un material de apoyo actualizado. En esta obra tratamos de actualizar temas, resumirlos, incluir imgenes ilustrativas, hacer uso de los medios y herramientas auxiliares que mejoren la calidad de EnseanzaAprendizaje y lo mas importante es obtener los elementos metodolgicos, tcnicos necesarios para que puedas realizar una verdadera Investigacin Cientfica desde el inicio de tu carrera. Estamos en el laboratorio de Microbiologa de la Facultad de Estudios Profesionales Zaragoza! Tel. M.C. Mario Martnez Robles 51-12-51-69

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