l~aunyn-Sehmiedebergs Arch. exp. Path. u. Pharmak. 253, 395--401 (1966)

Mechanismus der gesteigerten glykogenolytischenWirkung des Diazoxids im Kaliummangel ~

H. KAESS**, G. SENFT, W . LOSERT, R. SITT** u n d G. SCHULTZ

Pharmakologisches Insti tut der Freien Universit~t Berlin

Eingegangen am 29. Oktober 1965

Bei Un te r suchungen fiber die nach chronischer Gabe yon sulfonami- d ie r t en Benzo th iad iaz inen au f t r e t ende Blu tzuckers te igerung wurde fest- gestel l t , d a b diese durch Verabfo lgung ka l iumha l t ige r Salze ve rh inde r t werden k a n n (WOLFF U. PA~MLEY, 1964; MENG U. K~ONEBE~G, 1965; LOSE~T, SE~FT u. SITT, 1965). Auch die In t ens i t~ t de r D ia z ox id -H ype r - g lyk~mie wi rd du tch Zufuhr yon K a l i u m herabgese tz t (KvAM u. STANTOI~, 1964). K a l i u m m a n g e l f i ihr t zu einer Versti~rkung des pha rmako log i schen Effekts. W i t h a b e n un te r such t , in welcher Weise K a l i u m i o n e n die durch Diazox id bed ing te Glykogenolyse (Sc~uLTZ, SENFT, LOSERT u. SITT, 1966; LOSE~T, SENFT, SITT, SCHULTZ U. KAESS, 1966) beeinflussen.

Methodik Die Versuche warden an m~nnlichen Wistarratten mit einem Gewicht zwisehen

100 und 150 g durchgefiihrt. Sie erhielten Leitungswasser und Trockenfutter Altromin R, das wit ihnen zu Beginn der Versuche entzogen.

Diaxozid wurde den Tieren in einer Gummi-arabicum-Suspension dutch eine Sehhindsonde gegeben.

Zur Erzeugung eines Kaliumdefizits wurden die Ratten in Stoffwechselk~figen 1 gehalten, die ein quantitatives Auffangen yon Stuhl und Urin ermSglichen, ohne da~ die Ausscheidungen dutch Futter verunreinigt werden. Die Ratten erhielten eine nahezu kaliumfreie, sonst jedoch vollwertige Digit (Nutritional Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio) und destflliertes Wasser als Trinkfliissigkeit. Die mit dem Stuhl und Urin ausgeschiedenen Kaliummengen wurden flammenphotometriseh ge- messen.

Die Na +- und K+-Konzentrationen ira extra- und intraeellul~ren Raum wurden nach einem in einer friiheren Arbeit angegebenen Verfahren bestimmt (LosE~T, SENFT U. SEI~T, 1964).

Die Technik der Blutgewinnung, die Messung der G]ucose, Phosphorylase- und 3',5'-AMP-Phosphodiesterase-Aktivit~t sind bei SCHULTZ, SENFT, LOSERT U. SITT (1966) publiziert.

* Ein Teil der Ergebnisse wurde auf der 29. Tagung der Deutsehen Phar- makologisehen Gesellschaft vorgetragen (K~Ess, LOSERT, SCHULTZ, SEI~FT n. SITT, 1966).

** Wir danken der Deutsehen Forschungsgemeinschaft f'ur die Unterstiitzung unserer Arbeiten.

1 Wir danken Herrn Mechanikermeister H. DIETZ fiir die Anfertigung dieser KKfige.

396 H. K ~ s s , G. S~yT, W. LOS~RT, R. SITT und G. SCHVL~Z:

F ~

~ ' ~ " 0

Phosphorylase-Phosphatase wurde nach dem von KELL~.~ U. CORI (1955) an- gegebenen Verfahren aus Skeletmuskulatur yon Ratten gewonnen. Nach der in der gleichen Arbeit angegebenen l~ethode lieBen wit dieses Ferment in vitro auf ge- reinig~ Muskel-Phosphorylase a (SIGMA Chemical Comp., St. Louis, Mo.) ein- wirken und bestimmten soino Aktivit~it dutch Messung der Abnahme der Phos- phorylase a-Konzentration.

Ergebnisse Der durch Diazoxid (100 mg/kg p.o.) bedingte Anstieg der Glucose-

konzentration im Blur wird bei normal ern~hrten Tieren fast vSllig unterdriickt, wenn die Rat ten 10 mmol KC1/kg zusammen ~70 mit dem Benzothiadiazin er- halten (Abb. 1). ~ ~o

Der blutzuekersteigernde Effekt der Verbindung wird dagegen nach Erzeugung eines ~ ~ 5o

Kaliumdefizits durch kalium- freie Ern~hrung verst~rkt ~ ¢0 (hbb.2).! .~

zac~ gle/c~e/Wge/" B'OZ~ vonZO mmol K ~ [ ~

P<4

n =/9 ~=18 Abb. 1

I

+ 1

p=~o7

mch 50 m~]~ D<hzoxid per os KJ/ym_~2#: 0 8Gg, I 7q~,,l

Abb . 2

uzbe/la~ell 0

Abb. i. Steigerung der Glucosekonzentration im Blur 2 Std nach oraler Gabe yon 100 mg/kg Diazoxid Abb. 2. Zunahme der blutzuckersteigernden Wirkung yon Diazoxid im Kaliummangel

Die Verst~rkung der Diazoxid-Hyperglyk~mie im Kaliummangel kann nieht auf eine Aktivit~tsabnahme der 3',5'-AMP-Phosphodiesterase zuriiekgefiihrt werden, die eine Folge der mit einem Kaliummangel ver- bundenen Elektrolytverschiebungen sein kSnnte. Untersuchungen mit Rinderherz-3',5'-AMP-Phosphodiesterase zeigen, daJ~ die Umsatz- geschwindigkeit des 3' ,5'-AMP yon der Na +- und K+-Konzentration des Ansatzes unabhi~ngig ist (Abb. 3).

Die glykogenolytische Wirkung des Diazoxids kSnnte im Kalium- mangel aueh dann gesteigert sein, wenn dieser eine Hemmung der Phosphorylase-Phosphatase bewirkte. Dieses Ferment katalysiert die

l~Iechanismus der gesteigerten glykogenolytischen Wirkung des Diazoxids 397

4 × ~_

I I 100. ~0 0 50 oo[No+],, ~[K+ ~ gvoll~J ZJ

l b b . 3 a. ]~influfl der ~Ta +- bzw. K+-Konzen t ra t ion a u f die l k t i v i t l t der 3 ' , 5 ' - lMP-Phosphodl - esterase aus Rinderherz . [$] = 1,5 • 10 -~ M 8 ' ,5 ' -AMP

] 0 0 r s 8u J- [m7 ~0-~-----o . . . . . . . . . . . . . ; . . . . O, z8 I

20L " " .. 0,58

I i I ~ . z U _ ~ M [ i ] o 0j5 7 Dl~Z.O.J:'i~

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120 . - . / -

I i I / 7 / Ng 37,J- ~.val[~t NO

[Na +] Abb.ll b. EinfluB yon Dhlzoxid. Iozw. ~ai~rium auf die A.ktbcU~lit der Phos!ohory|ase-I~'hosl)hal~ase der

PhosiDhor~lase a Skeletmuskulatur . v

r a in . Ansa tz

[S] ~ Phosphorylase a-Akt iv i t~ t ] ~lnol Glucose- l -Phosphat . / m i n - Ansa tz J L

® OIXkogen

/ XTp~C/O'~ ,1¢, ~Mp -~/~'SLrLAMP \

. . . . . . . 7i .... \ ® Znsuh'n

i I ® Pkospk. ~ pko,~pk.Lpkospk~,~.~e@Pko,.epko,,>yl~'~.e

®GI, ykogen-Synthetose t --- i " @O/yk.Synm.u/

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I @ G - s - P ~ @ G/ucose

Abb.4 . S~Srungen i m Glykogenstoffwechsel nach Gabe yon Diazoxid

398 H. KAEss, G. SEI~FT, W. LOSERT, R. SITT und G. SCttULTZ:

Umwand lung der &ktiven Form der Phosphorylase in die inaktive (Abb.4) und wird durch Diazoxid nicht gehemmt (siehe Abb.3). Die AktivitKt der Phosphorylase-Phosphatase n immt zwar bei Erniedrigung der K+-Konzent ra t ion im Ansatz nicht ab, eine Erh6hung der Na +- Konzent ra t ion im Inkuba t ionsmedium ffihrt dagegen zu einer Enzym- hemmung (siehe Abb. 3).

Tabelle 1. Erniedrigung der intracelluliireu Kaliumkonzentration und Anstieg der celluliiren Natriumkonzentration nach Erzeugung eines Kaliumde/izits

Bei K+-freier Di~tt Bei normaler Ern~hrung (15--22 Tage)

K+-Defizit (~val/Tier) 0 1414,5 =}= 70,6 n ~ 10

K + Qzval/g FG) 117,6 i 1,72 76,1 ± 4,55 p < 0,0002

K+-IZR (~val/g FG) 116,9 :L 1,71 I 75,3 ~ 4,55 p < 0,0002

K+-IZR (~val/ml IZF) 182,3 ~ 2,66 I 139,1 -~: 9,79 p < 0,0004

K+-EZR (izval/ml EZF) 6,4 ~: 0,09 I 2,1 :£ 0,1 p < 0,0002

n 18 I 5

Na + (~zv&l/g FG) 27,4 :k 1,38 I 53,6 :]: 3,06 l

p < 0,0002

Iq&+-IZR (~zval/g FG) 9,9 ~ 1,55 I 31,0 ± 3,32 p < 0,0002

15,4 ::k 2,36 ! 56,9 ~ 5,72 I Na+-IZR (~val/ml IZF) p < 0,0002

142,4 ± 0,94 I 123,5 ~: 2,29 Na+-EZR (~val/ml EZF) p < 0,0002

n 18 I 5

l~a + ~ K + -- IZR (~zval/ml IZF) 197,7 I 196,0 I

Dieser Befund k6nnte die Verst/trkung der Diazoxidwirkung im Kal iummangel erkl~ren, wenn dieser mit einem Anstieg der intra- cellul~iren Na+-Konzentra t ion einherginge. Untersuchungen fiber die Verteilung der Natr ium- und Kaliumionen zwischen dem extra- und intracellul/tren R a u m haben gezeigt, dab die intracellul~ire K+-Kon- zentrat ion in der Skeletmuskulatur nach 15--22ti~giger kaliumfreier Ern/thrung und einer negat iven Kaliumbflanz von etwa 1300 ~val/Tier erheblich abgenommen hat. Die cellul/ire Na+-Konzentra t ion ist dabei

Mechanismus der gesteigerten glykogenolytischen Wirkung des Diazoxids 399

auf mehr als das Dreifache der bei normal ern/ihrten Tieren gewonnenen Werte angestiegen (Tab. 1).

Als Folgen dieser enzymatischen St6rung steigern bereits 50 mg/kg Diazoxid p.o. die Aktivit/it der Muskel-Phosphorylase, wenn das Phar- makon Tieren mit einem Kaliummangel verabfolgt wird. Die gleiche Dosis hat bei normal ern/~hrten Tieren keinen aktivierenden Effekt (Tab. 2).

Tabelle 2. Zunahme des phosphorylaseaktivierenden E//ekts vow Diazoxid im Kaliummangel

KontroUen

Diazoxid (50 mg/kg p.o., 4 Std)

Phosphorylase a-Gehalt der Skeletmuskulatur (in Prozent der Gesamtaktivit~t)

Normale Ern~hrung K+-freie Di~t (14--18 Tage)

3,59 4- 1,42 n ~ 5

p > 0,4 - -

4,80 ± 0,89

p < 0,007

3,46 4- 0,40

p < 0 , 0 0 6 -

19,20 4- 4,12 n = 5

Diskussion Verschiedene Untersucher haben darauf hingewiesen, dal~ das Gleich-

gewicht zwischen Glykogenolyse und Glykogenaufbau im Kalium- mangel zuungunsten des Glykogenaufbaus verschoben ist (CA~I1-LL, ASHMORE, ZOTTU U. HASTINGS, 1956; NIEDERMEYER U. CARMICHAEL, 1960). Die Verminderung der Phosphorylase-Phosphatase-Aktivit~t im Kaliummangel, die eine Folge der dabei erh6hten Na+-Konzentration ist, erkl/~rt die Aktivierung der Phosphorylase in Gewebeschnitten, die in natriumhaltigen Medien inkubiert werden (C~mL, ASHMORE, ZOTTU U. HASTINGS, 1956). Frfihere Untersuchungen yon KELLER U. CORI (1955) sowie WOSILAIT 11. SUTHERLAND (1956), die auf eine verminderte Aktiviti~t der Phosphorylase-Phosphatase bei Zugabe yon Natrium- ionen hinweisen, werden durch unsere Resultate best/~tigt und erweitert. Die Erh6hung der intracellul/iren Na+-Konzentration ist offensichtlich eine Folge des cellul~ren Kaliumverlustes. Natriumionen reichern sich im intracellul/iren Raum an, um den Kationenverlust elektrostatisch auszugleichen (ORLoFF, KENNEDY U. BEI~LINE~, 1953 ; 01~LOFF, WALSER, KENNEDY U. BARTTER, 1959).

Die Verabfolgung yon Kaliumionen ffihrt auch bei normal ern/~hrten Tieren zu einem Anstieg der intracellul/iren Kaliumkonzentration, der eine Abnahme der cellul/~ren Natriumkonzentration folgt. Diese Ver- /inderungen erkl/~ren die auch schon yon KVAM u. STANTON (1964) sowie WOLFF U. PARMLEY (1964) mitgeteilte Verminderung der Diazoxid-

400 H. KA~ss, G. SENFT, W. LOSERT, R. SITT und G. SCttULTZ-*

Hyperglykamie nach Gabe yon Kalium, obwohl die Verbindung im Gegensatz zu den sulfonamidsubstituierten Benzothiadiazinderivaten keine renalen Kaliumverluste hervorruft.

Die intracellulare Kalium-Konzentration der Skeletmuskulatur wird durch Diazoxid nicht vermindert (ToTT~,, 1966). Es besteht somit auch keine Veranlassung, die blutzuckersteigernde Wirkung des Diazoxids selbst auf eine StSrung der Elektrolytverteilung zurfickzuffihren, welche die Aktivititt der Phosphorylase-Phosphatase herabsetzt. Ein direkter hemmender Einflul~ des Pharmakons auf das Enzym konnte ebeufalls ausgeschlossen werden.

Die im Kaliummangel auftretende Verminderung der Phosphorylase- Phosphatase-Aktiviti~t wirkt sich mit der durch Diazoxid bedingten Hemmung der 3',5'-AMP-Phosphodiesterase und einer Aktivierung der Adenyl-Cyclase durch Adrenalin (vermehrte Catecholamin-Inkretion als Folge des hypotensiven Diazoxid-Effekts) synergistisch aus (siehe Abb. 4). ttieraus resultiert die Versti~rkung der Diazoxid-Hyperglyk~mie nach Erzeugung eines Kaliumdefizits. Auf die Bedeutung und den Me- chanismus der dutch Diazoxid verminderten Insulininkretion haben wir in den vorangegangenen Arbeiten hingewiesen (LosEttT, SENFT, SITT, SCHULTZ U. KAESS, 1966; SCH~-LTZ, Sv,~FT, LOSERT U. SrrT, 1966) (siehe Abb.4).

Summary Administration of potassium chloride to normal rats causes a decrease

in the hyperglycemic response to diazoxide.

The hyperglycemic effect of diazoxide has been shown to exaggerate in animals with progressively increasing negative potassium balance.

Potassium deficiency results in a decrease in intracellular potassium concentration accompanied by an increase in intracellular sodium concentration.

There is no influence of varying potassium and sodium concentrations on 3',5'-AMP phosphodiesterase activity.

The activity of phosphorylase phosphatase has been found pro- gressively reduced with increasing sodium concentration in the incubate.

Diazoxide administered in doses insufficient to increase phosphory- lase activity in normal rats has been shown to gain such action in rats with potassium deficiency.

These data indicate the increase in the hyperglycemic action of diazoxide in potassium deficiency being caused by a reduction in phos- phorylase phosphatase activity in consequence of the increase in intra- cellular sodium concentration.

Mechanismus der gesteigerten glykogenolytischen Wirkung des Diazoxids 401

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Priv.-Doz. Dr. reed. G. S ~ T Pharmakologisehes Institut der Freien Universit~t 1000 Berlin 33 (Dahlem), Thielallee 69]73